JPH08188597A - 変異型ヒト腫瘍壊死因子 - Google Patents
変異型ヒト腫瘍壊死因子Info
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- JPH08188597A JPH08188597A JP7016386A JP1638695A JPH08188597A JP H08188597 A JPH08188597 A JP H08188597A JP 7016386 A JP7016386 A JP 7016386A JP 1638695 A JP1638695 A JP 1638695A JP H08188597 A JPH08188597 A JP H08188597A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヒト腫瘍壊死因子のアミノ酸配列のうち第２
番目のアルギニンがリジンで置換されたアミノ酸配列を
含む変異型ヒト腫瘍壊死因子、変異型ヒト腫瘍壊死因子
遺伝子、該変異型ヒト腫瘍壊死因子遺伝子が組み込まれ
た組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡにより形質転換さ
れた形質転換体、該形質転換体を培養し、得られる培養
物から変異型ヒト腫瘍壊死因子を分離することを特徴と
する変異型ヒト腫瘍壊死因子の製造方法及び変異型ヒト
腫瘍壊死因子を有効成分として含む制癌剤。 【効果】 本発明により、各種腫瘍細胞に対して効果的
であり、かつ、毒性の少ない変異型ヒト腫瘍壊死因子が
得られる。
番目のアルギニンがリジンで置換されたアミノ酸配列を
含む変異型ヒト腫瘍壊死因子、変異型ヒト腫瘍壊死因子
遺伝子、該変異型ヒト腫瘍壊死因子遺伝子が組み込まれ
た組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡにより形質転換さ
れた形質転換体、該形質転換体を培養し、得られる培養
物から変異型ヒト腫瘍壊死因子を分離することを特徴と
する変異型ヒト腫瘍壊死因子の製造方法及び変異型ヒト
腫瘍壊死因子を有効成分として含む制癌剤。 【効果】 本発明により、各種腫瘍細胞に対して効果的
であり、かつ、毒性の少ない変異型ヒト腫瘍壊死因子が
得られる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、変異型ヒト腫瘍壊死因
子遺伝子、変異型ヒト腫瘍壊死因子およびその製造方法
並びにその用途に関する。
子遺伝子、変異型ヒト腫瘍壊死因子およびその製造方法
並びにその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】腫瘍壊死因子は、腫瘍細胞に対して直接
殺傷作用を起こす生物活性因子である。腫瘍壊死因子は
現在までに発見された生物活性因子の中で最も強い殺傷
力を持つものであり、かつ、他の生物因子、例えばイン
ターフェロン等のサイトカイン類と共に作用することに
より、抗腫瘍効果の強度及びその及ぼす範囲を拡大する
ことが可能である。ヒト由来の腫瘍壊死因子としては、
遺伝子組換え型のヒト腫瘍壊死因子−αが知られてお
り、そのアミノ酸配列、塩基配列も解明され、癌患者に
対する医薬品等としての開発が試みられていた。しか
し、ヒト腫瘍壊死因子−αを安全な使用量で使用した場
合では、有効な抗腫瘍効果は得られない。一方、有効な
抗腫瘍効果を得るためには、投与できる最大許容量の５
〜25倍の量を投与しなければならない。従って、従来の
ヒト腫瘍壊死因子−αそのままでは、臨床的に使用する
ことは困難である。
殺傷作用を起こす生物活性因子である。腫瘍壊死因子は
現在までに発見された生物活性因子の中で最も強い殺傷
力を持つものであり、かつ、他の生物因子、例えばイン
ターフェロン等のサイトカイン類と共に作用することに
より、抗腫瘍効果の強度及びその及ぼす範囲を拡大する
ことが可能である。ヒト由来の腫瘍壊死因子としては、
遺伝子組換え型のヒト腫瘍壊死因子−αが知られてお
り、そのアミノ酸配列、塩基配列も解明され、癌患者に
対する医薬品等としての開発が試みられていた。しか
し、ヒト腫瘍壊死因子−αを安全な使用量で使用した場
合では、有効な抗腫瘍効果は得られない。一方、有効な
抗腫瘍効果を得るためには、投与できる最大許容量の５
〜25倍の量を投与しなければならない。従って、従来の
ヒト腫瘍壊死因子−αそのままでは、臨床的に使用する
ことは困難である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒト腫瘍壊
死因子−αの有効な抗腫瘍効果が得られ、かつ、癌患者
に対する毒性（副作用）が低いヒト腫瘍壊死因子−αの
変異体、その製造方法及びそれを用いた制癌剤を提供す
ることを目的とする。
死因子−αの有効な抗腫瘍効果が得られ、かつ、癌患者
に対する毒性（副作用）が低いヒト腫瘍壊死因子−αの
変異体、その製造方法及びそれを用いた制癌剤を提供す
ることを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
に基づいて鋭意研究を行った結果、ヒト腫瘍壊死因子の
アミノ酸配列のうちＮ末端第２位のアミノ酸配列を置換
することにより、優れた抗腫瘍効果及び安全性を有する
変異型ヒト腫瘍壊死因子を見い出し、本発明を完成する
に至った。すなわち、本発明は、配列番号３で表される
ヒト腫瘍壊死因子のアミノ酸配列のうち第２番目のアル
ギニンがリジンで置換された配列番号１で表されるアミ
ノ酸配列を含む変異型ヒト腫瘍壊死因子である。
に基づいて鋭意研究を行った結果、ヒト腫瘍壊死因子の
アミノ酸配列のうちＮ末端第２位のアミノ酸配列を置換
することにより、優れた抗腫瘍効果及び安全性を有する
変異型ヒト腫瘍壊死因子を見い出し、本発明を完成する
に至った。すなわち、本発明は、配列番号３で表される
ヒト腫瘍壊死因子のアミノ酸配列のうち第２番目のアル
ギニンがリジンで置換された配列番号１で表されるアミ
ノ酸配列を含む変異型ヒト腫瘍壊死因子である。
【０００５】また、本発明は、前記変異型ヒト腫瘍壊死
因子のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む変異型ヒ
ト腫瘍壊死因子遺伝子である。ここで、該変異型ヒト腫
瘍壊死因子遺伝子としては、配列番号２で表されるもの
が挙げられる。
因子のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む変異型ヒ
ト腫瘍壊死因子遺伝子である。ここで、該変異型ヒト腫
瘍壊死因子遺伝子としては、配列番号２で表されるもの
が挙げられる。
【０００６】さらに、本発明は、前記変異型ヒト腫瘍壊
死因子遺伝子が組み込まれた組換え体ＤＮＡである。
死因子遺伝子が組み込まれた組換え体ＤＮＡである。
【０００７】さらに、本発明は、前記組換え体ＤＮＡに
より形質転換された形質転換体である。
より形質転換された形質転換体である。
【０００８】さらに、本発明は、前記形質転換体を培養
し、得られる培養物から変異型ヒト腫瘍壊死因子を分離
することを特徴とする変異型ヒト腫瘍壊死因子の製造方
法である。
し、得られる培養物から変異型ヒト腫瘍壊死因子を分離
することを特徴とする変異型ヒト腫瘍壊死因子の製造方
法である。
【０００９】さらに、本発明は、前記変異型ヒト腫瘍壊
死因子を有効成分として含む制癌剤である。
死因子を有効成分として含む制癌剤である。
【００１０】以下、本発明を詳細に説明する。 （１）ＤＮＡの合成およびプラスミドの構築 まず、本発明の変異型ヒト腫瘍壊死因子（以下「変異型
ｈＴＮＦ−α」という）遺伝子は、例えばＤＮＡ合成装
置を用いて合成することにより得られる。すなわち、天
然型のヒト腫瘍壊死因子−α（以下「ｈＴＮＦ−α」と
いう）の157 個のアミノ酸配列（配列番号３）中、第２
番目のアミノ酸残基であるアルギニンに対応するコドン
（「ＣＧＴ」）を、リジンに対応するコドン（「ＡＡ
Ａ」又は「ＡＡＧ」）に置換した塩基配列を合成する。
ｈＴＮＦ−α」という）遺伝子は、例えばＤＮＡ合成装
置を用いて合成することにより得られる。すなわち、天
然型のヒト腫瘍壊死因子−α（以下「ｈＴＮＦ−α」と
いう）の157 個のアミノ酸配列（配列番号３）中、第２
番目のアミノ酸残基であるアルギニンに対応するコドン
（「ＣＧＴ」）を、リジンに対応するコドン（「ＡＡ
Ａ」又は「ＡＡＧ」）に置換した塩基配列を合成する。
【００１１】得られたＤＮＡ断片については、ＰＣＲ
（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）法により該
ＤＮＡを増幅させることもできる。なお、求めるＤＮＡ
が得られたか否かの確認は、例えばアガロースゲル電気
泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により行うこ
とができる。
（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）法により該
ＤＮＡを増幅させることもできる。なお、求めるＤＮＡ
が得られたか否かの確認は、例えばアガロースゲル電気
泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により行うこ
とができる。
【００１２】次に、変異型ｈＴＮＦ−αをコードするＤ
ＮＡの全部又は一部を適当な制限酵素（例えば、Ｎco
Ｉ、ＢamＨＩ等）によって切り出し、これを適当なプロ
モーター、エンハンサー等の下流につないだ後、これを
形質転換可能な宿主に導入することにより形質転換させ
る。ここで使用されるベクターＤＮＡとしては、プラス
ミドベクター等が用いられる。宿主としては、大腸菌、
例えば大腸菌71／18株等が挙げられる。
ＮＡの全部又は一部を適当な制限酵素（例えば、Ｎco
Ｉ、ＢamＨＩ等）によって切り出し、これを適当なプロ
モーター、エンハンサー等の下流につないだ後、これを
形質転換可能な宿主に導入することにより形質転換させ
る。ここで使用されるベクターＤＮＡとしては、プラス
ミドベクター等が用いられる。宿主としては、大腸菌、
例えば大腸菌71／18株等が挙げられる。
【００１３】（２）変異型ｈＴＮＦ−αの精製 本発明の変異型ｈＴＮＦ−αを得るには、形質転換させ
て得られた形質転換体を一般に使用されている培地で培
養し、その培養物を集め、通常行われている方法によっ
て精製する。培地としては、例えばＬＢ培地（大腸菌培
養用）等が挙げられ、培養は通常37℃で16時間〜20時間
程度行う。培養後、遠心分離、超音波破砕等を行い、沈
殿物を除いた後、培養上清液を得る。
て得られた形質転換体を一般に使用されている培地で培
養し、その培養物を集め、通常行われている方法によっ
て精製する。培地としては、例えばＬＢ培地（大腸菌培
養用）等が挙げられ、培養は通常37℃で16時間〜20時間
程度行う。培養後、遠心分離、超音波破砕等を行い、沈
殿物を除いた後、培養上清液を得る。
【００１４】得られた培養上清液からの変異型ｈＴＮＦ
−αの分離、精製は、通常知られている蛋白質の精製方
法に従えばよい。例えば、塩析法、遠心分離法、透析、
各種クロマトグラフィー、電気泳動等を適当に組み合わ
せて精製を行う。各種クロマトグラフィーとしては、ゲ
ルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙
げられる。なお、精製品の純度及びおよその分子量の確
認については、ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）ポリ
ビニル酸アミドゲル電気泳動法（例えば、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動）等を用いて行う。
−αの分離、精製は、通常知られている蛋白質の精製方
法に従えばよい。例えば、塩析法、遠心分離法、透析、
各種クロマトグラフィー、電気泳動等を適当に組み合わ
せて精製を行う。各種クロマトグラフィーとしては、ゲ
ルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙
げられる。なお、精製品の純度及びおよその分子量の確
認については、ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）ポリ
ビニル酸アミドゲル電気泳動法（例えば、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動）等を用いて行う。
【００１５】（３）制癌剤 本発明の変異型ｈＴＮＦ−αとＴＮＦ−αを制癌剤とし
て投与するには、投与する対象を特に限定しない。本発
明の変異型ｈＴＮＦ−αを投与する方法は経口又は非経
口でもよく、経口投与には舌下投与を包含する。非経口
投与の場合には、注射、例えば皮下、腹腔内、筋肉、静
脈注射、点滴の他、坐剤等を含む。また、その投与量
は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異な
り、広範囲に変えることができる。また、非経口投与の
場合には、安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加
剤を含有し、通常単位投与量アンプル又は多投与量容器
の状態で提供される。上記の組成物は使用する際に適当
な担体、例えば発熱物質不含の滅菌した水で再溶解させ
る粉体であってもよい。
て投与するには、投与する対象を特に限定しない。本発
明の変異型ｈＴＮＦ−αを投与する方法は経口又は非経
口でもよく、経口投与には舌下投与を包含する。非経口
投与の場合には、注射、例えば皮下、腹腔内、筋肉、静
脈注射、点滴の他、坐剤等を含む。また、その投与量
は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異な
り、広範囲に変えることができる。また、非経口投与の
場合には、安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加
剤を含有し、通常単位投与量アンプル又は多投与量容器
の状態で提供される。上記の組成物は使用する際に適当
な担体、例えば発熱物質不含の滅菌した水で再溶解させ
る粉体であってもよい。
【００１６】経口投与の場合には、それに適用される錠
剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等とすればよく、特に顆粒
剤、細粒剤及び散剤は、必要に応じてカプセル剤として
単位量投与形態とすることができる。これら経口投与用
固形剤は、通常それらの組成物中に製剤上一般に使用さ
れる結合剤、包含剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤
等の添加物を含有する。また、経口用液体製剤として
は、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等いずれの状
態であってもよく、また、使用する際に再溶解させる乾
燥生成物にしてもよい。更に、その組成物は添加剤、保
存剤のいずれを含有してもよい。
剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等とすればよく、特に顆粒
剤、細粒剤及び散剤は、必要に応じてカプセル剤として
単位量投与形態とすることができる。これら経口投与用
固形剤は、通常それらの組成物中に製剤上一般に使用さ
れる結合剤、包含剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤
等の添加物を含有する。また、経口用液体製剤として
は、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等いずれの状
態であってもよく、また、使用する際に再溶解させる乾
燥生成物にしてもよい。更に、その組成物は添加剤、保
存剤のいずれを含有してもよい。
【００１７】ここで、下記の通り本発明の変異型ｈＴＮ
Ｆ−αの薬理試験例を挙げ、本化合物を用いた抗腫瘍効
果（制癌活性）について説明する。 〔試験例１〕 各種腫瘍細胞に対する制癌活性 （１）変異型ｈＴＮＦ−α及びｈＴＮＦ−αの比活性 96ウェルの培養プレートの１ウェル中にそれぞれ２×10
4 個のＬ９２９細胞をまき、37℃、５％CO2 の条件下、
インキュベーター中で１夜培養した。次に、各段階に希
釈した変異型ｈＴＮＦ−α又はｈＴＮＦ−αを各ウェル
に添加し、更に腺菌素Ｄ（終濃度１μg/ml) を添加した
後、37℃、５％CO2 条件下で引き続き16時間培養した。
培養後、培養液の吸光度（570nm)を測定した。Ｌ９２９
細胞を50％殺傷するときの上記変異型ｈＴＮＦ−α又は
ｈＴＮＦ−αの希釈度を１活性単位とした。その結果、
変異型ｈＴＮＦ−αの比活性は6.9(±0.５）×107U/mg
、ｈＴＮＦ−αの比活性は1.5(±0.3)×107U/mg であ
った。このことから、変異型ｈＴＮＦ−αの比活性はｈ
ＴＮＦ−αの比活性よりも４倍以上高いものであること
がわかった。
Ｆ−αの薬理試験例を挙げ、本化合物を用いた抗腫瘍効
果（制癌活性）について説明する。 〔試験例１〕 各種腫瘍細胞に対する制癌活性 （１）変異型ｈＴＮＦ−α及びｈＴＮＦ−αの比活性 96ウェルの培養プレートの１ウェル中にそれぞれ２×10
4 個のＬ９２９細胞をまき、37℃、５％CO2 の条件下、
インキュベーター中で１夜培養した。次に、各段階に希
釈した変異型ｈＴＮＦ−α又はｈＴＮＦ−αを各ウェル
に添加し、更に腺菌素Ｄ（終濃度１μg/ml) を添加した
後、37℃、５％CO2 条件下で引き続き16時間培養した。
培養後、培養液の吸光度（570nm)を測定した。Ｌ９２９
細胞を50％殺傷するときの上記変異型ｈＴＮＦ−α又は
ｈＴＮＦ−αの希釈度を１活性単位とした。その結果、
変異型ｈＴＮＦ−αの比活性は6.9(±0.５）×107U/mg
、ｈＴＮＦ−αの比活性は1.5(±0.3)×107U/mg であ
った。このことから、変異型ｈＴＮＦ−αの比活性はｈ
ＴＮＦ−αの比活性よりも４倍以上高いものであること
がわかった。
【００１８】（２）ヒト腫瘍細胞株に対する制癌活性 本試験では、腫瘍細胞株として、Ｍ7609（ヒト結腸癌細
胞株）、ＯＳ（ヒト骨肉癌細胞株）、ＬＡＸ（ヒト肺腺
癌細胞株）、ＭＧＣ（ヒト胃癌細胞株）、ＳＰＣ（ヒト
小細胞肺癌細胞株）を用いた。上記各腫瘍細胞株をそれ
ぞれ１×104 個／ウェルの濃度で96ウェル培養プレート
にまき、異なる濃度の変異型ｈＴＮＦ−α又はｈＴＮＦ
−αを添加した。37℃で培養し、さらに５％CO2 インキ
ュベーター中で24時間培養したのち、3H-TdRを0.5 μCi
／ウェル入れ、マルチヘッド細胞コレクターを用いて細
胞を回収し、放射活性としてＣＰＭ値を測定した。かか
るＣＰＭ値に基づいて、腫瘍細胞増殖抑制率を、下記式
により計算した。 腫瘍細胞増殖抑制率（％）＝〔（対照組のＣＰＭ値−実
験組のＣＰＭ値）／対照組のＣＰＭ値〕×100 その結果、変異型ｈＴＮＦ−αは濃度の変化に従ってＭ
ＧＣ及びＬＡＸ細胞に対する抑制作用が異なり、２×10
4U/mg の時にのみ部分的抑制作用が見られた。
胞株）、ＯＳ（ヒト骨肉癌細胞株）、ＬＡＸ（ヒト肺腺
癌細胞株）、ＭＧＣ（ヒト胃癌細胞株）、ＳＰＣ（ヒト
小細胞肺癌細胞株）を用いた。上記各腫瘍細胞株をそれ
ぞれ１×104 個／ウェルの濃度で96ウェル培養プレート
にまき、異なる濃度の変異型ｈＴＮＦ−α又はｈＴＮＦ
−αを添加した。37℃で培養し、さらに５％CO2 インキ
ュベーター中で24時間培養したのち、3H-TdRを0.5 μCi
／ウェル入れ、マルチヘッド細胞コレクターを用いて細
胞を回収し、放射活性としてＣＰＭ値を測定した。かか
るＣＰＭ値に基づいて、腫瘍細胞増殖抑制率を、下記式
により計算した。 腫瘍細胞増殖抑制率（％）＝〔（対照組のＣＰＭ値−実
験組のＣＰＭ値）／対照組のＣＰＭ値〕×100 その結果、変異型ｈＴＮＦ−αは濃度の変化に従ってＭ
ＧＣ及びＬＡＸ細胞に対する抑制作用が異なり、２×10
4U/mg の時にのみ部分的抑制作用が見られた。
【００１９】（３）マウス腫瘍細胞株に対する増殖抑制
作用 本試験では、腫瘍細胞株として、マウス白血病Ｌ1210細
胞、マウスメラノーマＢ16細胞、マウスＹＡＣ−１細
胞、マウス白血病Ｐ388 細胞、マウス白血病Ehclich(E
C) 腹水癌細胞を用いた。上記（２）と同様にして変異
型ｈＴＮＦ−α又はｈＴＮＦ−αのマウス腫瘍細胞に対
する増殖抑制作用の試験を行った。結果を表１に示す。
作用 本試験では、腫瘍細胞株として、マウス白血病Ｌ1210細
胞、マウスメラノーマＢ16細胞、マウスＹＡＣ−１細
胞、マウス白血病Ｐ388 細胞、マウス白血病Ehclich(E
C) 腹水癌細胞を用いた。上記（２）と同様にして変異
型ｈＴＮＦ−α又はｈＴＮＦ−αのマウス腫瘍細胞に対
する増殖抑制作用の試験を行った。結果を表１に示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】表１から明らかなとおり、本発明の変異型
ｈＴＮＦ−α（表１中「[Lys2]hTNF-α」と表示）は、
上記各種のマウス腫瘍細胞Ｐ388 、Ｌ1210、Ｂ16及びＹ
ＡＣ−１に対して一定の増殖抑制作用を有していた。こ
れに対して、ｈＴＮＦ−αは、変異型ｈＴＮＦ−α（[L
ys2]hTNF- α）と比較して腫瘍細胞増殖抑制作用は弱い
ものであった。
ｈＴＮＦ−α（表１中「[Lys2]hTNF-α」と表示）は、
上記各種のマウス腫瘍細胞Ｐ388 、Ｌ1210、Ｂ16及びＹ
ＡＣ−１に対して一定の増殖抑制作用を有していた。こ
れに対して、ｈＴＮＦ−αは、変異型ｈＴＮＦ−α（[L
ys2]hTNF- α）と比較して腫瘍細胞増殖抑制作用は弱い
ものであった。
【００２２】（４）変異型ｈＴＮＦ−α及びｈＴＮＦ−
αのマウス移植性腫瘍Ｐ388 白血病細胞に対する増殖抑
制効果 成長期のマウスからＰ388 腹水癌細胞を採取し、生理食
塩水に１：３に希釈した後、１匹ずつＤＳＡ／２マウス
に0.2ml/匹接種した。腫瘍接種翌日から１日１回、計５
日間、マウス腹腔に変異型ｈＴＮＦ−α又はｈＴＮＦ−
αを投与した。投与後の生存日数を記録し、マウス生存
延長率を計算した。なお、対照として、変異型ｈＴＮＦ
−α及びｈＴＮＦ−αのいずれも投与しない組（生理食
塩水のみを投与）を用いた。生存延長率は、下記式によ
り求めた。 生存延長率（％）＝〔（投与組平均生存日数−対照組平
均生存日数）／対照組平均生存日数〕×100 結果を表２に示す。
αのマウス移植性腫瘍Ｐ388 白血病細胞に対する増殖抑
制効果 成長期のマウスからＰ388 腹水癌細胞を採取し、生理食
塩水に１：３に希釈した後、１匹ずつＤＳＡ／２マウス
に0.2ml/匹接種した。腫瘍接種翌日から１日１回、計５
日間、マウス腹腔に変異型ｈＴＮＦ−α又はｈＴＮＦ−
αを投与した。投与後の生存日数を記録し、マウス生存
延長率を計算した。なお、対照として、変異型ｈＴＮＦ
−α及びｈＴＮＦ−αのいずれも投与しない組（生理食
塩水のみを投与）を用いた。生存延長率は、下記式によ
り求めた。 生存延長率（％）＝〔（投与組平均生存日数−対照組平
均生存日数）／対照組平均生存日数〕×100 結果を表２に示す。
【００２３】
【表２】 この実験から明らかなとおり、変異型ｈＴＮＦ−αを２
×104U/ 匹投与した場合に、マウス移植性腫瘍Ｐ388 白
血病細胞に対する一定の治療効果が認められた。ｈＴＮ
Ｆ−αを投与した組の場合は、投与３日後にマウスは全
て死亡した。これは、対照群よりも平均生存日数が少な
いことから、ｈＴＮＦ−αの副作用が強いか、又はｈＴ
ＮＦ−αが腫瘍Ｐ388 白血病細胞の拡散を促進している
ものと考えられる。
×104U/ 匹投与した場合に、マウス移植性腫瘍Ｐ388 白
血病細胞に対する一定の治療効果が認められた。ｈＴＮ
Ｆ−αを投与した組の場合は、投与３日後にマウスは全
て死亡した。これは、対照群よりも平均生存日数が少な
いことから、ｈＴＮＦ−αの副作用が強いか、又はｈＴ
ＮＦ−αが腫瘍Ｐ388 白血病細胞の拡散を促進している
ものと考えられる。
【００２４】
（１）ＤＮＡの合成、発現プラスミドの構築及び大腸菌
の形質転換 変異を導入する合成ＤＮＡについては、自動ＤＮＡ合成
機を用いて合成した。発現ベクターpSB-92がもつプロモ
ーターとターミネーターとの間のクローニングサイトを
制限酵素ＮcoＩ及びＢamＨＩで切断して除き、ＤＮＡを
回収した。次に、合成により得られた変異型ｈＴＮＦ−
αと、前記のように処理したpSB-92とをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて結合し、発現プラスミドpSB-TNF-K2を得
た。これを大腸菌71／18に形質転換した。
の形質転換 変異を導入する合成ＤＮＡについては、自動ＤＮＡ合成
機を用いて合成した。発現ベクターpSB-92がもつプロモ
ーターとターミネーターとの間のクローニングサイトを
制限酵素ＮcoＩ及びＢamＨＩで切断して除き、ＤＮＡを
回収した。次に、合成により得られた変異型ｈＴＮＦ−
αと、前記のように処理したpSB-92とをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて結合し、発現プラスミドpSB-TNF-K2を得
た。これを大腸菌71／18に形質転換した。
【００２５】（２）変異型ｈＴＮＦ−αの精製 上記（１）で得られた形質転換体を37℃で16〜20時間培
養し、培養後、菌体をTrisバッファーに懸濁し、菌体浮
遊液を調製した。次いで、超音波破砕、遠心分離を行い
沈殿を除去して上澄み液を得た。これに40％硫酸アンモ
ニアを添加し、遠心して沈殿を除去した。得られる上清
液に60％硫酸アンモニアを添加して遠心し、沈殿物を得
た。次に、リン酸バッファー（pH6.9)を用いて透析した
のち、得られる透析内液を、0-0.5 ＭのNaCl濃度勾配と
したＣＭ−sepharose カラムによりイオン交換クロマト
グラフィーを行い、ＴＮＦ分画を回収した。ＴＥバッフ
ァー（pH7.8)を用いて透析し、0-0.5 ＭのNaCl濃度勾配
としたイオン交換クロマトグラフィーによりＴＮＦ分画
を回収した。ＰＢＳを用いて透析を行った後、Sephacry
l 200 カラムによるゲルクロマトグラフィーにより、変
異型ｈＴＮＦ−αを精製した。精製結果を表３に示す。
養し、培養後、菌体をTrisバッファーに懸濁し、菌体浮
遊液を調製した。次いで、超音波破砕、遠心分離を行い
沈殿を除去して上澄み液を得た。これに40％硫酸アンモ
ニアを添加し、遠心して沈殿を除去した。得られる上清
液に60％硫酸アンモニアを添加して遠心し、沈殿物を得
た。次に、リン酸バッファー（pH6.9)を用いて透析した
のち、得られる透析内液を、0-0.5 ＭのNaCl濃度勾配と
したＣＭ−sepharose カラムによりイオン交換クロマト
グラフィーを行い、ＴＮＦ分画を回収した。ＴＥバッフ
ァー（pH7.8)を用いて透析し、0-0.5 ＭのNaCl濃度勾配
としたイオン交換クロマトグラフィーによりＴＮＦ分画
を回収した。ＰＢＳを用いて透析を行った後、Sephacry
l 200 カラムによるゲルクロマトグラフィーにより、変
異型ｈＴＮＦ−αを精製した。精製結果を表３に示す。
【００２６】
【表３】
【００２７】（３）ＳＤＳポリビニル酸アミドゲル電気
泳動 精製した変異型ｈＴＮＦ−αについて、ＳＤＳポリビニ
ル酸アミドゲル電気泳動を行った。結果を図１に示す。
図中、レーン１、２、３及び４は、それぞれ分子量マー
カー、菌体培養後の培養物、イオン交換クロマトグラフ
ィー後の分画、ゲルクロマトグラフィー後の分画の電気
泳動図を示す。
泳動 精製した変異型ｈＴＮＦ−αについて、ＳＤＳポリビニ
ル酸アミドゲル電気泳動を行った。結果を図１に示す。
図中、レーン１、２、３及び４は、それぞれ分子量マー
カー、菌体培養後の培養物、イオン交換クロマトグラフ
ィー後の分画、ゲルクロマトグラフィー後の分画の電気
泳動図を示す。
【００２８】
【発明の効果】本発明により、各種腫瘍細胞に対して効
果的であり、かつ、毒性の少ない変異型ヒト腫瘍壊死因
子が得られる。
果的であり、かつ、毒性の少ない変異型ヒト腫瘍壊死因
子が得られる。
【００２９】
【００３０】配列番号：１ 配列の長さ：１５７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Val Lys Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro 1 5 10 Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln 15 20 25 Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu 30 35 40 Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu 45 50 55 Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr 60 65 70 His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr 75 80 85 Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln 90 95 100 Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro 105 110 115 Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu 120 125 130 Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser 135 140 145 Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 150 155
【００３１】配列番号：２ 配列の長さ：４７１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： A GCC ATG GTA AAA TCT AGC TCT CGC ACT CCA TCT GAC AAA CCA Met Val Lys Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro 1 5 10 GTT GCT CAT GTT GTT GCT AAC CCA CAG GCT GAA GGT CAG CTG CAA Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln 15 20 25 TGG CTG AAC CGT CGT GCT AAC GCT CTG CTG GCT AAC GGT GTT GAA Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu 30 35 40 CTG CGT GAC AAC CAG CTT GTG GTA CCG TCT GAA GGT CTG TAC CTG Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu 45 50 55 ATC TAC TCC CAG GTT CTT TTC AAA GGT CAG GGT TGC CCA TCT ACA Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr 60 65 70 CAC GTT CTG CTT ACC CAC ACT ATC TCT CGT ATT GCT GTT TCC TAC His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr 75 80 85 CAG ACT AAA GTT AAC CTG CTG TCT GCG ATC AAA TCT CCG TGC CAG Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln 90 95 10 CGT GAA ACC CCA GAA GGT GCT GAA GCT AAA CCA TGG TAT GAA CCG Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro 105 110 115 ATT TAC CTT GGT GGT GTT TTC CAA CTG GAG AAG GGT GAC CGT CTG Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu 120 125 130 TCT GCT GAA ATC AAC CGT CCA GAC TAC CTT GAC TTC GCT GAA TCT Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser 135 140 145 GGT CAG GTA TAC TTC GGT ATT ATC GCT CTG TGA Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 150 155
【００３２】配列番号：３ 配列の長さ：１５７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro 1 5 10 Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln 15 20 25 Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu 30 35 40 Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu 45 50 55 Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr 60 65 70 His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr 75 80 85 Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln 90 95 100 Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro 105 110 115 Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu 120 125 130 Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser 135 140 145 Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 150 155
【図１】ＳＤＳ−ポリビニル酸アミドゲル電気泳動の結
果を示す図である。
果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｌ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (7)
- 【請求項１】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
む変異型ヒト腫瘍壊死因子。 - 【請求項２】 請求項１記載の変異型ヒト腫瘍壊死因子
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む変異型ヒト腫
瘍壊死因子遺伝子。 - 【請求項３】 アミノ酸配列をコードするＤＮＡが配列
番号２で表されるものである、請求項２記載の変異型ヒ
ト腫瘍壊死因子遺伝子。 - 【請求項４】 請求項２又は３記載の変異型ヒト腫瘍壊
死因子遺伝子が組み込まれた組換え体ＤＮＡ。 - 【請求項５】 請求項４記載の組換え体ＤＮＡにより形
質転換された形質転換体。 - 【請求項６】 請求項５記載の形質転換体を培養し、得
られる培養物から変異型ヒト腫瘍壊死因子を分離するこ
とを特徴とする変異型ヒト腫瘍壊死因子の製造方法。 - 【請求項７】 請求項１記載の変異型ヒト腫瘍壊死因子
を有効成分として含む制癌剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP01638695A JP3344609B2 (ja) | 1995-01-09 | 1995-01-09 | 変異型ヒト腫瘍壊死因子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP01638695A JP3344609B2 (ja) | 1995-01-09 | 1995-01-09 | 変異型ヒト腫瘍壊死因子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08188597A true JPH08188597A (ja) | 1996-07-23 |
| JP3344609B2 JP3344609B2 (ja) | 2002-11-11 |
Family
ID=11914836
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP01638695A Expired - Fee Related JP3344609B2 (ja) | 1995-01-09 | 1995-01-09 | 変異型ヒト腫瘍壊死因子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3344609B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005042008A1 (ja) * | 2003-10-31 | 2005-05-12 | Gen-Ichiro Soma | 抗悪性神経膠腫剤及び動物用抗悪性神経膠腫剤 |
-
1995
- 1995-01-09 JP JP01638695A patent/JP3344609B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005042008A1 (ja) * | 2003-10-31 | 2005-05-12 | Gen-Ichiro Soma | 抗悪性神経膠腫剤及び動物用抗悪性神経膠腫剤 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3344609B2 (ja) | 2002-11-11 |
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