KR100496460B1 - 폴리펩티드 - Google Patents

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Abstract

면역담당 세포에 의하여 인터페론-감마의 생성을 유도할 수 있는 안정한 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 시스테인을 다른 아미노산으로 치환함으로써 통상적으로 야생형 폴리펩티드에서 유래하며 인터페론-감마를 생성할 수 있는 특정의 아미노산 서열을 가진다. 본 발명의 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드보다 유의하게 높은 안정성과 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생성유도 활성을 가지고 있다. 이러한 활성 외에도 본 발명의 폴리펩티드는 킬러 세포의 생성을 유도하고 그 세포독성을 증강시키는 현저한 활성을 발휘 할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 재조합 DNA 기술을 이용하는 본 발명의 방법에 의하여 용이하게 제조할 수 있다. 따라서 본 발명의 폴리펩티드는 바이러스성 질환, 감염증, 악성 종양 및 면역질환 등의 각종 감수성 질환의 치료 및/또는 예방에 사용할 수 있다.

Description

폴리펩티드
본 발명은 신규의 생물학적 활성 폴리펩티드에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 면역담당 세포에 의하여 인터페론-감마(이하, 간단히 “IFN-γ”라 함)의 생성을 유도할 수 있는 인공적으로 창성(創成)된 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명자들은 면역담당 세포에 의해 IFN-γ생성을 유도할 수 있는 몇가지 폴리펩티드(이하, 간단히 “야생형 폴리펩티드”라 함) 및 이 야생형 폴리펩티드를 코우드하는 클로닝된 cDNA를 분리하는데 성공하였다. 관련된 발명은 일본국 특허공개 제27,189/96호 공보 및 제193,098/96호 공보와 일본국 특허출원 제67,434/96호에 개시되어 있다. 야생형 폴리펩티드에는 통상적으로 서열번호(SEQ ID NO:) 1 ~ 3을 동감성 부분 아미노산 서열로서 함유하고 있고, 또한 이들은 유용한 생물학적 활성 단백질인 IFN-γ의 생성을 유도하는 성질외에도 통상적으로 킬러 세포 생성을 유도하는 성질과 그 세포독성을 증강하는 성질을 가지고 있다는 것은 공지되어 있다. 이러한 성질들로 인하여 항바이러스제, 살균제, 항종양제 및/또는 면역질환제 등으로서의 야생형 폴리펩티드의 이용이 크게 기대되고 있다.
그러나 본 출원인에 의한 일본국 특허출원 제67,434/96호에 개시된 바와 같이 천연 세포는 통상적으로 야생형 폴리펩티드를 소망량으로 생성할 수 없다는 문제가 있다. 본 발명자들은 그 원인에 대해 예의 검토한 결과, 야생형 폴리펩티드는 통상적으로 천연 세포에서 생물학적 활성을 전혀 나타내지 않는 선구체 형태로 존재하고 있음을 판명하였다. 이 선구체는 본 출원인에 의한 일본국 특허출원 제207,691/96호 및 제213,267/96호에 기재된 바와 같이 인터로이킨-1β 변환효소 등의 변환효소의 작용에 의해 그 활성형으로 변환됨이 판명되었다.
야생형 폴리펩티드는 다른 원인으로서 상기한 문제에 내포되어 있는 바와 같이 불안정성을 가지고 있는 것으로 생각할 수 있다. 최근 수년사이의 재조합 기술의 진보에 따라 생물학적 활성 단백질중의 아미노산 하나 이상을 제거 및/또는 치환하여 돌연변이 유발 폴리펩티드를 개발하는 것이 용히해 졌다. 그러나 단백질에 대해 개별적으로 시행착오를 하지 않는 한 진보된 재조합 DNA 기술에 의해서도 고유 활성을 가진 단백질 모두의 안정성을 향상시킬 수 없었다.
상기한 점을 고려하여 본 발명의 제1과제는 야생형 폴리펩티드의 생물학적 활성을 실질적으로 유지하면서도 안정성이 현저하게 향상된 폴리펩티드를 제공함에 있다.
본 발명의 제2과제는 이 폴리펩티드의 제조방법을 제공함에 있다.
본 발명의 제3발명은 이 폴리펩티드의 의약으로서의 용도를 제공함에 있다.
본 발명자들은 상기한 과제들을 해결하고자 예의 연구를 한 결과, 시스테인 하나 이상을 다른 아미노산으로 치환한 서열번호(SEQ ID NO:) 1 ~ 3의 부분 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드 유래 또는 시스테인이 치환된 위치를 제외한 위치에 아미노산 하나 이상을 부가, 제거 및/또는 치환한 시스테인 치환 아미노산 서열 유래의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드가 야생형 폴리펩티드보다 훨씬 안정하다는 것을 판명하였고, 또한 시스테인이 치환된 안정한 폴리펩티드 몇가지는 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생성 유도 활성을 야생형 폴리펩티드 보다 유의하게 높게 나타낸다는 것을 판명하였다. 이들 폴리펩티드는 재조합 DNA기술을 이용함으로써 소요량이 쉽사리 생성되고 독성이 거의 없다는 것이 판명되었다. 이 사실에 근거하여 본 발명의 폴리펩티드는 IFN-γ 유도제로서 뿐만 아니라 의약으로서도 유효하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 제1과제는 면역담당 세포에 의한 인터페론-감마 생성을 유도할 수 있고, 서열번호 1 ~ 3에 나온 각각의 동감성 서열을 그대로 유지하면서 시스테인 하나 이상이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 동감성 서열의 것들을 포함하고 치환된 시스테인의 것을 제외한 하나 이상의 부위에 아미노산 하나 이상이 부가, 제거 및/또는 치환된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 분리함으로써 달성된다.
본 발명의 제2과제는 본 발명의 폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 함유한 세포를 배양하여 폴리펩티드를 생성시키고, 생성된 폴리펩티드를 배양물로부터 채취하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법에 의해 달성된다.
본 발명의 제3과제는 본 발명의 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 감수성 질환 치료제에 의해 달성된다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시형태에 대하여 설명한다. 본 발명의 폴리펩티드는 면역 담당 세포에 의해 인터페론-감마의 생성을 유도할 수 있고, 서열번호 1 ~ 3에 나온 각각의 동감성 서열을 그대로 유지하면서 시스테인 하나 이상이 상이한 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 동감성 서열의 것을 포함하나 치환된 시스테인의 것을 제외한 하나 이상의 부위에 아미노산 하나 이상이 부가, 제거 및/또는 치환된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 모두 포함한다. 시스테인과 치환되는 상이한 아미노산은 어떤 종류에 한정되는 것이 아니고, 다른 아미노산과 치환된 아미노산 서열을 가진 생성된 폴리펩티드가 동감성 부분 아미노산 서열로서 서열번호 1 ~ 3을 가진 야생형 폴리펩티드와 같이 적당한 보조인자 존재하 또는 부재하에 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생성을 유도하는 활성을 나타내고 야생형 폴리펩티드보다 유의하게 높은 안정성을 나타내는 것이면 어떤 것이라도 좋다. 상이한 아미노산으로서는 세린, 트레오닌, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 히스티딘, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌 등이 있는데, 이들 중에서 가장 바람직한 아미노산은 세린 또는 알라닌이다.
하나 이상의 시스테인이 상이한 아미노산으로 치환되는 동감성 부분 아미노산 서열로서 서열번호 1 ~ 3을 가진 아미노산 서열의 예로서는 서열번호 4 또는 5를 가진 야생형 폴리펩티드이다. 서열번호 4는 N 말단으로부터 38번째, 68번째, 76번째 및 127번째 위치에 시스테인을 가지고 있고, 서열번호 5는 7번째, 75번째 및 125번째 위치에 시스테인을 가지고 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 4를 가진 야생형 폴리펩티드 유래의 것으로서 서열번호 6 ~ 12중의 어느 하나의 아미노산 서열을 가진 것들, 서열번호 5의 아미노산 서열을 가진 야생형 폴리펩티드 유래의 것으로서 서열번호 13 또는 14의 아미노산 서열을 가진 것들 및 소요의 생물학적 활성과 안정성을 유지하면서 시스테인이 치환된 위치를 제외한 위치에 하나 이상의 아미노산을 부가, 제거 및/또는 치환함으로써 서열번호 6 ~ 14중의 어느 하나에서 유래하는 아미노산 서열을 가진 것들을 포함한다. “하나 이상의 아미노산”이라 함은 부위 지향 돌연변이 유발 등의 종래 방법에 의해 통상적으로 부가, 제거 또는 치환할 수 있는 아미노산의 수를 의미한다. 서열번호 6 ~ 14중의 하나를 가진 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드의 경우보다 유의하게 높은 안정성과 생물학적 활성을 가지고 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드를 코우드하는 DNA로써 적당한 숙주 세포를 형질전환하여 이 DNA를 함유한 세포를 얻고, 이 DNA를 함유한 세포를 배양하여 폴리펩티드를 생성시킨후, 생성된 폴리펩티드를 배양물로부터 채취하는 재조합 DNA기술에 의해 제조할 수 있다. 추가로 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 소요량을 쉽사리 얻을 수 있는 본 발명의 폴리펩티드 제조를 위한 재조합 DNA기술을 이용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 사용되는 DNA는 천연의 공급원 또는 화학합성 유래의 DNA를 인공적으로 돌연변위 유발시키는 방법에 의해 얻을 수 있는 본 발명의 폴리펩티드 하나를 코우드하는 DNA를 모두 포함한다. 전자의 방법의 예로서는 천연 세포를 공급원으로 하여 이로부터 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열을 코우드하는 서열번호 25 또는 28의 뉴클레오드 서열을 가진 DNA를 제조한 다음, 이 DNA에 “오우벌랩 익스텐션 PCR법(overlap extension PCR method)” [문헌(Robert M. Horton et al, Methods in Enzymology, Vol.217 (New York : Academic Press. Inc., 1993), pp. 270 ~ 279)에 보고된 방법]을 적용하여 서열번호 4 또는 5에서의 시스테인에 대한 코돈 하나 이상을 상이한 아미노산에 대한 코돈으로 치환하는 방법을 들 수 있다. 본 발명의 DNA는 서열번호 25 유래의 서열번호 15 ~ 21의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 28 유래의 서열번호 22 및 23의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 15 ~ 23에 대한 상보적인 뉴클레오티드 서열 및 이들 뉴클레오티드 서열에 의해 코우드된 아미노산 서열을 변경함이 없이 뉴클레오티드 하나 이상을 다른 뉴클레오티드로 치환한 이들 뉴클레오티 유래의 것들 중의 어느 하나를 가진 DNA를 포함한다. 후자의 방법의 예로서는 서열번호 9 ~ 15의 뉴클레오티드 서열에 근거하여 본 발명의 DNA를 통상의 방법으로 제조할 수 있는 화학합성법을 들 수 있다. 어떠한 방법에 의해서라도 일단 제조된 본 발명의 DNA를 PCR을 이용하여 소요의 양까지 쉽사리 증폭시킬 수 있다.
이 분야에서 일반적으로 폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 숙주 세포에서 발현시켜 발현 효율을 향상시키거나 발현된 폴리펩티드의 생물학적 활성을 증대시키고자 할 경우에는 DNA중의 뉴클레오티드 하나 이상을 다른 것으로 치환할 수 있으며, 적당한 프로모우터 및/또는 인핸서를 DNA에 연결할 수 있다. 또한 본 발명의 DNA를 이러한 방식과 마찬가지로 변형시킬 수도 있다. 예컨대 생성된 폴리펩티드가 소요의 생물학적 활성과 안정성을 상실하지 않는 한, 서열번호 16에 나온 바와 같이 인터페론-α의 아형 α2b의 신호 펩티드를 포함한 적당한 신호 펩티드, 종결 코돈, 개시 코돈, 적당한 제한효소에 의해 인식부위에 대한 뉴클레오티드 서열을 서열번호 9 ~ 15의 뉴클레오티드 서열 중의 어떠한 서열의 5 ‘말단 및/또는 3’ 말단에다 임의로 연결할 수 있다.
본 발명의 DNA는 미생물, 식물 및 동물 유래, 특히 동물 유래의 적당한 숙주세포에 도입된 후에는 개선된 안정성과 생물학적 활성을 가진 본 발명의 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 본 발명의 DNA를 재조합 DNA형태로 하여 숙주세포에 도입한다. 재조합 DNA는 통상적으로 본 발명의 DNA 하나와 자율복제 가능한 벡터 하나를 포함하는데, 이들은 본 발명의 DNA를 얻게 되는 종래의 재조합 DNA기술에 의해 얻을 수 있다.
본 발명의 DNA를 삽입할 수 있는 벡터의 예로서는 pCD, pCDL-SRα, pKY4, pCDM8, pCEV4 및 pME18S를 비롯한 플라스미드 벡터를 들 수 있으며, 이들은 통상적으로 프로모우터, 인핸서, 복제기원, 전사 종결인자, 스플라이싱 서열 및/또는 선택 마아커 등, 숙주에서 본 발명의 DNA를 발현하기에 적합한 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있다. 본 출원인에 의해 일본국 특허 공개 제163,368호에 개시되어 있는 인터페론-α 프로모우터 또는 열충격 단백질 프로모우터 등의 프로모우터를 가진 벡터를 사용하면 외부 자극에 의해 형질 전환제에서 본 발명의 DNA 발현을 조절할 수 있다.
본 발명의 DNA를 벡터에 삽입하자면 이 분야에서의 종래의 방법을 사용할 수있다. 예컨대 상기한 벡터와 본 발명의 DNA를 함유한 유전자를 제한 효소 및/또는 초음파에 의해 절단한 후 본 발명의 DNA로부터 얻은 단편들을 벡터 단편으로 연결한다. 뉴클레오티드에 특이적으로 작용하는 제한효소, 바람직하게는 AccI, BamHI, BglII, BstXI, EcoRI, HindIII, NotI, PstI, SacI, SalI, SmaI, SpeI, XbaI, XhoI 등에 작용하는 제한 효소로 절단하면 DNA 단편과 벡터 단편의 연결이 용이해진다. DNA 단편과 벡터 단편을 연결할 경우, 필요에 따라서는 이들을 먼저 어니일링한 다음 생체내 또는 생체외에서 DNA 리가아제로 처리한다. 수득한 재조합 DNA를 미생물 또는 동물 유래의 숙주중에서 무한하게 복제할 수 있다.
재조합 DNA를 본 발명의 폴리펩티드 생성에 적합한 숙주 세포속에 도입한다. 이 기술분야에서 종래에 숙주 세포로 사용된 세포이면 본 발명에서 사용할 수 있는데, 생성된 폴리펩티드가 의약에 사용될 경우에는 효모 또는 포유동물 유래의 숙주세포가 보다 바람직하다. 포유동물 유래의 숙주 세포의 예로서는 인간, 원숭이 마우스 및 햄스터 유래의 표피세포, 간질세포 및 조혈세포가 있는데, 이들 중에는 3T3 세포, C127 세포, CHO 세포, CV-1 세포, COS 세포, HeLa 세포, MOP 세포 및 이들의 변이주를 포함한다.
본 발명의 DNA를 숙주속에 도입하자면 종래의 방법, 예컨대 DEAE-덱스트란법, 인산 칼슘 감염법, 일렉트로포레이션법, 리포펙션법, 마이크로인젝션법, 및 레트로바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 및 종두 바이러스 등을 사용하는 바이러스 감염법 등을 사용한다. 형질 전환체로부터 본 발명의 폴리펩티드를 생성하는 클론을 선별하자면 형질 전환체를 배양한 후 배양물 중에 본 발명의 폴리펩티드가 생성하였는가를 조사한다. 포유동물 숙주세포를 사용하는 재조합 DNA 기술은 문헌 [Toshio KUROKI, Masaru TANIGUCHI and Mitsuo OSHIMURA eds., Jikken-Igaku-Bessatsu, Saibo-Kogaku Handbook(세포공학 핸드북), (Tokyo, Japan: Yodosha. Co., Ltd., 1992), 및 Takashi YOKOTA and Kenichi ARAI eds., Jikken-Igaku-Bessatsu, Biomanual Series 3, Idenshi-Cloning-Jikken-Ho(유전자 클로닝 실험법), (Tokyo, Japan: Yodosha Co., Ltd., 1993)]에 상세하게 나와 있다.
본 발명의 DNA를 함유한 세포인 수득한 형질 전환체를 배지에서 배양하면 세포내 및/또는 세포외에서 본 발명의 폴리펩티드를 생성한다. 배지로서는 형질전환체를 배양하기 위한 종래의 배양배지를 사용한다. 배지는 일반적으로 완충액을 기재로 하여 여기에, 나트륨 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온, 인 이온 및 염소 이온 등의 무기 이온과, 세포의 대사능력에 따라 미량 영양소, 탄소원, 질소원, 아미노산 및 비타민류 등을 사용할 수 있으며, 또한 필요에 따라서는 혈청, 호르몬, 세포 성장 인자 및 세포 부착 인자 등을 사용한다.
배지의 예로서는 199 배지, DMEM 배지, Ham's F12 배지, IMDM 배지, MCDB 104 배지, MCDB 153배지, MEM 배지, RD 배지, RITC 80-7 배지, RPMI-1630 배지, RPMI-1640 배지 및 WAJC 404 배지가 있다.
다음과 같은 조건하에서 본 발명의 형질 전환체를 배양하면 본 발명의 폴리펩티드를 함유한 배양물이 생성된다. 즉 본 발명의 형질 전환체를 세포밀도 1×104 ~ 1×107개/ml, 보다 바람직하게는 1×105 ~ 1×106개/ml 되도록 배지에 접종한후 필요에 따라서는 배지를 새것으로 교체해주면서 세포를 약 37℃에서 1 ~ 7일간, 보다 바람직하게는 2 ~ 4일간, 부유배양 또는 단일층 배양으로 배양한다. 수득한 배양물1L당 통상적으로 본 발명의 폴리펩티드를 약 1㎍ ~ 1㎎의 농도로 함유 하는데, 이것은 사용된 형질 전환체의 종류 또는 배양 조건에 따라 달라진다.
수득한 배양물을 그대로 IFN-γ 유도제로 사용할 수 있으나, 통상적으로는 사용하기 전에 필요에 따라서는 초음파 처리, 세포용해 효소 및/또는 세척제로 균체를 파쇄한후 균체 또는 균체 파쇄물로부터 본 발명의 폴리펩티드를 여과, 원심분리 등에 의해 분리하고, 폴리펩피트 정제 단계에서 정제한다.
본 발명의 폴리펩티드를 정제하기 위하여는 이 기술분야에서의 종래의 생물학적 활성 폴리펩티드 정제법, 예컨대 염석, 투석, 여과, 농축, 분별침전, 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 등전점 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 전기영동 및/또는 등전점 겔 전기영동 등의 방법을 임의로 사용할 수 있다. 이렇게 하여 정제한 본 발명의 폴리펩티드를 최종용도에 따라 농축 및/또는 동결건조한다. 본 출원인에 의한 일본국 특허출원 제58,240/95호에 개시된 모노클로날 항체는 본 발명의 폴리펩티드 정제에 극히 유용하다. 항체를 사용하는 면역친화성 크로마토그래피에 의하여 최소한의 경비와 인력으로 비교적 고순도의 본 발명의 폴리펩티드를 얻을 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 통상적으로 면역담당 세포 배양배지에 가하여 IFN-γ를 생성시키거나 인간에게 투여하여 IFN-γ 감수성 질환을 치료 또는 예방한다. IFN-γ를 생성시킬 경우에 있어서 포유동물의 말초혈에서 분리한 임파구 또는 HBL-38 세포, Mo 세포 ATCC CRL8066, Jurkat 세포 ATCC CRL8163, HuT78 세포 ATCC TIB161, EL4 세포 ATCC TUB39, L12-R4 세포 등의 주화세포 및 이들의 돌연변이주 등을 본 발명의 폴리펩티드 0.1ng ~ 1㎍/ml, 바람직하게는 1 ~ 100ng/ml을 함유한 배지중에 부유시킨 다음, 필요에 따라 유사분열물질, 인터로이킨 2 및 항-CD3 항체등의 T세포 자극제 존재하에 배지를 새것으로 교체해주면서 종래방법으로 세포를 약 1 ~ 100 시간 배양한다. 생성된 IFN-γ를 채취하자면 수득한 배양물을 종래의 IFN-γ 정제법, 예컨대 염석, 투석, 여과, 농축, 분별침전, 겔 여과 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 등전점 크로마토그래피, 겔 전지영동 및 등전점 겔 전기영동 등에서 적절히 선택되는 방법으로 처리한다.
본 발명의 폴리펩티드는 IFN-γ 생성을 유도하므로 본 발명의 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 감수성 질환제를 인간에 투여하면 인체내에서 IFN-γ 생성을 유도하여 IFN-γ 감수성 질환을 치료 및/또는 예방할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 아래에 나오는 본 발명의 각 실시예에서와 같이 IFN-γ 유도활성외에도 NK세포, LAK 세포 (림포카인 활성화 킬러세포) 및 세포독성 T세포 등의 킬러세포의 세포독성을 증강시키는 활성 및/또는 킬러세포의 생성유도 활성을 가질 경우, 이들 킬러세포 역시 감수성 질환의 치료 및/또는 예방에 관여하게 된다. 따라서 본 발명에서 말하는 “감수성 질환”이라 함은 IFN-γ 및/또는 킬러세포의 직접 또는 간접 작용에 의해 치료 및/또는 예방할 수 있는 모든 질환을 포함한다.
이러한 감수성 질환으로서는 간염, 헤르페스, 첨규 콘딜롬 및 AIDS를 비롯한 바이러스성 질환, 칸디다증, 말라리아증, 크립토콕스증, 예르시아증, 및 결핵을 비롯한 감염증, 악성 신종양, 균상식육증 및 만성 육아종증을 비롯한 고형 악성종양, 성인 T 세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 악성 임파종을 비롯한 혈구계 악성종양, 알레르기, 류마티즘 및 교원병을 비롯한 면역질환, 및 골다공증 등을 들 수 있다. 추가로 인터로이킨 3을 함유한 본 발명의 약제는 백혈병과 골수종 이외에도 악성종양 치료시의 방사선 요법이나 화학요법에서 기인하는 백혈구 감소증 및 혈소판 감소증을 완전히 치료 또는 경감한다.
따라서 본 발명의 감수성 질환제를 항종양제, 항바이러스제, 항균제, 면역질환제, 혈소판증식제 및 백혈구 증식제 등의 형태로 하여 상기한 감수성 질환을 치료 및/또는 예방하는데 널리 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 약제를 통상적으로 고형물 기준으로 본 발명의 폴리펩티드를 0.000001 ~ 100w/w%, 바람직하게는 0.0001 ~ 0.1w/w% 함유하는 액제, 페이스트제, 또는 고형제제로 할 수 있는데, 제형과 용량은 치료 및/또는 예방하고자 하는 질환의 종류와 증상 및 용도에 따라 달라진다.
본 발명의 제제에는 본 발명의 폴리펩티드 단독으로서 뿐만 아니라 기타 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제, 면역 조성제 및 안정제를 첨가하고 필요에 따라서는 기타 생물학적 활성물질 1종 이상을 첨가하여, 각종 조성물을 제조할 수 있다. 안정제로서는 혈청 알부민 및 젤라틴을 비롯한 각종 단백질, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스, 락토오스, 트레할로오스, 소르비톨, 만니톨, 말티톨 및 락티톨 등의 각종 당류 및 인산 및/또는 시트르산계 완충액을 들 수 있다. 기타 생물학적 활성물질의 예로서는 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 인터로이킨 2, 인터로이킨 3, 인터로이킨 12, TNF-γ, TNF-β, 과립구-콜로니 자극인자, 과립구 매크로파아지 자극인자, 카르보콘, 시클로포스포아미드, 아클라루비신, 티오테파, 부술판, 안시타빈, 시타라빈 5-플루오로우라실, 5-플루오로-1-(테트라히드로-2-푸릴)우라실, 메토트렉세이트, 악티노마이신 D, 크로모마이신 A3, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 미토마이신 C, 빈크리스틴, 빈블라스틴, L-아스파라기나아제, 콜로이드상 방사성금, 크레스틴, 피시바닐, 렌티난 및 마루야마 백신 등을 들 수 있다.
이들 제제중에서 인터로이킨 2를 함유한 것들은 본 발명의 폴리펩티드가 면역담당 세포에 의해 IFN-γ 생성을 유도할 때 인터로이킨 2가 보조인자로 작용하므로 특히 유용하다. 따라서 추가로 천연 또는 재조합 인터로이킨 2를 함유한 이들 약제는 본 발명의 폴리펩티드의 단일작용에 의해 IFN-γ를 생성하기 어려운 면역담당 세포에 의해서도 소망하는 양의 IFN-γ의 생성을 유도할 수 있다.
추가로 인터로이킨 12를 함유한 본 발명의 약제는 본 발명의 폴리펩티드 또는 인터로이킨 12 자체가 달성할 수 없는 IFN-γ를 특히 고레벨로 유도할 수 있다. 더욱이 본 발명의 폴리펩티드는 면역 글로불린 E 항체의 생성에 대한 인터로이킨 12의 억제작용을 증강시키므로 인터로이킨 12를 함유한 본 발명의 제제는 아토피성 천식, 아토피성 기관지 천식, 건초열, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 혈관부종 및 아토피성 소화기 이상의 치료 및/또는 예방을 위한 면역질환제로 유용하다. 비교적 저함량이지만 인체내에 인터로이킨 12가 존재할 경우가 가끔 있으므로 본 발명의 폴리펩티드는 단독으로서도 인체에 있어서 소요의 효과를 달성할 수 있다.
본 발명의 제제는 투여에 적합한 물리적으로 분리되어 형성된 의약으로서 폴리펩티드를 1일 투여량 또는 1일 투여량의 1/40내지 몇 배(4배이하) 1회 투여량을 함유하는 제형단위의 것들을 포함한다. 이러한 의약의 예로서는 주사제, 액제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 설하제, 점안액, 비강 드롭제 및 좌제 등이 있다.
본 발명의 제제를 사용하여 아래에 나온 바와 같이 환자에게 경구 또는 비경구 투여하여 생체외에서 항종양 세포를 활성화 할 수 있는데, 이들 효과는 감수성 질환의 치료 및/또는 예방에 있다. 예컨대 본 발명의 제제는 통상적으로 환자의 증상과 회복을 관찰하면서 본 발명의 폴리펩티드를 1회 약 0.1㎍ ~ 약 50㎎, 바람직하게는 1회 1㎍ ~ 1mg의 투여량으로 하여 1일 1 ~ 4회 또는 1주 1 ~ 5회씩 1일 내지 1년간 환자에게 경구투여하거나 환자의 피내(皮內)조직, 피하(皮下)조직, 근육내 또는 혈관내에 비경구 투여한다.
본 발명의 제제는 인터로이킨 2를 사용하는 소위 “항종양 면역요법”에도 유용하다. 항종양 면역요법은 일반적으로, (가) 악성종양 환자의 체내에 직접 인터로이킨 2를 투여하는 방법 및 (나) 인터로이킨 2에 의해 생체외에서 활성화된 항종양 세포를 환자의 체내에 도입하는 방법(양자면역요법 : adoptive immunotherapy)의 두 가지로 대별되는데, 이들 방법중 어느 것이나 본 발명의 폴리펩티드와 함께 사용하면 현저히 개선된 효과를 발휘한다. 예컨대, (가)의 방법에서 본 발명의 폴리펩티드를 인터로이킨 2 투여와 동시에 또는 투여전에 성인 1인당 1회에 약 0.1㎍ ~ 1㎎을 1회 내지 10회에 걸쳐 환자에게 투여할 수 있다. 인터로이킨 2의 투여량은 악성종양의 종류, 환자의 증상 및 본 발명의 폴리펩티드 투여량에 따라 달라지는데, 통상적으로 성인 1인당 1회당 10,000 ~ 1,000,000 단위이다. (나)의 방법에서는 악성종양 환자로부터 채취한 단핵세포 또는 임파구를 인터로이킨 2 존재하에 배양하는 배지에 대해 본 발명의 폴리펩티드를 통상적으로 세포 1×106개당 약 0.1ng ~ 1㎍의 양으로 첨가한다. 세포를 일정기간 동안 배양한후 배양물로부터 NK세포 또는 LAK 세포를 채취하여 환자의 체내로 되돌린다. 본 발명의 항종양 면역요법의 목표인 질환으로서는 결장암, 직장암, 위암, 갑상선암, 혀암, 방광암, 융모막암, 간암, 전립선암, 자궁암, 후두암, 폐암, 유방암, 악성 흑색종, 카포시 육종, 뇌종양, 신경아세포종양, 난소종양, 고환종양, 골육종, 췌장암, 신장암, 부신종 및 혈관내피종 등의 고형 악성종양과, 백혈병 및 악성 임파종 등의 혈구계 악성종양 등이 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 코우드하는 본 발명의 DNA는 소위 “유전자 요법”에도 유용하다. 종래의 유전자 요법에 의하여 본 발명의 DNA를 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스 등의 바이러스 유래의 백터에 삽압한후 또는 양이온 폴리머 또는 멤브레인 융합 리포좀에 첨가한후 IFN-γ 및/또는 킬러세포 감수성 질환을 가진 환자에게 직접 주사하여 도입할 수 있다. 혹은 DNA를 도입하기전에 환자로부터 채취한 임파구를 자체 이식함으로써 본 발명의 DNA를 환자에게 도입할 수도 있다.
양자 면역 유전자요법에 있어서 본 발명의 DNA를 종래의 기술을 사용할 때와 마찬가지로 하여 주효세포(effector cell)에 도입한다. 이렇게 함으로써 종양세포에 대한 주효세포의 세포독성이 증대하여 양자면역 요법이 개선된다.
종양 백신 유전자요법에 있어서, 본 발명의 DNA를 위와 마찬가지로 도입할 수 있는 환자의 종양세포는 생체외에서 소요의 세포수로 증식된후 자체이식된다. 이식된 종양 세포는 환자체내에서 백신으로 작용하여 항원에 특이적인 개선된 항종양 면역을 나타낸다. 따라서 본 발명의 DNA는 바아러스성 질환, 세균성 질환, 악성종양 및 면역병 등의 각종질환에 대한 유전자 요법에 있어서 현저한 효과를 나타낸다. 유전자 요법의 일반적인 방법은 문헌 [Takashi SHIMADA, Izumi SAITO and Keiya OZAWA eds., Jikken-Igaku-Bessatsu, Biomanual UP Series, Idenshichiryo-no-Kisogijutsu(유전자 치료의 기초기술)(Tokyo, Japan : Yodosha Co., Ltd., 1996)]에 상세하게 나와 있다.
아래에 나온 실시예들은 본 발명을 설명하는 것이다. 실시예 A-1 내지 A-9는 본 발명에 의한 폴리펩티드의 바람직한 실시예 및 그 제조방법을 설명하고, 실시예 B-1 내지 B-5는 본 발명에 의한 감수성 질환제의 바람직한 실시예를 설명한다. 실시예 A-1 내지 A-9의 기술은 이 기술분야에서 사용되는 통상적인 기술인데, 상세한 것은 문헌 [Toshio KUROKI, Masaru TANIGUCHI and Mitsuo OSHIMURA eds., Jikken-Igaku-Bessatsu, Saibo-Kogaku Handbook(세포공학 핸드북), (Tokyo, Japan : Yodosha. Co., Ltd., 1992), 및 Takashi YOKOTA and Kenichi ARAI eds., Jikken-Igaku-Bessatsu, Biomanual Series 3, Idenshi-Cloning-Jikken-Ho(유전자 클로닝 실험법), (Tokyo, Japan : Yodosha Co., Ltd., 1993]에 나와 있다.
실시예 A-1 : 폴리펩티드 제조
실시예 A-1(a) : 재조합 DNA의 구축
종래의 방법으로 인간 급성 임파구성 백혈병 유래의 주화세포계인 BALL-1 세포, ATCC RCB0256로부터 게놈 DNA를 채취하고, 센스 프라이머로서의 5‘-ACACCTCGAGCCACCATGGCCTTGACCTTTGCTTTAAC-3' (센스 프라이머 1) 및 안티센스 프라이머로서의 5’-TTGCCAAAGTAGCCCACAGAGCAGCTTG-3' (안티센스 프라이머 1)의 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 문헌 [K. Henco et al. Journal of Molecular Biology, Vol.185, pp. 227 ~ 260(1985)]에 기재된 서열번호 24에 나온 인간 인터페론-α의 아형 α2b의 신호 펩티드에 대한 뉴클레오티드 서열에 근거하여 화학 합성하였다. 0.5ml 반응관에서 게놈 DNA 1㎍, 10×PCR 완충액 10㎕, 25mM dNTP mix 1㎕ 및 적당량의 센스 프라이머 1 및 안티센스 프라이머 1를 혼합하여 여기에 멸균 증류수를 가하여 체적이 99㎕되게 하였다. 이 혼합물에 1㎕의 2.5 단위/㎕ Pfu DNA 폴리메라아제를 추가하고, 이 혼합물을 각각 94℃, 60℃, 및 72℃에서 1분간의 인큐베이션을 30회 실시하여 PCR을 함으로써 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 24의 5 ‘ 말단에 연결된, 제한효소 XhoI에 의해 인식된 부위 및 서열번호 24의 3’ 말단에 연결된, 서열번호 25의 1번째 내지 11번째 뉴클레오티드의 서열을 포함한 DNA 단편 (DNA 단편 1)을 얻었다.
서열번호 4의 아미노산 서열을 가진 야생형 폴리펩티드를 코우드하는 서열번호 25의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 DNA "pHIGIF"를 본 출원인에 의한 일본국 특허공개 제193,098/96호 공보에 개시된 방법에 따라 제조하였다. 서열번호 4의 아미노산 서열을 가진 야생형 폴리펩티드는 16번째 ~ 21번째, 30번째 ~ 35번째 및 51번째 ~ 55번째 아미노산의 영역에서 서열번호 1 ~ 3의 부분 아미노산 서열을 가지고 있다. 센스 프라이머로서의 5 ‘-CTGCTCTGTGGGCTACTTTGGCAAGCTTGAATC-3' (센스 프라이머 2) 및 안티센스 프라이머로서의 5’-ACACGCGGCCGCCTAGTCTTCGTTTTGAACAG-3' (안티센스 프라이머 2)의 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 서열번호 25 및 26에 근거하여 통상의 방법으로 화학합성하였다. 0.5ml 반응관에서 재조합 DNA "pHIGIF" 1ng, 10×PCR 완충액 10㎕, 25mM dNTP mix 1㎕ 및 적당량의 센스 프라이머 2 및 안티센스 프라이머 2를 혼합한 다음, 여기에 멸균 증류수를 가하여 체적이 99㎕되게 하였다. 이 혼합물에 1㎕의 2.5 단위/㎕ Pfu DNA 폴리메라아제를 추가하고, 이 혼합물을 각각 94℃, 60℃, 및 72℃에서 1분간의 인큐베이션을 30회 실시하여 PCR을 함으로써 서열번호 25의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 25의 3‘ 말단에 연결된 TAG의 종결 코돈, 제한효소 NotI에 의해 인식된 부위, 및 서열번호 25의 5’ 말단에 연결된, 서열번호 24의 57번째 내지 69번째 잔기의 뉴클레오티드 서열을 포함한 DNA 단편 (DNA 단편 2)을 얻었다.
0.5ml 반응관에서 DNA 단편 1 및 2를 각각 1ng, 10×PCR 완충액 10㎕ 및 25mM dNTP mix 1㎕를 혼합한 다음, 여기에 멸균 증류수를 가하여 체적이 99㎕되게 하였다. 이 혼합물을 94℃에서 3분간 배양하고 서서히 37℃로 냉각한후, 이 온도에서 15분간 배양하였다. 이 혼합물에 1㎕의 2.5 단위/㎕ Pfu DNA 폴리메라아제를 가하고 서서히 72℃로 가열한 다음, 이 온도에서 2분간 배양하였다. 적당량의 센스 프라이머 1 및 안티센스 프라이머 2를 가한후 이 혼합물을 각각 94℃에서 1분간, 60℃에서 1분간, 및 72℃에서 30초 동안의 인큐베이션을 30회 실시하여 PCR을 함으로써 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열을 포함한 DNA 단편 (DNA 단편 3)을 얻었다.
서열번호 26에서의 뉴클레오티드의 287번째 구아닌을 시토신으로 치환하기 위한 돌연변이 유발 센스 프라이머로서의 5'-CTCTGTGAAGTCTGAGAAAATTTCAACTC-3'의 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 통상의 방법으로 화학합성하였다. DNA 단편 3을 템플레이트로 사용하고 센스 프라이머 2 대신에 돌연변이 유발 센스 프라이머를 사용한 이외는 DNA 단편 2를 얻는 경우와 마찬가지로 하여 PCR을 실시함으로써, 시토신으로 치환된 287번째의 경우를 제외하고는 서열번호 26의 276번째~ 570번째 뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한 DNA 단편 (DNA 단편 4)을 얻었다.
서열번호 26에서의 뉴클레오티드의 287번째 구아닌을 시토신으로 치환하기 위한 돌연변이 유발 안티센스 프라이머로서의 5'-GAGTTGAAATTTTCTCAGACTTCACAGAG-3'의 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 통상의 방법으로 화학합성하였다. DNA 단편 3을 템플레이트로 사용하고 안티센스 프라이머 1 대신에 돌연변이 유발 안티센스 프라이머를 사용한 이외는 DNA 단편 1을 얻는 경우와 마찬가지로 하여 PCR을 실시함으로써, 시토신으로 치환된 287번째의 경우를 제외하고는 서열번호 26의 1번째 ~ 304번째 뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한 DNA 단편 (DNA 단편 5)을 얻었다.
DNA 단편 4와 5를 템플레이트로 사용한 이외는 DNA 단편 3을 얻는 경우와 마찬가지로 하여 PCR을 실시함으로써, 서열번호 6의 아미노산 서열을 코우드하는 뉴클레오티드 서열을 함유한 DNA 단편 (DNA 단편 6)을 얻었다. 이 DNA 단편 6은 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 15의 5‘ 말단에 연결된 제한효소 XhoI에 의해 인식된 부위 및 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 15의 3’말단에 연결된 제한효소 NotI에 의해 인식된 부위와 5‘-TAG-3'의 뉴클레오티드의 종결 코돈을 가지고 있었다.
제한효소 XhoI 및 NotI에 의하여 DNA 단편 6을 분해하여 555bp의 DNA 단편을 생성시킨후, 생성된 DNA 단편 25ng에 XhoI와 NotI에 의해 분해시켜 둔 플라스미드 벡터 “pCDM8” (미합중국의 Invitrogen사 판매)를 10ng 혼합한 다음, 이 혼합물을 라이게이션 키트(일본국의 Takara Shuzo사 판매의 "LIGATION KIT VERSION 2")를 사용하여 16℃에서 30분간 배양하였다. 클로닝함으로써 4,494bp로 된 자율복제 가능한 재조합 DNA "pCSHIGIF/MUT12"를 얻었다. 도 1에 나온 바와 같이 재조합 DNA "pCSHIGIF/MUT12"에 있어서 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 가진 cDNA "IGIF/MUT12"는 인간 인터페론-α의 아형 α2b의 신호 펩티드를 코우드하는 뉴클레오티드 서열 "IFNss"의 하류에 연결되어 있었다. 첨부된 아미노산 서열에 나온 바와 같이 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4를 가진 야생형 폴리펩티드 에서의 68번째 위치의 시스테인이 세린으로 치환된 서열번호 6의 아미노산 서열을 코우드한다.
대조로서 DNA 단편 6을 DNA 단편 3으로 치환한 외에는 위와 마찬가지로 하여 자율복제 가능한 재조합 DNA "pSCHIGIF/WT"를 제조하였다. 도 2에 나온 바와 같이 재조합 DNA "pCSHIGIF/WT"에 있어서 야생형 폴리펩티드를 코우드하는 서열번호 25의 뉴클레오티드 서열을 가진 cDNA "IGIF/WT"는 인간 인터페론-α의 아형 α2b의 신호 펩티드를 코우드하는 뉴클레오티드 서열 "IFNss"의 하류에 연결되어 있었다.
실시예 A-1(b) : 형질 전환체에 의한 폴리펩티드의 제조
실시예 A-1(a)에서 제조한 재조합 DNA "pCSHIGIF/MUT12"를 종래의 면역담당 세포법에 의해 대장균주 "MC1061/P3"(미합중국의 Invitrogen사 판매)에 도입하여 형질 전환체를 얻었다. 이 형질 전환체를 20㎍/ml 앰피실린 및 10㎍/ml 테트라사이클린을 함유한 L 배지 (pH 7.2)에서 37℃에서 18시간 진탕 조건하에서 배양하였다. 수득한 배양물을 원심분리하여 세포를 분리하고, 분리된 세포를 종래의 알칼리-SDS법으로 처리하여 재조합 DNA를 추출하였다.
10v/v% 소 태아 혈청이 보충된 DME 배지 (pH 7.4) 2.5ml을 6웰 마이크로플레이트의 각각의 웰에 가하고, 각 웰에 아프리칸 그린 몽키(African green monkey) 신장 유래의 주화세포계인 COS-1, ATCC CRL1650을 1.8×105개 접종하였다. 마이크로플레이트를 5v/v% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 24 시간 배양한후, 배지를 제거하고 각 웰을 50mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.4)을 함유한 DME 배지로 세척하였다. 각 웰에 상기한 재조합 DNA 2.8㎍/ml, 50mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.4), DEAE-덱스트란 0.4mg/ml 및 0.1mM 클로로퀸을 함유한 DME 배지 1.8ml을 가하고 마이크로플레이트를 5v/v% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 4시간 배양한후, 배지를 제거하고 각 웰에 10v/v% 디메틸술폭시드와 140mM NaCl을 함유한 10mM 인산 완충액 (pH 7.4)을 2.5ml씩 가한 다음, 마이크로플레이트를 실온에서 2분간 방치하였다. 방치한후, 완충액을 제거하고 각 웰을 50mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.4)을 함유한 DME 배지로 세척하였다. 각 웰에 배지 "COS MEDIUM”(일본국의 COSMOBIO사 판매)를 2.5ml 씩 가하고 마이크로플레이트를 5v/v% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 3일간 유지함으로써 세포를 배양하였다. 수득한 배양물을 일본국 특허공개 제231,598/96호 공보에 개시된 모노클로날 항체를 이용하는 웨스턴 블로팅법으로 분석한 결과, 면역담당 세포에 의해 IFN-γ의 생성을 유도할 수 있고 68번째 위치의 시스테인이 세린으로 치환된 서열번호 4 유래의 아미노산 서열을 함유한 본 발명의 폴리펩티드가 약 20ng/ml의 양으로 배양물중에 생성해 있었다.
대조 실험으로서 실험 A-1(a)에서 얻은 재조합 DNA "pCSHIGIF/WT"를 재조합 DNA "pCSHIGIF/MUT12"와 마찬가지로 처리한 결과, IFN-γ 생성 유도능이 있는 야생형 폴리펩티드가 약 1ng/ml의 양으로 배양물중에 생성해 있었다. 이 수득량은 재조합 DNA "pCDHIGIF/MUT12"를 사용하여 얻은 것의 5% 보다 적은 것이었다. 이로부터 본 발명에 의한 폴리펩티드는 본 실시예에 있어서 야생형 폴리펩티드보다 훨씬 높은 생물학적 활성과 안정성을 나타냄을 알 수 있다.
실시예 A-1(c) : 폴리펩티드 정제
실험 A-1(b)에서 얻은 본 발명의 폴리펩티드를 함유한 배양물을 원심분리하여 상청액을 채취하였다. 본 출원인에 의한 일본국 특허공개 제231,598/96호 공보에 개시된 방법으로 제조된 모노클로날 항체를 사용하는 면역 친화성 크로마토그래피용 겔이 충전된 칼럼에 상청액을 가하고, 인산 완충 식염수 (이하, 간단히 "PBS"라 함)로 예비 세척한후, 신선한 PBS를 칼럼에 통액하여 세척한 다음 1M NaCl을 함유한 0.1M 글리신-HCl 완충액 (pH 2.5)를 가하여 용출시켰다. 용출 획분으로부터 면역담당 세포에 의해 IFN-γ 생성 유도능이 있는 폴리펩티드를 함유한 것들을 채취하였다. 채취된 획분들을 PBS에 대해 4℃에서 18시간 동안 투석한후 멤브레인 여과에 의해 농축한 다음 동결건조하여 순도 약 95% 이상의 고형 폴리펩티드를 출발원료인 배양물에 대해 약 50%의 회수율로 얻었다. 이와 병행하여 재조합 DNA "pCSHIGIF/WT"를 사용하여 얻은 야생형 폴리펩티드를 함유한 배양물을 대조의 경우에 대해 위에 나온 바와 마찬가지로 정제하고, 아래와 같이 그 물리화학적인 성질을 분석하였다.
실시예 A-1(d) : 분자량
문헌 [U. K. Laemli, Nature, Vol.227, pp. 680 ~ 685 (1970)]에 기재된 방법에 따라 환원제로서 2w/v% 디티오드레이톨 존재하에 실시예 A-1(c)의 폴리펩티드의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 한 결과, 분자량 약 18,000 ~ 19,500 달톤에 상응하는 위치에서 IFN-γ 유도능이 있는 단백질의 주밴드를 나타내었다. 사용된 분자량 마아커는 소 혈청 알부민 (67,000 달톤), 오브알부민 (45,000 달톤), 카보닉 안히드라아제 (30,000 달톤), 대두 트립신 억제제 (20,100 달톤) 및 α-락토알부민 (14,000 달톤) 이었다.
실시예 A-1(e) : N 말단 아미노산 서열
프로우틴 시퀀서(protein sequencer, 미합중국의 Perkin-Elmer사 판매의 “Model 473A")를 사용하여 종래의 방법으로 분석을 한 결과, 실시예 A-1(c)의 폴리펩티드는 N 말단 영역에서 서열번호 27의 아미노산 서열을 가지고 있었다.
실시예 A-1(f) : 안정성
실시예 A-1(c)의 본 발명의 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드를 배지 "COS MEDIUM" (일본국의 COSMOBIO사 판매)에 약 10ng/ml되도록 용해하고, 이 용액을 40℃에서 24시간 배양하였다. 배양개시로부터 0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12 또는 24시간후에 각 용액의 일부를 샘플링하여 아래의 실시예 A-1(g)에 나온 방법에 따라 IFN-γ 유도활성을 각각 분석하여 배양에 따른 활성의 시간경과를 조사하였다. 각 시간에서의 잔존활성의 백분율(%)을 개시시간에서의 활성에 대하여 산출하였다. 그 결과는 표 3에 나와 있다.
도 3에 나온 바와 같이 본 실시예의 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드 보다 훨씬 안정하며 오래동안 활성을 유지하였다. 이로부터 본 실시예에 사용된 아미노산 서열 치환에 의해 생물학적 활성을 감소시킴이 없이 야생형 폴리펩티드의 안정성을 효과적으로 개선할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 A-1(g) : 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 제조
인간 급성 골수성 백혈병 유래의 주화세포주인 KG-1 세포, ATCC CCL246을 혈청 무함유의 RPMI-1640 배지 (pH 7.4)에 밀도 3×105개/ml되도록 접종하고 10v/v% CO2 인큐베이터 중에서 37℃에서 4일 동안 배양하였다. 배양된 세포를 채취하고 10v/v% 어린소 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지 (pH 7.4)에 밀도 3×106개/ml되도록 부유시켰다. 세포 부유액 0.1ml을 96웰 마이크로플레이트의 각 웰에 넣고, 실시예 A-1(c)에서의 본 발명의 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드를 함유한 적당히 희석된 용액 0.1ml을 각 웰에 가한 후, 이들 세포를 10v/v% CO2 인큐베이터 중에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양물의 상청액 0.1ml을 각 웰로부터 채취하고 종래의 효소 면역 시험법으로 IFN-γ의 생성을 조사하였다, 블랭크 테스트로서 폴리펩티드를 전혀 사용하지 않고 상기와 동일하게 하여 실험을 하였다. 표 1에 그 결과가 나와 있다. 표 1에서의 IFN-γ의 생성량을 미합중국의 국제 보건원으로부터 입수한 IFN-γ 표준 Gg23-901-530에 근거하여 산출하여 국제단위 (IU)로 나타내었다.
[표 1]
Figure pat00001
*) 괄호속의 값은 야생형 폴리펩티드를 사용할 경우의 IFN-γ 생성량을 나타냄.
표 1로부터 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드는 면역담당 세포인 KG-1에 작용하여 IFN-γ 생성을 유도함을 알 수 있다. IFN-γ 생성량은 야생형 폴리펩티드에 의한 것과 같거나 이보다 훨씬 높았다.
실시예 A-1(h) : NK 세포의 세포독성 증강
헤파린을 함유한 시린지를 사용하여 건강한 공여자로부터 신선한 혈액을 채취하여 PBS에 의해 2배로 희석한 후, 희석된 혈액을 FICOLL위에 피복한 다음 원심분리하여 고밀도 임파구를 얻었다. 이 임파구를 카나마이신 10㎍/ml, 5×10-5M 2-메르캅토에탄올 및 10v/v% 소 태아 혈청을 함유한 RPMI-1640 배지 (pH 7.2) 중에 밀도 1×106개/ml 되도록 부유시켰다. 세포 부유액 0.5ml을 12웰 마이크로플레이트 각각에 넣고, 실시예 A-1(c)의 본 발명의 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드를 신선한 배지로 적당히 희석한 후에 각각의 웰에 대해 1.5ml씩 가한 다음, 재조합 인간 인터로이킨 2를 50 단위/ml 함유하거나 또는 함유하지 않은 신선한 배지 0.5ml을 추가하였다. 이어서 세포를 5v/v% CO2 인큐베이터 중에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 PBS로 세척하여 주효세포로서 NK 세포를 함유한 배양된 임파구를 얻었다.
인간 만성 골수성 백혈병 유래의 주화세포인 K-562 세포, ATCC CCL243을 NK 세포에 대해 감수성인 표적세포로 하여 종래의 방법으로 51Cr로 표지하고, 표지된 세포 1×104개를 96웰 마이크로플레이트의 각각의 웰에 넣었다. 각각의 웰에 대해 위에서 얻은 배양된 임파구를 주효세포와 표적세포 사이에 2.5:1, 5:1 및 10:1의 비율이 되도록 가한 다음, 5v/v% CO2 인큐베이터 중에서 37℃에서 4시간 동안 배양한후 배양 상청액에 대하여 통상의 방법으로 방사능을 측정하여 사멸 세포의 수를 구하였다. 각각의 계(系)에서 시험된 표적세포에 대한 사멸 세포의 백분율(%)을 산출하여 세포독성을 평가하였다. 표 2에 그 결과가 나와 있다.
[표 2]
Figure pat00002
(주) * : "pM"은 10-12 M의 몰농도를 뜻함.
** : 괄호속의 값은 야생형 폴리펩티드를 사용할 경우 나타나는 세포독성을 뜻함.
표 2에 나온 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드는 NK 세포의 세포독성을 증강하였고, 그 증강정도는 야생형 폴리펩티드의 경우와 동일하거나 그 보다 컸다. 이러한 증강은 인터로이킨 2의 공존에 의해 증대하였다.
실시예 A-1(i) : LAK 세포 생성 유도
주효 세포로서 LAK 세포를 함유한 배양된 임파구를 배양시간을 72시간으로 한 외에는 실시예 A-1(g)에서와 마찬가지의 방법으로 제조하였다. NK 세포에 대해 감수성이 없는 표적세포로서 인간 Burkitt 임파종 유래의 주화세포인 Raji 세포, ATCC CCL86을 종래의 방법에 따라 51Cr으로 표지하였다. 표지된 세포 1×104개를 96웰 마이크로플레이트의 각각의 웰에 넣고, 각각의 웰에 배양된 임파구를 주효세포와 표적세포 사이에 5:1, 10:1 및 20:1의 비율이 되도록 가한 다음, 5v/v% CO2 인큐베이터 중에서 37℃에서 4시간 동안 배양한후 배양 상청액에 대하여 실시예 A-1(h)에서와 마찬가지로 하여 방사능을 측정하여 세포독성을 평가하였다. 표 3에 그 결과가 나와 있다.
[표 3]
Figure pat00003
(주) * : "pM"은 10-12M의 몰농도를 뜻함.
** : 괄호속의 값은 야생형 폴리펩티드를 사용할 경우 나타나는 세포독성을 뜻함.
표 3에 나온 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드는 LAK 세포의 생성을 유도하였고, 그 유도정도는 야생형 폴리펩티드의 경우와 동일하거나 그 보다 컸다. 이러한 유도는 인터로이킨 2의 공존에 의해 증대하였다.
실시예 A-1(j) : 급성 독성 시험
실시예 A-1(c)의 본 발명의 폴리펩티드를 8주령의 마우스에게 통상의 방법으로 경피, 경구 또는 복막내 투여한 결과, 본 발명의 폴리펩티드의 LD50은 투여경로와는 관계없이 체중 1kg당 약 1mg 이상이었음이 판명되었다. 이로부터 본 발명의 폴리펩티드는 아무런 염려없이 인간의 의약에 첨가할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 A-2 : 폴리펩티드 제조
서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 함유한 자율복제 가능한 재조합 DNA "pCSHIGIF/MUT21"는 실시예 A-1(a)에서 얻은 DNA 단편 6을 템플레이트로 사용하고, 5'-CTGATTCTGACTCTAGATAATGC-3'의 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드와 5'-GCATTATCTCTAGAGTCAGAATCAG-3'의 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 각각 돌연변위 유발 센스 프라이머 및 돌연변위 유발 안티센스 프라이머로서 사용하여 서열번호 4의 38번째 위치의 시스테인을 세린으로 치환함으로써 실시예 A-1(a)에서와 마찬가지 방법으로 제조하였다. 도 4에 나온 바와 같이 재조합 DNA "pCSHIGIF/MUT21"에 있어서 서열번호 7의 아미노산 서열을 코우드하는 cDNA "IGIF/MUT21"는 인간 인터페론-α의 아형 α2b의 신호 펩티드를 코우드하는 뉴클레오티드 서열 "IFNss"의 하류에 연결되어 있었다.
실시예 A-1(b)와 마찬가지로 재조합 DNA 를 COS-1 세포내에 도입하여 형질 전환체를 얻고, 이 형질 전환체를 배양함으로써 서열번호 7의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 배양물 1ml당 약 50ng의 양으로 생성시켰다. 이 배양물을 실시예 A-1에서와 마찬가지로 정제한후 그 물리화학적 성질을 분석한 결과, 본 실시예의 폴리펩티드는 분자량, N 말단 아미노산 서열 및 저독성 등의 성질이 실시예 A-1과 유사하였음이 판명되었다. 도 3에 나온 바와 같이 실시예 A-1(f)의 방법으로 얻은 안정성에 관한 분석결과에 있어서 본 실시예의 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드보다 훨씬 안정하였다. 이들 결과로부터 본 실시예에서 사용된 아미노산 치환법에 의하여 생물학적 활성을 감소시킴이 없이 야생형 폴리펩티드의 안정성을 효과적으로 개선할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 A-3 : 폴리펩티드 제조
서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 가진 자율복제 가능한 재조합 DNA "pCSHIGIF/MUT25“는 실시예 A-1(a)에서 얻은 DNA 단편 6을 템플레이트로 사용하고, 5'-CTTTCTAGCTTCTGAAAAAGAGAGAG-3' 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드와 5'-CTCTCTCTTTTTCAGAAGCTAGAAAG-3'의 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 각각 돌연변위 유발 센스 프라이머 및 돌연변위 유발 안티센스 프라이머로서 사용하여 서열번호 4의 127번째 위치의 시스테인을 세린으로 치환함으로써 실시예 A-1(a)에서와 마찬가지 방법으로 제조하였다. 도 5에 나온 바와 같이 재조합 DNA "pCSHIGIF/MUT25"에 있어서 서열번호 8의 아미노산 서열을 코우드하는 cDNA "IGIF/MUT25"는 인간 인터페론-α의 아형 α2b의 신호 펩티드를 코우드하는 뉴클레오티드 서열 "IFNss"의 하류에 연결되어 있었다.
실시예 A-1(b)와 마찬가지로 재조합 DNA 를 COS-1 세포내에 도입하여 형질 전환체를 얻고, 이 형질 전환체를 배양함으로써 서열번호 8의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 배양물 1ml당 약 30ng의 양으로 생성시켰다. 이 배양물을 실시예 A-1에서와 마찬가지로 정제한후 그 물리화학적 성질을 분석한 결과, 본 실시예의 폴리펩티드는 분자량, N 말단 아미노산 서열 및 저독성 등의 성질이 실시예 A-1과 유사하였음이 판명되었다. 도 3에 나온 바와 같이 실시예 A-1(f)의 방법으로 얻은 안정성에 관한 분석결과에 있어서 본 실시예의 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드보다 훨씬 안정하였다. 이들 결과로부터 본 실시예에서 사용된 아미노산 치환법에 의하여 생물학적 활성을 감소시킴이 없이 야생형 폴리펩티드의 안정성을 효과적으로 개선할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 A-4 : 폴리펩티드 제조
서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 가진 자율복제 가능한 재조합 DNA "pCSHIGIF/MUT32"는 실시예 A-2에서 얻은 재조합 DNA "pCSHIGIF/MUT21"에서 서열번호 7의 아미노산 서열을 코우드하는 cDNA "IGIF/MUT21"을 템플레이트로 사용하고, 5'-CTTTCTAGCTTCTGAAAAAGAGAGAG-3' 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드와 5'-CTCTCTCTTTTTCAGAAGCTAGAAAG-3'의 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 각각 돌연변위 유발 센스 프라이머 및 돌연변위 유발 안티센스 프라이머로서 사용하여 서열번호 4의 127번째 위치의 시스테인을 세린으로 치환함으로써 실시예 A-1(a)에서와 마찬가지 방법으로 제조하였다. 도 6에 나온 바와 같이 재조합 DNA "pCSHIGIF/MUT32"에 있어서 서열번호 9의 아미노산 서열을 코우드하는 cDNA "IGIF/MUT32"를 인간 인터페론-α의 아형 α2b의 신호 펩티드를 코우드하는 뉴클레오티드 서열 "IFNss"의 하류에 연결하였다.
실시예 A-1(b)와 마찬가지로 재조합 DNA를 COS-1 세포내에 도입하여 형질 전환체를 얻고, 이 형질 전환체를 배양함으로써 서열번호 9의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 배양물 1ml당 약 80ng의 양으로 생성시켰다. 이 배양물을 실시예 A-1에서와 마찬가지로 정제한후 그 물리화학적 성질을 분석한 결과, 본 실시예의 폴리펩티드는 분자량, N 말단 아미노산 서열 및 저독성 등의 성질이 실시예 A-1과 유사하였음이 판명되었다. 도 3에 나온 바와 같이 실시예 A-1(f)의 방법으로 얻은 안정성에 관한 분석결과에 있어서 본 실시예의 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드보다 훨씬 안정하였다. 이들 결과로부터 본 실시예에서 사용된 아미노산 치환법에 의하여 생물학적 활성을 감소시킴이 없이 야생형 폴리펩티드의 안정성을 효과적으로 개선할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 A-5 : 폴리펩티드 제조
서열번호 19의 뉴클레오티드 서열을 가진 자율복제 가능한 재조합 DNA "pCSHIGIF/MUT41“는 실시예 A-4에서 얻은 재조합 DNA "pCSHIGIF/MUT32"에서 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 가진 cDNA "IGIF/MUT32" 를 템플레이트로 사용하고, 5'-CAACTCTCTCCTCTGAGAACAA-3' 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드와 5'-TTGTTCTCAGAGGAGAGAGTTG-3'의 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 각각 돌연변위 유발 센스 프라이머 및 돌연변위 유발 안티센스 프라이머로서 사용하여 서열번호 4의 76번째 위치의 시스테인을 세린으로 치환함으로써 실시예 A-1(a)에서와 마찬가지 방법으로 제조하였다. 도 7에 나온 바와 같이 재조합 DNA "pCSHIGIF/MUT41" 에 있어서 서열번호 10의 아미노산 서열을 코우드하는 cDNA "IGIF/MUT41"는 인간 인터페론-α의 아형 α2b의 신호 펩티드를 코우드하는 뉴클레오티드 서열 "IFNss"의 하류에 연결되어 있었다.
실시예 A-1(b)와 마찬가지로 재조합 DNA 를 COS-1 세포내에 도입하여 형질 전환체를 얻고, 이 형질 전환체를 배양함으로써 서열번호 10의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 배양물 1ml당 약 6ng의 양으로 생성시켰다. 이 배양물을 실시예 A-1에서와 마찬가지로 정제한후 그 물리화학적 성질을 분석한 결과, 본 실시예의 폴리펩티드는 분자량, N 말단 아미노산 서열 및 저독성 등의 성질이 실시예 A-1과 유사하였음이 판명되었다. 도 3에 나온 바와 같이 실시예 A-1(f)의 방법으로 얻은 안정성에 관한 분석결과에 있어서 본 실시예의 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드보다 훨씬 안정하였다. 이들 결과로부터 본 실시예에서 사용된 아미노산 치환법에 의하여 생물학적 활성을 감소시킴이 없이 야생형 폴리펩티드의 안정성을 효과적으로 개선할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 A-6 : 폴리펩티드 제조
서열번호 20의 뉴클레오티드 서열을 가진 자율복제 가능한 재조합 DNA "pCSHIGIF/MUT35“는 시예 A-2에서 얻은 재조합 DNA "pCSHIGIF/MUT21"에서 서열번호 7의 아미노산 서열을 코우드하는 cDNA "IGIF/MUT21" 을 템플레이트로 사용하고, 5'-CTCTCCGCTGAGAACAAAATTATTTCC-3' 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드와 5'-TTTGTTCTCAGCGGAGAGAGTTG-3'의 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 각각 돌연변위 유발 센스 프라이머 및 돌연변위 유발 안티센스 프라이머로서 사용하여 서열번호 4의 76번째 위치의 시스테인을 알라닌으로 치환함으로써 실시예 A-1(a)에서와 마찬가지 방법으로 제조하였다. 도 8에 나온 바와 같이 재조합 DNA "pCSHIGIF/MUT41" 에 있어서 서열번호 11의 아미노산 서열을 코우드하는 cDNA "IGIF/MUT35"는 인간 인터페론-α의 아형 α2b의 신호 펩티드를 코우드하는 뉴클레오티드 서열 "IFNss"의 하류에 연결되어 있었다.
실시예 A-1(b)와 마찬가지로 재조합 DNA 를 COS-1 세포내에 도입하여 형질 전환체를 얻고, 이 형질 전환체를 배양함으로써 서열번호 11의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 배양물 1ml당 약 60ng의 양으로 생성시켰다. 이 배양물을 실시예 A-1에서와 마찬가지로 정제한후 그 물리화학적 성질을 분석한 결과, 본 실시예의 폴리펩티드는 분자량, N 말단 아미노산 서열 및 저독성 등의 성질이 실시예 A-1과 유사하였음이 판명되었다. 도 3에 나온 바와 같이 실시예 A-1(f)의 방법으로 얻은 안정성에 관한 분석결과에 있어서 본 실시예의 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드보다 훨씬 안정하였다. 이들 결과로부터 본 실시예에서 사용된 아미노산 치환법에 의하여 생물학적 활성을 감소시킴이 없이 야생형 폴리펩티드의 안정성을 효과적으로 개선할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 A-7 : 폴리펩티드 제조
서열번호 21의 뉴클레오티드 서열을 가진 자율복제 가능한 재조합 DNA "pCSHIGIF/MUT42“는 시예 A-4에서 얻은 재조합 DNA "pCSHIGIF/MUT32"에서 서열번호 18의 아미노산 서열을 코우드하는 cDNA "IGIF/MUT32"를 템플레이트로 사용하고, 5'-CTCTCCGCTGAGAACAAAATTATTTCC-3' 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드와 5'-TTTGTTCTCAGCGGAGAGAGTTG-3'의 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 각각 돌연변위 유발 센스 프라이머 및 돌연변위 유발 안티센스 프라이머로서 사용하여 서열번호 4의 76번째 위치의 시스테인을 알라닌으로 치환함으로써 실시예 A-1(a)에서와 마찬가지 방법으로 제조하였다. 도 9에 나온 바와 같이 재조합 DNA "pCSHIGIF/MUT42"에 있어서 서열번호 12의 아미노산 서열을 코우드하는 cDNA "IGIF/MUT42"는 인간 인터페론-α의 아형 α2b의 신호 펩티드를 코우드하는 뉴클레오티드 서열 "IFNss"의 하류에 연결되어 있었다.
실시예 A-1(b)와 마찬가지로 재조합 DNA를 COS-1 세포내에 도입하여 형질 전환체를 얻고, 이 형질 전환체를 배양함으로써 서열번호 12의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 배양물 1ml당 약 30ng의 양으로 생성시켰다. 이 배양물을 실시예 A-1에서와 마찬가지로 정제한후 그 물리화학적 성질을 분석한 결과, 본 실시예의 폴리펩티드는 분자량, N 말단 아미노산 서열 및 저독성 등의 성질이 실시예 A-1과 유사하였음이 판명되었다. 도 3에 나온 바와 같이 실시예 A-1(f)의 방법으로 얻은 안정성에 관한 분석결과에 있어서 본 실시예의 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드보다 훨씬 안정하였다. 이들 결과로부터 본 실시예에서 사용된 아미노산 치환법에 의하여 생물학적 활성을 감소시킴이 없이 야생형 폴리펩티드의 안정성을 효과적으로 개선할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 A-8 : 폴리펩티드 제조
실시예 A-8(a) : 재조합 DNA의 구축
5'-CGGCCAAAGTTGCCCACAGAGCAGCTTG-3'의 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 안티센스 프라이머 1 대신에 사용하고 실시예 A-1(a)의 DNA 단편 1의 제조시의 PCR과 마찬가지로 PCR을 실시하였다. 이 PCR에 의해 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 24의 5'말단에 연결된 제한효소 XhoI에 의해 인식된 부위, 및 서열번호 24의 3' 말단에 연결된 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열에서의 1번째 ~ 11번째 뉴클레오티드의 서열을 포함한 DNA 단편(DNA 단편 7)을 얻었다.
서열번호 5의 아미노산 서열을 가진 야생형 폴리펩티드를 코우드하는 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열을 가진 재조합 DNA "pMGTG-1"을 본 출원인에 의한 일본국 특허공개 제27,189/96호 공보에 개시된 방법에 따라 제조하였다. 서열번호 5의 아미노산 서열을 가진 야생형 폴리펩티드는 16번째 ~ 21번째, 29번째 ~ 34번째 및 50번째 ~ 54번째 아미노산으로 구성된 부분에서 각각 서열번호 1, 2 및 3의 부분 아미노산 서열을 가지고 있다.
5'-CTGCTCTGTGGGCAACTTTGGCCGACTTCACTG-3'의 뉴클레오티드 서열을 센스 프라이머(센스 프라이머 3)로서 가지고 또한 5'-ACACGCGGCCGCCTAACTTTGATGTAAGTTAG-3'의 뉴클레오티드 서열을 안티센스 프라이머(안티센스 프라이머 3)로서 가진 올리고뉴클레오티드를 화학합성한 후, 재조합 DNA "pMGTG-1", 센스 프라이머 2 및 안티센스 프라이머 2 대신에 재조합 DNA "pMGTG-1", 센스 프라이머 3 및 안티센스 프라이머 3을 각각 사용하고, 실시예 A-1(a)에서 DNA 단편 2를 얻을 경우와 마찬가지로 하여 PCR을 실시하였다. 이 PCR에 의하여 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열, 서열 번호 28의 3' 말단에 연결된 5'-TAG-3'의 종결코돈 및 제한효소 NotI에 의해 인식된 부위, 및 서열번호 28의 5'말단에 연결된 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열에서의 57번째 ~ 69번째 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 DNA 단편(DNA 단편 8)을 얻었다.
DNA 단편 1 및 2과 안티센스 프라이머 2 대신에 위에서 얻은 DNA 단편 7 및 8과 안티센스 프라이머 3을 각각 사용하고 실시예 A-1(a)에서 DNA 단편 3을 얻을 경우와 마찬가지로 하여 PCR을 실시하였다. 이 PCR에 의하여 서열번호 29의 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA 단편(DNA 단편 9)을 얻었다.
DNA 단편 3 대신 DNA 단편 9, 안티센스 프라이머 2 대신 안티센스 프라이머 3, 및 돌연변이 유발 센스 프라이머로서 5'-GGCCGACTTCACGCTACAACC-3'의 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 사용하고 실시예 A-1(a)에서 DNA 단편 4를 얻을 경우와 마찬가지로 하여 PCR을 함으로써 서열번호 29의 103번째의 티민 및 104번째 구아닌을 각각 구아닌 및 시토신으로 각각 치환하였다. 이 PCR에 의하여 103번째와 104번째가 구아닌 및 시토신으로 각각 치환된 경우를 제외하고는 서열번호 29의 91번째 ~ 570번째 뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드를 가진 DNA 단편(DNA 단편 10)을 얻었다.
DNA 단편 3 대신 DNA 단편 9를, 그리고 돌연변이 유발 안티센스 프라이머로서 5'-GGTTGTAGCGTGAAGTCGGCC-3'의 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 사용하고 실시예 A-1(a)에서 DNA 단편 5를 얻을 경우와 마찬가지로 PCR을 하여 서열번호 29의 103번째의 티민과 104번째의 구아닌을 각각 구아닌과 시토신으로 치환하였다. 이 PCR에 의하여 103번째와 104번째가 각각 구아닌 및 시토신으로 치환된 경우를 제외하고는 서열번호 29의 1번째 ~ 111번째 뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드를 서열을 가진 DNA 단편(DNA 단편 11)을 얻었다.
DNA 단편 1 및 2와 안티센스 프라이머 2 대신에 위에서 얻은 DNA 단편 10 및 11과 안티센스 프라이머 3을 각각 사용하고 실시예 A-1(a)에서 DNA 단편 3을 얻을 경우와 마찬가지로 PCR을 실시하였다. 이 PCR에 의하여 서열번호 13의 아미노산 서열을 코우드하는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 22의 5' 말단에 연결된 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열과 제한효소 XhoI에 의해 인식된 부위, 및 서열번호 22의 3' 말단에 연결된 제한효소 NotI에 의해 인식된 부위와 종결코돈 5'-TAG-3'을 가진 DNA 단편(DNA 단편 12)을 얻었다.
이 DNA 단편 12를 실시예 A-1(a)에서의 재조합 DNA "pCSMIGIF/MUT12" 제조 방법에 따라 DNA 단편 6과 마찬가지로 처리하여 자율복제 가능한 재조합 DNA "pCSMIGIF/MUT11"을 얻었다. 도 10에 나온 바와 같이 재조합 DNA "pCSMIGIF/MUT11"에 있어서 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열을 가진 cDNA "mIGIF/MUT11"은 인간 인터페론-α의 아형 α2b의 신호 펩티드를 코우드하는 뉴클레오티드 서열 "IFNss"의 하류에 연결되어 있었다. 서열번호 22는 거기에 병기된 아미노산 서열에 나온 바와 같이 서열번호 5의 야생형 폴리펩티드에서의 7번째 위치의 시스테인이 알라닌으로 치환된 아미노산 서열을 코우드한다.
대조로서 DNA 단편 6 대신에 DNA 단편 9를 처리한 외에는 재조합 DNA "pCSHIGIF/MUT12"의 제조방법과 마찬가지로 하여 자율복제 가능한 재조합 DNA "pCSMIGIF/WT"를 제조하였다. 도 11에 나온 바와 같이 재조합 DNA "pCSMIGIF/WT"에 있어서 야생형 폴리펩티드를 코우드하는, 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열을 가진 cDNA “mIGIF/WT"는 인간 인터페론-α의 아형 α2b의 신호 펩티드를 코우드 하는 뉴클레오티드 서열 ”IFNss"의 하류에 연결되어 있었다.
실시예 A-8(b) : 형질전환체에 의한 폴리펩티드 제조
재조합 DNA "pCSHIGIF/MUT12" 대신에 실시예 A-1(a)에서 얻은 재조합 DNA "pCSMIGIF/MUT11"을 사용하고 실시예 A-1(b)에서의 폴리펩티드 제조방법에 따라 재조합 DNA를 추출하여 이 DNA를 COS-1 세포에 도입한후 DNA를 가진 COS-1 세포를 배양하여 배양물을 얻었다. 이 배양물을 본 출원인에 의한 일본국 특허공개 제217,798/96호 공보에 개시된 모노클로날 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅법으로 분석한 결과, 7번 위치의 시스테인이 알라닌으로 치환된 서열번호 5 유래의 아미노산 서열을 가지며 면역담당세포에 의해 IFN-γ 생성을 유도할 수 있는 본 발명의 폴리펩티드가 배양물중에 약 20ng/ml의 양으로 생성해 있음이 판명되었다.
대조로서 재조합 DNA "pCSHMIGIF/WT"를 위와 마찬가지로 처리한 결과 면역담당세포에 의한 IFN-γ 생성 유도능이 있는 야생형 폴리펩티드가 생성되었다. 이 야생형 폴리펩티드의 생성량은 상기한 "pCSMIGIF/MUT11"을 사용하여 얻은 것보다 현저하게 적었다. 이로부터 본 실시예의 본 발명의 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드보다 훨씬 안정하고 높은 생물학적 활성을 나타냄을 알 수 있다.
실시예 A-8(c) : 폴리펩티드 정제
실시예 A-8(b)에서의 본 발명의 폴리펩티드를 함유한 배양물을 원심분리하여 상청액을 채취하고, 이것을 본 출원인에 의한 일본국 특허공개 제217,798/96호 공보에 기재된 방법으로 제조한, 모노클로날 항체를 사용하는 면역 친화성 크로마토그래피용 겔이 충전된 칼럼에 가한후, PBS로 예비 세척하였다. 신선한 PBS를 칼럼에 가하여 세척한 다음, 35mM 에틸아민 수용액(pH 10.8)을 가하여 용출시켰다.
용출된 획분으로부터 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생성 유도능이 있는 폴리펩티드를 함유한 획분을 채취하고, 채취된 획분을 PBS에 대해 4℃에서 18시간 투석한 다음, 멤브레인 여과에 의해 농축한후 동결건조하여 순도 약 95%의 고형 폴리펩티드를 얻었다. 이와 병행하여 재조합 DNA "pCSMIGIF/WT"를 사용하여 제조한 야생형 폴리펩티드를 함유한 배양물을 위와 마찬가지로 정제하여 대조로 하고, 아래와 같이 물리화학적 성질을 분석하였다.
실시예 A-8(d) : 분자량
실시예 A-8(c)의 본 발명의 폴리펩티드를 실시예 A-1(d)와 마찬가지로 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 결과, 분자량 약 18,500 ~ 19,500 달톤에 상응한 위치에서 IFN-γ 생성 유도능이 있는 폴리펩티드의 주밴드가 나타났다.
실시예 A-8(e) : N 말단 아미노산 서열
실시예 A-1(e)와 마찬가지로 분석한 결과, 실시예 A-8(c)의 본 발명의 폴리펩티드는 N 말단에 서열번호 30의 아미노산 서열을 가지고 있음이 판명되었다.
실시예 A-8(f) : 안정성
실시예 A-8(c)의 본 발명의 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드를, 말토오스 0.2g/ml을 함유한 PBS에 폴리펩티드 고형물로서 약 10ng/㎖가 되도록 각각 별도로 용해하고, 이 용액을 40℃에서 24시간 배양하였다. 배양개시로부터 0, 3, 9 또는 24 시간후에 각 용액의 일부를 샘플링하여 아래의 실시예 A-8(g)에 나온 방법에 따라 IFN-γ 유도활성을 각각 분석하여 배양에 따른 활성의 시간경과를 조사하였다. 각 시간에서의 잔존활성의 백분율(%)을 개시시간에서의 활성에 대하여 산출하였다. 그 결과는 도 12에 나와 있다.
도 12에 나온 바와 같이 본 실시예의 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드 보다 훨씬 안정하며 오래동안 활성을 유지하였다. 이로부터 본 실시예에 사용된 아미노산 서열 치환에 의해 생물학적 활성을 감소시킴이 없이 야생형 폴리펩티드의 안정성을 효과적으로 개선할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 A-8(g) : 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생성
면역담당 세포로서의 비장 세포(splenocyte)를 C3H/HeJ 마우스로부터 채취하여 10v/v% 소 태아 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지중에 부유시켰다. 이 부유액에 콘카나발린 A 또는 인터로이킨 2 존재하에 또는 부재하에 실시예 A-8(a)에서의 본 발명의 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드를 가하였다. 이어서 비장 세포를 배양하여 종래의 효소면역 분석법으로 IFN-γ 생성에 대해 조사하여 IFN-γ 생성의 유도활성을 평가하였다. 본 발명의 폴리펩티드는 면역담당 세포인 비장 세포에 작용하여 IFN-γ 생성을 유도함이 판명되었다. 본 발명의 폴리펩티드의 IFN-γ 생성의 유도활성은 야생형 폴리펩티드의 경우에 비하여 동일하거나 그 보다 높았다.
실시예 A-8(h) : 급성독성 시험
실시예 A-8(a)의 본 발명의 폴리펩티드를 실시예 A-1(j)의 방법에 의해 급성독성을 조사하였다. 그 결과, 본 발명의 폴리펩티드의 LD50은 투여경로와는 관계없이 체중 1kg당 약 1mg 이상이었음이 판명되었다. 이로부터 본 발명의 폴리펩티드는 아무런 염려없이 인간을 비롯한 포유동물용의 의약에 첨가할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 A-9 : 폴리펩티드 제조
서열번호 23의 뉴클레오티드 서열을 함유한 자율복제 가능한 재조합 DNA "pCSMIGIF/MUT12"는 실시예 A-8(a)에서 얻은 DNA 단편 9를 템플레이트로 사용하고, 5'-GGACACTTTCTTGCTAGCCAAAAGG-3'의 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드와 5'-CCTTTTGGCTAGCAAGAAAGTGTCC-3'의 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드를 각각 돌연변위 유발 센스 프라이머 및 돌연변위 유발 안티센스 프라이머로서 사용하여 서열번호 5의 125번째 위치의 시스테인을 세린으로 치환함으로써 실시예 A-8(a)에서와 마찬가지 방법으로 제조하였다. 도 13에 나온 바와 같이 재조합 DNA "pCSMIGIF/MUT12"에 있어서 서열번호 14의 아미노산 서열을 코우드하는 cDNA "mIGIF/MUT12"는 인간 인터페론-α의 아형 α2b의 신호 펩티드를 코우드하는 뉴클레오티드 서열 "IFNss"의 하류에 연결되어 있었다.
실시예 A-1(b)와 마찬가지로 재조합 DNA 를 COS-1 세포내에 도입하여 형질 전환체를 얻고, 이 형질 전환체를 배양함으로써 서열번호 14의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 배양물 1ml당 약 50ng의 양으로 생성시켰다. 이 배양물을 실시예 A-8에서와 마찬가지로 정제한후 그 물리화학적 성질을 분석한 결과, 본 실시예의 폴리펩티드는 분자량, N 말단 아미노산 서열 및 저독성 등의 성질이 실시예 A-8과 유사하였음이 판명되었다. 도 12에 나온 바와 같이 실시예 A-8(f)의 방법으로 얻은 안정성에 관한 분석결과에 있어서, 본 실시예의 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드보다 훨씬 안정하였다. 이들 결과로부터 본 실시예에서 사용된 아미노산 치환법에 의하여 생물학적 활성을 감소시킴이 없이 야생형 폴리펩티드의 안정성을 효과적으로 개선할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 B-1 : 액제
실시예 A-1 내지 A-9에서 정제한 본 발명의 폴리펩티드중의 어느 한가지를 안정제로서 1v/v% 인간 혈청 알부민을 함유한 생리 식염수에 농도 1mg/ml되도록 용해한 후, 이 용액을 통상의 방법으로 멤브레인 여과하여 무균 액제를 얻었다.
이 액제는 안정성이 양호하며, 인간을 비롯한 포유동물의 악성 종양, 바이러스성 질환, 감염증 및 면역병 등의 각종 감수성 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 주사액, 점안액 및 점비액(collunarium)으로 사용할 수 있다.
실시예 B-2 : 건조 주사제
실시예 A-1 내지 A-9에서 정제한 본 발명의 폴리펩티드중의 어느 한가지 100mg을 안정제로서 1w/v% 젤라틴을 함유한 생리 식염수 100ml 중에 용해한 후, 이 용액을 통상의 방법으로 멸균 멤브레인 여과하여 무균액제를 얻었다. 멸균액 1ml씩을 취하여 바이알에 넣고 동결건조 한후 캡으로 바이알을 밀봉하였다.
이 건조 주사제는 안정성이 양호하며 인간을 비롯한 포유동물의 악성종양, 바이러스성 질환, 감염증 및 면역병 등의 각종 감수성 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 건조 주사제로 사용할 수 있다.
실시예 B-3 : 연고제
"HI-BIS-WAKO 104" (일본국의 Wako Pure Chemicals사 판매의 카르복시비닐폴리머) 및 "TREHALOSE"(일본국의 Hayashibara사 판매의 트레할로오스 결정분말)을 각각 농도 1.4w/w% 및 2.0w/w%되도록 멸균 증류수에 용해하였다. 이 용액에 실시예 A-1 내지 A-9에서 정제한 본 발명의 폴리펩티드중의 한가지를 균일히 혼합한 다음, 균질액 각각을 pH 7.2로 조정하여 상기 폴리펩티드 한가지를 약 1mg/g 함유하는 페이스트를 제조하였다.
이 페이스트는 퍼짐성과 안정성이 양호하며, 인간을 비롯한 포유동물의 악성종양, 바이러스성 질환, 감염증 및 면역병 등의 각종 감수성 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 연고제로 사용할 수 있다.
실시예 B-4 : 정제
실시예 A-1 내지 A-9 에서 정제한 폴리펩티드중의 한가지와 세포 활성화제로서의 "LUMIN"[비스-4-(1-에틸퀴놀린)][γ-4'-(에틸퀴놀린)]펜타메티오닌 시아닌을 "FINETOSE" (Hayashibara사 판매의 무수 α-말토오스 결정)와 균일히 혼합하였다. 이 균일 혼합물을 종래의 타정기에서 타정하여 1개의 중량이 200mg이고, 폴리펩티드와 LUMIN중의 한가지를 약 1mg 함유하는 정제를 얻었다.
이 정제는 삼키기가 용이하고 안정성과 세포 활성화 작용이 양호하므로 인간을 비롯한 포유동물의 악성종양, 바이러스성 질환, 감염증 및 면역병 등의 각종 감수성 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 정제로 사용할 수 있다.
실시예 B-5 : 양자면역(養子免疫) 요법제
악성 임파종 환자의 말초 혈액으로부터 단핵세포를 분리하고, 이들 세포를 10v/v% 인간 AB 혈청이 보충된 37℃로 예열된 RPMI-1640 배지(pH 7.2) 중에 밀도 1×106개/ml가 되도록 부유시켰다. 이 세포 부유액에 실시예 A-1 내지 A-7의 본 발명의 폴리펩티드중의 어느 한가지와 재조합 인간 인토로이킨 2를 양자면역 요법제로 하여 각각 농도 10ng/ml 및 100단위/ml가 되도록 첨가한후, 이들 세포를 5v/v/% CO2 인큐베이터중에서 37℃에서 1주일 동안 배양한 다음 배양물을 원심분리하여 LAK 세포를 채취하였다.
LAK세포는 환자의 체내에 복귀하였을 경우 임파종에 대하여 강력한 세포독성을 나타낼 수 있고, 본 발명의 약제를 사용한 양자면역 요법에 의해 인터로이킨 2를 단독으로 사용할 경우보다 현저히 높은 효과를 나타낼 수 있다. 단핵세포를 제외하고 종양 침윤 임파구로 치환된 위와 마찬가지로 하여 수득한 세포독성 T 세포도 환자의 체내에 복귀하였을 경우 LAK 세포와 동일한 효과를 나타낼 수 있다. 따라서 본 실시예에서의 양자면역 요법제를 악성 임파종 외에도 신장암, 악성 흑색종, 결장암, 직장암 및 폐암 등의 고형 악성 종양에 효과적으로 적용할 수 있다.
IFN-γ는 바이러스와 박테리아 등의 감염에 대한 예방, 악성종양 증식 억제, 예방을 필요로 하는 면역계 조절 및 면역 글로불린 E 항체 생성의 억제에 관여하는 것이 공지되어 있다. IFN-γ는 현재 인간의 감수성 질환에 대한 약제에 사용되고 있으므로 목적으로 하는 질환, 용도, 투여량 및 안전성에 대한 지침은 이미 확립되어 있다.
문헌 [Frances R. Balkwill, Saitokain-To-Ganchiryo (Cytokines in Cancer Therapy), Yoshihiko WATANABE tr., (Tokyo, Japan : Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd., 1991)]에 기재되어 있는 바와 같이 항종양 면역요법을 포함하는 NK 세포 및 LAK 세포 등의 킬러 세포를 사용하는 요법을 인간에게 적용함으로써 전반적으로 만족스러운 효과를 얻게 된다. 근래, 치료효과에 있어서 사이토카인류에 의해 증강된 세포독성을 가지는 킬러 세포 또는 사이토카인류에 의해 생성이 유발되는 킬러 세포의 관련에 대해 관심이 집중되고 있다. 예컨대 문헌 [T. Fujioka et al., British Journal of Urology, Vol.73, No.1, pp. 23 ~ 31 (1994)]에 의하면 LAK 세포와 인터로이킨 2를 사용하는 항종양 면역요법에 있어서 인터로이킨 2는 LAK 세포의 생성을 유도함으로써 심각한 독성과 부작용을 나타냄이 없이 인간의 암 전이에 대해 현저한 효과를 나타내었다고 하고 있다.
따라서 IFN-γ 또는 킬러 세포는 각종 인간 질환의 치료 및/또는 예방에 관여하며 이들 질환의 완치 또는 경감에 기여를 할 수 있음이 판명되었다. 실시예 A-1 내지 A-9에서 나온 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드는 면역담당 세포에 의하여 IFN-γ의 생성을 유도하고, NK 세포의 세포독성을 증강하며 LAK 세포의 생성을 유도하므로, 본 발명의 감수성 질환제는 비교적 장기간에 걸쳐 환자에게 계속하여 투여할 수 있고, IFN-γ 및/또는 킬러 세포가 개입하는 각종 질환을 심각한 부작용을 유발할 우려없이 치료 및/또는 예방할 수 있다.
위에서 설명한 바와 같이 본 발명은 면역담당 세포에 의해 IFN-γ의 생성을 유도할 수 있는 안정한 폴리펩티드의 확립에 근거하여 된 것이다. 본 발명에 의한 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드보다 안정성이 높기 때문에 그 아미노산 서열 및 실제 사용시에 비교적 장기간에 걸쳐 생물학적 활성을 유지하는 특성이 밝혀진 물질이다. 따라서 본 발명의 폴리펩티드는 세포 배양물에서 IFN-γ를 생성하기 위한 IFN-γ 유도제 및 바이러스성 질환, 감염, 악성 종양 및 면역병을 비롯한 일반적인 IFN-γ에 대한 각종 감수성 질환의 치료제 및/또는 예방제 등의 각종 용도를 제공한다. 추가로 킬러 세포의 생성 유발 작용 및/또는 세포독성 증강 작용을 가진 본 발명의 폴리펩티드를 유효성분으로 함유한 각종 약제는 악성 종양 등의 중증의 각종 질환을 만족스럽게 치료할 수 있다.
더욱이 본 발명의 폴리펩티드는 IFN-γ의 생성을 유도하는 작용이 강하므로 일반적으로 소량만으로도 필요한 량의 IFN-γ를 유도할 수 있다. 또한 독성이 거의 없으므로 폴리펩티드는 비교적 고투여량에서도 심각한 부작용을 일으키지 않는다. 따라서 본 발명의 폴리펩티드는 실제 사용시에 투여량을 엄격히 조절하지 않더라도 필요한 량의 IFN-γ를 신속히 유발할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 이러한 유용성을 가진 폴리펩티드를 재조합 DNA 기술을 이용하는 본 발명의 방법에 의하여 필요한 양으로 용이하게 생성시킬 수 있다.
따라서 본 발명은 현저한 효과를 가지며 이 기술분야에 큰 기여를 할 수 있는 의의가 있는 발명이다.
배 열 표
(1) 서열번호 (SEQ ID NO:) 1의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 6 아미노산
(B) 서열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 펩티드
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 1 :
Asn Asp Gln Val Leu Phe
1 5
(2) 서열번호 (SEQ ID NO:) 2의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 6 아미노산
(B) 서열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 펩티드
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 2 :
Phe Glu Asp Met Thr Asp
1 5
(3) 서열번호 (SEQ ID NO:) 3의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 5 아미노산
(B) 서열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 펩티드
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 3 :
Met Tyr Lys Asp Ser
1 5
(4) 서열번호 (SEQ ID NO:) 4의 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이 : 157 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 펩티드
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 4 :
Figure pat00004
(5) 서열번호 (SEQ ID NO:) 5의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 157 아미노산
(B) 서열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 펩티드
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 5 :
Figure pat00005
(6) 서열번호 (SEQ ID NO:) 6의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 157 아미노산
(B) 서열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 펩티드
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 6 :
Figure pat00006
(7) 서열번호 (SEQ ID NO:) 7의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 157 아미노산
(B) 서열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 펩티드
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 7 :
Figure pat00007
(8) 서열번호 (SEQ ID NO:) 8의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 157 아미노산
(B) 서열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 펩티드
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 8 :
Figure pat00008
(9) 서열번호 (SEQ ID NO:) 9의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 157 아미노산
(B) 서열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 펩티드
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 9 :
Figure pat00009
(10) 서열번호 (SEQ ID NO:) 10의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 157 아미노산
(B) 서열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 펩티드
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 10 :
Figure pat00010
(11) 서열번호 (SEQ ID NO:) 11의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 157 아미노산
(B) 서열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 펩티드
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 11 :
Figure pat00011
(12) 서열번호 (SEQ ID NO:) 12의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 157 아미노산
(B) 서열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 펩티드
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 12 :
Figure pat00012
(13) 서열번호 (SEQ ID NO:) 13의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 157 아미노산
(B) 서열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 펩티드
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 13 :
Figure pat00013
(14) 서열번호 (SEQ ID NO:) 14의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 157 아미노산
(B) 서열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 펩티드
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 14 :
Figure pat00014
(15) 서열번호 (SEQ ID NO:) 15의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 471 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(ix) 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : mat peptide
(B) 존재위치 : 1..471
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 15 :
Figure pat00015
(16) 서열번호 (SEQ ID NO:) 16의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 471 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(ix) 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : mat peptide
(B) 존재위치 : 1..471
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 16 :
Figure pat00016
(17) 서열번호 (SEQ ID NO:) 17의 정보 :(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 471 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(ix) 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : mat peptide
(B) 존재위치 : 1..471
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 17 :
Figure pat00017
(18) 서열번호 (SEQ ID NO:) 18의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 471 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(ix) 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : mat peptide
(B) 존재위치 : 1..471
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 18 :
Figure pat00018
(19) 서열번호 (SEQ ID NO:) 19의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 471 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(ix) 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : mat peptide
(B) 존재위치 : 1..471
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 19 :
Figure pat00019
(20) 서열번호 (SEQ ID NO:) 20의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 471 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(ix) 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : mat peptide
(B) 존재위치 : 1..471
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 20 :
Figure pat00020
(21) 서열번호 (SEQ ID NO:) 21의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 471 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(ix) 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : mat peptide
(B) 존재위치 : 1..471
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 21 :
Figure pat00021
(22) 서열번호 (SEQ ID NO:) 22의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 471 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(ix) 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : mat peptide
(B) 존재위치 : 1..471
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 22 :
Figure pat00022
(23) 서열번호 (SEQ ID NO:) 23의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 471 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(ix) 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : mat peptide
(B) 존재위치 : 1..471
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 23 :
Figure pat00023
(24) 서열번호 (SEQ ID NO:) 24의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 69 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 기타 핵산
(ix) 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : sig peptide
(B) 존재위치 : 1..69
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO:) 24 :
Figure pat00024
(25) 서열번호 (SEQ ID NO:) 25의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 471 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(vi) 기원 :
(A) 생물명 : 인간
(B) 조직의 종류 : 간장
(ix) 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : mat peptide
(B) 존재위치 : 1..471
(C) 특징을 결정하는 방법 : E
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO :) 25 :
Figure pat00025
(26) 서열번호 (SEQ ID NO :) 26의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 570 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(ix) 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : 5' UTR
(B) 존재위치 : 1..15
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(A) 특징을 나타내는 기호 : sig peptide
(B) 존재위치 : 16..84
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(A) 특징을 나타내는 기호 : mat peptide
(B) 존재위치 : 85..555
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(A) 특징을 나타내는 기호 : 3' UTR
(B) 존재위치 : 556..570
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO :) 26 :
Figure pat00026
(27) 서열번호 (SEQ ID NO :) 27의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 10 아미노산
(B) 서열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 펩티드
(V) 단편형 : N 말단 단편
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO :) 27 :
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser
1 5 10
(28) 서열번호 (SEQ ID NO :) 28의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 471 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(vi) 기원 :
(A) 생물명 : 마우스
(B) 조직의 종류 : 간장
(ix) 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : mat peptide
(B) 존재위치 : 1..471
(C) 특징을 결정하는 방법 : E
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO :) 28 :
Figure pat00027
(29) 서열번호 (SEQ ID NO :) 29의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 570 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : cDNA
(ix) 특징 :
(A) 특징을 나타내는 기호 : 5' UTR
(B) 존재위치 : 1..15
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(A) 특징을 나타내는 기호 : sig peptide
(B) 존재위치 : 16..84
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(A) 특징을 나타내는 기호 : mat peptide
(B) 존재위치 : 85..555
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(A) 특징을 나타내는 기호 : 3' UTR
(B) 존재위치 : 556..570
(C) 특징을 결정하는 방법 : S
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO :) 29 :
Figure pat00028
(30) 서열번호 (SEQ ID NO :) 30의 정보 :
(i) 서열의 특징 :
(A) 서열의 길이 : 6 아미노산
(B) 서열의 형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ii) 서열의 종류 : 펩티드
(V) 단편형 : N 말단 단편
(xi) 서열번호 (SEQ ID NO :) 30 :
Asn Phe Gly Arg Leu His
1 5
도 1은 본 발명에 의한 폴리펩티드를 코우드하는 재조합 DNA “pCSHIGIF/MUT12”의 제한지도.
도 2는 인간 기원의 야생형 폴리펩티드를 코우드하는 재조합 DNA “pCSHIGIF/WT”의 제한지도.
도 3은 인간 기원의 야생형 폴리펩티드와 본 발명에 의한 폴리펩티드의 배양시의 활성의 시간 경과를 나타내는 도면.
도 4는 본 발명에 의한 다른 폴리펩티드를 코우드하는 재조합 DNA “pCSHIGIF/MUT21”의 제한지도.
도 5는 본 발명에 의한 또 다른 폴리펩티드를 코우드하는 재조합 DNA “pCSHIGIF/MUT25”의 제한지도.
도 6은 본 발명에 의한 또 다른 폴리펩티드를 코우드하는 재조합 DNA “pCSHIGIF/MUT32”의 제한지도.
도 7은 본 발명에 의한 또 다른 폴리펩티드를 코우드하는 재조합 DNA “pCSHIGIF/MUT41”의 제한지도.
도 8은 본 발명에 의한 또 다른 폴리펩티드를 코우드하는 재조합 DNA“ pCSHIGIF/MUT35”의 제한지도.
도 9는 본 발명에 의한 또 다른 폴리펩티드를 코우드하는 재조합 DNA “pCSHIGIF/MUT42”의 제한지도.
도 10은 본 발명에 의한 또 다른 폴리펩티드를 코우드하는 재조합 DNA “pCSMIGIF/MUT11”의 제한지도.
도 11은 마우스 기원의 야생형 폴리펩티드를 코우드하는 재조합 DNA “pCSMIGIF/WT”의 제한지도.
도 12는 마우스 기원의 야생형 폴리펩티드와 본 발명에 의한 폴리펩티드의 배양시의 활성의 시간 경과를 나타내는 도면.
도13은 본 발명에 의한 또 다른 폴리펩티드를 코우드하는 재조합 DNA “pCSMIGIF/MUT12”의 제한지도.
*도면의 주요부분에 대한 부호의 설명
CMV : 거대세포 바이러스 프로모우터
IFNss : 인간 인터페론-α의 아형(亞型) α2b의 신호 펩티드를 코우드하는 뉴클레오티드 서열
IGIF/WT 및 mIGIF/WT : 야생형 폴리펩티드 하나를 코우드하는 cDNA
IGIF/MUT12, IGIF/MUT21, IGIF/MUT25, IGIF/MUT32, IGIF/MUT41, IGIF/MUT35, IGIF/MUT42, mIGIF/MUT11 및 mIGIF/MUT12 : 본 발명에 의한 폴리펩티드 하나를 코우드하는 각각의 cDNA.

Claims (21)

  1. 아래의 서열번호 [SEQ ID NO :] 4에서의 n 말단으로부터 38번째, 68번째, 76번째 및 127번째 위치의 시스테인 혹은 아래의 서열번호 [SEQ ID NO :] 5에서의 N말단으로부터 7번째, 75번째 및 125번째 위치의 시스테인 중에서 선택되는 잔기 하나 이상이, 세린, 트레오닌, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 히스티딘, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌으로 된 군으로부터 선택되는 다른 아미노산 하나로 치환됨에 의한 변화를 가진 서열번호 [SEQ ID NO :] 4 또는 5의 아미노산 서열로 이루어진, 면역담당 세포에 의하여 인터페론-감마의 생성을 유도할 수 있는 분리된 폴리펩티드.
    Figure pat00029
    Figure pat00030
  2. 제1항에 있어서, SEQ ID NO: 6 ~ 12와 SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 14로 된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드.
    Figure pat00031
    Figure pat00032
    Figure pat00033
    Figure pat00034
    Figure pat00035
  3. 제1항에 있어서, 킬러 세포의 세포독성 증강성 및 킬러 세포 생성 유발성으로 된 군으로부터 선택되는 한가지 이상의 성질을 추가로 가진 폴리펩티드.
  4. SEQ ID NO: 15 ~ 23의 뉴클레오티드 서열 및 이들 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가진, 제1항의 폴리펩티드를 코우드하는 DNA.
    Figure pat00036
    Figure pat00037
    Figure pat00038
    Figure pat00039
    Figure pat00040
    Figure pat00041
  5. 제4항에 있어서, 5' 말단에서 SEQ ID NO: 24의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 DNA.
    SEQ ID NO: 24
    Figure pat00042
  6. 제4항에 있어서, 자율복제 가능한 벡터속에 도입되는 DNA.
  7. 제4항에 있어서, 포유 동물의 표피세포, 간질 세포 및 조혈 세포로 된 군으로부터 선택되는 세포속에 도입되는 DNA.
  8. (가) 제1항의 폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 함유하며 적당한 숙주속에 DNA를 도입하여 수득되는 세포를 배양하여 폴리펩티드를 생성시키고, (나) 생성된 폴리펩티드를 수득한 배양물로부터 채취하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 숙주가 포유 동물의 표피세포, 간질 세포 및 조혈 세포로 된 군으로부터 선택되는 세포인 제조방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 투석, 염석, 여과, 농축, 분별침전, 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 등전점 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 전기영동, 및 등전점 겔 전기영동으로 된 군으로부터 선택되는 한가지 이상의 기술에 의하여 채취하는 제조방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 모노클로날 항체를 사용하는 면역 친화성 크로마토그래피에 의하여 채취하는 제조방법.
  12. 제1항의 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는, 바이러스성 질환, 감염증, 고형 악성 종양, 혈구계 악성 종양, 면역 질환 및 골다공증으로 된 군으로부터 선택되는 질환을 치료 혹은 예방하기 위한 치료제 또는 예방제.
  13. 제12항에 있어서, 추가로 인터로이킨 2를 함유하는 치료제 또는 예방제.
  14. 제12항에 있어서, 안정제로서 혈청 알부민, 젤라틴, 당 또는 완충액을 함유하는 치료제 또는 예방제.
  15. 제12항에 있어서, 항종양제의 형태인 치료제 또는 예방제.
  16. 제15항에 있어서, 항종양 면역요법제의 형태인 치료제 또는 예방제.
  17. 제12항에 있어서, 항바이러스제의 형태인 치료제 또는 예방제.
  18. 제12항에 있어서, 항균제의 형태인 치료제 또는 예방제.
  19. 제12항에 있어서, 면역질환제의 형태인 치료제 또는 예방제.
  20. 제19항에 있어서, 추가로 인터로이킨 12를 함유하는 치료제 또는 예방제.
  21. 제19항에 있어서, 아토피성 질환을 치료하기 위한 치료제 또는 예방제.
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