JP2687995B2 - Ｄｎａ配列、組替えｄｎａ分子およびヒト繊維芽細胞インターフェロン様ポリペプチドの製造方法 - Google Patents

Ｄｎａ配列、組替えｄｎａ分子およびヒト繊維芽細胞インターフェロン様ポリペプチドの製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の要約 DNA配列、組替えDNA分子およびそれらにより形質転換
されかつヒト繊維芽細胞インターフェロンの生物学的も
しくは免疫学的活性を示すポリペプチドを生産する宿
主、これらポリペプチドをコードする遺伝子ならびにこ
れらDNA配列、分子、宿主、遺伝子およびポリペプチド
の製造および使用方法を開示する。DNA配列は、ヒト繊
維芽細胞インターフェロンの生物学的もしくは免疫学的
活性を示すポリペプチドをコードすることを特徴とす
る。適当な宿主において、これらのDNA配列および組替
えDNA分子は、ヒト繊維芽細胞インターフェロンの生物
学的もしくは免疫学的活性を示す遺伝子およびポリペプ
チドの生産および同定を可能にすると共に、抗ウィルス
および抗腫瘍もしくは抗癌剤におけるその使用を可能に
する。 本発明は、DNA配列、組替えDNA分子ならびにヒト繊維
芽細胞インターフェロン様ポリペプチドの製造方法に関
するものである。さらに詳細には、本発明は適当な宿主
微生物において発現されるDNA配列に関するものであ
る。本明細書中に開示する組替えDNA分子は、アミノ酸
配列と組成とがヒト繊維芽細胞インターフェロンと実質
的に一致しかつヒト繊維芽細胞インターフェロンの免疫
学的もしくは生物学的活性を有するポリペプチドをコー
ドするDNA配列を特徴とする。以下の記載から明らかに
なるように、本発明のDNA配列、組替えDNA分子およびそ
の製造方法は、抗ウィルス剤および抗腫瘍もしくは抗癌
剤ならびに免疫調節方法に有用なポリペプチドを製造す
るのに使用することができる。 本出願においては、ネイチャー誌第286巻、第2421頁
（1980年７月10日）に発表されたインターフェロンとい
う名称を使用する。この名称をもって、本出願の優先権
となる原出願において使用されたものと交換する。例え
ば、IFはここではIFNで表わされ、繊維芽細胞インター
フェロンはここではIFN−βで表わされる。 インターフェロン（“IFN"）は２種類存在することが
知られている。種類Ｉのインターフェロンは小さい酸安
定性の（糖）−蛋白質であって、細胞をウィルス感染耐
性にするものである〔エー・イサークスおよびジェー・
リンデンマン「ウィルス干渉Ｉ、インターフェロン」、
プロシーディング・ロイヤル・ソサイエティ・シリーズ
Ｂ、第147巻第258〜267頁（1957）およびダブリュー・
イー・スチュアートII、「ザ・インターフェロン・シス
テム」、スプリンガー出版（1979）（以下、「ザ・イン
ターフェロン・システム」と云う）〕。種類IIのIFNは
酸不安定である。現在、これらは良く同定されていな
い。IFNは、或る程度、細胞特異的である（ザ・インタ
ーフェロン・システム第135〜145頁）がウィルス特異的
でない。寧ろ、IFNは広範囲のウィルスに対して細胞を
保護する。 ヒトインターフェロン（“HuIFN"）は３つの群α，β
およびγに分類されている。HuIFN−βすなわち繊維芽
細胞インターフェロンは二倍体繊維芽細胞において適当
に誘導させて生産される。これは、またリンパ芽細胞に
おいて、多量のHuIFN−αと共に少量で生産される。こ
れらの細胞から作られたIFN−βは鋭意精製されかつ同
定されている〔イー・ナイト・ジュニア、「インターフ
ェロン：ヒト二倍体細胞からの精製および初期同定」、
プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエン
ス・USA、第73巻、第520〜523頁（1976）〕。これは、
分子量約20,000の糖蛋白質である〔エム・ウイラノウス
カースチュワート等、「ヒト白血球、リンパ芽細胞およ
び繊維芽細胞インターフェロンの物理学的および生物学
的性質に対する炭水化物部分の寄与」、アブストラクト
・アニュアル・ミーティング・アメリカン・ソサイエテ
ィ・マイクロバイオロジー、第246頁（1978）〕。ま
た、これは、恐らく炭水化物部分のため大きさに関し不
均質である。 標準ヒト繊維芽細胞インターフェロンのアミノ酸組成
も報告されている〔イー・ナイト・ジュニア等、「ヒト
繊維芽細胞インターフェロン：アミノ酸分析およびアミ
ノ末端アミノ酸配列」、サイエンス誌、第207巻、第525
〜526頁（1980）〕。さらに、標準ヒト繊維芽細胞イン
ターフェロンにおけるアミノ酸配列の解明は進行中であ
る。現在のところ、標準成熟蛋白質のNH2末端のアミノ
酸配列は最初の13個のアミノ酸残基について報告されて
いる：すなわちMet−Ser−Tyr−Asn−Leu−Leu−Gly−P
he−Leu−Gln−Arg−Ser−Ser…〔イー・ナイト・ジュ
ニア等、上記〕。 二種の異なる遺伝子、すなわち一方は染色体２上に位
置し、他方は染色体５上に位置するものがIFN−βをコ
ードすると報告されている〔ディー・エル・スレートお
よびエフ・エッチ・ラドル「ヒトにおける繊維芽細胞イ
ンターフェロンは別々の染色体上の２つの位置によりコ
ードされる」、セル誌、第16巻、第171〜180頁（197
9）〕。しかしながら、他の研究は、IFN−βに対する遺
伝子が染色体９上に位置することを示している〔エー・
メッジャー等、「ヒト繊維芽細胞インターフェロン生産
における染色体９上の遺伝子の関与」、ネイチャー誌、
第280巻、第493〜495頁（1979）〕 標準HuIFN−βはグリコシル化されているが、炭水化
物部分の除去〔ピー・ジェー・ブリッジェン等、「ヒト
リンパ芽細胞インターフェロン」、ジャーナル・バイオ
ロジカル・ケミストリー、第252巻、第6585〜6587頁（1
977）〕またはグリコシル化を妨げる目的を持った阻害
剤の存在下におけるIFN−βの合成（ダブリュー・イー
・スチュワート・II等、「ヒト白血球インターフェロン
の生産および性質に対するグリコシル化阻害剤の作
用」、バイロロジー、第97巻、第473〜476頁（1979）；
ジェー・フジサワ等、「ツニカマイシンの作用により生
産される非グルコシル化ネズミＬ細胞インターフェロ
ン」、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第
253巻、第8677〜8679頁（1978）；イー・エーハベル
等、「グリコシル化の阻害剤の存在下に生産されるヒト
インターフェロンの変化分子種類」、ジャーナル・バイ
オロジカル・ケミストリー、第252巻、第4425〜4427頁
（1977）；ザ・インターフェロン・システム、第181
頁〕はより小さい型のIFN−βをもたらし、これはまだI
FN活性の大部分または全部を保有する。 HuIFN−βは、多くのヒト蛋白質と同様に多形性であ
る。従って、特定個人の細胞はより一般的なIFN−β群
内におけるIFN−β種を生成することができ、これはそ
の属する種類の原型と生理学的には同じであるが、構造
的には僅かに異なっている。従って、IFN−βの蛋白質
構造は一般的には良く規定されているが、特定個人はそ
れと僅かに異なるIFN−βを生成することができる。 IFN−βは、通常、正常もしくは健全な細胞には検出
されない（ザ・インターフェロン・システム、第55〜57
頁）。寧ろ、細胞をIFNインデューサに曝す結果、蛋白
質が生成される。IFNインデューサは一般にウィルスで
あるが、性質上非ウィルス性のもの、例えば天然もしく
は合成の二本鎖RNA、細胞内微生物、微生物生成物およ
び各種の化学薬剤とすることもできる。ヒト細胞をウィ
ルス感染耐性にすべく、これら非ウィルス性インデュー
サを利用する多くの試みがなされている〔エス・バロン
およびエフ・ジアンザニ編、テキサス・レポート・オン
・バイオロジー・アンド・メディスン、第35号（「テキ
サスレポート」）、第528〜540頁（1977）〕。これらの
試みは大して成功を収めていない。寧ろ、現在では外来 HuIFN−βの使用が好まれている。 ウィルスおよび腫瘍もしくは癌に対するインターフェ
ロン治療が、種々異なる投与量にてかつ幾つかの投与様
式にて行なわれている〔ザ・インターフェロン・システ
ム、第305〜321頁〕。例えばインターフェロンは、経口
的に或いは接種（静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮内および
皮下）により、或いは点眼薬、軟膏および噴霧剤の形態
で効果的に投与されている。通常、104〜107単位の投与
量で毎日１〜３回投与される。治療程度は、患者および
処置すべき状態に依存する。例えば、ウィルス感染は通
常、数日間乃至２週間にわたり毎日もしくは１日２回投
与することにより処置され、腫瘍および癌は通常数ヵ月
乃至数年間にわたり毎日また１日多数回投与することに
より処置される。勿論、或る患者に対し最も有効な治療
は、投与様式および投与量を選択するにあたり、例えば
病気、従前の治療およびインターフェロンに対する患者
の反応など周知の因子を考慮する担当医師により決定さ
れねばならない。 抗ウィルス剤として、HuIFNは次の病気を処置するた
めに使用されている：呼吸器感染症（テキサスレポー
ト、第486〜496頁）、単純疱疹性角膜炎（テキサスレポ
ート、第497〜500頁、アール・スンドマツハー、「眼病
における外来インターフェロン」、インターナショナル
・バイロロジーIV、ザ・ハーグ、アブストラクトNo.W2/
11、第99頁（1978）〕、急性出血性結膜炎〔テキサスレ
ポート、第501〜510頁〕、アデノウィルス角結膜炎〔エ
ー・ロマノ等、ISMメモI-A8131（1979年10月）〕、水痘
性帯状疱疹（テキサスレポート、第511〜515頁）、巨大
ウィルス感染症（テキサスレポート、第523〜527号）、
およびＢ型肝炎（テキサスレポート、第516〜522頁）。
ザ・インターフェロン・システム、第307〜319頁も参照
できる。しかしながら、抗ウィルス剤としてのIFNの大
規模な使用は、従来入手し得るよりも多量のIFNを必要
とする。 IFNは、その抗ウィルス作用に加えて、他の効果をも
有する。例えば、これは集落刺戟因子の効果に拮抗し、
造血性集落形成細胞の生長を抑制しかつまた顆粒球およ
び大食球先駆体の正常分化を阻害する（テキサスレポー
ト、第343〜349頁）。さらに、これはDMSO処理されたフ
レンド白血病細胞における赤血球分化を抑制する（テキ
サスレポート、第420〜428頁）。幾つかの細胞系統は、
これらの点においてHuIFN−αに対するよりもHuIFN−β
に対し著しく敏感である〔エス・アインホルンおよびエ
ッチ・ストランダー、「インターフェロンは組織特異的
であるか？−リンパ芽細胞および骨癌細胞系の成長に対
するヒト白血球および繊維芽細胞インターフェロンの効
果」、ジャーナル・ゼネラル・バイロロジー、第35巻、
第573〜577頁（1977）；ティー・カワタ等、「白血球お
よび繊維芽細胞インターフェロンによる形質転換ヒト細
胞における細胞およびウィルス成長の抑制比較」、ジャ
ーナル・ゼネラル・バイロロジー、第43巻、第435〜439
頁（1979）〕。 また、IFNは、免疫反応の調整に役割を演ずる。例え
ば、抗原に対する施用の量と時間とに応じて、IFNは生
体内および試験官内において免疫促進的にも或いは免疫
抑制的にもなりうる（テキサスレポート、第357〜369
頁）。さらに、特異的に感応されたリンパ芽細胞は、抗
原に接触すると、IFNを生成することが観察された。従
って、この種の抗原誘発されたIFNは免疫反応の調節体
となり、循環抗原レベルと細胞免疫の表現との両者に作
用することができる（テキサスレポート、第370〜374
頁）。さらに、IFNはキラーリンパ球の活性および抗体
依存性の細胞媒介される細胞毒性を高めることも知られ
ている〔アール・アール・ハーバーマン等、「ヒト天然
および抗体依存性細胞媒介細胞毒性のインターフェロン
による促進」、ネイチャー誌、第277巻、第221〜223頁
（1979）；ピー・ビバリーおよびディー・ナイト、「死
亡は自然に起こる」、ネイチャー誌、第278巻、第119〜
120頁（1979）；テキサスレポート、第375〜380頁、ジ
ェー・アール・ハドルストーン等、「インターフェロン
治療に従うヒトにおける天然キラー細胞の誘発および活
動」、ネイチャー誌、第282巻、第417〜419頁（197
9）；エス・アインホルン等、「人間におけるインター
フェロンおよび自然細胞毒性II、外来性白血球インター
フェロンを受けた患者における研究」、アクタ・メジカ
・スカンジナビア、第204巻、第477〜483頁（197
8）〕。これらの両種類は、腫瘍細胞に対する免疫学的
攻撃に直接的または間接的に含まれる。 従って、抗ウィルス剤としての使用に加え、HuIFNは
抗腫瘍および抗癌治療において有力な用途を有する（ザ
・インターフェロン・システム、第319〜321頁および第
394〜399頁）。現在、IFNは多くの動物における多くの
種類の腫瘍の生長に影響を与えることが知られている
（ザ・インターフェロン・システム、第292〜304頁）。
それらは、他の抗腫瘍剤と同様、小腫瘍に対して使用さ
れた場合特に効果的であると思われる。動物IFNの抗腫
瘍効果は投与量と時間とに左右されるが、これは毒性レ
ベル以下の濃度で示されたものである。従って、IFNの
抗腫瘍および抗癌性につき多くの研究および臨床試験が
過去に行なわれ、現在も行なわれ続けている。これらに
は、例えば骨肉腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫お
よびホドキンス病のような幾つかの悪性疾患の処置が包
含される（テキサスレポート、第429〜435頁）。さら
に、HuIFN−βは、黒腫症および胸部癌に侵された患者
における皮下腫瘍結節に注射すると、局部腫瘍退化をも
たらすことが最近示された〔ティー・ネモト等、「黒腫
症および胸部癌のヒトインターフェロンおよび内部治
療」、アメリカン・アソシエーション・フォー・カンサ
ー・リサーチ、アブストラクト、第994号、第246頁（19
79）〕。これら臨床試験の結果は好ましいものであった
が、IFN−βの抗腫瘍および抗癌用途は、精製IFN−βの
充分な供給が得られないため、著しく妨げられている。 顕著なことに、IFN−αの抗細胞効果に抵抗性である
幾つかの細胞系はIFN−βに敏感である。この効果の差
が示唆するように、IFN−βはIFN−αの高投与量で処置
された患者において選択的圧力下に生ずるような或る種
の抵抗性腫瘍細胞に対して有効に使用することができる
〔ティー・カワタ等、上記；エー・エー・クリージィー
等、「インターフェロンによる腫瘍細胞成長の抑制にお
けるG0-G1補捉の役割」、アブストラクト、インターフ
ェロンの制御機能に関する会議、ニューヨーク・アカデ
ミー・サイエンス、第17号（1979年10月23〜26日）〕。 生化学レベルにおいてIFNは少なくとも３種の蛋白質
の生成を誘導する。すなわち、蛋白質キナーゼ〔ビー・
レブロイ等、「インターフェロン、二本鎖RNAおよび蛋
白質リン酸化」、プロシーディング・ナショナル・アカ
デミー・サイエンス・USA、第73巻、第3107〜3111頁（1
976）；エー・ジー・ホバネシアンおよびアイ・エム・
ケール、「インターフェロン処理された細胞からの（2-
-5-）オリゴアデニレート（pppA2--5A2--5-A）合成酵素
および蛋白質キナーゼ」、ヨーロッパ・ジャーナル・バ
イオケミストリー、第93巻、第515〜526頁（1979）〕
と、（2--5-）オリゴ（Ａ）ポリメラーゼ〔エー・ジー
・ホバネシアン等、「インターフェロン処理された細胞
からの酵素による蛋白質合成の低分子量抑制剤の合
成」、ネイチャー誌、第268巻、第537〜539頁（197
7）；エー・ジー・ホバネシアンおよびアイ・エム・ケ
ール、ヨーロッパ・ジャーナル・バイオケミストリー、
上記〕と、ホスホジエステラーゼ〔エー・シュミット
等、「tRNAの（2--5-）オリゴイソアデニレートおよびC
-C-A末端を減成するインターフェロン誘発されたホスホ
ジエステラーゼ」、プロシーディング・ナショナル・ア
カデミー、サイエンス・USA、第76巻、第4788〜4792頁
（1979）〕とである。 IFN−βとIFN−αとの両者は同様な酵素経路の引金に
なると思われ〔シー・バグルオニ、「抗ウィルス状態に
おけるインターフェロン誘発された酵素活性およびその
役割」、セル誌、第17巻、第255〜264頁（1979）〕、両
者は共通の活性核を共有する。何故なら、これら両者は
染色体21でコードされる細胞レセプタを識別するからで
ある〔エム・ウイラノウスカースチュワート、「インタ
ーフェロンに対する感受性におけるヒト染色体21の役
割」、ジャーナル・ゼネラル・バイロロジー、第37巻、
第629〜634頁（1977）〕。IFNで処理された細胞におけ
るこれら酵素の一種もしくはそれ以上の出現は、IFN様
活性を有する蛋白質の同定をさらに可能にする筈であ
る。 現在、HuIFN−βは、組織培養で生育されたヒト細胞
系により生産される。これは、低収率かつ高価な方法で
ある。一つの大生産業者は年間僅か40〜50×108単位の
粗IFN−βしか生産しない〔ヴィー・ジー・エディー
等、「ヒトインターフェロン；胎児繊維芽細胞培養物に
おける大規模生産」、ヒトインターフェロン（ダブリュ
・アール・スタインブリングおよびピー・ジェー・シヤ
プル編）、プレナム・パブリッシング社、第55〜60頁
（1978）〕。細孔調節されたガラスビーズへの吸着によ
り精製すれば、約106単位/mgの比活性を有するIFN−β
を粗細胞抽出物から50％収率で回収することができる
〔エー・ビリオー等、「臨床試験用のヒト繊維芽細胞イ
ンターフェロン：生産、部分精製および特性化」、アン
チミクロビアル・エージェント・アンド・ケモテラピ
ー、第49〜55頁（1979）〕。亜鉛キレートアフィニティ
クロマトグラフィーによれば、さらに約109単位/mgの比
活性までの精製が100％収率で達成される〔エー・ビリ
オー等、「ヒト繊維芽細胞インターフェロンの生産、精
製および性質」、アブストラクト、インターフェロンの
制御機能に関する会議、ニューヨーク、アカデミー・サ
イエンス、第29号（1979年10月23〜26日）〕。HuIFN−
βの比活性は極めて高いので、産業的使用に要する量は
少なくてすむ。例えば、100gの純IFN−βは300〜3000万
回の投与量を与えるであろう。 分子生物学における最近の進歩により、特異性非細菌
成熟核蛋白質をコードするDNAを細菌細胞中に導入する
ことが可能となった。一般に、化学合成により製造され
たもの以外のDNAによれば、この種の組替えDNA分子の製
造は、所望蛋白質に対する精製メッセンジャーRNA（mRN
A）鋳型の一本鎖DNAコピー（cDNA）を生成させ、このcD
NAを二本鎖DNAに変え、このDNAを適当なクローン化運搬
体における適当な部位に結合させて組替えDNA分子を形
成させかつこの組替えDNA分子により適当な宿主を形質
転換させるという工程からなっている。このような形質
転換は、宿主が所望蛋白質を生産するのを可能にする。
これらには、例えばIFN−α（エス・ナガタ等、「ヒト
白血球インターフェロン活性によるポリペプチドの大腸
菌における合成」、ネイチャー誌、第284巻、第316〜32
0頁（1980）〕が包含される。さらに、組替えDNA技術を
使用して、IFN−βをコードする遺伝子配列を含むとい
われるプラスミドが生産される〔ティー・タニグチ等、
「ヒト繊維芽細胞インターフェロン遺伝子配列を含む細
菌プラスミドの構造および同定」、プロシーディング・
ジャパン・アカデミー・シリーズＢ、第55巻、第464〜4
69頁（1979）〕。 しかしながら、上記のいずれにもIFN−βの実際の遺
伝子配列は記載されておらず、またいずれにもその配列
が標準IFN−βの初期アミノ酸配列またはアミノ酸組成
と比較されていない。前者の研究はIFN−αのみ、すな
わちIFN−βとは異なる化学的、生物学的かつ免疫学的
種類Ｉのインターフェロンのみに向けられている（上記
文献参照）。後者の報告はハイブリダイズのデータのみ
に基づいている。これらデータのみでは、IFN−βをコ
ードする完全もしくは実際の遺伝子配列を選択クローン
が有するかどうか、或いはクローン化遺伝子配列が細菌
におけるIFN−βを表現しうるかどうか決定することが
できない。ハイブリダイズは、卵母細胞中に注入された
際インターフェロン活性を誘起されるようなポリ（Ａ）
RNAのmRNA成分に対し、特定DNA挿入物が或る程度類似し
ておりかつ相補的であることのみを確定する。さらに、
類似性の程度は選別処理用に選択されたハイブリダイズ
条件に依存する。従って、ポリ（Ａ）RNAのmRNA成分に
対するハイブリダイズのみでは、選択DNA配列が、HuIFN
−βまたはHuIFN−βの免疫学的もしくは生物学的活性
を示すポリペプチドをコードする配列であるかどうか、
或いはこの配列が適当な宿主においてこの種のポリペプ
チドを生産するのに有用であるかどうか示されない。 1980年２月25日のチューリッヒでのゼミナールにおい
て、タニグチは、このハイブリダイズ用クローンの一つ
についてヌクレオチド配列を決定したと述べている。さ
らに彼は、この配列によりコードされた最初の13個のア
ミノ酸が、標準HuIFN−βにつきナイト等（上記）によ
り決定されたものと同一であった、と述べている。タニ
グチは彼のクローンにつき完全なヌクレオチド配列を開
示せず、或いはそのアミノ酸組成を標準HuIFN−βにつ
き決定されたものと比較しなかった。その後、タニグチ
はそのハイブリダイズ用クローンについての完全なヌク
レオチド配列を報告している〔ティー・タニグチ等、ジ
ーン誌、第10巻、第11〜15頁（1980）〕。この配列は、
本出願の優先権を主張した1980年４月３日出願の英国特
許出願第8011306号に記載されたものとは、一つのヌク
レオチドにおいて相違している。タニグチにより報告さ
れたアミノ酸配列は、上記出願に記載されたものと同一
である。また、タニグチは適当な宿主における次のよう
なポリペプチドの発現をも報告していない。すなわち、
このポリペプチドは、本出願の優先権を主張した1980年
６月６日出願の英国特許出願第80.18701号の出願時にお
いてHuIFN−βの免疫学的もしくは生物学的活性を示し
たものである。HuIFN−βの免疫学的もしくは生物学的
活性を示すポリペプチドの宿主におけるこの発現、なら
びにその方法、ポリペプチド、遺伝子および組替えDNA
分子が本発明の特徴である。 また、本発明は、IFN遺伝子をクローン化させようと
せずに純粋またはほぼ純粋なIFN−α mRNAを調製したり
或いは細菌宿主において繊維芽細胞インターフェロン様
ポリペプチドを生産させるという、研究報告第18309
号、第361〜362頁（1979）の明白な示唆とは異なるもの
である。 最後に、DNA配列の選択、または卵母細胞においてHuI
FN活性をもたらすようなポリ（Ａ）RNAからのmRNAにハ
イブリダイズする組替えDNA分子の調製は、DNA配列また
は組替えDNA分子のハイブリダイズ挿入物がHuIFNに相当
することを示すには充分でないことを認めるべきであ
る。寧ろ、特定DNA配列によりコードされるアミノ酸配
列と標準蛋白質のアミノ酸配列との比較が存在しない場
合、HuIFNの免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリ
ペプチドの生産のみが、選択DNA配列または構成組替えD
NA分子がHuIFNに相当することを実際に証明しうる。さ
らに重要なことに、この種のHuIFN活性の後にのみ、DNA
配列、組替えDNA分子またはそれに関連する配列を有益
に用いて、本発明によりHuIFNに相当する他の配列を選
択することができ、或いはHuIFN−βの免疫学的または
生物学的活性を有する物質を発現しうる組替えDNA分子
を生成させることができる。 従って、組替えDNA技術を使用してHuIFN−βを生産す
る問題は上記した方法のいずれとも極めて異なること
が、上記から判るであろう。ここでは、未知構造の特定
DNA配列（適当な宿主においてHuIFN−βの発現をコード
する）を、極めて複雑なDNA配列の混合物において見出
しかつそこから分離してこれをHuIFN−βの生産に使用
せねばならない。さらに、この位置決定および分離の問
題は、複合混合物において所望DNA配列の著しい低濃度
が予想されることおよび所望配列を選択しかつ分離する
ため混合物の多くのDNA配列を迅速分析する有効手段が
ないことにより悪化される。 本発明は、適当な宿主においてHuIFN−βの発現をコ
ードするDNA配列を位置決定しかつ分離しそれによりDNA
配列と、組替えDNA分子と、宿主を形質転換させてヒト
繊維芽細胞インターフェロンの免疫学的もしくは生物学
的活性を示すポリペプチドを生産する方法とを提供する
ことにより、上記の問題を解決する。 本発明により、抗ウィルス剤、抗腫瘍または抗癌剤お
よび方法に使用するためのHuIFN−βの免疫学的もしく
は生物学的活性を示すポリペプチドを得ることができ
る。本発明は、従来不可能であった量および方法でこれ
らポリペプチドの生産を可能にする。 以下の開示から判るように、本発明のDNA配列および
組替えDNA分子は、HuIFN−βの免疫学的もしくは生物学
的活性を示すポリペプチドの、適当な宿主における生産
を方向付けることができる。適当な宿主におけるこれら
DNA配列と組替えDNA分子との複製は、これらポリペプチ
ドをコードする遺伝子を多量に生産することを可能にす
る。これらポリペプチドおよび遺伝子の分子構造および
性質は容易に決定することができる。ポリペプチドおよ
び遺伝子は、宿主で生産されたまま或いは適当な誘導化
もしくは改変の後、組成物中におよびこれら生成物自身
の生産を検知かつ改善する方法に使用することができ、
かつ抗ウィルス剤および抗腫瘍もしくは抗癌剤および免
疫調節方法に使用することができる。 従って、この方法は、上記の従来方法とは異なり、DN
A配列と、HuIFN−βの免疫学的もしくは生物学的活性を
示す少なくとも一種のポリペプチドをコードする適当な
DNA配列を含んだ組替えDNA分子との調整および選択を含
む点において、上記従来方法と区別できる。 上記から判るように、本発明の基本的局面はHuIFN−
βの免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチド
をコードすることを特徴としかつG-pHFIF−１、Ｇ−pHF
IF−３、Ｇ−pHFIF−６、Ｇ−pHFIF−７、Ｇ−pPLa−HF
IF−67−12、Ｇ−pPLa−HFIF−67−12Δ19、Ｇ−pPLa−
HFIF−67−８、Ｇ−pPLa−HFIF−67−12Δ279T、Ｇ−pP
La−HFIF−67−12Δ218M1、Ｇ−pPLa−HFIF−67−12ΔM
1、Ｇ−pPLa−HFIF−67−12Δ19BX−２のDNA挿入物と、
これらDNA挿入物のいずれかにハイブリダイズするDNA配
列と、これらDNA配列もしくは挿入物のいずれかに対し
単一もしくは多重のベース置換、削除、挿入および転位
を含め突然変異に関連して得られる天然、合成もしくは
半合成の起源を包含するあらゆる起源からのDNA配列
と、前記DNA配列のいずれかのコドンの発現においてコ
ードされるポリペプチドに類似した免疫学的もしくは生
物学的活性を発現においてコードするコドンの配列から
なるDNA配列とよりなる群から選択されることを特徴と
するDNA配列を提供することである。本発明の配列は宿
主においてHuIFN−βおよびHuIFN−β様ポリペプチドの
生産を可能にすることをさらに特徴とする。 ここに記載した本発明をより充分に理解するため、以
下詳細に説明する。 本明細書中において、次の用語を使用する。 ヌクレオチド：糖成分（ペントース）とリン酸塩と含
窒素複素環塩基とからなるDNAもしくはRNAの単量体単
位。塩基は、グリコシド炭素（ペントースの1-炭素）を
介して糖成分に結合し、塩基と糖との結合はヌクレオチ
ドと呼ばれる。各ヌクレオチドはその塩基を特徴とす
る。４種のDNA塩基はアデニン（“A"）、グアニン
（“G"）、シトシン（“C"）およびチミン（“T"）であ
る。４種のRNA塩基は、A,G,Cおよびウラシル（“U"）で
ある。 DNA配列：隣接ペントースの3-炭素と5-炭素との間の
ホスホジエステル結合により互いに結合されたヌクレオ
チドの線状列。 コドン:mRNAを介してアミノ酸と翻訳開始シグナルと
翻訳終了シグナルとをコードする３種のヌクレオチド
（トリプレット）のDNA配列。例えばヌクレオチドトリ
プレットTTA,TTG,CTT,CTC,CTAおよびCTGはアミノ酸ロイ
シン（“Leu"）をコードし、TAG,TAAおよびTGAは翻訳停
止シグナルであり、ATGは翻訳開始シグナルである。 リーディングフレーム：アミノ酸配列までmRNAを翻訳
する際のコドンのグループ化。翻訳の際、適切なリーデ
ィングフレームを維持せねばならない。例えば、配列 GCTGGTTGTAAGは３つのリーディングフレームすなわち相
において表現することができ、その各々は異なるアミノ
酸配列 GCT GGT TGT AAG−−Ala−Gly−Cys−Lys G CTG GTT GTA AG−−Leu−Val−Val GC TGG TTG TAA G−−Trp−Leu−（停止） を与える。 ポリペプチド：隣接するアミノ酸のα‐アミノ基とカ
ルボキシル基との間のペプチド結合により互いに結合さ
れたアミノ酸の線状列。 ゲノム：細胞もしくはウィルスの全DNA。これは、特
に物質のポリペプチドをコードする構造遺伝子、ならび
にオペレータ、プロモータおよびリボソーム結合ならび
に例えばシャイン‐ダルガルノ配列のような配列を含め
て相互作用配列を包含する。 構造遺伝子：鋳型もしくはメッセンジャーRNA（“mRN
A"）を介して、特定ポリペプチドに特徴的なアミノ酸の
配列をコードするDNA配列。 転写：構造遺伝子からmRNAを生成する過程。 翻訳:mRNAからポリペプチドを生成する過程。 発現：ポリペプチドを生産するための構造遺伝子によ
り受ける過程。これは、転写と翻訳との組合せである。 プラスミド：完全「レプリコン」からなる非染色体二
本鎖DNA配列であり、これによりプラスミドは宿主細胞
内で複製される。プラスミドを単細胞微生物に入れる
と、その生物の特性がプラスミドのDNAの結果として変
化または形質転換する。例えば、テトラサイクリン耐性
（TetR）についての遺伝子を担持するプラスミドは従前
テトラサイクリンに感受性であった細胞をこれに対し抵
抗性の細胞に形質転換させる。プラスミドにより形質転
換された細胞を「トランスホーマント」と呼ぶ。 ファージまたはバクテリオファージ：細菌性ウィルス
であり、その多くは蛋白質エンベロプもしくはコート
（「カプシド」）中にカプセル化されたDNA配列からな
っている。 クローン化運搬体（cloning vehicle）：宿主細胞中
で複製しうるプラスミド、ファージDNAまたはその他のD
NA配列であり、これは一個または小数のエンドヌクレア
ーゼ認識部位を特徴とし、この部位においてこのDNA配
列はDNAの本質的な生物学的機能（例えば複製）、コー
ト蛋白質の生成の喪失またはプロモータもしくは結合部
位の喪失を伴わずに決定可能に切断され、またこの部位
は形質転換細胞の同定（例えばテトラサイクリン耐性ま
たはアンピシリン耐性）に使用するのに適するマーカー
を含有する。クローン化運搬体はしばしばベクタ（Vect
or）と呼ばれる。 クローン化：微生物またはDNA配列の集団を得る過程
であって、無性増殖によりこの種の一種の微生物または
配列から得られる。 組替えDNA分子またはハイブリッドDNA:生体細胞の外
部で末端−末端結合されかつ宿主細胞に感染してそこに
維持される能力を有する、異なるゲノムからのDNA断片
よりなる分子。 発現制御配列：構造遺伝子と作用結合した場合これら
遺伝子の発現を制御および調整するヌクレオチドの配
列。それらには、lac系、trp系、ファージλの主要オペ
レータおよびプロモータ領域、fdコート蛋白質の制御領
域ならびに原核もしくは真核細胞およびウィルスの遺伝
子の発現を制御することが知られたその他の配列が包含
される。 第１図について述べれば、これは組替えDNA分子の混
合物の製造方法における一実施態様の概略図であり、こ
こで組替えDNA分子の幾つかは本発明の特徴である挿入D
NA配列を含んでいる。 ヒト繊維芽細胞インターフェロンmRNA（IFN−β mRNA）
を含有するポリ（Ａ）RNAの調整 本発明に使用するRNAはヒトVGS細胞、すなわち単層培
養物中に37℃にて増殖しうる二倍体繊維芽細胞系から抽
出した。IFN−βは、シクロヘキシミドの存在下にポリ
（I,C）により誘発させると、これら細胞中に生産され
る。 典型的なRNA単離には、融合性単層における二倍体VGS
細胞の20個の転動壜をそれぞれ100単位/mlのIFN−βに
より一晩「プライミング（prime）」し、かつ培養物を1
00μg/mlのポリ（I,C）および50μg/mlのシクロヘキシ
ミドにより１時間誘発させ、そしてシクロヘキシミド
（50μg/ml）と共に４時間培養し、リン酸塩緩衝液中に
掻き入れて回収し、遠心分離した。細胞を０℃で15分間
溶解させて、DNAを含有する完全核を取り出しかつこれ
を低張緩衝液〔10mMのトリス−Hcl（pH7.4）、10mMのNa
clおよび1.5mMのMgCl2〕中に懸濁させ、NP40を１％まで
加えることにより細胞質RNAを単離した。ソルバールSS
−34型ロータ中で3000rpmにて５分間ペレット化させる
ことにより核を除去した。ドデシル硫酸ナトリウム
（「SDS」）とEDTAとを上澄液にそれぞれ１％および10m
Mまで加え、混合物を２倍容量の1:1の再蒸留フェノール
およびクロロホルム−イソアミルアルコール（25:1）に
より５回抽出し、RNAを含有する水相を各抽出後にソル
バールSS−34型ロータで8000rpmにて10分間遠心分離す
ることにより分離した。1/10容量の2M酢酸ナトリウム
（pH5.1）と2.5容量のエタノールとを加えてRNAを水相
から沈澱させた。通常、転動壜１本当り60〜90μｇの全
細胞質RNAが得られた。 細胞質RNAを抽出するため、他の方法も使用されてい
る。例えば、細胞を0.2Mのトリス−Hcl（pH9.0）と50mM
のNaClと20mMのEDTAと0.5％のSDSとの中でホモジナイズ
した後完全に溶解させそして上記のようにフェノール−
クロロホルムにより抽出した〔エフ・エッチ・レイノル
ズ等、「無細胞リボソーム系およびキセノプス（Xenopu
s）卵母細胞においてヒトインターフェロンメッセンジ
ャRNAの翻訳により生成されるインターフェロン活
性」、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サ
イエンス・USA、第72巻、第4881〜87頁（1975）〕、或
いは洗浄された細胞を0.1MのNaClと0.01Mのトリス−HCl
（pH7.5）と0.001MのEDTAとの400μｌ（「NTE緩衝
液」）に懸濁させ、20mMの酢酸ナトリウム中4Mのグアニ
ジニウムイソチオシアネートと1Mのβ−メルカプトエタ
ノールとの2.5ml（pH5.0）を加えて、細胞をホモジナイ
ズした。溶解物をベックマンSW−60型Tiニトロセルロー
ス管中の1.3mlの5.7MCsClクッション上に上層し、39000
にて17時間遠心分離してRNAをペレット化させかつこれ
をDNA、蛋白質および脂質から分離しそしてRNAをフェノ
ール−クロロホルムで１回抽出した〔ジェー・モルサー
等、「ヒトリンパ芽細胞からのインターフェロンメッセ
ンジャーRNAの特性化」、ジャーナル・ゼネラル・バイ
ロロジー、第44巻、第231〜234頁（1979）〕。 全RNAを、キセノプス・レビス（Xenopus laevis）卵
母細胞の細胞質中に注入することによりIFN−β mRNAの
存在につき分析すると共に、そこに誘発されたIFN−β
活性を測定した〔レイノルズ等、上記〕。RNAを水中に
溶解させかつ約50nlを各卵母細胞中に注入することによ
り分析を行なった。卵母細胞をバース培地中で室温にて
一晩培養し〔ジェー・ガードン、ジャーナル・エンブリ
オロジー・エキスペリメンタル・モーホロジー、第20
巻、第401〜414頁（1968）〕、培地の一部においてホモ
ジナイズし、残渣を遠心分離により除去しそして上澄液
のIFN−β活性を測定した。IFN−β活性の検出を、ウィ
ルス誘発された細胞病理学的作用の減少により行なった
〔ダブリュ・イー・スチュワートおよびエス・イー・ス
ルキン、「狂犬病ウィルスを実験感染させたハムスター
におけるインターフェロン生産」、Proc.Soc.Exp.Biol.
Med.、第123巻、第650〜653頁（1966）〕。試験ウィル
スは水泡性口内炎ウィルス（インジアナ株）であり、細
胞は染色体21に対しトリソミーのヒト二倍体繊維芽細胞
であってより高いIFN−β感受性を与えたものであっ
た。IFN−β活性は、IFN比較標準69/19に対比して表わ
される。 IFN−β mRNAを含有するポリ（Ａ）RNAを、0.4MのNaC
lと10mMのトリス−HCl（pH7.8）と10mMのEDTAと0.2％の
SDSとにおけるオリゴ（dT）−セルロース（型7;P−Ｌバ
イオケミカルス社）に室温にて10分間吸着させることに
より細胞質RNAから単離した。吸着前に70℃にて２分間R
NAを加熱することにより、RNA凝集を最小にした。セル
ロースを上記の緩衝液で洗浄した後、ポリ（Ａ）RNAフ
ラクションを10mMのトリス−HCl（pH7.8）と1mMのEDTA
と0.2％のSDSとで溶出させた。これは、通常、260nmに
おける光学密度法により測定して全RNAの４〜５％から
なっていた。 IFN−β mRNAにおけるポリ（Ａ）RNAを集積させるた
めの精製はホルムアミド−ショ糖濃度勾配によって行な
った〔ティー・ポーソン等、「無細胞翻訳において活性
のラウス家鶏肉腫ウィルスmRNAの大きさ」ネイチャー
誌、第268巻、第416〜420頁（1977）〕。これら濃度勾
配は、未変性ショ糖濃度勾配よりもずっと高い分離能を
与えた。通常、約80μｇのポリ（Ａ）RNAを50％ホルム
アミドと100mMのLiClと5mMのEDTAと0.2％のSDSと10mMの
トリス−HCl（pH7.4）との中に溶解させ、37℃にて２分
間加熱して凝集を防止しそしてベックマンSW−60型Tiポ
リアロマー管中に５〜20％ショ糖濃度勾配にて充填し
た。ベックマンSW−60型Tiロータ中にて、サイズマーカ
として役立つ全てC14−ラベルされた真核細胞RNAと共に
20℃かつ60000rpmで4.5時間遠心分離した後、濃度勾配
を分別して各フラクションの光学密度を測定した。全て
のRNAフラクションを0.5MのNaClと2.5容量のエタノール
とで２回沈澱させそして上記したようにインターフェロ
ンmRNA活性につき分析した。これらの精製処理はポリ
（Ａ）RNAのINF−β mRNA含量における約40倍の集積化
をもたらした。 代案として、オリゴ（dT）−吸着されたmRNA（60μ
ｇ）を、7Mの尿素と0.1％のSDSと50mMのトリス−ホウ酸
塩（pH8.3）と1mMのEDTAとにおける４％ポリアクリルア
ミドゲルでの電気泳動により分別し、この場合mRNAをこ
の緩衝液中に溶解させ、ゲルに施す前に55℃にて１分間
加熱した。電気泳動後、幅2mmの断片をゲルから切り取
り、RNAを各ホモジナイズしたゲル断片から溶出させ、
さらにオリゴ（dT）−セルロースへの吸着により不純物
を除去して上記のようにIFN−β mRNAにつき分析した。 この時点において、ホルムアミド−ショ糖勾配および
ポリアクリルアミドゲル分別から得られたポリ（Ａ）RN
A生成物でさえ極めて多数の異なるmRNAを含有すること
を認めるべきである。IFN−βに対して特異的なmRNAを
除き、他のmRNAは望ましくない汚染物である（第１
図）。不都合なことに、これら汚染RNAは、本発明の残
余のクローン化過程全体においてHuIFN−β mRNAと同様
に挙動する。従って、ポリ（Ａ）RNA中にそれらが存在
すると、IFN−β以外のポリペプチドをコードする遺伝
子を含有する多数の望ましくない細菌クローンの最終的
調製物が生ずる。この汚染は所望のIFN−βハイブリッ
ドクローンの単離において複雑な選別問題を提起する。 IFN−βの場合、この選別問題は、所望クローンを同
定するための選別試料として作用するHuIFN−β mRNAま
たはDNAもしくはその一部の精製試料が充分存在しない
ためさらに悪化する。従って、IFN−βクローンの選別
過程は極めて時間がかかりかつ困難となる。さらに、極
めて少割合のIFN−βクローンしか生物学的活性型また
は免疫学的活性型においてIFN−βを発現することが期
待されないので、活性クローンの単離はわら山から針を
探すような選別過程になる。 有利なことに、本発明は組替えDNA技術を用いて、HuI
FN−β mRNAまたはcDNAもしくはその一部の精製試料を
得ることができる。この精製mRNAまたはcDNAを使用して
極めて多数の細菌クローンを迅速に選別しかつそれによ
り活性型でIFN−βを発現するクローンを単離する確率
が著しく増大する。 IFN−βcDNAを含有する二本鎖cDNAの合成 IFN−β mRNAに豊んだポリ（Ａ）RNAを鋳型として使
用し、アール・デボス等により実質的に記載された相補
的DNA（「cDNA」）を調製し〔「バクテリオファージMS2
RNAのほぼ完全寸法DNAコピーを含有するプラスミドの
生成および特性化」、ジャーナル・モレキュラー・バイ
オロジー、第128巻、第595〜619頁（1979）〕、バクテ
リオファージMS2RNAのDNAコピーを含有するプラスミド
を作成した。 単一鎖cDNAは、鳥類骨髄芽球腫症ウィルス（「AM
V」）逆転写酵素〔ジェー・ビアド博士から寄贈、ライ
フ・サイエンス、ガルフポート、フロリダ〕からのRNA
依存性DNAポリメラーゼ（25単位）によりポリ（Ａ）RNA
から調製し、これはRNAのポリ（Ａ）末端にハイブリダ
イズさせた（dT）10プライマ（６μｇ、マイルズ社）に
より50mMのトリス−HCl（pH8.3）と10mMのMgCl2と30mM
のβ−メルカプトエタノールと4mMのNa4P2O7と2.5μg/
μｌの不活性化子牛血清アルブミンとそれぞれ0.5mMのd
TTPとdATPとdCTPとdGTPとα−P32−dATP（20μCi、アム
ステルダム）との50μｌ中にて開始させた。41℃にて30
分間後、EDTAを10mMまで添加して反応を終了させ、反応
混合物を等容量のフェノール：クロロホルム：イソアミ
ルアルコール（25:24:1）にて抽出し、水相をセファデ
ィックスG50カラムに上層し、そしてTE緩衝液〔10mMの
トリス−HCl（pH7.5）、1mM EDTA〕で溶出させた。放射
活性を示すボイドフラクションを10μｇの大腸菌トラン
スファーRNAと0.2Mまでの酢酸カリウム（pH5.1）と2.5
容量のエタノールとの添加により沈澱させた。 実際上、上記のように合成したcDNA集団は、濃化した
ポリ（Ａ）mRNA中に存在した異なるmRNAから生ずる複雑
なcDNA混合物である（第１図）。さらに、AMV逆転写酵
素による不完全な終了のため、cDNAの多くはポリ（Ａ）
RNAにおける各種mRNAの不完全コピーである（第１図に
図示せず）。 cDNA二本鎖にする前に、これをエタノールによる沈澱
およびTE緩衝液〔10mMのトリス−HCl（pH7.5）、1mMのE
DTA〕中におけるリボヌクレアーゼT1（10単位、三共株
式会社）および10μｌまでの膵臓リボヌクレアーゼＡ
（10μｇ、シグマ社）との37℃にて30分間にわたる培養
により、結合体から相補的鋳型RNAまで取り除いた（リ
ボヌクレアーゼは単一鎖特異的エンド−およびエキソ−
デオキシリボヌクレアーゼを含有しない）。アルカリに
よらずにリボヌクレアーゼによる鋳型鎖の除去は、アル
カリ触媒脱アミノ化によるcDNAの突然変異を回避する。 cDNA鎖は、DNAポリメラーゼＩにより二本鎖にするこ
とができる〔エー・エフストラチアジス等、「グロビン
遺伝子の酵素的試験管内合成」、セル誌、第７巻、第27
9〜288頁（1976）〕。上記からの10μｌのリボヌクレア
ーゼ/cDNA混合物を、10mMまでのMgCl2と10mMまでのDTT
と100mMまでのリン酸カリウム（pH6.9）と各0.3mMまで
のdATP、dCTP、dTTPおよびdGTPとα−P32−dATP（20μC
i、アメルシヤム社）とDNAポリメラーゼＩ（40単位、バ
イオラブス社）とにより20μｌまで希釈した。15℃にて
６時間後、10mMまでのEDTAと0.1％までのSDSとを加え、
抽出（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコー
ル）とクロマトグラフィー（セファデックスG50）とボ
イドフラクションの沈澱とにより上記のように二本鎖cD
NAを単離した。 二本鎖cDNA構造上に残存する単一鎖へアピン環を開く
ため、沈澱cDNAを0.2MのNaClと50mMの酢酸ナトリウム
（pH4.5）と10mMの酢酸亜鉛と２μｇの熱変性子牛胸腺D
NAとの100μｌに溶解させ、S1ヌクレアーゼ（５単位、
シグマ社）と37℃にて30分間反応させた。10mMまでのED
TAの添加と、フェノール：クロロホルム：イソアミルア
ルコールによる抽出と、キヤリヤとしての10μｇの大腸
菌トランスファーRNA、0.2Mの酢酸ナトリウム（pH5.1）
および2.5容量のエタノールの添加による水相からの沈
澱とは、平滑末端（blunt-ended）二本鎖cDNA混合物を
もたらした。この混合物は、調製用に鋳型として使用し
たポリ（Ａ）RNAの不均質性（第１図）およびAMV逆転写
酵素によるcDNA転写の不完全停止（第１図に図示せず）
の結果として、不均質となる。 後者の不均質性の効果を少なくするため、二本鎖cDNA
を、50mMのトリス−ホウ酸塩緩衝液（pH8.3）と1mMのED
TAとにおける４％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳
動によりサイズ決定し、この際5-−P32−ラベルした制
限断片〔φ×174（RF）−DNA〕をサイズマーカとして使
用した。適当なサイズのDNAバンド（例えば、サイズ種
類800〜900bp、700〜800bp、650〜700bpおよび550〜650
bp）を選択した。ポリアミドゲル電気泳動されたポリ
（Ａ）RNAから調製した二本鎖cDNAは約850bpに顕著なバ
ンドを示し、このバンドは完全長さのDNAを示すと思わ
れた。これらバンドを、0.5Mの酢酸アンモニウムと0.1
％のSDSとの中でゲルを破砕しかつ一晩撹拌することに
より溶出させた。遠心分離により残渣を除去した後、DN
Aをヒドロキシアパタイト粉末に吸着させ、5mMリン酸ナ
トリウム（pH7.5）によりセファデックスG50カラムに充
填し、緩衝液により充分に洗浄し、0.45Mのリン酸ナト
リウム（pH7.5）により溶出させ、そしてセファデック
スG50マトリックスの分子節作用により直ちに脱塩し
た。溶出DNAを含有するフラクションを、10μｇの大腸
菌トランスファーRNAと0.2Mまでの酢酸ナトリウムと2.5
容量のエタノールとの添加により、P32−放射能で監視
しながら沈澱させた。 上記したcDNA調製の効率を典型的な実験により例示す
るが、ここでホルムアミド−ショ糖密度勾配後の約２μ
ｇのポリ（Ａ）RNAは800〜900bpの範囲のサイズを有す
る約16ngの二本鎖cDNAを生成した。 ここでも、この二本鎖cDNAは多数のcDNAの混合物であ
り、その極く小数のみがHuIFN−β cDNAであることを認
めねばならない（第１図）。 二本鎖DNAのクローン化 多種類の宿主／クローン化運搬体の組合せ物を使用し
て、本発明により調製された二本鎖cDNAをクローン化さ
せた。例えば、有用なクローン化運搬体は、染色体、非
染色体および合成DNA配列の断片、例えば各種公知のSV4
0の誘導体および公知の細菌プラスミド、例えばcolE1、
pCR1、pBB322、pMB9およびそれらの誘導体を含む大腸菌
（イー・コリ）からのプラスミド、広範囲の宿主のプラ
スミド、例えばRP4、ファージDNA、例えばファージλの
多数の誘導体、例えばNM989およびその他のDNAファー
ジ、例えばM13およびフィラメント状一本鎖DNAファージ
ならびにプラスミドとファージDNAとの組合せから生じ
たベクタ、例えばファージDNAもしくは他の発現制御配
列を用いて改変させたプラスミドまたは酵母プラスミ
ド、例えば２μプラスミドもしくはその誘導体から構成
することができる。有用な宿主は細菌宿主、例えば大腸
菌の菌株、例えばイー・コリHB101、イー・コリX1776、
イー・コリX2282、イー・コリMRCIおよびシュードモナ
ス（Pseudomonas）、枯草菌（Bacillus subtilis）高熱
菌（Bacillus stearothermophilus）およびその他バシ
ルスの菌株、酵母およびその他の真菌類、動物もしくは
植物宿主、例えば動物（人間を含む）もしくは培養した
植物細胞またはその他の宿主を包含する。勿論、必ずし
も全ての宿主／ベクタ組合せ物が同等に有効ではない。
宿主／クローン化運搬体組合せの特定の選択は、示した
原理を適当に考慮して当業者により、本発明の範囲を逸
脱することなく行なうことができる。 さらに、各特定クローン化運搬体内において、種々の
部位を選択して二本鎖DNAを挿入することもできる。こ
れらの部位は通常、これらを切断する制限エンドヌクレ
アーゼにより命名することができる。例えば、pBR22に
おいてPstＩ部位は、β−ラクタマーゼ用の遺伝子にお
いて、その蛋白質のアミノ酸181および182をコードする
ヌクレオチドトリプレットの間に位置する。この部位
は、最初に、IFN−αの免疫学的もしくは生物学的活性
を示すポリペプチドの合成において、エス・ナガタ等
（上記）により使用されたものである。２つのHindIIエ
ンドヌクレアーゼ認識部位の一方はアミノ酸101および1
02をコードするトリプレットの間に存在し、また数個の
Taq部位の一つはpBR322におけるβ−ラクタマーゼのア
ミノ酸45をコードするトリプレットに存在する。同様
に、このプラスミドにおけるEcoRI部位およびPvuII部位
は、コード域の外部に存在し、EcoRI部位はそれぞれテ
トラサイクリンおよびアンピシリン耐性をコードする遺
伝子の間に位置する。この部位は、ティー・タニグチ等
（上記）により、組替え合成法において使用された。こ
れらの部位は当業者により充分認識されている。勿論、
本発明に有用なクローン化運搬体は、選択DNA断片を挿
入するための制限エンドヌクレアーゼ部位を有する必要
のないことを理解すべきである。寧ろ、運搬体は別の手
段により断片に結合させうるであろう。 ベクタすなわちクローン化運搬体および特に選択DNA
断片を結合させて組替えDNA分子を生成させるためそこ
に選択される部位は種々の要因例えば特定制限酵素に対
し感受性の部位の数、発現すべき蛋白質の大きさ、宿主
細胞酵素により蛋白質分解を受ける所望蛋白質の感受
性、精製の際除去困難な宿主細胞蛋白質により発現すべ
き蛋白質の汚染もしくは結合、例えばベクタ配列に関す
る開始および停止コドンの位置のような発現特性ならび
に当業者により認められるその他の要因のような各種の
要因により決定される。ベクタおよび特定遺伝子用の挿
入部位の選択は、これら要因のバランスにより決定さ
れ、必ずしも全ての選択が一定の場合に対し同等に有効
であるとは限らない。 外来DNAをクローン化運搬体すなわちベクタ中に挿入
して組替えDNA分子を生成させるには幾つかの方法が当
分野で知られているが、本発明による初期クローン化に
好ましい方法は、プラスミド（特にpBR322）を挿入用に
選択された部位（特にPstＩ）に特異的な制限酵素によ
り消化させそしてdA末端を末端トランスフェラーゼによ
り3-末端に付加させることである。同様に、二本鎖cDNA
は、dT末端を切断プラスミドに対する結合を可能にする
3-末端に付加させて伸長される。次いで切断プラスミド
とcDNAとをアニールして、プラスミドの適当な部位にcD
NAを挿入すると共にバイブリッドDNAを環化させ、末端
の相補的性質はそれらの凝集を可能にする（第１図）。
かくして生じた組替えDNA分子は、選択PstＩ制限部位に
挿入遺伝子を有する（第１図）。挿入用のdA-dT末端化
のこの方法は、ディー・エー・ジャクソン等〔「新規な
遺伝情報を猿ウィルス40のDNAに挿入する生化学的方
法：大腸菌のλファージ遺伝子とガラクトースオペレー
タとを含有する環状SV40DNA分子」、プロシーディング
・ナショナル・アカデミー・サイエンス・USA、第69
巻、第2904〜2909頁（1972）〕およびアール・デボス等
（上記）により記載されている。これは、dG-dC末端化
より約３倍多い組替えDNAプラスミドをもたらす。 勿論、DNA配列をクローン化運搬体中に挿入して組替
えDNA分子を生成させるその他の公知方法も、同様に本
発明において有用である。これらは、例えばdG-dC末端
化、直接的連結、合成リンカー、エキソヌクレアーゼお
よびポリメラーゼ結合修復反応に続く連結、或いはDNA
ポリメラーゼと適当な一本鎖鋳型とによるDNA鎖の伸長
に続く連結を包含する。 勿論、クローン化運搬体の選択位置に挿入されたヌク
レオチド配列またはcDNA断片は、所望ポリペプチド用の
実際の構造遺伝子の一部でないヌクレオチドも包含する
ことができ、或いは所望蛋白質用の完全構造遺伝子の断
片のみも包含することもできることを了解すべきであ
る。何らかのDNA配列が挿入されて形質転換した宿主がH
uIFN−βの生物学的もしくは免疫学的活性を有するポリ
ペプチドを生産すること、或いはHuIFN−βの免疫学的
もしくは生物学的活性を有するポリペプチドの生産に有
用なDNA配列を含んだクローンを選択するためDNA配列自
身がハイブリダイズ試料として使用できることのみが必
要とされる。 外来遺伝子を含有するクローン化運搬体すなわちベク
タを使用して、ハイブリッド遺伝子によりコードされる
HuIFN−βの免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリ
ペプチドを宿主が発現しうるよう、この宿主を形質転換
させる。適当な宿主の選択も、当分野で知られた多くの
要因により管理される。これら要因には、例えば選択ベ
クタとの適合性、バイブリッドプラスミドによりコード
される蛋白質の毒性、所望蛋白質の回収の容易さ、発現
特性、生物安全性および価格が包含される。これら要因
をバランスさせるには、必ずしも全ての宿主が特定の組
替えDNA分子を発現するのに同等に有効でないと云う理
解を考慮せねばならない。 この合成において、好適な初期クローン化運搬体は細
菌性プラスミドpBR322であり、好適な初期制限エンドヌ
クレアーゼ部位はPstＩ部位である（第１図）。このプ
ラスミドは、抗生物質アンピシリン（Amp）およびテト
ラサイクリン（Tet）に対する耐性遺伝子を有する小型
（分子量約2.6メガダルトン）のプラスミドである。プ
ラスミドは完全に特性化されている〔エフ・ボリバール
等、「新規クローン化運搬体IIの構成および特性化。多
目的クローン化システム」、ジーン誌、第95〜113頁（1
977）；ジェー・ジー・サットクリッフ、「DNA配列から
生ずるpBR322制限地図:4361ヌクレオチド対の長さまで
の正確なDNAサイズマーカ」、ヌクレイック・アシッド
・リサーチ、第５巻、第2721〜2728頁（1978）；ジェー
・ジー・サットクリフ、「大腸菌プラスミドpBR322の全
ヌクレオチド配列」、コールド・スプリング・ハーバー
・シンポジウム、第43巻、Ｉ、第77〜90頁（1978）〕。
この部位におけるDNA生産物の挿入は多数の細菌クロー
ンを与え、その各々は予め調製されたcDNA生産物に存在
するDNA遺伝子もしくはその断片の一つを含有する。こ
こでも、これらクローンの極く小数のみがIFN−βもし
くはその断片用の遺伝子を含有し（第１図）、それらの
いずれもIFN−βの免疫学的もしくは生物学的活性を示
すポリペプチドの発現を可能にしない。本発明における
好適な初期宿主はイー・コリHB101である。 1.PstI−開裂され、dA−伸長されたpBR322の調製 プラスミドpBR322を、10mMのトリス−HCl（pH7.6）と
7mMのMgCl2の7mMの２−メルカプトエタノールとの中でP
stIエンドヌクレアーゼ（ニューイングランド・ビオラ
ブス社）により37℃にて完全に消化した。この混合物を
１容量のフェノールと10容量のエタノールとで抽出しそ
して2.5容量のエタノール:0.2モル酢酸ナトリウム溶液
で沈澱させた。 末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Td
T）〔エル・チャングおよびエフ・ジェー・ボルム、
「子牛胸腺のデオキシヌクレオチド重合酵素」、ジャー
ナル・バイオロジカル・ケミストリー、第246巻、第909
〜916頁（1971）に従って精製〕によるホモポリマーdA
末端（第１図）の付加を、0.14Mのカコジル酸カリウム
と30mMのトリス−HCl（pH6.8）と1mMのCoSO4と0.2μg/
μｌの熱失活牛血清アルブミンと0.8mMのDTTと0.2mMのd
ATPと若干のα−P32−dATPとを含有する50μｌの反応容
量において行なった。37℃にて５分間培養した後、EDTA
を10mMまで加えかつSDSを0.1％まで加え、混合物をフェ
ノールで抽出しそしてTE緩衝液にセファデックスG50上
でクロマトグラフにかけた。線状化しかつ伸長したpBR3
22を含有するボイドフラクションを、10mMのトリス−HC
l（pH7.8）と1mMのEDTAと0.4MのNaClとにおいてオリゴ
（dT）セルロースに吸着させることによりさらに精製し
た。充分洗浄した後、所望のフラクションを10mMのトリ
ス−HCl（pH7.8）と1mMのEDTAとで溶出させた。 2.dT−伸長したDNAの調製 二本鎖DNAを、pBR322のdA末端化について上記したと
同様にdTMP残基により伸長させたが、ただしdATPとα−
P32−ATPの代りにdTTPと若干のH3−dTTPとを使用した。
勿論、オリゴ（dT）セルロース上の精製は省略した。上
記と同様、dT−伸長したDNAは種々異なる種類の混合物
であり、そのうち極く僅かのみがHuIFN−β関連のもの
である（第１図）。 3.Ca++処理されたイー・コリHB101の調製 イー・エム・レダーベルクおよびエス・エヌ・ユーヘ
ン、「プラスミドデオキシリボ核酸によるサルモネラ・
チフイムリウム（Salmonella typhimurium）の形質転
換」、ジャーナル・バクテリオロジー、第119巻、第107
2〜1074頁（1974）の方法により、イー・コリHB101（エ
ッチ・ボイヤーから寄贈）を5mlのLB倍地（１当り10
部のバクトトリプトンと５部の酵母抽出物と５部のNaC
l）中に接種し、培養物を37℃にて一晩増殖させること
により、Ca++処理されたイー・コリHB101を調製した。
新鮮な培養物を20mlのLB倍地中で1/100に希釈し、1ml当
り約２×108個の細菌数という密度まで増殖させ、氷中
で急冷しかつソルバールSS34型ロータ中で４℃にて6000
rpmで５分間ペレット化させた。細胞を０〜４℃に保っ
て20mlの100mMCaCl2にて洗浄した。氷中で20分間の後、
細胞を再ペレット化させ、2mlの100mMCaCl2中に再懸濁
させそして０℃に15分間保った。一部（200μｌ）にグ
リセリンを11％まで補充し、活性を損失することなく−
80℃にて数ヵ月間貯蔵することができた〔ディー・エー
・モリソン、「大腸菌における形質転換：コンピテント
細胞の冷温保存」、ジャーナル・バクテリオロジー、第
132巻、第349〜351頁（1977）〕。 4.dA−伸長されたpBR322とdT−伸長されたDNAのアニー
ル化 ベクタおよびDNA挿入物の相補的dA−およびdT−末端
は、アニール化により所望のハイブリッドプラスミドま
たは組替えDNA分子を生成することを可能にする。この
目的で、dA−末端化PstI−開裂pBR322ベクタおよびサイ
ズ決定されたdT−末端化したcDNAの混合物をTSE緩衝液
〔10mMのトリス−HCl（pH7.6）と1mMのEDTAと10mMのNaC
l〕中に1.5μg/mlプラスミドまでおよびプラスミド対DN
A挿入物のモル比1.5対2.0まで溶解させた。65℃で10分
間加熱した後、混合物を４時間かけて室温までゆっくり
冷却した。 生成物は、勿論、挿入DNA配列を含まない異なる組替
えDNA分子と幾らかのクローン化運搬体との大混合物で
ある。しかしながら、各組替えDNA分子は、PstＩ部位に
cDNA断片を含有する。この種の各cDNA断片は遺伝子また
はその断片からなることができる。極めて少数のcDNA断
片のみがHuIFN−βまたはその部分をコードする（第１
図）。大多数は、他の蛋白質の一種またはその部分をコ
ードし、そのmRNAは本発明の方法に使用されるポリ
（Ａ）RNAの一部である（第１図）。また、上記で調製
した貯蔵物のクローンのいずれも、IFN−βの免疫学的
または生物学的活性を示すポリペプチドの発現を可能に
しないことを了解すべきである。 5.アニール化されたハイブリッドプラスミドによるイー
・コリHB101の形質転換 P3封じ込め設備を形質転換方法および全ての後の過程
に必要なものとして使用し、ここで得られた形質転換細
菌を取扱った。上記混合物の一部（90μｌまたはそれ以
下）を０℃まで冷却しそして1MのCaCl2を0.1Mまで加え
た。この溶液の一部（100μｌもしくはそれ以下）を氷
中において200μｌのCa++処理されたイー・コリHB101に
加え、０℃にて30分間静置した後、細胞に37℃で５分間
熱ショックを与え、再び０℃にて15分間冷却した。2ml
のLB倍地を加えた後、細胞を振とう水浴中にて37℃で30
〜45分間培養し、細菌懸濁物を、10μg/mlのテトラマイ
シンを補填したLB倍地を含有する1.2％寒天板の上に塗
沫した。 プラスミドpBR322はテトラサイクリン耐性に関する遺
伝子を含むので、その完全遺伝子を有するプラスミドで
形質転換させたイー・コリ宿主は、そのように形質転換
させてない細菌を除き、その抗生物質を含有する培養物
において増殖するであろう。従って、テトラサイクリン
含有培養物における増殖は、組替えDNA分子または再使
用ベクタにより形質転換させた宿主の選択を可能にす
る。 37℃にて24時間の後、個々の集落を採取してこれらを
ミクロ測定板（ダイナテク社）の穴部における100μｌ
のLB倍地（上記のように補填したもの）に懸濁させた。
37℃にて一晩培養した後、11μｌのジメチルスルホキシ
ドを各穴中に混入し、皿を接着テープでシールした。測
定板を−20℃に保存し、そして形質転換イー・コリHB10
1の170,000個の個々のクローンを調製した。この貯蔵物
は270fモル（128ng）のdT−末端化cDNA挿入物から得ら
れ、またcDNA挿入物は4.4μｇの勾配精製したポリ
（Ａ）RNAから合成した。この貯蔵物のクローンの約98
％はカルベニシリン（より安定なアンピシリン誘導体）
に対し感受性であった。従って、この貯蔵物のうち約98
％はpBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子のPst−部位に挿
入物を有するプラスミドを含有し、約２％のみが挿入物
のない再環化ベクタを含有した。 これら170,000個のクローンは、IFN−β生成性細胞か
らのポリ（Ａ）RNA調製物においてmRNAの混合物の完全
もしくは部分的コピーを示す各種の組替えDNA分子を含
有する（第２図）。これらの大多数は単一の組替えDNA
分子のみを含有するであろう。これら組替えDNA分子の
極く少数のみがHuIFN−βに関連する。従って、クロー
ンを選別してHuIFN−β関連クローンを他のものから分
離せねばならない。 HuIFN−β cDNAを含有するクローンの選別 HuIFN−β cDNAを含有する細菌クローンを選別するた
めの幾つかの方法がある。これらには、例えばRNA選択
ハイブリダイズ〔アルウイン等、下記〕、選別ハイブリ
ダイズ〔ティー・ピー・セントジョーンおよびアール・
ダブリュー・デービス、「差別プラークフィルターハイ
ブリダイズによるサツカロミセス・セレビシエからのガ
ラクトース誘起DNA配列の単離」、セル誌、第16巻、第4
43〜452頁（1979）〕、合成試料によるハイブリダイズ
〔ビー・ノイエス等、「オリゴデオキシヌクレオチド試
料を使用するガストリンmRNAの検出および部分的配列分
析」、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サ
イエンス・USA、第76巻、第1770〜1774頁（1979）〕ま
たは免疫学的分析〔エル・ビラーカマロフ等、「プロイ
ンシュリンを合成する細菌クローン」、プロシーディン
グ・ナショナル・アカデミー・サイエンス・USA、第75
巻、第3727〜3731頁（1978）〕もしくは生物学的分析
〔エー・シー・ワイ・チャング等、「ネズミジヒドロフ
オレートレダクターゼをコードするDNA配列のイー・コ
リにおける発現型」、ネイチャー誌、第275巻、第617〜
624頁（1978）〕による所望蛋白質を生成するクローン
の選別が包含される。本発明は、第一次選別に対し最も
便利でありかつ有望な方法としてRNA選択ハイブリダイ
ゼーションを選択した。 A.RNA選択ハイブリダイゼーション分析 1.初期分析の概要 次に第２図について述べれば、組替えDNA分子を、上
記クローン貯蔵物（第２図に示した２種クローンの２つ
の混合物）からのカルベニシリン感受性かつテトラサイ
クリン耐性の約46種クローンの個々の培養物から単離し
た（工程Ａ）。組替えDNA分子を開裂させ、そして前記
したように調製したHuIFN−βmRNAを含有する全RNAにハ
イブリダイズさせた（工程Ｂ）。全ての組替えDNA分子
−全RNAハイブリッドを非ハイブリダイズ全RNAから分離
した（工程Ｃ）。ハイブリダイズした全RNAをハイブリ
ッドから回収しかつ精製した（工程Ｄ）。回収したRNA
を上記のようにHuIFN−βmRNA活性につき分析した（工
程Ｅ）。組替えDNA分子の混合物が厳格なハイブリダイ
ズ条件の下で全RNA中のHuIFN−βmRNAにハイブリダイズ
しうる挿入ヌクレオチド配列を有する組替えDNA分子を
含有する場合および含有する場合のみ、そのハイブリッ
ドから遊離されたmRNAは卵母細胞中においてHuIFN−β
の生成をもたらすであろう。何故なら、その他の如何な
る組替えDNA分子−全RNAハイブリッドから遊離されたmR
NAもIFN−β関連性がないからである。46個のクローン
の群が正の反応を示せば、これらクローンを６個のサブ
グループ（８つのサブグループ４個と７つのサブグルー
プ２個に再組分けして、各サブグループにつき上記のよ
うに分析した。この処理を、この分析に応答する単一の
クローンが同定されるまで続けた。 形質転換されかつこのように同定された組替えDNA分
子および細菌培養物が完全なIFN−βcDNA配列を含有し
たり、或いはDNA配列が実際にIFN−βをコードし、また
はIFN−βの免疫学的または生物学的活性を示すポリペ
プチドをクローンが発現する保証はない。しかしなが
ら、組替えDNA分子は、IFN−βmRNAコード配列に相補的
な広汎なヌクレオチド配列を確実に含有する。従って、
組替えDNA分子は、他の組替えDNA分子およびそれにより
形質転換されたクローンを迅速選別するためのプローブ
の供給源として使用することにより、標準または完全な
IFN−βヌクレオチドコード配列を含有しうる別の群の
クローンを同定することができる。次いで、これらクロ
ーンを、IFN−βの生物学的または免疫学的活性を示す
ポリペプチドの可能な発現につき分析することができ
る。またこれらハイブリッドプラスミドの挿入DNA断片
のヌクレオチド配列およびそのアミノ酸翻訳生成物を決
定し、そして必要に応じ標準IFN−β（上記）につき報
告されたアミノ酸組成および初期配列に相関させること
ができる。 2.初期分析の実施 過程Ａ−組替えDNA分子混合物の調製 上記クローンのライブラリーからの96種のクローンを
含有するミクロ測定板のレプリカをLB寒天板上で作成
し、一つは10μg/mlのテトラサイクリンを含有し、他方
には100μg/mlのカルベニシリンを補填した。このよう
にして、テトラサイクリン耐性かつカルベニシリン感受
性の約45〜45種よりなる二組のクローンを釣り上げ、10
μg/mlテトラサイクリンを含有する100mlのLB倍地で37
℃にて一晩別々に増殖させた。これら培養物を集め、ソ
ルバールGS-3型ロータにて8000rpmで10分間遠心分離
し、TES緩衝液〔50mMのトリス−HCl（pH8）と5mMのEDTA
と5mMのNaCl〕で２回洗浄し、そして初期培養容量１
につき40mlのTES中に再懸濁させた。細胞をシゾチーム
−トリトンＸ−100により溶菌させた〔エム・カーン
等、「プラスミドColE1、Ｆ、R6KおよびRK2から得られ
るプラスミドクローン化用運搬体」、メソッド・イン・
エンチモロジー、68:組替えDNA（アール・ウー編）、19
80、印刷中〕。40mlのTES懸濁細胞を、50mMトリス−HCl
（pH8）中の10％ショ糖20mlおよび1.3mg/mlまでのリゾ
チームと混合し、室温で20分間静置させた。この懸濁物
に、1mlの0.5MのEDTA−NaOH（pH8）と8mlの0.2％トリト
ンＸ−100と25mMのEDTAと50mMのトリス−HCl（pH8）と
を加え、室温にて30分間かけて溶菌を完結させた。細胞
残渣と大部分の染色体DNAとをベックマンSW27型ロータ
にて24000rpmで45分間ペレット化させることにより除去
した。上澄液を氷冷し、1/3容量の40％ポリエチレング
リコール6000−2M NaClと混合しそして０℃で一晩静置
させた。得られた沈澱物をソルバールHB4型ロータで500
0rpmにて４℃において10分間集め、TES緩衝液中に溶解
させた。この溶液を0.2容量の10mg/mlの臭化エチジウム
（セルバ社）および1g/mlのCsClと共にベックマンR60Ti
ロータにて40000rpmで少なくとも48時間遠心分離し、こ
の場合通常１〜2lの初期培養物容量からの溶菌物に対し
一本のポリアロマー試験管で充分であった。この試験管
中にはUV照射下で二つのDNAバンドを見ることができ
た。最高密度の帯域はプラスミドＩ型DNAに相当し、第
二の帯域はII型およびIII型のプラスミドDNAおよび若干
の染色体DNAに相当する。最初の帯域を試験管から回収
し、イソアミルアルコールで６回抽出して臭化エチジウ
ムを除去しそして水相を0.2Mまでの酢酸を補填した水
（pH5.1）の３容量で希釈した後、DNAを2.5容量のエタ
ノールで沈澱させた。DNAを再溶解させ、フェノールで
抽出しそして再びエタノールで沈澱させた。40mMのトリ
ス−HOAc（pH7.8）と20mMの酢酸ナトリウムと2mMのEDTA
とにおける１％アガロースゲル上での電気泳動の後、臭
化エチジウム染色によりDNAの品質を管理した。DNAがRN
Aの過多量で汚染されている場合は、これを中性ショ糖
−濃度勾配遠心分離によりさらに精製した。すなわち、
10mMトリス−HCl（pH7.6）中の300μgDNAと1mMのEDTAと
を、10mMのトリス−HCl（pH7.6）と1mMのEDTAと1MのNaC
lとにおける36mlの５〜20％のショ糖密度勾配に供し、
ベックマンSW27型ロータにおいてポリアロマー試験管中
で24000rpmにて16時間遠心分離し、そしてフラクション
（OD260）を含有するDNAを集め、酢酸ナトリウム−エタ
ノールで沈澱させた。 過程Ｂ−DNAと全RNAとのハイブリダイゼーション このように調製した約150μｇのDNAを内部標準として
の均一ラベルした幾らかのP32−標識DNAおよび２μｇの
pSTNV-1DNA〔サテライトタバコ壊疽ウィルス（「STN
V」）‐RNAの全サイズcDNAコピーを含有する組替えプラ
スミド；ジェー・バン・エメロ等、「サテライトタバコ
ウィルスRNAのほぼ全サイズDNAコピーを含有するプラス
ミドの作成および特性化」、ジャーナル・モレキュラー
・バイオロジー（印刷中）〕と混合し、MSE型超音波器
により超音波破壊し、そして酢酸ナトリウム−エタノー
ルで沈澱させた。 ジアゾベンジルオキシメチル（DBM）−セルロース固
体マトリックス〔ジェー・シー・アルウイン等、「ジア
ゾベンジルオキシメチル紙への移行とDNA試料でのハイ
ブリダイゼーションとによるアガロースゲルにおける特
定RNAの検出方法」、プロシーディング・ナショナル・
アカデミー・サイエンス・USA、第74巻、第5350〜5354
頁参照〕を、ジェー・シー・アルウイン等の方法〔「ゲ
ルにおけるDNA分別およびジアゾベンジルオキシメチル
紙への移行による特定RNAまたは特定断片の検出」、メ
ソッド‐エンチモロジー、68:組替えDNA（アール・ウー
編）、1980〕により調製した。紙マトリックスについて
は、ワットマン540の紙シートを、２〜3mgの１−（ｍ−
ニトロベンジルオキシ）メチルピリジニウムクロライド
（NBPC/BDH）と0.7mlの酢酸ナトリウム三水塩とを含有
する溶液に1cm2当り28.5μｌの水で均一に浸漬させ、60
℃にて乾燥するまでおよびさらに10分間保温しそして13
0〜135℃にて30〜40分間焼成した。水で数回（約20分
間）、アセトンで３回（約20分間）洗浄しかつ乾燥させ
た後、貯蔵した。この紙を1cm2当り0.4mlの20％ジチオ
ン酸ナトリウム‐水の中に時々振とうしながら60℃で30
分間温浸した。この紙を再び水で４回、30％酢酸で１回
（５分間）および水で４回洗浄し、使用直前に０℃で30
分間かけて10mg/mlの新鮮NaNO2が加えられている1cm2当
り0.3mlの氷冷された1.2MのHClに移しそして氷冷水で２
回迅速に洗浄しかつ80％ジメチルスルホキシド（分光分
析級、メルク社）−20％25mMリン酸ナトリウム（pH6.
0）にて１回洗浄した。粉末マトリックスについては、
微粒セルロース粉末（ワットマンCC31）を使用して実質
的に同じ手順に従ったが、この場合それぞれの量はセル
ロースマトリックスの対応する重量に対して表わす。 最初は、結合能力がより高く、従ってハイブリダイゼ
ーション、洗浄および溶出に関し比較的少容量の使用で
済むため、粉末マトリックスを使用した。その後、個々
のクローン選別につき紙マトリックスを使用した。紙の
使用は水による効果的な溶出を可能にし、後のIFN−βm
RNAの分析に関しより優れていることが判明した。 上記のように調製したDNAを25mMのリン酸ナトリウム
（pH6.0）中に溶解させ、１分間加熱し、急冷しそして
４容量のDMSOを加えた。一般に、マトリックス（50mgの
粉末）またはペーパーディクス（直径10mm）へのカップ
リングは、週末にわたり連続混合しながら４℃にて進行
させた。DNAの容量をかなり少なく保つことによマトリ
ックスと緊密接触させ、それによりマトリックスに対す
るDNAの効果的カップリングを向上させた。カップリン
グ後、マトリックスを水で４回および0.4NのNaOHで４回
それぞれ37℃にて10分間洗浄し、さらに室温にて水で４
回洗浄し、最後にハイブリダイゼーション用緩衝液〔50
％ホルムアミド（脱イオン処理したもの、ベーカー
社）、40mMのピペラジン−N,N-−ビス（２−エタンスル
ホン酸）（pH6.4）（「PIPES」、シグマ社）、1mMのEDT
A、0.6MのNaClおよび0.1％のSDS〕で２回４℃にて洗浄
した。カップリング効率はP32−放射能により測定し
た。 前記のように調製した20μｇの全RNAと50ngのSTNV-RN
Aとを250μｌ（紙マトリックスの場合は50μｌ）のハイ
ブリダイゼーション用緩衝液中に溶解させ、そしてDNA
結合したマトリックスに加えた。このマトリックスを70
℃にて２分間加熱し、静かに混合しながら37℃にて一晩
保った。 過程Ｃ−非ハイブリダイズ全RNAからのハイブリダイズ
全RNA−DNAの分離 粉末マトリックスを遠心分離した後、非ハイブリダイ
ズRNAを除去し、このマトリックスを全部で2mlの５％ホ
ルムアミドと10mMのPIPES（pH6.4）と1mMのEDTAと0.3M
のNaClと0.1％のSDSとにより７回洗浄し、ここでこれら
洗浄物の低塩含量は非特異的RNA-DNA結合を不安定化さ
せた。各洗浄の後、遠心分離しそしてマトリックスを緩
衝液中に再懸濁させた。後の分析のため、非ハイブリダ
イズRNAを含む第一の洗浄物を集め（「フラクション
１」）、さらに洗浄物２〜４（「フラクション２」）お
よび洗浄物５〜７（「フラクション３」）を集めた。紙
マトリックスにハイブリダイズさせる際は、同様な手順
を用いたが、ただし全洗浄物容量を1mlに制限した。 過程Ｄ−ハイブリダイズ全RNAの精製 ハイブリダイズされた全RNA-DNAを、全部で900μｌの
99％ホルムアミドと0.2％のSDSとにより70℃で２分間、
３回溶出させることにより粉末マトリックスから溶出さ
せそして氷中で急冷した。全ハイブリダイズ手順および
ホルムアミドによる溶出は、実質的にエー・ジー・スミ
ス（私通信）により記載された通りとした。ハイブリダ
イズされた全RNA-DNAの紙マトリックスからの溶出は、
先ず100μｌの氷冷水で洗浄し次いで80℃における２分
間、２回の水溶出（全部で300μｌ）によって行なっ
た。後の分析のため、これら溶出液および100μｌの洗
浄物を集めた（「フラクション４」）。 ４種のフラクションの各々の半量に0.1μｇの牛肝臓t
RNAまたはリボソームRNAを加え（フラクション1A,2A,3A
および4A）、他の半量には８μｇの真核ポリ（Ａ）RNA
またはリボソームRNAを加えた（フラクション1B,2B,3B
および4B）。0.5MのNaClと2.5容量のエタノールとの添
加によりフラクションを沈澱精製して微量のホルムアミ
ドと他の不純物とを除去した。 過程Ｅ−IFN−βmRNA活性の測定 フラクション1A,2A,3Aおよび4Aを、25μｌのヌクレア
ーゼ処理された兎網状赤血球溶解物〔アール・ビー・ペ
ルハムおよびアール・ジェー・ジャクソン、「網状赤血
球溶解物に対する効果的なmRNA依存翻訳系」、ヨーロピ
アン・ジャーナル・バイオケミストリー、第７巻、第24
7〜256頁（1976）の方法により調製〕において、ビー・
レブロイ等の方法〔「キセノプス・レビス卵母細胞およ
び兎網状赤血球溶解物におけるネズミインターフェロン
mRNAの翻訳」、バイオケミカル・バイオフィジックス・
リサーチ・コミュニケーション、第82巻、第665〜673頁
（1978）〕により翻訳したが、ただしこの場合250mMの
スペルミジン‐HClと1mMのフラクトースー1,6−ジホス
フェートとをS35−メチオニン（0.5mCi/ml、アメルシヤ
ム社）の存在下で加えた。培養後、上記からの25μｌの
網状赤血球溶解物を１μｌの10％デオキシコレート−10
％トリトンX100および２μｌの抗血清−PBS（1:9）と混
合し、37℃にて１時間加熱した。10％の10mMのNaClと10
mMのトリス−HCl（pH7.4）と1mMのEDTAと0.05％のNP40
とにおける20μｌのスタフィロコッカス・アウレウス
（Staphylococcus aureus）コワンＩ〔新たに洗浄した
もの、エス・ダブリュ・ケスラー等、「スタフィロコッ
カス蛋白質Ａ−抗体吸着剤による細胞からの抗原の迅速
単離：蛋白質Ａとの抗体−抗原複合体の相互作用におけ
るパラメータ」、ジャーナル・イミュノロジー、第115
巻、第1617〜1624頁（1975）〕を加えそして混合物を20
℃にて30分間維持し、エッペンドルフ5412型遠心分離器
にて２分間遠心分離した。ペレットを洗浄し、PBSと共
に２回遠心分離しそして最終ペレットを試料緩衝液中に
溶解させ、ユ・ケー・レムリ等に記載されたように
〔「バクテリオファージT4の頭部の結合時における構造
蛋白質の開裂」、ネイチャー誌、第227巻、第680〜685
頁（1970）〕13％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動
させ、オートラジオグラフ分析にかけた。フラクション
1Aと4AとにおけるSTNV-RNA翻訳生成物の比較は、この処
理におけるハイブリダイゼーションおよびRNA減成の効
率を示す。 フラクション1B,2B,3Bおよび4Bを２μｌの水に溶解さ
せ、上記したようにIFN−βmRNA含量につき卵母細胞に
おいて分析した。 3.後の分析−ニトロセルロースシートに対するハイブリ
ダイゼーション 個々のクローンの後の分析をニトロセルロースシート
において行なった〔エム・コヘット等、「ほぼ完全長さ
のひなコナルブミン二本鎖cDNAのクローン化」、ヌクレ
イック・アシッド・リサーチ、第６巻、第2435〜2452頁
（1979）〕。DNAを2MのNaClおよび0.2MのNaOH中に溶解
させ、100℃にて１分間加熱し、急冷しそして界面活性
剤を含まないミリポアフィルター（孔径0.45μｍ、直径
7mm）上にスポットした。このフィルターを80℃にて２
時間処理し、0.3MのNaClと2mMのEDTAと0.1％のSDSと10m
Mのトリス−HCl（pH7.5）とで洗浄しそして室温で乾燥
した。RNAを30％ホルムアミドと0.5MのNaClと0.4％のSD
Sと2mMのEDTAと50mMのPIPES（pH7.5）とにおいて47℃で
３時間ハイブリダイズさせた。10容量の0.1MのNaClで希
釈してハイブリダイゼーションを停止させ、紙を15ml
の0.3MのNaClと0.1％のSDSと2mMのEDTAと10mMのトリス
−HCl（pH7.5）とで45℃にて振とうすることにより数回
洗浄し、さらに同溶液でSDSなしに４℃にて数回洗浄し
た。ハイブリダイズされたRNA-DNAの溶出は、30μｌの5
mMの塩化カリウム中で100℃にて１分間行なった。 4.RNA選択ハイブリダイゼーション分析の結果 16群の約46種のクローンを選別した（群A-P）。６つ
の群においてはフラクション1BはIFN−βmRNA活性のみ
を含有し、８つの群においてはIFN−βmRNAは検出され
ず、２つの群（群ＣおよびＯ）においてはフラクション
4BにIFN−βmRNAが観察された。群ＣおよびＯの分析は
次のように報告される:IFN−β単位の対数（比較標準69
/19に対して検量）であり、フラクション1B（非ハイダ
リダイズ）の分析およびフラクション4B（ハイブリダイ
ズ）の分析において検出された。検出限界は0.1であっ
た。群 フラクション1B フラクション4B C 1.0 ０ 0.5 0.5 ０ 0.2 O ０ ０ 0.2 0.5 群Ｏを６つのサブ群（サブ群O1〜O6;4群の８種クロー
ンと２群の７種クローン）に分割し、ハイブリダイズさ
せそして上記のように分析したが、ただし１クローン当
り400mlの培養物を使用した。サブ群は、上記と同じよ
うに表わして次の結果を与えた。ハイブリダイゼーショ
ンは、特記した点を除き、DMB−セルロース粉末におい
て行なった。サブ群 フラクション1B フラクション4B O1 0 1.2 0 1.5 0 0.5 0 0.5 0.2 0.5 0 1.2※ O2 0.7 ０ O3 0.7 ０ 0.5 ０ O4 0 ０ O5 0.5 ０ O6 0 ０ ※DBMセルロース紙法 サブ群O1を個々のクローン（クローンO1 ］ １〜O1 ］ ８
と名付ける）に細分割し、ハイブリダイズさせ、そして
前記のように分析したが、ただしクローン１種当り700m
lの培養物を使用した。再びハイブリダイゼーション
を、特記した点を除き、DBM−セルロース粉末にて行な
った。 従って、クローンO1 ］ ８は、IFN−βmRNAを含有する
全RNAからIFN−βmRNAをハイブリダイズさせうる組替え
DNA分子を含有する。 非特異的RNA-DNA結合は殆んど起らない。何故なら、
フラクション1Aと4Aとを比較すると、これらの同じ実験
においてSTNV・DNAの非特異的結合が殆んど全く見られ
なかったからである。例えば、上記したように、S35−
メチオニンの存在下における兎網状赤血球溶解物での翻
訳に続き、ゲル電気泳動により監視された。クローンO1
］ ８をイー・コリHB101（G-pBR322（Pst）/HFIF（「Ｇ
−HB101−pHFIF1」）と名付け、その組替えDNA分子をＧ
−pBR322（Pst）HFIF1（「pHFIF1」）と、またそのハイ
ブリッド挿入物を「pHFIF1断片」と名付ける。この命名
は、クローンおよび組替えDNA分子が遺伝子（「Ｇ」）
に由来しかつPst部位にHuIFN−βcDNAを含有するプラス
ミドpBR322からなり（「HFIF」）そして特定分子が最初
に位置する（「１」）ことを示している。 pHFIF1にクロスハイブリダイズする組替えDNA−分子を
含有するクローンの同定 上記で単離されたpHFIF1を使用して、前記で調製され
たクローンのライブラリーを、関連ハイブリッドDNA挿
入物を持った組替えDNA分子を含有する細菌クローンに
つきコロニーハイブリダイゼーションによって選別した
〔エム・グルンスタインおよびディー・エス・ホグネ
ス、「特定遺伝子を含有するクローン化DNAの単離方
法」、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サ
イエンス・USA、第72巻、第3961〜3965頁（1975）〕。
この方法は、pHFIF1から作成された放射性試料を、ニト
ロセルロース紙に固定された溶菌細菌コロニーのDNA
に、ハイブリダイズさせることによる関連クローンの迅
速同定を可能にする。 上記のようにミクロ測定板に保存されたクローンのラ
イブラリーを同寸法のニトロセルロースシート（孔径0.
45μｍ、シュライヒヤー・アンド・シュエル社またはミ
リポア社）において複製させたが、この場合ニトロセル
ロースシートは予め煮沸して界面活性剤を除去したもの
を用い、これをテトラサイクリン（10μg/ml）を含有す
るLB寒天板上に置いた。細菌コロニーを37℃にて一番増
殖させた。ニトロセルロースシート上での細菌の溶菌お
よび固定を行なった後、0.5NのNaOH（２回、７分間）
と、1Mのトリス−HCl（pH7.5）（７分間）と0.5Mのトリ
ス−HCl（pH7.5）および1.5MのNaCl（７分間）と2XSSC
〔0.15MのNaCl、0.015Mのクエン酸ナトリウム（pH7.2）
（７分間）〕とで洗浄した。エタノールで充分洗浄しか
つ風乾した後、シートを減圧下で80℃にて２時間処理し
そして室温で保存した。 pHFIF1断片に特異的なHinfＩ制限断片（下記）を、下
記するように、コロニーハイブリダイゼーションに対す
る試料として使用した。この断片（〜170塩基対）を、
６％ポリアクリルアミドゲルにおけるpHFIF1のHinf消化
生成物の電気泳動により精製した。DNAバンドを臭化エ
チジウムで染色した後、特定断片を溶出させ、再び電気
泳動にかけ、そして「ニックトランスレーション」によ
りP32−ラベルし〔ピー・ダブリュ・ジェー・リグビー
等、「DNAポリメラーゼＩでのニックトランスレーショ
ンによる試験管内の高特異活性に到るデオキシリボ核酸
のラベル化」、ジャーナル・モレキュラー・バイオロジ
ー、第113巻、第237〜251頁（1977）〕、これは50μｌ
の50mMトリス−HCl（pH7.4）と10mMのMgCl2とそれぞれ4
00μＭでdCTP、dTTPおよびdGTPを含有する20mMのβ−メ
ルカプトエタノールと100pモルのα−ATP（アメルシヤ
ム社、2000Ci/ミリモル）と2.5単位のDNA−ポリメラー
ゼＩ（ベーリンガー社）とにおいて14℃でd45分間培養
することにより行なった。未反応のデオキシヌクレオシ
ド三リン酸を、TE緩衝液におけるセファデックスG-50で
のゲル過によって除去した。高度にP32−ラベルしたD
NAを0.1容量の2M酢酸ナトリウム（pH5.1）と2.5容量の
エタノールとにより20℃にて沈澱させた。 紙含浸したDNAに対する上記試料のハイブリダイゼ
ーションは、ディー・ハナバンおよびエム・メセルソン
（私通信）に実質的に記載されているように行なった。
上記のように調製した紙を、0.1％のフイコールと0.1
％のポリビニルピロリドンと0.1％の牛血清アルブミン
と0.15MのNaClと0.03Mのトリス−HCl（pH8）と1mMのEDT
Aとにおいて68℃で２時間予備保温し、0.02％のフイコ
ールと0.02％のポリビニルピロリドンと0.02％の牛血清
アルブミンと0.75MのNaClと0.15Mのトリス−HCl（pH8）
と5mMのEDTAと0.5％のSDSとで洗浄した。洗浄溶液と同
一の溶液中において、使用前100℃にて５分間変性させ
たP32−ラベル試料を用い、ハイブリダイゼーションを6
8℃にて一晩進行させた。ハイブリダイゼーションした
紙を0.3MのNaClと0.06Mのトリス−HCl（pH8）と2mMの
EDTAとで68℃にて２時間洗浄した御、風乾しかつオート
ラジオグラフ分析にかけた。 800〜900DNAサイズ種類から生じた約1350種のクロー
ンを選別した。pHFIF1を包含する13種のコロニーはプラ
スの結果を与えた。これらクローンをＧ−HB101−pHFIF
1〜13と名付け、それらの組替えDNA分子をpHFIF1〜13と
名付けた。クローンの一種、すなわちpHFIF2を、IFN−
βmRNAを含有するポリ（Ａ）mRNAでハイブリダイズさ
せ、DBM−セルロース紙（上記）を用いて分析した。全I
FN-RNA活性はハイブリダイズされたフラクション中に検
出されかつ未ハイブリダイズRNAは何ら検出可能な活性
を含有しなかったので、pHFIF1断片の一部に対するコロ
ニーハイブリダイゼーションにより同定されたクローン
もIFN−βmRNAにハイブリダイズしたことは明らかであ
る。 勿論、pHFIF1のHuIFN−β DNA挿入物或いはpHFIF1のD
NA挿入物を用いて同定されたクローンの他のDNA挿入物
を使用することクローン選別方法を、組替えDNA技術、
合成源もしくは天然源またはその組合せから生ずるDNA
配列を含有する他のクローン、或いは単一もしくは多重
の塩基置換、挿入、転位もしくは削除を包含する突然変
異による上記DNA配列のいずれかに関連したDNA配列を含
有するクローンについても充分同等に使用しうることは
明らかである。従って、このようなDNA配列およびその
同定も本発明の範囲内である。上記DNA配列により選別
されないが、そのヌクレオチド配列の結果上記DNA配列
によりコードされたようなポリペプチドをコードするDN
A配列も、本発明の範囲内にあることを了解すべきであ
る。 IFN−β関連組替えプラスミドの特性化 コロニーハイブリダイゼーションにより検出された13
種のクローン（pHFIF1〜13）をさらに特性化した。これ
らクローンの挿入物の物理的地図を作成し、そして各種
クローンにおける挿入物の方向性を決定した。 プラスミドの物理的地図は、10mMのトリス−HCl（pH
7.6）と7mMのMgCl2と7mMのβ−メルカプトエタノールと
において周知方法により37℃にて各種制限酵素（ニュー
イングランドビオラブ社）により消化することにより作
成した。消化生成物を、40mMのトリス−HOAc（pH7.8）
と20mMのEDTAとにおいて2.2％アガロースまたは６％ポ
リアクリルアミドゲルとで電気泳動にかけた。それらを
臭化エチジニウムで染色して可視状態にした後に分析
し、pBR322の詳細な物理的地図（ジェー・ジー・サット
クリフ、上記）と比較した。異なるプラスミドの制限地
図を、これら消化パターンに基づいて作成した。これら
を、各種プラスミドにおけるDNA挿入物の配列決定によ
り精製し、これは実質的にエー・エム・マキサムおよび
ダブリュ・ギルバートの方法〔「DNA配列決定の新規方
法」〕、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・
サイエンス・USA、第74巻、第560〜564頁（1977）〕に
よって行なった。 プラスミドDNAを本発明により各種のpHFIF1〜13から
調製したが、その方法は選別用としてクローン群からDN
Aを単離するため上記において使用したカー等（上記）
の方法である。単離された型ＩのDNAを、上記のように
中性ショ糖−密度勾配遠心分離により精製しかつ供給業
者（ニュージーランドビオラブス社）により実質的に推
奨されたように各種の制限酵素により制限酵素処理を行
なった。 制限酵素処理されたDNAを、４単位の細菌アルカリホ
スファターゼおよび0.1％SDSの存在下に65℃にて30分間
脱リン酸化した。２回のフェノール抽出とエタノール沈
澱との後、DNAをγ−P32−ATP（〜3000Ci/ミリモル）お
よびポリヌクレオチドキナーゼ（P-Lビオケミカルス
社）により5-−末端ラベル化した。 配列決定のため、ラベル化した断片を二つの方法で処
理した。幾つかについては、第二の制限酵素で開裂させ
る前にポリアクリルアミドゲルにて精製した。その他の
ものについては、直ちに第二の制限酵素で開裂させた。
両者の場合、所望の断片をトリス−ホウ酸塩−EDTA緩衝
液でポリアクリルアミドゲル上で分離させた。第７図
は、各種制限断片を示し（円はラベルを示しかつ矢印は
配列決定の方向を示す）、配列決定法にはpHFIF1とpHFI
F3とpHFIF6とpHFIF7とを使用した。 断片をエー・エム・マキサムおよびダブリュ・ギルバ
ート（上記）の方法に従って減成させた。生成物を、種
々な濃度および長さのポリアクリルアミドゲル上で、50
mMのトリス−ホウ酸塩と1mMのEDTA（pH8.3）とにおいて
900V〜2000Vにて分別した。 cDNA挿入物の各長さを両ストランドから配列決定し、
ラベル末端として役立つ各制限部位はこれを間隔決定す
る断片を用いて配列決定した。IFN−βDNAまたは遺伝子
のコードストランドにつきこのように得られた複合ヌク
レオチド配列およびその対応するアミノ酸配列を第４図
に示す。プラスミドpHFIF1〜13にいずれもHuIFN−βに
関する完全遺伝子を含有しなかったので、第４図はこの
種の少なくとも２種のプラスミドからのデータを組合せ
て得られる。これに関し、第５図は挿入物pHFIF1、pHFI
F3、pHFIF6、およびpHFIF7の関係を示し、実線矢印また
は山形印は挿入物の種々な部分の方向性を示している。 次に第４図について述べれば、挿入物のヘテロ重合体
部分はＴに豊んだ断片とＡのストリングとが一端部に存
在する（恐らく、mRNAのポリＡ末端を反映する）。参照
用として、挿入物には、複合挿入物の第一ヌクレオチド
から挿入物の未翻訳部分中に充分入り込んだヌクレオチ
ドまで番号を付する。位置65〜67におけるATG開始トリ
プレットと位置626〜628におけるTGA停止トリプレット
とは無意味コドンにより中断されないリーディングフレ
ームを規定する。ATGもしくはGTGと停止シグナルとによ
り規定された、他のリーディングフレームにおけるその
他任意の翻訳可能な配列は、短か過ぎて予想サイズのIF
N−βのポリペプチドをコードできない。従って、ヌク
レオチド65と625との間の領域が恐らく、本発明によりI
FN−βをコードする複合DNA配列に関するヌクレオチド
配列を含むであろう。 この配列は、例えば単一もしくは多重の塩基置換、削
除、挿入もしくは転位を含む突然変異のような遺伝子に
対する変化がまだ遺伝子に生じていないか或いはその性
質またはそれから翻訳されたポリペプチドの性質を変化
させるため後に使用されえないという可能性を排除する
ものでない。また、これは、第４図に示したものと生理
学的には同様であるが構造的に若干異なる遺伝子もしく
はポリペプチドをもたらしうる如何なる多形現像をも排
除するものでない（上記）。例えば、本発明により同定
された他のクローンは、IFN−βをコードするヌクレオ
チド配列のヌクレオチド90に、「Ｃ」の代りに「Ｔ」を
有する。第三ヌクレオチドにおけるコドンのこの変化
は、それによりコードされるアミノ酸を変化させない。
第４図のDNA配列によりコードされるアミノ酸配列は、
タニグチ等（上記）により報告されたアミノ酸配列と同
一である。 勿論、通常の方法〔エー・エフストラチアジス等、上
記〕によるポリ（Ａ）RNAからのクローン化cDNAは5-末
端ヌクレオチドを欠如しかつ人工的配列さえ含みうるこ
とを了解すべきである〔アール・アイ・リチャード等、
「成鶏β−グロビンcDNAの分子クローン化および配列分
析」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第７巻、第
1137〜1146頁（1979）〕。従って、ヌクレオチド65〜67
に位置するATGが標準IFN−βコード配列の最初のATGで
あるとは限らない。しかしながら、以下の説明の目的
で、ヌクレオチド65〜67におけるATGが標準IFN−βmRNA
の最初のATGであると仮定する。 挿入物のこの領域によりコードされるポリペプチドを
標準ヒト繊維芽細胞インターフェロンの13個末端アミノ
酸、すなわちナイト等（上記）により決定されたMetSer
TyrAsnLeuLeuGlyPheLeuGlnArgSerSerと比較すれば、選
択リーディングフレームは適正であり、ヌクレオチド65
〜127は「成熟」ポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列に先立つシグナルペプチドをコードしうるものと
思われる。 さらに、真核mRNAにおいて、5-末端からの第一AUGト
リプレットは通常、蛋白合成に対する開始部位である
〔エム・コザック、「真核リボソームはどのようにして
メッセンジャーRNAにおける開始域を選択するか」、セ
ル誌、第15巻、第1109〜1125頁（1978）〕。ここで、繊
維芽細胞インターフェロンの第一アミノ酸に相当する複
合断片におけるコドンは、第一ATGからの22個のコドン
である。このことは、再び、繊維芽細胞インターフェロ
ンをコードするDNA配列の前に21個のアミノ酸のシグナ
ルポリペプチドを決定する配列が存在しうることを示唆
している。この仮想シグナル配列は一連の疎水性アミノ
酸を含有する。勿論、疎水性残基のこの蓄積がシグナル
配列の特徴である〔ビー・ディー・デビスおよびピー・
シー・タイ、「膜を透過する蛋白質分泌のメカニズ
ム」、ネイチャー誌、第283巻、第433〜438頁（198
0）〕。 「成熟」HuIFN−βに明らかに相当するヌクレオチド
配列は、498個のヌクレオチドからなり、166個のアミノ
酸をコードする。カルボキシ末端処理が存在しないと仮
定すれば、インターフェロンポリペプチドの分子量は20
085である。コード配列の塩基組成は45％Ｇ＋Ｃであ
る。インターフェロンコード配列内のコドン使用は、一
般に哺乳類mRNAに対して示されたものとよく一致する
〔アール・グランタム等、「コドンカタログ使用および
ゲノム仮説」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第
８巻、第49〜62頁（1980）〕。観察される全ての変化
は、関与する小数に起因する。 複合断片について第４図に示したポリペプチドの構造
は、勿論、生体内酵素との相互作用、例えばグリコシル
化により生じたポリペプチドに対し何らの変化をも考慮
に入れない。従って、第４図に示したアミノ酸配列は生
体内で生成されたHuIFN−βと同一でありえないことを
理解せねばらない。 標準繊維芽細胞インターフェロンの最初の13個のアミ
ノ酸（ナイト等、上記）と第４図の複合遺伝子から推定
される配列とを比較すると、相違点を示さない。一方で
は標準繊維芽細胞インターフェロンにつき直接に決定さ
れたアミノ酸組成物と、他方では本発明の複合遺伝子の
配列から推定されたものとは、実質的な類似性を示す。
第６図はこれら組成物の比較を示している。 本発明により最初に製造された組替えDNA分子のいず
れも繊維芽細胞インターフェロンに対する完全なDNA配
列を含有しないが、これらはHuIFN−βに関連するよう
な配列に対するDNA配列の集合物を選別するための有用
な資料を提供する。さらに、完全IFN−βコード配列を
与えるこれら組替えDNA分子の挿入物部分の組合せは、
下記に示すように、当分野の知識内にある。例えば第５
図および第８図を参照すれば、pHFIF6のPstI‐BglII断
片をpHFIF7のPstI‐HaeII断片と結合させうるか、或い
はpHFIF6のEcoRI-PstＩ断片をpHFIF7のPstI‐HaeII断片
と結合させうるか、或いはpHFIF6のBglII‐PstI断片を
クローン７のPstI‐BglII断片と結合させて複合HuIFN−
βコード配列を形成させうることが容易に判るであろ
う。勿論、これら断片の結合は、所望プラスミド中への
クローン化断片の挿入前もしくは挿入後に行なうことが
できる。 HuIFN−β活性を示すポリペプチドを発現する目的の、H
uIFN−βをコードする完全DNA配列を含有するプラスミ
ドの調製 バクテリオファージλは２種の強力なプロモータPLお
よびPRを含有し、それらの活性はリプレッサ蛋白質の制
御下においてファージ遺伝子cIの産物である。リプレッ
サの存在下において、これらプロモータの転写は充分に
制御される。リプレッサの除去はPLおよびPRからの強力
な転写をもたらす〔参考のため、エッチ・スジバルスキ
ーおよびダブリュ・スジバルスキー、「バクテリオファ
ージλの広汎な分子地図」、ジーン誌、第７巻、第217
〜270頁（1979）〕。 多重コピープラスミドpBR322の誘導体、〔エフ・ボリ
バー等、「新規クローン化運搬体の作成および特性化。
II,多重クローン化系」、ジーン誌、第２巻、第95〜113
頁（1977）〕を作成してPLプロモータを組込んだ。これ
らプラスミドは英国特許出願第80.28983号（1980年９月
８日出願）明細書に記載されており、参考のため本明細
書中に加入する。 A.PLプロモータを含有するプラスミドの構造プラスミド
pPLa2311 プラスミドpPLa2311（第８図に示す）は３種のHaeII
断片からなっている。最大の断片、すなわち約1940個の
塩基対はバクテリオファージλからのPLOL域とpBR322か
らのβ−ラクタマーゼ遺伝子域とを含有する〔ジェー・
サットクリフ、「大腸菌プラスミドpBR322の完全ヌクレ
オチド配列」、コールド・スプリング・ハーバー・シン
ポジウム、第49巻、第77〜90頁（1978）〕。この断片に
隣接して、プラスミドColE1から得られる370個の塩基対
HaeII断片が存在する。複製開始点は、これら二つの断
片の間の接合部に渡る〔エー・オカ等、「小ColE1誘導
体のヌクレオチド配列。自己複製およびコリシンE1免疫
に必須の領域の構造」、モレキュラー・ゼネラル・ゲネ
チックス、第172巻、第151〜159頁（1979）〕。第三のH
aeII断片、すなわち長さにおいて約1600個の塩基対はカ
ナマイシン耐性をコードする。この断片は元来、プラス
ミドpCR1から生ずる〔シー・コベイ等、「細菌プラスミ
ドDNAにおける制限部位の検出方法」、モレキュラー・
ゼネラル・ゲネチックス、第145巻、第155〜158頁（197
6）〕。PLプロモータからの転写の方向は、β−ラクタ
マーゼ遺伝子と同じ方向である。プラスミドpPLa2311は
100μg/mlカルベニシリンおよび50μg/mlのカナマイシ
ンに対する耐性を示す。 プラスミドG-pPLa8 プラスミドG-pPLa8（第９図に示す）は、β−ラクタ
マーゼ遺伝子におけるPstＩ部位をBamHI部位に変えるこ
とによりpPLa2311から得られた。これは、PstＩ−開裂p
PLa2311のS1ヌクレアーゼ処理の後、BamHIリンカ断片
（コラボラテイブ・リサーチ・インコーポレーション、
ワルタム、マサチューセッツから得られたもの）への平
滑末端連結およびBamHI開裂後の分子の再環化によって
達成された。プラスミドpPLa8はもはやカルベニシリン
耐性に対し特異的でないが、まだカナマイシン耐性を示
す。 プラスミドG-pHLc24 プラスミドG-pPLc24（第10図に示す）はβ−ラクタマ
ーゼ遺伝子とpBR322からの複製開始点とを含有する。29
0塩基対HaeII-EcoRI断片はバクテリオファージλからの
PLOL域を含有する。PLプロモータからの転写方向はEcoR
I部位に指向する。431塩基対EcoRI-BamHI断片は、プラ
スミドPMS2-7から得られた、リボソーム結合部位とバク
テリオファージMS2レプリカーゼ遺伝子の最初の98アミ
ノ酸残基とをコードする〔アール・デボス等、「バクテ
リオファージMS2RNAのほぼ完全寸法DNAコピーを含有す
るプラスミドの作成および特性化」、ジャーナル・モレ
キュラー・バイオロジー、第128巻、第595〜619頁（197
9）〕。MS2レプリカーゼ蛋白質断片の翻訳はPLプロモー
タからの転写と平行して起こる。 B.PLプロモータ活性の温度依存性の開始 PLプロモータ（プラスミドpPLa2311、pPLa8およびpPL
c24に存在する）は、リプレッサ蛋白質を合成するイー
・コリ菌株にプラスミドを維持することにより抑制され
る。合成の自己調節様式〔エム・プタシン等、「バクテ
リオファージλにおけるリプレッサの自己調節および機
能」、サイエンス誌、第194巻、第156〜161頁（197
6）〕により、溶原性菌株の染色体に対するcI遺伝子の
一コピーは、多重コピープラスミドに存在するPLプロモ
ータを完全に抑制することができる。 本発明に使用した菌株は、イー・コリK12ΔHI〔K12M7
21acamΔtrpEA2SmR（λc1857Nam7Nam53ΔHIビオ）；ユ
ー・バーナード等、「バクテリオファージλPLプロモー
タからの遺伝子発現を促進するプラスミドクローン化運
搬体の作成」、ジーン誌、第５巻、第59〜76頁（197
9）〕およびイー・コリM5219（K12M721acamtrpamSm
R（λcI857ΔHIビオ252）；エッチ・グリア、「バクテ
リオファージλのKi1遺伝子」、バイロロジー、第66
巻、第589〜604頁（1975）〕であった。両菌株は、突然
変異cI遺伝子を有する欠陥のある非切断性λプロファー
ジを含んでいる。この突然変異遺伝子は温度感受性リプ
レッサをコードし、従って温度を変えることによりPLプ
ロモータからの転写を開始させ、すなわち28℃において
リプレッサは活性であってPLプロモータからの転写を抑
制するが、42℃においてリプレッサは不活性となってPL
プロモータからの転写が開始される。 プロファージのΔHI削除は、cro遺伝子の一部とcroの
さらに右方までの他の遺伝子の全てを除去する〔エム・
カステラッチ等、「プロファージＩイー・コリK12とし
て存在するバクテリオファージλにおける単離および削
除の特性化」、モレキュラー・ゼネラル・ゲネチック
ス、第117巻、第211〜218頁（1972）〕。cro遺伝子の削
除は有利である。何故ならcro蛋白質の蓄積はPLプロモ
ータからの転写を抑制することが知られているからであ
る〔エー・ジョンソン等、「バクテリオファージλのcr
o蛋白質の作用メカニズム」、プロシーディング・ナシ
ョナル・アカデミー・サイエンス・USA、第75巻、第178
3〜1787頁（1978）〕。さらに、菌株M5219はビオ252の
削除を含み、これは全ての遺伝子をkilを含む左方cIII
まで除去する。 温度誘発させると菌株M5219は、機能性Ｎ−遺伝子生
産物を発現する。他方、菌株K12ΔHIはＮにおける２つ
のアンバー（amber）突然変異体を有してこれを機能的
にＮ−陰性にする。Ｎ遺伝子の生産物は、バクテリオフ
ァージλにおいて抗−停止因子として作用することが知
られている〔ジェー・ダブリュ・ロバーツ、「ファージ
λにおける転写停止および遅延抑制」、プロシーディン
グ・ナショナル・アカデミー・サイエンス・USA、第72
巻、第3300〜3304頁（1975）〕。抗−停止作用は、RNA
転写がPLプロモータにおいて開始する限り、ファージλ
DNAには天然に存在しない停止因子配列において同様に
観察された（例えば、trp作用子の末端における自然停
止）。さらに、PL転写における無意味コドンの存在によ
りもたらされる極性効果は、Ｎ−遺伝子蛋白質の作用下
で顕著になった〔参考として、エヌ・フランクリンおよ
びシー・ヤノフスキー、「λのＮ蛋白質：イー・コリRN
Aポリメラーゼの転写停止、極性および変化に関する証
明」、RNAポリメラーゼ（コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリーズ、1976）、第693〜706頁〕。 従って、熱誘発性の細菌cIのバックグラウンドに上記
プラスミドが存在すれば、PLプロモータの活性の実験的
開始および停止が可能になる。さらに、K12ΔHIまたはM
5219を選択すれば、転写をＮ−遺伝子生産物の不存在下
または存在下のいずれかにおいて進行させることが可能
になる。後者は、上記したように、RNAポリメラーゼに
対する転写停止因子様配列または遅延配列を有するDNA
領域を転写させる場合有利であろう。 C.PLプロモータを含有するプラスミドに挿入されたHuIF
N−βをコードするようなDNA配列を有するクローンの作
成 以下の説明において、プラスミドDNAの単離、DNAの制
限分析およびDNA断片の連結は、二本鎖DNAのクローン化
について上記したものと同様に行なった。形質転換過程
も上記のように行なったが、ただし菌株K12ΔHIまたはM
5219を宿主として使用した場合は、熱ショックを34℃に
て５分間行ないかつ形質転換細胞を28℃で培養した。 1.プラスミドＧ−pPLa−HFIF−67−１の作成 この作成の原理は、クローンＧ−pBR322（Pst）/HFIF
-6およびG-pBR322（Pst）/HFIF-7からの適当な制限断片
の組合せがIFN−βの完全かつ連続的なコード配列の再
編成を可能にするという観察に基づいている。幾つかの
作成過程にわたる誘導断片の流れを第８図に概略示す。
プラスミドG-pBR322（Pst）/HFIF-6をEcoRIとPstＩとで
開裂させ、そして予めPstＩとPvuＩとで開裂されている
プラスミドG-pBR322（Pst）/HFIF-7に連結した。連結
後、混合物をEcoRIとHaeIIとで消化した。次いで４倍モ
ル過剰のこの混合物を、予めHaeIIとEcoRIとで消化され
ているプラスミドG-pPLa2311に連結した。カナマイシン
耐性についての選択により、菌種C600rKmK +（λ）〔こ
の菌株は、その比較的高い形質転換能力を有しかつ野性
型のcI遺伝子を含んでいるため使用した〕において形質
転換種を得た。選別した15種の形質転換種のうち、２種
のものがカルベニシリン耐性を喪失していた。これら形
質転換種のプラスミドから単離されたDNAの制限分析
は、１種のものが第８図に示されたG-pPLa-HFIF-67-1の
所望構造を有することを示した。このプラスミドは独特
のEcoRI部位と独特のPstＩ部位とを含んでいた。EcoRI-
PstＩ混成消化は２種の断片を生成し、その小さい方の
ものはG-pBR322（Pst）/HFIF-6のEcoRI-PstＩ開裂後に
得られた断片と共に挙動した。BgiII消化は約650塩基対
の小さな断片を開裂した。後者の断片の寸法は、クロー
ンG-pBR322（Pst）/HFIF-6の近心的BglII-PstＩ断片をG
-pBR322（Pst）/HFIF-7の遠心的PstI-BglIIの部分に結
合した後予想される寸法に一致する。HincII消化は、PL
領域とβ−ラクタマーゼ遺伝子のアミノ末端部のHuIFN
−βのDNA配列の未翻訳5-末端とにおいて、HincII部位
の存在から予測される３つの断片を生成した。このプラ
スミドをG-pPLa-HFIF-67-1と名付けた。 制限酵素分析による上記の特性化に基づけば、プラス
ミドG-pPLa-HFIF-67-1はHuIFN−βに対する完全なコー
ド配列を含有する筈である。所望の転写の方向は、PLプ
ロモータからのそれに対し共線的に延びる。PLとHuIFN
−βコード配列遺伝子との間に、プラスミドはG-pBR322
（Pst）/HFIF-6におけると同様にポリ（Ａ・Ｔ）末端と
逆転3-末端断片とを保持する。 3.プラスミドG-pPLa-HFIF-67-12の作成 作成における次の過程は、G-pPLa-HFIF-67-1からポリ
（Ａ・Ｔ）末端と逆転3-末端断片の一部との除去を目的
とした（第９図）。G-pPLa-HFIF-67-1DNAをBglIIとHpaI
Iとで開裂させた。HuIFN−βコード配列はHpaII部位を
含有していないので、この処理はIFN−β用の全コード
配列を含有するBglII断片をもたらすと同時にベクタの
残部を失活させる。得られたBglII断片を、予めBamHIに
より消化されているプラスミドG-pPLa8に連結した。酵
素BglIIとBamHIとは同一の波形末端を形成し、BglII末
端を開裂BamHI部位に連結させることができ、またその
逆もできる。この種の再編成された部位はもはやBglII
もしくはBamHIに対する基質でないが、酵素Sau3AI（Mbo
Ｉ）により識別される〔ヴィー・ピロッタ、「バチルス
・グロビギイ（Bacillus globigii）からの２種の制限
エンドヌクレアーゼ」、ヌクレイック・アシッド・リサ
ーチ、第３巻、第1747〜1760頁（1976）〕。連結後、混
合物を再びBamHIで開裂して、簡単に再環化されている
ようなG-pPLa8分子を除去した。再び、カナマイシン耐
性について選択したC600rKmK +（λ）において形質転換
種を得た。 上記したようにアガロースゲル上での未開裂DNAのサ
イズ決定により形質転換種を選別して、IFN−β関連組
替えプラスミドを特性化した。G-pPLa8の親より僅かに
大きいことが証明されたクローンを、さらにPstＩまた
はHincIIによる制限分析にかけた。１つのPst部位と３
つのHincII部位とを有する１つのクローンを見出した。
このクローンの１つの断片はHincII断片と共に、PLから
誘導されたpPLa8からβ−ラクタマーゼ域まで移動し
た。クローンの他の小さい断片は約400塩基対の大きさ
を有し、PLプロモータに関する配向方向においてG-pPLa
8中へのBglII断片の挿入と一致した。このプラスミドを
G-pPLa-HFIF-67-12と名付ける。このプラスミドの作成
に使用した過程を第９図に概略示す。このプラスミドの
一層詳細な地図を第11図に示す。このプラスミドの大き
さ（〜4450塩基対）はその成分断片の大きさにより推定
し、成分断片はアガロースゲルにおける電気泳動の際の
比移動度により推定した。 次いで、イー・コリK12ΔHIおよびM5219を、特性化さ
れたプラスミドG-pPLa-HFIF-67-12により形質転換させ
た。 G-pPLa-HFIF-67-12におけるBglII/BamHI接合部の近傍
の測定ヌクレオチド配列を検査すると、興味ある特徴が
判る。そのプラスミドのβ−ラクタマーゼコード配列の
AUGにおいて開始されるポリペプチドは、HuIFN−βコー
ド配列の未翻訳5-末端内に位置する二重アンバーコドン
において終了する。これらの停止コドンは、HuIFN−β
シグナルペプチドの開始AUGより23個のヌクレオチド前
に存在する。すなわち、 枠内の数値は、pBR322のβ−ラクタマーゼ蛋白質におけ
るアミノ酸残基の数を意味する〔ジェー・サットクリ
フ、上記〕。星印（＊）はpBR322のこの位置に存在する
CCUコドンが、pPLa2311におけるPstＩ部位をpPLa8にお
けるBamHI部位に変化させた結果、CCCに変化したことを
示している（上記参照）。 従って、この構成はHuIFN−βシグナルペプチドのAUG
における再開始を可能にし、従ってそのシグナルペプチ
ドに融合しているがβ−ラクタマーゼの部分には融合し
ていないIFN−βの発現を可能にする。早期停止に続く
この種の内部再開始がイー・コリ・ラクトースオペレー
タのリプレッサ遺伝子において観察されている〔ティー
・プラット等、「翻訳再開始：lacリプレッサ断片のAUG
再開始」、プロシーディング・ナショナル・アカデミー
・サイエンス・USA、第69巻、第897〜901頁（197
2）〕。この構成は、HuIFN−βシグナル配列の正確な細
菌識別による成熟IFN−βの分泌を可能にするであろ
う。 3.プラスミドG-pPLa-HFIF-67-12Δ19の作成 pBR322の既知配列およびHuIFN−βコード配列によ
り、G-pPLa-HFIF-67-12Δ19の作成 pBR322の既知配列およびHuIFN−βコード配列によ
り、G-pPLa-HFIF-67-12からの小さいHincII断片の削除
（β−ラクタマーゼ内部から、HuIFN−βシグナルペプ
チド開始AUGの前部における３個のヌクレオチドまで）
が、β−ラクタマーゼのAUGにて開始しかつHuIFN−βコ
ード配列の後に停止する連続翻訳リーディングフレーム
をもたらすことが推定されうる。従って、この構成は、
β−ラクタマーゼコード配列からの82個のアミノ酸残基
と、融合HincII部位においてコードされた１個のアミノ
酸とHuIFN−βシグナルペプチドと成熟HuIFN−βとより
なるポリペプチドをコードすることが予測される。 すなわち、次の通りである。 枠内の数値は、pBR322のβ−ラクタマーゼ蛋白質におけ
るアミノ酸残基の数を意味する〔ジェー・サットクリ
フ、上記〕。従って、この構成は、１個のアミノ酸を介
してHuIFN−βシグナルペプチドに融合したβ−ラクタ
マーゼの部分よりなる融合ポリペプチドを発現すること
ができ、ここでHuIFN−βシグナルペプチド自身は成熟H
uIFN−βに融合している。この種の融合蛋白質は細胞か
ら分泌することができる。 G-pPLa-HFIF-67-12をHincIIにより部分的に消化し
た。約0.01μg/mlのDNA濃度で連結した後、DNAをXorI
I、すなわち3-突出末端を生成するPvuＩのイソシゾマー
により開裂させ〔アール・ワング等、ビオヒミク・ビオ
フィジク・アクタ（印刷中）〕そして低DNA濃度にて再
連結した。親のG-pPLa-HFIF-67-12は２つのXorII部位を
含有する。すなわち、１つの部位はカナマイシン遺伝子
を失活させ、他の１つはプラスミドから削除されるべき
HincII断片に存在する。XorII消化−再連結過程の目的
は、HincII酵素により開裂されてない親DNA分子を除去
することである。この種の分子は２つのXorII部位を有
し、連結を行なう条件下で２つの断片は再結合すると思
われる。形質転換種が、カナマイシンに関して選択する
C600rK -mK +（λ）において得られ、これらを単一のPvu
Ｉ部位の存在に対する制限分析により選別した。その後
のクローンの分析は、HincII消化を用いて行なった。最
小のHincII断片を喪失したがその他はG-pPLa-HFIF-67-1
2と同一である１つのクローンをG-pPLa-HFIF-67-12Δ19
と名付けた。このプラスミドの作成に使用した過程を第
９図に略示する。このプラスミドの一層詳細な地図を第
12図に示す。このプラスミドの大きさ（〜4050塩基対）
はその成分断片の大きさを合計することにより推定し、
成分断片の大きさはアガロースゲルにおける電気泳動の
際の比移動度により推定した。次いで、イー・コリK12
ΔHIおよびM5219を、特性化されたプラスミドG-pPLa-HF
IF-67-12Δ19によって形質転換させた。 4.プラスミドG-pPLa-HFIF-67-8の作成 プラスミドG-pPLc24は、他の融合ポリペプチドを強力
に合成しうるような、HuIFN−β配列の挿入に関する他
の可能性を与える。G-pPLa-HFIF-67-1からのBglII断片
をG-pPLc24のBamHI部位に挿入すると、MS2レプリカーゼ
遺伝子からの98個のアミノ酸残基をコードする連続リー
ディングフレームが得られ〔ダブリュ・ファイエル等、
「バクテリオファージMS2RNAの完全ヌクレオチド配列：
レプリカーゼ遺伝子の一次および二次構造」、ネイチャ
ー誌、第260巻、第500〜507頁（1976）〕、27個のアミ
ノ酸はBglII部位とHuIFN−βシグナル配列の開始AUGと
の間の配列によりコードされ、続いてHuIFN−βシグナ
ルペプチドと成熟HuIFN−βとが存在する。すなわち、
次の通りである。枠内の数値は、MS2レプリカーゼ遺伝子蛋白質における
アミノ酸残基の数を意味する。〔アール・デボス等、上
記；ダブリュ・ファイエル等、上記〕。従って、この構
成は、MS2レプリカーゼの部分からなり、27個のアミノ
酸を介してHuIFN−βシグナルペプチド（これ自身は成
熟HuIFN−βに融合されている）に融合された融合ポリ
ペプチドの発現を可能にする。 G-pPLa-HFIF-67-1DNAをBglIIによって消化し、そして
BamHI開裂されたpPLc24DNAと連結した。連結混合物をBa
mHIにより再切断して親pPLc24分子を除去し、カルベニ
シリン耐性につき選択するC600rK -mK +（λ）に形質転換
させた。形質転換種をHincIIでの制限により分析した。
pPLc24上の制限部位の既知位置により、PLに関する配向
方向においてBglII-IFN−β断片を挿入すれば約650塩基
対の余分のHincII断片が生成することを予測できる。こ
の配置を示す代表的なクローンをpPLc-HFIF-67-8と名付
ける。このプラスミドの作成に使用した過程を第10図に
略示する。このプラスミドの一層詳細な地図を第13図に
示す。プラスミドの大きさ（〜3850塩基対）はその成分
断片の大きさを合計することにより推定し、断片の大き
さはアガロースゲルにおける電気泳動の際の比移動度に
よって推定した。イー・コリK12ΔHIおよびM5219を、特
性化されたプラスミドG-pPLc-HFIF-67-8により形質転換
させた。 5.プラスミドG-pPLa-HFIF-67-12Δ279Tの作成 プラスミドpKT279〔ケー・タルマツジにより寄贈され
た;pKT279はpBR322の誘導体であって、削除されるβ−
ラクタマーゼのための遺伝子部分を有しかつβ−ラクタ
マーゼのアミノ酸２に作られたPstＩ部位を有する〕をP
stＩにて消化し、3-末端延長部を除去しそしてデオキシ
−ヌクレオシド−トリホスファターゼの存在下における
イー・コリDNAポリメラーゼＩ（クレノー断片）での処
理によって断片を平滑端化（blunt-ended）させた。次
いで、PstＩ線状化されかつ3-平滑端化されたpKT279のD
NA断片をEcoRIで消化して、特にβ−ラクタマーゼのシ
グナル配列の成熟蛋白質における最初の４個のアミノ酸
とをコードする断片を生成させた。 次いで、この小さい断片を使用して、T4DNAリガーゼ
の存在下における前記断片とHpaI-EcoRI制限pPLa-HFIF-
67-12Δ19との連結によりG-pPLa-HFIF-67-12Δ19のHpaI
-EcoRI断片を置換した〔HpaＩ部位はG-pPLa-HFIF-67-12
からの上記削除の結果として生じた〕。 PstＩ（平滑端）‐HpaＩ接合部における予測配列は次
の通りである：（β−ラクタマーゼシグナルペプチドコ
ード配列）−CAC.CGC.AAC.His−Arg−Asn−AUG−（HuIF
N−βシグナルペプチドコード配列）−AUG−（成熟HuIF
N−βコード配列） その結果、この構成は、その先頭に、直列における２つ
シグナル配列（すなわち、細菌シグナル配列（β−ラク
タマーゼ）およびIFN−βシグナル配列）を数個のアミ
ノ酸を介して接続したIFN−βをもたらす。従って、こ
の構成は２つのシグナルペプチドに融合された成熟HuIF
N−βの発現を可能にし、或いは細菌シグナル配列とHuI
FN−βシグナル配列との直列組合せが細菌により識別さ
れて正確に開裂されれば、この構成は成熟HuIFN−βの
発現と細胞からのその分泌とを可能にする。 イー・コリM5219をpPLa-HFIF-67-12Δ279Tにより形質
転換させた。 6.プラスミドG-pPLa-HFIF-67-12Δ218M1の作成 プラスミドpKT218〔ケー・タルマツジにより寄贈され
た;pKT218はpBR322の誘導体であり、β−ラクタマーゼ
用の遺伝子の一部と削除されるそのシグナル配列を有し
さらにβ−ラクタマーゼのシグナル配列のアミノ酸４に
おいて作られたPstＩ部位を有する〕をEcoRIとAluＩと
で消化して、特にβ−ラクタマーゼ信号ペプチドの最初
の部分をコードする断片を生成させた。この断片を、ア
クチノマイシンＤ（0.05mM）の存在下におけるAluＩ消
化（プラスミドをIFN−βシグナルペプチドにおけるAlu
Ｉ部位にて制限する）とEcoRIでの制限とにより、pPLa-
HFIF-67-12Δ19から調製された断片に対し、T4DNAリガ
ーゼの存在下に連結させた。 pPLa-HFIF-67-12Δ218M1と名付けた得られたプラスミ
ドは、β−ラクタマーゼシグナルペプチドをコードする
遺伝子の最初の部分と、HuIFN−βシグナルペプチドを
コードする遺伝子の部分と、成熟HuIFN−βをコードす
る遺伝子とを含有した。このプラスミドの適切な領域の
予測配列は次の通りである。 枠内の数値は、pKT218のβ−ラクタマーゼシグナルペプ
チドにおけるアミノ酸残基の数を意味する。従って、こ
の構成は、細菌シグナル配列の部分とそれ自身のシグナ
ル配列の一部とに融合した成熟HuIFN−βの発現を可能
にする。ここでも、細菌宿主がハイブリッドシグナル配
列を識別して正確に開裂させれば、成熟HuIFN−βがこ
のプラスミドから発現されると共に細胞から分泌されう
るであろう。 イー・コリM5219を、pPLa-HFIF-67-12Δ218M1を用い
て形質転換させた。 7.プラスミドG-pPLa-HFIF-67-12ΔM1の作成 プラスミドpPLa-HFIF-67-12Δ19を、前記のようにア
クチノマイシンＤ（0.05mM）の存在下でAluＩにより線
状化させて、HuIFN−βのシグナルペプチドにおけるAlu
Ｉ部位で切断した。HpaＩで消化した後、DNAをT4DNAリ
ガーゼの存在下で再環化させた。得られたプラスミドを
pPLa-HFIF-67-12ΔM1と名付け、これは成熟IFN−βをコ
ードするDNA配列に先立ってIFN−βシグナル配列の極く
小さい部分を有した。接合部の予測配列は次の通りであ
る。 縦長枠内の数値は、β−ラクタマーゼにおけるアミノ
酸残基の数を意味し、横長枠は第二リーディングフレー
ム内の配列を意味する。従って、β−ラクタマーゼコー
ド配列と、IFN−βのシグナルペプチドに対する残部の
コード配列との翻訳は、UGA−停止コドンにおいて補足
される。しかしながら、同じ個所に成熟IFN−β用の開
始コドン（AUG）が存在し、ただし異なるリーディング
フレーム内に存在する。従って、その個所において翻訳
の再開始が起って成熟HuIFN−βを生成することができ
る。 イー・コリM5219をpPLa-HFIF-67-12ΔM1で形質転換さ
せた。 8.プラスミドG-pPLa-HFIF-67-12Δ19BX-2の作成 プラスミドpPLa-HFIF-67-12Δ19をHpaＩで線状化させ
かつエキソヌクレアーゼBal31で処理して、塩基対を順
次に線状化DNA断片の端部から順次除去した〔エッチ・
グレイ等、「シュードモナス・Bal31の細胞外ヌクレア
ーゼ。I.一本鎖特異性デオキシリボエンドヌクレアーゼ
の特性化」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第２
巻、第1459〜1492頁（1975）〕。エキソヌクレアーゼ処
理の時間および条件を変化させることにより、HuIFN−
βのシグナルペプチドに対するコード配列からの種々な
個数のヌクレオチドを有する一連のDNA断片を作成した
が、前記コード配列は成熟HuIFN−βのAUG開始コドンの
前部に位置する。次いで、これら断片を処理して、その
開始コドンから種々な間隔にあるリボソーム結合部位を
作りかつそのコドン近傍に所望の二次構造を与えて成熟
HuIFN−βの発現を向上させることができる。 エキソヌクレアーゼ処理した断片を、dATPとdGTPとの
存在下でイー・コリDNAポリメラーゼＩ（クレノー断
片）により平滑端化させて、任意の5-突出端部を充填し
た。次いで、配列5--CCTCGAGG-3-を有する二本鎖XhoＩ
リンカ（コラボラテイブ・リサーチ社）を平滑端化DNA
断片に連結させた。次いで、これら断片を、配列5--CCG
AATTCGG-3-を有する二本鎖EcoRIリンカ（コラボラテイ
ブ・リサーチ社）で伸長させた。EcoRI消化の後、「付
着性」EcoRI端部を有する断片をイー・コリDNAリガーゼ
により再環化させた。T4DNAリガーゼに代えてこのリガ
ーゼを使用すれば、平滑端化断片の再環化が避けられ
る。 １つのプラスミドを選択し、pPLa-HFIF-67-12Δ19BX-
2と名付けた。これは、成熟HuIFN−βのAUG開始コドン
の前部に約25個の塩基対のXhoＩ部位を有する。さら
に、XhoＩ部位の前部にはEcoRI部位が存在し、これはHp
aＩ断片のEcoRIリンカをpPLa-HFIF-67-12Δ19におけるP
Lプロモータ直前のEcoRI部位に連結して生じたものであ
る。従って、β−ラクタマーゼコード配列は削除されて
いる。さらに、HuIFN−βシグナル配列の少なくとも一
部が除去されているため、成熟HuIFN−βの発現のみが
可能である。 イー・コリK12ΔHIをpPLa-HFIF-67-12Δ19BX-2によっ
て形質転換させた。 細菌により作られたHuIFN−βの単離と特性化 A.細菌抽出物の調製 1.誘発手順 上記のようにIFN−β断片を含有するプラスミドで形
質転換させた菌株K12ΔHIおよびM5219の保存培養物を包
含する保存培養物（50％グリセリン−50％LB倍地におい
て−80℃で凍結）からの一部を、所望の抗生物質を含む
新たなLB倍地中に接種して28℃にて飽和するまで増殖さ
せた。抗生物質を含まないLB倍地の２つの500mlバッチ
に各1mlの飽和細胞を接種し、激しく振とうしながら28
℃にて細胞密度２×108/mlになるまで増殖させた。一方
のバッチを42℃に高めて振とうを続けた。使用したプラ
スミドに応じ、42℃に変化させた後種々の時間で培養物
を採取した。28℃に留めた比較培養物を、42℃の培養物
と同じ時間で採取した。細胞をGSA型ロータ（ソルバー
ル）にて8000rpmで10分間遠心分離することにより回収
した。ペレットを20mlの50mMトリスHCl（pH7.4）と30mM
NaClとで洗浄し、SS34型ロータ（ソルバール）にて10,0
00rpmで10分間再ペレット化させた。このペレットをド
ライアイス−メタノール中で迅速に凍結させて、−80℃
にて保存した。採取した細胞を浸透圧ショックにかける
ことを望む場合は、凍結過程を省略した。 細菌の溶菌および抽出には２つの異なる手順を使用し
た。 2.抽出手順 溶菌Ａ 細胞を最終容量4mlの上記緩衝液に再懸濁させ、リゾ
チーム（シグマ社）を1mg/mlまで加えた。０℃にて30分
間培養した。順次にエタノール−CO2混合物（−80℃）
と37℃の水浴とに浸漬して、懸濁物を凍結−解凍サイク
ルに２回かけた。溶菌した細菌（40ml）をベックマンSW
60型Tiロータにおいて４℃で60,000rpmにて１時間超遠
心分離することにより、S-100フラクションを調製し、
その後上澄液をさらに使用した。 溶菌Ｂ 上記（溶菌Ａ）と同様に溶菌Ｂを行なったが、ただし
50mMトリス−HCl（pH8.0）−30mMNaClの代りに50mMのHE
PES（シグマ社）−NaOH（7.0）と30mMのNaClと3mMのβ
−メルカプトエタノールと３％の新生児牛血清（ギブコ
社）とを使用した。 浸透圧ショック 回収しかつ洗浄した直後に、細胞ペレットを20％のシ
ョ糖と100mMのEDTAと100mMのトリス−HCl（pH7.4）との
中に最大細胞密度１×1010/mlにて再懸濁させた。この
懸濁物を氷上に10分間保ち、次いでソルバールSS34型ロ
ータにおいて10,000rpmで10分間遠心分離した。ショ糖
溶液を遠沈管から慎重に排液し、ペレットを等容量の水
中に再懸濁させた（細胞密度/1×1010/ml）。再懸濁し
た細胞を氷上に10分間保ち、次いで再びSS34型ロータ
（ソルバール）にて10,000rpmにて10分間遠心分離にか
けた。上澄液を胎児牛血清中３％、HEPES緩衝液（pH7）
中50mM、NaCl中30mMおよびβ−メルカプトエタノール中
3mMにした。この上澄液を「浸透圧ショック上澄液」と
呼ぶ。これを０℃で保存した。 3.硫酸アンモニウム沈澱 室温で飽和の（NH4）2SO4溶液1mlを0.5mlの比較溶液
またはS-100抽出物に加えた。この混合物を氷上に少な
くとも30分間保ち、その後沈澱物をエッペンドルフ遠心
分離器にて室温で10分間ペレット化させた。このペレッ
トをPBS（リン酸緩衝塩液）中に再溶解させた。 B.インターフェロン測定 1.直接抗ウィルス分析 HuIFN−βを、染色体21に関しトリソミーのヒト繊維
芽細胞においてCPE（細胞病理学的効果）−阻止技術に
よりミクロ測定皿（ステリリン社）で分析した。細胞を
使用の１日前に接種し、試料を一連に希釈して（log10
＝0.5）24時間培養しそして1ml当り106.9ネズミC-929プ
ラーク形成単位を含有する保存物の水胞性口内炎ウィル
ス（インディアナ株）10-3希釈物を接種した。VSV接種
の24時間後にCPEを記録し、インターフェロン数点を、
ウィルスCPEの50％減少をもたらす試料希釈と定義し
た。全ての分析はHuIFN−βの内部標準を含み、内部標
準はNIHヒト繊維芽細胞比較G023-902-527に対して検定
した。 染色体21に対しトリソミーの細胞系（以下、T21と呼
ぶ）を、ダウン症候群の婦人患者の皮膚バイオプシから
得た。その核型を確定し、これは染色体21（トリソミ
ー）以外全ての染色体につき二倍性を示した。インター
フェロンに対するこの細胞系の感度は、イー・デ・クラ
ーク等により記載された染色体21に関しトリソミーの細
胞系の感度に匹敵すると思われる〔「インターフェロン
の非抗ウィルス活性は染色体21により調節されない」、
ネイチャー誌、第256巻、第132〜134頁（1975）および
「染色体21はインターフェロン受容体をコードしな
い」、ネイチャー誌、第264巻、第249〜251頁（197
6）〕。 他の分析においては、細胞系E1SM〔エー・ビリオー
等、「臨床試験用のヒト繊維芽細胞インターフェロン：
生産、部分精製および特性化」、アンチミクロビアルエ
ージェント・アンド・ケモテラピー、第16巻、第49〜55
頁（1979）〕を使用した。この細胞系は染色体21に関し
ジソーミックな二倍体繊維芽細胞であり、２ヶ月令ヒト
胎児から得られた。T21細胞系と比較して、E1SMは係数1
0だけHuIFN−βに対し感度が低い。 2.2,5-Aシンセターゼ分析 インターフェロンの存在を検出する他の方法は、2,5-
Aシンセターゼ分析の使用によるものである。インター
フェロンは、ATPを2,5-Aの三量体に変化させる（より低
い程度であるが二量体、四量体および多量体に変化させ
る）この酵素を誘起させることが示されている〔エー・
キムチ等、「インターフェロンによる３種の翻訳制御酵
素の誘起に関する速度論」、プロシーディング・ナショ
ナル・アカデミー・サイエンス・USA、第76巻、第3208
〜3212頁（1979）〕。 E1SM細胞（エー・ビリオー等、上記）の培養物を含有
する25mlフラスコを、細菌抽出物の1:6希釈物またはMEM
-10％胎児牛血清中の比較インターフェロンで20時間処
理した。培養物をトリプシン（0.25％）とEDTA（0.17
％）とで分離させ、35mMトリス緩衝液（pH7.5）中の140
mMのNaClで充分に洗浄した。全ての後の操作は４℃で行
なった。細胞を、10mMのKClと1.5mMの酢酸マグネシウム
と0.5mMのジチオスレイトール（「溶菌緩衝液Ｉ」）と
を含有する1.5〜2.0容量の20mMのHEPES緩衝液（pH7.4）
においてダウンスガラス製ホモジナイザーで均質化させ
た。均質化物を10,000×ｇで20分間遠心分離し、そして
直ちに使用しない場合は上澄液（S10）を液体窒素中で
保存した。 96穴のミクト測定板（0.28cm2穴当り0.2ml中105個の
細胞）を、インターフェロンまたは上記のような各細菌
抽出物で処理した。20時間の処理の後、測定板を氷上で
冷却しそして35mMトリス緩衝液（pH7.5）中の140mMNaCl
で３回洗浄した。次いで、各穴に、0.5％ノニデットP40
と1mMフッ化フェニルメタンスルホニル（PMSF）とを溶
菌緩衝液Ｉ中に含有する溶液５μｌを加えることによ
り、培養物を溶菌させた。氷上で激しく20分間振とうし
た後、細胞溶菌物を集めそして上記のように10,000×ｇ
にて20分間遠心分離した。 上記のようにして調製した3.5μｌの溶菌物（溶菌Ａ
または溶菌Ｂ）を、100mMの酢酸カリウムと25mMの酢酸
マグネシウムと10mMのHEPES/KOH（pH7.4）と5mMのATPと
4mMのフラクトース−1,6−ビスホスフェートと1mMのジ
チオスレイトールと20μg/mlのポリ（Ｉ）・ポリ（Ｃ）
と２μCiの凍結乾燥した（α−P32）−ATP（400Ci/ミリ
モル、ラジオケミカル・センター、アメルシャム、U.
K）とを含有する培養混合物６μｌにおいて31℃で２時
間培養した。95℃にて３分間加熱して反応を停止させか
つ9,000×ｇにて２分間清澄させた後、試料を牛の腸か
らのアルカリホスファターゼ（ベーリンガー社、マンハ
イム、カタログNo.405612）150U/mlで37℃にて１時間処
理し、再び清澄させそしてポリエチレンイミン−セルロ
ース（ポリグラム、セル300PEI20×20cm、マシエレイ−
ナゲル社、デュレン、西ドイツ）の薄層板上にスポット
した（１試料につき１μｌ）。これら板を2lの蒸留水で
２回洗浄し、クロマトグラフィーにかける前に1M酢酸中
で２〜３時間減圧下に乾燥させた。乾燥後、これらをオ
ートラジオグラフ分析に１〜24時間かけた。 C.細菌抽出物中のHuIFN−β活性の検出 1.比較実験 ２つの主要な問題が上記分析の性能において遭遇され
た。両者は分析データを解釈する上で重要である。上記
の手順により溶菌から生ずる細菌抽出物（比較抽出物を
含む）は、分析において抗ウィルス活性を示す非インタ
ーフェロン関連因子を含むと思われた。この因子自身が
抗ウィルス性物質であったかどうか、或いはこの因子が
分析条件下で抗ウィルス性物質、例えばインターフェロ
ンを誘発させたかどうかは不明である。この因子の存在
をS100抽出物において繰返し検出した。この因子の活性
は、恐らく細胞密度のため、K12ΔHIまたはM5219宿主細
菌の同様な比較抽出物（ここで因子の活性は常に約0.71
og10/ml以下である）におけるよりもイー・コリHB101
からの比較抽出物においてしばしばより高いものであっ
た。幾つかの理由により、この因子の抗ウィルス活性
は、比較実験においてインターフェロンをも沈澱させた
条件下において、（NH4）2SO4での沈澱により低下され
或いはしばしば完全に除かれた。 この汚染性因子に起因する抗ウィルス活性のため、細
菌抽出物における微量のインターフェロンの存在につい
て結論を引き出すことは困難である。しかしながら、こ
の因子の抗ウィルス活性と標準インターフェロンの活性
との間の区別を、二倍体繊維芽細胞E1SMの使用により見
出すことは可能であった。これら細胞は、染色体21に対
しトリソミーの通常の細胞よりもHuIFN−βに対し感受
性が低い。しかしながら、これら細胞は、真のインター
フェロンに対するよりもこの因子に対しずっと感受性が
大である。例えば、イー・コリHB101〔エッチ・ボイヤ
ーおよびディー・ルーランド−ドウソワ、「大腸菌にお
けるDNAの制限および改変の補足分析」、ジャーナル・
モレキュラー・バイオロジー、第41巻、第459〜472頁
（1969）〕におけるpMS2-7〔アール・デボス等、「バク
テリオファージMS2RNAのほぼ完全寸法のDNAコピーを含
有するプラスミドの作成および特性化」、ジャーナル・
モレキュラー・バイオロジー、第128巻、第595〜619頁
（1979）〕或いはK12ΔHI-G-pPLa2311を比較溶菌物とし
て使用して、この相対的効果を示すデータを次表に示す
が、ここで抗ウィルス活性はlog10単位/mlとして測定し
た。 さらに、標準HuIFN−βの存在は、前記因子の存在に
より得られる値と比較して、T21:E1SMに関する値の異な
る比とT21に関する高い値とにより反映される。これを
次のデータに示す。 従って、活性T21:E1SMの比較とT21細胞に関する絶対
活性の測定は、上記のように抗ウィルス分析の使用によ
り細菌抽出物中のHuIFN−βの存在を明確に検出するこ
とを可能にする。さらに、本発明の幾つかのプラスミ
ド、例えばG-pPLa-HFIF-67-12、G-pPLa-HFIF-67-12Δ1
9、G-pPLc-HFIF-67-8、G-pPLa-HFIF-67-12Δ279T、G-pP
La-HFIF-67-12Δ218MI、G-pPLa-HFIF-67-12ΔMIまたはG
-pPLa-HFIF-67-12Δ19BX-2より形質転換されたイー・コ
リ（K12ΔHIまたはM5219のいずれか）の培養物の抽出物
については、抗ウィルス分析における未知因子によるそ
のような干渉は大して重大でなかったことに注目すべき
である。これら分析において、高度に濃縮されていない
抽出物（例えば、６×108個/mlの培養物150mlからの細
胞を溶菌させて4ml中に抽出したもの）は、未知因子に
起因する抗ウィルス活性の低レベルもしくは検出しえな
いレベルを示した。 さらに、この汚染性因子の存在も、2,5−Ａシンセタ
ーゼ活性分析において検出しうることが示された。しか
しながら、ここでこの因子は（NH4）2SO4での沈澱によ
り完全に除去することができる。従って、細菌抽出物に
おけるHuIFN−βの実際の存在は、汚染性因子の存在か
ら区別され、この分析において明確に検出することがで
きる。 しかしながら、イー・コリHB101/G-pBR322（Pst）/HF
IF-6からの抽出物は、不完全な共線状コード配列（最後
の二三の塩基対のみが欠如している）を有し、従って成
熟ポリペプチドを発現することができず、反復して陽性
の2,5−Ａシンセターゼ活性を示したが、これまで識別
しうる抗ウィルス活性を示していない。このことは、2,
5−Ａ分析を細菌により作られた完全なインターフェロ
ンの存在に関する唯一の基準と見做しえないことを示し
ている。また、これは、完全成熟インターフェロンが有
用な活用を持ち得ないことを示している。 2,5−Ａシンセターゼ活性は、オートラジオグラフ分
析で示されるように、2,5−Ａ三量体中へのP32の組込み
により測定される。その結果（反復３回）を次表に示
し、正の値の増大はP32の増大した組込みを反映してい
る。 抽出a/pHFIF-6 →＋＋＋；（NH4）2SO4沈澱後→＋＋ 抽出b/pMS2-7 →＋＋＋；（NH4）2SO4沈澱後→− 抽出b/pMS2-7 →＋＋＋；（NH4）2SO4沈澱後→＋＋ プラスHuIFN−β これらの分析における第二の重要な問題は、異なる実
験過程の間およびその後にヒト繊維芽細胞により分泌さ
れたHuIFN−βの低回収率である。白血球インターフェ
ロンとS-100抽出物に加えられた繊維芽細胞インターフ
ェロンとの回収率の比較は、 HuIFN−αの100％回収率に比較しHuIFN−βが僅か10％
の効率で回収されることを示している（抗ウィルス値は
log10単位/mlとして示され、T21細胞について分析され
る）。 HB101-pMS2-7のS100抽出物中に希釈されたIFN−α（溶
菌Ａ） :2.5 E-MEMプラス３％牛血清中に希釈されたIFN−α :2.7 HB101-pMS2-7のS-100抽出物中に希釈されたIFN−β（溶
菌Ａ） :0.7 E-MEMプラス３％牛血清中に希釈されたIFN−β :1.7 溶菌および抽出の前に細胞ペレットにIFN−βを加え
た他の実験（牛血清を安定剤として３％まで加えた）
は、僅か10〜30％のIFN−βが回収されたことを示し
た。 さらに、他の実験を行なってIFN−β活性の安定性と
回収率とを試験した。細菌抽出物の存在下または不存在
下のいずれかにおける上記したような（NH4）2SO4によ
る沈澱は、しばしば抗ウィルス分析における測定値の減
少をしばしばもたらした。 細菌抽出物の存在下または不存在下のいずれかにおけ
るIFN−βの透析（PBSに対し４℃で一晩）は、通常IFN
−β活性の回収率低下をもたらした。 IFN−βは型Ｉのインターフェロンであるから、その
活性は酸安定性の筈である。これは、細菌抽出物の存在
下または不存在下にIFN−β試料を5mMグリシン−HCl（p
H2.2）において４℃で一晩透析することにより試験し
た。この処理は沈澱物の生成をもたらし、この沈澱物を
エッペンドルフ遠心分離器において12,000×ｇにて２分
間ペレット化させた。次いで、上澄液を抗ウィルス活性
について試験した。この処理の後に幾分かの抗ウィルス
活性が残存したが、回収インターフェロン量には相当の
損失が生じた。 上記比較抽出物に対するこれらの異なる処理により観
察されたHuIFN−β活性の低下は、慎重に解釈せねばな
らない。この比較的低い抗ウィルス測定値は、インター
フェロンが分解したことを必ずしも意味しない。この低
い測定値は、透析膜に対する或いは細菌抽出物、例えば
膜成分に対するHuIFN−βの非特異的粘着に起因するこ
ともある。例えば、IFN−βは疎水性蛋白質であって
（その疎水性はさらにそのアミノ酸配列により具現化さ
れる）、管壁またはその他の表面に非特異的に粘着しう
ることが充分に確認されている。さらに、グリコシル化
を欠如する細菌IFN−βはより一層疎水性でありうる。
従って、ヒト細胞により分泌されるグリコシル化IFN−
βの回収に関する結論は、必ずしも細菌源のIFN−βに
外挿することができない。 2.IFN−β活性の例示 a.抗ウィルス活性 プラスミドG-pPLa-HFIF-67-12、G-pPLa-HFIF-67-12Δ
19、G-pPLc-HFIF-67-8、G-pPLa-HFIF-67-12Δ279T、G-p
PLa-HFIF-67-12Δ218MI、G-pPLa-HFIF-67-12ΔMIまたは
G-pPLa-HFIF-67-12Δ19BX-2を含有するイー・コリM5219
またはK12ΔHIの細菌抽出物を、IFN−β抗ウィルス活性
につき分析した。誘発ならびにS-100抽出物および浸透
圧ショック上澄液の調製に関する手順は実質的に上記し
た通りとした。１回の実験当り150mlの細菌培養物（３
〜６×108細胞/ml）を使用した。全ての生物学的測定値
をlog10単位/mlで示す。 G-pPLa-HFIF-67-12 G-pPLa-HFIF-67-12を使用してイー・コリM5219および
イー・コリK12ΔHIを形質転換させそしてS-100抽出物を
溶菌Ｂにより調製した。全ての試料は、抗ウィルス活性
につき試験する前に（NH4）2SO4で沈澱させた。 上記の表における第２番目の数値は、同じ試料の再分
析において測定された測定値である。細胞の溶菌前に標
準IFN−βをイー・コリHB101-PMS2-7に加えた比較実験
は、この分析において30％のIFN−β回収率を示した。
従って、誘発の際IFN−β抗ウィルス活性が細菌溶菌物
中に検出されることは明白である。E1SM細胞の検出レベ
ル以下において、測定値は、IFN−β活性が汚染性細菌
活性に起因するものでないことを明らかに示している。
この種の汚染性細菌活性は、E1SMに関し少なくとも2.0
の値を示し、この値はT21細胞に関し0.5もしくは0.7の
値に相当するであろう（上記比較実験参照）。 G-pPLa-HFIF-67-12Δ19 プラスミドG-pPLa-HFIF-67-12Δ19を使用してイー・
コリM5219を形質転換させ、S-100抽出物を溶菌Ｂにより
調製した。全ての試料を上記のように（NH4）2SO4で沈
澱させ、抗ウィルス活性につき分析した。ここでも、抽
出物中にHuIFN−β抗ウィルス活性が存在したことは明
白である。括弧内の数値は検出レベルを示し、これは組
織培養におけるヒト細胞に関し特定試料の或る程度の毒
性に基づくものである。 １）M5219-G-pPLa-HFIF-67-12Δ19（28℃） ２）M5219-G-pPLa-HFIF-67-12Δ19（42℃,90min,最終細
胞密度＝３×108/ml） T21について E１SMについて １） ＜0.5 2.2（＜2.0） ２） 2.2（＜0.5） 2.2（＜2.0） 細胞の溶菌前に標準IFN−βをHB101-pMS2-7に加えた
比較実験は30％の回収率を示した。ここで、E1SMについ
てよりもT21細胞についての高い数値およびT21について
の活性の比は、温度誘発された試料において、認めうる
汚染性細菌活性が存在しなかった（上記した通り）こと
を示している。 G-pPLc-HFIF-67-8 プラスミドG-pPLc-HFIF-67-8を使用してイー・コリM5
219を形質転換させ、S-100抽出物を溶菌Ｂにより調製し
た。全ての試料を（NH4）2SO4で沈澱させ、抗ウィルス
活性につき分析した。 １）M5219-G-pPLc-HFIF-67-8（28℃） ２）M5219-G-pPLc-HFIF-67-8（42℃,180min,最終細胞密
度＝６×108/ml） T21について E１SMについて １） ＜0.5 2.2 （＜2.0） ２） 2.2（＜0.5） 2.2（＜2.0） 括弧内の数値は、毒性に基づく検出レベルを示す。細
胞の溶菌前に標準IFN−βをHB101-pMS2-7に加えた比較
実験は30％の回収率を示した。 ここでも、細菌抽出物がHuIFN−β抗ウィルス活性を示
したことは明白である。 他の実験において、これら細胞の浸透圧ショック上澄
液をIFN−β抗ウィルス活性につき分析した。 １）比較:M5219-G-pPLa-HFIF-67-12Δ19（28℃） ２）M5219-G-pPLc-HFIF-67-8（28℃） ３）M5219-G-pPLc-HFIF-67-8（42℃,180min,細胞密度＝
６×108/ml） （NH4）2SO4沈澱の前および後の両場合においてT21細
胞につき分析を行なった。括弧内の数値は検出の限界を
示す。 沈澱前 沈澱後 １） ＜0.2 ＜0.2 ２） ＜0.2 ＜0.2 ３） 1.5（＜0.2）0.7（＜0.2） IFN−βの回収率は比較実験において約10％であっ
た。比較溶菌物は、E1SMについては検出しうる活性を示
さなかった。浸透圧ショック上澄液について得られた値
は、温度誘発されたM5219-G-pPLc-HFIF-67-8抽出物が抗
ウィルス活性を有し、この活性は非誘発試料には存在し
ないことを明白にする。0.7log10単位/mlの測定値を有
する、（NH4）2SO4による沈澱後の試料（３）を上記の
ようにpH2.2まで透析したが、何ら実質的な活性低下を
示さなかった。この酸安定性は、型Ｉのインターフェロ
ン、例えばIFN−βの特別の性質である。 G-pPLa-HFIF-67-12Δ279T プラスミドG-pPLa-HFIF-67-12Δ279Tを使用してイー
・コリM5219を形質転換させ、S-100抽出物を溶菌Ｂによ
り調製した。T21細胞に関するCPEによる分析の前に、試
料を（NH4）2SO4で沈澱させた。42℃にて誘発させた細
胞の抽出物は、抽出物1ml当り1.5〜1.7log10単位の抗ウ
ィルス測定値を示した。 G-pPLa-HFIF-67-12Δ218MI プラスミドG-pPLa-HFIF-67-12Δ218MIを使用してイー
・コリM5219を形質転換させ、S-100抽出物を溶菌Ｂによ
り調製した。T21細胞につきCPEによって分析する前に、
試料を（NH4）2SO4で沈澱させた。42℃にて誘発させた
細胞の抽出物は、抽出物1ml当り1.5log10単位の抗ウィ
ルス測定値を示した。 G-pPLa-HFIF-67-12ΔMI プラスミドG-pPLa-HFIF-67-12ΔMIを使用してイー・
コリM5219を形質転換させ、S-100抽出物を溶菌Ｂにより
調製した。T21細胞につきCPEによって分析する前に、試
料を（NH4）2SO4で沈澱させた。42℃にて誘発させた細
胞の抽出物は、抽出物1ml当り20log10単位の抗ウィルス
測定値を示した。 G-pPLa-HFIF-67-12Δ19BX2 プラスミドG-pPLa-HFIF-67-12Δ19BX-2を使用してイ
ー・コリK12ΔHIを形質転換させ、S-100抽出物を溶菌Ｂ
により調製した。T21およびFS-4細胞につきCPEによって
分析する前に、試料を（NH4）2SO4で沈澱させた。42℃
にて誘発させた細胞の抽出物は、抽出物1ml当り1.7〜2.
0log10単位の抗ウィルス測定値を示した。 b.HuIFN−β抗ウィルス活性の抗体中和 IFN−βの細菌的発現の実証は抗体中和実験により与
えられる。抗インターフェロン抗血清を、107単位の標
準IFN−β（ヒト繊維芽細胞により分泌されたもの）で
免疫化された山羊において生成させ、そして調節した細
孔のガラスビーズで精製した（エー・ビリオー等、上
記）。細菌抽出物を抗ウィルス活性につき上記のように
分析した後、抗血清の一連の希釈物を同様な試料に加
え、混合物を37℃にて１時間培養し、ヒト二倍体繊維芽
細胞T21に施しそして前記したように抗ウィルス活性に
つき分析した。IFN−β抗血清による中和の程度は、＋
＋＋（完全中和）から−（中和なし）までの範囲とす
る。括弧内の数値は、50％中和に要する大凡の抗血清希
釈率を示す。 （１）M5219-G-pPLc-HFIF-67-8（42℃,180min,これはT
21細胞につき2.2log10抗ウィルス単位/mlを与えた。） （２）M5219-G-pPLa-8（42℃,180min.），これには溶菌
前にIFN−β（ヒト繊維芽細胞からのもの）を加えた
（これは、T21細胞につき1.7log10抗ウィルス単位/mlを
与えた。） 抗血清の希釈 （１） （２） 10-3 ＋＋＋ ＋＋＋ 10-4 ＋ ＋＋＋ 10-5 ±（10- 4.5） ＋＋＋ 10-6 − ±（10-6） 10-7 − − M5219-pPLa-HFIF-67-12Δ19（42℃）からの抽出物に
ついて同様な結果が得られた。本発明の細菌IFN−βと
標準IFN−βとの間の中和値の差は、抗原性における
差、或いは細菌蛋白質におけるグリコシル化の欠如によ
りもたらされる、標準IFN−βに対比したこれら細菌蛋
白質のIFN比活性における差に基づくこともある。 c.HuIFN−β抗ウィルス活性の安定性 （１）熱処理 IFN−βは、IFN−αに比較して極めて異常な性質を有
し、その抗ウィルス活性は１％のSDSと１％のβ−メル
カプトエタノールと5Mの尿素とにおいて沸騰させた後に
回収されるが〔スチュワート、ダブリュ・イー・II等、
「ヒトインターフェロンの独特な分子種類、安定化に対
する要件ならびにヒト白血球および繊維芽細胞インター
フェロンの再活性化」、ジャーナル・ゼネセル・バイロ
ロジー、第26巻、第327〜331頁（1975）〕、通常100％
の回収率は得られない。この分析のため150ml培養物の
細菌細胞を溶菌Ｂ用の緩衝液に再懸濁させ、等容量の２
％SDSと２％のβ−メルカプトエタノールと10Mの尿素と
を加え、混合物を２分間煮沸し、そしてS-100フラクシ
ョンを調製した。 １）比較:M5219-G-pPLa-HFIF-67-12Δ19（28℃） ２）比較：溶菌Ｂ緩衝液中に希釈したHLIFN−βの3log
10単位 ３）M5219-G-pPLc-HFIF-67-8（42℃,180min.,細胞密度
＝６×108/ml）。 T21細胞について分析を行なった。括弧内の数値は、
固有の毒性に基づく検出の限界を示す。 煮沸前 煮沸後 １） ＜1.5 ＜1.5 ２） 2.2（＜1.5）2.0（＜0.5） ３） 3.0（＜2.0）2.2（＜1.5） 比較実験は、IFN−β活性の約10％の回収率を示し
た。E1SMにおける並行比較溶菌物中には、検出しうる値
が存在しなかった。これらのデータは、添加IFN−βの
僅か約10％のみが比較実験において回収されるが、この
苛酷な処理後でさえもIFN−β抗ウィルス活性が温度誘
発M5219-G-pPLc-HFIF-67-8培養物からの抽出物に存在し
たことを明白にしている。実際上、この処理の後には溶
菌Ｂ手順に比較してより高い抗ウィルス活性が見出さ
れ、このことはIFN−βが溶菌Ｂ過程において細胞成分
に粘着しうることを示している。 （２）透析 HuIFN−β抗ウィルス活性は、また、非透析性であ
る。例えば、PBSに対し中性pHかつ４℃にて16時間透析
した後、細菌抽出物の抗ウィルス活性（log10単位/ml）
は測定値減少にも拘らず維持された。 １）M5219-pPLc-HFIF-67-8（42℃） ２）M5219-pPLa-HFIF-67-12Δ19（42℃） ３）M5219-pPLa-8中のIFN−β（42℃） 透析前 透析後 １） 2.3 2.3 １） ３ 2.3 １） 1.5 1.3 ２） 2.3 1.3 ２） 2.3 ２ ２） 2.3 １ 透析後における活性の観測される減少は、透析膜など
に対するIFN−βの非特異的粘着に基づくこともある。 （３）（NH4）2SO4による沈澱 本発明の細菌抽出物の抗ウィルス活性（log10単位/m
l）は、67％飽和硫酸アンモニウム〔抽出物１容量に対
し２容量の（NH4）2SO4溶液〕、すなわちHuIFN−βを沈
澱させることが知られた濃度で沈澱させた後にも維持さ
れた。氷上で30分後、ペレットを12000×ｇにて10分間
遠心分離し、分析用としてPBS中に再溶解させた。 １）M5219-pPLc-HFIF-67-8（42℃） ２）M5219-pPLa-HFIF-67-12Δ19（42℃） ３）M5219-pPLa-8中のIFN−β（42℃） 沈澱前 沈澱後 １） ２ ２ １） ２ 2.3 ２） ２ ２ ３） 1.3 1.3 ３） 1.5 1.3 （４）pH2処理 本発明の細菌抽出物の抗ウィルス活性（log10単位/m
l）は、さらに、酸に対して安定であった。抽出物を、5
0mlのグリシン−HCl（pH2.2）に対して15時間透析した
後PBSに対し３時間透析するか、或いはHClで酸性化した
後NaOHで中和した。沈澱物を除去した後、分析を行なっ
た。 １）M5219-pPLc-HFIF-67-8（42℃） ２）M5219-pPLa-HFIF-67-12Δ19（42℃） ３）M5219-pPLa-8中のIFN−β（42℃） 酸性化前 酸性化後 １） ２ 1.3 １） 0.7 0.7 ２） ２ １ ３） ３ ２ d.2,5−Ａシンセターゼ活性 M5219−G-pPLc-HFIF-67-8の浸透圧ショック物（上
記）を、ミクロ測定板を用いて上記のように2,5−Ａシ
ンセターゼの存在について分析したが、ただしE1SM細胞
の代りにヘラ（Hela）細胞を使用した。次の結果が得ら
れた。 １）M5219-G-pPLc-HFIF-67-8（28℃）（上記参照） ２）M5219-G-pPLc-HFIF-67-8（42℃）（上記参照） 数値は、2,5−Ａシンセターゼ活性を反映し、2,5−Ａ
の三量体型に組込まれたP32−放射能を示す。 2,5−Ａシンセターゼ活性分析の結果は、温度誘発さ
れたM5219-G-pPLc-HFIF-67-8の浸透圧ショック上澄液が
抗ウィルス活性を有し（上記参照）、さらに2,5−Ａシ
ンセターゼ活性を誘発するが、非誘発細菌菌株はそうで
ないことを示している。これは、抗ウィルス活性分析の
結果と一致する。 2,5−Ａシンセターゼの刺戟の程度は、比較溶菌物に
添加されたIFN−βの活性に等しい〔試料（３）および
（４）参照〕。試料（７）〜（10）から展開された濃度
曲線の使用は、希釈率を考慮に入れて、1.7log10単位/m
lの活性が両試料（３）と（４）とにおいて推定される
ことを示し、この値は両試料に対する直接的抗ウィルス
分析の値、すなわち1.5log10単位と一致する。さらに、
この系列の実験は、2,5−Ａシンセターゼの誘発を抗ウ
ィルス分析の場合と同様抗IFN−β抗血清により中和で
きることをも示している。 e.他の細胞系に関する抗ウィルス活性 抽出物（ｉ）および（ii）（上記のM5219-G-pPLc-HFI
F-67-8）を猫、ネズミ、猿または兎源についても抗ウィ
ルス活性につき試験した。それらは、これら細胞につい
て何らの検出しうる抗ウィルス活性を示さず、ヒト細胞
により作られた標準IFN−βも示さなかった。さらに、
ヒト白血球インターフェロンに鋭敏な猫肺細胞系につい
ても活性は見られなかった。これらの結果は、細菌によ
り生産されたIFN−βが誘発ヒト繊維芽細胞により分泌
されるIFN−βの性質に実質的に同じ性質を示すという
実証をさらに与える。 f.プロテアーゼに対する感受性 本発明の細菌宿主からのIFN−βの感受性を、希釈細
菌抽出物を増加量のトリプシンで37℃にて１時間処理す
ることにより試験した。IFN−βの抗ウィルス活性を、
不活性比較溶菌物に加えられた標準IFN−βの活性を破
壊するものと同様な濃度のトリプシンにより破壊した。 3.活性IFN−β生産物の同定 種々の実験は、プレ−HuIFN−βが活性でなく、細菌
細胞によりまたは活性生産物に対する分析条件下で処理
されないことを示した。従って、上記の各種細菌抽出物
において検出されるIFN−β活性は、恐らく、細菌によ
るまたは活性生産物に対する分析の条件下における予想
融合蛋白質（例えばβ−ラクタマーゼ、MS2または細菌
シグナル配列に融合したHuIFN−β）の処理に基づくで
あろう。 この種の抽出物における活性生産物が成熟HuIFN−β
であるとは限らない（成熟HuIFN−βは勿論、G-pPLa-HF
IF-67-12ΔMIおよびG-pPLa-HFIF-67-12Δ19BX-2の生産
物である）。しかしながら、変性条件下でのポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により例えば誘発M5219-pPLa-HFI
F-67-120Δ19からまたは誘発M5219-pPLc-HFIF-67-8から
得られた細菌抽出物の分別は、２種の活性生産物の存在
を明らかにした。これら生産物の第一のものは、寸法約
15000〜18000ダルトンであって、成熟IFN−βに相当す
るであろう。それより大きい分子量を有する第二の生産
物は融合生成物または不完全処理生成物であって、IFN
−β活性を有するか或いは分析の条件下で成熟IFN−β
まで処理された生成物であろう。各種の発現生産物のア
ミノ酸配列は、周知技術を用いて、成熟HuIFN−βの他
にどのような蛋白質生産物がHuIFN−βの活性を示すの
かの決定を可能にするであろう。 本発明により生産されるHuIFN−β活性を示すポリペプ
チドの収率および活性の向上 蛋白質の生産レベルは三つの主要な要因により支配さ
れる。すなわち、細胞内におけるその遺伝子のコピーの
数と、それら遺伝子コピーが転写される効率と、それら
が翻訳される効率とである。転写および翻訳（共働して
発現を構成する）の効率は、通常、所望コード配列の前
部に位置するヌクレオチド配列に依存する。これらのヌ
クレオチド配列または発現制御配列は、特に、RNAポリ
メラーゼが相互作用して転写を開始させ（プロモータ配
列）ると共にリボゾームがmRNA（転写の産物）と結合し
かつ相互作用して翻訳を開始させるような位置を規定す
る。必ずしも全てこの種発現制御配列が同等な効率をも
って機能するとは限らない。従って、所望蛋白質に関す
る特定コード配列をその隣接するヌクレオチド配列から
分離し、それらを寧ろ他の公知の発現制御配列に融合さ
せてより高レベルの発現を促進することが有利である。
このことは達成されているが、新たに作成されたDNA断
片をより高レベルのコピー数プラスミドまたはバクテリ
オファージ誘導体に挿入して細胞内の遺伝子コピー数を
増加させ、それによりさらに発現蛋白質の収率を向上さ
せることもできる。 幾つかの発現制御配列を上記のように使用することが
できる。これらには、イー・コリのラクトースオペロン
のオペレータ、プロモータおよびリボソーム結合および
相互作用配列（例えばシャイン−ダルガルノ配列を含
む）（「lac系」）、イー・コリのトリプトファンシン
セターゼの対応配列（「trp系」）ファージλの主要オ
ペレータおよびプロモータ域（上記したようなOLPLおよ
びORRR）、フィラメント状単一鎖DNAファージ制御領
域、或いは原核もしくは真核細胞およびそれらのウィル
スにおける遺伝子の発現を制御する他の配列が包含され
る。従って、適当な宿主において特定オリペプチドの生
産を向上させるには、そのポリペプチドをコードする遺
伝子を前記のように調製しそしてこれをその前者の発現
制御配列に近接する組替えDNA分子からまたは上記発現
制御配列の一つの制御下に取り出すことができる。この
種の方法は当分野で公知である。 翻訳の効率を向上させるための他の方法は、化学的ま
たは酵素的に調製されたオリゴヌクレオチドを開始コド
ンの前部に挿入することである。この方法により、一層
適した一次および二次構造のメッセンジャーRNAを得る
ことができる。さらに詳細には、この配列を、開始AUG
コドンがヘヤピンの頂部またはその他一本鎖域のいずれ
かにおける容易に近接可能な位置（すなわち、二次構造
により隠蔽されていない位置）に生ずるよう設計するこ
とができる。さらに、上記シャイン−ダルガルノセグメ
ントの位置および配列も同様に最適化させることができ
る。メッセンジャRNAの一般構造（折りたたみ）の重要
性も記載されている〔ディー・イセレンタントおよびダ
ブリュ・ファイエル、「mRNAの二次構造および翻訳開始
の効率」、ジーン誌、第９巻、第１〜12頁（1980）〕。 さらに、所望生産物の細胞収率における増加は、細胞
中に利用されうる遺伝子の数の増加に依存する。これ
は、HuIFN−β遺伝子（転写および翻訳制御要素を含む
または含まない）をずっと高度のコピー数プラスミドに
或いは温度制御されたコピー数プラスミド（すなわち、
温度を高めた後にプラスミドのコピー数が増加するよう
な突然変異を有するプラスミド、ビー・ウーリン等、
「クローン化遺伝子の増幅に対する温度依存性コピー数
を有するプラスミドおよびその生産物」、ジーン誌、第
６巻、第91〜106頁（1979））に挿入することにより達
成できる。代案として、例えば上記のように作成された
組替えDNA分子を鋳型バクテリオファージλ中に挿入す
ることにより、特に簡単にはプラスミドを制限酵素で消
化させて線状分子を与え、次いでこれを制限ファージλ
クローン化運搬体と混合することにより遺伝子投入の増
大を達成することができ〔例えば、エヌ・イー・ムレイ
等、「試験管内組替え体の回収を簡単化させるファージ
λ」、モレキュラー・ゼネラル・ゲネチックス、第150
巻、第53〜61頁（1977）およびエヌ・イー・ムレイ等、
「バクテリオファージT4からのDNAリガーゼ遺伝子の分
子クローン化」、ジャーナル・モレキュラー・バイオロ
ジー、第132巻、第493〜505頁（1979）〕、組替えDNA分
子をDNAリガーゼとの培養により生成させることができ
る。次いで所望の組替えファージを上記のように選択し
て、イー・コリの宿主菌株を溶原菌化させる。 特に有用なλクローン化運搬体は抑制遺伝子cIにおけ
る温度感受性突然変異体と、その生産物が宿主細胞の溶
菌にとって必要とされる遺伝子Ｓおよびその生産物がウ
ィルスの主要なカプシド蛋白質である遺伝子Ｅにおける
抑制しうる突然変異体とを含有する。この系を用いて、
溶原性細胞を比較的低温度（例えば28〜32℃）にて増殖
させ、次いで高温度（例えば40〜45℃）まで加熱してプ
ロファージの切除を誘発させる。高温度で長時間増殖さ
せると、細胞内に保持される蛋白質の高レベルの生産が
もたらされる。何故なら、通常の方法ではこれらはファ
ージ遺伝子生産物により溶菌されないからである。さら
に、ファージ遺伝子挿入物はカプシド化されていないの
で、転写に利用しうる状態に留まる。次いで、細胞の人
工的溶菌は所望蛋白質を高収率で放出する。この発明に
おいては発現を制御するためλリプレッサ系も使用した
ので、プロファージの切除、すなわち例えばλファージ
21から生じた異種免疫制御域による遺伝子コピー数を制
御する必要があろう。 IFN−β活性を示すポリペプチド（本発明により調製
される）は融合蛋白質（例えば分泌を行なう原核Ｎ−末
端セグメントに結合）の形態で、或いはプロインターフ
ェロン（例えば分泌の際開裂させうるインターフェロン
信号配列から出発）の形態で、或いは成熟インターフェ
ロン（これは、成熟繊維芽細胞インターフェロンがメチ
オニン、すなわち翻訳の開始に使用されるアミノ酸から
出発するので可能である）として調製できることを了解
すべきである。これら異なる形態のポリペプチドの収率
は、上記した方法のいずれかまたはその組合せにより向
上させることができる。また、本発明のDNA配列に使用
されるコドンの幾つかまたは全部に代えて、異なるコド
ンを使用することもできる。これら代替使用するコドン
は、代替されたコドンによりコードされるアミノ酸と同
一のアミノ酸をコードすることができ、より高収率のポ
リペプチドを生成することができる。或いは、アミノ酸
交替をもたらすまたはより長いもしくはより短いHuIFN
−β関連ポリペプチドをもたらすコドンの１個もしくは
その組合せで代替すれば、その性質を有用な方向に変化
させることもできる（例えば、安定性を増大させ、溶解
性を増大させ、抗ウィルス活性を増大させ、2,5−Ａシ
ンセターゼ活性を増大させ或いは宿主特異性範囲を増大
させる）。 最後に、本発明の組替えDNA分子により生産されるポ
リペプチドの活性は、本発明の範囲から逸脱することな
く、周知の手段により本発明のDNA配列もしくはポリペ
プチドを断片化、改変または誘導体化して向上させるこ
ともできる。 HuIFN−βをコードする染色体遺伝子の同定 HaeIIIおよびAluＩでの部分開裂により生成されかつE
coRIリンカによりλシャロン（Charon）4A腕部に結合さ
れたヒト胎児染色体DNAの断片から誘導される一群のハ
イブリッドファージが、アール・エム・ローン等により
調製されている〔セル誌、第15巻、第1157〜1174頁（19
78）〕。この遺伝子群は、「現場」処理により、pHFIF-
21からTaqI-BglII制限により切除されたP32−ラベルIFN
−βcDNA挿入物を試料として用いて選別された〔ダブリ
ュ・ディー・ベントンおよびアール・ダブリュ・デビ
ス、サイエンス誌、第196巻、第180〜182頁（1977）；
ティー・マニアチス等、セル誌、第15巻、第687〜701頁
（1978）〕。プラスミドpHFIF-21は、本発明の選別方法
により同定された。このプラスミドのTaqI-BglII断片は
IFN−βのほぼ全部5-−未翻訳域とコード域とを含有す
る。１つのハイブリダイズ−陽性ファージクローンを、
反復プラーク精製により600,000個のプラークから単離
した〔ティー・マニアチス等、上記〕。このプラークを
λCH4A-gHFIF-1と名付けた。このプラークの制限分析
は、約16.3kbのヒトDNAを含有することを示した。 λCH4A-gHFIF-1のEcoRI消化は、２つのシャロン4Aフ
ァージ腕部の他に８個の挿入断片（長さにおいて4.6,3.
5,2.4,1.9,1.3,1.2,0.8および0.6kb）を生成した。サウ
ザーンブロッティング（Southern blotting）の後、1.9
kb断片のみがpHFIF-21のTaqI-BglII断片にハイブリダイ
ズした。 この1.9kb断片を、pBR325（pBR322の誘導体であっ
て、クロラムフェニコール耐性マーカを有し、単一のEc
oRI部位を有する）のEcoRI部位に直政敵に再クローン化
させた。0.6μｇのEcoRI−消化したλCH4A-gHFIF-1DNA
を100ngのpBR325に連結しかつイー・コリHB101を形質転
換させた後、幾つかのクローンを選択した。1.9kb断片
を含有するクローンのみがIFN−βcDNA試料にハイブリ
ダイズした。このクローンをｐ（325）‐gHFIF-4と名付
けた。pHFIF-21から誘導された制限断片とｐ（325）‐g
HFIF-4との比較は、染色体クローン中には介在配列が存
在しないこと、およびこのクローンにより支持されたDN
A情報がpHFIF-21のそれと同一であることを示した。 HuIFN−βをコードする染色体DNAの同定および単離
は、このDNAによる適当な宿主の形質転換と、それから
のHuIFN−βの発現とを可能にする。この種の発現は、
染色体DNA配列と連携した各種シグナルがこの種のクロ
ーン中に存在するので有利である。次いで、これらのシ
グナルは、より高収率の発現ならびに恐らく染色体DNA
のコード域によりコードされるポリペプチドの発現後の
処理を行なうのに使用できるであろう。 本明細書中に記載した方法で調製された微生物および
組替えDNA分子は、西ドイツ、ゲッチンゲン所在のドイ
ツチエ・ザンムルンク・フォン・ミクロオルガニスムの
カルチャー・コレクションに1980年４月２日付で寄託し
た培養物により代表され、下記HFIF-A〜Ｃとして同定さ
れている： A:イー・コリHB101（G-pBR322（Pst）/HFIF3） B:イー・コリHB101（G-pBR322（Pst）/HFIF6） C:イー・コリHB101（G-pBR322（Pst）/HFIF7） これらの培養物には、それぞれ受託番号DSM1791〜1793
が付されている。また、培養物は、西ドイツ、ゲッチン
ゲン所在のドイツチエ・ザンムルンク・フォン・ミクロ
オルガニスムのカルチャー・コレクションに1980年６月
５日付で寄託された培養物により代表され、HFIF-D〜Ｇ
として同定されている： D:イー・コリM5219（G-pPLa-HFIF-67-12） E:イー・コリK12ΔHI（G-pPLa-HFIF-67-12） F:イー・コリM5219（G-pPLa-HFIF-67-12Δ19） G:イー・コリM5219（G-pPLc-HFIF-67-8） これらの培養物には、受託番号DSM1851〜1854がそれぞ
れ付されている。さらに、培養物はメリーランド州ロッ
クビル所在のアメリカ・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョンに1981年２月26日付で寄託され、HFIF-H〜Ｉとして
同定されている： H:イー・コリM5219（pPLa-HFIF-67-12ΔMI） I:イー・コリHB101（ｐ〔325〕‐gHFIF-4） これら培養物には、受託番号ATCC31824および31825号が
それぞれ付されている。 以上、本発明の多くの具体例を示したが、本発明にお
ける方法および組成物を利用して本発明の基本構成を改
変し、他の具体化を計りうることが明白であろう。従っ
て、本発明は、上記実施例で示された特定具体例により
限定されないことが了解されよう。
【図面の簡単な説明】 第１図は、その幾つかが本発明のポリペプチドをコード
する挿入DNA配列を特徴とするような組替えDNA分子の混
合物を製造するための、本発明の方法の一実施態様を示
す概略図であり、 第２図は、本発明の初期クローン選別法の概略図であ
り、 第３図は、本発明により調製されたDNA配列を使用する
クローン選別法の一実施態様を示す概略図であり、 第４図は、HuIFN−βDNAのコード鎖の複合ヌクレオチド
配列を示す図であり、この配列は挿入物の始めから挿入
物の未翻訳域まで番号化され、ヌクレオチド65〜127は
シグナル配列を示しかつヌクレオチド128〜625は「成
熟」繊維芽細胞インターフェロンを示し、シグナルポリ
ペプチドのアミノ酸配列はそれらの各ヌクレオチド配列
の上部に示され、シグナルポリペプチドのアミノ酸は−
21から−１までそして成熟インターフェロンのアミノ酸
は１から166まで番号化され、1980年４月３日出願の英
国特許出願第80.11306号に関連して寄託した培養物中に
存在するHuIFN−βDNAの制限および断片分析データは英
国特許出願の第４図と比較して本願第４図では２個のヌ
クレオチドが変化しており、これら変化はHuIFN−βDNA
の提案シグナル配列の前の未翻訳配列に存在し、かつこ
れら変化はHuIFN−βDNAの配列またはその翻訳生産物の
アミノ酸配列に影響を与えず、さらにHuIFN−β関連DNA
挿入物用のクローンを選別するためハイブリダイズ試料
としてその配列を使用することを妨げず、 第５図は、本発明による数種のプラスミドの方向性およ
び制限地図を示し、 第６図は、本発明により決定されたヒト繊維芽細胞イン
ターフェロンのアミノ酸組成と標準繊維芽細胞インター
フェロンから決定されたものとの比較であり、 第７図は本発明のHuIFN−β遺伝子の制限地図およびpHF
IF3、pHFIF6およびpHFIF7を配列決定するため使用され
る配列決定法を示し、 第８図は本発明の組替えDNA分子pPLa-HFIF-67-1の作成
の略図であり、 第９図は本発明の組替えDNA分子pPLa-HFIF-67-12および
pPLa-HFIF-67-12Δ19の作成の略図であり、 第10図は本発明の組替えDNA分子pPLc-HFIF-67-8の作成
の略図であり、 第11図は本発明のpPLa-HFIF-67-12の方向性および部分
制限地図の略図であり、 第12図は本発明のpPLa-HFIF-67-12Δ19の方向性および
部分制限地図の略図であり、 第13図は本発明のpPLc-HFIF-67-8の方向性および部分制
限地図の略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 「Ｎａｔｕｒｅ」 第284巻，Ｐ．316 〜320，1980年３月27日発行 「ＧＥＮＥ」 第10巻，Ｐ．11〜15, 1980年５月21日発行

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 １．ヒトβ−インターフェロンの免疫学的または生物学
    的活性を示すポリペプチドの細菌宿主細胞での発現を誘
    発し得る組換えDNA分子により形質転換された選択され
    た宿主細胞を培養し、この分子は、 （ａ）それぞれ寄託番号DSM1851〜1854により同定され
    る微生物に担持される、Ｇ−pPLa−HFIF−67−12［Hinc
    II−Sau 3AI］、Ｇ−pPLa−HFIF−67−12 Δ 19［Hinc
    II−Sau 3AI］、およびＧ−pPLc−HFIF−67−８［Hinc
    II−Sau 3AI］に挿入されたDNAであって、式：のDNA配列を有するDNAと、 （ｂ）前記DNAのいずれかにストリンジェントな条件下
    でハイブリダイズし、β−インターフェロンの活性を有
    するポリペプチドをコードするヒト由来のDNAと、 （ｃ） （ａ）および（ｂ）に規定するDNAに対する遺
    伝子コードの結果として縮退し、発現に際しβ−インタ
    ーフェロン活性を有するポリペプチドをコードするDNA
    から選択されるDNAとからなり、前記DNAは前記組換えDN
    A分子中で発現制御配列に機能的に結合され、さらに （２）ポリペプチドを収集することからなるヒトβ−イ
    ンターフェロンの免疫学的又は生物学的活性を示すポリ
    ペプチドを産生する方法。 ２．挿入されたDNA（ａ）にストリンジェントな条件下
    でハイブリダイズする前記DNAが、受託番号ATCC31824に
    より同定される微生物に担持されるＧ−pPLa−HFIF−67
    −12 Δ M1［BamHI−Sau3AI］の挿入されたDNAであるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３．前記挿入されたDNA（ａ）にストリンジェントな条
    件下でハイブリダイズする前記DNAが、受託番号ATCC318
    25により同定される微生物に担持されるｐ［325］−gHF
    IF−４［EcoRI］の挿入されたDNAであることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４．前記発現制御配列が1ac系、β−1ac系、trp系、フ
    ァージλの主オペレータ及びプロモータ領域から選択さ
    れることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
    法。 ５．ヒトβ−インターフェロンの免疫学的または生物学
    的活性を示すポリペプチドが式： を有するポリペプチドから選択されることを特徴とする
    特許請求の範囲第１項記載の方法。
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YU (1) YU45104B (ja)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL58765A (en) * 1979-11-21 1986-09-30 Yeda Res & Dev Process for the production of essentially pure messenger rna of human fibroblast interferon and process for the production of interferon beta
US5510472A (en) * 1979-11-21 1996-04-23 Yeda Research And Development Co. Ltd. Production of recombinant human interferon-beta2
US5554513A (en) * 1979-11-21 1996-09-10 Yeda Research & Development Co. Ltd. Production of recombinant human interferon-beta2
DK33181A (da) * 1980-02-06 1981-08-07 Searle & Co Fremgangsmaade til fremstilling af et interferonlignende protein
DE3005843A1 (de) * 1980-02-16 1981-09-10 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enthaltenden mikroorganismus
NO811119L (no) * 1980-06-06 1981-12-07 Biogen Nv Forbedrede baerere, samt fremgangsmaate ved fremstilling av disse og for aa uttrykke klonede gener
EP0042246B1 (en) * 1980-06-12 1987-03-18 The Cancer Institute Of Japanese Foundation For Cancer Research Plasmid
US4874702A (en) * 1980-09-08 1989-10-17 Biogen, Inc. Vectors and methods for making such vectors and for expressive cloned genes
FR2490675B1 (fr) * 1980-09-25 1985-11-15 Genentech Inc Production microbienne d'interferon de fibroplaste humain
ZA816621B (en) * 1980-09-25 1982-09-29 Genentech Inc Microbial production of human fibroblast interferon
IL63327A (en) * 1981-07-16 1985-11-29 Yeda Res & Dev Production of interferon beta1 and alpha-phage recombinants for its production in host bacteria
GB2108510B (en) * 1981-10-03 1984-12-12 Ciba Geigy Ag Dnas, recombinant dnas, hosts containing them, polypeptides and processes for the production thereof
JPS58110600A (ja) * 1981-12-25 1983-07-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ヒトβ型インタ−フエロン遺伝子を含む組みかえ体プラスミド
JPS58141796A (ja) * 1982-02-18 1983-08-23 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ペプチドの製造法
US4582800A (en) * 1982-07-12 1986-04-15 Hoffmann-La Roche Inc. Novel vectors and method for controlling interferon expression
IL69382A (en) * 1982-08-05 1991-01-31 Carter William Alvin Method of protecting plants against viral pathogens by inserting into plant cells genes encoding polypeptides containing interferon domains
FI82266C (fi) * 1982-10-19 1991-02-11 Cetus Corp Foerfarande foer framstaellning av il-2 -mutein.
US4737462A (en) * 1982-10-19 1988-04-12 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β
US4588585A (en) * 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US4966843A (en) * 1982-11-01 1990-10-30 Cetus Corporation Expression of interferon genes in Chinese hamster ovary cells
GR79124B (ja) * 1982-12-22 1984-10-02 Genentech Inc
GB8308235D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4518584A (en) * 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US4746608A (en) * 1983-08-22 1988-05-24 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing peptides
DE3580590D1 (de) * 1985-05-29 1990-12-20 Green Cross Corp Herstellungsverfahren fuer heterogene proteine.
WO1987000553A1 (en) * 1985-07-16 1987-01-29 The Green Cross Corporation Process for preparing hetero-protein
FR2635113B1 (fr) * 1988-08-05 1992-07-24 Sanofi Sa Procede d'obtention d'interleukine-1 (beta) mature a partir de cellules d'e. coli transformees
US5545723A (en) * 1994-03-15 1996-08-13 Biogen Inc. Muteins of IFN-β
DK1017413T4 (da) 1997-09-23 2008-03-25 Rentschler Biotech Gmbh Flydende formulering af interferon-beta
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
US7431921B2 (en) 2000-04-14 2008-10-07 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
EP2267026A1 (en) 2000-04-12 2010-12-29 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
ATE432288T1 (de) 2001-02-27 2009-06-15 Maxygen Aps Neue interferon-beta-ähnliche moleküle
PT1463751E (pt) 2001-12-21 2013-08-26 Human Genome Sciences Inc Proteínas de fusão de albumina
GB2429207A (en) 2004-02-02 2007-02-21 Ambrx Inc Modified human interferon polypeptides and their uses
CN103965347B (zh) 2007-05-02 2017-07-18 Ambrx公司 经修饰干扰素β多肽和其用途
DE102009032179A1 (de) 2009-07-07 2011-01-13 Biogenerix Ag Verfahren zur Reinigung von Interferon beta

Family Cites Families (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1645C (da) 1898-06-20 Carl Christensen Lommekniv med et i Skaftet indskydeligt Blad.
US3699222A (en) 1958-03-11 1972-10-17 Nat Res Dev Production of viral interfering substances
US4184917A (en) 1974-04-01 1980-01-22 Sandoz Ltd. Process for producing a structurally modified interferon
NL7404589A (nl) 1974-04-03 1975-10-07 Stichting Rega V Z W Werkwijze voor het stabiliseren van interferon.
GB1521032A (en) 1974-08-08 1978-08-09 Ici Ltd Biological treatment
US4237224A (en) 1974-11-04 1980-12-02 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Process for producing biologically functional molecular chimeras
FR2321298A1 (fr) * 1975-08-01 1977-03-18 Anvar Procede de preparation de produits a activite interferon
US4190495A (en) 1976-09-27 1980-02-26 Research Corporation Modified microorganisms and method of preparing and using same
US4264731A (en) 1977-05-27 1981-04-28 The Regents Of The University Of California DNA Joining method
DE2724918A1 (de) 1977-06-02 1978-12-14 Thomae Gmbh Dr K Gewinnung und reinigung von humaninterferon
CS215108B2 (en) 1977-07-15 1982-07-30 Wellcome Found Method of making the interferrone
ZA782933B (en) 1977-09-23 1979-05-30 Univ California Purification of nucleotide sequences suitable for expression in bacteria
US4283489A (en) 1977-09-23 1981-08-11 The Regents Of The University Of California Purification of nucleotide sequences suitable for expression in bacteria
YU257078A (en) 1977-11-08 1983-12-31 Genentech Inc Process for obtaining the code of the structural gene for the microbial transcribing of polypeptides
JPS54145289A (en) 1977-11-08 1979-11-13 Genentech Inc Improving method of microbiological polypeptide displaying method and means
YU257278A (en) 1977-11-08 1984-02-29 Genentech Inc Process for obtaining a recombinat clone carrier
DE2759053A1 (de) 1977-12-30 1979-07-12 Uhlin Verfahren zum herstellen von genprodukten von plasmid-dns
FR2422956A1 (fr) 1978-04-13 1979-11-09 Pasteur Institut Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede
EP0005476B1 (de) 1978-05-17 1981-12-30 Dr. Karl Thomae GmbH Verfahren zur Herstellung von Humaninterferon
US4322497A (en) 1978-06-02 1982-03-30 Eli Lilly And Company Process for transducing Escherichia coli K12 χ1776
US4411994A (en) 1978-06-08 1983-10-25 The President And Fellows Of Harvard College Protein synthesis
US4307193A (en) 1978-06-09 1981-12-22 Toray Industries, Inc. Method of producing interferon
JPS5519239A (en) 1978-07-28 1980-02-09 Green Cross Corp:The Interferon-producing attractant
IE48385B1 (en) 1978-08-11 1984-12-26 Univ California Synthesis of a eucaryotic protein by a microorganism
JPS5561798A (en) 1978-10-30 1980-05-09 Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho Preparation of novel recombination dna
JPS5564799A (en) 1978-11-07 1980-05-15 Toray Ind Inc Multi-stage concentration and purification of interferon originated from human fibroblast
IN150740B (ja) 1978-11-24 1982-12-04 Hoffmann La Roche
US4241174A (en) 1978-11-24 1980-12-23 Hoffmann-La Roche Inc. Interferon assay
NL8000127A (nl) 1979-01-15 1980-07-17 Harvard College Werkwijze voor het vormen van prokaryotische of eukaryotische proteinen alsmede een daarbij toepasbaar gekoppeld gen.
EP0014050A3 (en) 1979-01-16 1980-10-01 Beecham Group Plc Interferon production
US5514567A (en) 1979-01-30 1996-05-07 Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research DNA and recombinant plasmid
US5326859A (en) * 1979-10-30 1994-07-05 Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research DNA and recombinant plasmid
JPS56131598A (en) 1980-03-19 1981-10-15 Japan Found Cancer Novel recombinant plasmid having gene of human fibroblastic interferon messenger rna
JPS5663996A (en) 1979-10-30 1981-05-30 Japan Found Cancer Novel recombinant having gene complementary to human interferon messenger rna
US4357421A (en) 1979-04-02 1982-11-02 G. D. Searle & Co. Synthetic gene coding for influenza hemagglutinin
FI77877C (fi) 1979-04-20 1989-05-10 Technobiotic Ltd Foerfarande foer framstaellning och rening av human le-formig interferonprotein.
IL57108A (en) 1979-04-22 1981-12-31 Yeda Res & Dev Assay for the quantitative determination of interferon and a kit therefor
US4293652A (en) 1979-05-25 1981-10-06 Cetus Corporation Method for synthesizing DNA sequentially
GB2052516B (en) 1979-06-01 1983-06-29 Searle & Co Plasmid vectors production and use thereof
US4262090A (en) 1979-06-04 1981-04-14 Cetus Corporation Interferon production
WO1981000116A1 (en) 1979-07-05 1981-01-22 United States Res Corp Method for the purification and analysis of interferon
ZA803943B (en) 1979-07-31 1981-06-24 Hoffmann La Roche Homogeneous fibroblast interferon and method for manufacture thereof
JPS5651995A (en) 1979-10-05 1981-05-09 Green Cross Corp:The Preparation of interferon
NL7907791A (nl) 1979-10-23 1981-04-27 Stichting Rega V Z W Werkwijze voor het zuiveren van interferon.
AU538665B2 (en) * 1979-10-30 1984-08-23 Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research Human interferon dna
IL58765A (en) * 1979-11-21 1986-09-30 Yeda Res & Dev Process for the production of essentially pure messenger rna of human fibroblast interferon and process for the production of interferon beta
EP0030094A1 (en) 1979-11-30 1981-06-10 Beecham Group Plc Calcium enhanced interferon production process
NZ195980A (en) 1980-01-08 1984-10-19 Biogen Nv Dna sequences,recombinant dna molecules and processes for producing leukocyte interferon-like polypeptides;pharmaceutical and veterinary compositions
GB2068970B (en) * 1980-02-06 1983-06-22 Searle & Co Recombinant dna technique for the preparation of a protein resembling human interferon
DK33181A (da) 1980-02-06 1981-08-07 Searle & Co Fremgangsmaade til fremstilling af et interferonlignende protein
IE51030B1 (en) 1980-02-06 1986-09-17 Searle & Co Recombinant dna technique for the preparation of a protein resembling human interferon
DE3005843A1 (de) 1980-02-16 1981-09-10 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enthaltenden mikroorganismus
DE3005897A1 (de) 1980-02-16 1981-09-03 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enhtaltenden mikroorganismus
AU546577B2 (en) 1980-02-25 1985-09-05 Trustees Of Columbia University, The Use of eucaryotic promoter sequences in the production of proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
ZA811368B (en) 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
US4338397A (en) 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
IL62903A0 (en) 1980-05-22 1981-07-31 Deutsches Krebsforsch Method for the production of interferon ii and stimulated clones for the carrying out of the method
DE3019621C2 (de) 1980-05-22 1982-08-19 Stiftung Deutsches Krebsforschungszentrum, 6900 Heidelberg Verfahren zur Herstellung von Interferon II.
JPS56167624A (en) 1980-05-29 1981-12-23 Toray Ind Inc Method of interferon production
JPS571237A (en) 1980-06-03 1982-01-06 Toshiba Corp Combined integrared circuit device
NO811119L (no) 1980-06-06 1981-12-07 Biogen Nv Forbedrede baerere, samt fremgangsmaate ved fremstilling av disse og for aa uttrykke klonede gener
JPS575158A (en) 1980-06-12 1982-01-11 Matsushita Electric Works Ltd Automatic resetting circuit for cpu function stopping phenomenon
EP0042246B1 (en) * 1980-06-12 1987-03-18 The Cancer Institute Of Japanese Foundation For Cancer Research Plasmid
CH657141A5 (de) 1980-07-01 1986-08-15 Hoffmann La Roche Dns-sequenzen, rekombinante expressionsvektoren zur mikrobiellen herstellung von human-leukozyten-interferonen und transformierte mikroorganismen.
US4357422A (en) 1980-08-14 1982-11-02 Massachusetts Institute Of Technology Method of enhancing interferon production
US4874702A (en) 1980-09-08 1989-10-17 Biogen, Inc. Vectors and methods for making such vectors and for expressive cloned genes
FR2490675B1 (fr) 1980-09-25 1985-11-15 Genentech Inc Production microbienne d'interferon de fibroplaste humain
US4315852A (en) 1980-11-26 1982-02-16 Schering Corporation Extraction of interferon from bacteria
JPS58201794A (ja) 1982-05-17 1983-11-24 Toray Ind Inc ヒトインターフェロンβの濃縮精製法
US4835256A (en) 1982-09-30 1989-05-30 New York University & Juridical Foundation Human gamma interferon polypeptide having glutamine as the ninth n-terminal amino acid
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
AU594014B2 (en) 1984-03-21 1990-03-01 Research Corporation Technologies, Inc. Recombinant DNA molecules
NZ212207A (en) 1984-05-31 1991-07-26 Genentech Inc Recombinant lymphotoxin
DE3683080D1 (de) 1985-04-22 1992-02-06 Lilly Co Eli Rekombinante dns-expressionsvektoren und dns-verbindungen.
US4892819A (en) 1985-11-25 1990-01-09 Eli Lilly And Company Recombinant DNA expression vectors and DNA compounds that encode isopenicillin N synthetase from penicillium chrysogenum
EP0257994B1 (en) 1986-08-29 1992-09-16 Tonen Corporation Dna coding for rinderpest virus antigen, its preparation and use
DE3642096A1 (de) 1986-12-10 1988-06-16 Boehringer Ingelheim Int Pferde-(gamma)-interferon
CA1339608C (en) 1987-04-09 1997-12-30 Hiroshi Okamoto Reg gene and protein encoded by the gene
ZA887773B (en) 1987-10-26 1989-07-26 Immunex Corp Interleukin-7
US5258287A (en) 1988-03-22 1993-11-02 Genentech, Inc. DNA encoding and methods of production of insulin-like growth factor binding protein BP53

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
「ＧＥＮＥ」 第１０巻，Ｐ．１１〜１５，１９８０年５月２１日発行
「Ｎａｔｕｒｅ」 第２８４巻，Ｐ．３１６〜３２０，１９８０年３月２７日発行

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Publication number Publication date
US7588755B1 (en) 2009-09-15
FI811008L (fi) 1981-10-04
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IE57069B1 (en) 1992-04-22
IN156128B (ja) 1985-05-18
AU564690B2 (en) 1987-08-20
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YU85981A (en) 1984-04-30
NO811118L (no) 1981-10-05
DD160280A5 (de) 1983-05-25
US7635466B1 (en) 2009-12-22
NZ196706A (en) 1988-01-08
NL970018I1 (nl) 1997-06-02
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EP0041313A2 (en) 1981-12-09
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