JPS635099A - 新規なポリペプチド、その製法及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、リンホトキシ／活性又はリンホトキシン様活
性を有する新規なポリペプチド、その製法及びこのもの
を場合によりリンホカインと組合せて含有する治療剤に
関する。

リンホトキシン（ＴＮＦ−βとも呼ばれる）は、１９６
８年に初めて文献に記載された（ラドル及びワックスマ
ン著Ｊ、　ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１２８巻１２６７〜１
２７９頁１９６８年；グランガー及びコルプ著Ｊ、　Ｉ
ｍｍｕｎ、　１０１巻１１１〜１２０頁１９６８年；ａ
−ゼナウ著Ｗ、　Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　２７巻３４〜
６８頁１９６８年参照）。リンホトキシンはマイトゲン
刺激性リンパ球からの生物学細胞性塞栓のような活性ス
ペクトル及び他の形質転換細胞に対し明白な細胞溶解活
性を有する（浜田及び小沢著Ｊａｐ、　Ｊ、　ｅｘｐ、
　Ｍｅｄ、　４６巻２６３〜２６７頁１９７６年；グラ
ンガーら著Ｊ。

Ｃｅ１１．　Ｉｍｍｕｎ、　５８巻３８８〜４０２頁１
９７８年：ランデル及びエバンス著イミューノファーマ
コロジイ３巻９〜１８頁１９８１年：グランガーら著Ｊ
、　Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ｒｅｓ、　１巻４５〜４９
頁１９８２年ニラドルら著Ｊ、　Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ
　Ｒｅｓ、　２巻２３〜３１頁１．９８３年参照）。

初代細胞培養及び正常細胞系に対し、リンホトキシンは
細胞毒活性を全く又はわずかじか示さない。この知見に
より生体内研究が行われるようになり（カーノら著Ｐｒ
ｏｃ、　Ｓｏｃ、　ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ。

Ｍｅｄ、　１６９巻２９１〜２９４頁１９８２年；ペー
パーマスターら著キャンサー４５巻１２４８〜１２５６
頁１９８０年；う／ンムら著Ｊ。

Ｎａｔｎ、　Ｃａｎｃｅｒ、　Ｉｎ５ｔ、　６９巻７４
１〜７４４頁１９８２年参照）、その結果は、リンホト
キシンが有効な抗腫瘍剤であることを示した。

ヒト−リンホトキシンは第１図と示すアミノ酸配列を有
する（グレイら著ネイチャー６１２巻７２１〜７２４頁
１９８４年参照）。このリンホトキシンのシグナル配列
は−６４ないし−１が特色を有する。

ヒト−リンホトキシン（ＴＮＦ−β）はリンホカインの
群に属し、後者は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ又はＴＮＦ−α
）に属する。両者の蛋白は試験管内及び生体内で類似の
作用スペクトルを示すだけでなく、時折インターフェロ
ン−ｒと共に相乗作用を有する（ラドルら著Ｌｙｍｐｈ
ｏｋｉｎｅ　Ｒｅｓ。

２巻２３〜３１頁、１９８６年：グランガーら著Ｌｙｍ
ｐｈｏｋｉｎｅ　Ｒｅｓ、　１巻４５〜４９頁１９８２
年；ルフ及びギフオード著すンホカインズ２巻Ｐ１ｃｋ
＋Ｅ、　ｅｄ、　２３５〜２７５頁アカデミツク・プレ
ス・ニュー−ヨーク１９８１年；カースウェルら著Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７２巻３
６６６〜３６７０頁１９７５年；エバンス著Ｃａｎｃ、
　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、　１２巻１８１〜１９０頁１９
８２年：ランデル及びエバンス著イムノファーマコロジ
イ３巻９〜１８頁１９８１年：ルフ及びギフオード著Ｉ
ｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　３１巻５８０〜３８５頁
１９８１年；ウィリアムノンら著Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８０巻５３９７〜５
４０１頁１９８３年：ウィリアムス及びペランチ著Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３０巻５１８〜５２０頁１９８６
年；ストーンーウオルフら著Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　
１５９巻８２８〜８４３頁１９８４年；リーら著Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３３巻１０８３〜１０８６１０８
６頁１９８４年ニホウエルｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ｒｅｓ、
　４巻１６〜２６頁１９８５年参照）。

両蛋白のための遺伝子は第６染色体上に隣接して局在す
る（ネドウイ／ら著Ｎｕｃ１．　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ。

１３巻１７号６３６１〜６３７３頁１９８５年参照）。

両蛋白のアミノ酸配列の比較を第２図に示す。

この図において、上段はとトーリンホトキシン（ＴＮＦ
−β）のアミノ酸配列、下段はヒト腫瘍壊死因子（ＴＮ
Ｆ−α）のアミノ酸配列である。

この比較によれば、両蛋白はアミノ酸水準において３０
％の相同性を有し、この相同性は両蛋白の中央及びＣ−
末端部に集中しているが、Ｎ−末端部は異質で長さが異
なることが知られる。

さらに、七〇Ｎ−末端が最初の２３個のアミノ酸の欠失
により自然のリンホトキシンと区別されるリンホトキシ
ン突然変異株が知られている。

本発明者らは、リンホトキシンのアミノ酸配列２５〜１
７１及び２６〜１７１から成り、モしてＮ−末端におい
てメチオニル基又はアラニル基及び／又は免疫原性作用
を有するペプチド配列を追加含有してもよいポリペプチ
ドが有利な性質を有することを見出した。

免疫原性作用を有するペプチド配列は、既知のリンホカ
イン例えばＴＮＦ又はインターフェロン−ｒの配列の一
部であってよく、あるいは特別の性質例えばフィブリン
親和性を有するペプチド配列であってよい、。

新規なポリペプチドは、（ａ）リンホトキシンを産生ず
る細胞系からメツセンジャーＲＮＡを分離し、［ｂ）こ
のメツセンジャーＲＮＡを相当する二重鎖相補ＤＮＡ中
に複製し、（Ｃ）この相補ＤＮＡを大腸菌のベクター中
に挿入し、（ｄ）こうして得られた新しいベクターによ
り大腸菌を形質転換し、（ｅ）リンホトキシン相補ＤＮ
Ａクローンを遺伝子ゾンデ及びハイブリッド形成により
選択して特性決定し、（ｆ）このリンホトキシン遺伝子
を含有するこの遺伝子又は遺伝子断片を適当なオリゴヌ
クレオチドと共に発現ベクター中に挿入し、（１）所望
により遺伝子の５′−端に追加のＤＮＡ配列を挿入し、
（ｊ）この発現ベクターにより大腸菌を形質転換し、そ
して（ｋ）希望する遺伝子産生物を発現させ、分離し、
そして精製することにより、製造することができる。

相当する相補ＤＮＡ　（ＣＤＮＡ　）を分離するために
は、リンパ芽球細胞系ＲＰＭ　Ｉ　１７８８　（ＡＴＣ
ＣＡＣＣＬ　１５６　）を文献（アが−ワルら著Ｊ、　
Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２５９巻６８６〜６９１頁１９８４年）の
記載により培養し、刺激したのちメツセンジャーＲＮＡ
　（ｍ　ＲＮＡ　）を分離し、そして既知の方法により
ｃ　ＤＮＡに変える。

このｃＤＮＡクローンは第６図（（示す配列を有する。

この配列部分（これらは制限認識部位における酵素的切
断により容易に入手できる）は、実施例中に詳細に記載
されるリンホトキシン様ポリペプチドをクローニングす
るために利用される。クローニングベクター例えば市販
のプラスミドｐＵＣ１８及びｐＵＣ１９への遺伝子断片
の導入は、公知の方法（マニアテイスら著モレキュラー
〇クローニング、コールド中スフリング・ハーバ−・ラ
ボシト９４１９８２年参照）により行われる。蛋白の発
現が可能な化学的に合成された適当な調節領域を、遺伝
子又は遺伝子断片に付与することもできる。こうして得
られるハイブリッドプラスミドを適当な宿主微生物好ま
しくは大腸菌中に形質転換することは、同様に公知であ
り、文献に詳細に記載されている。

大腸菌の周囲プラズマ中へのポリペプチドの分泌を可能
にする相当するシグナル配列を、ハイブリッドプラスミ
ドに付与することもできる。

こうして得られる蛋白は、分泌後はそのＮ−末端部にメ
チオニンを含有しないが、多くは切断位置にとって重要
なアミノ酸例えばアラニンを含有する（　Ｎｕｃｌ、　
Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、　８巻３０１１〜５０２７頁１９
８０年参照）。

遺伝子暗号の変性により、他のＤＮＡ配列例えば化学的
に合成された異なるＤＮＡ配列を有する遺伝子を新規な
ポリペプチドの発現のために使用することもできる。

新規なペプチドは腫瘍、免疫性疾患又は炎症性疾患例え
ばりウマチ又は多発性関節炎に使用できる。

−フエロンーβ及ヒインターフェロンーｒの添加、なら
びに制癌剤の添加により、相加効果以上に高めることが
できる。従って本発明は、新規なペプチドと、リンホカ
イン例工ばＴＮＦ−α及ヒ特にインターフェロン−α、
インターフェロン−β及びインターフェロン−γとの混
合物に関する。

従って本発明は、新規なポリペプチドの少なくとも１覆
を場合により製剤上容認しうる賦形剤又は結合剤中に含
有する医薬である。さらに本発明は、新規なポリペプチ
ドと既知のリンホカイン又はリンホカイン突然変異株（
例えばインターフェロン−ｒ又はＴＮＦ　）とを組合せ
た医薬である。

本発明の他の態様は下記実施例中に詳細に記載される。

比較物質として用いられたリンホトキシンは、リンホト
キシン突然変異株と同様にして大腸菌中でクローニング
し、発現させ、そして文献の記載と同様にして精製した
。

ｔ　ＣＤＮＡの製造ニ リンホトキシン（ＴＮＦ−β）を産生ずる細胞系ＲＰＭ
Ｉ−１７８８の培養： ＡＴＣＣ（扁ＣＣＬ１５６）から得られた造血細胞系Ｒ
ＰＭＩ−１７８８を、攪拌式フラスコ中で胎児子牛血清
２０％を含有するＲＰＭＩ　１６４０培地中で、３７℃
及びＣＯ□５％において培養した。７〜８　Ｘ　１０’
細胞／　ｍｌの細胞密度に達したのち、培地を胎児子牛
血清５％を含有するＲＰＭＩ　１６４０培地と交換し、
そして腫瘍プロモーターＰＭＡ　（４β−ホルボール−
１２β−ミリステート−１６α−アセテート）をあらか
じめ定められた１　５０　ｎＭの最適濃度で添加した。

７０時間ののち、最大量のリンホトキシン（７００Ｕ／
ｍｊ）が産生された。その生物学的活性を文献記載のよ
うにして測定した（アガーワル、モファット及びハーキ
ンス著Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５９巻６８６
〜６９１頁１９８４年参照）。この時間ののち細胞を集
め、ＰＢ８２　ｍｌで洗浄し、そして溶解緩衝液（グア
ニジニウムチオシアナート６Ｍ。

くえん酸ナトリウム５　ｍＭ％　ｐＨ７，０，２−メル
カプトエタノール０．１Ｍ、サルコシル０．５％）中で
ホモジナイザーにより分解した。ＲＮＡを５゜７　Ｍ　
−ＣｓＣ１パッドにより３５０００　ｒｐｍで１夜沈降
させた。オリゴ（ａＴ）セルロース上で７フイニテイク
ロマトグラフイを２回行うことによりｍＲＮＡのポリＡ
含有分画を分離して精製した。

ＡＭＶ−逆転写酵素により、このポリＡ　ＲＮＡを一本
鎖ｃＤＮＡに転写した。第２の鎖の合成は同様に逆転写
酵素を用いて行った。二重鎖ｃＤＮＡを、制限エンドヌ
クレアーゼＳａｕ　６Ａによりその製造業者の指示に従
って切断し、１％アガロースゲル上で分画したニゲルか
ら１　ｋｂｐ±０，５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を溶
離し、そして脱燐酸化されＢａｍＨＩで線状化された大
腸菌ベクターｐＵＣ１８と連結した。このＤＮＡをＨＢ
　１０１株のコンピテント大腸菌細胞中に形質転換し、
そしてアンピシリン１００゛μｆｉ／ｍｌを含有するＬ
Ｂ板上に塗布した。微生物をニトロセルロースフィルタ
ー上に移し、自己複製させ、分解し、ＤＮＡを変性し、
そしてフィルター上に固定した。

ＤＮＡ合成装置（アプライド・バイオシステムスＨｆ）
　３ａ　ＯＡ型）を用いて、公知のヒトーリこれらのゾ
ンデは下記の配列を有していた。

５’ＣＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣ５’５’ＴＴ
ＧＣＴＧＧＧＧＴＣＴＣＣＡＡＴ　３’５’ＧＡＧＴＧ
ＣＡＧＣＣＡ（）（）ＧＴＴＣ５’オリゴヌクレオチド
ゾンデを５′−端でｒ　　３２　ｐ−ＡＴＰにより標識
し、そしてニトロセルロースフィルターをＩＭ−ＮａＣ
１，１ｍＭ−ＥＤＴＡ　、　　１％−８ＤＳ、１０％−
デキストランスルフアート中でゾンデと共に攪拌下に４
２℃で１夜培養した。

フィルターをＩＭ−ＮａＣ１，１ｍＭ−ＥＤＴＡ　、　
１％−８ＤＳ中でよく洗浄したのち、このフィルターを
フィルムと共に照射し、配列相同性を有するクローンを
調べた。相同性クローンを分離し、そして個別に分けた
。プラスミドＤＮＡを分離し、そして配列を定めた。こ
うして分離されたクローンの一つはｐＬｙｔ　１５で、
その配列を第３図に示す。

λアミノ酸配列２４〜１７１を有する比較物質（Δ２３
リンホトキシン）のための遺伝子断金 片をい有するハイブリッドプラスミドの製造ニブラスミ
ドｐＬｙｔ　１５から出発する。この実験は、Ｓａｕ　
３　Ａで切断されたリンホトキシンＣＤＮＡ　（ＫＳ図
）をｐＵＣ１８のＢａｍＨ１認識部位に挿入することに
より行われた。プラスミドｐＬｙｔ　１５を既知の手段
で、制限エンドヌクレアーゼＢｂｖ　１　／ＡｃＣ１な
らびにＡｃｃ１／５ａ１１によりその製造業者の指示に
従って開環した（第３図及び第４図）。

消化混合物を５％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動
により既知の手段で分離し、砕片を臭化エチジウムで染
色して見えるようにした。次いで両方の必要なリンホト
キシン遺伝子断片Ｂｂｖ１／ＡＣＣＩ及びＡｃｃ　１　
／　Ｓａｌ　１をアクリルアミドゲルから切り取り、電
気泳動によりマトリックスから分離した。これら両方の
断片０．１　ｐＭｏｌを０．１　ｐＭｏｌのベクター（
ｐＵＣ１８ＥｃｏＲ１’／　Ｓａｌ　１　）及び合成の
オリゴヌクレオチドＫＳ２３／２４と１５℃で１夜連結
した。

ＫＳ　２３　：　５’ＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＴＡＧＣ３
’ＫＳ　２４　：　３’ＧＴ、ＡＣ（）ＴＡＴＣＧＴＧ
ＧＧ　３’第４図に示すようＫして、ハイブリッドプラ
スミドｐＫＳ　５０１が得られた。

＆アミノ酸配列２！：１〜１７１を有するポリペプチド
（Δ２４リンホトキシン）のための遺伝子断片を含有す
るハイブリッドプラスミドの製造ニ プラスミドｐＬｙｔ１５から出発する。この実験、は、
Ｓａｕ　３Ａで切断されたリンホトキシンｃＤＮＡ（第
３図）をｐＵＣ１８のＢａｍＨ１認識部位に挿入するこ
とにより行われた。プラスミドｐＬｙｔ　１５を既知の
手段で、制限エンドヌクレアーゼＢｂｖ　１／　Ａｃ　
ｃｌ　ｒＡらびにＡｃｃ１／５ａｉ１によりその製造業
者の指示に従って開環した（第３図及び第５図）。

消化混合物を５％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動
により既知の手段で分離した。臭化エチジウムで染色し
て砕片を見えるようにした。

次いで両方の必要なリンホトキシン遺伝子断片Ｂｂｖ１
／ＡＣＣ１及びＡｃｃｌ／５ａｉｌをアクリルアミドゲ
ルから切り出し、電気泳動によりマトリックスから分離
した。これら両方の断片０．１　ｐＭｏｌを０．１　ｐ
Ｍｏｌのベクター（ｐＵＣＩ　Ｂ　ＥｃｏＲ１／　Ｓａ
ｌ　１　）及び合成オリゴヌクレオチドＫＳ　２７／２
８と１５℃で１夜連結した。

ＫＳ　２７　：　５’ＡＡＴＴＣＡＴＧＡ（）Ｃ６’Ｋ
Ｓ２８　：　３’　　ＧＴＡＣＴＣＧＴＧＧＧ５’第５
図に示すよ５にして、ハイブリッドプラスミドｐＫＳ　
３０２が得られた。

４、アミノ酸配列２６〜１７１を有するポリペプチド（
Δ２５リンホトキシン）のための遺伝子断片を含有する
ハイブリッドプラスミドの製造： このハイブリッドプラスミドの製造は、例２及び３の記
載と同様にして新規なオリゴヌクレオチドＫＳ２９／３
０を用いて行われた。

ＫＳ　２９　：　５’ＡＡＴＴＣＡＴＣ）　５’ＫＳ　
３０　：　３’　（）ＴＡＣＴＧＧ（）５’例２及び３
と同様にして新規なハイブリッドプラスミドｐＫｓ　３
０３が得られた（第６因参照）。

５、ハイブリッドプラスミドの形質転換：コンビテント
大腸菌細胞例えばｗ３１１０　（ＡＴＣＣ２７５２５）
Ｋ、ハイブリッドプラスミドｐＫｓ　３０１、ｐＫｓ　
５０２及びｐＫＳ　３０　：５をそれぞれ０．１〜１μ
Ｉ用いて形質転換し、そしてアンピシリン含有寒天板上
に塗布した。次いで正確に組込まれたリンホトキシン部
分配列を含有するクローンは、プラスミド高速分析法に
より同定することができた。

３、リンホトキシン活性を有するポリペプチドの発現： 例２．６及び４で得られたハイブリッドプラスミドに既
知の手段により、その特異なＥＣＯＲ１切断位置におい
て、発現のための合成シグナル配列を付与した。これら
の新規なプラスミドを大腸菌中に形質転換した。産生細
胞の培養は、普通の完全培地（ペプトン１０ｇ／ｌ、酵
母抽出物５　ｆｉ／ｌ、　ＮａＣ１１０ｇ／１３及びア
ンピシリンｌｏＯダ／Ａり中で行った。リンホトキシン
及びリンホトキシン突然変異株の産生には、下記の培地
を使用した（成分の量はＥｌ／１３）。

酵母抽出物、デイフコ　　　　　　　　　２゜ＮＺアミ
ンＡ１シェフイールド　　　　　　２゜Ｋ２　ＰＯ４４ ＫＨｔ　ＰＯ４１ ＮＨ４Ｃ１ｌ ＣａＣｌ２　・２　Ｈ２Ｏ０，０ｌ ＭｎＣｌ２　・４　Ｈ２Ｏ０，２ に２Ｓｏ４２．６ Ｍｇ５Ｏ４−７Ｈ２００，５ ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，
０５ＦｅＣ１３’　６Ｈ２００，００５ ＺｎＯＯ，０００５ ＣｕＣ１□”　２　Ｈ２Ｏ０，０００１Ｃｏ（ＮＯ３）
２　・６Ｈ２００，０００１ＮＨ４−モリブデー）　−
４Ｈ２００，０００１アンピシリンを１００■／ｌ添加 ｐＨ限界Ｚ０ １比較物質リンホトキシンの精製及び特性決定ニリンホ
トキシンを発現する相当する振盪培養物の遠心分離によ
り得られた、リンホトキシン産生菌株（欧州特許１６４
９６５号明細書参照）の大腸菌の湿潤菌体１３６Ｉに、
２０　ｍＭ−燐酸ナトリウム緩衝液８００ｆｆｌＡ’、
４００ｍＭ−アルギニン・ＨＣＩ、ｐＨ８，５を加え、
この細胞懸濁液を超音波操作により４℃で溶解した。１
２゜５％アンモニア水でｐＨ価を′１２に調節しながら
、２Ｍ　−ＭｎＣｌ２溶液２Ｑｍｌを用いて核酸を沈殿
させた。沈殿を遠心分離し、上澄液に４℃で攪拌しなが
ら硫酸アンモニウム６９０ｇを添加した。蛋白沈殿を遠
心分離して上澄液を捨てたのち、２０　ｍＭ−燐酸ナト
リウム緩衝液２００ｍＡ！、０．１ｍＭ−アルギニン−
ＨＣＩ、ｐＨ８，５に溶解した。この緩衝液に対して透
析したのち、順次Ｋ　Ｑ−セファロース、Ｓ−セファロ
ース及びモノＱ（７アルマシア製）においてイオン交換
クロマトグラフィを行った。こうして得られたリンホト
キシン溶液は、ＥＬＩＳＡ−測定によれば０６０１〜０
．０５％の残留大腸菌蛋白を含有していた。Ｎ−末端の
配列決定により、このものは下記のリンホトキシン誘導
体の混合物であることが認められた。

１）Ｍｅｔ−リンホトキシン： Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−８ｅｒ２）へ６−リンホドキシ
ン： Ｖａ１４１ｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ａｌ
ａ−Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ｔｈｒ６）Δ２６−リンホドキシ
ン： Ｈｉｓ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａ
ｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ８、比較物質Δ２３−リ
ンホトキシンの精製及び特性決定： 相当する振盪培養物から遠心分離された大腸菌細胞（例
２及び６参照）２０ｇを、２ｍＭ−燐酸ナトリウム緩衝
液２００ｍｌ、ｐＨ８，５に移し、１５分間の超音波処
理ののち、核酸を沈殿させるため’ｌ　Ｍ　−ＭｎＣ１
□溶液４　ｍｌを添加した。

遠心分離ののち上澄液を稀アンモニア水でｐＨ８，９と
なし、硫酸アンモニウム７８ｇで粗蛋白を沈殿させた。

沈殿を遠心分離したのち１０ｍＭ−燐酸ナトリウム緩衝
液１００ｍｌ、ｐＨ９，０に溶解し、この緩衝液に対し
て透析した。Ｑ−セファロース及びＳ−セファロース（
ファルマシア製）上でのクロマトグラフィにより、均質
な蛋白溶液が得られ、この溶液はＮ−末端がメチオニン
化されたΔ２６−リンホドキシンを９９％以上の純度（
５ＤＳ−ゲル電気泳動分析）による）で含有していた。

この蛋白は下記のＮ−末端配列を有する。

Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−１１ｅ ９Δ２４−’）７ホトキシンの精製及び特性決定：Δ２
４−リンホトキシン産生大腸菌の相当する振盪培養物か
らの湿潤菌体（例６及び６参照）１１０Ｉを遠心分離し
たのち、緩衝Ｋ　（２０ｍ１ｒｌ−燐酸ナトリウム、４
００　ｍＭ−アルギニン・ＨＣｌ、ｐＨ８，５）Ｉｌ中
に懸濁し、４℃で超音波処理により溶解した。核酸を沈
殿させるため、得られた懸濁液に２Ｍ−ＭｎＣ１２溶液
２Ｑｒｔｌｌを添加した。１．５時間ののち、遠心分離
により可溶性蛋白分画が得られた。この溶液のｐＨ価を
稀アンモニア水で８．９にした。４℃で硫酸アンモニウ
ム３９０ｇ（６０％飽和）を添加することにより、Δ２
４−リンホトキシンを攪拌下に沈殿させた。硫酸アンモ
ニウム沈殿を緩衝液（２０ｍＭ−燐酸ナトリウム、０．
１　ｍＭ−アルギニン・ＨＣＩ、ｐＨ１０，５）　３０
０ｒｎｌに溶解し、この緩衝液（２０１）に対して１夜
透析した。透析された蛋白溶液を陰イオン交換体カラム
（Ｑ−セファロースｆｆ１ファルマ、シア製）によりク
ロマトグラフ処理した。さらに精製するため、蛋白をＣ
Ｍ−セファロース及びＳ−セファロース（ファルマシア
製）上で順次にクロマトグラフィに付した。

この蛋白の純度は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動によれば９９％以上であった。この蛋白はＮ−末
端メチオニンを含有しない。Ｎ−末端配列は下記のとお
りである。

５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−１１ｅ１０、Δ２５−リンホト
キシンの精製及び特性決定：Δ２５−リンホトキシン産
生大腸菌の振盪培養物からの湿潤菌体（例４及び６参照
）１７６ｐを遠心分離したのち、緩衝液（２０ｍＭ−燐
酸ナトリウム、４００　ｍＭ−アルギニン、ｐＨ８，５
）６００Ｍで懸濁させた。細胞の溶解は４℃で超音波処
理により行った。核酸を沈殿させるため、懸濁液を２　
Ｍ　−Ｍｎ（：Ｌ□浴溶液最終含量４０　ｍＭにした。

同時に１２．５　％アンモニア水でｐＨ価を１５にした
。遠心分離ののち上澄′ｔｉ、１１につき硫酸アンモニ
ウム３９０ｙを添加して、Δ２５−リンホトキシンを４
℃で沈殿させた。沈殿を２０　ｍＭ−燐酸ナトリウム緩
衝液３００ｍｇ、ｐＨ１０，５に溶解した。不溶性蛋白
凝集物を除去するため、この濁った溶液を遠心分離し、
上澄液を５　ｍＭ−燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８，５
に対して透析し、次いでＱ−セファロースカラム（ファ
ルマシア製）によりクロマトグラフィを行った。さらに
精製するため、Δ２５−リンホトキシン含有分画をＣＭ
−セファロース及びＱ−セファロース（ファルマシア製
）上で頭次にクロマトグラフィに付した。こうして得ら
れた蛋白の純度は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動によれば９９％以上であった。この蛋白は発酵条
件により、Ｎ−末端メチオニンをわずかしか又は全く含
有しなかった。Ｎ−末端配列は下記のものと決定された
。

Ｔｈ　ｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−
Ｈｉ　５−Ｌｅｕ−Ｉ　１　ｅ−Ｇｌｙ−・・・１１、
ＴＮＦ−及びリンホトキシン−感受性の細胞系Ｌ９２９
及びｗＥＨＩ−１６４に対するヒト組換えリンホトキシ
ン（ＬＴ　）ならびに（ＬＴ　）突然変異株Δ２３、△
２４及びΔ２５の生体内細胞毒活性： 指数的に増殖している新たにトリプシン処理された細胞
５　Ｘ　１０３個を、完全培地（アールの塩含有Ｍｌｌ
ｉＭ＋　１０　％　Ｆｅ２　、フロラ・ラボラトリイズ
、メツケンハイム、ＦＲＣ）　１２５μｌ中の９６個の
孔を有する板に塗布し、６７℃及び００２５％において
飽和水蒸気雰囲気中で１夜培著した。物質の添加は翌日
に、培養孔１個につき２５　μｌの完全培地に混合して
行った。出発濃度には次の対照を並べた。ａ）培地のみ
、ｂ）培地を含むがリンホトキシンを含まない細胞、Ｃ
）既知の生物活性を有する力価測定されたＴＮＦ　−標
準。前記の条件下でさらに４８時間培養したのち、生存
した細胞をクリスタルバイオレット溶液（クリスタルバ
イオレット１５．ｐ、ＮａＣ１７ｇ、エタノール６４６
ｒｎｌ及び６７％ホルムアルデヒド溶液１７２．８ｍＡ
’を水で全量２１にしたで培養板を、細胞と結合してい
ないすべての染料分が除去されるまで水洗した。測定液
（エタノール５０％、酢酸０．１％）１００μｌを添加
したのち、細胞と結合した染料を、タイターチク・マル
チスキャンＭＣＣ／６４０　（７０つ・ラボラトリイズ
、メツケンノ・イム）を用いて５４０ｎｍで光度定量し
た。未処理の細胞対照と比較して５０％の細胞溶解を生
じさせる（吸光の減少により測定される）リンホトキシ
ンならびにＬＴ−突然変異株の濃度が示された。

単位（Ｕ）は、与えられた細胞数の５０％溶解を誘起す
るリンホトキシン又はＬＴ−突然変異株の量と定義され
る。

これから、指標細胞系Ｌ９２９に対し次表に示す生物活
性が明らかになった（８．２Ｘ１０’Ｕ／■蛋白の活性
を有する対照ＴＮＦ−標準と比較して補正）。

物質　　　　　　活性（ｕ／ｍｔｉ蛋白）リンホトキシ
ン（ＬＴ）　　　　６．Ｉ　Ｘ　１０’△２５−ＬＴ　
　　　　　　１．２　Ｘ　１０’Δ２４−ＬＴ　　　　
　　　２．ＯＸ　１０’Δ２５−ＬＴ　　　　　　　８
．５　Ｘ　１０’腫瘍細胞系ＷＥＨ，Ｉ−１６４に対し
ては、リンホト株 キシンならびにＬＴ−突然変異いについて下記の生物活
性が明らかになった（与えられた細胞数の５０チ溶解を
生じさせる蛋白濃度として示す）。

ＬＴ　　　　　　　　　　　　　　０．５５Δ２３−　
ＬＴ　　　　　　　　　０．２９Δ２４−ＬＴ　　　　
　　　　０．１５Δ２５−ＬＴ　　　　　　　　　０．
３８１２、腫瘍細胞に対するヒト組換えリンホトキシン
及びその突然変異株とヒト組換えインターフェロン−ｒ
との細胞毒相乗活性ニ リンホトキシン又はＬＴ−突然変異株とインターフェロ
ン−γとの相乗活性を調べるため、ヒト骨肉腫ＭＧ−６
３（これはリンホトキシン単独に対しては不感受性、で
あるが、インターフェロン−ｒにより投与量に応じて増
殖が抑制される）を用いた。この実験は下記のように行
われた。

完全培地（ＲＰＭＩ　１６４０　＋　１０％ＦＣ８）中
の９６個の孔を有する板に、その孔１個につき２×１０
３個の指数的に増殖している細胞を塗布し、３７℃及び
ＣＯ□５％において飽和水蒸気雰囲気中で１夜培養した
。次いで一定に保持されたインターフェロン−ｒ濃度（
岨換え体、ヒト）において、リンホトキシン又はリンホ
トキシン突然変異株を一連で５倍に稀釈した。その際の
出発濃度は１０ｎｇ蛋白／　ｍｌであった。最終容量は
すべての培養孔において１５０μｇであった。対照とし
ては、純粋な培地あるいはＩＦＮ　−ｒ及び／又はＬＴ
もしくはＬＴ−突然変異株を添加しないで培養された細
胞が用いられた。培養板を前記の条件下でさらに７２時
間培養し、次いで例１１と同様のクリスタルバイオレッ
ト染色法により染色し、光度測定した。

ＭＧ−６３腫瘍細胞に対するインターフェロン−ｒ及び
リンホトキシンの相乗効果を測定するための実験データ
を、第７図に示す。この図中の記号Ｏは細胞対照、そし
て曲線ａ　％　ｄは下記のものを示す。

ａ＝ＩＦＮ−ｒ滴定 ｂ＝−定のＩＦＮ　−ｒ　（０，４ｎｇ　／ｍｌ　）、
リンホトキシン滴定 Ｃ＝−定ノＩＦＮ　−ｒ　（２ｎｇ／’）、リンホトキ
シン滴定 ｄ＝リンホトキシン滴定 リンホトキシンとインターフェロン−γとの相乗作用は
下記の方法により測定された。

ａ）インターフェロンの抗増殖活性は、光学濃度から次
式により求められた。

ＩＦＮ−ｒの活性 例えばＩＦＮ−ｒが２　ｎｇ　／　ｍｌのとき（第７図
参照）、 ＩＦＮ−γの活性 ｂ）インターフェロン−γとリンホトキシンの組合せの
細胞毒活性は、式Ａにより次のように求められる。

例えばインターフェロン−ｒが２　ｎｇ　／　ｍｌでＬ
Ｔが２ｎｇ／７ｎｌのとき（第７図参照）、ＩＦＮ−γ
＋ＬＴの活性 Ｃ）リンホトキシンとインターフェロン−γの相乗効果
の測定： 例えばＩＦＮ−γが２ｎｇ／ｍｌでリンホトキシンが２
ｎｇ　／　ｍｌのとき（第７図及び例１２ａ及びｂ参照
）、 インターフェロン−ｒ　２　ｎｇ／ｍｌト！Ｊンホトキ
シン２　ｎｇ　／　ｍｌの組合せは、インターフェロン
−γ２　ｎｇ　／　ｒｎｌ単独により生じる細胞毒効果
を１．５７倍増強した。第２の測定において１．４１の
値が得られた。両細胞の平均値（１，４９’）が後記表
中に示される。

ＭＧ−６６腫瘍細胞系に対するインターフェロン−ｒ及
びリンホトキシン突然変異株△２４の相乗効果を測定す
るだめの実験データは、第８図に示される。Δ２４−　
ＬＴとインターフェロン−ｒの相乗作用は、前記のよう
にして測定される。第８図の記号■は細胞対照、そして
曲線ａ′〜ｄ′は下記のものを示す。

ａ’＝ＩＦＮ−γ滴定 ｂ′＝−定のＩＦＮ　　ｒ　（０，４ｎｇ／ｍ／）、Δ
２４滴定Ｃ′−−定のＩＦＮ　−ｒ　（２ｎｇ／＋＋＋
／）　、　Δ２４滴定ａ／　＝＝＝Δ２４滴定 インターフェロン−ｒにより生じる細胞毒性が、リンホ
トキシン又は本明細書に記載のリンホトキシン突然変異
株との組合せにより増強された結果（相乗効果）を、次
表にまとめて示す。

ＬＴ−種　　ＩＦＨ−ｒ　　　　リンホトキシンの添加
量（ｎｇ／／ｒｎＯ（ｎｇ／Ｍ）　　　１０　　２　　
０．４　　０．０８　０．０１６ＬＴ　　　　　　２．
０　　　　　１．６１　　１．４９　　１．４０　　１
．２７　　１．１５０．４　　　　　２．１６　　１．
８９　　１．７５　　１．８７　　１．４２Δ２３　　
　　２．０　　　　１．４８　　１．３８　　１．３２
　　１．１６　　１．０５０．４　　　　　２．０　　
　１．９０　　１．６２　　１．２７　　１．２４Δ２
４　　　　１０　　　　　２．４５　　２．０４　　１
．６９　　１．４９　　１．５５０．４　　　　　６．
５９　３．７５　２．６９　　１．９６　２．３７Δ２
５　　　　２．０　　　　２．６１　　１．８９　　１
．６３　１．３８　　１．４１ＯＡ８．３０　　３．４
５　３．０４　　１．４５　　１．６５この表中に示す
数値は、前記の例１２ａないし１２ｃで説明したように
して測定されたもので、独立した２回の実験からの平均
値である。

１３、毒性の測定： 供試物質の急性毒性を調べるため、４〜６週令の雄性Ｂ
ａ１ｂ／ｃマウスを使用した。動物を無作為に分け（そ
れぞれ１群５匹）、１週間の順応時間ののち、被験物質
を種々の用量（０，２５〜４．０１ｎ９／ｋｌｉ１体重
）で尾の外側静脈内に静脈注射した。投与容積は１０ｍ
１ｌ／ｋｇ体重で、注射は１０秒間に行った。被験物質
は静脈内注射の直前に、ＢＳＡ　（牛血清アルブミン）
０．２％を含有する生理食塩水に溶解した。対照として
は、ＢＳＡＯ１２％含有の生理食塩水１　ｏ　ｒｎｔ　
／ｋｇ体重を静脈内投与した動物を用いた。被験物質を
静脈内注射したのち、全動物を７日間にわたり観察した
。

次の症状が認められた。下痢、歩行運動減少、立毛、チ
アノーゼ及び死亡。そのほか定期的に！動物の体温及び
体重を測定した。

多くの実験結果は、リンホトキシンもその突然変異株（
Δ２３−ＬＴ、Δ２４−ＬＴ及びΔ２５−ＬＴ）も、用
量及び時間に応じて体温、体重及び歩行運動の低下を生
じさせ、モして立毛及び下痢を　［誘発することを示し
た。これらの症状はすでに注射の２時間後に、特に高い
用量において認められ、生存動物において７日の観察時
間内に完全に可逆性であった。観察された症状は、ＬＴ
で処置された動物において最も顕著であった。

ＬＴ−突然変異株で処置された動物は、ＬＴ処装のもの
と比較して全体的にあまり顕著でない症状を示した。し
かしΔ２３−ＬＴはΔ２４−ＬＴよりも明らかに強い症
状を引き起こし、Δ２５−ＬＴはΔ２３−ＬＴとΔ２４
−ＬＴの間の位置を占めた。

各ＬＤ、ｏ−値についての評価は下記のように計算され
た。

ＬＴのＬＤ、。　　　　：０．７９□／ｋｇ体重Δ２３
−ＬＴのＬＤ、ｏ：　１．８４１ｎ９Ａ９体重Δ２５−
ＬＴのり、Ｉ）、。：　５．１　ｍ９Ａ９体重Δ２４−
ＬＴのＬＤ、。：いずれの用量でも動物の５０％以上が
死亡しなかったので、計算で きない。

４面の簡単な説明 第１図はシグナル配列を有するとトーリンホトキシンの
アミノ酸配列図、第２図はこのヒト−リンホトキシン（
上段）とシグナル配列を有しないヒト腫瘍壊死因子（下
段）のアミノ酸配列の比較図、第３図はヒト−リンホト
キシンクローンの相補ＤＮＡの配列図、第４図、第５図
及び第６図はそれぞれリンホトキシン相補ＤＮＡから突
然変異遺伝子を有するハイブリッドプラスミドｐＫｓ　
５０１、ｐＫＳ　３０２及びｐＫｓ　６０３を製造する
ための工程図、第７図はＭＧ−６３腫瘍細胞に対するイ
ンターフェロン−γ及びリンホトキの シンの相乗効果を測定するため実験データを示＾ すグラフ、そして第８図は同じ腫瘍細胞に対するインタ
ーフェロン−ｒ及びΔ２４−リンホトキシンの相乗効果
を測定するための実験データを示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次式 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＴＨＲ−、ＳＥＲ−ＴＨＲ−、ＭＥＴ−ＴＨ
   Ｒ−、ＭＥＴ−ＳＥＲ−ＴＨＲ−、ＡＬＡ−ＴＨＲ−又
   はＡＬＡ−ＳＥＲ−ＴＨＲ−を意味する）で表わされる
   ポリペプチド、ならびに対立変異体及び突然変異誘起に
   より得られるリンホトキシン活性又はリンホトキシン様
   活性を有する誘導体。 ２、ＸがＳＥＲ−ＴＨＲ−又はＴＨＲ−である特許請求
   の範囲第１項に記載のポリペプチド。 ３、次式 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＴＨＲ−、ＳＥＲ−ＴＨＲ−、ＭＥＴ−ＴＨ
   Ｒ−、ＭＥＴ−ＳＥＲ−ＴＨＲ−、ＡＬＡ−ＴＨＲ−又
   はＡＬＡ−ＳＥＲ−ＴＨＲ−を意味する）で表わされる
   ポリペプチド、ならびに対立変異体及び突然変異誘起に
   より得られるリンホトキシン活性又はリンホトキシン様
   活性を有する誘導体において、そのＮ−末端に免疫原性
   作用を有するペプチド配列を追加含有するポリペプチド
   。 ４、（ａ）リンホトキシンを産生する細胞系からメッセ
   ンジャーＲＮＡを分離し、（ｂ）このメッセンジャーＲ
   ＮＡを相当する二重鎖相補ＤＮＡ中で複製し、（ｃ）こ
   の相補ＤＮＡを大腸菌のベクター中に挿入し、（ｄ）こ
   うして得られる新しいベクターにより大腸菌を形質転換
   し、（ｅ）リンホトキシン相補ＤＮＡクローンを遺伝子
   ゾンデ及びハイブリット形成により選択して特性決定し
   、（ｆ）このリンホトキシン遺伝子を含有するベクター
   を増殖して分離し、（ｇ）制限エンドヌクレアーゼを用
   いてこの遺伝子又は遺伝子断片を分離し、（ｈ）この遺
   伝子又は遺伝子断片を適当なオリゴヌクレオチドと共に
   発現ベクター中に挿入し、（ｉ）所望により遺伝子の５
   ′−端に追加のＤＮＡ配列を挿入し、（ｊ）この発現ベ
   クターにより大腸菌を形質転換し、そして（ｋ）希望す
   る遺伝子産生物を発現させ、分離し、そして精製するこ
   とを特徴とする、次式 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＴＨＲ−、ＳＥＲ−ＴＨＲ−、ＭＥＴ−ＴＨ
   Ｒ−、ＭＥＴ−ＳＥＲ−ＴＨＲ−、ＡＬＡ−ＴＨＲ−又
   はＡＬＡ−ＳＥＲ−ＴＨＲ−を意味する）で表わされる
   ポリペプチド、ならびに対立変異体及び突然変異誘起に
   より得られるリンホトキシン活性又はリンホトキシン様
   活性を有する誘導体、又はそのＮ−末端に免疫原性作用
   を有するペプチド配列を追加含有するポリペプチドの製
   法。 ５、次式 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＴＨＲ−、ＳＥＲ−ＴＨＲ−、ＭＥＴ−ＴＨ
   Ｒ−、ＭＥＴ−ＳＥＲ−ＴＨＲ−、ＡＬＡ−ＴＨＲ−又
   はＡＬＡ−ＳＥＲ−ＴＨＲ−を意味する）で表わされる
   ポリペプチド、ならびに対立変異体及び突然変異誘起に
   より得られるリンホトキシン活性又はリンホトキシン様
   活性を有する誘導体、又はそのＮ−末端に免疫原性作用
   を有するペプチド配列を追加含有するポリペプチドのた
   めにコードする遺伝子配列を含有するベクター。 ６、次式 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＡＴＧ、ＡＴＧＡＧＣ、ＧＣＴ又はＧＣＴＡ
   ＧＣを意味する）で表わされる遺伝子配列を有する、特
   許請求の範囲第５項に記載のベクター。 ７、次式 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＴＨＲ−、ＳＥＲ−ＴＨＲ−、ＭＥＴ−ＴＨ
   Ｒ−、ＭＥＴ−ＳＥＲ−ＴＨＲ−、ＡＬＡ−ＴＨＲ−又
   はＡＬＡ−ＳＥＲ−ＴＨＲ−を意味する）で表わされる
   ポリペプチド、ならびに対立変異体及び突然変異誘起に
   より得られるリンホトキシン活性又はリンホトキシン様
   活性を有する誘導体、又はそのＮ−末端に免疫原性作用
   を有するペプチド配列を追加含有するポリペプチドのた
   めにコードするＤＮＡ配列。 ８、ＸがＳＥＲ−ＴＨＲ−又はＴＨＲ−であるポリペプ
   チド配列のためにコードする、特許請求の範囲第７項に
   記載のＤＮＡ配列。 ９、次式 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＴＨＲ−、ＳＥＲ−ＴＨＲ−、ＭＥＴ−ＴＨ
   Ｒ−、ＭＥＴ−ＳＥＲ−ＴＨＲ−、ＡＬＡ−ＴＨＲ−又
   はＡＬＡ−ＳＥＲ−ＴＨＲ−を意味する）で表わされる
   ポリペプチド、ならびに対立変異体及び突然変異誘起に
   より得られるリンホトキシン活性又はリンホトキシン様
   活性を有する誘導体、又はそのＮ−末端に免疫原性作用
   を有するペプチド配列を追加含有するポリペプチドの少
   なくとも１種を含有する医薬。 １０、既知のリンホカインとの混合物を含有する、特許
   請求の範囲第９項に記載の医薬。