JP2000504934A

JP2000504934A - 結合ドメインを含むグロビン

Info

Publication number: JP2000504934A
Application number: JP9523865A
Authority: JP
Inventors: ジェイアンソニー―カヒル，スペンサー; ケイ．エップ，ジャネット; エイ．カーウィン，ブルース; オー．オリンズ，ピーター; ジェイ．マシューズ，アントニー
Original assignee: バクスターバイオテクテクノロジーエス．アー．アール．エル．
Priority date: 1995-12-22
Filing date: 1996-12-20
Publication date: 2000-04-25
Also published as: CA2239303A1; US6218513B1; AU1468997A; EP0868521A2; AU715914B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、天然に存在しない結合ドメインを含むグロビンに関する。このような天然に存在しない結合ドメインは、オリゴマー化ドメインであり得るか、またはリガンド結合ドメインであり得る。本発明はまた、少なくとも１つの天然に存在しない結合ドメインを含む少なくとも１つのグロビンから構成されるマルチマーヘモグロビンに関する。

Description

【発明の詳細な説明】結合ドメインを含むグロビン発明の分野本発明は、一般的には、改変されたヘモグロビン、およびより詳細には、天然に存在しない結合ドメインを含むグロビンに関する。発明の背景赤血球の酸素運搬部分はタンパク質ヘモグロビンである。ヘモグロビンは、２つの同一のαグロビンサブユニット（α₁、α₂）、２つの同一のβグロビンサブユニット（β₁、β₂）、および４つのヘム分子から構成されるテトラマー分子であり、１グロビン当たり１つのヘムが組み込まれている。ヘムは、鉄原子を含む大きな大環状有機分子である；各ヘムは、酸素のような１つのリガンド分子と可逆的に結合し得る。ヘモグロビンテトラマーでは、各αサブユニットは、βサブユニットと会合して、安定なα／βダイマーを形成し、その２つは次に会合してテトラマーを形成する。サブユニットは、ファンデルワールスカ、水素結合、および塩架橋を介して非共有結合される。重篤な血液損失は、しばしば、損失した血液の容量ならびにその血液の酸素運搬能力の置換を必要とする。この置換は、代表的には、パックされたRBCとしてまたは全血のユニットとしてのいずれかとして、赤血球（RBC）を輸血することによって成し遂げられる。しかし、患者を献血で輸血することが、必ずしも可能、実用的、または望ましいわけではない。ヒト血液輸血は、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、非Ａおよび非Ｂ型肝炎、Ｂ型肝炎、Yersinia enterocoliti ca、サイトメガロウイルス、およびヒトＴ細胞白血病ウイルスのような、病気および病気を引き起こす病原体の伝染のような多くの危険性を付随する。さらに、血液輸血は、溶血輸血反応、免疫抑制、および移植片対宿主反応のような免疫学的反応に関連し得る。さらに、血液は、投与前に血液型を決定されそして交差適合されなければならず、そして制限された供給のために利用可能でないかもしれない。ヒト血液が利用可能でないかまたは輸血の危険性が大きすぎる場合、血漿増量剤が投与され得る。しかし、コロイドおよび晶質液のような血漿増量剤は、血液容量のみを置き換え、そして酸素運搬能力を置き換えない。血液が輸血のために利用可能ではない状況では、容量置換を提供するのに加えて酸素を輸送し得る赤血球代用物が望ましい。無細胞ヘモグロビン溶液は、血漿容量を増加および／または維持し得、そして従来の血漿増量剤と同様の形式で血液粘度を減少させ得るが、さらに、ヘモグロビンに基づく赤血球代用物は、肺から末梢組織への酸素の適切な輸送を支持し得る。さらに、酸素を輸送するヘモグロビンに基づく溶液は、赤血球が現在利用される大部分の状況で使用され得る。例えば、酸素を輸送するヘモグロビンに基づく溶液は、患者への自己血液の返却前の自己血液の献血中または献血前に一時的に酸素送達を増大するために使用され得る。この必要性と取り組むために、多くの赤血球代用物が開発されている（Winslo w，R.M.（１９９２）Hemoglobjn-based Red Cell Substitutes，The Johns Hop kins University Press，Baltimore 242頁）。これらの代用物には、合成ペルフルオロカーボン溶液（Long，D.M．欧州特許第0307087号）、化学的に架橋し得るかまたはし得ない種々の哺乳動物赤血球に由来する、無間質ヘモグロビン溶液（ Rausch，C.およびFeola，M.，米国特許第5,084,558号および第5,296,465号；Seh gal，L.R.，米国特許第4,826,811号および第5,194,590号；Vlahakes，G.J.ら，（1990）J．Thorac．Cardiovas．Surg．100:379-388）、および遺伝子操作した生物中で発現させ、そしてその生物から精製したヘモグロビン（例えば、細菌および酵母のような非赤血球細胞、Hoffmanら，WO 90/13645；細菌、Fronticelli ，C.ら，米国特許第5,239,061号；酵母、De Angeloら，WO 93/08831およびWO 91 /16349；ならびにトランスジェニック哺乳動物、Loganら，WO 92/22646；Townes ，T.M.およびMcCune，S.L.，WO 92/11283）が含まれる。これらの赤血球代用物は、赤血球の容量および酸素運搬能力を置換または増大するように設計されている。しかし、動物およびヒトに投与されている赤血球置換溶液は、投与の際に特定の有害な事象を示している。これらの有害な反応には、高血圧、腎不全、神経毒性、および肝毒性が含まれている（Winslow，R.M.，（1992）Hemoglobin-based Red Cell Substitutes，The Johns Hopkins University Press，Baltimore 242 頁；Biro，G.P.ら，（1992）Biomat.，Art．Cells & Immob．Biotech．20:1013- 1020）。ペルフルオロカーボンの場合、高血圧、細網内皮系の活性化、および補体活性化が観察されている（Reichelt，H.ら，（1992）Blood Substitutes and Oxygen Carriers，T.M．Chang(編)，769-772頁；Bentley，P.K．前出,778-781頁）。ヘモグロビンに基づく酸素キャリアについては、腎不全および腎毒性は、ヘモグロビンα／βダイマーの形成の結果である。ダイマーの形成は、テトラマーが解離するのを防止するようにヘモグロビンダイマーを化学的架橋（Sehgalら，米国特許第4,826,811号および第5,194,590号；Walder，J.A．米国再発行特許第R E34271号）または遺伝学的連結（Hoffmanら，WO 90/13645）することによって防止され得る。ダイマー形成の防止は、ヘモグロビン投与に関連する有害な事象のすべてを緩和したわけではなかった。ヘモグロビン溶液の投与の際の血圧変化および胃腸効果は、ヘモグロビンによる内皮由来血管弛緩因子（EDRF）の結合から生じる血管収縮に起因している（Spahn，D.R.ら，（1994）Anesth．Analg．78:1000-1021； Biro，G.P.，（1992）Biomat.，Art．Cells & Immob．Biotech.，20:1013-1020 ；Vandegriff，K.D．（1992）Biotechnology and Genetic Engineering Reviews ，第10巻:404-453 M.P．Tombs編者，Intercept Ltd.，Andover，England）。内皮由来血管弛緩因子は、酸化窒素（NO）として同定されている（総説については、Moncada，S.ら，（1991）Pharmacol．Rev．43:109-142）；誘導性および構成的NOの両方とも、主として血管系の内皮で産生され、そして血管緊張の局所モジュレーターとして作用する。いくつかの炎症性応答もまた、酸化窒素によって媒介される（Vandegriff，（ 1992）Biotechnology and Genetic Engineering Reviews，第10巻:404-453 M.P. Tombs編者，Intercept Ltd.，Andover，England；Moncada，S.ら，前出）。例えば、内皮によって産生される酸化窒素は、血小板凝集を阻害し、そして酸化窒素は無細胞ヘモグロビン溶液によって結合されるので、血小板凝集は増加し得る。血小板が凝集するので、これらはトロンボキサンＡ₂およびセロトニンのような強力な血管収縮剤化合物を放出する（Shuman，M.（1992）Cecil Textbook of Me dicine，J.B．Wyngaarden，L.H．SmithおよびJ.C．Bennett編，W.B．Saunders C o，Philadelphia，987-992頁）。これらは、過度の血管収縮を生じる、ヘモグロビンによる結合のため、減少した酸化窒素レベルと相乗的に作用し得る。血小板凝集を調節することに加えて、酸化窒素は細胞壁への好中球の付着を阻害する。好中球の細胞壁への増加した癒着は、細胞壁損傷を導き得る。ウサギにおける内皮細胞壁損傷は、いくつかのヘモグロビン溶液の注入の際に観察されている；この種の損傷は、ヘモグロビンによる内在性酸化窒素の取り込みに一致する（Whiteら，（1986）J．Lab．Clin．Med．108:121-131；Vandegriff（1992）B iotechnology and Genetic Engineering Revjews，第10巻:404-453 M.P．Tombs 編者，Intercept Ltd.，Andover，England）。これらのすべての場合、酸化窒素の減少したスカベンジングおよび生理学的に受容可能な酸素親和性を有するヘモグロビン分子は、これらの可能な効果のいくつかを改良し得るが、効果的な酸素キャリアとしてさらに機能する。ヘモグロビンが赤血球に含まれる場合、血管の境界を越えて移動し得ない。したがって、酸化窒素は、それが結合される前にRBC中のヘモグロビンに拡散しなければならない。ヘモグロビンに基づく血液代用物での場合のように、ヘモグロビンがRBC内に含まれない場合、それは血管の内側をおおう内皮を越えて通過し得、そして血管外腔に透過し得る（溢血）。したがって、細胞外ヘモグロビンの投与に関連する有害な事象の可能なメカニズムは、血管の血管外腔に入っているヘモグロビンによる酸化窒素の過剰な不活性化であり得る。NOは、血管内皮によって構成的に合成される。内皮および血管外腔におけるNOの迅速な不活性化は、細胞を含まないヘモグロビンの注入後に観察される血管収縮および昇圧応答を導き得る。より大きなヘモグロビン、すなわち、ヘモグロビンテトラマーのポリマーは、その増加したサイズのため、減少した溢血を生じ得る。減少した溢血は、次に、注入したヘモグロビン溶液から生じる減少した昇圧効果を導き得る。より大きなヘモグロビンはまた、改良された半減期特徴を有し得る。より大きな分子は、一般的に、インビボで投与された場合、著しく長い血清半減期に関連する。実際、より大きなヘモグロビンは、化学的重合によって探索されている。例えば、米国特許第4,001,401号、米国特許第4,001,200号、米国特許第4,336,24 8号、および米国特許第4,053,590号はすべて、より高い分子量を有するヘモグロビンを成し遂げるために化学的に架橋することによる、赤血球由来ヘモグロビンの重合に関する。架橋反応の結果は、一般的に、共有架橋した凝集物の多分散組成物にわたる。Bucci，米国特許第4,584,130号の第２カラムは、「ポリヘモグロビン反応産物は、サイズおよび形状の異なる種々の分子種の異種混合物である。これらのポリヘモグロビンの分子量は、64,500〜600,000ダルトンの範囲にわたる。異種混合物からの個々の分子種の分離は、実際には不可能である。さらに、インビボでのより長い保持時間がポリヘモグロビンを使用して得られるが、その酸素親和性は、間質を含まないヘモグロビンのものよりも高い。」と解説している。さらに、Tye，米国特許第4,529,719号によれば、重合したピリドキシル化(p yridoxylated)ヘモグロビンは、「薬学的薬剤として研究することを困難にするに十分な化学的異種性」を有する。したがって、ランダムな重合は制御することが困難であること、および種々のポリマーの異種混合物が得られ得ることは十分に認識される。さらに、重合化試薬でのヘモグロビンの処理は扱いにくく、そして物質のコストを増加させそして生産および精製工程の数を増加させることによって、産物のコストを増加させる。化学的手段による重合に加えて、遺伝子工学技法がタンパク質を連結させるために使用され得る。Andersonら，WO 93/09143は、１つ以上のグロビンサブユニットに導入されて次にジスルフィド結合の形成を可能にするシステイン変異による、ヘモグロビンテトラマーの重合を開示する。しかし、これらのジスルフィド結合は、インビボで切断されて、分子量の減少および減少した半減期を導き得る。あるいは、これらのジスルフィド結合の形成は、外因性化学的試薬の添加を必要とし得、上記の外因性化学的試薬の付帯する不利点を有する。ジスルフィドの形成のためにシステインを提供するための残基の変異に加えて、タンパク質は、直接遺伝子融合によって連結され得る。これらのリンカーは、独特の特徴を有するペプチドリンカーをコードし得る。例えば、Rutter，米国特許第4,769,326号を参照のこと。遺伝子の連結は、第１の遺伝子の停止コドンを除去することおよび第２の遺伝子に同位相で連結させることによる、目的のタンパク質をコードする遺伝子の融合によって行われ得る。遺伝子の一部はまた融合され得、そして位相を維持するスペーサーDNAは融合した配列間に挿入され得る。融合した遺伝子の産物は、単一の融合ポリペプチドである。 Hoffmanら，WO88/09179は、最終産物をプロセシングする前に切断されるリーダーペプチドに融合されるグロビンドメインの産生を記載する。Andersonら，WO 93/09143は、細菌および酵母におけるヘモグロビンおよびそのアナログの産生を記載する。彼らは、構成要素ポリペプチド鎖の１つが、分枝なしに、ペプチド結合によって、好ましくは１つ以上のアミノ酸の中間リンカーを介して、共有結合した２つのαまたは２つのβグロビンアミノ酸配列からなる、ヘモグロビンタンパク質のアナログを開示した。化学的に産生したおよび遺伝学的に連結したポリマーヘモグロビンに加えて、天然に存在するポリマーヘモグロビンが、種々の脊椎動物および無脊椎動物で報告されている。マウスポリマーヘモグロビンは、BonaventuraおよびRiggs，Scie nce，149:800-802(1967)；およびRiggs，Science，147:621-623(1965)に記載される。重合化サルヘモグロビン改変体は、Takenakaら，Biochem．Biophys．Acta ，492:433-444(1977)；Ishimotoら，J．Anthrop．Soc．Nippon，83(3):233-243( 1975)に報告される。また、両生類および爬虫類の両方とも、重合化ヘモグロビンを有する。Tamら，J．Biol．Chem.，261:8290-94(1986)。これらのヘモグロビンは、２つ以上のサブユニットまたはテトラマー間のジスルフィド結合の形成の結果として重合する。より大きなヘモグロビンはまた、マルチマーヘモグロビンを形成する、４つより多くのグロビンサブユニットの相互作用から生じ得る。例えば、ミミズ（Lumb ricus terrestris ）の細胞外ヘモグロビンは、１２サブユニットを有し、それぞれは、「a」、「b」、「c」、および「d」が主要なヘム含有鎖を示す構造(abcd)₂のダイマーである。「a」、「b」、および「c」鎖は、ジスルフィド連結したトリマーを形成する。全体の分子は、192ヘム含有鎖および12非ヘム鎖から構成され、そして380 0kDaの分子量を有する。他の無脊椎動物ヘモグロビンはまた、大きなマルチサブユニットタンパク質である。例えば、ブラインシュリンプArtemiaは、９つの遺伝学的に融合したグロビンサブユニットを有する３つのポリマーヘモグロビンを産生する（Manningら，（1990）Nature，348:653）。これらは、２つの異なるサブユニットタイプ（ａおよびｂ）の可変会合によって形成される。８つのサブユニット間リンカーのうち、６つは12残基長であり、１つは11残基であり、そして１つは14残基である。分子間（第１のテトラマーから第２のテトラマーへの）ジスルフィド架橋の形成の結果として重合する３つのヒト変異体が公知である。Tondo，Biochem．Biop hys．Acta，342:15-20(1974)およびTondo，An．Acad．Bras．Cr.，59:243-251(1 987)は、Hb Porto Alegreとして公知のこのような変異体の１つを記載する。Hb Mississippiは、Ser CD3(44)βの代わりのシステイン置換によって特徴づけられ、そしてAdamsら，Hemoglobin，11(5):435-542(1987)によれば、10以上のヘモグロビンテトラマーから構成されると考えられる。ヘモグロビンTa Liは、β83(EF 7)Gly→Cys変異によって特徴づけられ、これは、澱粉ゲル電気泳動での遅い移動度を示し、これもポリマーであることを示した。しかし、上記の天然に存在する重合化ヘモグロビンのすべては、ヒトまたは非ヒト起源に関わらず、それらを血液代用物としての使用に不適切にし得る酸素親和性を有する。さらに、これらの天然に存在する重合化ヘモグロビンは、有用な血液代用物であるために必要とされる量で収集することが困難であり得るか、またはこれらは静脈内に投与される場合に免疫原性応答を誘起し得る。ヘモグロビンを含む多くのタンパク質は、オリゴマー（ダイマー、トリマー、テトラマーなど）として存在することが公知であり、そしていくつかの場合、オリゴマータンパク質内の別個のフォールディングユニット（すなわちドメイン）は、オリゴマーのアセンブリーの原因である（Landschultz，Johnson，およびMc Knight，Science，240，1759，（1988）；McWhirter，Galasso，およびWang，Mo l． 2）；Morgelinら，J．Biol．Chem.，267，6137，(1992)）。これらのドメインがオリゴマー化を促進する能力は、推定のオリゴマー化ドメインに対応する配列を有するポリペプチドの化学的合成または細菌発現、およびその後の特徴づけによって証明されている（O'Shea，Rutkowski，Stafford，およびKim，Science，245 ，646，(1989)；0'Neil，Hoess，およびDeGrado，Science，249，774，(1990)； Anthony-Cahillら，Science，255，979，(1992)；Pavletich，Chambers，および Pabo，Genes Dev.，7，2556，(1993)；Efimov，Lustig，およびEngel，FEBS Let t ers，341，54，(1994)）。ヒトガン抑制p53タンパク質からのオリゴマー化ドメインは、酵母転写因子GCN4からのダイマー化ドメインによって置換され得ることが示されている。得られるキメラタンパク質は、培養した細胞における腫瘍増殖を抑制するために十分な活性を有した（Pietenpolら，Proc．Nat'l Acad．Sci． USA，91，1998，(1994)）。バクテリオファージλリプレッサーのDNA結合ドメインへのGCN4配列の融合は、安定で生物学的に活性なダイマーを生じる（Hu，O'Sh ea，Kim，およびSauer，Science，250，1400，(1990)）。単鎖抗体Fv遺伝子への GCN4ダイマー化ドメインの遺伝学的融合は、ダイマーである「ミニ抗体」を生じゴマーは、非共有結合的にアセンブリーされ、そして外因性の化学的共有架橋剤の添加なしに自発的に形成する。しかし、オリゴマー化ドメインは、グロビンに融合されていない。したがって、外因性の化学的架橋剤の添加なしにアセンブリーされ得る、より大きなヘモグロビンを産生する方法の必要性があり、ここで、所望ならば、最終的なマルチマーヘモグロビンのサイズは束縛され得る。このようなより大きなヘモグロビンは、溢血を減少させそして半減期を増加させ得る。本発明は、これらの必要性を満たし、そして関連の有利点を提供する。発明の要旨本発明は、天然に存在しない結合ドメインを含むグロビンに関する。これらの結合ドメインは、直接またはリンカーを介してのいずれかでＮ末端もしくはＣ末端へ融合されるか、またはヘモグロビンを構成するグロビンドメインのいずれか、あるいはこれらの結合ドメインの両方は、グロビンの現存するもしくは操作された領域を置換または増大し得る。グロビンドメインは、個々のグロビンドメインであり得、またはこれらはペプチドリンカーによって連結されているグロビンドメインであり得る。本発明の１つの局面では、これらの結合ドメインは、非ペプチドリガンド、例えば、ビオチンに結合する。本発明の別の局面では、結合ドメインは、任意の天然に存在するまたは人工的なオリゴマーからのオリゴマー化ドメインである。好ましくは、オリゴマー化ドメインは、天然に存在するオリゴマーからのオリゴマー化ドメイン、例えば、p53、COMP、arc、Mnt、BMP、BRS、Urechis、またはGCN4 からのオリゴマー化ドメインである。本発明はまた、１つ以上の天然に存在しない結合ドメインを含む少なくとも１つのグロビンから構成されるマルチマーヘモグロビンに関する。したがって、本発明はさらに、４つより多くのグロビンから構成されるヘモグロビンに関する。本発明はまた、天然に存在しない結合ドメインを含むこのようなグロビンをコードする核酸配列を有する核酸分子に関する。１つの実施態様では、核酸分子は、p53オリゴマー化ドメインを含むグロビンをコードする。さらなる実施態様では、核酸分子は、COMPオリゴマー化ドメインを含むグロビンをコードする。なおさらなる実施態様では、核酸分子は、GCN4オリゴマー化ドメインを含むグロビンをコードする。別の実施態様では、核酸分子は、ビオチンに対するアビジン結合ドメインを含むグロビンをコードする。天然に存在しない結合ドメインを含むグロビン、ならびに天然に存在しない結合ドメインを含む少なくとも１つのグロビンを含むマルチマーヘモグロビンを製造する方法もまた、本発明によって提供される。発明の詳細な説明本発明は、一般的に、１つ以上の天然に存在しない結合ドメインを含むグロビンタンパク質に関する。用語グロビンは、ヘム部分を共有または非共有結合し得、そしてそれゆえ酸素を輸送または貯蔵し得る、すべてのタンパク質またはタンパク質サブユニットを包含することが意図される。したがって、脊椎動物および無脊椎動物ヘモグロビン、脊椎動物および無脊椎動物ミオグロビン、またはそれらの変異体のサブユニットは、用語グロビンに包含される。例えば、ウシヘモグロビンのサブユニットは、この用語の範囲内である。したがって、用語「αグロビン」は、正常ヒトαグロビンを含む天然に存在するαグロビン、およびそれらの変異体を包含するが、これらに限定されないことが意図される。「βグロビン」は、類似して定義される。したがって、本発明によれば、ポリペプチドは、偶然から予測されるよりも大きな配列同一性を天然に存在するグロビンと有し、そしてまた、一般的にグロビンに関連する特徴的なより高度な構造（例えば、「ミオグロビンフォールド」）を有する場合、グロビンであると考えられ得る。多くの脊椎動物およびいくつかの無脊椎動物では、これらの４つのグロビンは、非共有結合してヘモグロビンテトラマーを形成する。本発明の範囲から逸脱することなく、グロビンの変異は、例えば、(1)酸素親和性、協同性、もしくは安定性を改変するために、(2)遺伝的融合もしくは架橋を容易にするために、または(3)個々の鎖の発現およびアセンブリーの容易さを増加させるために、導入され得る。あるタイプの変異についてのガイダンスは、例えば、米国特許第5,028,588号およびPCT公開第WO 93/09143号（両方とも参考として本明細書に援用される）に提供される。さらに、本発明は、既に遺伝的に融合されているグロビンへのオリゴマー化ドメインの付加にさらに関する。このような遺伝的に融合されたグロビンは、例えば、PCT公開第WO 90/13645号（参考として本明細書に援用される）に提供される。これらの遺伝的に融合されたグロビンは、例えば、ジ-αグロビン（１つのαグロビンのＮ末端と第２のαグロビンのＣ末端との間のグリシンリンカーによって融合された２つのαグロビン）およびジ-ジ-αグロビン（ジ-αグロビンのＮ末端とＣ末端との間のリンカーの挿入によってさらに融合された２つのジ-αグロビン）を含む。本発明はさらに、実質的に生物学的活性に影響を及ぼさない、必要のない変異による、本明細書に教示される分子から逸脱した分子を含む。本発明は、グロビン中に天然に存在しない結合ドメイン（天然に存在しない結合ドメイン）を含むグロビンに関する。したがって、用語「天然に存在しない」とは、特定の結合ドメインが目的のグロビン中に天然に見いだされるかどうかをいい、そして結合ドメインの供給源については言及しない。したがって、結合ドメインは、例えば、天然に存在する結合ドメイン、天然に存在する結合ドメインの変異体、または合成結合ドメインであり得る。さらに、所定のグロビン内に天然に見いだされるが、グロビン内で天然で見い出されない位置に移動されている、またはグロビンに付加されている結合ドメインもまた、「天然に存在しない結合ドメイン」である。したがって、本発明は、例えば、天然に存在するよりも多くのβグロビン結合ドメインを含むαグロビン、または、例えば、p53結合ドメインに連結したβグロビンに関する。本発明の結合ドメインは、リガンドまたは別のペプチド配列と、主として非共有的相互作用を介して自発的に会合し、そしてオリゴマーを形成し得る、ペプチド配列である。非共有結合した複合体（またはオリゴマー）は、ペプチドが、またはペプチドとリガンドとが結合した後にジスルフィドを形成し得る、例えば、システイン残基の付加によって、さらに安定化され得る。オリゴマー化ドメインは、他のペプチドドメイン（これは同じであるかまたは異なり得る）と特異的に会合するペプチド配列として定義される特殊化した結合ドメインである。例えば、１つのコイルドコイルヘリックスは、１つ以上の同様のヘリックスと会合してダイマーまたはより高次のオリゴマーを形成し得、ここで、オリゴマーコアは同一のコイルドコイルヘリックスから構成される。あるいは、ペプチド結合ドメインは、異なる分子上の非常に異なるペプチド結合ドメインに結合し得る。例えば、ジαグロビンの各末端へのαグロビンの融合は、αグロビンが、他のαグロビン（オリゴマー化ドメインと同様）およびβグロビン（オリゴマー化ドメインとは異なる）とオリゴマー化するので、βグロビンの存在下でトリマーヘモグロビンを生成し得る。言い換えれば、２つのオリゴマー化したジαグロビン上の追加のαグロビンは、互いにおよびβグロビンとアセンブリーして、新しい中心ヘモグロビンに連結される２つの正常なヘモグロビンテトラマーを形成する。この相互作用は、米国特許第5,449,759号（参考として本明細書に援用される）に教示されるように、中心ヘモグロビンにおけるcys変異の取り込みによって、さらに安定化され得る。同様に、付加した結合ドメインは、別の種からのグロビン結合ドメイン由来であり得、例えば、グロビンドメインはUrechisヘモグロビン由来であり得る（KolatkarおよびHackert，J．Mol．Biol.，237:87-97(1994)）。これは、４つの同一のサブユニットから構成されるヘモグロビンである。ジαグロビンUrechisグロビンの融合は、例えば、テトラマーマルチマーヘモグロビンの形成を導く。オリゴマー化ドメインは、リガンド結合ドメインが、必ずしもそれ自体と会合してオリゴマーを形成しないが、非ペプチドリガンドに結合することによってオリゴマー化をもたらし得る点で、「リガンド結合ドメイン」とは異なる（しかし、ストレプトアビジンは、自己会合し得るリガンド結合ドメインの例であり；ストレプトアビジン自体はテトラマーを形成するが、ビオチンにも結合することに留意すること）。したがって、リガンド結合ドメインは、グロビン分子に付加され得る。グロビン分子が、次いで適切な多官能性リガンド（例えば、複数のビオチン部分を有するデンドリマー(dendrimer)）に曝される場合、このシステムはオリゴマーを形成する。あるいは、天然にビオチン化されるリガンド結合ドメインは、グロビンに付加され得；ストレプトアビジンの存在下では、テトラマーヘモグロビンが形成され得る。結合ドメインは、天然に存在するペプチド配列または天然に存在しないペプチド配列であり得る。別個の結合ドメインが公知である場合、このドメインはグロビンに連結され得る。タンパク質がオリゴマーとして存在するが、オリゴマー化の原因である別個のドメインが存在しない（すなわち、タンパク質オリゴマー界面を定義するアミノ酸残基が、タンパク質中の１つ以上の領域またはドメインに及ぶ）場合、オリゴマータンパク質の配列全体（またはこの配列の所望の部分）は、任意の適切な手段によって、所望のオリゴマーを生成するためにグロビンに連結され得る。これらの配列、およびグロビン自体は、以下にさらに記載するように、任意の適切な生物学的発現系で発現され得るか、またはこれらは固相もしくは液相ペプチド合成によるような、任意の適切な化学的手段によって合成され得る。オリゴマー化の程度は、結合ドメインの選択および配置によって制御され得る。例えば、ダイマーを形成することが公知である結合ドメインが、例えば、αグロビンに連結される場合に、ダイマーグロビンは生成され得る。次いで２つのα グロビンが相互作用する場合、ダイマーαグロビンはアセンブリーされる。すなわち、２つのαグロビンは、αグロビンのそれぞれに付加されている天然に存在しないダイマー化ドメインを介して連結される。同様の形式で、オリゴマー化ドメインがトリマー化ドメインである場合は、トリマーグロビンオリゴマーが形成され得、オリゴマー化ドメインがテトラマー化ドメインである場合は、テトラマーグロビンオリゴマーが形成され得る、などである。ドメインがポリマー化ドメインである場合は、グロビンのポリマーが形成され得ることに留意すること。したがって、オリゴマー化ドメインが、遺伝学的に連結したグロビン（例えば、ジ-αグロビン）を含む１つ以上のグロビンに連結される場合、マルチマーヘモグロビンは形成され得る。例えば、オリゴマー化ドメインが、例えば、上記のようなαグロビン、またはジ-αグロビンのＮ末端に連結される場合、対応するオリゴマージ-αが形成される。すなわち、ジ-αグロビンは、オリゴマー化ドメインの相互作用を介して非共有結合される。もちろん、共有結合を形成する種々の部分は、相互作用をさらに安定化するためにオリゴマーに導入され得る。オリゴマージ-αグロビンが、βグロビンの存在下でアセンブリーされる場合、βグロビンはαグロビンと自発的に会合するので、αグロビン中のβグロビン結合ドメインがβグロビンへの結合に利用可能である限り、対応するオリゴマーヘモグロビンが生じる。結合ドメインの連結が単一のαグロビンに対するものである場合、ポリマーヘモグロビンが形成し得る。すなわち、各αグロビンは、別のαグロビン上の対応するオリゴマー化ドメインに結合するオリゴマー化ドメインを有し得る。これらのαグロビンのそれぞれは、βグロビンの存在下で、別のαグロビンと会合してテトラマーヘモグロビンを形成し得る。次いで、付加したαグロビン上の結合ドメインは、オリゴマー化し続けてポリマーヘモグロビンを形成する。αグロビンに対するこれらの変化のすべてが、任意のグロビン（例えば、βグロビン）で行われ得ることに留意すること。次いで、マルチマーヘモグロビンは、βグロビンのオリゴマー化、およびαグロビンとのアセンブリーによって形成される。酵母GCN4タンパク質からのダイマー化ドメインは、本明細書に記載の方法によるダイマーヘモグロビンマルチマーの生成に特に適切である。GCN4ダイマー化ドメインは、そのパートナーと対合して並行コイルドコイルを形成する単鎖α-ヘリックスである（O'Shea，Rutkowski，Stafford，およびKim，Science，245，64 6，(1989)）。GCN4コイルドコイルのＸ線結晶構造が決定されており（O'Shea，K lemm，Kim，およびAlber，Science，254,539，(1991)）、そして天然および変異体GCN4コイルドコイルペプチドの安定性およびオリゴマー化状態に影響を与える因子が決定されている（Harbury，Zhang，Kim，およびAlber，Science，262，14 01，(1993)；O'Neil，Hoess，およびDeGrado，Science，249，774，(1990)）。本出願で使用される場合、「GCN4誘導体」とは、GCN4ドメインの人工的および天然に存在する変異体の両方をいう。さらに、いくつかのモデルコイルドコイルペプチドは、広く研究されており、そしてこれらの設計されたペプチドの安定性を支配する規則が報告されている（Hodges，Zhou，Kay，およびSemchuk，Peptide Res.，3，123，(1990)；Zhuら，Int．J．Peptide Protein Res.，40，171，(199 2)；LumbおよびKim，Biochemistry，34，8642，(1995)）。別の有用なダイマー化結合ドメインは、バクテリオファージP22のArcリプレッサーからの結合ドメインである（Schildbach，JF，Milla ME，Jeffrey PD，Raumann BE，Sauer RT(199 5)．Biochemistry 34:13914-19）。Arcリプレッサーは、53アミノ酸のダイマーポリペプチドである。あるいは、ガン抑制p53からのＣ末端テトラマー化ドメインのような小さなテトラマー化配列は、目的のグロビンに融合され得る。このドメインの構造は、結晶から（Jeffrey，GorinaおよびPavletich，Science，267，1498，(1995)）および溶液中で（Cloreら，Nature Struct．Biol.，2，321，(1995)）決定されている。インビトロ結合研究は、53アミノ酸を含むタンパク質フラグメントが、テトラマー化を促進するために十分であることを示す（Pavletich，ChambersおよびP abo，Genes Dev.，7，2556，(1993)）。本発明に適切な別のテトラマー結合ドメインは、バクテリオファージP22のMntリプレッサーである（Waldburger，C.D.およびR.T．Sauer(1995)．Biochemistry 34(40):13109-13116）。Mntリプレッサーは、82アミノ酸のテトラマーポリペプチドである。本発明に適切な追加のテトラマー化結合ドメインは、ストレプトアビジンおよびアビジンである。ストレプトアビジン（Argarana，C.，Kuntz，I.D.，Birken，S，Axel，R.およびCantor，C. R.（1986）Nucleic Acids Res．14:1871）およびアビジン（Green，N.M.（1975 ）Adv．Protein Chem．29:85）は、それぞれ約125〜127および128アミノ酸の相同テトラマーポリペプチドである。別の適切なテトラマー化結合ドメインは、ビオチンリガーゼ（BLS）に対する認識部位である。BLSポリペプチド配列は、種々のタンパク質について記載されている：例えば、Escherichia coliアセチル-CoAカルボキシラーゼのビオチンカルボキシキャリアタンパク質のＣ末端87残基（Chapman-Smith，A.，D.L．Turner ら（1994）Biochem．J．302:881-7）；ヒトプロピオニル-CoAカルボキシラーゼ αサブユニットのカルボキシル末端フラグメントのＣ末端67残基が使用され得る（Leon-Del-Rio，A.およびR.A．Gravel（1994）J．Biol．Chem．269(37):22964- 8）；およびPropionibacterium freudenreichiiトランスカルボキシラーゼ1.3S ビオチンサブユニットの残基18-123（Yamano，N.，Y．Kawataら（1992）Biosci ．Biotechnol．Biochem．56(7):1017-1026）。BLSに融合したグロビンタンパク質は、ビオチンリガーゼによって、インビトロまたはインビボのいずれかで、ビオチン化され得る。次いで、ビオチン化グロビンは、テトラマーアビジンまたはストレプトアビジンと特異的に相互作用してテトラマーグロビン誘導体を形成する。上記のビオチン分子のペプチド模倣物もまた、本発明で利用され得る。ビオチンの存在なしでストレプトアビジンに直接結合する能力を与えるペプチド配列が記載されている。このようなビオチン模倣ペプチド（「BMP」）は、例えば、Sch midtおよびSkerra（Schmidt，T.G.M.およびA．Skerra(1993)．Protein Eng 6(1) :109-122）ならびにWeberら（Weber，P.C.，Pantoliano，M.W.，Thompson，L.D. （1992）Biochemistry 31:9350-9354）によって記載されている。BMPに融合したグロビンは、テトラマーアビジンまたはストレプトアビジンと特異的に相互作用してテトラマーグロビンを形成する。グロビンはまた、ビオチンに対する親和性を与える短いペプチド性結合ドメイン（「BBD」）に融合され得る。ビオチンを結合するペプチド配列は記載されている（Saggio，I.およびLaufer，R.（1993）Biochem．J．293:613-616）。グロビン-BBD融合タンパク質は、デンドリマー分子に共有結合した２〜６ビオチン分子のオリゴマーアレイと反応する。このようなデンドリマー分子は、Mekelberge tional edition in English，31(12):1571-1576）によって記載されている。ペンタマーグロビンは、例えば、軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質（COMP ）からのペンタマー化ドメインのジαグロビンのＮ末端への連結によって生成され得る。Efimovら（上記を参照）は、E．coliで発現される残基20-83を含むCOMP のタンパク質フラグメントが、インタクトな天然のCOMPタンパク質中の対応するセグメントに類似の円柱状構造を形成することを電子顕微鏡法によって示されたことを報告する。円柱状構造は、５つの共有結合したペプチド鎖から構成された；共有結合は、２つのシステイン残基（Cys-68およびCys-71）によって媒介されると考えられる（Oidbergら，J．Biol．Chem.，267，22346(1992)）。Efimov らは、酸化型および還元型の組換えペプチドの両方とも、α−ヘリックス構造に特有の円二色性スペクトルを有することを報告した。Cys-68とCys-71との間のジスルフィド結合形成は、５つの鎖の並行配置が一致するのみであるので、著者らは、COMPのアセンブリードメインが、一巻き中にアセンブリーされる５つの並行 α−ヘリックスから主としてなることを示唆した。天然のPAGEおよび沈降速度実験は、還元型および酸化型のペプチドの両方とも、同じペンタマー構造を有することを示唆した（Efimovら，上で引用）。還元型ペプチドが明らかに会合してペンタマーを形成するという事実は、システインがオリゴマー化に必要とされないことを示唆する。天然に存在しない結合ドメインは、グロビンの所望の生物学的活性が実質的に影響されない限り、グロビン分子中のどこにでも挿入され得る。例えば、天然に存在しない結合ドメインは、目的のグロビンのＮ末端またはＣ末端のいずれかに付加され得る。これらの種の付加に特に適切なグロビンは、ジ-αグロビンまたはジ-ジ-αグロビンである。オリゴマー化ドメインは、例えば、直接または任意の適切なリンカー配列を介して、ＮまたはＣ末端に付加され得る。このようなリ gA1ヒンジ領域（Hallewellら，J．Bjol．Chem.，264，5260，(1989)）に由来し得る。例えば、１つまたは少数のアミノ酸の単純反復がまた、リンカーとして使用され得る。Argosは、Thr、Ser、Gly、およびAlaが、Brookhavenタンパク質データベースに挙げられるリンカー領域の調査の結果に基づいたリンカーについて最も望ましい構成要素アミノ酸であることを報告した（Argos，J．Mol．Biol.， 211，943，(1990)）。特に適切なリンカーは、GlyGlyGlyGlySer（配列番号１）反復（Holliger，Prospero，およびWinter，Proc．Nat'l Acad．Sci USA，90，6 444，(1993)）、およびGlyGlyGlySer（配列番号２）反復（NeuholdおよびWold， Cell，74，1033，(1993)）に基づくリンカーである。さらに、天然に存在しない結合ドメインは、グロビン自体の中に配置され得る。例えば、βグロビンのＤヘリックスは、グロビンの酸素結合特徴にほとんど効果がないことが公知であり、それゆえ、Ｄ-ヘリックス内の挿入またはＤ-ヘリックス自体の一部もしくはすべての置換のいずれかによる、天然に存在しない結合ドメインの配置のための良好な候補位置である。他のグロビンは、Ｄ-ヘリックス領域を有さないが、結合ドメインは、等価な領域に配置され得る（Komiyama，N. ，Shih，D.，Looker，D.,Tame，J.，およびNagai，K.，Nature，352，349-351， (1991)）。あるいは、天然に存在しない結合ドメインは、グロビン中の新しいヘリックスまたは非ヘリックス領域として挿入され得る。このような領域は、本明細書に示されるガイダンスを使用して、当業者によって容易に決定され得る。本発明はさらに、本発明の新規なグロビンをコードする核酸を提供する。当業者は、当該技術分野で公知の方法を使用して、発現に使用される生物に特異的なコドンおよび制御エレメントを選択して、公知のヘモグロビンサブユニット、リンカー、および結合ドメインの公開されたヌクレオチドまたはアミノ酸配列の知見に基づいて、所望のヌクレオチド配列を容易に誘導し得る。例えば、合成ヘモグロビンのジ-αドメインおよびβドメインのアミノ酸配列は、本発明の核酸を誘導するために使用され得、その両方ともヌクレオチド配列に対して以下を修正して、PCT公開WO 90/13645（本明細書に参考として援用される）の図１２において同定される：塩基55、56、および57（コドン19）はGCGと読むべきであり、そして塩基208および209（コドン70の最初の２つの塩基）はGCと読むべきである。この図のアミノ酸配列への以下の変更は、偽テトラマーrHb1.1を生じる：ジ-α ドメインの残基142および143でのGly-Gly架橋は、α₁およびα₂ドメインを架橋する単一のGly残基に変更され得る；ジ-αドメインの残基54および97は、Glnと読むべきである；βサブユニットの残基70はAsnと読むべきである；そしてβサブユニットの残基107はLysと読むべきである。偽テトラマーrHb1.1はまた、Look erら，Nature，356:258-260（1992）（本明細書に参考として援用される）に記載される。この偽テトラマーは、ジ-αグロビンを形成するためのペプチドリンカーによって連結される２つのαグロビンドメイン、および２つの融合していないβグロビンから構成される。類似の偽テトラマーは、αグロビンとアセンブリーした遺伝学的に融合したジ-βグロビンから構成され得る。本発明の核酸は、従来の方法に従ってまたは以下の実施例に記載されるように、適切な組換え宿主細胞に挿入されるべきプラスミドを構築するために使用され得る。任意の適切な宿主細胞は、新規なポリペプチドを発現するために使用され得る。適切な宿主細胞は、例えば、細菌、酵母、噛乳動物、および昆虫細胞を含む。E．coli細胞は、新規なポリペプチドを発現するために特に有用である。好ましくは、複数のサブユニットが細菌中で発現される場合、WO 93/09143に記載されるように、サブユニットがポリシストロン的に同じ細胞で同時発現されることが望ましいが、必要とはされない。所望のタンパク質をコードする遺伝子の発現を駆動するために、E．coliにおいて、単一のプロモーターの使用が好ましいが、必要とはされない。本発明はまた、天然に存在しない結合ドメインを含む少なくとも１つのグロビンから構成される新規なヘモグロビンに関する。一般的に、本発明のグロビンから構成されるヘモグロビンは、マルチマーヘモグロビンを形成し、これは４つ以上のグロビンまたはグロビンドメインを含むヘモグロビンである。このようなマルチマーヘモグロビンは、ダイマーヘモグロビン（ダイマー化結合ドメインを介して結合される２つのテトラマーまたは偽テトラマーヘモグロビン）、トリマーヘモグロビン（３つのテトラマーまたは偽テトラマーヘモグロビン）、および高次のマルチマーまたはポリマーヘモグロビンを含む。しかし、本発明によれば、用語マルチマーヘモグロビンはまた、単一のタイプのグロビンから構成されるマルチマーヘモグロビン（例えば、αサブユニットのみから構成されるマルチマーヘモグロビン）、ならびにオリゴマー化されていないが、天然に存在しない結合ドメインを含む少なくとも１つのグロビンを含むテトラマーヘモグロビンを含む。マルチマーヘモグロビンを含む元のグロビン分子の配列中に遺伝子工学技法によって導入される新しい結合ドメインの会合のため、本発明の新規なマルチマーヘモグロビンは形成される。一般的に、αグロビンが、たやすくおよび非常に強力にβグロビンと会合してα／βダイマーを形成することに留意すること。例えば、βグロビンは、αグロビンと自発的におよび本質的に不可逆的に会合する。したがって、遺伝学的に融合したαグロビン（ジ-α）がβグロビンと一緒に発現される場合、組換え融合したヘモグロビン（rHb1.1，WO 90/13645に記載される）が形成される。すなわち、αグロビンは遺伝学的に融合され、そしてこれらのαグロビンは、天然に存在する結合ドメインを介してβクロビンと自発的にオリゴマー化する。したがって、本明細書に教示されるように、追加のオリゴマー化ドメインの導入は、高次のマルチマーヘモグロビンの形成を生じ得る。本発明のマルチマーヘモグロビンは、当業者に公知の任意の適切な精製方法によって精製され得る。本発明のヘモグロビンに有用な精製方法は、PCT公開WO 95 /14038（本明細書に参考として援用される）に教示される。簡単にいえば、これに記載の方法は、亜鉛のような２価金属イオンで荷電した、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー樹脂、次いでQ-SEPHAR0SEアニオン交換カラムを含む。この刊行物によれば、精製されるべき所望のHb含有物質を含む溶液は、最初に、プロトポルフィリンIX含有Hbを除去するために熱処理され得る。この基本的精製方法の後に、サイズ分離カラム（S-200）、次いで別のアニオン交換カラムがさらに続けられ得る。次いで、得られる溶液は、所望の処方物緩衝液中へ緩衝液交換され得る。アニオンおよびカチオン交換クロマトグラフィー技法を使用する他の適切な技法は、PCT公開第WO 90/13645号に記載される。本発明のマルチマーヘモグロビンは、インビトロまたはインビボでの適用に有用な処方物に使用され得る。このようなインビトロ適用は、例えば、インビトロで酸素レベルを維持することによる細胞培養物中の細胞増殖の増強のための、本発明のマルチマーヘモグロビンによる酸素送達を含む（DiSorboおよびReeves，P CT公開WO 94/22482、本明細書に参考として援用される）。さらに、本発明のマルチマーヘモグロビンは、酸素の除去を必要とする溶液から酸素を除去するために（BonaventuraおよびBonaventura，米国特許第4,343,715号、本明細書に参考として援用される）、そして分析アッセイおよび器械使用（Chiang，米国特許第 5,320,965号、本明細書に参考として援用される）ならびに当業者に公知の他のこのようなインビトロ適用のための参照標準として使用され得る。さらなる実施態様では、本発明のマルチマーヘモグロビンは、治療適用での使用のために処方され得る。本発明のマルチマーヘモグロビンに適切なこのような処方は、Milneら，WO 95/14038およびGerberら，PCT/US95/10232（両方とも参考として本明細書に援用される）に記載される。本発明の薬学的組成物は、例えば、皮下、静脈内、または筋肉内注射、局所または経口投与、血液代用物として有用な大容量非経口溶液などに有用であり得る。本発明の薬学的組成物は、経口もしくはエアロゾル投与による、経皮もしくは粘膜吸着による、または注射によるような、任意の従来の手段によって投与され得る。例えば、本発明のマルチマーヘモグロビンは、赤血球が使用される任意の適用において、赤血球の代用物として有用な組成物中で使用され得る。赤血球代用物として処方される本発明のこのようなマルチマーヘモグロビンは、血液容量が損失しそして液体容量もしくは酸素運搬能力のいずれかまたはその両方が置換されなければならない場合である、出血、外傷、および外科手術の処置に使用され得る。さらに、本発明のマルチマーヘモグロビンは薬学的に受容可能にされ得るので、本発明のマルチマーヘモグロビンは、酸素を送達する血液代用物としてだけでなく、大きなヘモグロビンタンパク質分子の存在による膨張圧を提供する単純な容量増量剤としても使用され得る。さらなる実施態様では、本発明のマルチマーヘモグロビンは、ヘモグロビンに基づく血液代用物の溢血を制限することが望ましい状況で使用され得る。したがって、本発明のマルチマーヘモグロビンは、赤血球代用物として酸素を輸送するために作用し得るが、過剰な溢血に関連し得る有害な効果を減少させ得る。さらに、特定のおよび制御された高分子量を有する本発明のマルチマーヘモグロビン（すなわち、トリマー、テトラマー、ペンタマーなど）が合成され得る。血液代用物としてのマルチマーヘモグロビンの代表的用量は、患者の体重１キログラム当たり10mg〜５グラム以上のマルチマーヘモグロビンであり得る。したがって、ヒト患者への代表的用量は、数グラムから350グラムより多くであり得る。必要な有効量は注射などのような多数投与の投与によって到達され得るので、各投薬形態の個々の用量に含まれる活性成分の単位含量が、それ自体で有効量を構成する必要がないことは理解される。投薬の選択は、利用される投薬形態、処置されるべき状況、および当業者の決定にしたがって達成されるべき特定の目的に依存する。マルチマーヘモグロビンの投与は、ヘモグロビン利用の目的に依存して数秒間から数時間の期間で生じ得る。例えば、酸素送達ビヒクルとして、投与の通常の時間経過は、できるだけ迅速である。血液置換物としてのヘモグロビン溶液についての代表的な注入速度は、約100ml〜3000ml／時間であり得る。さらなる実施態様では、本発明のマルチマーヘモグロビンは、貧血にかかっている患者に追加の酸素運搬能力を提供することによって、および造血を剌激することによっての両方により、貧血を処置するために使用され得る。造血を刺激するために使用される場合、ヘモグロビンの投薬量は、出血を処置するために必要とされ得る投薬量よりもずっと小さいので、投与速度はゆっくりであり得る。したがって、本発明のヘモグロビンは、患者への大容量のヘモグロビンの投与を必要とする適用に、ならびに本発明のマルチマーヘモグロビンのほんの少容量が投与される状況に使用され得る。血管系におけるマルチマーヘモグロビンの分布は、赤血球のサイズによって制限されないので、本発明のヘモグロビンは、赤血球が浸透できない領域へ酸素を送達するために使用され得る。これらの領域は、血栓、鎌状赤血球閉塞、動脈閉塞、血管形成用バルーン、外科的装置などの下流の領域のような、赤血球の流れに対する閉塞の下流に位置する任意の組織領域を含み得る。体内でのこの広い分布のため、本発明のヘモグロビンはまた、薬物を送達するためおよびインビボでのイメージングのために使用され得る。本発明のマルチマーヘモグロビンはまた、患者の血液が、外科手術の最後または回復の間の再注入のために取り出されそして貯蔵される、外科的手順の間に取り出される血液の置換物として使用され得る（急性正常血液量の血液希釈または血液増量(hemoaugmentation)）。さらに、本発明のマルチマーヘモグロビンは、供与される酸素運搬能力のいくらかを置換するために作用することによって、外科手術前に予め供与され得る血液の量を増加させるために使用され得る。正常な生理学的条件下では、酸化窒素は過剰量では産生されない。しかし、ある病状は過剰の酸化窒素産生に関連する。このような条件は、敗血症性ショックおよび低血圧を含む。これらの場合、本発明のマルチマーヘモグロビンは、過剰な酸化窒素を除去するために使用され得る。さらに、本発明のマルチマーヘモグロビンは、酸素送達が必要とされない適用に使用され得る。例えば、本発明のマルチマーヘモグロビンは、PCT公開第WO 93 /08842号（参考として本明細書に援用される）に記載されるように、薬物またはイメージング薬剤の送達のために使用され得る。本発明のマルチマーヘモグロビンは、高分子量のオリゴマーを形成し得、それゆえ、単独でまたは他の腫脹薬剤と組み合わせてのいずれかで、腫脹薬剤として使用され得る。さらに、本発明のグロビンはヘムを結合するので、これらはヘムが必要なインビボまたはインビトロシステムにそれを提供するために使用され得る。実施例以下の実施例は、本発明の範囲をいかなるようにも制限することを意図することなく、本発明の特定の実施態様を説明するために提供される。実施例１．７アミノ酸リンカーによって連結されるジ-ジ-α遺伝子構築物の構築（SGE939）Ａ．pTZ19U/705 変異体の構築 rHb1.1遺伝子を、BamHI/HindIII DNAフラグメントとしてpTZ19U（BioRad，Her cules，California）中にクローニングした。次いで、この構築物を、Hanahanプロトコル（Hanahan，J ．Mol．Biol.，166:557(1983)）の改変プロセスを使用して、CJ236 E.coli株（BioRad）中に形質転換した。Hanahan形質転換緩衝液は、4 5mM MnCl₂、60mM CaCl₂、40mM KOAc、620mMスクロース、15％グリセロール、および100mM塩化ルビジウムを含んだ。E．coli株の5ml培養物を、２×TYブロス中で単離したコロニーから開始し、そして一晩培養した。次いで、200mlの２×TY ブロスに、2mlの一晩培養物を接種し、そして37℃で激しく振盪しながら2.5時間インキュベートした。次いで、この培養物を２つの300ml遠心管に移し、そして氷上に15分間置いた。細胞を、8K rpm、４℃で１０分間の遠心分離でペレットにし、そして上清を流し出した。細胞を、80mlの形質転換緩衝液に穏やかであるが完全に再懸濁した。細胞を再度、8K rpm、10分間、４℃にてペレットにした。細胞を、20mlの氷冷した形質転換緩衝液に穏やかに再懸濁し、そして30〜60分間氷上に放置した。細胞を緩衝液中に等分して、20本の1mlチューブとした。細胞をドライアイス上で迅速に凍結し、そして−80℃で保存した。ウラシル置換を含む一本鎖DNAを単離し、そしてオリゴヌクレオチド特異的変異誘発を、Muta-gene Kit（BioRad，Hercules，CA）および標準的プロトコルを製造者の指示に従って使用して行った。２つのpTZ19U/705クローンを以下のように調製した。第１のpTZ19U/705クローンを、オリゴヌクレオチドJD29（ACC GTT CTG ACT AG T AAA TAC CGT TAA TGA[配列番号３]）を使用して調製した。このオリゴヌクレオチドは、ジ-αドメインの末端に独特のSpeI部位を生成した。第２のpTZ19U/70 5クローンを、オリゴヌクレオチドJD28（5'-GGA GGT TAA TTA ATG CTG TCT CCT GCA GAT-3'[配列番号４]）およびJD30（5'-CTG GTG GGT AAA GTT CTG GTT TGC G TT CTG-3'[配列番号５]）を使用して調製した。得られるクローンは、ジ-α遺伝子に独特のPstI部位を組込み、そしてβドメインにおけるSpeI部位を除去した。Ｂ．ジ-ジ-α遺伝子構築物のアセンブリージ-ジ-α遺伝子構築物のアセンブリーを、BamHI/SpeI酵素を使用する第１のpT Z19U/705クローンからのジ-α遺伝子カセットの除去、およびDNAフラグメントのゲル精製によって完了した。第２のpTZ19U/705クローンを、SpeI/BglII酵素で切断して、β遺伝子の5'末端を有する第２のジ-α遺伝子カセットを得、これも精製した。次いで、これらを、アニールしたオリゴヌクレオチドJAl13およびJAl14 とともにさらにライゲートして、２つのジ-αグロビンを連結する７アミノ酸融合ペプチドリンカーを有するジジ-αカセットを生成した。次いで、このジジ-αカセットを、rHb1.1遺伝子がBamHI/BglIIフラグメントとして除去されているpSGE705（PCT公開第WO 95/14038号に記載される、参考として本明細書に援用される）にBamHI/BglIIフラグメントとしてライゲートした。得られるジジ-αプラスミド（pSGE1000）を、上記のHanahanの改変プロトコルを使用してSGE1661（これもPCT公開第WO 95/14038号に記載される）に形質転換して、SGE939を生成した。２つの他のプラスミド、pSGE1006およびpSGE1008も、上記の同様の方法を使用して構築した。pSGE1006は、２つのジ-α領域を連結するリンカーをSpeI/PstIフラグメントとして切り出し、そして以下の配列の14アミノ酸リンカーをコードする合成した領域で置換した以外は、pSGE1000に対応する： pSGE1008を、置換リンカーが以下の配列の16アミノ酸リンカーであった以外は、 pSGE1006と同じ様式で生成した：実施例２．高コピープラスミドの構築（pSGE720） pSGE720の構築を２段階で行った。第１に、pUCの複製起点を導入してプラスミドpSGE715を生成した。次いで、lacI遺伝子をこのプラスミドから欠失し、そしていくつかの都合の良い制限部位を含む短いオリゴヌクレオチドで置換して、プラスミドpSGE720を生成した。Ａ．pSGE715 の構築 pUCの複製起点を導入して、pSGE508を介してプラスミドpSGE715を生成した。これは、塩基602での単一塩基対置換（Ｇ→Ａ）以外はpSGE509（PCT公開WO95/14 038に記載される）と同一である。この置換は、pBR322の複製起点をpUC19の複製起点に変化させる。プラスミドpSGE508およびpSGE705（pSGE705はPCT公開WO95/14038に記載される）を、製造者の指示（New England Biolabs.）に従って、制限酵素BamHIおよびH indIIIを用いて完全に消化した。プラスミドpSGE508を、最初にBamHIで完全に消化し、次いでHindIIIを添加し、そして消化を続けた。pSGE705消化物を、Promeg a Magic DNA Clean-upプロトコルおよび試薬（Promega，Madison，WI）で精製し、そしてさらに製造者の指示（New England Biolabs）に従って、BglIで完全に消化した。pSGE508およびpSGE705消化物の両方における酵素を、67℃にて10 分間の加熱によって不活性化し、次いでDNAをプールし、そしてPromega Magic D NA Clean-upプロトコルおよび試薬を使用して精製した。DNAをライゲーション緩衝液中に懸濁し、T4 DNAリガーゼを１つのアリコートに添加し、そしてDNAを16 ℃にて一晩インキュベートした。SGE1661細胞を、塩化ルビジウムを使用してHan ahanの方法によってコンピテントにし（Hanahan，D.，1985．DNA Cloning；A Pr actical Approach（Glover，D.M.編）第1巻，109-135頁，IRL Press，Oxford）、そしてHanahanプロトコルに従ってライゲーション混合物で形質転換した。形質転換体を、15g/mlテトラサイクリンを含むLBプレート上に細胞をプレーティングすることによって選択した。候補を、rHb1.1遺伝子の存在を決定するための制限消化およびpUCの複製起点を検出するための配列決定によってスクリーニングした。いくつかの候補を同定し、そして得られるプラスミドをpSGE715と命名した；E．coli株SGE1661中のpSGE715（ATCC受託番号55545）をSGE1453と呼んだ。Ｂ．pSGE720 の構築 lacI遺伝子を、以下の工程によってpSGE715から欠失し、そしていくつかの都合の良い制限部位を含む短いオリゴヌクレオチドで置換した。第１に、プラスミドpSGE715を、製造者の指示（New England Biolabs）に従って、制限酵素BamHI およびNotIで完全に消化した。pSGE715消化物を、Promega Magic DNA Clean-up プロトコルおよび試薬を使用して精製した。DNAを、アニールしたキナーゼ処理したオリゴヌクレオチド、CBG17＋CBG18と混合し、そしてライゲーション緩衝液中に懸濁した。 T4 DNAリガーゼを、１つのアリコートに添加し、そしてDNAを16℃にて一晩インキュベートした。SGE1821細胞を、塩化ルビジウムを使用してHanahanの方法によってコンピテントにし、そしてHanahanプロトコルに従ってライゲーション混合物で形質転換した。任意のコンピテント細胞がスクリーニングに使用され得た。形質転換体を、15g/mlテトラサイクリンを含むLBプレート上に細胞をプレーティングすることによって選択した。候補を、PstIおよびSmaIを使用して制限消化によってスクリーニングして、新しいリンカーの存在およびlacI遺伝子の非存在を検出し、そしてpUCの複製起点およびlacI遺伝子の非存在を検出するために配列決定した。いくつかの候補を同定し、そして得られるプラスミドをpSGE720と命名した。SGE1675中のプラスミドpSGE720を、SGE1464と表示した。SGE1675は、SG E1661とコンジェニックである：すなわち、SGE1675は、一連のP1形質導入によって導入されたlacIq¹対立遺伝子を含む。実施例３．高コピージジα構築物（SGE946）ジジ-αヘモグロビン遺伝子を含む第２のプラスミドを、ベクターとしてpSGE 720を使用して生成した。pSGE1000（実施例１に記載）からのジジ-α遺伝子カセットを、BamHI/HindIIIフラグメントとして取り出し、そしてゲル精製した。ベクターpSGE720も、BamHI/HindIIIで切断し、そしてrHb1.1遺伝子を取り出した。ベクターをゲル精製した。ジジ-αカセットをpSGE720ベクターにライゲートして、新しいベクターpSGE1004を得た。同じ手順を利用して、pSGE1006からのBa mHI/HindIIIフラグメントの除去およびpSGE715ベクターへの配置によって、14アミノ酸リンカーで連結されたジジ-α構築物の高コピー数型を作製して、ベクターpSGE1010を生成した。pSGE1008からのBamHI/HindIIIフラグメントを代わりに使用して、手順を３回繰り返して、16アミノ酸リンカーで連結されたジジ-αグロビンの高コピー型を生成した（pSGE1011）。実施例４．ジα-GCN4-ジα融合物（SGE954およびSGE955）改変したヘモグロビンを、プラスミドpSGE1012または1013を有するE．coli株S GE1661（ATCC受託番号55545）の発酵によって産生した。プラスミドpSGE1012を有する株SGE1661をSGE954と表示し、そしてプラスミドpSGE1013を有するSGE1661 をSGE955と表示した。pSGE1012および1013の構築を以下に記載する。材料。オリゴヌクレオチドを、Applied Biosystems DNA Synthesizer Model 3 92（Foster City，CA）で合成した。pSGE1012およびpSGE1013の調製に使用したオリゴヌクレオチドを表１に挙げる。制限エンドヌクレアーゼを、New England Biolabs(Beverly，Massachusetts)から購入し、そして製造者の仕様書に従って使用した。T4 DNA Ligaseを、New England BiolabsまたはGibco-BRL(Gaithersburg ，Massachusetts)のいずれかから購入し、そして製造者の仕様書に従って使用した。使用した培地は、J.H．Miller(Experiments in Molecular Genetics．Cold Sp ring Harbor Press,（1972）Cold Spring Harbor，NY)およびJ.H．Miller(A Sho rt Course in Bacterial Genetics.（1992）Cold Spring Harbor Press，Cold S pring Harbor，NY)に記載される。アクリジンオレンジ、アンピシリン、およびカナマイシン硫酸を、Sigma Chemical Co．(St．Louis，Missouri)から購入した。テトラサイクリンを、Aldrich Chemicals(Milwaukee，Wisconsin)から購入した。遺伝学的および分子生物学的手順。標準的細菌遺伝学的手順を、J.H．Miller( Experiments in Molecular Genetics.（1972）Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)およびJ.H．Miller(A Short Course in Bacterial Genetic s.（1992）Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY.)に記載のように行った。標準的分子生物学的手順を、Sambrook(Sambrookら，Molecular Cloni ng.（1989）Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)によって記載されるように行った。プラスミドDNA形質転換。プラスミドを、塩化カルシウム方法によってコンピテントにしたSGE1661細胞に形質転換した。以下に記載のDNAライゲーションを氷上に置いた。コンピテント細胞を添加し（0.2ml）、そして45分間インキュベートさせ、次いで細胞／DNA混合物に２分間42℃にて熱ショックを行った。1mlのL Bブロスを添加した後、細胞を37℃にて１時間インキュベートした。細胞をLB＋テトラサイクリン（15マイクログラム／ml）プレート上に広げ、そして37℃にて一晩インキュベートした。単離したコロニーを、組換えプラスミドの存在について分析した。表１．オリゴヌクレオチドクローニングカセットの構築。相補的リン酸化オリゴヌクレオチド（SAC67/SAC7 4；SAC68/SAC73；SAC69/SAC72；SAC70/SAC71）をアニールして、システイン含有カセットを生成し、そして相補的リン酸化オリゴヌクレオチド（SAC67/SAC74；S AC68/SAC73；SAC75/SAC76；SAC70/SAC71）をアニールして、システイン非含有カセットを生成した。オリゴヌクレオチドを、以下の手順によってアニールした：各リン酸化されたオリゴヌクレオチドの等モル量を、50マイクロリットルの20mM Tris-HCl pH7.5/2mM MgCl₂/50mM NaCl中で混合し、そして95℃にて５分間インキュベートした。オリゴヌクレオチド溶液を95℃から30℃へと60分間かけて冷却し、次いで氷浴に移した。次いで、アニールしたオリゴマーの対（SAC67/SAC74＋S AC68/SAC73；SAC69/SAC72＋SAC70/SAC71；およびSAC75/SAC76＋SAC70/SAC71）を、T4 DNAリガーゼで16℃にて一晩ライゲートして、２つのクローニングカセットの３つのクローニング半分を得た。最後に、２つのカセットを、T4 DNA リガーゼで16℃にて一晩、（SAC67/SAC74＋SAC68/SAC73）を（SAC69/SAC71＋SAC70/SAC 71）または（SAC75/SAC76＋SAC70/SAC71）のいずれかにライゲートすることによって構築した。完全なカセットを、オリゴヌクレオチドJD38（5'-CGCACTAGTAAAT ACCGTGGT-3'[配列番号22]）およびJD39（5'-CGCCTGCAGGAGACAGAACAC-3'[配列番号23]）を用いるポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。この増幅は、SpeI/Ps tIフラグメントとしての各カセットの別々のクローニングについて、２つの全長カセットのそれぞれから十分なDNAを生成した。消化したDNAカセットを、２％アガロースゲルでゲル精製し、そしてWizard DNAクリーンアップキット（Promega ，Madison，WI）によって精製した。pSGE1012 および1013の構築。最後のベクターを、２段階で構築して、GCN4ドメインのDNA配列決定を容易にした。第１のベクター、pBluescript（Stratagene，La Jolla Ca.）をSpeI/PstIで切断し、そしてベクターを１％アガロースゲルを使用してゲル精製した。ベクターDNAを電気溶出し、そしてWizard DNAクリーンアップキット（Promega）を使用して精製した。２つのDNAカセットを、25℃にて２時間、T4 DNAリガーゼでpBluescriptにライゲートした。連結物を、DH5αコンピテント細胞に形質転換した。サブクローンをGCN4カセットの存在についての制限分析によってスクリーニングした。GCN4/pBluescriptプラスミドを、Sequenasev 2 .0キット（United States Biochemical，Inc.,［USB］Cleveland，Ohio）でのジ -デオキシDNA配列決定によって、配列決定した。２つの正確なクローンを、SpeI /PstI制限酵素で切断し、そして194塩基対GCN4カセットを、１％アガロースゲルでゲル精製した。バンドをゲルから切り出し、電気溶出し、そしてWizard DNAクリーンアップキット（Promega）で精製した。上記の実施例３の上記のベクターpSGE1011を、SpeI/PstI制限酵素で切断して、ジジα融合ドメインを除去した。残りのベクターを１％アガロースゲルでゲル精製した。ベクターバンドを切り出し、電気溶出し、そしてWizard DNAクリーンアップキット（Promega）を使用して精製した。２つのGCN4カセットを、25℃ にて２時間、pSGE1011ベクターにライゲートした。SGE1661コンピテント細胞を、pSGE1011およびGCN4カセット（システインおよびシステインなし）の連結物で形質転換した。サブクローンを、制限分析によってGCN4カセットの存在についてスクリーニングした。ポジティブクローンを、LB＋テトラサイクリン（15マイクログラム／ml）上にストリークして単離した。単離したコロニーを使用して、種ストックを作製し、これを−80℃で凍結した。プラスミドを含む株を、SGE954＝ SGE1661＋pSGE1012（システインあり）およびSGE955＝SGE1661＋pSGE1013（システインなし）と表示した。上記のライゲートしたオリゴヌクレオチドによってコードされるGCN4オリゴマー化ドメインの最後のアミノ酸配列を以下に挙げる。制限酵素切断部位がそのコドンの中間にあり、それゆえクローニングに適切な付着末端を形成するコドンの一部のみがカセットによってコードされるので、オリゴヌクレオチドがその残基のコドンの一部のみをコードするので、末端アミノ酸は括弧内にあることに留意すること。 Cysを有するGCN4： Cysを有さないGCN4：Ｂ．発酵発酵槽接種物（２Ｌ振盪フラスコ中500mLブロス）発酵槽接種物を調製するために、種ストックを解凍した。種ストック（100μl ）を、１インチ回転振盪機（275〜300rpm）で８〜10時間37℃にてErlenmeyerフラスコ中の500mlのDM59で増殖させた。DM59培地は：3.34g/L KH₂PO₄、5.99g/L K₂ HPO₄、1.36g/L NaH₂PO₄・H₂O、1.95g/L Na₂HPO₄、および1.85g/L (NH₄)SO₄であり、滅菌されている。滅菌後、以下の最終濃度を得るために構成される痕跡量の金属溶液：917mg/Lクエン酸３カリウム、220mg/Lクエン酸３ナトリウム、185mg/ ml FeCl₃・6H₂O、14.8mg/ml ZnCl₂、2.2mg/ml CoCl₂・6H₂O、1.8mg/ml Na₂MoO₄・2H₂ O、18.6mg/L MnCl₂、44.7mg/mL CaCl₂・2H₂O、10.1mg/ml Cu(II)SO₄・5H₂O、および100.2mg/L H₃PO₄を溶液に添加し、フラスコに添加された場合、0.69g/Lクエン酸３カリウム、0.264g/Lクエン酸３ナトリウム、および0.379g/L MgSO₄・7H₂Oの最終濃度を得る。すべての濃度が発酵槽またはフラスコ中での最終濃度であることに留意すること。さらに、滅菌後に以下の成分を添加して、指示された最終濃度を達成した：9.4mg/Lテトラサイクリン、263mg/Lチアミン、およびポリプロピレングリコール2000。発酵槽（100Ｌ容量）次いで、2000mLの発酵槽接種物を、上記の54ＬのDM59培地を含む100リットルB iolafitte発酵槽に無菌的に（asceptically）移した。発酵槽を、30±１℃にて運転し、溶存酸素を20％に、そしてグルコースを０〜６g/Lに制御した。OD 30±２で、発酵槽の温度を26℃に低下させ、43.5mLの100m Mイソプロピルチオガラクトシド（IPTG）および73mLの50mg/mLヘミンを添加することによって、誘導を起こした。誘導後３時間目に、96mLの50mg/mLヘミンを添加し、誘導後６時間目に、125mLの50mg/mLヘミンを添加し、誘導後９時間目に、 125mLの50mg/mLヘミンを添加し、そして誘導後12時間目に、125mLの50mg/mLヘミンを添加した。採取およびさらなる精製は、誘導後16時間目に起きた。Ｃ．精製 Niro PANDA細胞破砕デバイス（Niro Hudson，Inc．Hudson，WI）を、発酵ブロスのホモジナイゼーションのために使用した。細胞を、800バールにセットしたホモジナイザーによる１回の通過によって溶解した。溶解産物にCOガスを散布し、72℃に11秒間加熱し、次いで回転ドラム真空フィルターを使用して澄明にした。澄明にした溶解産物のpHを、水酸化ナトリウムでpH8に調節し、そして十分なZ n(OAc)₂を添加して、Zn(OAc)₂が２〜４mMの溶液を作製した。次いで、澄明にした溶解産物をCUNO（Meriden，CT）装置で濾過した。クロマトグラフィー：すべての溶液は４℃であり、そして４℃にて正確なpHに調整した。1000mLのCh elating SEPHAR0SE fast flow樹脂（Pharmacia，Piscataway，New Jersey）を、４カラム容量（CV）の蒸留水での洗浄によって調製した。すべての工程でカラムを通過する流量は1000mL/分であった。樹脂を、２〜３CVの20mM Zn(OAc)₂、次いで２〜３CVの200mM NaClで装填した。溶解産物をカラムに載せ、そして１CVの20 mM Tris-HCl 50mM NaCl pH8.0；２CVの20mM Tris-HCl 500mM NaCl pH8.0；２CV の20mM Tris-HCl 50mM NaCl pH8.0；10CVの10mMイミダゾール50mM NaCl pH 7.2；４CVの20mMリン酸ナトリウム50mM NaCl pH6.5で洗浄した。次いで、結合したタンパク質を、20mM Tris-HCl 15mM EDTA pH8.0で溶出した。次いで、精製したタンパク質溶液を、約20mg/mLに濃縮し、そして30kD MWCO膜を装着したFiltro n Technology Corp.（Northborough，MA）ダイアフィルトレーション装置を使用して、緩衝液を６〜８CVの20mM Tris，pH8.5に交換して、1.1gmの部分精製融合タンパク質を得た。サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を、Sephacryl S-200 HRを詰めた、１メートルの長さがあるPharmacia（Piscataway，NJ）XK50カラムで行った。移動相はリン酸緩衝化生理食塩水（pH7.5）であり、そして流速を５m L/分に調節した。上記のIMAC工程からの180μgの部分精製融合タンパク質を、22 mLの容量でSECカラムに載せた。より大きなサイズのrHbを含む画分をプールし、そしてAmicon（Beverly，MA）Centriprep30濃縮器で濃縮して、84μgの融合タンパク質を得た。タンパク質分析および特徴付け。 SEC精製した融合タンパク質を集め、そしてVydac 5μ 0.46×25cm C4カラムを装着したHewlett Packard model 1090 HPLCで、移動相として水中（0.1％トリフルオロ酢酸）アセトニトリル（ACN）のグラジエントを使用するC4逆相高速液体クロマトグラフィーによって、グロビン鎖を分離した。75分のグラジエント溶出を、以下のように確立した：30％ACNで３分間、12分間にわたる30〜37％ACNの直線グラジエント、60分間にわたる37〜50％ACNの直線グラジエント。C4クロマトグラムは、それぞれ22分、38分、55分、58分、および60分に溶出する、５つの顕著なピークを示した。分離したグロビンを、エレクトロスプレー質量分析法（Ve stec，Inc.，Houston，Texas）によって分析した。22分に溶出するピークを、ヘムと同定した。38分に溶出するピークを、βグロビンと同定した（実測質量＝15 912、計算質量＝15913）。58分に溶出するピークは、予測されたジα-GCN4-ジα 融合ペプチドであった（実測質量＝66051、計算質量＝66026）。55および60分に溶出するピークは、解明可能なマススペクトルを与えなかった。55分と60分との間に溶出するピークを、Porton Automated Edmanシークエンサー（Porton Instr uments，Tarzana，CA）での10サイクルのＮ-末端アミノ酸配列決定によってすべて分析した。３つのすべてのピークは、αグロビンについて予測されたＮ-末端配列を与えた。Pharmacia SUPEROSE 12カラムで行った高性能サイズ排除クロマトグラフィー分析は、単一のrHb分子よりも大きい融合タンパク質の続きを示す。融合タンパク質およびrHb1.1についてのこのカラムの保持時間は、それぞれ20 .4分および25.2分である。実施例５．Ｃ-末端ジ-α-GCN4融合物（SGE947）遺伝子合成。以下のアミノ酸配列をコードする合成DNAカセットを合成した：SKYRは、ジαグロビンの最後の４つの残基をコードし、PKPSTPPGSSは、リンカー配列をコードし、そしてRLKQLED....KKLCGERは、酵母転写因子GCN4からの変異体コイルドコイルドメインをコードする。このGCN4コイルドコイル改変体では、コイルドコイルにおけるヘリックス間の疎水性界面を定義するすべての残基はLeu である（２つの隣接するヘリックス間に共有結合を作製するための手段を提供するために取り込まれる単一のCysを除いては）。DNAクローニングカセットを、pS GE1000または誘導体への挿入のためのSpeIおよびBspEI末端を有するように作製した。カセットを以下の合成オリゴマーから構築した：オリゴマーを、対（SAC51:SAC58、SAC52:SAC57、SAC53:SAC56、SAC54:SAC55）でアニールしてdsDNAオリゴマーを作製し、次に連続してアニールおよびライゲートしてカセットを形成した。カセットによってコードされるドメインのアミノ酸配列は、以下のとおりである：実施例４で論じたように、括弧内のＮ-末端残基が、制限部位のため、オリゴヌクレオチドによってコードされないことに留意すること。配列番号35の次の残基、SerLysTyrArgは、融合したジ-αグロビンの４つのＣ-末端残基であり、次いで変異体GCN4ドメインが続く。GCN4ドメインの後、カセットのDNAは、２つの停止コドンおよび翻訳されない「スペーサーDNA」領域をコードする。スペーサーDNA は、翻訳されるならば、残基SerArg次いで別の停止コドン、およびその後は残基：GlyGlyGlyLysTyr（配列番号64）をコードする。GCN4ドメインのＣ-末端の２つの停止コドンの後の、このスペーサーDNAは、XbaI部位続いてβグロビンの翻訳を開始するために使用されるリボソーム結合部位を含む。翻訳されない「スペーサーDNA」の後は、βグロビンの以下のＮ-末端をコードする領域である。MetHis LeuThr(ProGlu)（配列番号65）。また、括弧内のアミノ酸は、カセットの末端の制限部位の一部であり、したがって、これらのアミノ酸のコード領域は、カセットが適所にライゲートされるまで完成されない。カセットを、SpeI/BspEIフラグメントとして、SpeIおよびBspEIで切断されているpSGE1000にライゲートした（実施例４に記載のように）。形質転換体を同定し、そしてジαグロビン遺伝子の3'末端への改変GCN4コイルドコイル配列の融合物を含むプラスミドDNA（pSGE1005）を単離した。融合物の配列を、ジデオキシ配列決定（USBからのSequenase）によって確認した。pSGE1005を、E．coli発現株SGE1661に形質転換して、株SGE947を作製した。遺伝子発現。 SGE947を、実施例４に記載のように最少培地を使用して100Ｌ発酵槽中で30℃ にて増殖させた。30のOD₆₀₀で、55μM IPTGを発酵ブロスに添加して、融合タンパク質の発現を誘導した。誘導は、28℃の温度で10時間続けた。50mg/mLの濃度でのヘミンストックを、73mL 96mL、および125mLアリコートで、誘導の０、３、および６時間後に添加した。タンパク質精製。誘導期間の後、細胞を、Niroホモジナイザーを使用して溶解した。溶解産物に COガスを分散させ、72℃で11秒間加熱し、次いで回転ドラム真空フィルターを使用して澄明にした。澄明にした溶解産物を、CUNO装置（Meriden，CT）で濾過し、そしてZnで充填した固定化金属アフィニティーカラム（IMAC）に載せた。樹脂を結合した物質を、以下の緩衝液でこの順で洗浄した：20mM Tris-HCl 50mM NaC l pH8.0；20mM Tris-HCl 500mM NaCl pH8.0；20mM Tris-HCl 50mM NaCl pH8.0； 10mMイミダゾール50mM NaCl pH7.2；20mMリン酸ナトリウム50mM NaCl pH6.5。次いで、結合したタンパク質を、20mM Tris-HCl 15mM EDTA pH8.0で溶出した。溶出物を、Filtron（Filtron Technology Corp.，Northborough，MA）ダイアフィルトレーション装置を使用して、25〜50mg/mLに濃縮した。ヘモグロビンを、並行に連結したPharmacia（Piscataway，NJ）S-200およびS-300カラムでのサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によって分離した。適切な画分をプールして、そして緩衝液を、ダイアフィルトレーションによって20mM Tris-HCl pH8.8に交換した。SEC精製したタンパク質を、Q-SEPHAR0SE（Pharmacia）樹脂でのアニオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。CO-組換えヘモグロビン（C 0-rHb）を、高度に酸素化したリン酸緩衝化生理食塩緩衝液およびCENTRIPREP（A micon，Beverly，MA）濃縮器を使用するいくつかのサイクルの濃縮／希釈によって、17〜25mg/mLの最終濃度に、oxy-rHbに変換した。タンパク質分析および特徴付け。 SEC精製した融合タンパク質を集め、そしてVydac 5μ 0.46×25cm C4カラムを装着したHewlett Packard model 1090 HPLCでのC4逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)によって、グロビン鎖を分離した。タンパク質を、移動相として0 .1％トリフルオロ酢酸(TFA)を含む水中のアセトニトリル（ACN）のグラジエントを使用して分離した。75分のグラジエント溶出を、以下のように確立した：30％ ACNで３分間、12分間にわたる30〜37％ACNの直線グラジエント、60分間にわたる 37〜50％ACNの直線グラジエント。C4クロマトグラムは、それぞれ24分、45分、5 5分、および62分に溶出する、４つの顕著なピークを示した。分離したグロビンを、Vestec model ESMS（Houston，Texas）を使用するエレクトロスプレー質量分析法（ESMS）および自動化Ｎ-末端Edman配列決定（PI 2090Eアミノ酸シークエンサー，Porton Instruments，Tarzana，CA）によって分析した。 ESMS分析は、24分に溶出するピークがヘムであることを示した。45分に溶出するピークを、β-グロビンと同定した（実測質量＝15914、計算質量＝15913）。5 5分に溶出するピークは、未処理の融合ペプチドが、GCN4およびリンカー領域ならびにジαグロビンの４〜５アミノ酸を含んだ融合タンパク質のフラグメントに結合された、ジスルフィド結合した種であった（実測質量＝40837、アミノ酸配列決定によって同定したフラグメントについての計算質量＝40733および40834）。62分に溶出するピークは、グルタチオンに結合した融合ペプチド（実測質量＝ 35571、計算質量＝35558）および予測されたジスルフィド結合した融合タンパク質ダイマー（実測質量＝70525、計算質量＝70503）の混合物であった。Q-SEPHAR OSE精製したタンパク質の酸素親和性および協同性を、授与された特許5,028,588 に記載の方法を使用して、Hemox分析機（TCS Medical Products，Southampton， PA）を使用して37℃にて決定した。実測したＰ₅₀は、1.5のｎ_maxで9.0トルであった。Pharmacia SUPEROSE-12カラムで行った高性能SEC分析は、融合タンパク質が単一の組換えヘモグロビン分子よりも大きなタンパク質として溶出したことを示した。融合タンパク質およびrHb1.1についてのこのカラムにおける保持時間は、それぞれ21.6分および25.2分であった。実施例６ジ-α-テトラZIP GCN4融合物テトラZIP GCN4オリゴマー化ドメインについての合成遺伝子を、以下の通りであるテトラZIP GCN4ロイシンジッパー配列に基づいて設計した：テトラZIP GCN4ドメインを、以下のペプチドリンカーを介してジ-αグロビンのＮ-またはＣ-末端に融合した：GGSGGSGGSGG（配列番号67）。このGCN4コイルドコイル改変体では、ヘプタド反復の疎水性ａ位の残基はロイシンであり、そしてすべてのｄ位残基はイソロイシンである。クローニングカセットを、pSGEの誘導体への挿入のためのSpeIおよびXbaI末端を有するように作製した。Ｃ-末端融合遺伝子についての合成遺伝子を、合成オリゴマーからアセンブリーし、そしてジαグロビンのＣ-末端およびＮ-末端で独立してクローニングした。クローニングストラテジーは実施例４と類似した。分子生物学的技法および手順は、他に示してなければ実施例９に記載のとおりであった。Ｃ-末端テトラZIP GCN4オリゴヌクレオチド：相補的オリゴヌクレオチドを、ゲル精製し、リン酸化し、そしてアニールして、フラグメントEV173/174およびEV175/176を形成した。これらの２つのフラグメントをライゲートして、製造者の指示に従ってAmpliTaq PCR（Perkin-Elmer）キットを使用して、プライマーEV171およびEV172（各0.2μM）を使用して次にPCR 増幅されるフラグメントを形成した。PCRサイクル条件：95℃15秒間、60℃15秒間、72℃30秒間、25サイクル。増幅した産物をゲル精製し、そして配列分析のためのpBC SK＋にクローニングした。配列分析は、製造者の仕様書に従ってABI 自動化シークエンサーによって行った。正確なクローンを、SpeIおよびXbaIで消化し、そしてテトラZIP GCN4遺伝子を含むフラグメントをゲル精製した。フラグメントを、SpeI-XbaI消化したpSGE1103にクローニングし、COMPドメインをテトラZIP GCN4ドメインで置換した。PresbysterianβグロビンとのＣ-末端テトラZI P GCN4-ジα融合物を、pSGE1357と命名した。ジα-テトラZIP GCN4を含むpSGE13 57からのBamHI-BspEIフラグメントを、実施例４に記載のようにBamHI-BspEI消化したpSGE768にクローニングし、Providence(K82D)βとともにＣ-末端テトラZIP- ジαを同時発現するプラスミドを生成し、pSGE1538と命名した。このプラスミドをSGE1675に形質転換して、株SGE2960を生成した。Ｎ-末端テトラZIP GCN4 Ｎ-末端テトラZIPドメインDNAカセットを、以下のオリゴヌクレオチドからアセンブリーした：相補的オリゴヌクレオチドを、ゲル精製し、リン酸化し、そしてアニールして、フラグメントEV179/180およびEV181/182を形成した。２つのフラグメントをライゲートし、そして得られるフラグメントをゲル精製し、そして製造者の指示に従ってAmpliTaq PCRキット（Perkin-Elmer）を使用して、PCRプライマーEV177およびEVI78（各0.2μM）を使用して増幅した。増幅した産物をゲル精製し、そして配列分析のためのBamHI-HindIIIフラグメントとしてpBC SK＋にクローニングした。正確なDNA配列を有するクローンを、PacIおよびPstIで消化し、そしてテトラZIPドメイン遺伝子を含むフラグメントをゲル精製した。除去したBamHI部位の上流のPstI部位を有するpSGE1351（実施例９）の誘導体である、プラスミドpSGE 1176を、PacIおよびPstIで消化し、そして大きなフラグメントをゲル精製した。テトラZIPフラグメントおよびpSGE1176フラグメントをライゲートして、プラスミドpSGE1360を生成し、そしてSGE1675に形質転換して、株SGE2962を生成した。このプラスミドは、Providence(K82D)βグロビンを有するＮ-末端ジα-テトラZI P GCN4融合物をコードする。実施例７ジ-αWTGCN融合物。 GCN4からの野生型ロイシンジッパー配列を、実施例５に記載のジαGCN4融合物との比較のためにクローニングした。WTロイシンジッパーアミノ酸配列は以下である：ドメインを、以下のペプチドリンカーを介してジαグロビンのＣ-末端に融合した：ドメイン-リンカーコード配列を、合成DNAフラグメントとしてクローニングした。クローニングストラテジーおよび分子生物学的技法は、他に示してなければ実施例９に記載の通りであった。合成クローニングカセットを、以下のオリゴヌクレオチドからアセンブリーした：相補的オリゴヌクレオチドを、ゲル精製し、リン酸化し、そしてアニールして、フラグメントJE37/38、JE39/40、JE41/42、およびJE42/43を形成した。フラグメント37/38および39/40を一緒にライゲートし、そしてフラグメント41/42および43/44を一緒にライゲートした。ライゲートしたフラグメントをゲル精製し、そして２つのフラグメントをライゲートして１つのフラグメントを形成した。このフラグメントを、スピンカラム（Qiagen）によって精製し、そして製造者の指示に従ってAmpliTaq PCRキット（Perkin-Elmer）を使用して、プライマーJE66およびJE68（各１μM）で増幅した。PCRサイクル条件は：95℃15秒間、60℃15秒間、72℃15秒間、25サイクルであった。増幅した産物をスピンカラム精製し、そしてSpeIおよびXbaIで消化した。リンカー-GCN4コード配列を含むフラグメントをゲル精製し、そして実施例４に記載のようにSpeI-XbaI消化したpSGE1307とライゲートした。形質転換体を、配列分析（ABI自動化シークエンサー）によってスクリーニングし、そして正確なプラスミドをpSGE1318と命名した。このプラスミドは、Presbyterianβグロビンについての遺伝子を同時発現する。ジαグロビン-GCN4融合遺伝子を含む、pSGE1318からのBamHI-BspEIフラグメントを、実施例４に記載のようにBamHI-BspEI消化したpSGE768にサブクローニングして、Providence(K82D)βグロビンとともにジαWTGCN4融合タンパク質を同時発現するpSGE1320を生成した。SGE1675へのこのプラスミドの形質転換は、株SGE28 20を生成した。実施例８．ジα-p53融合物（SGE2802）Ａ．p53のテトラマー化ドメインに融合したrHb1.1の組換え産生のための細菌系の構築改変したヘモグロビンを、プラスミドpSGE1304を有する、上記のE．coli株167 5の発酵によって産生した。pSGE1304の構築を以下に記載する。プラスミドpSGE1 304を有する株SGE1675をSGE2802と表示した。他に示してない限り、実施例４に記載の技法を使用して、構築物を生成した。表２．オリゴヌクレオチドクローニングカセットの構築。相補的リン酸化オリゴヌクレオチド（SAC59/SA C66；SAC60/SAC65；SAC61/SAC64；SAC62/SAC63）を、以下の手順に従ってアニールした：各リン酸化オリゴヌクレオチドの等モル量を、20μlの20mM Tris-HCl p H7.5／2mM MgCl₂／50mM NaClに混合し、そして95℃にて５分間インキュベートした。オリゴヌクレオチド溶液を60分間かけて95℃から30℃に冷却し、次いで氷浴中に移した。次いで、アニールしたオリゴマーの対（SAC59/SAC66＋SAC60/SAC 65；SAC61/SAC64＋SAC62/SAC63）をT4 DNAリガーゼで16℃にて一晩ライゲートして、クローニングカセットの半分を２つ得た。最後に、T4 DNAリガーゼで２つの半分を16℃にて一晩ライゲートすることによって、カセットを構築した。カセットのアミノ酸配列は以下のとおりである： pSGE1304 の構築。 p53テトラマー化ドメインコード配列を、5'末端にSpeI部位および3'末端にBsp EI部位を有するように設計した。SpeI部位は、ジα遺伝子中にある；合成遺伝子は、αグロビンの最後の４つのアミノ酸、p53テトラマー化ドメイン、２つの翻訳終結コドン、およびβグロビンの最初の５つのアミノ酸をコードする。ライゲートしたカセットを、2.5％アガロースでの電気泳動によって精製した。予測された長さのクローニングカセットに対応する221bpフラグメントを切り出し、そしてジエチルアミノエチル（DEAE）膜（S&SNA45，Schleicher and Schuel l，Inc．Keene，NH）上への電気溶出によって単離した。フラグメントを、１M N aCl、0.1mM EDTA、20mM Tris-HCl pH8.0中で65℃にて膜から溶出し、そしてエタノール沈澱により回収した。次いで、フラグメントを、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（NEB）を使用してリン酸化し、そしてWizard DNAクリーンアップキット（P romega）によって精製した。クローニングベクターを、BspEIおよびSpeI（NEB）で約10μg pSGE1004を消化することによって調製した。約3600bpフラグメントを上記のようにDEAE膜でゲル精製し、そしてエタノールで沈澱させた。約100ngのベクターフラグメントを、約100ng p53フラグメントでライゲートした（NEB T4 DNAリガーゼおよび緩衝液）。ライゲーション混合物の10分の１を、製造者の指示（BTX，Inc.，San Diego，CA）に従って、BTX E.coli Transporato rを使用するエレクトロポレーションによって、市販の調製されたエレクトロコンピテントE．coli JS4（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）細胞に形質転換した。形質転換体を、制限分析によってp53合成遺伝子の存在についてスクリーニングした。正確なp53テトラマー化ドメイン遺伝子配列の確認を、製造者の指示（USB）に従ってSequenase v.2キットによって行った。正確なp53配列を含むプラスミドを、pSGE1304と命名し、そして産生株SGE1675に形質転換した。得られる形質転換体を、SGE2802と命名した。実施例４に従って増殖した振盪フラスコ培養物中のIPTGでのSGE2802の誘導の際の約39,000ダルトンのサイズのタンパク質の産生を、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定した。培養物を凍結し、そして実施例４に記載のように100L発酵槽のために保存した。タンパク質を精製し、そして実施例４に記載のようにクロマトグラフィーによって分離した。タンパク質の分析および特徴付け。 SEC精製した融合タンパク質を集め、そしてグロビン鎖を、上記のように移動相として水（0.1％TFA）中アセトニトリル（ACN）のグラジエントを使用してC4 逆相HPLCによって分離した。75分グラジエント溶出を以下のように確立した：30 ％ACNで３分間、12分間にわたる30〜37％ACNの直線グラジエント、60分間にわたる37〜50％ACNの直線グラジエント。C4クロマトグラムは、それぞれ22分、36分、および46分に溶出する、３つの顕著なピークを示した。分離したグロビンを、エレクトロスプレー質量分析法によって分析した。22分に溶出するピークはヘムである。36分に溶出するピークはβ-グロビンである（実測質量＝15911、計算質量＝15913）。46分に溶出するピークは、予測されたジα-p53融合ペプチドである（実測質量＝36291、計算質量＝36280）。Pharmacia SUPEROSE 12カラムで行ったHPSEC分析は、単一のrHb分子よりも大きな融合タンパク質の続きを証明した。融合タンパク質およびrHb1.1についてのこのカラムでの保持時間は、それぞれ21 .0分および25.2分である。SEC精製した融合タンパク質の粒子サイズを、NICOMP 370 HPL Submicron Particle Sizer（Santa Barbara，CA）を使用するレーザー光散乱によって決定した。融合タンパク質についての平均直径は10.9nmであった（代表的には5.5〜６nmであるrHb1.1と比較）。実施例９ジ-α-COMP融合物 COMPオリゴマー化ドメインについての合成遺伝子を、マウスドメインの公開されたアミノ酸配列から設計した（Efimovら，FEBS Letters 341（1994）54-58）：類似の遺伝子を、ヒトCOMPドメインのほとんど同一のアミノ酸配列から設計し得る（Newtonら，Genomics 24，435-439(1994)，Genbank accession # L32137）：ペプチド配列をコードするコドンを、制限酵素認識配列を操作するために使用されるコドン以外は、公開されたコドン使用頻度表（Sharpら，Nucleic Acids Res earch 16第17号，8207頁(1988)）に従ってE．coliでの発現のために最適にした。COMPドメイン-ジα融合遺伝子を調製することに使用したオリゴヌクレオチドを、表３に挙げる。他に示してない限り、すべての手順は実施例４に記載のようであった。表３．オリゴヌクレオチド配列（5'-3'）ジαグロビン-COMPオリゴマー化ドメイン融合タンパク質の発現のための４つの構築物を設計した。構築物は、実施例３に記載の高コピーpSGE715発現ベクターに基づいた。４つの構築物は以下のとおりである：ジαのアミノ末端に融合したCOMPドメインの２つの改変体： (1)公開されたCOMPドメインアミノ酸配列（Efimovら，FEBS Letters 341（199 4）54-58）、これは２つのシステインを含む、および (2)システインを置換するアラニン残基を有するCOMPドメイン。ジαのカルボキシ末端に融合したCOMPドメインの２つの改変体： (3)システインを有するCOMPドメイン、および (4)システインを置換するアラニンを有するCOMPドメイン。すべての構築物は、COMPドメインとジαグロビンとの間のリンカー配列の改変を可能にするための操作された制限部位を含んでいた。最初に使用されたリンカーは、(Gly-Gly-Ser)₃-Gly-Gly（配列番号63）であった。アミノ末端融合物：ゲル精製した相補的オリゴヌクレオチドを、10mM Tris-HC l pH8.0，1mM EDTA中でアニールした。等モル量のオリゴヌクレオチドを混合し、65℃まで15分間加熱し、37℃に15分間移し、次いで氷上で１時間保持した。アニールした相補的オリゴマーによって形成される二本鎖DNAフラグメントを、表４に挙げる：表４．フラグメントオリコ゛説明＃ヌクレオチド１ 21/22 アミノ末端ジ-α融合物のためのPacI→DraIIIフラグメント２ 23/24 DraIII→1/3 COMPペンタマー化ドメイン遺伝子３ 25/26 1/3→2/3 COMPペンタマー化ドメイン遺伝子４ 27/28 システインを有する2/3→BlpI COMPドメイン遺伝子（野生型）５ 29/30 2 Cys→Ala変異を有する2/3→BlpI COMPドメイン遺伝子６ 31/32 アミノ末端ジ-α融合物のためのBlpI→PstIフラグメント７ 33/34 カルボキシ末端ジα融合物のためのBlpI→BspEIフラグメント８ 48/49 カルボキシ末端ジα融合物のためのSpeI→DraIIIフラグメントアニールしたオリゴヌクレオチドを、製造者の仕様書に従ってNEBポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化した。COMP ペンタマー化ドメイン合成遺伝子のアセンブリー：フラグメントを、以下の工程でライゲートした（T4 DNAリガーゼ、NEB）：１．JE23/24＋JE25/26＋JE27/28（システインを含む） JE23/24＋JE25/26＋JE29/30（Cys→Ala）２．得られる175bp DNAフラグメントを、実施例８に記載のようにDEAE膜上にゲル精製した。３．各フラグメントを、フラグメント21/22および31/32とライゲートした。４．得られる247bpフラグメントを、実施例８に記載のようにゲル精製した。これらのフラグメントは、おのおの、5'末端にPacI付着配列および3'末端にPstI付着配列を含む。５．247bpフラグメントを、以下の構成成分を有する50μlの容量でポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した：250μM dNTP；0.2μM各プライマーJE50およびJE51 ；約50ngテンプレートフラグメント；５μl 10×Pfu反応緩衝液（Stratagene）、および１μl Pfuポリメラーゼ（Stratagene）。反応を、95℃での30秒間の変性、30秒間、60℃でのアニーリング、および30秒間、72℃での伸長を25サイクルで、Perkin-Elmer 9600サーモサイクラーで行った。６．増幅産物を、製造者の指示に従ってPromega Wizard PCR Cleanupキットを使用して精製した。７．精製したフラグメントを、PacIおよびPstIで消化し、そしてゲル精製した。クローニング： 20μg pSGE1010を、PacIおよびPstIで消化した。約4800bpフラグメントをゲル精製し、そしてH₂Oに溶解して約200ng/μlの濃度にした。アセンブリー工程７からの合成DNAフラグメントを、pSGE1010ベクターフラグメントにライゲートした。連結物を、形質転換によって、BRLから得たコンピテントなDH5 a細胞に導入した。形質転換手順： 1.7ml微量遠心管中の50μl凍結コンピテント細胞を、氷上で解凍した。約１μlのライゲーション混合物を添加した。混合物を、氷上に30分間保持し、37℃まで45秒間加熱し、そして氷に２分間戻した。950μlの室温LBを各混合物に添加し、そして培養物を、振盪しながら１時間37℃に置いた。100μlアリコートの培養物を、LB＋15μg/mlテトラサイクリンプレートにプレートし、そして37℃にて一晩インキュベートした。形質転換体を、正確なサイズの組換えフラグメントについての制限分析によってスクリーニングした；さらに、独特の内部制限部位は、診断目的のためにCOMP コード配列中に操作されている。システインを含む遺伝子は、NsiI部位を含み、そして制限分析によりNsiI部位を含まないCys→Ala変異体とは区別され得る。 DNA配列の確認を、製造者の指示に従って、USB Sequenase v.2キットを使用して完了させた。Ｎ-末端COMP-ジα発現プラスミドを、pSGE1308（WT COMP）およびpSGE1309（c ys--alaCOMP）と命名した。プラスミドpSGE1308および1309は、Presbyterian（N108K）βグロビンを含む。 Providence（K82D）βグロビン変異体でPresbyterianβを置換する２つの追加のプラスミドを構築した。720プラスミドバックグラウンド中にK82Dβグロビン遺伝子およびジαグロビン遺伝子を含むプラスミドpSGE768を、BamHIおよびBspEI で消化し、そして大きなフラグメントをゲル精製した。プラスミドpSGE1308およびpSGE1309を、BamHIおよびBspEIで消化し、そしてCOMP-ジα遺伝子を含むフラグメントをゲル精製した。1308および1309フラグメントを、K82Dβグロビン遺伝子を含むpSGE768フラグメントとライゲートした。得られるプラスミドを、配列分析によって確認し、そしてpSGE1351（WTCOMP）およびpSGE1352（cys→ala COM P）と命名した。カルボキシ末端融合物： pSGE1010を、SpeIおよびBspEIで消化し、そして大きなフラグメントをゲル精製した。上記のアミノ末端融合プラスミドから、DraIII -BlpIフラグメント（システインを有するおよび有さない）をゲル精製し、そしてアニールしたリン酸化合成フラグメント33/34および48/49とライゲートし、Sp eI-BSpEIフラグメントを生成した。ゲル精製したフラグメントを1010ベクターとライゲートして、２つのカルボキシ末端ジα-COMPドメイン融合タンパク質（１つはシステインを含むCOMP、そして１つはCys→Ala変異体COMP配列）をコードする２つのプラスミドを形成した。収率を増加させるため、および中間ベクターからの配列分析のためのクローニング部位を導入するために、SpeI-XbaIフラグメントを、製造者の指示に従ってP erkin-Elmer AmpliTaqキットを使用するPCRによって増幅した。プライマーJE64 およびJE55を、約0.5uMの濃度で使用した。PCR条件は、95℃15秒間；66℃15秒間；72℃30秒間、25サイクルであった。増幅した産物をゲル精製し、HindIIIおよびBamHIで消化し、そしてBamHI-HindIII消化したpBCSK+（Stratagene）とライゲートした。ライゲートしたDNAを、DH5αコンピテント細胞に形質転換し、そして形質転換体を、製造者の指示に従ってAmplicycle DNA配列決定キット（Perkin-E lmer）を使用する配列分析によってスクリーニングした。正確なフラグメントを、SpeIおよびXbaIで消化することによって単離し、そしてCOMP-ジαフラグメントをゲル精製した。pSGE1004の誘導体であるプラスミドpSGE1307を、SpeIおよび XbaIで消化し、そして大きなフラグメントをゲル精製した。２つのフラグメントをライゲートし、そしてE．coli株1675に形質転換した。得られるプラスミドおよび株を、それぞれpSGE1143およびSGE2944と命名した。 cys→ala Ｃ-末端ジα-COMP融合物を、以下のように構築した：pSGE1309からのBlpI-DraIIフラグメントを、AmpliTaqキットならびにプライマーJE64およびJE 65（各0.5μM）を使用して増幅した。PCRを、２段階サイクルで行った：95℃15 秒間、48℃15秒間、72℃15秒間、15サイクル、次いで95℃15秒間、55℃15秒間、 72℃15秒間、20サイクル。この反応からの増幅した産物を、PCRクリーンアップスピンカラム（Qiagen）上で精製し、そして上記のようにプライマーJE64および JE66で再増幅した。増幅したDNAフラグメントを、スピンカラム（Wizard PCR cl eanup，Promega）上で精製し、SpeIおよびXbaIで消化し、そしてゲル精製した。ゲル精製したフラグメントを、上記のpSGE1307の大きな精製フラグメントとライゲートし、そしてSGE1675に形質転換した。正確なジα-cys→alaCOMP融合クローンを、配列分析によって同定し、そしてpSGE1312と命名した。形質転換した株を、SGE2810と命名した。株SGE2944およびSGE2810は、Presbyterianβグロビンを有するジα融合物を発現する。Ｃ-末端ジα-COMP融合遺伝子を、上記のようにプラスミドpSGE768にクローニングして、Providence（K82D）βグロビンと同時発現させた。Providenceβを有するＣ-末端ジα-COMPは：WT COMP融合物：pSGE1314/SGE2813；cys→alaCOMP融合物：pSGE1315/SGE2814である。 PresbyterianβからProvidence（K82D）βへの変化は、Ｎ-末端構築物の発現に大きな効果を有さなかった；しかし、これは、＜1g/Lから＞1.4g/LへとＣ-末端構築物の発現を増加させた。実施例10 rHb1.1- アビジンハイブリッドタンパク質およびビオチン化デンドリマーとのカップリング。 rHb1.1- アビジンハイブリッドタンパク質の産生アビジンをコードする合成遺伝子を、Livnahら（1993，Proc．Natl．Acad．Sc i．90:5076）によって公開された一次アミノ酸配列に基づいて構築する。コドン使用頻度は、E．coliにおいて高度に発現される遺伝子での使用頻度を反映する。合成遺伝子を、適切なE．coli発現ベクター（例えば、その１つは実施例４に記載される）にクローニングし、そして任意の好都合な方法による部位特異的変異誘発を使用して、ビオチン結合に影響を与えることなくテトラマー化を崩壊させるアビジン遺伝子における変異を生成する。例えば、テトラマー化に重要な領域（Lys45-Thr55、Gln61-Asn69、Thr76、Val78、Thr80-Gln82、Leu93-Met96、およびLeu98-Ser102）を、ランダムに変異させ、そしてビオチン結合活性をまだ保持する約1000クローンを、テトラマー化の損失について再スクリーニングする。ビオチン結合を、ビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼでコロニーをプローブすることによってアッセイし得る。テトラマー化を、天然のままのゲル電気泳動を使用してタンパク質を分離すること、タンパク質をニトロセルロースに移すこと、そしてビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼでプローブすることによって、決定し得る。ビオチン結合およびマルチマーを形成できないことの両方を示すタンパク質をコードする遺伝子を、E．coli発現ベクター中のジαグロビン遺伝子の5 'または3'末端のいずれかに融合する。この構築物の発現は、２つのβグロビンと会合してアビジン-rHb1.1を形成する、アビジン-ジαグロビンを産生する。ビオチン化デンドリマーの産生ビオチンを、別々の数（すなわち、３、４、５など）のビオチン部分がともに結合されるが、アビジンへは接近可能なままであるように、活性化したマトリクスにカップリングする。例えば、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド活性化したビオチンを、水性緩衝液中でNHS-LC-ビオチン（Pierce Chemical Co.）をデンドリマーと反応させることによって、末端アミノ基を有するデンドリマー（Dendritech Inc.，Midland，Michigan）に直接カップリングし得る。反応を、別々の数のビオチンを各デンドリマーに架橋するように制御し、そしてデンドリマービオチン複合体を、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィーのような任意の適切な方法によって精製する。アビジン-rHb1.1とビオチン化デンドリマーとのカップリングアビジン-rHb1.1と適切な誘導体化デンドリマー（例えば、ビオチン化デンドリマー）とのカップリングを、約5:1のモル比のアビジン-rHb1.1：ビオチンでアビジン-rHb1.1を混合することによって完成する。これは、アビジン-rHb1.1で飽和した100％のビオチン部分を有するビオチン化デンドリマーを産生する。次いで、未反応のアビジン-rHb1.1をダイアフィルトレーションによって取り出し、そして将来のカップリング反応に使用するために回収し得る。実施例11 P22 Arc- ジα融合物。 P22 Arcリプレッサーは、溶液中でダイマーを形成する。そしてこれを、ダイマー化ドメインのアセンブリーがテトラマーヘモグロビンを形成するように、２つのジαグロビン遺伝子を融合するリンカーとしてクローニングした。クローニングストラテジーは、実施例４に記載の内部GCN4融合物について記載されたものと類似していた。分子生物学的技法は、他に示されない限り、実施例９に使用されるものと同様であった。 Arcドメイン遺伝子は、以下のタンパク質をコードする：Arcタンパク質を、Arcの各末端で同一のペプチドリンカーを介して２つのジαグロビン間で融合した：GGSGGSGGSGG（配列番号93）。合成Arc-リンカークローニングカセットを、以下のオリゴヌクレオチドからアセンブリーした：相補的オリゴヌクレオチドをゲル精製し、リン酸化し、そしてアニールしてフラグメントEV154AB、EV155AB、およびEV156ABを形成した。３つのフラグメントを一緒にライゲートし、ゲル精製し、そしてプライマーEV153およびEV152（各0. 5μM）ならびに製造者に指示に従ってAmpliTaq PCRキット（Perkin-Elmer）を使用して増幅した。PCRサイクル条件は、Perkin-Elmer 9600サーモサイクラー中で 95℃15秒間、60℃15秒間、72℃30秒間、25サイクルであった。PCR増幅した産物をゲル精製し、そして配列分析のためのBamHI-HindIIIフラグメントとしてpBCSK +にクローニングした。正確なリンカー-Arc-リンカードメインを、SpeI-PstIフラグメントとしてpBC SK+から切り出し、そしてSpeI-PstI消化したpSGE1000にライゲートし、Presbyterianβグロビンと同時発現した内部Arc-ジジα融合物を含むプラスミドpSGE1146を生成した。このプラスミドをSGE1464に形質転換して、株SGE2953を生成した。 Arc-ジジα遺伝子を含むpSGE1146からのBamHI-BspEIフラグメントを精製し、そしてProvidence（K82D）βグロビン遺伝子を含むpSGE768からのBamHI-BspEI とライゲートした。得られるプラスミドpSGE1148をSGE1675に形質転換して株SGE 2955を生成した。これは、ProvidenceβグロビンとともにArc-ジジαを発現する。実施例12 ジ-α P22 Mntリプレッサー融合物。独立したα-ヘリックステトラマー化ドメインを形成するバクテリオファージP 22 MntリプレッサーのＣ-末端ドメイン（残基52〜82）を、ジαグロビンのＣ-末端に融合した。Mntテトラマー化ドメインのペプチド配列は：SPVTGYRNDAERLADEQ SELVKKMVFDTLKDLYKKTT（配列番号102）である。ドメインを、ペプチドリンカー：GGSGGSGGSGG（配列番号103）を介してジαグロビンに融合した。リンカー-ドメインコード配列を、合成DNAフラグメントとしてクローニングした。クローニングストラテジーおよび分子生物学的技法は、他に示されない限り、本質的に実施例９に記載のとおりであった。合成遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドからアセンブリーした：相補的オリゴヌクレオチドをゲル精製し、リン酸化し、そしてアニールしてフラグメントJEMS1/MA3、JEMS2/MA2、およびJEMS3/MA1を形成した。３つのフラグメントを一緒にライゲートし、そして150bpフラグメントをゲル精製した。ゲル精製したフラグメントを、製造者に指示に従ってAmpliTaq PCRキット（Perkin-E lmer）を使用してプライマーJE66およびJE67（各1.0μM）で増幅した。PCR条件は：95℃15秒間、50℃15秒間、72℃15秒間、25サイクルであった。増幅した産物を、スピンカラム精製し（Qiagen）、そしてSpeIおよびXbaIで消化した。消化したフラグメントをゲル精製し、そして実施例９に記載のようにSpeI-XbaI切断したpSGE1307とライゲートし、そしてコンピテントSGE1675に形質転換した。正確なジα-Mntドメインコード配列を含む形質転換したプラスミドを、配列分析（ABI自動化シークエンサーモデル373A）によって同定した。ジα-Mnt融合物をP resbyterianβグロビンと同時発現するこのプラスミドを、pSGE1317、および株S GE2817と命名した。ジα-Mnt遺伝子を含むpSGE1317からのBamHI-BspeIフラグメントをゲル精製し、そしてProvidence（K82D）βグロビン遺伝子を含むpSGE768からの精製したBam HI-BspeIフラグメントとライゲートした。得られるプラスミドを、pSGE1319と命名し、そしてSGE1675に形質転換して、株SGE2819を生成した。この株は、Provid ence（K82D）βグロビンと同時発現したジα-Mnt融合タンパク質を産生する。実施例13結合ドメインを含むグロビンすべての株を、特許に記載のDM59培地を使用してBiolafitte 100L発酵槽中で増殖させた。誘導を、28℃にて16時間行った。誘導後、発酵ブロスを冷却し、次いで以下の記載のように採取した。この補遺に記載の株のすべては、βグロビン Providence変異を含む。この変異は、rHbの可溶性発現収量を増加させることが示されており、そして前臨床物質の迅速な回収および精製を援助するためにここに組み込まれた。いくつかの株では、他のβグロビン変異（例えば、Presbyteri an）も存在する。Ａ．SGE955 SGE955は、βグロビン中にPresbyterian変異を有するジα-GCN4-ジαグロビンを含むrHbである。SGE955は、テトラ-rHbを生じるように設計される。 (i)回収 Niro Panda^TM細胞破砕デバイス（Niro Hudson，Inc．Hudson，WI）を、発酵ブロスのホモジナイゼーションのために使用した。細胞を、800バールにセットしたホモジナイザーによる１回の通過によって溶解した。溶解産物にCOガスを分散させ、72℃で11秒間加熱した。溶解産物のpHを、水酸化ナトリウムでpH8に調整し、十分なZn(OAc)₂を添加して、Zn(OAc)₂中２〜４mMの溶液を作製し、綿状化剤（Magnafloc 573-C，American Cyanamid，Wayne NJ）を0.25％(v/v)まで添加し、そして溶解産物を｛Zn(OAc)₂中２〜４mMの溶液によって澄明にし、綿状化剤（ Magnafloc 573-C，American Cyanamid，Wayne NJ）を0.25％(v/v)まで添加し、そして溶解産物を｝遠心分離によって澄明にした。次いで、澄明にした溶解産物を、CUNO（Meriden，CT）装置で濾過した。 (ii)精製：すべての溶液は４℃であり、そして４℃にて正確なpHに調整した。2LのChelat ing Sepharose fast flow樹脂（Pharmacia，Piscataway，New Jersey）を、４カラム容量（CV）の蒸留水で洗浄することによって調製した。樹脂を、２〜３CV の20mM Zn(OAc)₂、次いで２〜３CVの200mM NaClで装填した。濾過して澄明にした溶解産物をカラムに載せ、そして１CVの20mM Tris・HCl 50mM NaCl pH8.0；２C Vの20mM Tris・HCl 500mM NaCl pH8.0；２CVの20mM Tris・HCl 50mM NaCl pH8.0； 10CVの10mMイミダゾール50mM NaCl pH7.2；４CVの20mMリン酸ナトリウム50mM Na Cl pH6.5で洗浄した。次いで、結合したタンパク質を、20mM Tris・HCl15mM EDTA pH8.0で溶出した。次いで、精製したタンパク質溶液を、約20mg/mLに濃縮し、そして30kDa MWCO膜を装着したFiltron Technology Corp．（Northborough，MA ）ダイアフィルトレーション装置を使用して、緩衝液を６〜８CVの20mM Tris・HC l，pH8.8に交換して、1.5gmの部分精製タンパク質を得た。種々のサイズのヘモグロビンを、平行に連結したPharmacia（Piscataway，NJ）S-200およびS-300カラムでのサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によって分離した。各SECカラムに、約6.5Lの指定された樹脂を充填した。カラムを、移動相として10mMリン酸塩 pH7.4，150mM NaCl（PBS）を使用して溶出した。7.5gmのタンパク質をカラムに載せた。適切な画分をプールし、そして緩衝液をダイアフィルトレーションによって20mM Tris・HCl pH8.8に交換して、3.0gmのオリゴマーrHbを得た。 SEC精製したタンパク質を、Zn(OAc)₂で装填した薄ベッドIMACカラムに結合し、次いで高度に酸素化された緩衝液を０℃にて７時間固定したrHb上に通すことによって再酸素化した。再酸素化後、タンパク質を、上記のようにEDTAで溶出し、そして濃縮し、そして20mM Tris・HCl pH8.9にダイアフィルトレーションした。酸素化したタンパク質を、Q-SEPHAROSE樹脂（Pharmacia，300mLカラム）での陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。2.5gmのタンパク質を、20mM Tris・HCl pH9.0中でカラムに載せた。カラムを３CVの20mM Tris・HCl pH9 .0で洗浄し、次いで20mM Bis-Tris pH6.8で溶出した。タンパク質（1.5gm）を、清浄な環境でのダイアフィルトレーションによって、エンドトキシンを含まない PBS中に31mg/mLの最終濃度で前臨床研究用に処方した。 (iii)タンパク質分析および特徴付け。最終精製した物質のグロビン鎖を、Vydac 5μ 0.46×25cm C4カラムを装着したHewlett Packard model 1090HPLCで、移動相として水中（両方とも0.1％トリフルオロ酢酸を含む）アセトニトリル（ACN）のグラジエントを使用するC4逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）によって、分離した。75分のグラジエント溶出を、以下のように確立した：30％ACNで３分間、12分間にわたる30〜37 ％ACNの直線グラジエント、60分間にわたる37〜50％ACNの直線グラジエント。C4 クロマトグラムは、それぞれ15.7分、40.8分、59.9分、および65.4分に溶出する、４つの顕著なピークを示した。分離したグロビンを、エレクトロスプレー質量分析法（Vestec，Inc.，Houston，TX）によって分析した。 ESMS分析は、15.7分に溶出するピークがヘムであることを示した。40.8分に溶出するピークを、β-グロビンと同定した（実測質量＝15913、計算質量＝15913 ）。65.4分に溶出するピークを、ジα-GCN4-ジαグロビンと同定した（実測質量＝66092、計算質量＝66036）。59.9分に溶出する広いピークは、明らかに、GCN4 ドメインおよびリンカー領域を含むがジαグロビンは１つだけを含むα融合タンパク質のフラグメントの異種混合物である。このピークは、おおよそ23％のαグロビン種を含む。連続して連結したPharmacia SUPEROSE-12およびSUPEROSE-6カラムで移動相としてPBSを用いて行った分析的SECは、SGE955タンパク質が単一の組換えヘモグロビン分子よりも大きなタンパク質として溶出することを示した。955タンパク質およびrHb1.1についてのこのカラムでの保持時間は、それぞれ48.8分および60.1 分であった。精製したヘモグロビンの粒子サイズを、NICOMP 370HPL SubmicronP article Sizer（PSS，Santa Barbara，CA）を使用するレーザー光散乱によって決定した。試料を、PBS中10mg/mLで分析した。955タンパク質の平均直径は、13. 2nmであった（モノ-rHbは6.0nmの平均直径を有する）。精製したタンパク質の酸素親和性および協同性を、発行された米国特許第5,02 8,588号に記載の方法を使用するHemox analyzer(TCS Medical Products，Southa mpton，PA)を使用して37℃にて決定した。実測したＰ₅₀は、2.1のｎ_maxで27トルであった。Ｂ．SGE2795 SGE2795は、βグロビンにおけるPresbyterianおよびProvidence（K82D）変異を有するジα-GCN4-ジαグロビンを含むrHbである。タンパク質は、各βグロビンサブユニットにおけるProvidence変異の存在によって、SGE955のタンパク質とは異なる。SGE2795のタンパク質は、テトラ-rHbを生じるように設計される。 (i)回収： SGE955についてＡ部に上記のように行った。 (ii)精製：すべての溶液は４℃であり、そして４℃にて正確なpHに調整した。2LのChelatin g Sepharose fast flow樹脂（Pharmacia，Piscataway，New Jersey）を、４カラム容量（CV）の蒸留水で洗浄することによって調製した。樹脂を、２〜３CVの20 mM Zn(OAc)₂、次いで２〜３CVの200mM NaClで装填した。濾過して澄明にした溶解産物をカラムに載せ、そして１CVの20mM Tris・HCl 50mM NaCl pH8.0；２CVの2 0mM Tris・HCl 500mM NaCl pH8.0；２CVの20mM Tris・HCl 50mM NaCl pH8.0；10CV の10mMイミダゾール50mM NaCl pH7.2；４CVの20mMリン酸ナトリウム50mM NaCl p H6.5で洗浄した。次いで、結合したタンパク質を、20mM Tris・HCl15mM EDTA pH8 .0で溶出した。次いで、精製したタンパク質溶液を、約20mg/mLに濃縮し、そして30kDa MWCO膜を装着したFiltron Technology Corp．（Northborough，MA）ダイアフィルトレーション装置を使用して、緩衝液を６〜８CVの20mMTris・HCl，pH 8.8に交換して、９gmの部分精製タンパク質を得た。種々のサイズのヘモグロビンを、平行に連結したPharmacia（Piscataway，NJ）S-200およびS-300カラムでのサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によって分離した。各SECカラムに、約 6.5Lの指定された樹脂を充填した。カラムを、移動相として10mMリン酸塩pH7.4 ，150mM NaCl(PBS)を使用して溶出した。6.5gmのタンパク質をカラムに載せた。適切な画分をプールし、そして緩衝液をダイアフィルトレーションによって20mM Tris・HCl pH8.8に交換して、3.6gmのオリゴマーrHbを得た。 SEC精製したタンパク質を、Zn(OAc)₂で装填した薄ベッドIMACカラムに結合し、次いで高度に酸素化された緩衝液を、固定化rHb上に０℃にて７時間通すことによって再酸素化した。再酸素化後、タンパク質を、上記のようにEDTAで溶出し、そして濃縮し、そして20mM Tris・HCl pH8.9にダイアフィルトレーションした。酸素化したタンパク質を、Q-SEPHAROSE樹脂（Pharmacia，700mLカラム）での陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。5.4gmのタンパク質を、20mM Tris・HCl pH8.9中カラムに載せた。カラムを３CVの20mM Tris・HCl pH8.9 で洗浄し、次いで20mM Bis-Tris pH6.8，15mM NaClで溶出した。タンパク質（3. 0gm）を、清浄な環境でのダイアフィルトレーションによって、エンドトキシンを含まないPBS中に50mg/mLの最終濃度で、前臨床研究用に処方した。 (iii)タンパク質分析および特徴付け。最終精製した物質のグロビン鎖を、Vydac 5μ 0.46×25cm C4カラムを装着したHewlett Packard model 1090HPLCで、移動相として水中（両方とも0.1％トリフルオロ酢酸を含む）アセトニトリル（ACN）のグラジエントを使用するC4逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）によって、分離した。75分のグラジエント溶出を、以下のように確立した：30％ACNで３分間、12分間にわたる30〜37 ％ACNの直線グラジエント、60分間にわたる37〜50％ACNの直線グラジエント。C4 クロマトグラムは、それぞれ27.4分、42.4分、および61.1分に溶出する、３つの顕著なピークを示した。さらに、61.1分ピークの面積の15％未満を含む広いピークも観察された。分離したグロビンを、エレクトロスプレー質量分析法(ESMS)(V estec，Inc.，Houston，TX)によって分析した。 ESMS分析は、27.4分に溶出するピークがヘムであることを示した。42.4分に溶出するピークを、β-グロビンと同定した（実測質量＝15902、計算質量＝15899 ）。61.1分に溶出するピークを、ジα-GCN4-ジαグロビンと同定した（実測質量＝66069、計算質量＝66036）。56.8分に溶出するピークは、明らかに、GCN4ドメインおよびリンカー領域を含むがジαグロビンは１つだけ含むα融合タンパク質のフラグメントの異種混合物である。連続して連結したPharmacia SUPEROSE-12およびSUPEROSE-6カラムで移動相としてPBSを用いて行った分析的SECは、SGE2795タンパク質が単一の組換えヘモグロビン分子よりも大きなタンパク質として溶出することを示した。2795タンパク質およびrHb1.1についてのこのカラムでの保持時間は、それぞれ48.0分および60 .1分であった。精製したヘモグロビンの粒子サイズを、NICOMP370HPL Submicron Particle Sizer（PSS，Santa Barbara，CA）を使用するレーザー光散乱によって決定した。試料を、PBS中10mg/mLで分析した。2795タンパク質の平均直径は、 13.8nmであった（モノ-rHbは6.0nmの平均直径を有する）。精製したタンパク質の酸素親和性および協同性を、発行された米国特許第5,02 8,588号に記載の方法を使用するHemox analyzer（TCS Medical Products，South ampton，PA）を使用して37℃にて決定した。実測したＰ₅₀は、2.0のｎ_maxで39トルであった。 (iv)循環半減期の決定雄性Sprague-Dawleyラットを、実験の４〜６日前に静脈カテーテルを長期的に器具装着した。rHbの350mg/kgの最高負荷用量を、実験群およびコントロール（r Hb1.1を受ける）群において各６匹のラットに、静脈内注入によって0.5mL/分の速度で投与した。注入後０、0.5、１、２、４、８、12、および24時間に、血液（0.3mL）をヘパリン処理チューブに尾静脈から採取し、そして遠心分離して血漿を分離した。血漿rHb濃度を、Hewlett-Packard model 8452A分光光度計を使用するシアンメト-Hb方法(cyanomet-Hb method)によって決定した（吸光係数を鉄分析によって独立して決定した）。一次指数方程式を使用して曲線をデータに適合させた。rHb1.1およびSGE2795は、2.8時間の同様の実測半減期を有した。Ｃ．SGE2948（ジα-p53融合物） SGE2948は、ヒトp53のテトラマー化ドメインにＣ-末端で融合したジαグロビンを含むrHbである。βグロビンは、Providence(K82D)変異を含む。SGE2948タンパク質は、テトラ-rHbを生じるように設計され、そしてβグロビン配列においてのみSGE2802タンパク質と異なる。 (i)回収溶解産物が、72℃よりもむしろ82℃に加熱されること以外は、上記のように行った。 (ii)精製：すべての溶液は４℃であり、そして４℃にて正確なpHに調整した。3LのChelat ing Sepharose fast flow樹脂（Pharmacia，Piscataway，New Jersey）を、４カラム容量（CV）の蒸留水で洗浄することによって調製した。樹脂を、２〜３CVの 20mM Zn(OAc)₂、次いで２〜３CVの200mM NaClで装填した。濾過して澄明にした溶解産物をカラムに載せ、そして１CVの20mM Tris・HCl 50mM NaCl pH8.0；２CV の20mM Tris・HCl 500mM NaCl pH8.0；２CVの20mM Tris・HCl 50mM NaCl pH8.0；1 0CVの10mMイミダゾール50mM NaCl pH7.2；４CVの20mMリン酸ナトリウム50mM NaC l pH6.5で洗浄した。次いで、結合したタンパク質を、20mM Tris・HCl15mM EDTA pH8.0で溶出した。次いで、精製したタンパク質溶液を、約20mg/mLに濃縮し、そして30kDa MWCO膜を装着したFiltron Technology Corp．（Northborough，MA）ダイアフィルトレーション装置を使用して、緩衝液を６〜８CVの20mM Tris・HCl ，pH8.8に交換して、85gmの部分精製タンパク質を得た。種々のサイズのヘモグロビンを、平行に連結したPharmacia（Piscataway，NJ）S-200およびS-300カラムでのサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によって分離した。各SECカラムに、約6.5Lの指定された樹脂を充填した。カラムを、移動相として10mMリン酸塩pH 7.4，150mM NaCl(PBS)を使用して溶出した。7.0gmのタンパク質をカラムに載せた。適切な画分をプールし、そして緩衝液をダイアフィルトレーションによって 20mM Tris・HCl pH8.8に交換して、3.1gmのオリゴマーrHbを得た。 SEC精製したタンパク質を、Zn(OAc)₂で装填した薄ベッドIMACカラムに結合し、次いで高度に酸素化された緩衝液を固定化rHb上に０℃にて７時間通すことによって再酸素化した。再酸素化後、タンパク質を、上記のようにEDTAで溶出し、そして濃縮し、そして20mM Tris・HCl pH8.9にダイアフィルトレーションした。酸素化したタンパク質を、Super-Q 650C樹脂（TosoHaas，Montgomeryville，PA，4 00mLカラム）での陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。6. 0gmのタンパク質を、20mM Tris・HCl pH8.9中カラムに載せた。カラムを８CVの20 mM Tris・HCl pH7.6で洗浄し、次いで20mM Bis-Tris pH6.8，15mM NaClで溶出した。タンパク質（2.4gm）を、清浄な環境でのダイアフィルトレーションによってエンドトキシンを含まないPBS中に48mg/mLの最終濃度で、前臨床研究用に処方した。 (iii)タンパク質分析および特徴付け。最終精製した物質のグロビン鎖を、Vydac 5μ 0.46×25cm C4カラムを装着したHewlett Packard model 1090HPLCで、移動相として水中（両方とも0.1％トリフルオロ酢酸を含む）アセトニトリル（ACN）のグラジエントを使用するC4逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）によって、分離した。75分のグラジエント溶出を、以下のように確立した：30％ACNで３分間、12分間にわたる30〜37 ％ACNの直線グラジエント、60分間にわたる37〜50％ACNの直線グラジエント。C4 クロマトグラムは、それぞれ25.4分、45.1分、および54.4分に溶出する、３つの顕著なピークを示した。分離したグロビンを、エレクトロスプレー質量分析法（ Vestec，Inc.，Houston，TX）によって分析した。 ESMS分析は、25.4分に溶出するピークがヘムであることを示した。45.1分に溶出するピークを、β-グロビンと同定した（実測質量＝15886、計算質量＝15886 ）。54.4分に溶出するピークを、ジα-p53グロビンと同定した（実測質量＝3633 7、計算質量＝36280）。連続して連結したPharmacia SUPEROSE-12およびSUPEROSE-6カラムで移動相としてPBSを用いて行った分析的SECは、SGE2948タンパク質が単一の組換えヘモグロビン分子よりも大きなタンパク質として溶出することを示した。2948タンパク質およびrHb1.1についてのこのカラムでの保持時間は、それぞれ49.2分および60 .1分であった。精製したタンパク質の酸素親和性および協同性を、発行された米国特許第5,02 8,588号に記載の方法を使用するHemox analyzer（TCS Medical Products，South ampton，PA）を使用して37℃にて決定した。実測したＰ₅₀は、2.05のｎ_maxで12. 9トルであった。 (iv)循環半減期の決定雄性Sprague-Dawleyラットを、実験の４〜６日前に、静脈カテーテルを長期的に器具装着した。rHbの350mg/kgの最高負荷用量を、実験群およびコントロール（rHb1.1を受ける）群において各６匹のラットに、静脈内注入によって0.5mL/分の速度で投与した。注入後０、0.5、１、２、４、８、12、および24時間に、血液（0.3mL）をヘパリン処理チューブに尾静脈から採取し、そして遠心分離して血漿を分離した。血漿rHb濃度を、Hewlett-Packard model 8452A分光光度計を使用するシアンメト-Hb方法によって決定した（吸光係数を鉄分析によって独立して決定した）。一次指数方程式を使用して曲線をデータに適合させた。rHb1.1およびSGE2948は、それぞれ2.8時間および4.9時間の実測半減期を有した。Ｄ．SGE2813（ジジα-COMP融合物） SGE2813は、ラット軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質（COMP）からのペンタマー化ドメインにＣ-末端に融合したジαグロビンを含むrHbである。この株におけるβグロビンは、Providence（K82D）変異を含む。SGE2813は、ペンタ-rHb を生じるように設計される。COMPペンタマー化ドメイン中には２つのCys残基が存在する。これらのCys残基は、天然の構造中に存在して、ペンタマーの共有安定化を提供し得る。 (i)回収溶解産物が、72℃よりもむしろ82℃に加熱されること以外は、上記のように行った。 (ii)精製：すべての溶液は４℃であり、そして４℃にて正確なpHに調整した。3LのChelatin g Sepharose fast flow樹脂（Pharmacia，Piscataway，New Jersey）を、４カラム容量（CV）の蒸留水で洗浄することによって調製した。樹脂を、２〜３CVの20 mM Zn(OAc)₂、次いで２〜３CVの200mM NaClで装填した。濾過して澄明にした溶解産物をカラムに載せ、そして１CVの20mM Tris・HCl 50mM NaCl pH8.0；２C Vの20mM Tris・HCl 500mM NaCl pH8.0；２CVの20mM Tris・HCl 50mM NaCl pH8.0； 10CVの10mMイミダゾール50mM NaCl pH7.2；４CVの20mMリン酸ナトリウム50mM Na Cl pH6.5で洗浄した。次いで、結合したタンパク質を、20mM Tris・HCl15mM EDTA pH8.0で溶出した。次いで、精製したタンパク質溶液を、約20mg/mLに濃縮し、そして30kDa MWCO膜を装着したFiltron Technology Corp．（Northborough，MA ）ダイアフィルトレーション装置を使用して、緩衝液を６〜８CVの20mM Tris・HC l，pH8.8に交換して、50gmの部分精製タンパク質を得た。種々のサイズのヘモグロビンを、平行に連結したPharmacia（Piscataway，NJ）S-200およびS-300カラムでのサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によって分離した。各SECカラムに、約6.5Lの指定された樹脂を充填した。カラムを、移動相として10mMリン酸塩pH 7.4，150mM NaCl(PBS)を使用して溶出した。10gmのタンパク質をカラムに載せた。適切な画分をプールし、そして緩衝液をダイアフィルトレーションによって20 mM Tris・HCl pH8.8に交換して、4.3gmのオリゴマーrHbを得た。 SEC精製したタンパク質を、Zn(OAc)₂で装填した薄ベッドIMACカラムに結合し、次いで高度に酸素化された緩衝液を固定化rHb上に０℃にて７時間通すことによって再酸素化した。再酸素化後、タンパク質を、上記のようにEDTAで溶出し、そして濃縮し、そして20mM Tris・HCl pH8.9にダイアフィルトレーションした。酸素化したタンパク質を、Super-Q 650C樹脂（TosoHaas，Montgomeryville，PA，5 00mLカラム）での陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。9. 0gmのタンパク質を、20mM Tris・HCl pH8.9中カラムに載せた。カラムを４CVの20 mM Tris・HCl pH7.6で洗浄し、次いで20mM Bis-Tris pH6.8，15mM NaClで溶出した。タンパク質（4.6gm）を、清浄な環境でのダイアフィルトレーションによってエンドトキシンを含まないPBS中に52mg/mLの最終濃度で、前臨床研究用に処方した。 (iii)タンパク質分析および特徴付け。最終精製した物質のグロビン鎖を、Vydac 5μ 0.46×25cm C4カラムを装着したHewlett Packard model 1090HPLCで、移動相として水中（両方とも0.1％トリフルオロ酢酸を含む）アセトニトリル（ACN）のグラジエントを使用するC4逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）によって、分離した。75分のグラジエント溶出を、以下のように確立した：30％ACNで３分間、12分間にわたる30〜37 ％ACNの直線グラジエント、60分間にわたる37〜50％ACNの直線グラジエント。C4 クロマトグラムは、それぞれ26.5分、43.0分、59.9分、および61.2分に溶出する、４つの顕著なピークを示した。分離したグロビンを、エレクトロスプレー質量分析法（Vestec，Inc.，Houston，TX）によって分析した。 ESMS分析は、26.5分に溶出するピークがヘムであることを示した。43.0分に溶出するピークを、β-グロビンと同定した（実測質量＝15886、計算質量＝15886 ）。59.9分および61.2分に溶出するピークは、ジα-COMPグロビンについて予測されたよりもおおよそ600amu大きい質量を有する（実測質量＝それぞれ38672および38671、計算質量＝38076）。この余分な質量は、おそらく、グロビンへの２つのグルタチオン部分の付加である（COMP配列中に２つのCys残基が存在することを思い起こすこと）。連続して連結したPharmacia SUPEROSE-12およびSUPEROSE-6カラムで移動相としてPBSを用いて行った分析的SECは、SGE2813タンパク質が単一の組換えヘモグロビン分子よりも大きなタンパク質として溶出することを示した。2813タンパク質およびrHb1.1についてのこのカラムでの保持時間は、それぞれ47.7分および60 .1分であった。精製したタンパク質の酸素親和性および協同性を、授与された特許第5,028,58 8号に記載の方法を使用するHemox analyzer（TCS Medical Products，Southampt on，PA）を使用して37℃にて決定した。実測したＰ₅₀は、1.3のｎ_maxで5.5トルであった。 (iv)循環半減期の決定雄性Sprague-Dawleyラットを、実験の４〜６日前に、静脈カテーテルを長期的に器具装着した。rHbの350mg/kgの最高負荷用量を、実験群およびコントロール（rHb1.1を受ける）群において各６匹のラットに、静脈内注入によって0.5mL/分の速度で投与した。注入後０、0.5、１、２、４、８、12、および24時間に、血液（0.3mL）をヘパリン処理チューブに尾静脈から採取し、そして遠心分離して血漿を分離した。血漿rHb濃度を、Hewlett-Packard model 8452A分光光度計を使用するシアンメト-Hb方法によって決定した（吸光係数を鉄分析によって独立して決定した）。一次指数方程式を使用して曲線をデータに適合させた。rHb1.1およびSGE2813は、それぞれ2.8時間および3.9時間の実測半減期を有した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者カーウィン，ブルースエイ. アメリカ合衆国コロラド 80026，ラファイエット，オーバーランドコート 133 (72)発明者オリンズ，ピーターオー. アメリカ合衆国コロラド 80026，ラファイエット，グースヘブンドライブ 10625 (72)発明者マシューズ，アントニージェイ. アメリカ合衆国コロラド 80027，ルイスビル，ダブリュー．ローカストコート 673

Claims

【特許請求の範囲】１．天然に存在しない結合ドメインを有するグロビンであって、ここで、該結合ドメインは、主として非共有相互作用を介して自発的にリガンドまたは他のペプチド配列と会合するペプチド配列であり、そしてオリゴマーを形成し得る、グロビン。２．前記天然に存在しない結合ドメインが、オリゴマー化ドメインである、請求項１に記載のグロビン。３．前記グロビンが、融合したグロビンである、請求項１に記載のグロビン。４．前記オリゴマー化ドメインが、p53、COMP、Arc、Mnt、BMP、BLS、GCN4、およびGCN4誘導体からなる群より選択される、請求項２に記載のグロビン。５．前記結合ドメインがリガンド結合ドメインである、請求項１に記載のグロビン。６．前記リガンド結合ドメインが、非ペプチド化合物を結合する、請求項５に記載のグロビン。７．前記非ペプチド化合物がビオチンである、請求項６に記載のグロビン。８．グロビンから構成されるマルチマーヘモグロビンであって、少なくとも１つの該グロビンが、請求項１に記載の天然に存在しない結合ドメインを含む、マルチマーヘモグロビン。９．前記グロビンが組換え宿主細胞によって発現される、請求項１に記載のグロビン。１０．前記組換え細胞が非赤血球細胞である、請求項９に記載のグロビン。１１．前記非赤血球細胞がE．coliである、請求項１０に記載のグロビン。１２．マルチマーヘモグロビンを含む組成物であって、該マルチマーヘモグロビンは、請求項１に記載の少なくとも１つの天然に存在しない結合ドメインを有する少なくとも１つのグロビンから構成される、組成物。１３．請求項１に記載のグロビンをコードする核酸配列を含む、核酸分子。１４．請求項１に記載の天然に存在しない結合ドメインを有するグロビンを製造する方法であって、（a）該グロビンをコードする核酸配列を得る工程；および（b）適切な宿主細胞中で該グロビンを発現させる工程、を包含する、方法。１５．請求項１４に記載の方法であって、（c）前記グロビンを他のグロビンと接触させてマルチマーヘモグロビンを形成させる工程、をさらに包含する、方法。