JPH09157180A - 感受性疾患剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘
導するポリペプチドを有効成分として含んでなる感受性
疾患剤を提供する。 【解決手段】 特定のアミノ酸配列を有し、免疫担当細
胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドを
有効成分として含んでなる感受性疾患剤により解決す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、免疫担当細胞に
おいてインターフェロン−γ（以下、「ＩＦＮ−γ」と
略記する。）の産生を誘導する新規なポリペプチドを有
効成分として含んでなる感受性疾患剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＩＦＮ−γは、抗ウイルス作用、抗腫瘍
作用、免疫調節作用を有する蛋白質として知られ、抗原
やマイトジェンによる刺激を受けた免疫担当細胞が産生
すると云われている。これら生物作用ゆえに、ＩＦＮ−
γはその発見当初より抗腫瘍剤としての実用化が鶴首さ
れ、現在では脳腫瘍を始めとする悪性腫瘍一般の治療剤
として精力的に臨床試験が進められている。現在入手し
得るＩＦＮ−γは免疫担当細胞が産生する天然型ＩＦＮ
−γと、免疫担当細胞から採取したＩＦＮ−γをコード
するＤＮＡを大腸菌に導入してなる形質転換体が産生す
る組換え型ＩＦＮ−γに大別され、上記臨床試験におい
ては、これらのうちのいずれかが「外来ＩＦＮ−γ」と
して投与されている。

【０００３】このうち、天然型ＩＦＮ−γは、通常、培
養株化した免疫担当細胞をＩＦＮ−γ誘導剤を含む培養
培地で培養し、その培養物を精製することにより製造さ
れる。この方法では、ＩＦＮ−γ誘導剤の種類がＩＦＮ
−γの産生量や精製のし易さ、さらには、製品の安全性
等に多大の影響を及ぼすと云われており、通常、コンカ
ナバリンＡ、レンズ豆レクチン、アメリカヤマゴボウレ
クチン、エンドトキシン、リポ多糖などのマイトジェン
が頻用される。しかしながら、これら物質は、いずれも
分子に多様性があり、給源や精製方法に依って品質が変
動し易く、誘導能の一定したＩＦＮ−γ誘導剤を所望量
入手し難いという問題がある。くわえて、上記物質の多
くは生体に投与すると顕著な副作用を示したり、物質に
依っては毒性を示すものすらあり、生体に直接投与して
ＩＦＮ−γの産生を誘導するのが極めて困難な状況にあ
った。

【０００４】一方、最近では、ＩＦＮ−γ以外にも、例
えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、
ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、インターロイキン２、インタ
ーロイキン１２などのサイトカインを有効成分とする医
薬品が実用化されたり、実用化を目指して鋭意研究が進
められている。その用途は抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗
菌剤及び免疫調節剤を包含し、必要に応じて他の医薬品
と組合せて使用されている。

【０００５】サイトカインを有効成分とする医薬品の最
大の特徴は、合成医薬品と違って、重篤な副作用を惹起
することなく、長期間連用できることにある。問題点と
しては、疾患の種類や症状にも依るものの、一般に奏効
率が低く、単独では疾患を緩解又は完治するのが難しい
点にある。これにより、悪性腫瘍などの難治性疾患の治
療においては、合成医薬品の補助手段としてか、あるい
は、単に患者を延命するためだけの手段として用いられ
ているのが実状である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】斯かる状況に鑑み、こ
の発明の目的は、顕著な薬効が期待でき、かつ、重篤な
副作用を惹起することなく、長期間連用可能な医薬品を
提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】この発明は、上記課題を
配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列又はそれ
に相同的なアミノ酸配列（ただし、符号「Ｘａａ」を付
して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを
表わすものとする。）を有し、免疫担当細胞においてＩ
ＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドを有効成分とし
て含んでなる感受性疾患剤により解決するものである。

【０００８】この発明は、免疫担当細胞においてＩＦＮ
−γの産生を誘導する新規なポリペプチドの発見に基づ
くものである。本発明者らが、哺乳類の細胞が産生する
サイトカインにつき研究していたところ、コリネバクテ
リウム死菌体とリポ多糖で予処理したマウスの肝臓中に
ＩＦＮ−γの産生を誘導する物質が存在することを見出
した。カラムクロマトグラフィーを中心とする種々の精
製方法を組合せてこの物質を単離し、その性質・性状を
調べたところ、その本質は蛋白質であり、次のような理
化学的性質を有していることが判明した。 （１） 分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又はゲル濾
過法で測定すると、分子量１９，０００±５，０００ダ
ルトンを示す。 （２） 等電点 クロマトフォーカシング法で測定すると、４．８±１．
０に等電点を示す。 （３） 部分アミノ酸配列 配列表における配列番号４及び５に示す部分アミノ酸配
列を有する。 （４） 生物作用 免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する。

【０００９】斯かる理化学的性質を有する蛋白質は未だ
知られておらず、新規物質であると判断される。そこ
で、本発明者が、引続き、マウス肝細胞を鋭意検索した
ところ、この蛋白質をコードするＤＮＡを単離するのに
成功した。解読したところ、このＤＮＡは４７１塩基対
からなり、配列表における配列番号６に示すアミノ酸配
列をコードしていることが判明した。

【００１０】これら知見に基づき、ヒト肝細胞を引続き
検索したところ、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産
生を誘導するさらに別の新規物質をコードするＤＮＡが
得られた。この物質の本質はポリペプチドであり、ＤＮ
Ａを解読したところ、配列表における配列番号１に示す
アミノ酸配列を含んでなることが判明した。その後、こ
のＤＮＡを大腸菌に導入し、発現させたところ、培養物
中にポリペプチドが好収量で産生した。以上の知見は、
同じ特許出願人による特願平６−１８４１６２号明細書
及び特願平６−３０４２０３号明細書に開示されてい
る。この発明は、この新規ポリペプチドの感受性疾患剤
としての用途を提供するものである。

【００１１】

【発明の実施の形態】この発明の感受性疾患剤は、ヒト
に投与すると、体内の免疫担当細胞においてＩＦＮ−γ
の産生を誘導し、ＩＦＮ−γ感受性疾患の治療・予防に
効果を発揮する。ポリペプチドがキラー細胞による細胞
障害性の増強又はキラー細胞の生成を誘導する作用を兼
備するときには、悪性腫瘍を始めとする難治性疾患の治
療に格別の効果を発揮する。

【００１２】この発明で用いるポリペプチドは、配列表
における配列番号１に示すアミノ酸配列又はそれに相同
的なアミノ酸配列（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示
したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表わす
ものとする。）を有し、免疫担当細胞においてインター
フェロン−γの産生を誘導する。配列表における配列番
号１に示すアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列とは、
免疫担当細胞におけるＩＦＮ−γの産生を誘導する性質
を実質的に失わない範囲で、その配列番号１のアミノ酸
配列におけるアミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ
酸で置換したもの、配列番号１のアミノ酸配列における
Ｎ末端及び／又はＣ末端にアミノ酸が１又は２個以上付
加したもの及びそのＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸
が１個又は２個以上欠失したものを包含する。この発明
においては、ポリペプチドが斯かるアミノ酸配列及び性
質を有するかぎり、細胞培養法により天然の給源から分
離したものであっても、組換えＤＮＡ技術やペプチド合
成法により人工的に合成したものであっても構わない。

【００１３】経済的見地に立てば、組換えＤＮＡ技術に
よる方法が有利であり、斯かる方法においては、通常、
微生物又は動植物由来の適宜宿主に上記アミノ酸配列を
コードするＤＮＡを導入して形質転換体となし、これを
常法により培養後、培養物をサイトカインを精製するた
めの斯界における慣用の方法により精製して目的とする
ポリペプチドを得る。同じ特許出願人による特願平６−
３０４２０３号明細書には、組換えＤＮＡ技術による当
該ポリペプチドの製造方法が詳述されており、また、同
じ特許出願人による特願平７−５８２４０号明細書に開
示された精製方法によるときには、高純度のポリペプチ
ドが最少のコストと労力で得られる。

【００１４】前述のとおり、当該ポリペプチドは、免疫
担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する性質を有
する。したがって、この発明の感受性疾患剤は、ヒトに
投与すると、体内の免疫担当細胞がＩＦＮ−γを産生
し、ＩＦＮ−γ感受性疾患の治療・予防に効果を発揮す
る。また、例えば、配列表における配列番号１に示すア
ミノ酸配列を含んでなるポリペプチドのように、ポリペ
プチドが免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導
する性質に加えて、ＮＫ細胞やＬＡＫ細胞（リンホカイ
ン活性化キラー細胞）、細胞障害性Ｔ細胞などのキラー
細胞による細胞障害性の増強又はキラー細胞の生成を誘
導する性質を兼備するときには、キラー細胞も感受性疾
患の治療・予防に関与することとなる。したがって、こ
の発明でいう感受性疾患とは、ＩＦＮ−γ感受性疾患を
含む、ＩＦＮ−γ及び／又はキラー細胞が直接又は間接
に関与して治療及び／又は予防し得る疾患全般を意味す
るものとし、具体的には、例えば、肝炎、ヘルペス症、
尖圭コンジロム、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）な
どのウイルス性疾患、カンジダ症、マラリヤ症などの細
菌感染症、腎細胞癌、菌状息肉腫、慢性肉芽腫などの固
形悪性腫瘍、成人Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、悪
性リンパ腫などの血球系悪性腫瘍、さらには、アレルギ
ー症、リウマチなどの免疫疾患を挙げることができる。
また、インターロイキン３と併用するときには、白血
病、骨髄腫、さらには、悪性腫瘍を治療する際の放射線
照射や化学療法剤の投与に伴なう白血球減少症や血小板
減少症の完治又は緩解にも効果を発揮する。

【００１５】斯くして、この発明の感受性疾患剤は、上
記のごとき感受性疾患を治療・予防するための抗腫瘍
剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、免疫疾患剤、血小板増多
剤、白血球増多剤などとして多種多様な用途を有するこ
ととなる。剤型並びに感受性疾患の種類及び症状にも依
るが、この発明の感受性疾患剤は、通常、液状、ペース
ト状又は固状に調製され、当該ポリペプチドを０．００
０００１乃至１００％（ｗ／ｗ）、望ましくは、０．０
００１乃至０．１％（ｗ／ｗ）含んでなる。

【００１６】この発明の感受性疾患剤は当該ポリペプチ
ド単独の形態はもとより、当該ポリペプチドとそれ以外
の生理的に許容される、例えば、担体、賦形剤、希釈
剤、免疫助成剤、安定剤、さらには、必要に応じて、イ
ンターフェロン−α、インターフェロン−β、インター
ロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン１
２、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、カルボコン、シクロホス
ファミド、アクラルビシン、チオテパ、ブスルファン、
アンシタビン、シタラビン、フルオロウラシル、テトラ
ヒドロフリルフルオロウラシル、メトトレキセート、ア
クチノマイシンＤ、クロモマイシンＡ3 、ダウノルビシ
ン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン
Ｃ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、Ｌ−アスパラギ
ナーゼ、金コロイド、クレスチン、ピシバニール、レン
チナン及び丸山ワクチンを始めとする他の生理活性物質
の１種又は２種以上との組成物としての形態をも包含す
る。このうち、インターロイキン２との併用は、インタ
ーロイキン２が、当該ポリペプチドが免疫担当細胞にお
いてＩＦＮ−γの産生を誘導する際の補因子として機能
するので特に有利である。天然型又は組換え型ヒトイン
ターロイキン２を併用することにより、当該ポリペプチ
ド単独ではＩＦＮ−γを産生し難い免疫担当産生細胞に
おいても、所期のＩＦＮ−γ産生を誘導することができ
る。また、インターロイキン１２と併用するときには、
当該ポリペプチド又はインターロイキン１２単独では容
易に達成し得ない、極めて高レベルのＩＦＮ−γ産生を
誘導することができる。しかも、当該ポリペプチドは、
ヒト体内におけるインターロイキン１２によるイムノグ
ロブリンＥ抗体の産生阻害を高めるので、イムノグロブ
リンＥ抗体の産生を主因とする、例えば、アトピー性喘
息、アトピー性気管支喘息、枯草熱、アレルギー性鼻
炎、アトピー性皮膚炎、血管性浮腫、アトピー性消化器
異常を始めとするアトピー性疾患を治療するための免疫
疾患剤においても極めて有用である。なお、ヒトの体内
には、微量ではあるが、インターロイキン１２が存在す
ることがあるので、斯かる場合には、当該ポリペプチド
のみを投与すれば所期の治療効果が達成できる。

【００１７】さらに、この発明の感受性疾患剤は、投薬
単位形態の薬剤をも包含し、その投薬単位形態の薬剤と
は、当該ポリペプチドを、例えば、１回当りの用量又は
その整数倍（４倍まで）若しくはその約数（１／４０ま
で）に相当する量を含んでなり、投薬に適する物理的に
分離した一体の剤型にある薬剤を意味する。このような
投薬形態の薬剤としては、注射剤、液剤、散剤、顆粒
剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、点眼剤、点鼻剤、坐剤
などが挙げられる。

【００１８】この発明の感受性疾患剤は経口的に投与し
ても非経口的に投与しても、また、以下に述べるように
抗腫瘍細胞などを体外で活性化させる場合に用いてもよ
く、いずれの場合にも、感受性疾患の治療・予防に効果
を発揮する。感受性疾患の種類や症状に依るが、具体的
には、患者の症状や投与後の経過を観察しながら、成人
当たり約０．１μｇ乃至５０ｍｇ／回、望ましくは、約
１μｇ乃至１ｍｇ／回のポリペプチドを１乃至４回／日
又は１乃至５回／週の用量で１日乃至１年間に亙って経
口投与するか、皮内、皮下、筋肉内又は静脈内に非経口
投与すればよい。

【００１９】この発明の感受性疾患剤は、インターロイ
キン２を用いる、いわゆる「抗腫瘍免疫療法」にも有用
である。抗腫瘍免疫療法は、一般に、（ｉ）悪性腫瘍患
者の体内に直接インターロイキン２を投与する方法と、
（ｉｉ）インターロイキン２により生体外で活性化させ
た抗腫瘍細胞を患者の体内に移入する方法（養子免疫療
法）に大別されるが、当該ポリペプチドを併用するとき
には、その効果を有意に高めることができる。具体的に
は、前記（ｉ）の方法の場合、患者にインターロイキン
２を投与するのと同時又は事前に当該ポリペプチドを成
人当たり約０．１μｇ乃至１ｍｇ／回の用量で１乃至１
０回投与する。インターロイキン２の投与量は、悪性腫
瘍の種類、患者の症状及びポリペプチドの用量にも依る
が、通常、成人当たり約１０，０００乃至１，０００，
０００単位／回とする。一方、前記（ｉｉ）の方法の場
合には、悪性腫瘍患者から採取した単核球又はリンパ球
をインターロイキン２の存在下で培養するに当たり、そ
れら血球１×１０⁶ 個当たり当該ポリペプチドを約１ｎ
ｇ乃至１ｍｇ共存させておく。そして、一定時間培養
後、培養物からＮＫ細胞又はＬＡＫ細胞を採取し、これ
を元の患者に移入するのである。この発明による抗腫瘍
免疫療法の対象となり得る疾患としては、例えば、結腸
癌、直腸癌、大腸癌、胃癌、甲状腺癌、舌癌、膀胱癌、
絨毛癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、喉頭癌、肺癌、乳
癌、悪性黒色腫、カポジ肉腫、脳腫瘍、神経芽細胞腫、
卵巣腫瘍、睾丸腫瘍、骨肉腫、膵臓癌、腎癌、副腎腫、
血管内皮腫などの固形悪性腫瘍や白血病、悪性リンパ腫
などの血球系悪性腫瘍が挙げられる。

【００２０】つぎの実験例では、組換えＤＮＡ技術によ
り当該ポリペプチドを調製し、その生物作用と毒性につ
いて試験する。

【００２１】

【実験例１ ポリペプチドの調製】

【００２２】

【実験例１−１ 形質転換体ＫＧＦＨＨ２の作製】０．
５ｍｌ容反応管に２５ｍＭ塩化マグネシウムを８μｌ、
１０×ＰＣＲ緩衝液を１０μｌ、２５ｍＭ ｄＮＴＰミ
ックスを１μｌ、２．５単位／μｌアンプリタックＤＮ
Ａポリメラーゼを１μｌ、特願平６−３０４２０３号明
細書に記載された方法にしたがってファージＤＮＡクロ
ーンから調製した配列表における配列番号２に示す塩基
配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列のポリペプ
チドをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを１ｎｇ、
配列表の配列番号１におけるＮ末端及びＣ末端付近のア
ミノ酸配列に基づき化学合成した５´−ＡＴＡＧＡＡＴ
ＴＣＡＡＡＴＧＴＡＣＴＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡ
ＴＣ−３´及び５´−ＡＴＡＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＣ
ＴＴＣＧＴＴＴＴＧＡＡＣ−３´で表わされる塩基配列
のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの適量
を加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした。常法により、
この混合物を９４℃で１分間、４３℃で１分間、７２℃
で１分間、この順序でインキュベートするサイクルを３
回繰返した後、さらに、９４℃で１分間、６０℃で１分
間、７２℃で１分間、この順序でインキュベートするサ
イクルを４０回繰返してＰＣＲ反応させた。

【００２３】このＰＣＲ産物とストラタジーン製プラス
ミドベクター『ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ （＋）』
を常法にしたがってＤＮＡリガーゼにより連結して組換
えＤＮＡとし、これをコンピテントセル法によりストラ
タジーン製大腸菌株『ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ´Ｋ
ａｎ』に導入して形質転換した。形質転換体を５０μｇ
／ｍｌアンピシリンを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．
２）に接種し、３７℃で１８時間振盪培養した後、培養
物を遠心分離して形質転換体を採取し、通常のアルカリ
−ＳＤＳ法を適用して組換えＤＮＡを単離した。この組
換えＤＮＡの一部をとり、ジデオキシ法により分析した
ところ、配列表の配列番号２に示す塩基配列における５
´末端及び３´末端にそれぞれＥｃｏ ＲＩ切断部位及
びＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を、また、その配列番号２に
併記したアミノ酸配列におけるＮ末端及びＣ末端のそれ
ぞれ直前及び直後に対応する部位にポリペプチド合成開
始のためのメチオニンコドン及びポリペプチド合成終止
のためのＴＡＧコドンを有するＤＮＡを含んでいた。

【００２４】そこで、常法にしたがって残りの組換えＤ
ＮＡを制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切
断後、宝酒造製ＤＮＡライゲーションキット『ＤＮＡラ
イゲーション・キット・バージョン２』を使用して、得
られたＥｃｏ ＲＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡ断片
０．１μｇと予め同じ制限酵素で切断しておいたファル
マシア製プラスミドベクター『ｐＫＫ２２３−３』１０
ｎｇを１６℃で３０分間反応させて連結して複製可能な
組換えＤＮＡ『ｐＫＧＦＨＨ２』を得た。コンピテント
セル法により、この組換えＤＮＡ ｐＫＧＦＨＨ２で大
腸菌Ｙ１０９０株（ＡＴＣＣ３７１９７）を形質転換
し、得られた形質転換体『ＫＧＦＨＨ２』を５０μｇ／
ｍｌアンピシリンを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）
に接種し、３７℃で１８時間振盪培養した。培養物を遠
心分離して形質転換体を採取し、その一部に通常のＳＤ
Ｓ−アルカリ法を適用して組換えＤＮＡ ｐＫＧＦＨＨ
２を抽出した。ジデオキシ法により分析したところ、図
１に示すように、組換えＤＮＡｐＫＧＦＨＨ２において
は、配列表における配列番号２に示す塩基配列を含むＫ
ＧＦＨＨ２ ｃＤＮＡがＴａｃプロモータの下流に連結
されていた。

【００２５】

【実験例１−２ 形質転換体ＫＧＦＨＨ２によるポリペ
プチドの産生と精製】オートクレーブによりアンピシリ
ン５０μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）
を滅菌し、３７℃に冷却後、実験例１−１で作製した形
質転換体ＫＧＦＨＨ２を接種し、振盪下、同じ温度で１
８時間種培養した。２０ｌ容ジャーファーメンタに新鮮
な同一培地を１８ｌとり、同様に滅菌し、３７℃に冷却
後、上記で得た種培養物を１％（ｖ／ｖ）接種し、同じ
温度で８時間通気撹拌培養した。培養物を遠心分離して
菌体を採取し、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１６ｍＭ燐
酸水素二ナトリウム及び４ｍＭ燐酸二水素ナトリウムを
含む混液（ｐＨ７．３）に浮遊させ、超音波破砕後、遠
心分離により菌体破砕物を除去し、上清を採取した。

【００２６】この上清に氷冷下で硫酸アンモニウムを４
０％（ｗ／ｖ）まで加え、均一に溶解し、暫時静置し、
遠心分離後、上清を採取した。この上清を予め１．５Ｍ
硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．
６）により平衡化しておいたファルマシア製『フェニル
・セファロース』のカラムに負荷し、カラムを新鮮な同
一緩衝液で洗浄後、１．５Ｍから０Ｍに下降する硫酸ア
ンモニウムの濃度勾配下、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ
６．６）を通液した。

【００２７】別途、同じ特許出願人による特願平７−５
８２４０号明細書に記載された方法にしたがってイムノ
アフィニティークロマトグラフィー用ゲルを調製し、プ
ラスチック製円筒管内部にカラム状に充填し、燐酸食塩
緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と云う。）で洗浄後、上記カ
ラムクロマトグラフィーにおいて硫酸アンモニウム濃度
１．０Ｍ付近で溶出した画分１０ｍｌを負荷した。新鮮
なＰＢＳで洗浄後、カラムに１Ｍ塩化ナトリウムを含む
０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）を通液
し、ＩＦＮ−γ誘導能ある画分を採取した。採取した画
分をプールし、ＰＢＳに対して４℃で一晩透析し、濃縮
後、ＩＦＮ−γ誘導活性及び蛋白質含量を測定したとこ
ろ、純度９５％以上の精製ポリペプチドが、培養液１ｌ
当たり、約２５ｍｇの収量で得られていた。

【００２８】特願平６−３０４２０３号明細書に記載し
た方法に準じて分析したところ、精製ポリペプチドは次
のような理化学的性質を有していた。すなわち、非還元
条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動する
と、分子量１８，５００±３，０００ダルトンに相当す
る位置にＩＦＮ−γ誘導能ある主たるバンドを示す一
方、クロマトフォーカシングすると、４．９±１．０に
等電点を示した。また、そのＮ末端は、配列表の配列番
号１に示すアミノ酸配列におけるＮ末端にメチオニンが
結合した配列番号３に示すアミノ酸配列を有していた。

【００２９】

【実験例２ 生物作用】

【００３０】

【実験例２−１ 免疫担当細胞におけるＩＦＮ−γの産
生】ヘパリン加注射器により健常者から血液を採取し、
血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）によ
り２倍希釈した。血液をフィコール上に重層し、遠心分
離して採取したリンパ球を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血
清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）によ
り洗浄した後、新鮮な同一培地に細胞密度５×１０⁶ 個
／ｍｌになるように浮遊させ、９６ウェルマイクロプレ
ートに０．１５ｍｌ／ウェルずつ分注した。

【００３１】別途、実験例１−２の方法により得たポリ
ペプチドを１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲ
ＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）により適宜濃度に希
釈して上記マイクロプレートに０．０５ｍｌ／ウェルず
つ分注し、２．５μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ又は５０
単位／ｍｌ組換え型ヒトインターロイキン２を含むか含
まない新鮮な上記と同一培地を０．０５ｍｌ／ウェル加
えた後、５％ＣＯ₂ インキュベータ中、３７℃で２４時
間培養した。培養後、各ウェルから培養上清を０．１ｍ
ｌずつ採取し、通常の酵素免疫測定法によりＩＦＮ−γ
含量を測定した。同時に、ポリペプチドのみを省略した
系を設け、上記と同様に処置して対照とした。結果を表
１に示す。なお、表１中のＩＦＮ−γ含量は、米国国立
公衆衛生研究所から入手したＩＦＮ−γ標品（Ｇｇ２３
−９０１−５３０）に基づき国際単位（ＩＵ）に換算し
ている。

【００３２】

【表１】

【００３３】表１の結果は、当該ポリペプチドを作用さ
せると、免疫担当細胞としてのリンパ球がＩＦＮ−γを
産生したことを示している。また、表１の結果に見られ
るように、このＩＦＮ−γ産生は、補因子としてインタ
ーロイキン２又はコンカナバリンＡを共存させると、一
段と高まる。

【００３４】

【実験例２−２ ＮＫ細胞による細胞障害性の増強】ヘ
パリン加注射器により健常者から血液を採取し、１４０
ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ
７．４）により２倍希釈した。血液をパコール上に重層
し、遠心分離後、パコール勾配遠心分離して高密度リン
パ球を得た。

【００３５】このリンパ球を細胞密度１×１０⁶ 個／ｍ
ｌになるように１０μｇ／ｍｌカナマイシン、５×１０
^-5Ｍ ２−メルカプトエタノール及び１０％（ｖ／ｖ）
ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．
２）に浮遊させ、１２ウェルマイクロプレートに０．５
ｍｌ／ウェルずつ分注した。そして、実験例１−２の方
法により得たポリペプチドを新鮮な上記と同一培地に適
宜希釈してマイクロプレートに１．５ｍｌ／ウェルずつ
加えた後、さらに５０単位／ｍｌ組換え型ヒトインター
ロイキン２を含むか含まない同培地を０．５ｍｌ／ウェ
ル加えた後、５％ＣＯ₂ インキュベータ中、３７℃で２
４時間培養し、１４０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍ
Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄して効果細胞として
のＮＫ細胞を含む培養リンパ球を得た。

【００３６】別途、常法により⁵¹Ｃｒ標識したＮＫ細胞
感受性標的細胞としてのヒト慢性骨髄性白血病由来のＫ
−５６２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４３）を９６ウェル
マイクロプレートに１×１０⁴ 個／ウェルずつとり、上
記で調製した効果細胞を効果細胞／標的細胞比で２．
５：１、５：１又は１０：１の割合で加え、５％ＣＯ₂
インキュベータ中、３７℃で４時間培養した後、常法に
したがって培養上清の放射能を測定して死滅標的細胞数
を求めた。そして、各々の系につき、試験に供した標的
細胞数に対する死滅標的細胞数の百分率（％）を計算
し、細胞障害性の目安とした。結果を表２に示す。

【００３７】

【表２】

【００３８】表２の結果は、当該ポリペプチドに、ＮＫ
細胞による細胞障害性を増強する性質のあることを示し
ている。また、表２の結果に見られるように、この細胞
障害性の増強は、インターロイキン２が共存すると、一
段と増強される。

【００３９】

【実験例２−３ ＬＡＫ細胞の生成誘導】常法により⁵¹
Ｃｒ標識したＮＫ細胞非感受性標的細胞としてのヒトバ
ーキットリンパ腫由来のＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ８６）を９６ウェルマイクロプレートに１×１０⁴ 個
／ウェルずつとり、７２時間培養した以外は実験例２−
２と同様にして調製した効果細胞としてのＬＡＫ細胞を
含む培養リンパ球を効果細胞／標的細胞比で５：１、１
０：１又は２０：１の割合で加え、５％ＣＯ₂ インキュ
ベータ中、３７℃で４時間培養した後、常法にしたがっ
て培養上清の放射能を測定した。その後、実験例２−２
と同様にして細胞障害性（％）を計算した。結果を表３
に示す。

【００４０】

【表３】

【００４１】表３の結果は、当該ポリペプチドに、ＬＡ
Ｋ細胞の生成を誘導する性質のあることを示している。
また、表３の結果に見られるように、この誘導は、イン
ターロイキン２が共存すると、一段と増強される。

【００４２】

【実験例３ 急性毒性試験】常法にしたがって、８週齢
のマウスに実験例１−２の方法により得た精製ポリペプ
チドを経皮、経口又は腹腔内に注射投与した。その結
果、精製ポリペプチドのＬＤ５０は、いずれの投与経路
によっても約１ｍｇ／ｋｇ以上であった。このことは、
当該ポリペプチドがヒトへの投与を前提とする医薬品に
配合して安全であることを裏付けている。

【００４３】周知のように、ＩＦＮ−γはウイルス、細
菌などに対する感染防御、悪性腫瘍の増殖抑制、免疫機
能の調節作用を通じてヒトの生体防御、さらには、イム
ノグロブリンＥ抗体の産生阻害に多大の関与をしてい
る。前述のとおり、ＩＦＮ−γはヒトの感受性疾患剤と
してすでに実用化されており、その対象疾患、用量、用
法及び安全性はほぼ確立している。一方、フランセス・
アール・バークウィル著、渡部好彦訳、『サイトカイン
とがん治療』、１９９１年、東京化学同人発行などにも
記載されているように、ＮＫ細胞及びＬＡＫ細胞などの
キラー細胞を利用する療法は、抗腫瘍免疫療法を始めと
して、多種多様のヒト疾患において試みられ、総じて良
好な成果が報告されている。最近では、サイトカインを
用いるキラー細胞による細胞障害性の増強又はキラー細
胞の生成の誘導と治療効果との関連性が注目されてお
り、例えば、ティー・フジオカら『ブリティッシュ・ジ
ャーナル・オブ・ユーロロジー』、第７３巻、第１号、
２３乃至３１頁（１９９４年）には、ＬＡＫ細胞とイン
ターロイキン２を併用する抗腫瘍免疫療法において、イ
ンターロイキン２がＬＡＫ細胞の生成を顕著に誘導し、
重篤な毒性や副作用を惹起することなく、ヒトの転移癌
に格別の効果を発揮したことが報告されている。

【００４４】このように、多種多様のヒト疾患の治療・
予防にＩＦＮ−γやキラー細胞が深く関わり、その完治
又は緩解への多大の寄与が明らかになっている。斯かる
状況において、実験例２乃至３の結果に見られるよう
に、当該ポリペプチドが、顕著な毒性を示すことなく、
免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するとと
もに、ＮＫ細胞による細胞障害性の増強又はＬＡＫ細胞
の生成を誘導したことは、この発明の感受性疾患剤が、
重篤な副作用を惹起することなくヒトに長期間連用で
き、ＩＦＮ−γ及び／又はキラー細胞が関与する疾患の
治療・予防に効果を発揮することを示している。

【００４５】以下、実施例に基づき、この発明の感受性
疾患剤を説明する。

【００４６】

【実施例１ 液剤】安定剤として１％（ｗ／ｖ）ヒト血
清アルブミンを含む生理食塩水に実験例１−２の方法に
より得たポリペプチドを１ｍｇ／ｍｌになるように溶解
し、常法にしたがって精密濾過により滅菌して液剤を得
た。

【００４７】安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウイル
ス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患を含む感受性疾患を
治療・予防するための注射剤、点眼剤及び点鼻剤として
有用である。

【００４８】

【実施例２ 乾燥注射剤】安定剤として１％（ｗ／ｖ）
精製ゼラチンを含む生理食塩水１００ｍｌに実験例１−
２の方法により得たポリペプチドを１００ｍｇ溶解し、
常法にしたがって精密濾過により滅菌し、バイアル瓶に
１ｍｌずつ分注し、凍結乾燥後、密栓した。

【００４９】安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウイル
ス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患を含む感受性疾患を
治療・予防するための乾燥注射剤として有用である。

【００５０】

【実施例３ 軟膏剤】滅菌蒸留水に和光純薬工業製カル
ボキシビニルポリマー『ハイビスワコー１０４』と高純
度トレハロースをそれぞれ濃度１．４％（ｗ／ｗ）及び
２．０％（ｗ／ｗ）になるように溶解し、実験例１−２
の方法により得たポリペプチドを均一に混合後、ｐＨ
７．２に調整して、１ｇ当たりポリペプチドを約１ｍｇ
含むペースト状物を得た。

【００５１】延展性と安定性に優れた本品は、悪性腫
瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患を含む感
受性疾患の治療・予防するための軟膏として有用であ
る。

【００５２】

【実施例４ 錠剤】林原製無水結晶α−マルトース粉末
『ファイントース』に実験例１−２の方法により得たポ
リペプチドと細胞賦活剤としてのルミンを均一に混合
し、得られる混合物を常法により打錠して製品１錠（約
２００ｍｇ）当たりポリペプチド及びルミンをそれぞれ
約１ｍｇ含む錠剤を得た。

【００５３】摂取性、安定性に優れ、細胞賦活作用も有
する本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及
び免疫疾患を含む感受性疾患を治療・予防するための錠
剤として有用である。

【００５４】

【実施例５ 養子免疫療法剤】悪性リンパ腫患者の末梢
血から単核球を単離し、３７℃に予温した１０％（ｖ／
ｖ）ヒトＡＢ血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐ
Ｈ７．２）に細胞密度約１×１０⁶ 個／ｍｌになるよう
に浮遊させ、実験例１−２の方法により得たポリペプチ
ドを約１．０μｇ／ｍｌと組換え型ヒトインターロイキ
ン２を約１００単位／ｍｌ加え、５％ＣＯ₂ インキュベ
ータ中、３７℃で１週間培養した後、遠心分離によりＬ
ＡＫ細胞を採取した。

【００５５】このＬＡＫ細胞は、元の悪性リンパ腫患者
の体内に移入すると、リンパ腫細胞に顕著な細胞障害性
を示し、インターロイキン２のみ用いる養子免疫療法と
比較して有意に高い治療効果を発揮する。なお、ヒト単
核球に代えて腫瘍組織浸潤リンパ球を同様に処置して得
られる細胞障害性Ｔ細胞も、元の患者体内に移入する
と、ＬＡＫ細胞と同様の効果を発揮する。本例の養子免
疫療法剤は、悪性リンパ腫以外に、例えば、腎癌、悪性
黒色腫、大腸癌、肺癌などの固形悪性腫瘍にも有利に適
用できる。

【００５６】

【発明の効果】以上説明したように、この発明の感受性
疾患剤は、ヒトに投与すると、悪性腫瘍、ウイルス性疾
患、細菌感染症及び免疫疾患を含む感受性疾患の治療・
予防に効果を発揮する。また、キラー細胞による細胞障
害性の増強又はキラー細胞の生成を誘導する性質を兼備
するポリペプチドを有効成分とする感受性疾患剤は、悪
性腫瘍などの難治性疾患の治療に格別の効果を発揮す
る。

【００５７】この発明は、斯くも顕著な作用効果を発揮
するものであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義の
ある発明であると云える。

【００５８】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：157 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn Asp 1 5 10 15 Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp Met Thr 20 25 30 Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met 35 40 45 50 Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys 55 60 65 Glu Lys Ile Ser Xaa Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu 70 75 80 85 Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe 90 95 100 Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser 105 110 115 Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu 120 125 130 135 Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val 140 145 150 Gln Asn Glu Asp 155

【００５９】配列番号：2 配列の長さ：471 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ヒト 組織の種類：肝臓 配列の特徴 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：1..471 特徴を決定した方法：S 配列 TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA AGA AAT TTG AAT 48 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGG CCT CTA TTT GAA GAT 96 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 ATG ACT GAT TCT GAC TGT AGA GAT AAT GCA CCC CGG ACC ATA TTT ATT 144 Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGC CAG CCT AGA GGT ATG GCT GTA ACT ATC 192 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 TCT GTG AAG TGT GAG AAA ATT TCA AYT CTC TCC TGT GAG AAC AAA ATT 240 Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Xaa Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 ATT TCC TTT AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC AAG GAT ACA AAA 288 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 AGT GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA CAT GAT AAT AAG 336 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT CTA GCT TGT GAA 384 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAA AAA GAG GAT GAA TTG 432 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTT CAA AAC GAA GAC 471 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155

【００６０】配列番号：3 配列の長さ：11 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：N末端フラグメント

【００６１】配列番号：4 配列の長さ：25 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：中間部フラグメント 配列 Ile Ile Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln 1 5 10 15 Ser Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys 20 25

【００６２】配列番号：5 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメントの種類：中間部フラグメント 配列 Gln Pro Val Phe Glu Asp Met Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro 1 5 10 15 Gln

【００６３】配列番号：6 配列の長さ：471 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列の特徴 起源 生物名：マウス 組織の種類：肝臓 配列の特徴 配列を表わす記号：mat peptide 存在位置：1..471 特徴を決定した方法：S 配列 AAC TTT GGC CGA CTT CAC TGT ACA ACC GCA GTA ATA CGG AAT ATA AAT 48 Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn 1 5 10 15 GAC CAA GTT CTC TTC GTT GAC AAA AGA CAG CCT GTG TTC GAG GAT ATG 96 Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met 20 25 30 ACT GAT ATT GAT CAA AGT GCC AGT GAA CCC CAG ACC AGA CTG ATA ATA 144 Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile 35 40 45 TAC ATG TAC AAA GAC AGT GAA GTA AGA GGA CTG GCT GTG ACC CTC TCT 192 Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser 50 55 60 GTG AAG GAT AGT AAA AYG TCT ACC CTC TCC TGT AAG AAC AAG ATC ATT 240 Val Lys Asp Ser Lys Xaa Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile 65 70 75 80 TCC TTT GAG GAA ATG GAT CCA CCT GAA AAT ATT GAT GAT ATA CAA AGT 288 Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser 85 90 95 GAT CTC ATA TTC TTT CAG AAA CGT GTT CCA GGA CAC AAC AAG ATG GAG 336 Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu 100 105 110 TTT GAA TCT TCA CTG TAT GAA GGA CAC TTT CTT GCT TGC CAA AAG GAA 384 Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu 115 120 125 GAT GAT GCT TTC AAA CTC ATT CTG AAA AAA AAG GAT GAA AAT GGG GAT 432 Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp 130 135 140 AAA TCT GTA ATG TTC ACT CTC ACT AAC TTA CAT CAA AGT 471 Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser 145 150 155

【図面の簡単な説明】

【図１】組換えＤＮＡ ｐＫＧＦＨＨ２の構造を示す図
である。

【符号の説明】

ＫＧＦＨＨ２ ｃＤＮＡ ポリペプチドをコードす
るｃＤＮＡ Ｐｔａｃ ｔａｃプロモータ ｒｒｎＢＴ１Ｔ２ リボゾームＲＮＡオペロ
ンの転写終止領域 ＡｍｐＲ アンピシリン耐性遺伝子 ｐＢＲ３２２ｏｒｉ 大腸菌における複製開始
点

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/52 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ 14/54 ＡＤＹ 14/55 ＡＤＺ

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表における配列番号１に示すアミノ
   酸配列又はそれに相同的なアミノ酸配列（ただし、符号
   「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又
   はトレオニンを表わすものとする。）を有し、免疫担当
   細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するポ
   リペプチドを有効成分として含んでなる感受性疾患剤。
2. 【請求項２】 ポリペプチドがキラー細胞による細胞障
   害性の増強又はキラー細胞の生成を誘導する性質を有す
   る請求項１に記載の感受性疾患剤。
3. 【請求項３】 安定剤として血清アルブミン及び／又は
   ゼラチンを含んでなる請求項１又は２に記載の感受性疾
   患剤。
4. 【請求項４】 インターロイキン２をさらに含んでなる
   請求項１、２又は３に記載の感受性疾患剤。
5. 【請求項５】 抗腫瘍剤としての請求項１、２、３又は
   ４に記載の感受性疾患剤。
6. 【請求項６】 抗腫瘍剤が抗腫瘍免疫療法剤である請求
   項５に記載の感受性疾患剤。
7. 【請求項７】 抗ウイルス剤としての請求項１、２、３
   又は４に記載の感受性疾患剤。
8. 【請求項８】 抗菌剤としての請求項１、２、３又は４
   に記載の感受性疾患剤。
9. 【請求項９】 免疫疾患剤としての請求項１、２、３又
   は４に記載の感受性疾患剤。
10. 【請求項１０】インターロイキン１２をさらに含んでな
    る請求項９に記載の感受性疾患剤。
11. 【請求項１１】アトピー性疾患を治療するための請求項
    ９又は１０に記載の感受性疾患剤。