JPH0827189A - インターフェロン−γの産生を誘導する蛋白質 - Google Patents
インターフェロン−γの産生を誘導する蛋白質Info
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- JPH0827189A JPH0827189A JP6184162A JP18416294A JPH0827189A JP H0827189 A JPH0827189 A JP H0827189A JP 6184162 A JP6184162 A JP 6184162A JP 18416294 A JP18416294 A JP 18416294A JP H0827189 A JPH0827189 A JP H0827189A
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Abstract
導する蛋白質、その蛋白質をコードするDNA、そのD
NAを含む組換えDNA及び形質転換体並びにその形質
転換体を用いる蛋白質の製造方法を提供する。 【構成】 特定の理化学的性質を有する蛋白質と、その
蛋白質をコードするDNAと、そのDNAと自律複製可
能なベクターを含んでなる複製可能な組換えDNAと、
その組換えDNAを適宜宿主に導入してなる形質転換体
と、その形質転換体を培養培地で培養し、産生した蛋白
質を培養物から採取してなる蛋白質の製造方法を要旨と
する。
Description
インターフェロン−γ(以下、「IFN−γ」と略記す
る。)の産生を誘導する新規な蛋白質に関するものであ
る。
作用、免疫調節作用を有する蛋白質として知られ、抗原
やマイトジェンによる刺激を受けた免疫担当細胞が産生
すると云われている。これら生物作用ゆえに、IFN−
γはその発見当初より抗腫瘍剤としての実用化が鶴首さ
れ、現在では脳腫瘍を始めとする悪性腫瘍一般の治療剤
として精力的に臨床試験が進められている。現在入手し
得るIFN−γは免疫担当細胞が産生する天然型IFN
−γと、免疫担当細胞から採取したIFN−γをコード
するDNAを大腸菌に導入してなる形質転換体が産生す
る組換え型IFN−γに大別され、上記臨床試験におい
ては、これらのうちのいずれかが「外来IFN−γ」と
して投与されている。
養株化した免疫担当細胞をIFN−γ誘導剤を含む培養
培地で培養し、その培養物を精製することにより製造さ
れる。この方法では、IFN−γ誘導剤の種類がIFN
−γの産生量や精製のし易さ、さらには、製品の安全性
等に多大の影響を及ぼすと云われており、通常、コンカ
ナバリンA、レンズ豆レクチン、アメリカヤマゴボウレ
クチン、エンドトキシン、リポ多糖などのマイトジェン
が頻用される。しかしながら、これら物質は、いずれも
分子に多様性があり、給源や精製方法に依って品質が変
動し易く、誘導能の一定したIFN−γ誘導剤を所望量
入手し難いという問題がある。くわえて、上記物質の多
くは生体に投与すると顕著な副作用を示したり、物質に
依っては毒性を示すものすらあり、生体に直接投与して
IFN−γの産生を誘導するのが極めて困難であった。
発明の目的は、免疫担当細胞においてIFN−γの産生
を誘導する新規な蛋白質を提供することにある。
ードするDNAを提供することにある。
Aと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組
換えDNAを提供することにある。
えDNAを適宜宿主に導入してなる形質転換体を提供す
ることにある。
A技術を応用した当該蛋白質の製造方法を提供すること
にある。
課題を、下記の理化学的性質を有する蛋白質により解決
するものである。 (1) 分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又はゲル濾
過法で測定すると、分子量19,000±5,000ダ
ルトンを示す。 (2) 等電点 クロマトフォーカシング法で測定すると、4.8±1.
0に等電点を示す。 (3) 部分アミノ酸配列 配列表における配列番号1及び2に示す部分アミノ酸配
列を有する。 (4) 生物作用 免疫担当細胞においてIFN−γの産生を誘導する。
白質をコードするDNAにより解決するものである。
NAと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な
組換えDNAにより解決するものである。
NAと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な
組換えDNAを適宜宿主に導入してなる形質転換体によ
り解決するものである。
質を産生し得る形質転換体を栄養培地で培養し、産生し
た蛋白質を培養物から採取してなる蛋白質の製造方法に
より解決するものである。
知の蛋白質には見られない独特の理化学的性質を具備し
ており、免疫担当細胞に作用させると、IFN−γの産
生を誘導する。
ベクターに挿入して組換えDNAとし、この組換えDN
Aを、本来、当該蛋白質を産生しないけれども、容易に
増殖させることのできる宿主に導入して形質転換体とす
ることにより、当該蛋白質の産生を発現する。
来、当該蛋白質を産生しないけれども、容易に増殖させ
ることのできる宿主に導入して形質転換体とすることに
より、当該蛋白質の産生を発現する。
該蛋白質を産生する。
したがって培養すれば、所望量の蛋白質が比較的容易に
得られる。
を説明するに、この発明は、免疫担当細胞においてIF
N−γの産生を誘導する新規な蛋白質の発見に基づくも
のである。本発明者が、哺乳類由来の細胞が産生するサ
イトカイン類につき研究していたところ、マウスの肝臓
中にIFN−γの産生を誘導する従来未知の全く新規な
物質が存在することを見出した。カラムクロマトグラフ
ィーを中心とする種々の精製方法を組合せてこの物質を
単離し、その性質・性状を調べたところ、その本質は蛋
白質であり、次のような理化学的性質を有するものであ
ることが判明した。 (1) 分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又はゲル濾
過法で測定すると、分子量19,000±5,000ダ
ルトンを示す。 (2) 等電点 クロマトフォーカシング法で測定すると、4.8±1.
0に等電点を示す。 (3) 部分アミノ酸配列 配列表における配列番号1及び2に示す部分アミノ酸配
列を有する。 (4) 生物作用 免疫担当細胞においてIFN−γの産生を誘導する。
った一連の実験について説明する。
ウス600匹の腹腔内にコリネバクテリウム・パルバム
(ATCC11827)を60℃で1時間加熱して調製
した死菌体を1mg/匹注射投与し、通常一般の方法で
7日間飼育後、静脈内に大腸菌由来の精製リポ多糖を1
μg/匹注射投与した。1乃至2時間後、頸椎を脱臼さ
せてマウスを屠殺し、心臓採血後、肝臓を摘出し、8倍
容の50mM燐酸緩衝液(pH7.3)中、ホモゲナイ
ザーにより破砕して抽出した。抽出物を約8,000r
pmで20分間遠心分離し、得られた上清約9lに飽和
硫酸アンモニウムを含む50mM燐酸緩衝液(pH7.
3)を硫酸アンモニウムが45%飽和になるように加
え、4℃で18時間静置後、約8,000rpmで30
分間遠心分離して当該蛋白質を含む上清約19lを得
た。
む50mM燐酸緩衝液(pH7.3)で平衡化させてお
いたファルマシア製『フェニルセファロース』約4.6
lのカラムに負荷し、カラムを新鮮な同一緩衝液で洗浄
後、1Mから0.2Mに下降する硫酸アンモニウムの濃
度勾配下、50mM燐酸緩衝液(pH7.3)をSV
0.57で通液した。硫酸アンモニウム濃度が0.8M
付近のときに溶出した当該蛋白質を含む画分約4.8l
を採取し、膜濃縮し、20mM燐酸緩衝液(pH6.
5)に対して4℃で18時間透析後、予め20mM燐酸
緩衝液(pH6.5)で平衡化させておいたファルマシ
ア製『DEAE−セファロース』約250mlのカラム
に負荷した。カラムを新鮮な同一緩衝液で洗浄後、0M
から0.2Mに上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、
カラムに20mM燐酸緩衝液(pH6.5)をSV1.
2で通液したところ、当該蛋白質が0.13M付近の塩
化ナトリウム濃度で溶出した。
取し、濃縮し、25mMビス−トリス緩衝液(pH7.
1)に対して4℃で18時間透析後、予め新鮮な同一の
緩衝液で平衡化させておいたファルマシア製『Mono
−P』約24mlのカラムに負荷し、pH7からpH4
に下降するpH勾配下、カラムに10%(v/v)ポリ
バッファー74(pH4.0)を通液したところ、pH
が約4.8のときに当該蛋白質が溶出した。当該蛋白質
を含む溶出液約23mlを採取し、濃縮し、予め7mM
燐酸水素二ナトリウム、3mM燐酸二水素ナトリウム及
び139mM塩化ナトリウムからなる混液(pH7.
2)で平衡化させておいたファルマシア製『スーパーデ
ックス 75』のカラムに負荷し、新鮮な同一混液を通
液してゲル濾過クロマトグラフィーしたところ、分子量
19,000ダルトン付近に当該蛋白質が溶出した。当
該蛋白質を含む画分を採取し、濃縮して下記の実験例2
に供した。収量は、マウス1匹当たり約0.6μgであ
った。
質をユー・ケー・レムリが『ネーチャー』、第227
巻、第680〜685頁(1970年)に報告している
方法に準じ、還元剤の非存在下でSDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動したところ、分子量19,000±
5,000ダルトンに相当する位置にIFN−γ誘導能
ある主たるバンドが観察された。なお、このときの分子
量マーカは、ウシ血清アルブミン(67,000ダルト
ン)、オボアルブミン(45,000ダルトン)、大豆
トリプシンインヒビター(20,100ダルトン)及び
α−ラクトアルブミン(14,400ダルトン)であっ
た。
てクロマトフォーカシングしたところ、4.8±1.0
に等電点を示した。
た精製蛋白質を含む水溶液の一部をとり、約50μlま
で濃縮した。濃縮物に3%(w/v)SDS、60%
(v/v)グリセロール及びジチオトレイトール60m
g/mlからなる混液25μlを加え、50℃で30分
間インキュベート後、15%(w/v)ポリアクリルア
ミドゲル上に移し、常法にしたがって電気泳動した。そ
の後、ゲルを0.1%(w/v)クーマシーブリリアン
トブルーR250を含む50%(v/v)水性メタノー
ルと10%(v/v)酢酸水溶液の混液に浸漬して染色
し、12%(v/v)水性メタノールと7%(v/v)
酢酸水溶液の混液で繰返し濯いで脱色し、蒸留水中に1
8時間浸漬して洗浄後、ゲルよりクーマシーブリリアン
トブルー染色された当該蛋白質を含む部分を切出し、凍
結乾燥した。
プシン』2μg/mlを含む100mM炭酸水素ナトリ
ウム、0.5mM塩化カルシウム及び0.02%(v/
v)Tween 20水溶液からなる混液0.6mlに
浸漬し、37℃で18時間インキュベートして蛋白質を
トリプシン消化した。そして、消化物を遠心分離して上
清を採取する一方、沈澱部を0.001%(v/v)T
ween 20を含む1%(v/v)水性トリフルオロ
酢酸1mlに浸漬し、室温下で4時間振盪後、遠心分離
し上清を採取した。新たに生じた沈澱を0.001%
(v/v)Tween 20を含む70%(v/v)水
性トリフルオロ酢酸、0.001%(v/v)Twee
n 20を含む50%(v/v)水性トリフルオロ酢酸
及び50%(v/v)水性アセトニトリルの順序で上記
と同様に処理し、得られた上清と上記で得られた上清を
プールし、250μlまで濃縮後、遠心濾過した。
液を、予め0.1%(v/v)水性トリフルオロ酢酸で
平衡化させておいた東ソー製高速液体クロマトグラフィ
ー用カラム『HPLC ODS−120T』に負荷し、
カラムを0.1%(v/v)水性トリフルオロ酢酸で洗
浄後、溶出液中のペプチド濃度を吸光光度計により21
4nm及び280nmの波長下でモニタしながら、0%
(v/v)から70%(v/v)に上昇する水性アセト
ニトリルの濃度勾配下、カラムに0.1%(v/v)ト
リフルオロ酢酸を0.5ml/分の流速で通液した。そ
して、通液開始から約75分後又は約55分後に溶出し
た画分(以下、それぞれ『ペプチド断片A』又は『ペプ
チド断片B』と云う。)を別々に採取した。このときの
溶出パターンを図1に示す。
ンサ『473A型』を使用し、常法にしたがってこれら
ペプチド断片A及びBのアミノ酸配列を調べたところ、
それぞれ、配列表における配列番号1又は2に示すアミ
ノ酸配列を有していた。
γ産生の誘導】8週齢の雌BDF1マウスから脾臓を摘
出し、血清無含有のRPMI1640培地(pH7.
4)中で分散し、新鮮な同一培地で洗浄後、ゲイ緩衝液
(pH8.0)中に浸漬して溶血させた。得られた脾細
胞を10%(v/v)牛胎児血清を補足したRPMI1
640培地(pH7.4)に細胞密度1×107個/m
lになるように懸濁した後、和光純薬工業製細胞分離用
ナイロンウールカラムに負荷し、5%CO2インキュベ
ータ中、37℃で1時間インキュベートした。その後、
カラムに10%(v/v)牛胎児血清を補足したRPM
I1640培地(pH7.4)を通液してT細胞を採取
し、新鮮な同一培地で洗浄し、下記のIFN−γ誘導試
験に供した。
RPMI1640培地(pH7.4)に浮遊させたマウ
スT細胞を96ウエルマイクロプレート上に0.15m
lずつとり、精製蛋白質を10%(v/v)牛胎児血清
を補足したRPMI1640培地(pH7.4)で適宜
希釈して0.05ml加えた後、0.5μg/mlコン
カナバリンAの存在下又は非存在下で5%CO2インキ
ュベータ中、37℃で24時間培養した。その後、各ウ
エルから培養上清を0.1mlずつ採取し、産生したI
FN−γを通常の酵素免疫測定法により測定した。同時
に、精製蛋白質を省略した以外は同一の系を設け、これ
を上記と同様に処置して対照とした。なお、IFN−γ
の標準品には、米国国立公衆衛生研究所から入手した標
準マウスIFN−γ(Gg02−901−533)を使
用し、国際単位(IU)に換算して表示した。
γの産生が認められなかったのに対して、精製蛋白質を
加えた系では顕著なIFN−γの産生が認められ、0.
02乃至10μg/mlの用量で、コンカナバリンAの
非存在下でマウスT細胞1×106個当たり約2乃至2
00IU、コンカナバリンAの存在下で約2乃至2,0
00IUのIFN−γが産生していた。このことは、当
該蛋白質に免疫担当細胞におけるIFN−γの産生を誘
導する作用のあることを裏付けている。
位とは、コンカナバリンAの存在下で上記のとおり試験
したときに、IFN−γを160IU誘導する蛋白質の
量と定義する。
100μg/mlカナマイシン、5×10-5M 2−メ
ルカプトエタノール及び10%(v/v)牛胎児血清を
含むRPMI1640培地(pH7.2)に実験例2−
4(a)と同様に調製したマウス脾細胞を細胞密度1×
107個/mlになるように浮遊させ、組換え型ヒトイ
ンターロイキン2を0、1、5又は10u/ml加えた
後、25ml容培養フラスコに収容した。培養フラスコ
内の細胞浮遊液に精製蛋白質を0、0.8、4、20又
は100単位/ml加え、5%CO2インキュベータ
中、37℃で72時間培養し、新鮮なRPMI1640
培地(pH7.2)で洗浄後、脾細胞を予め放射性クロ
ム酸ナトリウムで標識したYAC−1細胞(ATCC
TIB160)とともに効果細胞/標的細胞比20:1
又は40:1の割合で新鮮なRPMI1640培地(p
H7.2)に浮遊させた。細胞浮遊液を96ウェルマイ
クロプレートにとり、5%CO2インキュベータ中、3
7℃で4時間培養し、培養上清中の51Crによる放射能
をガンマカウンタにより測定した。結果を表1に示す。
細胞による細胞障害性を有意に増強する性質があり、し
かも、その性質がインターロイキン2により顕著に増強
されることを示している。
は未だ知られておらず、新規物質であると判断される。
そこで、本発明者が、マウス肝細胞からmRNAを単離
し、これを鋳型に前記実験例2−3で明らかにした部分
アミノ酸配列に基づき化学合成したプライマーの存在下
でRT−PCR反応させて当該蛋白質を部分コードする
DNA断片を採取し、これをプローブにして上記mRN
Aから別途作製したcDNAライブラリーを鋭意検索し
た結果、471塩基対からなる、配列表における配列番
号4に示す5´末端からの塩基配列のDNA断片が得ら
れた。この塩基配列を解読したところ、当該蛋白質は、
157個のアミノ酸からなる、配列表における配列番号
3に示すN末端からのアミノ酸配列を有していることが
判明した。なお、配列表における配列番号3において、
符合「Xaa」を付して示したアミノ酸は、メチオニン
又はトレオニンを意味するものとする。
ミノ酸配列及び塩基配列を解明するに到った一連の操作
を要約すると、次のようになる。 (1) クロマトグラフィーを中心とする種々の精製方
法を組合せてマウス肝細胞から当該蛋白質を単離し、高
度に精製した。 (2) 精製蛋白質をトリプシンで消化し、消化物から
2種類のペプチド断片を単離し、そのアミノ酸配列を決
定した。 (3) マウス肝細胞からmRNAを採取し、これを鋳
型に上記部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴ
ヌクレオチドのプライマーの存在下でRT−PCR反応
させてDNA断片を調製する一方、それら部分アミノ酸
配列に基づき別途化学合成したオリゴヌクレオチドをプ
ローブにしてそれらDNA断片を検索し、当該蛋白質を
部分コードするDNA断片を採取した。 (4) 別途、前記mRNAを鋳型にcDNAライブラ
リーを作製し、これに上記で調製したDNA断片をプロ
ーブにしてハイブリダイズさせ、顕著な会合を示す形質
転換体を採取した。 (5) 形質転換体からcDNAを採取し、その塩基配
列を決定し、解読するとともに、解読したアミノ酸配列
と前記部分アミノ酸配列を比較して、その塩基配列が当
該蛋白質をコードしていることを確認した。
(5)を中心に具体的に説明するが、本例で用いた手法
自体は斯界において公知であり、例えば、ティー・マニ
ャティス等『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラ
トリー・マニュアル』、1989年、コールド・スプリ
ング・ハーバー発行や、村松正実『ラボマニュアル遺伝
子工学』、1988年、丸善出版発行などにも詳述され
ている。
列】
て調製したマウス肝細胞を湿重で3gとり、これを6M
グアニジンイソチオシアナート、10mMクエン酸ナト
リウム及び0.5%(w/v)SDSからなる混液(p
H7.0)20mlに浸漬し、ホモゲナイザーで破砕し
た。次に、常法にしたがって、35ml容遠心管に5.
7M塩化セシウムを含む0.1M EDTA(pH7.
5)を25ml注入し、その上部に細胞破砕物を10m
l重層し、この状態で20℃、25,000rpmで2
0時間超遠心分離後、RNA画分を採取した。このRN
A画分を15ml容遠心管にとり、等容量のクロロホル
ム/イソブタノール混液(4:1)を加え、5分間振盪
し、4℃、10,000rpmで10分間遠心分離した
後、水層部を採取し、2.5倍容のエタノールを加え、
−20℃で2時間静置して全RNAを沈澱させた。この
沈澱を採取し、75%(v/v)水性エタノールで洗浄
後、滅菌蒸留水0.5mlに溶解して下記の実験に供し
た。なお、全RNAの収量は約4mgであった。
調製】実験例3−1で得た全RNA 1μgに25mM
塩化マグネシウムを4μl、10×PCR緩衝液(10
0mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.3)、500mM
塩化カリウム)を2μl、1mM dNTPミックスを
8μl、1単位/μlのRNaseインヒビターを1μ
l、2.5単位/μlの逆転写酵素を1μl及び2.5
μMランダムヘキサマーを1μl加え、滅菌蒸留水で2
0μlとした。混合物を0.5ml容反応管にとり、常
法にしたがって25℃で10分間、42℃で30分間、
99℃で5分間、5℃で5分間インキュベートして逆転
写酵素反応させ、第一ストランドcDNAを含む水溶液
を得た。
lに25mM塩化マグネシウムを4μl、10×PCR
緩衝液を8μl、2.5単位/μlアンプリタックDN
Aポリメラーゼを0.5μl、さらに、センスプライマ
ー又はアンチセンスプライマーとしてプライマー1及び
プライマー2をそれぞれ1pmolずつ加え、滅菌蒸留
水で100μlとした。そして、常法により、混合物を
94℃で1分間、45℃で2分間、72℃で3分間の順
序でインキュベートするサイクルを40回繰返して反応
させ、第一ストランドcDNAを鋳型に当該蛋白質を部
分コードするDNA断片を増幅した。なお、プライマー
1及びプライマー2は、配列表の配列番号1及び2にお
けるPro−Glu−Asn−Ile−Asp−Asp
−Ile又はPhe−Glu−Asp−Met−Thr
−Asp−Ileで表わされるアミノ酸配列に基づき化
学合成したオリゴヌクレオチドであり、それぞれ、5´
−ATRTCRTCDATRTTYTCNGG−3´又
は5´−TTYGARGAYATGACNGAYAT−
3´で表わされる塩基配列を有していた。
り、常法により2%(w/v)アガロースゲル上で電気
泳動して分画し、ナイロン膜上に移し取り、0.4N水
酸化ナトリウムで固定し、2×SSCで洗浄し、風乾
後、5×SSPE、5×デンハルト液、0.5%(w/
v)SDS及び100μg/ml変性サケ精子DNAを
含むプレハイブリダイゼーション混液に浸漬し、65℃
で3時間インキュベートした。別途、プローブ1とし
て、配列表の配列番号1におけるPhe−Glu−Gl
u−Met−Asp−Proで表わされるアミノ酸配列
に基づき5´−TTYGARGARATGGAYCC−
3´で表わされる塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学
合成し、[γ−32P]ATPとT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼにより同位体標識した。このプローブ1を1pm
olとり、これと5×SSPE、5×デンハルト液、
0.5%(w/v)SDS及び100μg/ml変性サ
ケ精子DNAを含む混液にナイロン膜を浸漬し、45℃
で24時間インキュベートしてハイブリダイズさせた。
ナイロン膜を6×SSCで洗浄し、常法によりオートラ
ジオグラィーしたところ、目的とするDNA断片がPC
R産物に含まれていた。
ミドベクター『pT7ブルーT』を50ngと適量のT
4 DNAリガーゼを加え、さらに、100mM AT
Pを最終濃度1mMまで加えた後、16℃で18時間イ
ンキュベートしてプラスミドベクターにDNA断片を挿
入し、得られた組換えDNAをコンピテントセル法によ
りファルマシア製大腸菌『NoVa Blue』株に導
入して形質転換体とした。得られた形質転換体を10g
/lバクトトリプトン、2.5g/l塩化ナトリウム、
15g/lバクトアガー、100mg/lアンピシリ
ン、40mg/lX−Gal及び23.8mg/lイソ
プロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(以下、
「IPTG」と略記する。)を含むプレート培地に植菌
し、37℃で24時間培養してコロニーを形成させた。
常法にしたがって、プレート培地にナイロン膜を載置
し、約30秒間静置してコロニーを移取った後、ナイロ
ン膜を剥離し、0.5N水酸化ナトリウム及び1.5M
塩化ナトリウムを含む混液に7分間浸漬して溶菌した。
その後、ナイロン膜を1.5M塩化ナトリウムを含む
0.5Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.2)に3分間浸
漬し、2×SSCで洗浄し、0.4N水酸化ナトリウム
に20分間浸漬して固定し、5×SSCでさらに洗浄
し、風乾後、5×SSPE、5×デンハルト液、0.5
%(w/v)SDS及び100μg/ml変性サケ精子
DNAを含むプレハイブリダイゼーション混液に浸漬
し、65℃で3時間インキュベートした。その後、常法
にしたがってナイロン膜にプローブ1をハイブリダイズ
させ、6×SSCで洗浄後、前記と同様にオートラジオ
グラフィーし、プローブ1と顕著な会合を示した形質転
換体をプレート培地から採取した。
/mlを含むL−ブロス培地(pH7.2)に植菌し、
37℃で18時間培養後、培養物から菌体を採取し、通
常のアルカリ−SDS法により組換えDNAを採取し
た。ジデオキシ法により調べたところ、この組換えDN
Aは配列表の配列番号4に示す塩基配列における第85
乃至281番目に相当する塩基配列のDNA断片を含ん
でいた。
全RNAを含む水溶液を0.05mlとり、これに1m
M二ナトリウム−EDTAと0.1%(w/v)SDS
を含む10mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)を
0.5ml加えて全量を1mlとした。混合物に日本ロ
シュ製オリゴ(dT)30ラテックス『オリゴテックス−
dT30スーパー』を1ml加え、65℃で5分間加熱
して変性させた後、直ちに氷浴中で3分間冷却した。5
M塩化ナトリウムを0.2mlを加え、37℃で10分
間インキュベートし、25℃、10,000rpmで1
0分間遠心分離し、上清を除いて得られたペレット状の
沈澱に滅菌蒸留水0.5mlを加えて懸濁させ、65℃
で5分間インキュベートしてオリゴテックスからmRN
Aを溶出させた。回収したmRNAは約5μgであっ
た。
ャム製cDNAクローニングキット『cDNA合成シス
テム・プラス』を使用し、実験例3−3で調製したmR
NAからcDNAライブラリーを作製した。すなわち、
1.5ml容反応管に第一ストランドcDNA合成用溶
液4μl、ピロリン酸ナトリウム溶液1μl、ヒト胎盤
リボヌクレアーゼインヒビター溶液1μl、デオキシヌ
クレオチド三燐酸混合液2μl及びオリゴdTプライマ
ー溶液1μlをこの順序で加え、さらに、実験例3−3
で得たmRNAを2μg加えた後、滅菌蒸留水で19μ
lとした。混合物に逆転写酵素20単位を含む溶液1μ
lを加え、42℃で40分間インキュベートして第一ス
トランドcDNAを含む反応物を得た。
液を37.5μl、大腸菌由来のリボヌクレアーゼHを
0.8単位、DNAポリメラーゼIを23単位この順序
で加え、滅菌蒸留水で100μlとした後、12℃で6
0分間、22℃で60分間インキュベートし、T4 D
NAポリメラーゼを2単位加え、37℃でさらに10分
間インキュベートして第二ストランドcDNAを含む反
応物を得た。反応物に0.25M EDTA(pH8.
0)を4μl加えて反応を停止させた後、常法によりフ
ェノール/クロロホルム抽出し、エタノール沈澱させて
cDNAを採取した。
液を2μl、Eco RIアダプターを250ピコモ
ル、T4 DNAリガーゼを2.5単位この順序で加
え、滅菌蒸留水で20μlとした後、15℃で16時間
インキュベートしてcDNA両端にEco RIアダプ
ターを連結した。反応物に0.25M EDTAを2μ
l加えて酵素を失活させ、常法により分子篩クロマトグ
ラフィーにより未反応のEco RIアダプターを除去
し、L/K緩衝液を40μlとT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼを80単位加え、滅菌蒸留水で全量400μlと
し、37℃で30分間インキュベートしてEco RI
切断部位をメチル化した後、反応物をフェノール/クロ
ロホルム抽出及びエタノール沈澱してDNAを採取し
た。DNAに適量のλgt10アームを含むL/K緩衝
液を1.5μlとT4 DNAリガーゼを2.5単位加
え、滅菌蒸留水で全量15μlとし、15℃で16時間
インキュベートしてライゲートした後、通常の生体外パ
ッケージングを適用して組換えλDNAを含むファージ
を得た。
ャム製大腸菌NM514株に実験例3−4で調製したフ
ァージを常法により感染させた後、10g/lバクトト
リプトン、5g/lバクトイーストエキストラクト、1
0g/l塩化ナトリウム及び15g/lバクトアガーを
含む寒天培地(pH7.0)に植菌し、37℃で6時間
培養してプラークを形成させた。寒天培地にナイロン膜
を載置し、約30秒間静置してプラークをナイロン膜上
に移取った後、ナイロン膜を剥離し、先ず、0.5M水
酸化ナトリウムと1.5M塩化ナトリウムを含む水溶液
に2分間、次に、1.5M塩化ナトリウムを含む0.5
Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.0)に5分間浸漬し
た。ナイロン膜を5×SSCで濯ぎ、風乾後、5×SS
PE、5×デンハルト溶液、0.5%(w/v)SDS
及びサケ精子DNAを100μg/ml含む混液に浸漬
し、65℃で3時間インキュベートした。その後、ナイ
ロン膜をアマシャム製DNA標識キット『レディ・プラ
イムDNA標識システム』を用いて32P標識した実験例
3−2で得たプローブ2としてのDNA断片の適量と5
×SSPE、5×デンハルト溶液、0.5%(w/v)
SDS及びサケ精子DNAを100μg/ml含む混液
中、60℃で20時間インキュベートしてハイブリダイ
ズさせ、以後、前記と同様にオートラジオグラフィーし
て、プローブ2に顕著な会合を示したファージDNAク
ローンを採取した。
で増幅し、菌体から組換えDNAを抽出した。組換えD
NAを制限酵素Eco RIで切断する一方、プラスミ
ドベクターpUC19(ATCC37254)を同じ制
限酵素で切断し、得られたDNA断片とプラスミド断片
を常法によりDNAリガーゼで連結して組換えDNAと
した。そして、この組換えDNAを通常のコンピテント
セル法により大腸菌JM109株(ATCC5332
3)に導入し、形質転換体を得た。
例3−5で調製した形質転換体をL−ブロス培地(pH
7.2)に植菌し、37℃で18時間振盪培養した。培
養物から形質転換体を採取し、通常のアルカリ−SDS
法により処理してこの発明のDNAを含む組換えDNA
を得た。蛍光光度計を使用する自動シーケンサにより分
析したところ、この組換えDNAは配列表における配列
番号5に示す5´末端からの塩基配列を含んでおり、そ
の塩基配列を解読したところ、同じく配列番号5に示す
N末端からのアミノ酸配列をコードしていることが示唆
された。このアミノ酸配列においては、その第79乃至
103番目又は第26乃至43番目に配列表における配
列番号1及び2に示す部分アミノ酸配列が含まれてお
り、このことは、この発明の蛋白質が配列表における配
列番号3に示すN末端からのアミノ酸配列を有すること
あり、マウス肝臓においては、当該蛋白質が配列表にお
ける配列番号4に示す5´末端からの塩基配列を有する
DNAによりコードされていることを示している。
てIFN−γの産生を誘導する蛋白質は、本発明者の長
年に亙る研究の一成果として見出されたものであり、従
来公知の蛋白質には見られない独特の理化学的性質を具
備している。この発明は、組換えDNA技術を応用する
ことにより、この蛋白質を創製しようというものであ
る。以下、実施例等を参照しながら、この発明の蛋白質
とその製造方法等につき、具体的に説明する。
的性質を具備する、天然由来の蛋白質及び組換えDNA
技術により創製された蛋白質全般を意味する。この発明
の蛋白質は、通常、一部又は全部が解明されたアミノ酸
配列を有しており、その一例として、例えば、配列表に
おける配列番号3に示すN末端からのアミノ酸配列かそ
れに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列番号3の
アミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体
は、所期の生物作用を実質的に変えることなく、配列番
号3のアミノ酸配列におけるアミノ酸の1個又は2個以
上を他のアミノ酸で置換することにより得ることができ
る。なお、同じDNAであっても、それを導入する宿主
や、そのDNAを含む形質転換体の培養に使用する栄養
培地の成分・組成、培養温度・pHなどに依っては、宿
主内酵素によるDNA発現後の修飾などにより、所期の
生物作用を保持しているものの、配列番号3のアミノ酸
配列におけるN末端付近のアミノ酸が1個又は2個以上
欠失したり、N末端に1個又は2個以上のアミノ酸が新
たに付加した変異体の産生することがある。斯かる変異
体も、それが免疫担当細胞においてIFN−γの産生を
誘導するかぎり、当然、この発明の蛋白質に包含され
る。
NAを含む形質転換体を栄養培地で培養し、産生した蛋
白質を培養物から採取することにより製造することがで
きる。この発明で使用する形質転換体は、例えば、配列
表における配列番号4に示す5´末端からの塩基配列若
しくはそれに相同的な塩基配列又はそれらに相補的な塩
基配列のDNAを適宜宿主に導入することにより得るこ
とができる。なお、上記塩基配列は、遺伝子の縮重を利
用して、コードするアミノ酸配列を変えることなく、塩
基の1個又は2個以上を他の塩基で置き換えてもよい。
また、DNAが宿主中で実際に当該蛋白質の産生を発現
するために、当該蛋白質又はその相同変異体をコードす
る塩基配列における塩基の1個又は2個以上を他の塩基
で適宜置換し得ることは云うまでもない。
のような配列を有するかぎり、それが天然に由来するも
のか人為的に合成されたものであるかは問わない。天然
の給源としては、例えば、マウスの肝臓が挙げられ、そ
の細胞からはこの発明のDNAを含む遺伝子が得られ
る。すなわち、例えば、コリネバクテリウム・パルバ
ム、BCG、マイトジェン、リポ多糖などの細網内皮系
刺激物質で刺激しておいたマウスから肝臓を摘出し、破
砕後、全RNAを単離する。この全RNAをオリゴ(d
T)セルロース、オリゴ(dT)ラテックスなどで処理
してポリ(A)+RNAとした後、蔗糖濃度勾配などに
より分画してmRNAを単離する。このmRNAを鋳型
に逆転写酵素とポリメラーゼを作用させて二重鎖cDN
Aとし、これを自律複製可能な適宜ベクターに挿入し、
得られた組換えDNAを大腸菌などの適宜宿主に導入し
て形質転換体とする。この形質転換体を栄養培地で培養
し、培養物にコロニーハイブリダイゼーション法を適用
してこの発明の蛋白質をコードするDNAを含む形質転
換体を採取する。斯くして得られた形質転換体を通常一
般の方法により処理すれば、この発明のDNAが得られ
る。一方、この発明のDNAを人為的に合成するには、
例えば、配列表における配列番号4に示す塩基配列に基
づいて化学合成するか、配列表における配列番号3に示
すアミノ酸配列をコードするDNAを自律複製可能な適
宜ベクターに挿入して組換えDNAとし、これを適宜宿
主に導入して得られる形質転換体を培養し、培養物から
菌体を分離し、その菌体から当該DNAを含むプラスミ
ドを採取すればよい。
態で宿主に導入される。組換えDNAは、通常、DNA
と自律複製可能なベクターを含んでなり、DNAが入手
できれば、通常一般の組換えDNA技術により比較的容
易に調製することができる。斯かるベクターの例として
は、例えば、pKK223−2、pGEX−2T、pR
L−λ、pBTrp2 DNA、pUB110、YEp
13、Tiプラスミド、Riプラスミド、pBI121
などのプラスミドベクターが挙げられ、このうち、この
発明のDNAを大腸菌、枯草菌、酵母などの原核生物で
発現させるにはpKK223−2、pGEX−2T、p
RL−λ、pBTrp2、pUB110、YEp12
が、また、動植物由来の細胞で発現させるにはTiプラ
スミド、Riプラスミド、pBI121が好適である。
するには、斯界において通常一般の方法が採用される。
具体的には、先ず、この発明のDNAを含む遺伝子と自
律複製可能なベクターとを制限酵素及び/又は超音波に
より切断し、次に、生成したDNA断片とベクター断片
とを連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチ
ドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、II型の制
限酵素、詳細には、Sau 3AI、Eco RI、H
ind III、Bam HI、Sal I、Xba
I、Sac I、Pst Iなどを使用すれば、DNA
断片とベクター断片を連結するのが容易となる。DNA
断片とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両
者をアニーリングした後、生体内又は生体外でDNAリ
ガーゼを作用させればよい。斯くして得られた組換えD
NAは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培
養することにより無限に複製可能である。
枯草菌、放線菌、酵母を始めとする適宜の宿主に導入す
ることができる。宿主が大腸菌の場合には、宿主を組換
えDNAとカルシウムイオンの存在下で培養すればよ
く、一方、宿主が枯草菌の場合には、コンピテントセル
法やプロトプラスト法を適用すればよい。形質転換体を
クローニングするには、コロニーハイブリダイゼーショ
ン法を適用するか、栄養培地で培養し、免疫担当細胞に
おいてIFN−γの産生を誘導する蛋白質を産生するも
のを選択すればよい。
で培養すると、菌体又は細胞内外に当該蛋白質を産生す
る。栄養培地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、
さらには、必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微
量栄養素を補足した通常一般の液体培地が使用され、個
々の炭素源としては、澱粉、澱粉加水分解物、グルコー
ス、果糖、蔗糖などの糖質が、また、窒素源としては、
例えば、アンモニア又はアンモニウム塩、尿素、硝酸
塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティー
プリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙げ
られる。形質転換体を斯かる栄養培地に植菌し、栄養培
地を温度25乃至65℃、pH2乃至8に保ちつつ、通
気撹拌などによる好気的条件下で約1乃至10日間培養
すれば、当該蛋白質を含む培養物が得られる。この培養
物はIFN−γ誘導剤としてそのまま使用可能ではある
が、通常は使用に先立ち、必要に応じて、超音波や細胞
壁溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離な
どにより当該蛋白質を菌体若しくは菌体破砕物から分離
し、精製する。精製には菌体又は菌体破砕物を除去した
培養物に、例えば、濃縮、塩析、透析、分別沈澱、ゲル
濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動、
等電点電気泳動などの生理活性物質を精製するための斯
界における通常一般の方法が採用でき、必要に応じて、
これら方法を適宜組合せればよい。そして、最終使用形
態に応じて、精製した蛋白質を濃縮・凍結乾燥して液状
若しくは固状にすればよい。
担当細胞においてIFN−γの産生を誘導する性質を有
する。この性質により、この発明の蛋白質は、細胞培養
法によりIFN−γを製造の際の誘導剤として、さらに
は、IFN−γに感受性を有する、例えば、エイズや尖
圭コンジロムなどのウイルス性疾患、腎臓癌、肉芽腫、
菌状息肉症、脳腫瘍などの悪性腫瘍、関節リウマチやア
レルギー症などの免疫疾患に対する治療剤・予防剤とし
て有用である。
を培養してIFN−γを製造するための培養培地に共存
させるか、IFN−γ感受性疾患の治療・予防のために
哺乳類の体内に直接投与される。すなわち、前者の用途
においては、哺乳類の末梢血から分離される白血球や、
例えば、HBL−38細胞、MO細胞、Jurkat細
胞、EL−4細胞、L12−R4細胞などの培養株化さ
れた免疫担当細胞をこの発明の蛋白質を含む適宜の培養
培地に浮遊させる。必要に応じて、培養培地にマイトジ
ェンやインターロイキン2、抗CD3抗体などのT細胞
刺激物質を加え、培養培地を温度約30乃至40℃、p
H約5乃至8に保ちつつ、培養培地を適宜新鮮なものと
取替えながら、通常一般の方法により約1乃至100時
間培養する。斯くして得られる培養物を生理活性物質を
精製するための通常一般の方法、すなわち、濃縮、塩
析、透析、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォ
ーカシング、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの1種
若しくは2種以上を適宜組合せて適用することにより、
IFN−γを採取することができる。
のためには、哺乳類の体内にこの発明によるIFN−γ
誘導剤を直接投与すればよい。具体的には、この発明の
IFN−γ誘導剤を投与に適した適宜剤型に調製後、哺
乳類に経口投与するか、例えば、皮内、皮下、筋肉内、
静脈内又は腹腔内に注射投与する。この発明の蛋白質を
投与し得る哺乳類はヒトに限定されず、例えば、マウ
ス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、
ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サルなどの哺乳動物であっ
てもよい。この発明の蛋白質は強力なIFN−γ誘導能
を有することから、一般に少量で所期のIFN−γ産生
を誘導でき、また、毒性が極めて低いことから、多量投
与しても重篤な副作用を惹起することがない。したがっ
て、この発明の蛋白質は、使用に際して用量を厳密に管
理しなくても、所望のIFN−γ産生を迅速に誘導でき
る利点がある。
による細胞障害性を増強する性質が顕著なことから、イ
ンターロイキン2や腫瘍壊死因子と適宜併用することに
より、養子免疫療法による肺癌、腎臓癌、乳癌などの固
形癌を含む悪性腫瘍の治療における治療効果や副作用の
改善に顕著な効果を発揮する。
蛋白質の製造につき、実施例に基づいて具体的に説明す
る。
酒造製PCRキット『GeneAmp RNA PCR
Kit』を使用し、実験例3−1の方法により得た全
RNAから第一ストランドcDNAを調製した。すなわ
ち、0.5ml容反応管に25mM塩化マグネシウムを
4μl、10×PCR緩衝液を2μl、1mM dNT
Pミックスを8μl、1単位/μlのRNaseインヒ
ビターを1μl、2.5単位/μlの逆転写酵素を1μ
l、2.5μMランダムヘキサマーを1μl及び実験例
3−1の方法により得た全RNA 1μgをとり、滅菌
蒸留水で20μlとした。そして、混合物を25℃で1
0分間、42℃で30分間、99℃で5分間、5℃で5
分間この順序でインキュベートして第一ストランドcD
NA含む反応物を得た。
M塩化マグネシウムを4μl、10×PCR緩衝液を8
μl、2.5単位/μlアンプリタックDNAポリメラ
ーゼを0.5μl、配列表の配列番号3におけるN末端
又はC末端付近のアミノ酸配列に基づき化学合成した5
´−CGAGGGATCGAACTTTGGCCGAC
TTC−3´又は5´−CGAGGAATTCCTAA
CTTTGATGTAAG−3´で表わされる塩基配列
のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの適量
を加え、滅菌蒸留水で100μlとした。次に、常法に
より、この混合物を94℃で1分間、55℃で2分間、
72℃で3分間この順序でインキュベートするサイクル
を40回繰返し、得られたPCR産物を制限酵素Bam
HI及びEco RIで切断してBam HI−Ec
o RI DNA断片を得た。
00ngとり、これに、予め制限酵素Bam HI及び
Eco RIで切断しておいたファルマシア製プラスミ
ドベクター『pGEX−2T』を10ng、適量のT4
DNAリガーゼ及び10mM ATPを最終濃度1m
Mになるように加えた後、16℃で18時間インキュベ
ートした。得られた組換えDNAをコンピテントセル法
により大腸菌DH5(ATCC53868)株に導入し
て形質転換体とし、これをアンピシリン50μg/ml
を含むL−ブロス培地(pH7.2)に植菌し、37℃
で18時間培養した後、通常のアルカリ−SDS法によ
り組換えDNAを抽出した。
命名するとともに、その構造をジデオキシ法により調べ
たところ、図2に見られるように、このpMGTG−1
においては、配列表における配列番号4に示す塩基配列
のMGTG cDNAがTacプロモータ及びグルタチ
オンSトランスフェラーゼ遺伝子の下流に連結されてい
た。
の方法で得た形質転換体をアンピシリン50μg/ml
を含むL−ブロス培地(pH7.2)に植菌し、振盪し
ながら37℃で18時間種培養した。種培養物を1%
(v/v)の割合で新鮮な18lの同一培地に植菌し、
37℃で通気撹拌培養した。そして、波長650nmに
おける培養物の吸光度が約0.6に達した時点でIPT
Gを最終濃度1mMまで加え、さらに5時間培養した。
その後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、15
0mM塩化ナトリウム、16mM燐酸水素二ナトリウム
及び4mM燐酸二水素ナトリウムを含む混液(pH7.
3)に浮遊させ、常法により超音波処理後、菌体破砕物
を遠心分離し、上清を採取した。
を含む50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)で平
衡化させておいたファルマシア製『グルタチオン・セフ
ァロース4B』カラムに負荷し、新鮮な同一緩衝液で洗
浄後、カラムに5mM還元型グルタチオンを含む50m
Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)を通液して蛋白質
を溶出させた。次いで、蛋白質を含む画分に採取濃度が
2.5mMになるように塩化カルシウムを加えるととも
に、トロンビンを1,000単位加え、25℃で18時
間インキュベートし、反応物を予め150mM塩化ナト
リウムを含む50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.
5)で平衡化させておいたグルタチオン・セファロース
4Bカラムに通液して非吸着画分を採取した。その後、
この画分を濃縮し、凍結乾燥したところ、比活性約5×
105単位/mg蛋白質の当該蛋白質を含む固状物が培
養物1l当たり約3mgの収量で得られた。
化学的性質を調べたところ、この精製蛋白質は、SDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動方法又はゲル濾過法
により測定すると分子量19,000±5,000ダル
トンを、また、クロマトフォーカシング法により測定す
ると4.8±1.0に等電点を示した。さらに、実験例
2−4の方法により試験したところ、精製蛋白質は、コ
ンカナバリンAの非存在下及び存在下で免疫担当細胞に
おけるIFN−γ産生をよく誘導し、また、キラー細胞
の細胞障害性も顕著に増強した。これは、組換えDNA
技術によっても、当該蛋白質を製造し得ることを裏付け
るものである。
N−γの産生を誘導する新規な蛋白質の発見に基づくも
のである。この発明の蛋白質は、通常、アミノ酸配列の
一部又は全部が解明された物質であり、免疫担当細胞に
おいて安定したIFN−γ誘導能を発揮する。これによ
り、この発明の蛋白質は、細胞培養法によりIFN−γ
を製造するためのIFN−γ誘導剤として、さらには、
IFN−γに感受性を有するウイルス性疾患、悪性腫
瘍、免疫疾患一般に対する治療剤・予防剤として多種多
様の用途を有することとなる。
能を有することから、一般に少量で所期のIFN−γ産
生を誘導でき、また、毒性が極めて低いことから、多量
投与しても重篤な副作用を惹起することがない。したが
って、この発明の蛋白質は、使用に際して用量を厳密に
管理しなくても、所望のIFN−γ産生を迅速に誘導で
きる利点がある。くわえて、この発明の蛋白質はキラー
細胞による細胞障害性を増強する性質が顕著なことか
ら、インターロイキン2や腫瘍壊死因子と適宜併用する
ことにより、養子免疫療法による肺癌、腎臓癌、乳癌な
どの固形癌を含む悪性腫瘍の治療における治療効果や副
作用の改善に顕著な効果を発揮する。
をコードするこの発明のDNAを利用することにより、
所望量を容易に製造することができる。
するものであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義の
ある発明であると言える。
るペプチド断片の高速液体クロマトグラフィーにおける
溶出パターンを示す図である。
−1の構造を示す図である。
ドするcDNA Ptac tacプロモータ GST グルタチオンSトランス
フェラーゼ遺伝子 AmpR アンピシリン耐性遺伝子 ori 大腸菌における複製開始
点
り、常法により2%(w/v)アガロースゲル上で電気
泳動して分画し、ナイロン膜上に移し取り、0.4N水
酸化ナトリウムで固定し、2×SSCで洗浄し、風乾
後、5×SSPE、5×デンハルト液、0.5%(w/
v)SDS及び100μg/ml変性サケ精子DNAを
含むプレハイブリダイゼーション混液に浸漬し、65℃
で3時間インキュベートした。別途、プローブ1とし
て、配列表の配列番号1におけるPhe−Glu−Gl
u−Met−Asp−Proで表わされるアミノ酸配列
に基づき5´−TTYGARGARATGGAYCC−
3´で表わされる塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学
合成し、[γ−32P]ATPとT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼにより同位体標識した。このプローブ1を1pm
olとり、これと5×SSPE、5×デンハルト液、
0.5%(w/v)SDS及び100μg/ml変性サ
ケ精子DNAを含む混液にナイロン膜を浸漬し、45℃
で24時間インキュベートしてハイブリダイズさせた。
ナイロン膜を6×SSCで洗浄し、常法によりオートラ
ジオグラフィーしたところ、目的とするDNA断片がP
CR産物に含まれていた。
化学的性質を調べたところ、この精製蛋白質は、SDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又はゲル濾過法に
より測定すると分子量19,000±5,000ダルト
ンを、また、クロマトフォーカシング法により測定する
と4.8±1.0に等電点を示した。さらに、実験例2
−4の方法により試験したところ、精製蛋白質は、コン
カナバリンAの非存在下及び存在下で免疫担当細胞にお
けるIFN−γ産生をよく誘導し、また、キラー細胞の
細胞障害性も顕著に増強した。これは、組換えDNA技
術によっても、当該蛋白質を製造し得ることを裏付ける
ものである。 ─────────────────────────────────────────────────────
全RNAを含む水溶液を0.05mlとり、これに1m
MEDTAと0.1%(w/v)SDSを含む10mM
トリス−塩酸緩衝液(pH7.5)を0.5ml加え、
滅菌蒸留水で全量を1mlとした。混合物に日本ロシュ
製オリゴd(T)30ラテックス『オリゴテックス−d
T30スーパー』を1ml加え、65℃で5分間加熱し
て変性させた後、直ちに氷浴中で3分間冷却した。その
後、5M塩化ナトリウムを0.2ml加え、37℃で1
0分間インキュベートし、25℃、10,000rpm
で10分間遠心分離し、上清を除いて得られたペレット
状の沈澱に滅菌蒸留水0.5mlを加えて懸濁させ、6
5℃で5分間インキュベートしてオリゴテックスからm
RNAを溶出させた。回収したmRNAは約5μgであ
った。
ャム製大腸菌NM514株に実験例3−4で調製したフ
ァージを常法により感染させた後、10g/lバクトト
リプトン、5g/lバクトイーストエキストラクト、1
0g/l塩化ナトリウム及び15g/lバクトアガーを
含む寒天培地(pH7.0)に植菌し、37℃で6時間
培養してプラークを形成させた。寒天培地にナイロン膜
を載置し、約30秒間静置してプラークをナイロン膜上
に移取った後、ナイロン膜を剥離し、先ず、0.5M水
酸化ナトリウムと1.5M塩化ナトリウムを含む水溶液
に2分間、次に、1.5M塩化ナトリウムを含む0.5
Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.0)に5分間浸漬し
た。ナイロン膜を5×SSCで濯ぎ、風乾後、5×SS
PE、5×デンハルト溶液、0.5%(w/v)SDS
及び変性サケ精子DNAを100μg/ml含む混液に
浸漬し、65℃で3時間インキュベートした。その後、
ナイロン膜をアマシャム製DNA標識キット『レディ・
プライムDNA標識システム』を用いて32P標識した
実験例3−2で得たプローブ2としてのDNA断片の適
量と5×SSPE、5×デンハルト溶液、0.5%(w
/v)SDS及び変性サケ精子DNAを100μg/m
l含む混液中、60℃で20時間インキュベートしてハ
イブリダイズさせ、以後、前記と同様にオートラジオグ
ラフィーして、プローブ2に顕著な会合を示したファー
ジDNAクローンを採取した。
態で宿主に導入される。組換えDNAは、通常、DNA
と自律複製可能なベクターを含んでなり、DNAが入手
できれば、通常一般の組換えDNA技術により比較的容
易に調製することができる。斯かるベクターの例として
は、例えば、pKK223−2、pGEX−2T、pR
L−λ、pBTrp2 DNA、pUB110、YEp
13、Tiプラスミド、Riプラスミド、pBI121
などのプラスミドベクターが挙げられ、このうち、この
発明のDNAを大腸菌、枯草菌、酵母などの原核生物で
発現させるにはpKK223−2、pGEX−2T、p
RL−λ、pBTrp2 DNA、pUB110、YE
p13が、また、動物由来の細胞で発現させるにはTi
プラスミド、Riプラスミド、pBI121が好適であ
る。
るcDNA Ptac tacプロモータ GST グルタチオンSトランスフェ
ラーゼ遺伝子 Amp R アンピシリン耐性遺伝子 pBR322ori 大腸菌における複製開始点
Claims (22)
- 【請求項1】 下記の理化学的性質を有する蛋白質。 (1) 分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又はゲル濾
過法で測定すると、分子量19,000±5,000ダ
ルトンを示す。 (2) 等電点 クロマトフォーカシング法で測定すると、4.8±1.
0に等電点を示す。 (3) 部分アミノ酸配列 配列表における配列番号1及び2に示す部分アミノ酸配
列を有する。 (4) 生物作用 免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘
導する。 - 【請求項2】 配列表における配列番号3(ただし、
「Xaa」はメチオニン又はトレオニンを意味するもの
とする。)に示すN末端からのアミノ酸配列又はそれに
相同的なアミノ酸配列を有する請求項1に記載の蛋白
質。 - 【請求項3】 請求項1乃至2に記載の蛋白質をコード
するDNA。 - 【請求項4】 配列表における配列番号4に示す5´末
端からの塩基配列若しくはそれに相同的な塩基配列又は
それらに相補的な塩基配列を有する請求項3に記載のD
NA。 - 【請求項5】 遺伝子コードの縮重に基づき、配列表に
おける配列番号3に示すアミノ酸配列を変えることな
く、配列表における配列番号4に示す塩基配列における
塩基の1個又は2個以上を他の塩基で置換した請求項3
又は4に記載のDNA。 - 【請求項6】 マウスの肝臓に由来する請求項3、4又
は5に記載のDNA。 - 【請求項7】 請求項1乃至2に記載の蛋白質をコード
するDNAと自律複製可能なベクターを含んでなる複製
可能な組換えDNA。 - 【請求項8】 DNAが配列表における配列番号4に示
す5´末端からの塩基配列若しくはそれに相同的な塩基
配列又はそれらに相補的な塩基配列を有する請求項7に
記載の複製可能な組換えDNA。 - 【請求項9】 遺伝子コードの縮重に基づき、配列表に
おける配列番号3に示すアミノ酸配列を変えることな
く、配列表における配列番号4に示す塩基配列における
塩基の1個又は2個以上を他の塩基で置換した請求項7
又は8に記載の複製可能な組換えDNA。 - 【請求項10】 ベクターがpGEX−2Tである請求
項7、8又は9に記載の複製可能な組換えDNA。 - 【請求項11】 請求項1乃至2に記載の蛋白質をコー
ドするDNAと自律複製可能なベクターを含んでなる複
製可能な組換えDNAを適宜宿主に導入してなる形質転
換体。 - 【請求項12】 DNAが配列表における配列番号4に
示す5´末端からの塩基配列若しくはそれに相同的な塩
基配列又はそれらに相補的な塩基配列を有する請求項1
1に記載の形質転換体。 - 【請求項13】 遺伝子コードの縮重に基づき、配列表
における配列番号3に示すアミノ酸配列を変えることな
く、配列表における配列番号4に示す塩基配列における
塩基の1個又は2個以上を他の塩基で置換した請求項1
1又は12に記載の形質転換体。 - 【請求項14】 ベクターがpGEX−2Tである請求
項11、12又は13に記載の形質転換体。 - 【請求項15】 宿主が大腸菌である請求項11、1
2、13又は14に記載の形質転換体。 - 【請求項16】 請求項1乃至2に記載の蛋白質を産生
し得る形質転換体を栄養培地で培養し、産生した蛋白質
を培養物から採取してなる蛋白質の製造方法。 - 【請求項17】 形質転換体が請求項1乃至2に記載の
蛋白質をコードするDNAと自律複製可能なベクターを
含んでなる複製可能な組換えDNAを適宜宿主に導入し
てなる請求項16に記載の蛋白質の製造方法。 - 【請求項18】 DNAが配列表における配列番号4に
示す5´末端からの塩基配列若しくはそれに相同的な塩
基配列又はそれらに相補的な塩基配列を有する請求項1
6又は17に記載の蛋白質の製造方法。 - 【請求項19】 遺伝子コードの縮重に基づき、配列表
における配列番号3に示すアミノ酸配列を変えることな
く、配列表における配列番号4に示す塩基配列における
塩基の1個又は2個以上を他の塩基で置換した請求項1
6、17又は18に記載の蛋白質の製造方法。 - 【請求項20】 ベクターがpGEX−2Tである請求
項16、17、18又は19に記載の蛋白質の製造方
法。 - 【請求項21】 宿主が大腸菌である請求項16、1
7、18、19又は20に記載の蛋白質の製造方法。 - 【請求項22】 産生した蛋白質を濃縮、塩析、透析、
分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、
ゲル電気泳動及び等電点電気泳動から選ばれる1種若し
くは2種以上の精製方法により採取する請求項16、1
7、18、19、20又は21に記載の蛋白質の製造方
法。
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-
1994
- 1994-07-14 JP JP06184162A patent/JP3109018B2/ja not_active Expired - Lifetime
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