JPH02119793A - 新規ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規なポリペプチドに関する。

本発明のポリペプチドは、インターロイキン１β（ＩＬ
−１β）に認められるのと同様の生理作用を有している
が、その作用が改良されており、医薬として有用である
。

（従来の技術） 生体内に異物１例えば細菌やウィルスの侵入が起こった
場合には、侵入局所での炎症反応が引き起こされ、さら
には免疫応答による生体防御反応が誘導される。これら
一連の生体反応に関馬する物質として、マクロファージ
より産生される因子が注目され、その生物学的作用の違
いより、リンパ球活性化因子、Ｂ細胞活性化因子、ある
いは内因性発熱物質等と呼ばれていたが、互いに物理化
学的性質が類似しているので。

ＸＬ−１として統一し呼称された。

ＩＬ−１は、当初単球、マクロファージ、あるいは単球
性白血病株から産生されるとされたが、その後皮膚ケラ
チノサイト、脳の星状細胞。

グリア細胞、腎糸球体メザンギウム細胞、眼の角膜細胞
等、多くの組織由来の細胞から産生されることが明らか
になるにつれ、その多彩な役割が注目されてきた。

ＩＴ、−−１およびその前駆体をコードする２種類の遺
伝子がクローニングされ、その全アミノ酸配列も決定さ
れた（ＩＬ−１αと■Ｌ−１β）［Ｎａｔｕｒｅ　３１
２．４５８（１，９８４）　；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｊ、ＵＳＡ、　８１．７９０７（１９８４）；　Ｎ
ａｔｕｒｅ　３１５゜６４１（１９８５）　；　Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　　１３．５８６９（１
９８５）］。

現在では遺伝子組み換え法により大量に、かつ均一なＩ
Ｌ−１が得られるようにな、ｊ）、ＩＬｌの多様な生物
学的作用が認められてきた。

その主な作用としての抑制や完全退縮が認められること
［Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ＋、り匝、　３０９８　（１９８
６）、　Ｊｐｎ。

Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　１ｍｍｕｎｏ１．９．３３０　（１
，９８６）　］、放射線障害防止作用［Ｊ、１ｍｍｕｎ
ｏ１．１３６．２４８３（１９８６）］、　　日和見感
染に対する防御作用［１ｎｆｅｃｔ−１ｍｍｕｎ、　５
５゜１４３６（１９８７）］が知られているほか、ＩＬ
−１は内因性発熱物質であること、また結合組織系細胞
、即ち滑膜細胞や線維芽細胞からのプロスタグランジン
Ｅ２（ＰＧＥ２）の産生先進作用を有していることが報
告されている。才だ最近では。

ＩＬ−１は線維芽細胞の堆殖を促進することから動脈硬
化の増悪に関与するとの報告や、β細胞破壊活性を有す
ることから糖尿病の発症に関与するとの可能性も示唆さ
れている［　５ｃｉｅｎｃｅ２３９、２５７（１９８７
）］。

ＩＬ−１のこのような多彩な生物活性は、ある種の疾病
の治療に対して障害的に働くこともあり、ＩＬ−１の医
薬としての利用を複雑にしている。

最近、いくつかのＩＬ−１α誘導体（特開昭６２−１８
５０９７）や、ＩＬ−１β誘導体（特開昭６３−１５２
３９８）が報告され、ＩＬ−１の作用の改善が試みられ
ている。

（発明が解決しようとする課題） 本発明者らは、かかる技術水準下に種々研究した結果、
下記一般式で表わされるアミノ酸配列を有する新規ポリ
ペプチドが、天然のヒトＩＬ−１βと比較して改良され
たＩＬ−１活性を有し、医薬品として有用に使用できる
ことを知り１本発明を完成した。

Ｒ−Ａ　１　ａ−Ｐ　ｒｏ−Ｖａｌ　−Ａ　ｒｇ−８ｅ
　ｒ−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　５ｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈ　ｒ−Ｌｅ
ｕ−Ａｒｇ−Ａ　５ｐ−３ｅｒ　−Ｇ　ｉｎ　−Ｇ　１
ｎ−Ｌｙｓ−８ｅ　ｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ　−Ｍｅ　ｔ　
−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ　−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ
−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＨｉｓＬｅｕ−Ｇｉｎ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｍｅｔ−Ｙ−Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−Ｖａ
ｌ、−ＶａｌＰｈｅ−８ｅｒ−Ｍｅｔ−８ｅｒ−Ｐｈｅ
−Ｖａｌ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＧｌｕＳｅｒ−Ａ
ｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌ
ａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇ　１ｕ−Ｌｙ
ｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｃｙｓ
Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−８ｅ
ｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ
−Ｐｒ。

Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＰｈｅＡｓｎ−Ｌｙｓ−１１ｅ
−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−
ＧｌｕＰｈｅ−Ｇｌｕ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｈ
ｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒｌ　１ｅ−３ｅｒ
−Ｔｈｒ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−
Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＧｌｎＡｓｐ
−］　］１ｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＴｈｒＭｅｔ
−Ｇｉｎ−Ｐｈｅ−ＹａＩ−３ｅｒ （上記一般式中、ＲはＮ末端が水素原子であるか又はＭ
ｅｔであることを、Ｘ、ＹおよびＺは単なる結合である
か又は、同一または異なって。

蛋白質を構成する任意のα−アミノ酸であることを意味
する。ただし、　ｘ、　ｙおよびＺの組合せが夫々Ａｓ
ｐ、　ＧｌｕおよびＳｅｒである場合を除く。）ここに
、上記アミノ酸配列のＸ、ＹおよびＺの位置は、ＩＬ−
１βにおけるアミノ酸配列の夫々３５位、３７位および
１５２位に相当する部位に位置している。

最近、ヒトのＩＬ−１βが結晶化され、Ｘ線解析により
その立体構造が明らかにされた［ＥＭＢＯ，Ｊ、７，３
３９（１，９８８）］が、これによると。

ＩＬ−１βは、１２本のβ−８’ｈ　ｅ　ｅ　ｔを構成
するアミノ酸と、それを連絡するαループを構成するア
ミノ酸の部分からなり、２本の逆平行なβ５ｈｅｅｔの
組が１辺を成す四面体構造を呈している。更には、ＩＬ
−１βの活性部分として想定されでいるアミノ酸配列［
Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３７．３２０１（１，９８
６）　］が、４番目のβ−８ｈｅｅｔの後半から５番目
のβ−８ｈｅｅｔの前半部分を構成している［蛋白質・
核酸・酵素、　　３３．１７９３（１９８８）］ことが
示唆されている。

本発明者等はこの点に着目し、３番目と４番目のβ−８
ｈｅｅｔを連絡し、かつ四面体の頂点の１つを構成する
αルー１部分を改変することにより、活性部分の立体構
造に変化をもたらしめ。

かつ改良された■Ｌ−１活性が得られるか否か種々検討
した。

その結果、そのαループ部分を構成するアミノ酸のうち
、３５位のＡｓｐと３７位のＧｌｕの疎水性を改善する
ことにより、改良されたＩＬ−１活性を有するＩＬ−１
β誘導体を得ろことに成功した。

本発明のポリペプチドにおけるＸおよびＹは。

３番目と４番目のβ−８ｈｅｅｔを連絡するαループ部
分の構成アミノ酸部位に位置している。

つぎに、　　Ｘ、　ＹおよびＺについて更に説明すると
、これらの特定部位のアミノ酸は、ＩＬ−１βにおける
この部位のアミノ酸以外のものであれば特に制限はない
。好適なアミノ酸としては、中性アミノ酸の中から選択
される。Ｘ位のアミノ酸としては、たとえばＡｓｎ、　
Ａｓｐ、　ＡｌａおよびＳｅｒであり、Ｙ位のアミノ酸
としては、たとえばＧｌｕ、　ＧｉｎおよびＳｅｒであ
り、さらに２位のアミノ酸としては、たとえばＳｅｒお
よびＡｒｇなどで゛ある。

上記一般式に含捷れる本発明の新規ポリペプチドの代表
的なものを挙げるとつぎの通りである。

（効果） 本発明の新規ポリペプチドは、ＩＬ−１βに認められる
のと同様の薬理作用を有しているが。

幾つかの作用については選択性があり、その作用が改善
されている。すなわち２本発明の新規ポリペプチドは、
リンパ球活性化作用、インク−ロイキン２（ＩＬ−２）
の産生亢進作用、抗体産生の増強やコロニー刺激因子（
Ｃ３Ｆ）産生光通作用等免疫系細胞に対する作用の増大
２発熱作用の減少やＰ　Ｇ　Ｅ２産生九充進用の減少な
どで改良されたＩＬ−１活性を示すことができる。

さらに２本発明の新規ポリペプチドは、ＩＬｌと同様マ
クロファージ、血管内皮細胞や線維芽細胞などからのＣ
８Ｆ産生を促進し［Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　８１．９２（１９８８）　；Ｂｌｏｏ
ｄ　６８．１３１６（１９８６）］。

かつ放射線障害防止作用を有していることから。

化学療法剤治療や放射線治療後の顆粒球減少症や放射線
障害防止に有用であり、−！だ２日和見感染に対する抗
感染剤、抗炎症剤としても有用である。

更に２本発明の新規ポリペプチドは、他の生理活性物質
、化学療法剤や免疫増強剤と併用して用いることにより
その治療効果を高めることができろ。例えば、ＩＬ−２
，腫瘍壊死因子（ＴＮＦα、ＴＮＦβ）ヤインターフェ
ロンーガンマ（ＩＦＮγ）等と併用することにより、免
疫増強作用や抗腫瘍作用に於て、相加並びに相乗効果が
認められる。化学療法剤や免疫増強剤等と併用すること
により、その抗腫瘍効果を増強し、かつ副作用を低減せ
しめることができる。寸だ、５−ＦＵによる造血障害に
対して、Ｇ−Ｃ８Ｆとの併用により相乗的に回復作用を
果たすことや牌臓中のコロニー形成能の増強作用を有す
ることが期待できる［Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．１４０．
３８３０（１９８８）］。

本発明の新規ポリペプチドにおいて、少なくともＸ位が
単結合であるもの、あるいはＡｓｎ。

Ａｒｇ＋　Ａｌａ等のα−アミノ酸であるものは、天然
のＩＬ−１に比較して高い活性を示す。

（製造方法） 本発明の新規ポリペプチドは５例えば遺伝子工学的手法
により製造することができる。すなわち。

前記本発明に係わる特定のポリペプチドをコードする遺
伝子を利用し、これを微生物のベクターに絹込んで該微
生物細胞内で、複製、転写、翻訳させることによって製
造することができる。

上記方法において用いられる遺伝子は８通常の合成法２
例えばホスファイト・トリエステル法［Ｎａｔｕｒｅ、
　３１０．１０５　（１，９８４，）］あるいはホスフ
ォアミダイト法［Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、
２２．１．８５９　（１９８］　）］等の手法を用いた
核酸の化学合成により全合成することができる。合成法
の代りにＩ　Ｌ　−１βもしくはその前駆体をコードす
る遺伝子を利用し、その一部を改変することによっても
得ることができる。核酸配列の改変方法は、目的とする
ポリペプチドのアミノ酸配列に応じ、たとえばＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｊｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）に
記載の手法により実施することができる。

たとえば、ＤＮＡの切断、結合、リン酸化等を目的とす
る制限酵素、ＤＮＡリガーゼ、ポリヌクレオチドキナー
ゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等の各種の酵素処理等の常套手
段等が採用でき、それら酵素は市販品として容易に人手
できる。これら各操作における遺伝子乃至核酸の単離、
精製も常法、たとえばアガロース電気泳動法等に従えば
よい。

所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片や合成リン
カ−は上記した化学合成により容易に製造できる。尚、
上記において所望のアミノ酸に対応するコドン自体公知
であり、−１：たその選択は任意でよい。またこれらの
核酸配列のコドンを一部改変するには、たとえば常法ど
うり、１５〜３０塩基長程度の、所望の改変をコードす
る合成オリゴヌクレオチドからなるブライマーを用いた
サイト・スペシフィック・ミュータジェネシス［ｐｒｏ
ｃＮａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　８１．５６６２
　（’８４　）　］等の方法を採用することができる。

上記方法により得られる所望の遺伝子は、たとえばマク
サム−ギルバートの化学修飾法［Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂ
ｅｒｔ、、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ、、　６５，４９
９　（１９８０）　］やｐＵＣプラスミドもしくはＭ１
３ファージを用いるジデオキシ法［Ｍｅｓｓｉｎｇ、　
Ｊ、　ａｎｄ　Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、、　Ｇｅｎｅ、　
１９゜２６９　（１９８２）　］等により、その塩基配
列の決定および確認を行なうことができる。

かくして、前記した特定のアミノ酸列を有するポリペプ
チドをコードする新規な遺伝子が提供される。

本発明の新規ポリペプチドは、上記特定の遺伝子を利用
し、従来公知の一般的な遺伝子組換え技術に従い製造で
きる。すなわち、上記遺伝子が宿主細胞中で発現できる
ような組換えＤＮＡを作成し、これを宿主細胞に導入し
形質転換し、該形質転換体を培養すればよい。

ここで宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のいず
れをも用いることができる。該真核生物の細胞には、動
物、昆虫、酵母等の細胞が含まれる。動物細胞としては
、たとえばＣ（＋ｓ細胞［Ｙ。

Ｇｌｕｚｍａｎ、　Ｃｅ１ｌ　２３．１７．５−　（１
，９８１）　］やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞の
ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株　［Ｇ、　Ｕｒｌａｕ
ｂ　ａｎｄ　Ｌ、Ａ、　Ｃｈａｓｉｎ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　７７
、４２１６　　（１９８０）　］等がよく用いられてい
るがこれらに限定されるわけではない。動物細胞の発現
ベクターとしては。

通常発現する遺伝子の上流に位置するプロモータＲＮＡ
のスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終了
配列等を保有するものを使用でき、これは更に必要によ
り複製起点を保有していてもよい。該発現ベクターの例
としては、ＳＶ４０の後期プロモーターを保有するｐＳ
ＶＬ　［ファルマシア社製；　Ｓｐｒａｇｕｅ、　、Ｔ
、　ｅｌ、ａｌ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　４５．７７３（
１９８３）　］等を例示できるが、これに限定されない
。

原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によく
用いられている。本発明ではたとえば該宿主菌中で複製
可能なプラスミドベクターを用い。

このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺
伝子の上流にプロモーターおよびＳＤ（シャインーダル
ガリーノ）配列、更にタンパク合成開始に必要なＡＴＧ
を付与した発現プラスミドが使用できる。

上記宿主菌としての大腸菌としては、に１２株等がよ（
用いられ、ベクターとしてはコリシン系プラスミドであ
るｐＢ　Ｒ３２２がよく用いられるが。

これに限定されない。プロモーターとしては、たモータ
ー、　　ｌｐｐプロモーター等を使用することができ、
いずれの場合にも本発明遺伝子を発現させることができ
る。

ｔａｃプロモーターを用いる場合を例とすると。

発現ベクターとしてｔａｃプロモーターおよびＳ　Ｄ配
列をもつベクターｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製
）を使用し、ＳＤ配列の下流に存在する制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ部位に、必要に応じてＡＴＧを付与した所望のポリ
ペプチドをコードする遺伝子を連結させればよい。

尚、直接発現させる系に限らず、プロティンＡやβ−ガ
ラクトシダーゼやβ−ラクタマーゼ等を利用する融合タ
ンパクとして発現させることもできる。

また、該ペプチドにメチオニンを付加した形で発現させ
るのではなく、特定のペプチドをＮ末端側に付加して発
現させた後、それを特異的ペプチダーゼ処理により除去
することにより、Ｎ末端のメチオニンを除去したポリペ
プチドを作ることも可能である。

かくして得られる発現ベクターの宿主細胞への導入およ
び形質転換の方法としては、一般に用いられる方法、た
とえば塩化カルシウム処理することにより、自然にＤＮ
Ａを取り込まれ易くして。

ベクターを取込ませる方法等を採用できる。

また、宿主細胞をスフェロプラストおよびプロトプラス
ト化してから形質転換させる方法も採用することができ
る。また、電気ショック法により形質転換させる方法を
採用することもできる。

このようにして得られる所望の形質転換体は。

常法に従い培養することができる。該培養により所望の
ポリペプチドを生産することができ、その際の該ポリペ
プチドの生産様式、即ち形質転換体の内部あるいは外部
に生産されるかは、特に限定しない。該培養に用いられ
る培地は１通常細胞の培養の際に使用される培地各種の
いずれでもよい。

具体的には、原核生物の場合、ＬＢ培地、ＹＴ改良培地
、Ｍ９培地、Ｌ培地、Ｅ培地等及びこれらに通常知られ
ている各種の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン類等を
添加した培地を例示することができる。尚、上記ｔａｃ
プロモーターを用いた場合には、一般にプロモーター活
性を向上させるために、イソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシドを通常使用される濃度で添加した培地
を使用することができる。また同様Ｋｔｒｐプロモータ
ーを用いた場合には、一般にプロモーターが働くように
カザミノ酸を添加した培地を用いて培養することができ
、該培地中には培養の適当な時期にインドールアクリル
酸等のｔｒｐプロモーターの活性を高めるための薬剤を
添加することでできる。

このようにして得られる活性物を含有する培養物からの
目的とするポリペプチド、すなわち本発明ポリペプチド
の精製、単離は常法により行うことが可能である。

本発明ポリペプチドの、産生細胞からの抽出に際しては
、超音波処理による細胞の破砕法、マントン−ガラリン
　ホモジナイザー等を用いた加圧式破砕法、リゾチウム
等の酵素眞よる溶解法、凍結融解法あるいは、浸透圧シ
ョック法等を使用することができる。特に、活性あるい
はその高次構造を保持するような温和な方法を用いるこ
とが好ましい。

上記精製、単離は２例えば当該ポリペプチドの物理化学
的な性質を利用した各種の処理操作に従い実施すること
ができる。該方法としては、具体的如は例えば通常の蛋
白沈澱剤による処理、限外ｆ１過２分子ふるいクロマト
グラフィー（ゲルｒ過）およびイオン交換クロマトグラ
フィー等の液体クロマトグラフィー、遠心分離、電気泳
動、透析。

これらの組合せ等を採用することができる。

より具体的には、上記操作は９例えば以下のよって実施
できる。培養上清から目的のポリペプチドを予め部分精
製する場合２例えばアセトン、メタノール、エタノール
、プロパツール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の
有機溶媒あるいは酢酸、過塩素酸（ＰＣＡ）、）リクロ
ロ酢酸（ＴＣＡ）等の酸を蛋白沈澱剤として用いる処理
、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウ
ム等の塩析剤による処理を使用することができる。

または透析膜、平板膜、中空繊維膜等を用いる限外沢過
法によることも可能である。これらの各処理の操作及び
条件は、その際に通常用いられる方法と同様にすれば良
い。

次いで得られた粗精製物を、液体クロマトグラフィーに
付すことにより、目的とするポリペプチドの活性が認め
られる両分を得る。より具体的には９分子ふるいクロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー　吸着ク
ロマトグラフィーアフィニティー　りロマトグラフィー
　クロマトフオーカシング法、逆相分配高速クロマトグ
ラフィーなと、及びこれらの組合せにより精製を進める
ことが可能であり、均質な物質として単離することがで
きる。

上記分子ふるいクロマトグラフィーは９通常の方法によ
り行うことが可能であり、その除用いる基体は特に限定
しない。例えばデキストランゲル。

ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル、ポリアクリ
ルアミド−アガロースゲル、セルロース等を素材とする
ものの何れも使用できる。また、高速液体クロマトグラ
フィー用の基体である多孔質ガラス２　シリカゲル系、
ポリエチレングリコール系も同様である。具体的には、
セファデックスＧタイフケル、セファロースゲル、七フ
アクリルゲル（以上、ファルマシア社製）、バイオゲル
Ｐ及びＡタイプ（バイオ−ランド社製）ウルトロゲル（
ファルマシア−Ｌ　Ｋ　Ｂ社ｆｆ　）　Ｔ　Ｓ　Ｋ−ケ
ル　トヨパールＨＷタイプ及びＧタイプ（東ソー社製）
。

セルロファイン（チッソ社製）等の市販品をあげること
ができる。

上記イオン交換クロマトグラフィーは、適宜陽イオン交
換体、陰イオン交換体を選択し、またはそれらを組み合
わせて使用する。例えばその交換基として、ジエチルア
ミンエチル基、ジエチル（２−ハイドロキシプロピル）
アミノエチル基。

フオスフオ基、カルボキシメチル基を用いている各種交
換体があげられる。具体的には、Ｑ−８ＤＥＡＥ−ＣＭ
−セファロース　ファース）７０−（以上、　ファルマ
シア社製）、ＤＥＡＥ　−、ＣＭ　□、　　５Ｐ−）ヨ
パール６５０（以上。

東ソー社製）等の市販品があげられる。

上記アフィニティー　クロマトグラフィーは。

特に疎水クロマトグラフィーが有効である。吸着体とし
ては、オクチル−セファロース　ＣＬ−４Ｂ、フェニル
−セファロース　ＣＬ−４Ｂ（以上。

ファルマシア社製）、　　ブチル−トヨバール６５０゜
フェニル５ＰＷ（以上、東ソー社製）等の市販品があげ
られる。

上記逆相高速クロマトグラフィーは７例えばその官能基
をオクタデシルシラン基とするμＢ　ｏｎｄａｐａｋ　
Ｃ１，８，Ｃ４（ウォーターズ社製）。

スチレン・ジビニルベンゼン共重合体を充填剤とするＴ
ＳＫ　　ゲル　スチレン−２５０及びスチレン６０　（
以上、東ソー社製）等を用いることができ、溶離剤とし
てアセトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦ’Ａ）、水
等及びこれらの混合溶媒を用いて実施できる。

このようにして本発明の新規ポリペプチドを純粋に単離
、取得することができる。

（実施例） つぎに２本発明の新規ポリペプチド及びその製造法をさ
らに具体的に説明するため、参考例、実施例および薬埋
効果測定例を掲記する。

参考例１は、天然ヒトＩＬ−１βのＮ末端にメチオニン
を付加したポリペプチド（この物質をポリペプチドＩと
略称する）の遺伝子組換え法による製造法を説明したも
のである。また、実施例１，２および３は、夫々本発明
の目的物質である新規ポリペプチドＴＩ、ＩＩＩＩおよ
び■の製造法を説明したものである。これらの参考例、
および実施例の説明においてＩＰＴＧは、イソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを意味する。さらに
、薬埋効果測定例は１本発明の目的物質の代表的化合物
であるポリペプチドＨについて、ポリペプチド■との薬
理活性の比較を薬理活性比較例に、また、抗腫効果を薬
理試験例に夫々説明したものである。

なお、以下の各側において用いられたポリペプチドの各
種生理活性の測定法はつぎの通りである。

活性の測定法（１） リンパ球活性化因子（ＬＡＦ）活性によるＩ　Ｌ−１活
性の評価 Ｔ−Ａ　Ｆ活性［Ｍｉｚｅｌ、　Ｓ、Ｂ、　ｅｔ　ａｌ
、　Ｊ、１ｒｒｍｕｎｏ　１　、　Ｌ刈１４９７、０９
７ｓ）　］は、マイトジェンによるマウス胸腺細胞分裂
作用を促進させる生物活性であり、これをＩＬ−１活性
の指標とした。

活性測定試料を７％牛脂児血清及び５８μＭ２メルカプ
トエタノールを含む組織培養用培地ＲＰＭ１１６４０に
て適当に希釈しておく。この希釈液の１００μＬを９６
穴平底型マルチプレー１・に入れ、それぞれに４−６週
令、雄のＣ３Ｈ／　Ｈｅ　Ｊマウスより採取した胸腺細
胞（］、　Ｘ　１０７ｃｅｌｌＳ／　ｍｌ　）とコンカ
ナバリンＡ　（０，６μｇ／ｍ７）を含む細胞浮遊液を
、　１００μを加え、５％二酸化炭素を含む３７°Ｃの
培養器内で。

４８時間培養した。次いで３Ｈ−チミジンを０．５μＣ
１／２０μ乙／穴加え、更に１８時間培養後、セルノ・
−ベスターを用いて、細胞をグラスファイバーフィルタ
ー上に集め、液体シンチレーションカウンターでその細
胞内に取り込まれた３Ｈ−チミジン量を計測することに
より、ＬＡＦ活性を測定した。

活性の測定法（２） ｒＬ−１依存的にＩＬ−２を産生するＴ細胞株によるＩ
Ｌ−１活性の評価 ＩＬ−１依存的にＩＬ−２を産生するＴ細胞株（ＬＢＲ
Ｍ−３３−Ｉ　Ａ　５．　ＡＴＣＣＣＲＬ　８０７９　
）　　と。

ＩＬ−２依存的に増殖するＴ細胞株（ＣＴＬＬ　−２゜
ＡＴＣＣＴＩＢ　２１４　）を用いて、以下のようにＩ
Ｌ１活性を測定した［　Ｃｏｎ１ｏｎ、　Ｐ、　Ｊ、　
Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．１３１　。

１２８０、　（１９８３）　］。

上記細胞（ＬＢＲＭ　−３３−Ｉ　Ａ５　）を、５×１
０５個／ｍｌになるように、フィトヘマグルチニン−Ｐ
（４ｔＬｇ／　ｍｌ　）を含む培地（」二記活性の測定
法（１）で用いた培地）に浮遊させ、その細胞浮遊液０
．１　ｍｌを９６穴平底型マルチプレートに加えて種々
の濃度の被験物質を含む培地０．１．　ｍｌと混合し、
　５％二酸化炭素を含む培養器内で３７°Ｃで２４時間
培養した。

各培養上清０．１　ｍｌを、新しい９６穴平底型マルチ
プレートに入れ、上記細胞（ＣＴＬＬ　−２）　４×１
０３個を含む細胞浮遊液５０μ乙と混合し、さらに２０
時間培養した。ついで３Ｈ−チミジンを０．５　ａ　Ｃ
１／２０１Ｌ１／穴加えて４時間培養後、細胞内に取り
込まれた３Ｈ−チミジン量を上記活性の測定法（１）の
ように計測した。被験溶液中に含まれるＩＬ−１量は、
市販のＩＩ、−１α（ゼンザイム社）ならびにＩＬ−１
β（コラボレイティプリサーチ社）を用いて同様の試験
を行い検量線を作成して求めた。

活性の測定法（３） マウス移植腫瘍に対する抗腫瘍効果によるＩＬ−１活性
の評価 マウス移植腫瘍として、　　Ｂａ１ｂ／ｃ由来のＭｅｔ
ｈ　　Ａ肉腫を用いて以下の試験をおこなった。

６−８週令の雄Ｂａ１ｂ／ｃマウスに、上記腫瘍５×１
０５個を含む生理食塩水０．１　ｍｌを皮下注射し、５
７日後に腫瘍径が８　ｍｍ前後になったとき２種々の濃
度の被験物質を含む溶液５０μＬを１日１回、計２３回
、腫瘍内に注射し、経時的に腫瘍径を測定した。対照群
には、被験物質を含まない溶液を同様に投与した。

参考例　１．（その１） ポリペプチド１発現プラスミド及び形質転換体の作製 ポリペプチドＩをコードするＤＮＡをｔａｃフロモータ
ーの下流に連結することにより、ポリペプチドエを発現
するプラスミドを作製した。即ち。

ｔａｃプロモーターを有する発現ベクターとしてはｐＫ
Ｋ　２２３−３　（ファルマシア社製）を使用し、　ｐ
ＫＫ２２３−３のｔａｃプロモーター下流のＥｃｏ　Ｒ
Ｉ　　部位からＨｉｎｄ　ｌｌ［部位に、該ＤＮＡを挿
入することにより。

ポリペプチド１発現プラスミドを作製した。

■）ポリペプチドＩをコードする遺伝子の調製（１）　
　オリゴヌクレオチドの合成 ポリペプチド１発現プラスミドを作製するために構築し
た。ポリペプチド■をコードする遺伝子を含むＤＮＡの
塩基配列は次の通りである。

３′ ＧＴＡＣＣＧＡＧＧＣＣＡＴＧＣＡＴＣＧＧＡＧＴＴＧ
ＡＣＧＴＧＴＧＡＣＧＣＧＣＴＧＡＧＡＧＴＣＧＴＣＴ
ＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＴＴＡＣＴＣＧＣＣＡＧＧＣＡＴ
ＧＣＴＴＧＡＣＴＴＣＣＧＴＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＴＣ
ＣＣＡＧＴＣＴＴＧＴＡＣＣＴＴＧＴＣＧＴＣＣＡＴＣ
ＡＴＡＡＡＴＣＧＴＡＣＴＣＧＡＡＧＣＡＴＧＴＣＣＣ
ＧＣＴＴＣＴＣＡＧＡＴＴＧＣＴＧＴＴＴＴＡＧＧＧＣ
ＣＡＴＣＧＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴ
ＴＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＡＧＡＡＣＧＣＡＴＧＡＡＴＴ
ＴＣＴＧＣＴＧＴＴＴＧＧＣＴＧ’ｒｃＴＧＣＡＧＣＴ
ＧＧＡＧＴＣＣＧＴＴＧＡＣＣＣＧＡＡＧＡＡＡＧＡＣ
ＧＴＣＧＡＣＣＴＣＡＧＧＣＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴ
ＴＣＴＡＣＣＣＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＡ
ＧＣＧＣＴＴＧＡＴＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣ
ＣＴＴＴＴＣＧＣＧＡＡＣＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＡＧＡ
ＴＣＧＡＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＣＡＴＡＡＧＴＴ
ＧＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＧＴＴＧＴＴＧＴＴ３ｉ３０
　　　　　　３４０　　、　　　　３５０ＡＣＴＧＧＡ
ＧＴＴＣＧＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＧＴＴＣＣＣＧＡＡＴ
ＧＡＣＣＴＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＧＡＧＴＣＡＡＧＧ
ＧＣＴＴＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＴＣＴＡＣＣＴＣＴＣＡ
ＧＧＣＧＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＧ
ＡＧＡＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴ３ＰＯ４♀０４＋０ ＣＡＴＧＣＣＧＧＴＡＴＴＴＴＴＧＧＧＣＧＧＴＡＣＣ
ＡＡＡＧＧＧＴＡＣＧＧＣＣＡＴＡＡＡＡＡＣＣＣＧＣ
ＣＡＴＧＧＴＴＴＣＣ４２０４３０４４−Ｏ ＣＧＧＣＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣ
ＡＴＧＣＡＧＣＣＧＧＴＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＣＴＧＡ
ＡＧＴＧＧＴＡＣＧＴ該ＤＮＡを、つぎに示す１５個の
オリゴヌクレオチドに分け、以下のようにして合成した
。

（１）　　ブロック１構成フラグメンｉ・塩基配列は、
５′末端より３′末端の方向へ記載した。

ＧＡＣＡＴ ＴＡＣＡＧＧＧＣＧＡＡＧＡＧＴＣＴＡＡＣＧＡＣＡＡ
ＡＡＴＣＣＣＧＣＴＧＣＡ ＢＩＭＩ　；　ＡＴＴＡＣＧＡＧＧＣＴＣＴＴＣＴＧＣ
ＴＧＡＧＡＧＴＣＧＣＧＣＡＧＴＧＴＧＣＡＧＴＴＧＡ
ＧＧＣＴＡＣＧＴＡＣＣＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＧＡＣＣ
ＧＣＴＣ ４門　　　　　　　４６０ ＧＴＴＣＧＴＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡ　　　　　　３’Ｃ
ＡＡＧＣＡＡＴＣＧＡＧＡＡＣＴＴＣＧＡ　　５’（２
）　　ブロック２構成フラグメント塩基配列は、５′末
端より、３′末端の方向へ記載した。

ＡＡＧＡＴＣＧＡＧ ＣＧＧＡＧＡＡＣＡ、ＴＧＣ ＣＴＣＴＴＧＡ ＡＴＡＣ すなわち、マクロポーラスシリカに結合した５′Ｏ−ジ
メトキシトリチルおよびＮ−保護デオキシヌクレオシド
（アプライド　バイオシステムズ社製）を出発材料とし
、３′側より５′側へ５’　−０ジメトキシトリチルお
よびＮ−保護デオキシモノヌクレオシド−３′−ホスホ
アミダイトを縮合単位として、自動ＤＮＡ合成機（アプ
ライド　バイオシステムズ社製、　　３８０Ａ　　ＤＮ
Ａ　　シンセサイザー）を用いて順次、ヌクレオチド鎖
を延長させた。

続いてチオフェノールを用いた処理による脱メチル化お
よび２５〜２８％アンモニアを用いた処理により、シリ
カよりヌクレオチドを遊離させ、完全保護オリゴヌクレ
オチドを得た。以上の操作はすべて自動合成機を用いて
行なった［　Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ　ｅｔ、　ａｌ。

Ｎａｔｕｒｅ　３１０．１０５　（１９８４）　］。

次いで、得られた完全保護オリゴヌクレオチドを２８％
アンモニア水２ｍｌで５５℃で１０時間処理してＮ−保
護基を脱離させ、５’−０−ジメトキシトリチルオリゴ
ヌクレオチドを得た。この２１５量を用いて、ＯＤＳを
担体とするカラムであるセンシュー・パンクＮＰ−３１
８−２２５２（センシュー科学社製）による逆相高速液
体クロマトグラフィにより精製後、８０％酢酸］００μ
乙で室温１５分間処理して粗オリゴヌクレオチドを得た
。これをＯＤＳを担体とする同上逆相高速液体クロマト
グラフィーにより更に精製して、目的とするオリゴヌク
レオチドを得た。

（１１）　　オリゴヌクレオチド５′末端のリン酸化上
記で合成したオリゴヌクレオチドＢＩＰ２、ＢｉＦ３．
ＢｉＦ３．、ＢＩＭＩ、ＢＩＭ２．ＢＩＭ３．Ｂ２Ｐ５
．Ｂ２Ｐ６．Ｂ２Ｐ７．Ｂ２Ｍ５゜Ｂ２Ｍ６．Ｂ２Ｍ７
の各５′末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより
リン酸化した。

すなわち、各オリゴヌクレオチド６μｇを。

１０μ乙の反応液（５０ｒｎＭ　ｌ−リス・塩酸（ｐＨ
７，６）。

］、ＯｍＭ塩化マグネシウム（Ｍｇ　Ｃ１２）＋　　１
０　ｍＭ２−メルカプトエタノール、　　０．５ｍＭア
デノシン３リン酸（ＡＴＰ　）中で、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（全酒造社製）１２単位と２３７０Ｃにで
３０分間反応させ、ＤＮＡの５′末端をラベルした。反
応後９０’Ｃ，２分間処理することにより、酵素を失活
させた。

（曲　ポリペプチド１をコードする遺伝子の構築このよ
うにしてリン酸化したＢＩ、Ｐ２．ＢｉＦ３．　ＢＩ　
Ｐ４．　ＢＩ、　Ｍｌ、　ＢＩ　Ｍ２．　ＢＩ　Ｍ３と
リン酸化していないＢＩ　Ｐｉ、　ＢＩ　Ｍ４　　を等
モル数ずつ混合後アニーリングしてブロック１を作製し
た。同様にして、リン酸化したＢ２Ｐ５゜Ｂ２　Ｐ６．
　Ｂ２　Ｐ７．　Ｂ２　Ｍ５．　Ｂ２　Ｍ６．　Ｂ２　
Ｍ７とリン酸化していない８２Ｍ８を等モル数ずつ混合
後アニーリングしてブロック２を作製した（第１図）。

このようにして作製したブロック１　、　４０　Ｘ　１
０’−”　ｍｏｌｅ　とプ０ツク２゜４　Ｘ　ＩＦｌｌ
ｍｏｌｅとを混合後、ＤＮＡライゲーションキノｌ−（
全酒造製）を用いて４°Ｃにて連結後、アガロースゲル
電気泳動に付して。

４７０　ｂｐのポリペプチド１遺伝子を分離精製した。

すなわち、低融点アガロース（ＢＲＬ社製。

２％）にて電気泳動後、エチジウムブロマイド０５μｇ
／ｍｌにてＤＮＡを染色し、ＵＶ照射下で約４７０　ｂ
ｐの断片を含むアガロースを切り出し、　　０．５ｍＭ
エチレンジアミン　テトラアセテート（ＥＤＴＡ）含有
５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＩ（ｓ、ｏ　）を２培容加え
、６５°Ｃで１０分間でアガロースを溶解後、フェノー
ル抽出を２回行な℃・、エタノール沈殿にてＤＮＡを回
収した。

ポリペプチド■の遺伝子を構成する前記１５個の構成フ
ラグメントを用いて、ブロック１及びブロック２を作成
する工程を第１図に示す。

２）ポリペプチド■発現プラスミドの作製このようにし
て作製したＩＬ−１遺伝子の両末端はそれぞれ制限酵素
Ｅｃｏ　ＲＩあるいはＨｉｎｄ　ｍで切断されたときに
生じる塩基配列となっている。

他方、プラスミドｐＫＫ２２：３−３　（ファルマシア
社製）１Ｌｇを２制限酵素ＥｃｏＲＩ３単位およびＨｉ
ｎｄｌＩＩ　３単位で３７℃２時間反応させ切断後。

アガロースゲル電気泳動によりｔａｃプロモーター領域
を含む約４．５　ｋｂのＤＮＡ断片を単離精製した。こ
のＤＮＡ断片Ｌｏｎｇと、先に調製した４７０　ｂｐの
Ｅｃｏ　Ｒｌ−Ｈｌｎｄ　ｍ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片１０ｎｇ
　とをＤＮＡライゲーション・キット（全酒造社製）を
用いて連結して所望のポリペプチド１発現用プラスミド
ｐｔａｃ　ＩＬ　１−　Ｉを得た。

３）形質転換体の調製および塩基配列の決定（１）該プ
ラスミドを、　　Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｊ　Ｍ　１０９コン
ピテントセル（宝酒造製）ニドランスフォームレ目的の
トランスフォーマントを、アルカリ法により得られるプ
ラスミドＤＮＡの制限酵素分析により選択した［　Ｔ、
　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ、Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈａｎ
ｄ　Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　；　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ｐｐ　３６８　ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　（１９
８２）　］　。

以上の概略を第２図に示す。

（１１）　　ポリペプチド１をコードする遺伝子の塩基
配列の決定 上記形質転換体（大腸菌に１２　ＪＭ１０９　／ｐｔａ
ｃＩＬ１．　　Ｉ）を、アンピシリン１００μｇ／ｍ／
および０．５　ｍＭ　Ｉ　ＰＴＧを含むＬＢ培地（１％
トリプトン、００５％酵母エキスおよび０．５％塩化す
ｌ・リウム）１ｍＺ中で、３７℃にて一晩振とう培養後
、菌体を回収した。これを１００　ｍＭ　）　！Ｊスス
−酸緩衝液（ｐＨ７，５）　１００μ乙に懸濁後、超音
波処理して菌体破砕液を調製し、活性の測定法（２）に
よりそのＩＬ−１活性を測定した。

一方、このようにしてＩＬ−１活性を確認した形質転換
体よりプラスミドをアルカリ法により分離後、ポリペプ
チド■をコードする遺伝子部分に関し、ＤＮＡの塩基配
列の決定を行なった。

すなわち９分離したプラスミドｐｔａｃＩＬｌ−Ｉを、
制限酵素Ｅｃｏ　ＲＩ、　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ、　ｐｓｔ
Ｉで切断後、アガロースゲル電気泳動により、約２５０
ｂｐのＥｃｏＲニーＰｓｔ■断片と約２２０　ｂｐのＰ
ｓｔ　Ｉ　−Ｈｉｎｄ　ＴＩＩ断片を分離精製した。−
そのそれぞれと、　Ｅｃｏ　ＲＩとＰｓｔ　（により切
断したプラスミドｐＵＣ１８（全酒造社製）、Ｐｓｔｌ
とＨｉｎｄ　ｍにより切断したプラスミドｐＵＣ］、８
とを、　ＤＮＡライゲーション・キット（全酒造社製）
を用いて１６℃にて、１５時間反応して連結する。連結
後、　　Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＪＭ１０９コンピテント・
セル（全酒造社製）にトランスフオーム後。

０．５　ｍＭ　Ｉ　Ｐ　Ｔ　Ｇ、　　４Ｃ１ｇ／ｍｌ　
　５−フロモー４クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガ
ラクトシド（Ｂ　ＣＩ　Ｇ、　Ｓｉｇｍａ社製）を含む
Ｌ　Ｂ培地上で培養し、白色コロニーを形成するトラン
スフォーマントを得る。　これより、ポリペプチド■を
コードするＤＮＡを組み込んだプラスミドをアルカリ法
により分離精製後。

Ｍ１３プライマーＭ２およびＲＶ　（以上、全酒造社製
）およびＭ１３シークエンシング・キット（全酒造社製
）を用い、ジデオキシ法により７組み込んだ遺伝子の両
方の鎖についてＤＮＡ塩基配列を決定した。

（その２） ポリペプチドＴの製造 １）形質転換体の培養 前記参考例１（その］）で得た形質転換体（大腸菌Ｋ　
１．２　ＪＭ　１０９／　ｐｔａｃ　ＩＬ　Ｉ　　Ｉ）
をＹＴ改良培地（１）（組成；１乙あたりバクトドリプ
トン１６ｇ。

酵母エキスＬｏｇ、　　アンピシリン１．００　ｍｇ　
）中で３７°Ｃにて一夜振とう培養した。その菌体懸濁
液をＹＴ改良培地（２）（組成；１Ｌあたりバクトトリ
プトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、　　塩化アンモニウ
ム（ＮＨ４Ｃｌ　）　１．０ｇ、　　リン酸水素ナトリ
ウム（ＮａｚＨＰ０４・　１２　Ｈ２Ｏ）　１５．２ｇ
、　　リン酸２水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）３．０ｇ
、塩化ナトリウム（ＮａＣ１）　３．５ｇ。

硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）　０．１５ｇ、塩化マ
クネシウム（ＭｇＣ１２・６Ｈ２ｏ）０．１ｇ、アンピ
シリンｌＱＱｍｇ）ｌｊあたり２０　ｍｌ接種し、３７
°Ｃで培養した。ＯＤ、。値が１．０になったところで
Ｉ　ＰＴＧを終濃度０．５　ｍＭ　Ｋなるように添加し
□、さらに３７°Ｃで１６時間培養した。菌体は、　遠
心分離（４℃、　８０００　ｘｇ　−Ｒｍａｘ、　３０
分）Ｋより回収した。

２）菌体抽出液の調製 得られた菌体を＋　　５０ｍＭ　ｌ・＋）スー塩酸緩衝
液（ｐＨ８，０）で懸濁し、　　１０％（ｗ／ｖ）の菌
体懸濁液を調製した。これを、マントン−ガラリンホモ
ジナイザー　モデル１５Ｍ−８ＴＡ　（マントン−ガラ
リン社製）で２回破砕した後、遠心分離（４°Ｃ，１０
０００ｘｇ−Ｒｍａｘ、　４０分）により菌体残渣を除
き、清澄な抽出を得た。

３）ポリペプチド■の精製 上記で得た菌体抽出液を１０ｍＭ　）　’）スー塩酸緩
衝液（ｐＨ８，０）で透析後、再度同様の遠心操作を行
った。これを、陰イオン交換体であるＱ−セファロース
　ファースト　フロー（ファルマシア社製）にアプライ
し、イオン交換クロマトグラフィーによる分離操作を行
った。その条件は下記の通りである。

ゲル；Ｑ−セファロース　ファースト　７０−３０ｍ７ アブライ量；６００００Ｄ２８゜ 溶離液；　Ａ液＝１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８
，０）　　　　７５０　ｍｌ Ｂ液””１００ｍＭ　　塩化ナトリウム含有１０ｍＭ　
　トリス−塩酸緩 衝液 （ｐＨ８，０）　　　　７５０　ｍｌ 但し溶出は、試料をアプライし、更 に充分Ａ液でゲルを洗浄した後行った。

流速；　６００ｍ１／時間 分取容積；　　２０ｍｔ／試験管 濃度勾配；　塩化ナトリウム濃度が、０−５０ｍＭの直
線的濃度勾配をかけた。

５０ｍＭ到達時の最終溶出容積は。

１５００ｍｌであった。

以上の操作により得られた各両分のＬＡＦ活性を測定し
、塩化ナトリウム濃度２５ｍＭを活性のピークとする。

溶出量７８０　ｍｌ　−１２００ｍｌまでの活性画分を
回収した。

上記で得られた活性画分をまとめ、２５ｍＭ酢酸アンモ
ニウム緩衝液（ｐＨ５，５）で透析した後。

Ｓ−セファロス　ファースト　フロー（ファルマシア社
製）によるイオン交換クロマトグラフィーを行った。操
作の条件は、下記の通り。

ゲル；　Ｓ−セファロース　ファーストフロー　７５ｍ
１ アプライ量；２２００Ｄ２８゜ 溶離液；　Ａ液＝２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐ
Ｈ５，５）　　５００　ｍｌ Ｂ液＝２００ｍＭ塩化ナトリウム含 有２５ｍＭ酢酸アンモニウム 緩衝液（ｐＨ５，５）　　５００　ｍｌ但し溶出は、試
料をアプライし。

更にＡ液でゲルを充分洗浄後行っ た。

流速；　　３００ｍＺ／時間 分取容積；　　２０ｍ１／試験管 濃度勾配；　塩化ナトリウム濃度が、Ｏ−１，００ｍＭ
の直線的濃度勾配をかげた。

１００ｍＭ到達時の最終溶出容積 は、　　１０１００Ｏであった。

以上の操作により得られた各両分のＬＡＦ活性を測定し
、塩化すトリウム濃度６０ｍＭを活性のピークとする。

溶出量５６０−６４０ｍＺの活性画分を回収した。

上記で得られた活性画分をまとめ、硫安で飽和した２５
ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液を硫安終濃度が４０％にな
るように添加し、これを試料とり、−Ｃフェニル−セフ
ァロース　ＣＬ−４Ｂ（７アルマシア社製）による疎水
性クロマトグラフィーを行った。操作の条件は下記の通
り。

ゲル；　フェニル−セファロース　ＣＬ−４Ｂｍｌ アプライ量；２５０Ｄ２８゜ 溶離液；　Ａ液＝４０％硫安含有２５ｍＭ酢酸アンモニ
ウム緩衝液 （ｐＨ５，５）　　１００　ｍｌ Ｂ液：２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩 衝酸（ｐＨ５，５）　　１００　ｍｌ 但し溶出は、試料をアプライし。

さらにＡ液で充分ゲルを洗浄した 後おこなった。

流速；　　］、００ｍ４／時間 分取容積；５ｍｌ／試験管 濃度勾配；　硫安濃度が、　　４０−２０％の直線的濃
度勾配をかけた。２０％到達 時の最終溶出容積は、　　２００ｍＺであった。

以上の操作により得られた両分のＬＡＦ活性を測定し、
硫安濃度が３２−３６％（溶出量３５８０ｍｌ）の活性
画分を回収した。

４）ポリペプチド■の分子量の算出 泳動は、　　Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、　Ｋ、の方法（Ｎ
ａｔｕｒｅ　２７７゜６８０、１９７０）　Ｋ従い、上
記３）で得られたポリペプチド１の５ＤＳ−ＰＡＧＥを
行った。その条件は２次の通りである。

試料調製；　上記疎水性クロマトグラフィーで得られた
Ｉ　Ｌ　−１活性画分をプー ルし、　２８０ｎｍでの吸光度で０．０３量に、　　Ｌ
ａｅｍｍｌｉのサンプル　バッファー［２−メルカプト
エタノ− ル（２ＭＥ）存在下（＋）および非 存在下（−）］を添加し、１００’Ｃで５分処理した。

ゲル１ニ５ さ１ｍｍ）を使用した。

泳動条件＋　　３０ｍＡの定電流で１５時間泳動した。

分子量マーカーには，ファル マシア社製のＬＭＷ　　ｋｉｔ　　Ｅを，染色にはパイ
オーラッド社製シルバー スティン　キットを用いた。

泳動後，染色したところ，ポリペプチド■は単一のバン
ドとして検出された。また９分子量マーカーにより検索
線を作成し，ポリペプチド■の分子量を求めたところ，
　　２　Ｍ　Ｅ（＋）、　　２　ＭＥ（−）のいずれも
分子量は，　　１７５００と見積られた。

（実施例） 実施例　１ １）ポリペプチド■遺伝子の調製 （１）オリゴヌクレオチドの合成 ＩＩ，−１βのＮ末端側より３５番目のＡｓｐをＡｓｎ
に。

１５２５２番目ｅｔをＡｒｇに変異したポリペプチド■
を製造するために，該ポリペプチドをコードする下記遺
伝子を参考例１（その１　）、　］）、　（ｉ）と同様
に１５個のフラグメントに分けて製造した。Ｂ　Ｉ　Ｐ
　２。

ＢＩＭ２，　Ｂ２Ｐ７およびＢ２Ｍ８の各フラグメント
を夫々下記のＭＢＩＰ２，　ＭＢ］．Ｍ２，　ＭＢ２Ｐ
７封よびＭＢ　２Ｍ８で表わされるフラグメントに改変
した以外，その他のフラグメントは前述の参考例と全（
同一である。

ＡＡＣＡＴ ＧＧＡＣＣＧＣＴＣ ＣＴＣＴＴＧＡ ＝４９ （１１）オリゴヌクレオチドの５′末端のリン酸化合成
したオリゴヌクレオチドのＭＢＩＰ２．ＭＢＩＭ２およ
びＭＢ２Ｐ７の各５′末端を、参考例１（その１）、Ｉ
Ｌ　（ｉｎと同様にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによ
りリン酸化した。

（ｉｉｉ）　　ポリペプチド■をコードする遺伝子の構
築参考例１における１５個のフラグメントのうちＢＩＰ
２．　ＢＩＭ２．　Ｂ２Ｐ７およびＢ２Ｍ８のかわりに
それぞれＭＢＩＰ２．　ＭＢＩＭ２．　ＭＩ３２Ｐ７お
よびＭＢ２Ｍ８を用い、ブロック１およびブロック２を
参考例１（その１）、　］　）、　（ｉｉｉ）と全く同
様にして作成した。その工程図を第３図に示す。

以下、遺伝子の構築および分離精製の手順は参考例１（
その１　）　、　　１）　、　（ｉｉｉ）と同様に行っ
た。構築した。ポリペプチドＩＩをコードする遺伝子を
含むＤＮＡの塩基配列は次の通りである。

３′ ＧＴＡＣＣＧＡＧＧＣＣＡＴＧＣＡＴＣＧＧＡＧＴＴＧ
ＡＣＧＴＧＴＧＡＣＧＣＧＣＴＧＡＧＡＧＴＣＧＴＣＴ
ＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＡＡＴＧＡＧＣＧＧＴＣＣＧＴＡ
ＣＧＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＡＣＴＴＴＡＣＴＣＧＣＣＡ
ＧＧＣＡＴＧＣＴＴＧＡＣＴＴＣＣＧＴＧＡＧＣＡＣＣ
ＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＡＡＣＡＴＧＧＡＡＣＡＧＣＡ
ＣＧＴＧＧＡＡＧＴＣＣＣＡＧＴＣＴＴＧＴＡＣＣＴＴ
ＧＴＣＧＴＧＧＴＡＧＴＡＴＴＴＡＧＣＡＴＧＡＧＣＴ
ＴＣＧＴＡＣＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＴＡＡＡＴＣＧＴＡ
ＣＴＣＧＡＡＧＣＡＴＧＴＣＣＣＣＧＡＡＧＡＧＴＣＴ
ＡＡＣＧＡＣＡＡＡＡＴＣＣＣＧＧＴＡＧＣＧＣＴＴＣ
ＴＣＡＧＡＴＴＧＣＴＧＴＴＴＴＡＧＧＧＣＣＡＴＣＧ
ＴＣＴＧＧＧＴＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＣＴＣ
ＴＡＴＣＴＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴ
ＴＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＡＧＡＡＣＧＣＡＴＧＡＡＴＴ
ＴＣＴＧＣＴＧＴＴＴＧＧＣＴＧＡＧＡＣＧＴＣＧＡＣ
ＣＴＣＡＧＧＣＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴＴＧＡＴＧＧ
ＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＣＴＴＴＴＣＧＣＧＡＡ
ＧＣＡＴＡＡＧＴＴＧＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＧＴＴＧ
ＴＴＧＴＴＴＧＡＣＣＴＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＧＡＧ
ＴＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＣＣＡＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧ
ＧＡＧＡＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＧＴＡＣＧＧＣＣＡＴ
ＡＡＡＡＡＣＣＣＧＣＣＡＴＧＧＴＴＴＣＣＣＧＧＣＣ
ＡＧＧＡＴＡＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣＡ
ＧＣＣＧＧＴＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＣＴＧＡＡＧＴＧＧ
ＴＡＣＧＴ型　　　　　　４９０ ＧＴＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＴＴＧＡ　　　　　３’ＣＡ
ＡＧＣＡＡＧＣＧＡＧＡＡＣＴＴＣＧＡ　５’２）ポリ
ペプチド■発現用プラスミド（ｐ　ｔａｃＩＬＩ−’Ｉ
Ｉ）の調製 上記ポリペプチド■の遺伝子と参考例１（その１　）、
　２）で得られたｔａｃプロモーター領域を含むＤＮＡ
断片を用いて、参考例１（その１）、２）と同様にして
ポリペプチドＴＩ　を発現するプラスミドｐｔａｃ　Ｉ
ＬＩ　ＩＩを製造した。

３）形質転換体の作製 このようにしたプラスミドｐｔａｃＩＬＩ　　ＩＩは、
参考例１（その１　）、　　３）、　（ｉ）と全く同様
にして。

大腸菌に１２ＪＭ１０９株に形質転換して、形質転換体
（大腸菌に１２ＪＭ１０９／ｐｔａｃ　ＩＬＬ−２）を
作製した。この形質転換体は、微工研に微工研菌寄第１
Ｄ３’４号として寄託されている。作製した形質転換体
に関しては、活性の測定法（２）によりＩＩ、−１活性
を確認後、ポリペプチド■をコードする遺伝子領域に関
して、参考例１（その１）。

３　）　、　（ｉｉ）と同様にしてジデオキシ法により
ＤＮＡ塩基配列の決定を行なった。

４）形質転換体の培養 上記３）で得た形質転換体（大腸菌に１．２　ＪＭ１０
９／ｐ襞ＩＬ１−１．Ｉ）を参考例１（その２）、］、
）に記載した方法と同様に培養し、菌体を得た。

５）菌体抽出液の調製 上記により得られた菌体は、参考例１（その２）、　２
）の方法と同様に調製し菌体抽出液を得た。

６）ポリペプチドＨの精製 ポリペプチド■と異なり、ＬＡＦ活性が非吸着画分に検
出される。そのためこの操作では、非吸着画分を回収し
た。

ゲルを予め１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）
で平衡化しておき、適量の抽出液をアプライした。その
後ゲルを、該緩衝液で２８０　ｎｍでの吸光度がかなり
低（なるまで充分洗浄した。このとき。

非吸着画分及び洗浄液を回収１〜だ。

上記操作により得た抽出液を１０　ｍＭ　）、　＋）ス
塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）で透析後、遠心分離（４℃。

１００００ｘ１００００ｘ、　４０分）を行い菌体残渣
を除去した。

これを、参考例１（その２）、３）と同様にＱセファロ
ース　ファスト　フロー（ケル量；　３００ｍ１　）に
アプライ（アプライ量；　２３５４００Ｄ２８０）　Ｕ
ｌイオン交換クロマトグラフィーを行った。このクロマ
トグラフィーは、ポリペプチドエの精製の際にも用いた
が、ポリペプチドＨの挙動は。

■　分離−１ 上記操作で得られた非吸着画分を、　　２５ｍＭ酢酸ア
ンモニウム緩衝液（ｐＨ６，０）で透析した後。

参考例１（その２）、３）と同様にＳ−セファロース　
ファースト　フローによルイオン交換りｏ　−ｒトゲラ
フイーを行った。この操作は、参考例１（その２）、３
）ポリペプチド■の精製の際にも用いているが、アミノ
酸組成の違いによる化学的性質の変化により、クロマト
グラフィーに於ける挙動にも影響があったため、緩衝ｉ
ｐＨ値を。

５５から６．０に変更した。条件は、下記の通り。

ゲル：Ｓ−セファロース　ファースト　フロー７５　ｍ
ｌアプライ量；　９００００Ｄ２８゜ 溶離液；Ａ液＝　２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐ
Ｈ６，０） Ｂ液−０，２Ｍ塩化ナトリウム含有２５ｍＭ酢酸アンモ
ニウム緩衝液 （ｐＨ６，０） Ｃ液＝　１．０Ｍ塩化ナトリウム含有２５ｍＭ酢酸アン
モニウム緩衝液 （ｐＦ（６，０） 流速；　３００ｍＺ／時間 分取容積：　２０ｍＺ／試験管 濃度勾配；試料をアプライ後、Ａ液で充分ゲルを洗浄し
た。次いでＢ液で溶出し。

更にＣ液で溶出するという２段階的 な濃度勾配をかけた。すなわち塩化 ナトリウム濃度が、Ｏ−０，２→１．０　（Ｍ）と移行
することになる。

以上の操作により得られた画分のＬＡＦ活性を測定した
ところ、Ｂ液で溶出を始めてから１２ｌ２１−２６Ｏの
画分に活性が検出された。

■分離−２ 得られた活性画分を、上記溶離液Ａ液で透析後、再度ｓ
−セファロース　ファスト　７０−によるイオン交換ク
ロマトグラフィーを行った。

条件は、下記の通り。

ゲル；Ｓ−セファロース　ファースト　フローｍｌ アプライ量；　　９２　０Ｄ２８０ 溶離液；Ａ液−２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ
６，０）　　　　１００　ｍｌ Ｂ液＝４００ｍＭ塩化ナトリウム含有 酢酸アンモニウム緩衝液 （ｐＩ（６，０）　　　　１００　ｍｌ流速；　１００
ｍ７／時間 分取容積；４ｍｔ／試験管 濃度勾配；試料をアプライし、Ａ液で充分洗浄した後、
塩化ナトリウム濃度０ ２００ｍＭの直線的濃度勾配をかけた。

２’００ｍＭ到達時の最終溶出容積は。

２００　ｍｌであった。

この操作により得られた画分ＬＡＦ活性を測定したとこ
ろ、塩化ナトリウム濃度６５ｍＭを活性のピークとする
。溶出容積４８４８−８Ｏの両分に活性か検出された。

上記の操作で得られた活性画分をまとめ、硫安飽和２５
ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６，０）を、硫安終
濃度が４０％になるように添加し、フェニル−セファロ
ース　ＣＩ、−４８Ｋ　ヨル疎水性クロマトグラフィー
を行った。この操作は、参考例１（その２）、３）ポリ
ペプチドエの精製の場合と同様であるが、該緩衝液のｐ
Ｈ値が異なる。

条件は、下記の通り。

ゲル；フェニル−セファロース　ＣＬ−４８４ｍｌアプ
ライ量　；　　３３　０Ｄ２＋１Ｑ溶離液；Ａ液−４０
％硫安含有２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝ｇ（ｐＩ（６
，０）　３５　ｍｌＢ液＝２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩
衝 液（ｐＨ６，０）　　　３５　ｍｌ 流速；５０ｍ１／時間 分取容積；２ｍＺ／試験管 濃度勾配；溶出は、試料アプライ後、Ａ液で充分洗浄の
のち行った。濃度勾配は。

硫安濃度が、　４．０−２０％の直線的な勾配をかげた
。

以上の操作により得られた両分のＬＡＦ活性を測定した
ところ、硫安濃度が３５−２６％の両分に活性が得られ
た。

実施例　２ ポリペプチド■の製造 ｐ−見１ｃＩＬＩ　　ＩＩを制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓ
ｔ　Ｉにより切断後、アガロースゲル電気泳動に付して
、約２５０ｂｐのＥｃｏＲＩ　−ＰｓｔＩ断片を分離シ
タ。一方、　　ｐｔａｃＩＬＬ−Ｉを制限酵素Ｐｓｔ　
Ｉと）（ｉｎｄｌｌＩにより切断後。

アガロースゲル電気泳動に付して、約２２０　ｂｐのＰ
ｓｔ　Ｉ　−Ｈｉｎｄｌ［断片を分離した。一方、　ｐ
ＫＫ２２３−３をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄｌｌＩにより切
断後、アガロースゲル電気泳動に付して、約４．５　ｋ
ｂのＥｃｏＲＩ　−Ｈｉｎｄ［断片を分離　し　ブこ。

ＥｃｏＲＪ　−Ｈｉｎｄ１１’Ｊ切断したｐＫＫ２２３
−３を１．Ｏｎｇ、約２５０　ｂｐのＥｃｏＲＩ　−Ｐ
ｓｔ　ｒ断片Ｌｏｎｇ、約２２０　ｂｐのＰｓｔ　Ｔ−
Ｈｉｎｄｌｌ断片８．８　ｎｇをＤＮＡライゲーション
・キット（宝酒造社製）を用いて連結して所望のポリペ
プチド■発現用プラスミドｐｔａｃＩＬＩ　　ＩＩＩを
得た。ｐＫＫ２２３−３に組み込んだポリペプチド■を
コードする遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列を以下に示す
。

ＧＴＡＣＣＧＡＧＧＣＣＡＴＧＣＡＴＣＧＧＡＧＴＴＧ
ＡＣＧＴＧＴＧＡＣＧＣＧＣＴＧＡＧＡＧＴＣＧＴＣＴ
ＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＴＴＡＣＴＣＧＣＣＡＧＧＣＡＴ
ＧＣＴＴＧＡＣＴＴＣＣＧＴＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＴＣ
ＣＣＡＧＴＣＴＴＧＴＡＣＣＴＴＧＴｃＧＴＣＣＡＴＣ
ＡＴＡＡＡＴＣＧＴＡＣＴＣＧＡＡＧＣＡＴＧＴＣＣＣ
ＧＣＴＴＣＴＣＡＧＡＴＴＧＣＴＧＴＴＴＴＡＧＧＧＣ
ＣＡＴＣＧＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴ
ＴＧＧＡＧＡＴＡＧＡＡＧＡＣＧＴＣＧＡＣＣＴＣＡＧ
ＧＣＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴＴＧＡＴＧＧＧＣＴＴＣ
ＴＴＣＴＴＣＴＡＣＣＴＴＴＴＣＧＣＧＡＡＧＣＡＴＡ
ＡＧＴＴＧＴＴＣＴＡＧＣＴｃＴＡＧＴＴＧＴＴＧＴＴ
該プラスミドを、　　Ｅ、　Ｃｏ１ｔ　ＪＭ１０９コン
ピテントセル（全酒造社製）にトランスフオームし、目
的のトランスフォーマントを、アルカリ法により得られ
るプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により選択した。こ
うして得られた形質転換体（大腸菌に１２ＪＭ　１０９
／ｐ　ｔａｃ　ＩＬＩ　−３）は、微工研菌第１ρ３／
；θ号として寄託されている。

ＴＧＡＣＣＴＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＧＡＧＴＣＡＡＧ
ＧＧＣＴＴＧＡＣＣＡＴＧＴＡＧＡＧＡＴＧＧＡＧＡＧ
ＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＧＴＡＣＧＧＣＣＡＴＡＡＡＡＡ
ＣＣＣＧＣＣＡＴＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＧＧＴＣＣＴＡ
ＴＡＧＴＧＡＣＴＧＡＡＧＴＧＧＴＡＣＧＴＧＴＴＣＧ
ＴＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡ　　　　　３’ＣＡＡＧＣＡＡ
ＴＣＧＡＧＡＡＣＴＴＣＧＡ　５’実施例　３ ポリペプチド■の製造 ｐｔａｃ　ＩＬＩ−Ｉを制限酵素Ｅｃｏ　ＲＩとＰｓｔ
　Ｉにより切断後、アガロースゲル電気泳動に付して、
約２５０ｂｐのＥｃｏ　ＲＪ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片を分離
した。一方、　　ｐｔａｃＩＬＬ−ＴＩを制限酵素Ｐｓ
ｔＩとＨｉｎｄｍにより切断後。

アガロースゲル電気泳動に付して、約２２０ｂｐのＰｓ
ｔ　Ｉ　−Ｈｉｎｄ　、［断片を分離した。一方、　　
ｐＫＫ２２３−３をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ　ＩＪＩによ
り切断後、アガロースゲル電気泳動に付して、約４．５
　ｋｂのＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄ　ＴＩＩ断片を分離し
た。

Ｅｃｏ　ＲＩ　−Ｈｌｎｄ　ｍ切断したｐＫＫ２２３−
３を１０ｎｇ、約２５０ｂｐのＥｃｏＲＩ　−ＰｓｔＩ
断片１０　ｎｇ、約２０ｂｐのＰｓｔＩ　−Ｈ１ｎｄＩ
ＩＩ断片８．８　ｎｇをＤＮＡライゲーション・キット
（全酒造社製）を用いて連結して所望のポリペプチドＩ
Ｖ発現用プラスミドｐｔａｃＩＬ１−１へｌを得た。ｐ
ＫＫ　２２３−３に組み込んだポリペプチド■をコード
する遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列を以下に示す。

ＧＴＡＣＣＧＡＧＧＣＣＡＴＧＣＡＴＣＧＧＡＧＴＴＧ
ＡＣＧＴＧＴＧＡＣＧＣＧＣＴＧＡＧＡＧＴＣＧＴＣＴ
ＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＴＴＡＣＴＣＧＣＣＡＧＧＣＡＴ
ＧＣＴＴＧＡＣＴＴＣＣＧＴＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＴＣ
ＣＣＡＧＴＣＣＴＧＴＡＣＣＴＴＧＴＣＧＴＣＣＡＴＣ
ＡＴＡＡＡＴＣＧＴＡＣＴＣＧＡＡＧＣＡＴＧＴＣＣＣ
ＧＣＴＴＣＴＣＡＧＡＴＴＧＣＴＧＴＴＴＴＡＧＧＧＣ
ＣＡＴＣＧＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴ
ＴＧＧＡＧＡＴＡＧＡ２４０２〒０２６０ ｒＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＴＣＣＧＴＴＧＡＣＣＣＧ
ＡＡＧＡＡＡＧＡＣＧＴＣＧＡＣＣＴＣＡＧＧＣＡＡＣ
ＴＧＧＧＣＴＴＣＴＴ２７０　　　　　　　荀０２￥０ ＣＴＡＣＣＣＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＡＧ
ＣＧＣＴＴＧＡＴＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＣ
ＴＴＴＴＣＧＣＧＡＡＣＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＡＧＡＴ
’ＣＧＡＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＣＡＴＡＡＧＴＴ
ＧＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＧＴＴＧＴＴＧＴＴＡＣＴＧ
ＧＡＧＴＴＣＧＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＧＴＴＣＣＣＧＡ
ＡＴＧＡＣＣＴＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＧＡＧＴＣＡＡ
ＧＧＧＣＴＴＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＴＣＴＡＣＣＴＣＴ
ＣＡＧＧＣＧＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＧＴＡＧＡＧＡＴ
ＧＧＡＧＡＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＣＡＴＧＣＣＧＧＴ
ＡＴＴＴＴＴＧＧＧＣＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＧＧＴＡＣ
ＧＧＣＣＡＴＡＡＡＡＡＣＣＣＧＣＣＡＴＧＧＴＴＴＣ
Ｃ型　　　　　　４３０　　　　　　４４０ＣＧＧＣＣ
ＡＧＧＡＴＡＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣＡ
ＧＣＣＧＧＴＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＣＴＧＡＡＧＴＧＧ
ＴＡＣＧＴＧＴＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＴＴＧＡ　　　　
　　３’ＣＡＡＧＣＡＡＧＣＧＡＧＡＡＣＴＴＣＧＡ　
　５’該プラスミドを、　　Ｅ、　Ｃｏ１１　　ＪＭ］
０９コンピテント・セル（全酒造社製）にトランスフオ
ームし、目的のトランスフォーマントを、アルカリ法に
より得られるプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により選
択した。こうして得られた形質転換体（大腸菌に１２Ｊ
Ｍ１．０９／ｐ　ｔａｃ　ＩＬＬ−４＋）は微工研菌寄
第１（５３６／号として寄託されている。

（薬理効果測定例） （１）薬理活性比較例（ポリペプチド■換算蛋白量（ｌ
ＴＩｇ）当りの本発明の目的物質のＩＬＩ−１活性）■
　ポリペプチド発現形質転換体の培養ポリペプチドを発
現する形質転換体の培養には）参考例１（その２）、１
）に記載した培地を使用した。培養方法は、以下の通り
であった。

各形質転換体をＹＴ改良培地（１）で３７℃にて一夜振
とう培養し、これを前培養とした。更に、得られた菌体
懸濁液を、■ＰＴＧを終濃度０．５ｍＭで含むＹＴ改良
培地（２）　１．５　ｍｌに、　　３００μ４添加し、
３７°Ｃで１６時間培養した。培養器として、ポリプロ
ピレン類の遠沈管（５０ｍＺ容量；コーニング社製）を
使用した。菌体は遠心分離（４°Ｃ，８０００ｘｇＲｍ
ａｘ、　３０分）により回収した。

■　菌体破砕液の調製 得られた菌体を洗浄するために、生理食塩水に再懸濁し
遠心分離するという操作を二度繰り返し、最終的に該液
により、　　０．０２０　Ｄ５５０　／ｍｌ濃度の菌体
懸濁液を調製した。この操作により、各菌体懸濁液の一
定量中に含まれる菌体数は等し℃・ことになる。

この懸濁液５ｍＸを、超音波破砕器インソネーター　Ｍ
ｏｄｅｌ　　２００Ｍ　（久保田製作所社製）を用い。

２００ワツト、２°Ｃで３０秒の超音波処理を５回繰り
返し、菌体破砕液を調製した。

■　ＩＩ、−１活性の測定 菌体破砕液中に含まれるポリペプチド■の量を、ポリペ
プチド■換算蛋白量として、ポリペプチド■に対する抗
血清を用いたヒトインターロイキン−１β（１□５工）
ＲＩＡキット（シストロン社製）を用いて定量した。更
に、この破砕液のＩＴ、−１活性を、活性の測定法（２
）の方法により求め、その両者から、ポリペプチド■換
算蛋白量（ｍｇ）当りのＩＬ−１活性を求めた。

結果を、第１表に示ず。

第　　１　　表 ポリペプチド　　　　■Ｌ−１活性（Ｕ／ｍｇ）ポリペ
プチドＩ　　　　１．３７　Ｘ　１０８ポリペプチドＩ
Ｉ　　　　１．．０３　Ｘ　１０９（２）薬埋試験例（
本発明誘導体のマウス移植腫瘍に対する抗腫瘍効果試験
） 活性の測定法（３）に記載した方法により、マウス移植
腫瘍に対する抗腫瘍試験を行った。

即ち、　　Ｂａ１ｂ／ｃマウスに皮下移植したＭｅｔｈ
　Ａ肉腫の腫瘍径が８ｍｍ前後の大きさになったマウス
を、１群５匹の各群に分けて用いた。

ダルベツコのリン酸緩衝食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　５
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ
）に、ポリペプチド■を溶解希釈し、上記マウスの腫瘍
内に、１日１回の割合で計３回、　０．０５　ｍｌ宛注
射した。尚、対照群として被験物質を含まなし・溶液を
同様に投与し、同一実験に供した。

結果を第４図に示す。図において、横軸はポリペプチド
■を最初に投与した後の日数を、縦軸には投与前の肉腫
重量を１とした場合における相対的腫瘍重量を示す。ま
た２図中の曲線（１）から（３）は、以下の被験物質を
投与したときの結果を示す。

曲線（１）：溶媒のみ 曲線（２）：ポリペプチドＴｉ　（１回宛　１×１０５
ＬＡＦ単位） 曲線（３）：ポリペプチドＩＩ（１回宛　３×１０５Ｌ
ＡＦ単位） ポリペプチド■投与群では、その投与量に依存してマウ
ス移植腫瘍に対する抗腫瘍効果が認められ、　　３　Ｘ
　１０５ＬＡＦ単位投与群では、投与後２−３週間で金
側に於て、腫瘍の完全退縮が認められた。

【図面の簡単な説明】

（１）第１図は、ポリペプチド■をコードする遺伝子を
構成する１５個のフラグメントを用いてブロック１及び
ブロック２を作製する工程図である。 （２）第２図は、オリゴペプチド■の発現プラスミドｐ
ｔａｃ　ＩＬＬ　−Ｉの構築図て゛ある。 （３）第３図は、ポリペプチド■をコードする遺伝子を
構成するフラグメントを用いてフロック１及びブロック
２を作成する工程図である。 （４）第４図は、ポリペプチドＨの各種濃度における抗
腫瘍効果を示す図である。 弔 図 −１１’）　　　ＬＬＩ Ｌｕｌｌ　”

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の一般式で表わされるアミノ酸配列からなる新
   規ポリペプチド 【遺伝子配列があります。】で （上記一般式中、ＲはＮ末端が水素原子であるか又はＭ
   ｅｔであることを、Ｘ、ＹおよびＺは単なる結合である
   か又は、同一または異なって、蛋白質を構成する任意の
   α−アミノ酸であることを意味する。ただし、Ｘ、Ｙお
   よびＺの組合せが夫々Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＳｅｒであ
   る場合を除く。） ２、ＸがＡｓｐ、Ａｓｎ、ＡｌａおよびＳｅｒよりなる
   群から選ばれたアミノ酸の一つ、ＹがＧｌｕ、Ｇｌｎお
   よびＳｅｒよりなる群から選ばれたアミノ酸の一つ、Ｚ
   がＳｅｒおよびＡｒｇからなる群から選ばれたアミノ酸
   の一つである請求項１に記載の新規ポリペプチド ３、請求項１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチ
   ドをコードする遺伝子 ４、下記塩基配列で示されるポリペプチドIIおよびIII
   遺伝子 ポリペプチドIIをコードする遺伝子 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 ポリペプチドIIIをコードする遺伝子 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】