JP3109018B2

JP3109018B2 - インターフェロン−γの産生を誘導する蛋白質

Info

Publication number: JP3109018B2
Application number: JP06184162A
Authority: JP
Inventors: 春樹岡村; 忠雄谷本; 角二鳥越; 雅司栗本
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1994-07-14
Filing date: 1994-07-14
Publication date: 2000-11-13
Anticipated expiration: 2015-11-13
Also published as: JPH0827189A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の利用分野】この発明は、免疫担当細胞において
インターフェロン−γ（以下、「ＩＦＮ−γ」と略記す
る。）の産生を誘導する新規な蛋白質に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】ＩＦＮ−γは、抗ウイルス作用、抗腫瘍
作用、免疫調節作用を有する蛋白質として知られ、抗原
やマイトジェンによる刺激を受けた免疫担当細胞が産生
すると云われている。これら生物作用ゆえに、ＩＦＮ−
γはその発見当初より抗腫瘍剤としての実用化が鶴首さ
れ、現在では脳腫瘍を始めとする悪性腫瘍一般の治療剤
として精力的に臨床試験が進められている。現在入手し
得るＩＦＮ−γは免疫担当細胞が産生する天然型ＩＦＮ
−γと、免疫担当細胞から採取したＩＦＮ−γをコード
するＤＮＡを大腸菌に導入してなる形質転換体が産生す
る組換え型ＩＦＮ−γに大別され、上記臨床試験におい
ては、これらのうちのいずれかが「外来ＩＦＮ−γ」と
して投与されている。

【０００３】このうち、天然型ＩＦＮ−γは、通常、培
養株化した免疫担当細胞をＩＦＮ−γ誘導剤を含む培養
培地で培養し、その培養物を精製することにより製造さ
れる。この方法では、ＩＦＮ−γ誘導剤の種類がＩＦＮ
−γの産生量や精製のし易さ、さらには、製品の安全性
等に多大の影響を及ぼすと云われており、通常、コンカ
ナバリンＡ、レンズ豆レクチン、アメリカヤマゴボウレ
クチン、エンドトキシン、リポ多糖などのマイトジェン
が頻用される。しかしながら、これら物質は、いずれも
分子に多様性があり、給源や精製方法に依って品質が変
動し易く、誘導能の一定したＩＦＮ−γ誘導剤を所望量
入手し難いという問題がある。くわえて、上記物質の多
くは生体に投与すると顕著な副作用を示したり、物質に
依っては毒性を示すものすらあり、生体に直接投与して
ＩＦＮ−γの産生を誘導するのが極めて困難であった。

【０００４】

【発明により解決すべき課題】斯かる状況に鑑み、この
発明の目的は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生
を誘導する新規な蛋白質を提供することにある。

【０００５】この発明の別の目的は、斯かる蛋白質をコ
ードするＤＮＡを提供することにある。

【０００６】この発明のさらに別の目的は、斯かるＤＮ
Ａと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組
換えＤＮＡを提供することにある。

【０００７】この発明のさらに別の目的は、斯かる組換
えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体を提供す
ることにある。

【０００８】この発明のさらに別の目的は、組換えＤＮ
Ａ技術を応用した当該蛋白質の製造方法を提供すること
にある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】この発明は、上記第一の
課題を、下記の理化学的性質を有する蛋白質により解決
するものである。（１）分子量ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又はゲル濾
過法で測定すると、分子量１９，０００±５，０００ダ
ルトンを示す。（２）等電点クロマトフォーカシング法で測定すると、４．８±１．
０に等電点を示す。（３）部分アミノ酸配列配列表における配列番号１及び２に示す部分アミノ酸配
列を有する。（４）生物作用免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する。

【００１０】この発明は、上記第二の課題を、斯かる蛋
白質をコードするＤＮＡにより解決するものである。

【００１１】この発明は、上記第三の課題を、斯かるＤ
ＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な
組換えＤＮＡにより解決するものである。

【００１２】この発明は、上記第四の課題を、斯かるＤ
ＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な
組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体によ
り解決するものである。

【００１３】この発明は、上記第五の課題を、当該蛋白
質を産生し得る形質転換体を栄養培地で培養し、産生し
た蛋白質を培養物から採取してなる蛋白質の製造方法に
より解決するものである。

【００１４】

【作用】この発明の蛋白質は、上記したごとく、従来公
知の蛋白質には見られない独特の理化学的性質を具備し
ており、免疫担当細胞に作用させると、ＩＦＮ−γの産
生を誘導する。

【００１５】この発明のＤＮＡは、自律複製可能な適宜
ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、この組換えＤＮ
Ａを、本来、当該蛋白質を産生しないけれども、容易に
増殖させることのできる宿主に導入して形質転換体とす
ることにより、当該蛋白質の産生を発現する。

【００１６】この発明の複製可能な組換えＤＮＡは、本
来、当該蛋白質を産生しないけれども、容易に増殖させ
ることのできる宿主に導入して形質転換体とすることに
より、当該蛋白質の産生を発現する。

【００１７】この発明の形質転換体は、培養すると、当
該蛋白質を産生する。

【００１８】斯かる形質転換体をこの発明の製造方法に
したがって培養すれば、所望量の蛋白質が比較的容易に
得られる。

【００１９】以下、実施例、実験例等に基づきこの発明
を説明するに、この発明は、免疫担当細胞においてＩＦ
Ｎ−γの産生を誘導する新規な蛋白質の発見に基づくも
のである。本発明者が、哺乳類由来の細胞が産生するサ
イトカイン類につき研究していたところ、マウスの肝臓
中にＩＦＮ−γの産生を誘導する従来未知の全く新規な
物質が存在することを見出した。カラムクロマトグラフ
ィーを中心とする種々の精製方法を組合せてこの物質を
単離し、その性質・性状を調べたところ、その本質は蛋
白質であり、次のような理化学的性質を有するものであ
ることが判明した。（１）分子量ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又はゲル濾
過法で測定すると、分子量１９，０００±５，０００ダ
ルトンを示す。（２）等電点クロマトフォーカシング法で測定すると、４．８±１．
０に等電点を示す。（３）部分アミノ酸配列配列表における配列番号１及び２に示す部分アミノ酸配
列を有する。（４）生物作用免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する。

【００２０】次に、これら理化学的性質を解明するに到
った一連の実験について説明する。

【００２１】

【実験例１精製蛋白質の調製】８週齢の雌ＣＤ−１マ
ウス６００匹の腹腔内にコリネバクテリウム・パルバム
（ＡＴＣＣ１１８２７）を６０℃で１時間加熱して調製
した死菌体を１ｍｇ／匹注射投与し、通常一般の方法で
７日間飼育後、静脈内に大腸菌由来の精製リポ多糖を１
μｇ／匹注射投与した。１乃至２時間後、頸椎を脱臼さ
せてマウスを屠殺し、心臓採血後、肝臓を摘出し、８倍
容の５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．３）中、ホモゲナイ
ザーにより破砕して抽出した。抽出物を約８，０００ｒ
ｐｍで２０分間遠心分離し、得られた上清約９ｌに飽和
硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．
３）を硫酸アンモニウムが４５％飽和になるように加
え、４℃で１８時間静置後、約８，０００ｒｐｍで３０
分間遠心分離して当該蛋白質を含む上清約１９ｌを得
た。

【００２２】この上清を予め１Ｍ硫酸アンモニウムを含
む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化させてお
いたファルマシア製『フェニルセファロース』約４．６
ｌのカラムに負荷し、カラムを新鮮な同一緩衝液で洗浄
後、１Ｍから０．２Ｍに下降する硫酸アンモニウムの濃
度勾配下、５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．３）をＳＶ
０．５７で通液した。硫酸アンモニウム濃度が０．８Ｍ
付近のときに溶出した当該蛋白質を含む画分約４．８ｌ
を採取し、膜濃縮し、２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．
５）に対して４℃で１８時間透析後、予め２０ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化させておいたファルマシ
ア製『ＤＥＡＥ−セファロース』約２５０ｍｌのカラム
に負荷した。カラムを新鮮な同一緩衝液で洗浄後、０Ｍ
から０．２Ｍに上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、
カラムに２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）をＳＶ１．
２で通液したところ、当該蛋白質が０．１３Ｍ付近の塩
化ナトリウム濃度で溶出した。

【００２３】当該蛋白質を含む溶出液約２６０ｍｌを採
取し、濃縮し、２５ｍＭビス−トリス緩衝液（ｐＨ７．
１）に対して４℃で１８時間透析後、予め新鮮な同一の
緩衝液で平衡化させておいたファルマシア製『Ｍｏｎｏ
−Ｐ』約２４ｍｌのカラムに負荷し、ｐＨ７からｐＨ４
に下降するｐＨ勾配下、カラムに１０％（ｖ／ｖ）ポリ
バッファー７４（ｐＨ４．０）を通液したところ、ｐＨ
が約４．８のときに当該蛋白質が溶出した。当該蛋白質
を含む溶出液約２３ｍｌを採取し、濃縮し、予め７ｍＭ
燐酸水素二ナトリウム、３ｍＭ燐酸二水素ナトリウム及
び１３９ｍＭ塩化ナトリウムからなる混液（ｐＨ７．
２）で平衡化させておいたファルマシア製『スーパーデ
ックス７５』のカラムに負荷し、新鮮な同一混液を通
液してゲル濾過クロマトグラフィーしたところ、分子量
１９，０００ダルトン付近に当該蛋白質が溶出した。当
該蛋白質を含む画分を採取し、濃縮して下記の実験例２
に供した。収量は、マウス１匹当たり約０．６μｇであ
った。

【００２４】

【実験例２蛋白質の理化学的性質】

【００２５】

【実験例２−１分子量】実験例１で調製した精製蛋白
質をユー・ケー・レムリが『ネーチャー』、第２２７
巻、第６８０〜６８５頁（１９７０年）に報告している
方法に準じ、還元剤の非存在下でＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動したところ、分子量１９，０００±
５，０００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ誘導能
ある主たるバンドが観察された。なお、このときの分子
量マーカは、ウシ血清アルブミン（６７，０００ダルト
ン）、オボアルブミン（４５，０００ダルトン）、大豆
トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）及び
α−ラクトアルブミン（１４，４００ダルトン）であっ
た。

【００２６】

【実験例２−２等電点】精製蛋白質を常法にしたがっ
てクロマトフォーカシングしたところ、４．８±１．０
に等電点を示した。

【００２７】

【実験例２−３部分アミノ酸配列】実験例１で調製し
た精製蛋白質を含む水溶液の一部をとり、約５０μｌま
で濃縮した。濃縮物に３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、６０％
（ｖ／ｖ）グリセロール及びジチオトレイトール６０ｍ
ｇ／ｍｌからなる混液２５μｌを加え、５０℃で３０分
間インキュベート後、１５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルア
ミドゲル上に移し、常法にしたがって電気泳動した。そ
の後、ゲルを０．１％（ｗ／ｖ）クーマシーブリリアン
トブルーＲ２５０を含む５０％（ｖ／ｖ）水性メタノー
ルと１０％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液の混液に浸漬して染色
し、１２％（ｖ／ｖ）水性メタノールと７％（ｖ／ｖ）
酢酸水溶液の混液で繰返し濯いで脱色し、蒸留水中に１
８時間浸漬して洗浄後、ゲルよりクーマシーブリリアン
トブルー染色された当該蛋白質を含む部分を切出し、凍
結乾燥した。

【００２８】次に、乾燥ゲルをシグマ製『ＴＰＣＫトリ
プシン』２μｇ／ｍｌを含む１００ｍＭ炭酸水素ナトリ
ウム、０．５ｍＭ塩化カルシウム及び０．０２％（ｖ／
ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０水溶液からなる混液０．６ｍｌに
浸漬し、３７℃で１８時間インキュベートして蛋白質を
トリプシン消化した。そして、消化物を遠心分離して上
清を採取する一方、沈澱部を０．００１％（ｖ／ｖ）Ｔ
ｗｅｅｎ２０を含む１％（ｖ／ｖ）水性トリフルオロ
酢酸１ｍｌに浸漬し、室温下で４時間振盪後、遠心分離
し上清を採取した。新たに生じた沈澱を０．００１％
（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含む７０％（ｖ／ｖ）水
性トリフルオロ酢酸、０．００１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含む５０％（ｖ／ｖ）水性トリフルオロ酢酸
及び５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルの順序で上記
と同様に処理し、得られた上清と上記で得られた上清を
プールし、２５０μｌまで濃縮後、遠心濾過した。

【００２９】斯くして得られたペプチド断片を含む水溶
液を、予め０．１％（ｖ／ｖ）水性トリフルオロ酢酸で
平衡化させておいた東ソー製高速液体クロマトグラフィ
ー用カラム『ＨＰＬＣＯＤＳ−１２０Ｔ』に負荷し、
カラムを０．１％（ｖ／ｖ）水性トリフルオロ酢酸で洗
浄後、溶出液中のペプチド濃度を吸光光度計により２１
４ｎｍ及び２８０ｎｍの波長下でモニタしながら、０％
（ｖ／ｖ）から７０％（ｖ／ｖ）に上昇する水性アセト
ニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）ト
リフルオロ酢酸を０．５ｍｌ／分の流速で通液した。そ
して、通液開始から約７５分後又は約５５分後に溶出し
た画分（以下、それぞれ『ペプチド断片Ａ』又は『ペプ
チド断片Ｂ』と云う。）を別々に採取した。このときの
溶出パターンを図１に示す。

【００３０】パーキン・エルマー製プロテイン・シーケ
ンサ『４７３Ａ型』を使用し、常法にしたがってこれら
ペプチド断片Ａ及びＢのアミノ酸配列を調べたところ、
それぞれ、配列表における配列番号１又は２に示すアミ
ノ酸配列を有していた。

【００３１】

【実験例２−４生物作用】

【００３２】

【実験例２−４（ａ）免疫担当細胞におけるＩＦＮ−
γ産生の誘導】８週齢の雌ＢＤＦ１マウスから脾臓を摘
出し、血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．
４）中で分散し、新鮮な同一培地で洗浄後、ゲイ緩衝液
（ｐＨ８．０）中に浸漬して溶血させた。得られた脾細
胞を１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を補足したＲＰＭＩ１
６４０培地（ｐＨ７．４）に細胞密度１×１０⁷個／ｍ
ｌになるように懸濁した後、和光純薬工業製細胞分離用
ナイロンウールカラムに負荷し、５％ＣＯ₂インキュベ
ータ中、３７℃で１時間インキュベートした。その後、
カラムに１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を補足したＲＰＭ
Ｉ１６４０培地（ｐＨ７．４）を通液してＴ細胞を採取
し、新鮮な同一培地で洗浄し、下記のＩＦＮ−γ誘導試
験に供した。

【００３３】細胞密度１×１０⁷個／ｍｌになるように
ＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）に浮遊させたマウ
スＴ細胞を９６ウエルマイクロプレート上に０．１５ｍ
ｌずつとり、精製蛋白質を１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清
を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）で適宜
希釈して０．０５ｍｌ加えた後、０．５μｇ／ｍｌコン
カナバリンＡの存在下又は非存在下で５％ＣＯ₂インキ
ュベータ中、３７℃で２４時間培養した。その後、各ウ
エルから培養上清を０．１ｍｌずつ採取し、産生したＩ
ＦＮ−γを通常の酵素免疫測定法により測定した。同時
に、精製蛋白質を省略した以外は同一の系を設け、これ
を上記と同様に処置して対照とした。なお、ＩＦＮ−γ
の標準品には、米国国立公衆衛生研究所から入手した標
準マウスＩＦＮ−γ（Ｇｇ０２−９０１−５３３）を使
用し、国際単位（ＩＵ）に換算して表示した。

【００３４】その結果、対照系において有意なＩＦＮ−
γの産生が認められなかったのに対して、精製蛋白質を
加えた系では顕著なＩＦＮ−γの産生が認められ、０．
０２乃至１０μｇ／ｍｌの用量で、コンカナバリンＡの
非存在下でマウスＴ細胞１×１０⁶個当たり約２乃至２
００ＩＵ、コンカナバリンＡの存在下で約２乃至２，０
００ＩＵのＩＦＮ−γが産生していた。このことは、当
該蛋白質に免疫担当細胞におけるＩＦＮ−γの産生を誘
導する作用のあることを裏付けている。

【００３５】なお、この発明を通じて当該蛋白質の１単
位とは、コンカナバリンＡの存在下で上記のとおり試験
したときに、ＩＦＮ−γを１６０ＩＵ誘導する蛋白質の
量と定義する。

【００３６】

【実験例２−４（ｂ）キラー細胞の細胞障害性増強】
１００μｇ／ｍｌカナマイシン、５×１０^-5Ｍ２−メ
ルカプトエタノール及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を
含むＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）に実験例２−
４（ａ）と同様に調製したマウス脾細胞を細胞密度１×
１０⁷個／ｍｌになるように浮遊させ、組換え型ヒトイ
ンターロイキン２を０、１、５又は１０ｕ／ｍｌ加えた
後、２５ｍｌ容培養フラスコに収容した。培養フラスコ
内の細胞浮遊液に精製蛋白質を０、０．８、４、２０又
は１００単位／ｍｌ加え、５％ＣＯ₂インキュベータ
中、３７℃で７２時間培養し、新鮮なＲＰＭＩ１６４０
培地（ｐＨ７．２）で洗浄後、脾細胞を予め放射性クロ
ム酸ナトリウムで標識したＹＡＣ−１細胞（ＡＴＣＣ
ＴＩＢ１６０）とともに効果細胞／標的細胞比２０：１
又は４０：１の割合で新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地（ｐ
Ｈ７．２）に浮遊させた。細胞浮遊液を９６ウェルマイ
クロプレートにとり、５％ＣＯ₂インキュベータ中、３
７℃で４時間培養し、培養上清中の⁵¹Ｃｒによる放射能
をガンマカウンタにより測定した。結果を表１に示す。

【００３７】表１の結果は、この発明の蛋白質にキラー
細胞による細胞障害性を有意に増強する性質があり、し
かも、その性質がインターロイキン２により顕著に増強
されることを示している。

【００３８】

【表１】

【００３９】以上のような理化学的性質を有する蛋白質
は未だ知られておらず、新規物質であると判断される。
そこで、本発明者が、マウス肝細胞からｍＲＮＡを単離
し、これを鋳型に前記実験例２−３で明らかにした部分
アミノ酸配列に基づき化学合成したプライマーの存在下
でＲＴ−ＰＣＲ反応させて当該蛋白質を部分コードする
ＤＮＡ断片を採取し、これをプローブにして上記ｍＲＮ
Ａから別途作製したｃＤＮＡライブラリーを鋭意検索し
た結果、４７１塩基対からなる、配列表における配列番
号４に示す５´末端からの塩基配列のＤＮＡ断片が得ら
れた。この塩基配列を解読したところ、当該蛋白質は、
１５７個のアミノ酸からなる、配列表における配列番号
３に示すＮ末端からのアミノ酸配列を有していることが
判明した。なお、配列表における配列番号３において、
符合「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、メチオニン
又はトレオニンを意味するものとする。

【００４０】配列表における配列番号３及び４に示すア
ミノ酸配列及び塩基配列を解明するに到った一連の操作
を要約すると、次のようになる。（１）クロマトグラフィーを中心とする種々の精製方
法を組合せてマウス肝細胞から当該蛋白質を単離し、高
度に精製した。（２）精製蛋白質をトリプシンで消化し、消化物から
２種類のペプチド断片を単離し、そのアミノ酸配列を決
定した。（３）マウス肝細胞からｍＲＮＡを採取し、これを鋳
型に上記部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴ
ヌクレオチドのプライマーの存在下でＲＴ−ＰＣＲ反応
させてＤＮＡ断片を調製する一方、それら部分アミノ酸
配列に基づき別途化学合成したオリゴヌクレオチドをプ
ローブにしてそれらＤＮＡ断片を検索し、当該蛋白質を
部分コードするＤＮＡ断片を採取した。（４）別途、前記ｍＲＮＡを鋳型にｃＤＮＡライブラ
リーを作製し、これに上記で調製したＤＮＡ断片をプロ
ーブにしてハイブリダイズさせ、顕著な会合を示す形質
転換体を採取した。（５）形質転換体からｃＤＮＡを採取し、その塩基配
列を決定し、解読するとともに、解読したアミノ酸配列
と前記部分アミノ酸配列を比較して、その塩基配列が当
該蛋白質をコードしていることを確認した。

【００４１】次の実験例３では、上記の工程（３）乃至
（５）を中心に具体的に説明するが、本例で用いた手法
自体は斯界において公知であり、例えば、ティー・マニ
ャティス等『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラ
トリー・マニュアル』、１９８９年、コールド・スプリ
ング・ハーバー発行や、村松正実『ラボマニュアル遺伝
子工学』、１９８８年、丸善出版発行などにも詳述され
ている。

【００４２】

【実験例３ＤＮＡの塩基配列と蛋白質のアミノ酸配
列】

【００４３】

【実験例３−１全ＲＮＡの調製】実験例１と同様にし
て調製したマウス肝細胞を湿重で３ｇとり、これを６Ｍ
グアニジンイソチオシアナート、１０ｍＭクエン酸ナト
リウム及び０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳからなる混液（ｐ
Ｈ７．０）２０ｍｌに浸漬し、ホモゲナイザーで破砕し
た。次に、常法にしたがって、３５ｍｌ容遠心管に５．
７Ｍ塩化セシウムを含む０．１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．
５）を２５ｍｌ注入し、その上部に細胞破砕物を１０ｍ
ｌ重層し、この状態で２０℃、２５，０００ｒｐｍで２
０時間超遠心分離後、ＲＮＡ画分を採取した。このＲＮ
Ａ画分を１５ｍｌ容遠心管にとり、等容量のクロロホル
ム／イソブタノール混液（４：１）を加え、５分間振盪
し、４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した
後、水層部を採取し、２．５倍容のエタノールを加え、
−２０℃で２時間静置して全ＲＮＡを沈澱させた。この
沈澱を採取し、７５％（ｖ／ｖ）水性エタノールで洗浄
後、滅菌蒸留水０．５ｍｌに溶解して下記の実験に供し
た。なお、全ＲＮＡの収量は約４ｍｇであった。

【００４４】

【実験例３−２蛋白質を部分コードするＤＮＡ断片の
調製】実験例３−１で得た全ＲＮＡ１μｇに２５ｍＭ
塩化マグネシウムを４μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液（１０
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ
塩化カリウム）を２μｌ、１ｍＭｄＮＴＰミックスを
８μｌ、１単位／μｌのＲＮａｓｅインヒビターを１μ
ｌ、２．５単位／μｌの逆転写酵素を１μｌ及び２．５
μＭランダムヘキサマーを１μｌ加え、滅菌蒸留水で２
０μｌとした。混合物を０．５ｍｌ容反応管にとり、常
法にしたがって２５℃で１０分間、４２℃で３０分間、
９９℃で５分間、５℃で５分間インキュベートして逆転
写酵素反応させ、第一ストランドｃＤＮＡを含む水溶液
を得た。

【００４５】この第一ストランドｃＤＮＡ水溶液２０μ
ｌに２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、１０×ＰＣＲ
緩衝液を８μｌ、２．５単位／μｌアンプリタックＤＮ
Ａポリメラーゼを０．５μｌ、さらに、センスプライマ
ー又はアンチセンスプライマーとしてプライマー１及び
プライマー２をそれぞれ１ｐｍｏｌずつ加え、滅菌蒸留
水で１００μｌとした。そして、常法により、混合物を
９４℃で１分間、４５℃で２分間、７２℃で３分間の順
序でインキュベートするサイクルを４０回繰返して反応
させ、第一ストランドｃＤＮＡを鋳型に当該蛋白質を部
分コードするＤＮＡ断片を増幅した。なお、プライマー
１及びプライマー２は、配列表の配列番号１及び２にお
けるＰｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ
−Ｉｌｅ又はＰｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ
−Ａｓｐ−Ｉｌｅで表わされるアミノ酸配列に基づき化
学合成したオリゴヌクレオチドであり、それぞれ、５´
−ＡＴＲＴＣＲＴＣＤＡＴＲＴＴＹＴＣＮＧＧ−３´又
は５´−ＴＴＹＧＡＲＧＡＹＡＴＧＡＣＮＧＡＹＡＴ−
３´で表わされる塩基配列を有していた。

【００４６】このようにして得たＰＣＲ産物の一部をと
り、常法により２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で電気
泳動して分画し、ナイロン膜上に移し取り、０．４Ｎ水
酸化ナトリウムで固定し、２×ＳＳＣで洗浄し、風乾
後、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／
ｖ）ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを
含むプレハイブリダイゼーション混液に浸漬し、６５℃
で３時間インキュベートした。別途、プローブ１とし
て、配列表の配列番号１におけるＰｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏで表わされるアミノ酸配列
に基づき５´−ＴＴＹＧＡＲＧＡＲＡＴＧＧＡＹＣＣ−
３´で表わされる塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学
合成し、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼにより同位体標識した。このプローブ１を１ｐｍ
ｏｌとり、これと５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、
０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サ
ケ精子ＤＮＡを含む混液にナイロン膜を浸漬し、４５℃
で２４時間インキュベートしてハイブリダイズさせた。
ナイロン膜を６×ＳＳＣで洗浄し、常法によりオートラ
ジオグラフィーしたところ、目的とするＤＮＡ断片がＰ
ＣＲ産物に含まれていた。

【００４７】次に、残りのＰＣＲ産物に宝酒造製プラス
ミドベクター『ｐＴ７ブルーＴ』を５０ｎｇと適量のＴ
４ＤＮＡリガーゼを加え、さらに、１００ｍＭＡＴ
Ｐを最終濃度１ｍＭまで加えた後、１６℃で１８時間イ
ンキュベートしてプラスミドベクターにＤＮＡ断片を挿
入し、得られた組換えＤＮＡをコンピテントセル法によ
りファルマシア製大腸菌『ＮｏＶａＢｌｕｅ』株に導
入して形質転換体とした。得られた形質転換体を１０ｇ
／ｌバクトトリプトン、２．５ｇ／ｌ塩化ナトリウム、
１５ｇ／ｌバクトアガー、１００ｍｇ／ｌアンピシリ
ン、４０ｍｇ／ｌＸ−Ｇａｌ及び２３．８ｍｇ／ｌイソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、
「ＩＰＴＧ」と略記する。）を含むプレート培地に植菌
し、３７℃で２４時間培養してコロニーを形成させた。
常法にしたがって、プレート培地にナイロン膜を載置
し、約３０秒間静置してコロニーを移取った後、ナイロ
ン膜を剥離し、０．５Ｎ水酸化ナトリウム及び１．５Ｍ
塩化ナトリウムを含む混液に７分間浸漬して溶菌した。
その後、ナイロン膜を１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む
０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）に３分間浸
漬し、２×ＳＳＣで洗浄し、０．４Ｎ水酸化ナトリウム
に２０分間浸漬して固定し、５×ＳＳＣでさらに洗浄
し、風乾後、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５
％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子
ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション混液に浸漬
し、６５℃で３時間インキュベートした。その後、常法
にしたがってナイロン膜にプローブ１をハイブリダイズ
させ、６×ＳＳＣで洗浄後、前記と同様にオートラジオ
グラフィーし、プローブ１と顕著な会合を示した形質転
換体をプレート培地から採取した。

【００４８】この形質転換体をアンピシリン１００μｇ
／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に植菌し、
３７℃で１８時間培養後、培養物から菌体を採取し、通
常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを採取し
た。ジデオキシ法により調べたところ、この組換えＤＮ
Ａは配列表の配列番号４に示す塩基配列における第８５
乃至２８１番目に相当する塩基配列のＤＮＡ断片を含ん
でいた。

【００４９】

【実験例３−３ｍＲＮＡの調製】実験例３−１で得た
全ＲＮＡを含む水溶液を０．０５ｍｌとり、これに１ｍ
ＭＥＤＴＡと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を０．５ｍｌ加え、
滅菌蒸留水で全量を１ｍｌとした。混合物に日本ロシュ
製オリゴｄ（Ｔ）_３０ラテックス『オリゴテックス−ｄ
Ｔ３０スーパー』を１ｍｌ加え、６５℃で５分間加熱し
て変性させた後、直ちに氷浴中で３分間冷却した。その
後、５Ｍ塩化ナトリウムを０．２ｍｌ加え、３７℃で１
０分間インキュベートし、２５℃、１０，０００ｒｐｍ
で１０分間遠心分離し、上清を除いて得られたペレット
状の沈澱に滅菌蒸留水０．５ｍｌを加えて懸濁させ、６
５℃で５分間インキュベートしてオリゴテックスからｍ
ＲＮＡを溶出させた。回収したｍＲＮＡは約５μｇであ
った。

【００５０】

【実験例３−４ｃＤＮＡライブラリーの作製】アマシ
ャム製ｃＤＮＡクローニングキット『ｃＤＮＡ合成シス
テム・プラス』を使用し、実験例３−３で調製したｍＲ
ＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製した。すなわち、
１．５ｍｌ容反応管に第一ストランドｃＤＮＡ合成用溶
液４μｌ、ピロリン酸ナトリウム溶液１μｌ、ヒト胎盤
リボヌクレアーゼインヒビター溶液１μｌ、デオキシヌ
クレオチド三燐酸混合液２μｌ及びオリゴｄＴプライマ
ー溶液１μｌをこの順序で加え、さらに、実験例３−３
で得たｍＲＮＡを２μｇ加えた後、滅菌蒸留水で１９μ
ｌとした。混合物に逆転写酵素２０単位を含む溶液１μ
ｌを加え、４２℃で４０分間インキュベートして第一ス
トランドｃＤＮＡを含む反応物を得た。

【００５１】反応物に第二ストランドｃＤＮＡ合成用溶
液を３７．５μｌ、大腸菌由来のリボヌクレアーゼＨを
０．８単位、ＤＮＡポリメラーゼＩを２３単位この順序
で加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした後、１２℃で６
０分間、２２℃で６０分間インキュベートし、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼを２単位加え、３７℃でさらに１０分
間インキュベートして第二ストランドｃＤＮＡを含む反
応物を得た。反応物に０．２５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）を４μｌ加えて反応を停止させた後、常法によりフ
ェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱させて
ｃＤＮＡを採取した。

【００５２】このようにして得たｃＤＮＡにＬ／Ｋ緩衝
液を２μｌ、ＥｃｏＲＩアダプターを２５０ピコモ
ル、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを２．５単位この順序で加
え、滅菌蒸留水で２０μｌとした後、１５℃で１６時間
インキュベートしてｃＤＮＡ両端にＥｃｏＲＩアダプ
ターを連結した。反応物に０．２５ＭＥＤＴＡを２μ
ｌ加えて酵素を失活させ、常法により分子篩クロマトグ
ラフィーにより未反応のＥｃｏＲＩアダプターを除去
し、Ｌ／Ｋ緩衝液を４０μｌとＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼを８０単位加え、滅菌蒸留水で全量４００μｌと
し、３７℃で３０分間インキュベートしてＥｃｏＲＩ
切断部位をメチル化した後、反応物をフェノール／クロ
ロホルム抽出及びエタノール沈澱してＤＮＡを採取し
た。ＤＮＡに適量のλｇｔ１０アームを含むＬ／Ｋ緩衝
液を１．５μｌとＴ４ＤＮＡリガーゼを２．５単位加
え、滅菌蒸留水で全量１５μｌとし、１５℃で１６時間
インキュベートしてライゲートした後、通常の生体外パ
ッケージングを適用して組換えλＤＮＡを含むファージ
を得た。

【００５３】

【実験例３−５組換えＤＮＡのクローニング】アマシ
ャム製大腸菌ＮＭ５１４株に実験例３−４で調製したフ
ァージを常法により感染させた後、１０ｇ／ｌバクトト
リプトン、５ｇ／ｌバクトイーストエキストラクト、１
０ｇ／ｌ塩化ナトリウム及び１５ｇ／ｌバクトアガーを
含む寒天培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で６時間
培養してプラークを形成させた。寒天培地にナイロン膜
を載置し、約３０秒間静置してプラークをナイロン膜上
に移取った後、ナイロン膜を剥離し、先ず、０．５Ｍ水
酸化ナトリウムと１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む水溶液
に２分間、次に、１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に５分間浸漬し
た。ナイロン膜を５×ＳＳＣで濯ぎ、風乾後、５×ＳＳ
ＰＥ、５×デンハルト溶液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ
及び変性サケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍｌ含む混液に
浸漬し、６５℃で３時間インキュベートした。その後、
ナイロン膜をアマシャム製ＤＮＡ標識キット『レディ・
プライムＤＮＡ標識システム』を用いて^３２Ｐ標識した
実験例３−２で得たプローブ２としてのＤＮＡ断片の適
量と５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、０．５％（ｗ
／ｖ）ＳＤＳ及び変性サケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍ
ｌ含む混液中、６０℃で２０時間インキュベートしてハ
イブリダイズさせ、以後、前記と同様にオートラジオグ
ラフィーして、プローブ２に顕著な会合を示したファー
ジＤＮＡクローンを採取した。

【００５４】常法にしたがってこのクローンを大腸菌中
で増幅し、菌体から組換えＤＮＡを抽出した。組換えＤ
ＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断する一方、プラスミ
ドベクターｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ３７２５４）を同じ制
限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断片とプラスミド断片
を常法によりＤＮＡリガーゼで連結して組換えＤＮＡと
した。そして、この組換えＤＮＡを通常のコンピテント
セル法により大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３２
３）に導入し、形質転換体を得た。

【００５５】

【実験例３−６塩基配列とアミノ酸配列の決定】実験
例３−５で調製した形質転換体をＬ−ブロス培地（ｐＨ
７．２）に植菌し、３７℃で１８時間振盪培養した。培
養物から形質転換体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ
法により処理してこの発明のＤＮＡを含む組換えＤＮＡ
を得た。蛍光光度計を使用する自動シーケンサにより分
析したところ、この組換えＤＮＡは配列表における配列
番号５に示す５´末端からの塩基配列を含んでおり、そ
の塩基配列を解読したところ、同じく配列番号５に示す
Ｎ末端からのアミノ酸配列をコードしていることが示唆
された。このアミノ酸配列においては、その第７９乃至
１０３番目又は第２６乃至４３番目に配列表における配
列番号１及び２に示す部分アミノ酸配列が含まれてお
り、このことは、この発明の蛋白質が配列表における配
列番号３に示すＮ末端からのアミノ酸配列を有すること
あり、マウス肝臓においては、当該蛋白質が配列表にお
ける配列番号４に示す５´末端からの塩基配列を有する
ＤＮＡによりコードされていることを示している。

【００５６】以上説明したように、免疫担当細胞におい
てＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質は、本発明者の長
年に亙る研究の一成果として見出されたものであり、従
来公知の蛋白質には見られない独特の理化学的性質を具
備している。この発明は、組換えＤＮＡ技術を応用する
ことにより、この蛋白質を創製しようというものであ
る。以下、実施例等を参照しながら、この発明の蛋白質
とその製造方法等につき、具体的に説明する。

【００５７】この発明でいう蛋白質とは、特定の理化学
的性質を具備する、天然由来の蛋白質及び組換えＤＮＡ
技術により創製された蛋白質全般を意味する。この発明
の蛋白質は、通常、一部又は全部が解明されたアミノ酸
配列を有しており、その一例として、例えば、配列表に
おける配列番号３に示すＮ末端からのアミノ酸配列かそ
れに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列番号３の
アミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体
は、所期の生物作用を実質的に変えることなく、配列番
号３のアミノ酸配列におけるアミノ酸の１個又は２個以
上を他のアミノ酸で置換することにより得ることができ
る。なお、同じＤＮＡであっても、それを導入する宿主
や、そのＤＮＡを含む形質転換体の培養に使用する栄養
培地の成分・組成、培養温度・ｐＨなどに依っては、宿
主内酵素によるＤＮＡ発現後の修飾などにより、所期の
生物作用を保持しているものの、配列番号３のアミノ酸
配列におけるＮ末端付近のアミノ酸が１個又は２個以上
欠失したり、Ｎ末端に１個又は２個以上のアミノ酸が新
たに付加した変異体の産生することがある。斯かる変異
体も、それが免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を
誘導するかぎり、当然、この発明の蛋白質に包含され
る。

【００５８】この発明の蛋白質は、それをコードするＤ
ＮＡを含む形質転換体を栄養培地で培養し、産生した蛋
白質を培養物から採取することにより製造することがで
きる。この発明で使用する形質転換体は、例えば、配列
表における配列番号４に示す５´末端からの塩基配列若
しくはそれに相同的な塩基配列又はそれらに相補的な塩
基配列のＤＮＡを適宜宿主に導入することにより得るこ
とができる。なお、上記塩基配列は、遺伝子の縮重を利
用して、コードするアミノ酸配列を変えることなく、塩
基の１個又は２個以上を他の塩基で置き換えてもよい。
また、ＤＮＡが宿主中で実際に当該蛋白質の産生を発現
するために、当該蛋白質又はその相同変異体をコードす
る塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基
で適宜置換し得ることは云うまでもない。

【００５９】この発明で使用するＤＮＡは、それが前述
のような配列を有するかぎり、それが天然に由来するも
のか人為的に合成されたものであるかは問わない。天然
の給源としては、例えば、マウスの肝臓が挙げられ、そ
の細胞からはこの発明のＤＮＡを含む遺伝子が得られ
る。すなわち、例えば、コリネバクテリウム・パルバ
ム、ＢＣＧ、マイトジェン、リポ多糖などの細網内皮系
刺激物質で刺激しておいたマウスから肝臓を摘出し、破
砕後、全ＲＮＡを単離する。この全ＲＮＡをオリゴ（ｄ
Ｔ）セルロース、オリゴ（ｄＴ）ラテックスなどで処理
してポリ（Ａ）⁺ＲＮＡとした後、蔗糖濃度勾配などに
より分画してｍＲＮＡを単離する。このｍＲＮＡを鋳型
に逆転写酵素とポリメラーゼを作用させて二重鎖ｃＤＮ
Ａとし、これを自律複製可能な適宜ベクターに挿入し、
得られた組換えＤＮＡを大腸菌などの適宜宿主に導入し
て形質転換体とする。この形質転換体を栄養培地で培養
し、培養物にコロニーハイブリダイゼーション法を適用
してこの発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含む形質転
換体を採取する。斯くして得られた形質転換体を通常一
般の方法により処理すれば、この発明のＤＮＡが得られ
る。一方、この発明のＤＮＡを人為的に合成するには、
例えば、配列表における配列番号４に示す塩基配列に基
づいて化学合成するか、配列表における配列番号３に示
すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを自律複製可能な適
宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを適宜宿
主に導入して得られる形質転換体を培養し、培養物から
菌体を分離し、その菌体から当該ＤＮＡを含むプラスミ
ドを採取すればよい。

【００６０】斯かるＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形
態で宿主に導入される。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡ
と自律複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手
できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容
易に調製することができる。斯かるベクターの例として
は、例えば、ｐＫＫ２２３−２、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＲ
Ｌ−λ、ｐＢＴｒｐ２ＤＮＡ、ｐＵＢ１１０、ＹＥｐ
１３、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、ｐＢＩ１２１
などのプラスミドベクターが挙げられ、このうち、この
発明のＤＮＡを大腸菌、枯草菌、酵母などの原核生物で
発現させるにはｐＫＫ２２３−２、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐ
ＲＬ−λ、ｐＢＴｒｐ２ＤＮＡ、ｐＵＢ１１０、ＹＥ
ｐ１３が、また、動物由来の細胞で発現させるにはＴｉ
プラスミド、Ｒｉプラスミド、ｐＢＩ１２１が好適であ
る。

【００６１】斯かるベクターにこの発明のＤＮＡを挿入
するには、斯界において通常一般の方法が採用される。
具体的には、先ず、この発明のＤＮＡを含む遺伝子と自
律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波に
より切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片
とを連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチ
ドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＩＩ型の制
限酵素、詳細には、Ｓａｕ３ＡＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、Ｘｂａ
Ｉ、ＳａｃＩ、ＰｓｔＩなどを使用すれば、ＤＮＡ
断片とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮＡ
断片とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両
者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリ
ガーゼを作用させればよい。斯くして得られた組換えＤ
ＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培
養することにより無限に複製可能である。

【００６２】この発明による組換えＤＮＡは、大腸菌、
枯草菌、放線菌、酵母を始めとする適宜の宿主に導入す
ることができる。宿主が大腸菌の場合には、宿主を組換
えＤＮＡとカルシウムイオンの存在下で培養すればよ
く、一方、宿主が枯草菌の場合には、コンピテントセル
法やプロトプラスト法を適用すればよい。形質転換体を
クローニングするには、コロニーハイブリダイゼーショ
ン法を適用するか、栄養培地で培養し、免疫担当細胞に
おいてＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質を産生するも
のを選択すればよい。

【００６３】斯くして得られる形質転換体は、栄養培地
で培養すると、菌体又は細胞内外に当該蛋白質を産生す
る。栄養培地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、
さらには、必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微
量栄養素を補足した通常一般の液体培地が使用され、個
々の炭素源としては、澱粉、澱粉加水分解物、グルコー
ス、果糖、蔗糖などの糖質が、また、窒素源としては、
例えば、アンモニア又はアンモニウム塩、尿素、硝酸
塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティー
プリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙げ
られる。形質転換体を斯かる栄養培地に植菌し、栄養培
地を温度２５乃至６５℃、ｐＨ２乃至８に保ちつつ、通
気撹拌などによる好気的条件下で約１乃至１０日間培養
すれば、当該蛋白質を含む培養物が得られる。この培養
物はＩＦＮ−γ誘導剤としてそのまま使用可能ではある
が、通常は使用に先立ち、必要に応じて、超音波や細胞
壁溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離な
どにより当該蛋白質を菌体若しくは菌体破砕物から分離
し、精製する。精製には菌体又は菌体破砕物を除去した
培養物に、例えば、濃縮、塩析、透析、分別沈澱、ゲル
濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動、
等電点電気泳動などの生理活性物質を精製するための斯
界における通常一般の方法が採用でき、必要に応じて、
これら方法を適宜組合せればよい。そして、最終使用形
態に応じて、精製した蛋白質を濃縮・凍結乾燥して液状
若しくは固状にすればよい。

【００６４】前述のとおり、この発明の蛋白質は、免疫
担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する性質を有
する。この性質により、この発明の蛋白質は、細胞培養
法によりＩＦＮ−γを製造の際の誘導剤として、さらに
は、ＩＦＮ−γに感受性を有する、例えば、エイズや尖
圭コンジロムなどのウイルス性疾患、腎臓癌、肉芽腫、
菌状息肉症、脳腫瘍などの悪性腫瘍、関節リウマチやア
レルギー症などの免疫疾患に対する治療剤・予防剤とし
て有用である。

【００６５】この発明の蛋白質は、通常、免疫担当細胞
を培養してＩＦＮ−γを製造するための培養培地に共存
させるか、ＩＦＮ−γ感受性疾患の治療・予防のために
哺乳類の体内に直接投与される。すなわち、前者の用途
においては、哺乳類の末梢血から分離される白血球や、
例えば、ＨＢＬ−３８細胞、ＭＯ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細
胞、ＥＬ−４細胞、Ｌ１２−Ｒ４細胞などの培養株化さ
れた免疫担当細胞をこの発明の蛋白質を含む適宜の培養
培地に浮遊させる。必要に応じて、培養培地にマイトジ
ェンやインターロイキン２、抗ＣＤ３抗体などのＴ細胞
刺激物質を加え、培養培地を温度約３０乃至４０℃、ｐ
Ｈ約５乃至８に保ちつつ、培養培地を適宜新鮮なものと
取替えながら、通常一般の方法により約１乃至１００時
間培養する。斯くして得られる培養物を生理活性物質を
精製するための通常一般の方法、すなわち、濃縮、塩
析、透析、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォ
ーカシング、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの１種
若しくは２種以上を適宜組合せて適用することにより、
ＩＦＮ−γを採取することができる。

【００６６】一方、ＩＦＮ−γ感受性疾患の治療・予防
のためには、哺乳類の体内にこの発明によるＩＦＮ−γ
誘導剤を直接投与すればよい。具体的には、この発明の
ＩＦＮ−γ誘導剤を投与に適した適宜剤型に調製後、哺
乳類に経口投与するか、例えば、皮内、皮下、筋肉内、
静脈内又は腹腔内に注射投与する。この発明の蛋白質を
投与し得る哺乳類はヒトに限定されず、例えば、マウ
ス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、
ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サルなどの哺乳動物であっ
てもよい。この発明の蛋白質は強力なＩＦＮ−γ誘導能
を有することから、一般に少量で所期のＩＦＮ−γ産生
を誘導でき、また、毒性が極めて低いことから、多量投
与しても重篤な副作用を惹起することがない。したがっ
て、この発明の蛋白質は、使用に際して用量を厳密に管
理しなくても、所望のＩＦＮ−γ産生を迅速に誘導でき
る利点がある。

【００６７】くわえて、この発明の蛋白質はキラー細胞
による細胞障害性を増強する性質が顕著なことから、イ
ンターロイキン２や腫瘍壊死因子と適宜併用することに
より、養子免疫療法による肺癌、腎臓癌、乳癌などの固
形癌を含む悪性腫瘍の治療における治療効果や副作用の
改善に顕著な効果を発揮する。

【００６８】以下、形質転換体を用いるこの発明による
蛋白質の製造につき、実施例に基づいて具体的に説明す
る。

【００６９】

【実施例１複製可能な組換えＤＮＡと形質転換体】宝
酒造製ＰＣＲキット『ＧｅｎｅＡｍｐＲＮＡＰＣＲ
Ｋｉｔ』を使用し、実験例３−１の方法により得た全
ＲＮＡから第一ストランドｃＤＮＡを調製した。すなわ
ち、０．５ｍｌ容反応管に２５ｍＭ塩化マグネシウムを
４μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液を２μｌ、１ｍＭｄＮＴ
Ｐミックスを８μｌ、１単位／μｌのＲＮａｓｅインヒ
ビターを１μｌ、２．５単位／μｌの逆転写酵素を１μ
ｌ、２．５μＭランダムヘキサマーを１μｌ及び実験例
３−１の方法により得た全ＲＮＡ１μｇをとり、滅菌
蒸留水で２０μｌとした。そして、混合物を２５℃で１
０分間、４２℃で３０分間、９９℃で５分間、５℃で５
分間この順序でインキュベートして第一ストランドｃＤ
ＮＡ含む反応物を得た。

【００７０】この反応物を２０μｌとり、これに２５ｍ
Ｍ塩化マグネシウムを４μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液を８
μｌ、２．５単位／μｌアンプリタックＤＮＡポリメラ
ーゼを０．５μｌ、配列表の配列番号３におけるＮ末端
又はＣ末端付近のアミノ酸配列に基づき化学合成した５
´−ＣＧＡＧＧＧＡＴＣＧＡＡＣＴＴＴＧＧＣＣＧＡＣ
ＴＴＣ−３´又は５´−ＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡ
ＣＴＴＴＧＡＴＧＴＡＡＧ−３´で表わされる塩基配列
のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの適量
を加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした。次に、常法に
より、この混合物を９４℃で１分間、５５℃で２分間、
７２℃で３分間この順序でインキュベートするサイクル
を４０回繰返し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素Ｂａｍ
ＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断してＢａｍＨＩ−Ｅｃ
ｏＲＩＤＮＡ断片を得た。

【００７１】このＤＮＡ断片を適量の滅菌蒸留水中に１
００ｎｇとり、これに、予め制限酵素ＢａｍＨＩ及び
ＥｃｏＲＩで切断しておいたファルマシア製プラスミ
ドベクター『ｐＧＥＸ−２Ｔ』を１０ｎｇ、適量のＴ４
ＤＮＡリガーゼ及び１０ｍＭＡＴＰを最終濃度１ｍ
Ｍになるように加えた後、１６℃で１８時間インキュベ
ートした。得られた組換えＤＮＡをコンピテントセル法
により大腸菌ＤＨ５（ＡＴＣＣ５３８６８）株に導入し
て形質転換体とし、これをアンピシリン５０μｇ／ｍｌ
を含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に植菌し、３７℃
で１８時間培養した後、通常のアルカリ−ＳＤＳ法によ
り組換えＤＮＡを抽出した。

【００７２】この組換えＤＮＡを『ｐＭＧＴＧ−１』と
命名するとともに、その構造をジデオキシ法により調べ
たところ、図２に見られるように、このｐＭＧＴＧ−１
においては、配列表における配列番号４に示す塩基配列
のＭＧＴＧｃＤＮＡがＴａｃプロモータ及びグルタチ
オンＳトランスフェラーゼ遺伝子の下流に連結されてい
た。

【００７３】

【実施例２形質転換体による蛋白質の製造】実施例１
の方法で得た形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ
を含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に植菌し、振盪し
ながら３７℃で１８時間種培養した。種培養物を１％
（ｖ／ｖ）の割合で新鮮な１８ｌの同一培地に植菌し、
３７℃で通気撹拌培養した。そして、波長６５０ｎｍに
おける培養物の吸光度が約０．６に達した時点でＩＰＴ
Ｇを最終濃度１ｍＭまで加え、さらに５時間培養した。
その後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、１５
０ｍＭ塩化ナトリウム、１６ｍＭ燐酸水素二ナトリウム
及び４ｍＭ燐酸二水素ナトリウムを含む混液（ｐＨ７．
３）に浮遊させ、常法により超音波処理後、菌体破砕物
を遠心分離し、上清を採取した。

【００７４】この上清を予め１５０ｍＭ塩化ナトリウム
を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平
衡化させておいたファルマシア製『グルタチオン・セフ
ァロース４Ｂ』カラムに負荷し、新鮮な同一緩衝液で洗
浄後、カラムに５ｍＭ還元型グルタチオンを含む５０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を通液して蛋白質
を溶出させた。次いで、蛋白質を含む画分に採取濃度が
２．５ｍＭになるように塩化カルシウムを加えるととも
に、トロンビンを１，０００単位加え、２５℃で１８時
間インキュベートし、反応物を予め１５０ｍＭ塩化ナト
リウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で平衡化させておいたグルタチオン・セファロース
４Ｂカラムに通液して非吸着画分を採取した。その後、
この画分を濃縮し、凍結乾燥したところ、比活性約５×
１０⁵単位／ｍｇ蛋白質の当該蛋白質を含む固状物が培
養物１ｌ当たり約３ｍｇの収量で得られた。

【００７５】実験例２と同様にしてこの精製蛋白質の理
化学的性質を調べたところ、この精製蛋白質は、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又はゲル濾過法に
より測定すると分子量１９，０００±５，０００ダルト
ンを、また、クロマトフォーカシング法により測定する
と４．８±１．０に等電点を示した。さらに、実験例２
−４の方法により試験したところ、精製蛋白質は、コン
カナバリンＡの非存在下及び存在下で免疫担当細胞にお
けるＩＦＮ−γ産生をよく誘導し、また、キラー細胞の
細胞障害性も顕著に増強した。これは、組換えＤＮＡ技
術によっても、当該蛋白質を製造し得ることを裏付ける
ものである。

【００７６】

【発明の効果】この発明は、免疫担当細胞においてＩＦ
Ｎ−γの産生を誘導する新規な蛋白質の発見に基づくも
のである。この発明の蛋白質は、通常、アミノ酸配列の
一部又は全部が解明された物質であり、免疫担当細胞に
おいて安定したＩＦＮ−γ誘導能を発揮する。これによ
り、この発明の蛋白質は、細胞培養法によりＩＦＮ−γ
を製造するためのＩＦＮ−γ誘導剤として、さらには、
ＩＦＮ−γに感受性を有するウイルス性疾患、悪性腫
瘍、免疫疾患一般に対する治療剤・予防剤として多種多
様の用途を有することとなる。

【００７７】この発明の蛋白質は強力なＩＦＮ−γ誘導
能を有することから、一般に少量で所期のＩＦＮ−γ産
生を誘導でき、また、毒性が極めて低いことから、多量
投与しても重篤な副作用を惹起することがない。したが
って、この発明の蛋白質は、使用に際して用量を厳密に
管理しなくても、所望のＩＦＮ−γ産生を迅速に誘導で
きる利点がある。くわえて、この発明の蛋白質はキラー
細胞による細胞障害性を増強する性質が顕著なことか
ら、インターロイキン２や腫瘍壊死因子と適宜併用する
ことにより、養子免疫療法による肺癌、腎臓癌、乳癌な
どの固形癌を含む悪性腫瘍の治療における治療効果や副
作用の改善に顕著な効果を発揮する。

【００７８】斯くも有用なるこの発明の蛋白質は、これ
をコードするこの発明のＤＮＡを利用することにより、
所望量を容易に製造することができる。

【００７９】この発明は、斯くも顕著な作用効果を発揮
するものであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義の
ある発明であると言える。

【００８０】

【配列表】配列番号：1 配列の長さ：25 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメントの種類：中間部フラグメント配列 Ile Ile Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln 1 5 10 15 Ser Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys 20 25

【００８１】配列番号：2 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメントの種類：中間部フラグメント配列 Gln Pro Val Phe Glu Asp Met Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro 1 5 10 15 Gln

【００８２】配列番号：3 配列の長さ：157 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn Asp 1 5 10 15 Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met Thr Asp 20 25 30 Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile Tyr Met Tyr 35 40 45 50 Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser Val Lys Asp Ser 55 60 65 Lys Xaa Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile Ser Phe Glu Glu Met 70 75 80 85 Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser Asp Leu Ile Phe Phe Gln 90 95 100 Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu 105 110 115 Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu 120 125 130 135 Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn 140 145 150 Leu His Gln Ser 155

【００８３】配列番号：4 配列の長さ：471 配列の型：核酸配列 AACTTTGGCC GACTTCACTG TACAACCGCA GTAATACGGA ATATAAATGA CCAAGTTCTC 60 TTCGTTGACA AAAGACAGCC TGTGTTCGAG GATATGACTG ATATTGATCA AAGTGCCAGT 120 GAACCCCAGA CCAGACTGAT AATATACATG TACAAAGACA GTGAAGTAAG AGGACTGGCT 180 GTGACCCTCT CTGTGAAGGA TAGTAAAAYG TCTACCCTCT CCTGTAAGAA CAAGATCATT 240 TCCTTTGAGG AAATGGATCC ACCTGAAAAT ATTGATGATA TACAAAGTGA TCTCATATTC 300 TTTCAGAAAC GTGTTCCAGG ACACAACAAG ATGGAGTTTG AATCTTCACT GTATGAAGGA 360 CACTTTCTTG CTTGCCAAAA GGAAGATGAT GCTTTCAAAC TCATTCTGAA AAAAAAGGAT 420 GAAAATGGGG ATAAATCTGT AATGTTCACT CTCACTAACT TACATCAAAG T 471

【００８４】配列番号：5 配列の長さ：471 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列の特徴起源生物名：マウス配列の特徴配列を表わす記号：1−471 mat peptide 配列 AAC TTT GGC CGA CTT CAC TGT ACA ACC GCA GTA ATA CGG AAT ATA AAT 48 Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn 1 5 10 15 GAC CAA GTT CTC TTC GTT GAC AAA AGA CAG CCT GTG TTC GAG GAT ATG 96 Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met 20 25 30 ACT GAT ATT GAT CAA AGT GCC AGT GAA CCC CAG ACC AGA CTG ATA ATA 144 Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile 35 40 45 TAC ATG TAC AAA GAC AGT GAA GTA AGA GGA CTG GCT GTG ACC CTC TCT 192 Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser 50 55 60 GTG AAG GAT AGT AAA AYG TCT ACC CTC TCC TGT AAG AAC AAG ATC ATT 240 Val Lys Asp Ser Lys Xaa Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile 65 70 75 80 TCC TTT GAG GAA ATG GAT CCA CCT GAA AAT ATT GAT GAT ATA CAA AGT 288 Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser 85 90 95 GAT CTC ATA TTC TTT CAG AAA CGT GTT CCA GGA CAC AAC AAG ATG GAG 336 Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu 100 105 110 TTT GAA TCT TCA CTG TAT GAA GGA CAC TTT CTT GCT TGC CAA AAG GAA 384 Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu 115 120 125 GAT GAT GCT TTC AAA CTC ATT CTG AAA AAA AAG GAT GAA AAT GGG GAT 432 Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp 130 135 140 AAA TCT GTA ATG TTC ACT CTC ACT AAC TTA CAT CAA AGT 471 Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser 145 150 155

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明の蛋白質をトリプシン消化して得られ
るペプチド断片の高速液体クロマトグラフィーにおける
溶出パターンを示す図である。

【図２】この発明による組換えＤＮＡであるｐＭＧＴＧ
−１の構造を示す図である。

【符号の説明】ＭＧＴＧｃＤＮＡこの発明の蛋白質をコードす
るｃＤＮＡＰｔａｃｔａｃプロモータＧＳＴグルタチオンＳトランスフェ
ラーゼ遺伝子ＡｍｐＲアンピシリン耐性遺伝子ｐＢＲ３２２ｏｒｉ大腸菌における複製開始点

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/54 C12N 15/24 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＳｗｉｓｓｐｏｒｔ／ＰＩＲ／Ｇｅｎｅｓｅｑ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の理化学的性質を有する蛋白質。（１）分子量ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又はゲル濾
過法で測定すると、分子量１９，０００±５，０００ダ
ルトンを示す。（２）等電点クロマトフォーカッシング法で測定すると、４．８±
１．０に等電点を示す。（３）部分アミノ酸配列配列表における配列番号１及び２に示す部分アミノ酸配
列を有する。（４）生物作用免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘
導する。
【請求項２】配列表における配列番号３（ただし、
「Ｘａａ」はメチオニン又はトレオニンを意味するもの
とする。）に示すアミノ酸配列又は、そのアミノ酸配列
において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若
しくは付加したアミノ酸配列を有し、免疫担当細胞にお
いてインターフェロン−γの産生を誘導する蛋白質。
【請求項３】配列表における配列番号１又は２に示す
アミノ酸配列からなるペプチド断片。
【請求項４】請求項２又は３のいずれかに記載の蛋白
質又はペプチド断片をコードするＤＮＡ。
【請求項５】配列表における配列番号４に示す塩基配
列、又は、その塩基配列において、１若しくは複数個の
塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列、又は、そ
れらに相補的な塩基配列、又は、それらの塩基配列にお
ける塩基の１個又は２個以上を、遺伝子の縮重に基づ
き、それがコードするアミノ酸配列を変えることなく他
の塩基で置換した塩基配列を含有する請求項４に記載の
ＤＮＡ。
【請求項６】マウスの肝臓に由来する請求項４又は５
に記載のＤＮＡ。
【請求項７】複製可能な組換えＤＮＡとして自律複製
可能なベクターに挿入された請求項４、５又は６に記載
のＤＮＡ。
【請求項８】適宜宿主に導入された請求項４、５、６
又は７に記載のＤＮＡ。
【請求項９】宿主が大腸菌である請求項８に記載のＤ
ＮＡ。
【請求項１０】請求項４乃至７のいずれかに記載のＤ
ＮＡを適宜の宿主に導入してなる形質転換体を栄養培地
で培養し、産生した蛋白質を培養物から採取してなる蛋
白質の製造方法。
【請求項１１】ＤＮＡが配列表における配列番号４に
示す塩基配列、又は、その塩基配列において、１若しく
は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配
列、又は、それらに相補的な塩基配列、又は、それらの
塩基配列における塩基の１個又は２個以上を、遺伝子の
縮重に基づき、それがコードするアミノ酸配列を変える
ことなく他の塩基で置換した塩基配列と、自律複製可能
なベクターを含んでなる組換えＤＮＡとしての形態にあ
る請求項１０に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１２】ＤＮＡがマウスの肝臓に由来する請求
項１０又は１１に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１３】宿主が大腸菌である請求項１０、１１
又は１２に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１４】産生した蛋白質を濃縮、塩析、透析、
分別沈澱、ゲル濾過クロマトグフィー、イオン交換クロ
マトグフィー、疎水性クロマトグフィー、アフィニティ
ークロマトグフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電
気泳動及び等電点電気泳動から選ばれる１種若しくは２
種以上の精製方法により採取する請求項１０、１１、１
２又は１３に記載の蛋白質の製造方法。