JPS62215392A - ウシ・ガンマ−インタ−フエロンのクロ−ニング、同定および発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はウシ・ガンマ−インターフエロン（以下す工Ｆ
Ｎ−γと略す）に関し、より詳細には、ｂ工ＦＮ−γの
ｍＲＮＡ　　を含有するウシｍＲＮＡから合成されたｃ
　ＤＮＡ　をスクリーニングするために、ヒト工ＦＮ−
γ　相補デオキシリボ核酸（ｃ　ＤＮＡ　）クローンか
ら由来するプローブを使用してｂ工ＦＮ−γをコードす
る遺伝子をクローニングする技術に関する。

（従来技術） 家畜産業が当面している重大な問題は、家畜輸送の際、
例えば放牧地から畜舎への輸送の際、相当数の家畜が体
重の減少を示し、病気になったり、死亡さえすることで
ある。輸送の間の家畜の受けるストレスは、ステロイド
ホルモンの生産が上昇し、これが免疫応答を弱めるため
と信じられている。家畜が畜舎に到着したとき、免疫応
答の減少のため、普段は動物達が対抗できる通常の細菌
や、ウィルスの犠牲となる。種々のタイプの上部気道感
染が生じ、これが通常は拒絶される病原因子による重症
な病気または死亡の原因となる。

近年、この「輸送熱」症候群を種々の種類のインターフ
ェロンで防止する可能性について可なりの注目が集めら
れている。研究によれば、二種類のインターフェロン（
工ＦＮ−α）および（工Ｆ’Ｎ−β）は有力な抗ウィル
ス剤である。これらのインターフェロンは家畜のある種
のウィルス感染に有用である。第三のインターフェロン
（工Ｆ’Ｎ−γ）は有力なウィルス防止剤であると知ら
れているのみならず、（工ＦＮ−α）および（ＩＦ’Ｎ
−β）にくらべて痕かに低い使用量で免疫システムの細
胞の活性を調節しうろことも知られている。例えば工Ｆ
’Ｎ−γは、オプソニン化微生物の食作用に有利に影響
すると知られる機能、例えばＦｃ１Ｊセプターを上方調
節する：　Ｇｕｙｒｅら、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　工ｎｖ
ｅｓｔ、。

７２：２９３（１９８３）。さらに、Ｎａｔｈａｎらは
Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１５９　：　６７０　（
１９８３）において、工１’Ｎ−γ　は酸素中間体の同
化増大によって、細砲内寄生生物の増殖を阻止すると報
告している。さらに、Ｃｅ１ａｄらは、Ｊ、　Ｉｘｐ、
　Ｍｅｄ。

１６０：５５（１９８４）において、低用量の工ＦＮ−
４でのマクロファージ介在肺瘍毒性の誘発を報告してい
る。

従って、多量のｂＩＦＮ−γの供給は、家畜の病気を防
止する新たな方法を提供する。従来、ｂＩＦＮ−γはマ
イト−ジエンによりウシリンパ節細胞を刺激することに
より、生産されている。不都合なことには、このｂＩＦ
Ｎ−γの天然の供給源は、その治療有用性を充分に調査
するだけの均一なＩＦＮ−γを充分な量で生産すること
が不可能である。

（発明が解決しようとする技術課題） 均一なり工ＦＮ−γを比較的多量に製造する一つの可能
な方法は、組み換えＤＮＡ技術である。組み換えＤＮＡ
技術は、蛋白質をコードする遺伝子が単離および同定さ
れた所望の蛋白質を経済的に製造するために開発された
。蛋白質製造のためのそのような組み換えＤＮＡ技術の
議論は５ｅｉｅｎｃｅ（Ａｐｒｉｌ、　１９７７　）第
１９６巻の論説および追加論文に記載されている。しか
しながら、この参考文献に論じられている組み換えＤＮ
Ａ技術を利用するには、先ずｂＩＦＮ−γ　をコードす
る遺伝子が単離されねばならない。

（発明の構成） 本発明によれば、ニックトランスレート化ヒトｃＤＮＡ
ライブラリーからｂＩＦＮ−γ　をコードする遺伝子を
単離する。このプローブはヒトｃＤＮＡライブラリーか
らヒトＴＦＮ−γ　のヌクレオチド配列の一部分に相当
する合成オリコヌクレオチドプローブを使用して単離す
る。全ウシＲＮＡは比較的高レベルのｂＩＦＮ−γ　を
生産することが知られているリンノ節細胞から抽出する
。ポリアデニル化ｍＲＮＡ　は全ＲＮＡ抽出物から単離
する。ｃＤＮＡライブラリーは逆転写酵素を用いてポリ
アデニル化ｍＲＮＡ　の逆転写により製造する。このＤ
ＮＡをＤＮＡポリメラーゼエで二重鎖とし、適当なりロ
ーニングベクターに挿入する。得られる組み換えクロー
ニングベクターを適当な宿主を形質転換するために使用
する。

形質転換した宿主は同定および類別してプールする。こ
れらのプールから調製したプラスミドＤＮＡをアイソト
ープ標識したヒトｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさ
せる。プローブにたいして陽性の信号を示すクローンの
プールを同定し、この候補のプールを再分割してノ・イ
ブリダイズスクリーニングを繰り返す。最後にｂＩＦＮ
−γ遺伝子に相当する単一の形質転換体を同定する。こ
の形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡ配
列を決定する。さらに、ヌクレオチド配列から相当する
アミノ酸配列を決定する。ｂＩＦＮ−ｒ遺伝子のコード
領域をバクテリアの発現系にクローニングし、成熟す工
ＦＮ−γを発現させる。その後、生物学的アッセイを実
施して、発現された蛋白質がｂ工Ｆ’Ｎ−γであること
を確認する。

次に図面を参照しつつ、本発明の典型的態様を説明する
。

第１図は合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて単離
したヒト１ＦＮ−ｒのヌクレオチド配列の主要部分を示
す図である。数字はヌクレオチド位置を示す。牛ｃＤＮ
Ａ　　ライブラリーをプローブするために使用したｃＤ
ＮＡ　フラグメントの部分を枠中に示す。

第２図はｂＩＦＮ−γ遺伝子のアミノ酸配列（下の列）
およびヌクレオチド配列（上の列）を示すが、成熟蛋白
質は星印の位置から開始する。各列の上部の数字はＭｅ
ｔ残基から開始するアミノ酸位置を示し、各列の下の数
字はヌクレオチド位置を示す。

第３図は機能的す工ＦＭ−γを発現させるためにバクテ
リア宿主細胞を形質転換するために使用する、ｂ工Ｆ’
Ｎ−ｊ　　遺伝子のコード領域が挿入されたΔｐＬＢγ
ＩＦ’Ｎプラスミドを説明する図である。

ｂ工１ｉ’Ｎ−γをコードする遺伝子を探すための（ｊ
ＤＮＡ　　ライブラリーは、好ましくは予め比較的高レ
イルのｂＩＦＮ−γを生産することが判っている細胞か
ら得られたものである。このような供給源は、牛Ｔ細胞
組織、例えばリンパ節または膵臓でありうる。

活性牝牛末梢血もまたｂＩＦＮ−１分子の可能な供給源
であろう。本発明に使用するには単核細胞は、全血から
標準的技術１例えばフィコール−ハイパツク遠心分離に
より単離できる。収穫した白血球を活性化剤例えばＴ細
胞分裂因子とともに血清を含有する培地中でインビトロ
に標準的技術で増殖させる。

ｂＩＦＮ−γ産生細胞からのＲＮＡの調製ＩＦ’Ｎ−ｒ
を産生ずる能力のある生細胞からの全ＲＮＡｔ−標準的
方法、例えば、シャーブラインら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、　　１８、５２９４（１９７９）およびマニ
アチスら、Ｍｏ１．ｅｃｕｌａｒ　Ｃ’ｌｏｎｉｎｇ、
　ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　　：＝ｙ
　−Ａ／　ｆ　　スプリングハーバ−ラボラトリ−、コ
ールド　スプＩＪ　７クハーバー、ニューヨーク（１９
８２）に記載されている方法で抽出する。

よく知られているように、細胞からＲＮＡ１抽出すると
きは、抽出の初期段階でリボヌクレアーゼ活性（ＲＮａ
ｓｓ）ｔ”最小にしておくことが主要である。このため
の一つの方法は、　ＲＮａｓｅによるＲＮＡの加水分解
を抑える程度に、　ＲＮａｓｅを含めた細胞蛋白質を変
成させることである。上記シャーブラインらおよびマニ
アチスらの１９６頁の方法では。

この変成はグアニジニウム　チオシアネートを還元剤例
えば２−メルカプトエタノール（蛋白質のジスルフィド
結合を開裂する）とともに使用することにより行われて
いる。ＲＮＡは蛋白質から標準的方法。

例えばフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈澱
または塩化セシウム沈降で単離することにより抽出する
。別法として、ＲＮＡは蛋白質からグアニジン　ハイド
１０クロライドによる抽出ののちフェノール／クロロホ
ルム抽出で単離してもよい。

次に、抽出した蛋白質からポリアデニル化ｍＲＮＡを分
離する。この分離過程には、何種もの技術が開発されて
いるが、好ましい方法の一つは、エドモンズら、Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　　６８　
：１３３６（１９７１）；アビプおよびレダー、Ｐｒｏ
ｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　６９　；　１４０
８　（１９７２）および上記マニアチスら第１９７頁に
記載されていルオリゴ（ａ’ｒ）　　−セルロースでポ
リアデニル化ｍＲＮ　Ａ　　をクロマトグラフィーする
ことである。

オリゴ（ａ’ｒ）−セルロースを充填緩衝液で調製し、
ついでｍＲＮＡ　を力ジムに誘導する。そののち。

カラムを緩衝液で最初に洗浄してポリアデニル化されて
いないｍＲＮＡ　’ｉ除去し、ポリアデニル化ｍＲＮＡ
を緩衝化低イオン強度の溶出液で溶出する。ゲル電気泳
動で、ｄ　リアデニル化ｍＲＮＡの完全性を確認する。

ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの調製 上記で調製レアツセイしたｍＲＮＡに相当する二重鎖ｃ
ＤＮＡのライブラリーを、逆転写酵素を使用する公知の
技術で製造する。本発明との関係で利用できるそのよう
な方法の一つは、上記マニアチスらの第２３０頁に記載
されており、グプラーおよびホフマン、Ｇｅｎｅ、　２
５　：　２６３−２６９（１９８３）に変法が記載され
ている。これを略述すれば、ｍＲＮＡのポリアデニル化
テールにハイブリダイズしたオリゴ−ａＴｌ第−ａＤＮ
Ａストランドのプライマーとして使用して、ポリアデニ
ル化ｍＲＮＡを逆転写する。ｃＤＮＡの第二鎖はＤＮＡ
ポリメラーゼエ、ＲＮａａｅ　　Ｈおよび大腸菌（Ｅ、
ｃｏｘｉ）　Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼを使用して合成す
る。

この方法は、最初のｃＤＮＡ鎖の３９末端に生じたヘア
ピンループを８１ヌクレアーゼの介在で開裂させる作業
を省略する（上記マニアチスらの標準的ｃＤＮＡ合成方
法をそのまま使用したなら、そのような作業が必要であ
る）。二重鎖ｃＤＮＡを任意の適当な方法で分画して、
短いストランドを取シ除き、これにより小さいｃＤＮＡ
分画の不要なりローニングを避けることができる。

本発明によれば、ｍＲＮＡから二重ＱｃＤＮＡを調製す
るために、他の標準的方法を使用してもよいことは理解
されるであろう。そのような他の技術はランドら、Ｎｕ
ｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｅ、、　９：２２５１（１９
８１）に開示されている。ランドらの方法でも、ｃＤＮ
Ａ第二鎖のプライマーとしてヘアピンループを使用して
いない。そのかわシに、ｃＤＮＡ第−鎖の３′末端を、
ターミナルデオキシヌクレオチジル　トランスフェラー
ゼ（ＴａＴ）　　の使用によ、ｊｔａｃＭＰでテール化
している。これにょシボＩＪ−Ｃ（７）３’　　テール
が形成される。その後この３′テールにハイブリダイズ
したオ１Ｊｄ−ｃｌＧで第二鎖の合成が開始される。こ
の方法は、マニアチスらの方法でヘアピンｔ−８１ヌク
レアーゼで開裂させるならひきおこされるおそれのある
５９テ一ル部分の消失を回避するために役立つといわれ
ている。

ｃＤＮＡのクローニング ついで、上記で得た二重鎖ａＤＭｋをクローニングベク
ター中に挿入し、これを該ベクターの複製のための適合
性をもっ原核もしくは真核宿主細胞の形質転換に使用す
る。その後、形質転換体を同定しそしてそれからプラス
ミ）ｊＤＮＡを調製する。

本発明を実施するには、Ｆ！々のクローニングベクター
を使用できる。好ましくはプラスミドであるが、ベクタ
ーはバクテリファージまたはコスミドであってもよい。

クローニングを哺乳類細胞でおこなうときは、はフタ−
としてウィルスを使用してもよい。

プラスミドを使用する時は、天然源からのものでも人工
的に合成されたものでもよい。選択する特定のプラスミ
ドは、使用する形質転換宿主が大腸菌のようなバクテリ
ア、酵母または他の単細胞微生物であるかにかかわらず
、宿主に適合性を有することが必要である。このプラス
ミドは採用する特定の宿主細胞のための適当な複製開始
点をもっている必要がある。さらに、このプラスミドは
形質転換宿主細胞を形質転換されなかった細胞から容易
に識別および分離することのできる表現特性を有する必
要がある。そのような表現形は抗生物質のような生長阻
害物質に対する抵抗性を付与する遺伝子を含んでいてよ
い。テトラサイクリン。

ストレプトマイシン、サルファ剤、ペニシリンおよびア
ンピシリンを含む種々の抗生物質に対する抵抗性遺伝子
をコードするプラスミドは市販品として入手可能である
。

宿主として大腸菌を採用するときは１本発明と関連して
使用できる多くの可能なりローニングプラスミドは市販
品として入手できる。好ましくは本発明を実施するプラ
スミドはｐＢＲ３２２であＱｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、、
　４３　：　７７　（１９７９）に記載されている。こ
のプラスミドの重要な利点は、アンピシリン耐性遺伝子
中のＰａｔ工部工部台む１１ケ所の特異的制限部位を有
することである。この性質はホ％ポリマーテーリング法
でのクローニングにとって特に有用である。

プラスミドの代わシにバクテリオファージを使用すると
きは、このバクテリオファージはプラスミドの選択に際
して上記したのと実質的に同一の特性を有するべきであ
る。例えば表現形マーカーや外来遺伝子の結合のための
連結可能部位の存在が必要である。

好ましくは、本発明においてプラント末端を持つ二重鎖
ｃＤＮ八は、ホモポリマーテーリング法によりプラスミ
ド９ベクター中に挿入される。この技術分野でよく知ら
れているように、この方法においてはｃＤＮＡのストラ
ンドおよびプラスミドＤＮＡに相補的ホモポリマートラ
ックを付加する。

ついでベクターおよび二重鎖ｃＤＮＡを相補的ホモポリ
マーテールの間での水素結合によって接合させ、大腸菌
のような宿主細胞を形質転換できる開いた環状ハイブリ
ッド分子を形成する。

ホモポリマーテーリング法の一つの方法では。

直線化プラスミドＤ１１Ａの３９末端に約５０ないし１
５０ｄＡヌクレオチド残基が付加される。同じ数のヌク
レオチド残基金二重鎮ｃＤＮＡの３２末端に付加し、そ
の後ｃＤＮＡとプラスミド９′ｆｔ結合する。

べつの好ましい方法では、適当な制限酵素で開裂してお
いたクローニングベクターの３′末端にａＧデテール付
加する。例えばｐＢＲ３２２プラスミドヲ使用するとき
は、プラスミドをアンピシリン耐性遺伝子部分で消化す
るために、制限酵素Ｐａｔ工を使用することができる。

ｃＤＮＡセグメントを適当なアニーリング緩衝液でプラ
スミド中に挿入する前に、相補的ｄＣテールを二重鎖Ｃ
ＤＩＡの３′末端に付加する。

二重鎖ｃＤＮＡは他の種々の標準的方法でもプラスミド
クローニングベクター中に挿入できることは、理解され
るであろう。そのような別法の一つは、ＤＮＡリガーゼ
を用いてｃＤＮＡストランド１の末端に合成ヌクレオチ
ドリンカーを付加する工程を含む。このリンカ−を制限
酵素で開裂させて接着末端を生じさせ、同じ制限酵素で
開裂したプラスミド中に挿入する。シェラ−（Ｓｃｈｅ
ｌｌｅｒ）ら％　５ｃｉｅｎｃｅ、１９６　：　１７７
−１８０（１９７７）；前記マニアチスら、第２１９頁
参照。

上記のようにして製造した組み換えＤＮＡプラスミドを
、宿主細胞を形質転換するために使用する。宿主は種々
のものでよいが、ｃＤＮＡのクローニングのため真核細
胞の大腸菌を使用することが好ましい。どの宿主を選択
するにしても、組み換えプラスミドを開裂させる制限酵
素部位を含まないことが必要である。

宿主として、大腸菌を使用するときは、好ましい株はＭ
Ｍ２′９４およびＲＲＩ（アメリカン拳タイプ・カルチ
ャー・コレクション、１２３０１パークローンドライブ
、ロックビル、　ＭＤ　２０８５２゜米国（ＡＴＣＣ）
、％３１３４３）である。ＭＭ２９４宿主をプラスミド
ベクターで形質転換する方法は、前記マニアチスら第２
５５頁およびハナハン、１．　Ｍｏ１．　Ｂｔｏｘ、、
　　１６６　：　５５７（１９８３）に記載されている
とおり、公知である。

ＲＲＩ宿主をプラスミドベクターで形質転換する方法は
、ポリバーら、Ｇｅｎｅ、２　：　９５　（１９７７）
およびピーコックら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ。

Ａｃｔａ、、６５５　：　２４３（１９８１）　　に記
載されているとおり、公知である。他の適当な宿主とし
ての制限エンドヌクレアーゼ陰性（Ｒ−）　大腸菌株は
、　ＤＨＩ　ＡＴＣＣΔ６３３８４９およびＣ６００な
どである。これらの株ならびにＭＭ２９４およびＲＲＩ
株は広く市販されている。

マ二アチスら（＃記）およびハナへン（前記）により開
示されたものも含めて、形質転換方法においては、細胞
によるプラスミドの限られた取込みのために、実際には
小割合の宿主細胞しか形質転換されない。形質転換され
た細胞は適当な増殖培地および表現特性同定物質、例え
ば抗生物質を含有する寒天プレートに細胞培養物をのせ
ることにより、同定することができる。適当な抵抗遺伝
子（例えば抗生物質に対するもの）を有する細胞のみが
、生存する。組み換えｐＢＲ３２２プラスミドを大腸菌
ＭＭ２９４またはＲＲＩ株の形質転換に使用する時は、
形質転換Ｍ！Ｉ胞は表現特性同定物質としてテトラサイ
クリンを使用して同定可能である。

上記で調製したウシｃＤＮＡフイズラリーをスクリーニ
ングするためのプローブとして、ヒトＩＦ’Ｎ−γ　種
をコードする遺伝子のヌクレオチド配列の大部分に相当
する数百１基対（ｂｐ）から構成された放射標＠ＤＮＡ
フラグメントを使用した。

このプローブは、ヒトミＤＮＡライブラリーからヒトエ
ＦＮ−７のヌクレオチド配列の一部に相当する放射標識
合成オリゴヌクレオチドプローブを使用して単離した。

本発明のスクリーニング方法に使用するｃＤＮＡプロー
ブを単離するには、ヒトｍＲＮＡからヒトｃＤＮ　Ａラ
イブラリーを先ず調製する。ｍＲＮ　Ａは標準技術、例
えばフィコール−ハイパツク遠心分離で全血から分離さ
れた単核球細胞から調製する。歩めた白血球を活性化剤
とともにインビトロで血清を含む培地中で培養して増殖
させる。適当な時間の後、細胞を遠心で収穫する。使用
できる活性化剤の例は次のものである：Ｔ細胞分裂刺激
剤としてのフイトヘマアグルチニｙ　（ＰＨＡ　）、ポ
ークウイードマイトージエン（ＰＫＭ）ｉたはコンカナ
バリンＡ　（Ｃｏｎ　Ａ）：大腸菌ＬＰＳ　；およびス
タフイロコツカル　エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）。

このヒト白血球から全ｍＲＮＡを抽出するには。

例えば２−メルカプトエタノールとともにグアニジウム
　チオシアネートを使用する前記標準的方法で良い。そ
の後ホリアデニル化ｍＲＮＡ１オリゴ（ａＴ）　　−セ
ルロースのクロマトグラフィーによって抽出蛋白質から
分離する。

ヒトｍＲＮＡに相当する二重鎖ｃＤＮＡのライブラリー
を構造するには、前記のとおシ逆転写酵素を使用してｍ
ＲＮＡを鋳型として最初にｃＤＮＡストランＹを形成さ
せる。次に酵素ＤＮＡポリメラーゼエを使用して第一ス
トランドを鋳型に第二〇ＤＮＡストランドを合成する。

この二重鎖ａＤＮ＆をベクターの複製のための適当な宿
主細胞の形質転換に使用するクローニングベクターに挿
入する。好ましくはベクターは単一制限部位を多数持つ
プラスミド、例えばｐＢＲ３２２からなる。ｍＲＮＡか
ら調整されたｃＤＮＡは上記のホモポリマーテーリング
によって上記プラスミド中に挿入することができる。こ
の組み換えプラスミドは、適合性の宿主１例えば大腸菌
の株を形質転換するために使用できる。勿論他の適当な
宿主を使用してよい。組み換えプラスミドにより形質転
換された宿主細胞は適当な標準的表現特性同定因子、例
えば抗生物質により同定出来る。

放射標識オリゴヌクレオチド９はヒトミＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングするプローブとして用いるために
合成する。ヒトエＦ’Ｎ−γをコードする遺伝子の意味
のないストランド（アンチセンスストランド）の一部か
ら誘導されたプローブは次の構造を有する：　５’　　
ＣＴＧＧＧＡＴＧＣＴＣＴ’Ｉ’ＣＧＡＣＣＴＣＧ０　
このプローブは第１図に示す意味のあるストランドのヌ
クレオチド／ｌ６５６９から５９８に相補する。そして
、比較的合成が容易なだけ充分短く、ヒトエＦ’Ｎ−ｒ
遺伝子のプローブとして有用な充分な情報を有するのに
充分な長さであるという利点がある。しかしながら、グ
ローブの構造は、本発明の範囲若しくは精神を外れるこ
となく、ヒトエＦＮ−γ遺伝子の他の部分に相当するも
のであってもよい。

合成オリゴヌクレオチドプローブは、公知の技術例えば
ホスホジエステルまたはトリエステル法で容易に化学合
成できる。例えばトリエステル合成技術の詳細は、スー
トら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅａ、。

４：２５５７（１９７７）およびヒロセら、Ｔｅｔ。

Ｌｅｔｔ、、２８：２４４９（１９７８）に記載されて
いる。合成の後、オリゴヌクレオチド１プローブはＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼおよび３２Ｐ−ＡＴＰで標識
する。標識の標準的方法は上記マニアチスらの１２２頁
に記載されている。有利には、オリビヌクレオチドブロ
ープはｏＨ５′末端を持つように合成し、典型的には必
要とされるホス７アターゼエ糧を省略する。

ヒトミＤＮＡライブラリーを合成放射標識プローブを使
用して、例えば後述の実施例３および４に記載するよう
にしてスクリーニングする。次いでこのスクリーニング
工程によって向見された特定の陽性コロニーからプラス
ミ）’ＤＮＡを調製する。制限エンドヌクレアーゼ消化
により、単離されたプラスミ）；ＤＮＡはヒトエＦ’Ｎ
−γ遺伝子のコード領域の大部分を含むことが見出され
た。

単離されたヒトプラスミ）”ＤＮＡは上記で調製したヒ
トミＤＮＡライブラリーからスクリーニングをおこなう
だめのプローブとして使用する。この比較的寸法の大き
いプローブの使用は、非工ＦＮ−γニー）４ｃＤＮＡフ
ラグメントのハイブリダイズよりも現実にウシｂ工Ｆ’
Ｎ−γをコードするｃＤＮＡが７・イブリダイズする可
能性を高める。

後で詳述するように、このプローブの使用によってｃＤ
ＮＡライブラリーからのｂ１１’Ｎ−ｒ遺伝子の単離に
成功した。ヒトプラスミドＤＮＡの他の部分のヌクレオ
チド配列に和尚するグループも。

本発明の精神および範囲を逸脱することなく、使用でき
ることは理解されるであろう。

ヒトｃＤＮＡプローブはウシａＤＮＡライブラリープー
ルのハイブリダイズのために用いる前に放射標識される
。プローブの比較的大きい寸法のため１種々の標識技術
を使用できるが、しかしながら、好ましくはプローブは
ニックトランスレーションにより標識される。この公知
技術はリグビーら、Ｊ、Ｍｏ１．ｅｃ、　Ｂｉｏ、、　
　１１３　：　２３７（１９７７）および上記マニアチ
スらの１０８頁に記載されており、非常に限定されたＤ
Ｎａｓｅ工処理により大きく離れた複数サイトにニック
を導入し、これによって遊離の３’−ＯＨ基を各ニック
に霧出させる。ＤＮ八へリメラーゼエを使用して適当な
放射標識デオキシヌクレオチドトリホスフェート（”２
Ｐ−ａＮＴＰｓ）ｆ３−’　　ＯＨ末端に導入Ｌ、同時
にニックの５′側のヌクレオチドを除去してＤＮＡに沿
ったニックの連続的移動を生じさせる（ニックトランス
レーション）。

ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング本発明のスクリ
ーニング手段においては、形質転換体は最初に各々約２
，５００形質転換体よりなる比較的大きな群にプールす
る。複製されたプラスミドは形質転換体から何種類かあ
る任意の公知技術１例えばアルカリ溶融法で抽出する。

抽出されたプラスミド＃を適当な制限酵素で開裂してプ
ラスミドＤＮＡを調製する。得られたＤＮＡセグメント
をアガロースゲル上での電気泳動で分画し、ついでサザ
ーンら、　Ｊ、　Ｍｏ１．　ｂｉｏＬ、９８　：　５０
３（１９７５）に記載されたサザーンプロット法で直接
分析する。サザーンプロット法でニドミセルロースフィ
ルターにハイブリダイズしたＤＮＡフラグメントを、標
識したｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。プロ
ーブとハイブリダイズした特定のＤＮＡフラグメントを
オートラジオグラフィーで同定する。

オートラジオグラフィーで強くハイブリダイズするバン
ドを示したクローンの候補プールを約５００形質転換体
のグループに再分割し、標識ヒトＣＤＮＡプローブを使
用する上記ハイブリダイズスクリーニングを繰り返す。

クローンの候補プールの再分割および形質転換体スクリ
ーニングの工程を、所望のプールサイズが得られるまで
謙り返す。つぎに、標識グループにハイブリダイズする
単一の形質転換体を、グルンスタインおよびホグネス、
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳ
Ａ）　。

７２：３９６１（１９７５）に記載され九公知のコロニ
ーハイブリダイズ法で同定する。この方法によって、本
発明者らは、一つの陽性コロニーを発見した。ｐＢγ工
１’Ｎ−γと命名されたプラスミドＤＮＡは、上記特定
のコロニーから調製され念。

スクリーニングされたｃＤＮＡの特性決定上記で調製し
たプラスミドＤＮＡを標準的チェイン−ターミネーショ
ン法で配列決定する。このヌクレオチド配列の決定法は
、サンガーら、Ｐｒｏｃ。

Ｈａｔｅ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、　７
０　：　５４６３（１９７７）が最初に開発したもので
、米国特許第４．３２２，４９９号にも記載されている
。チェーンターミネーション配列決定の方法は１次の放
置に解説されている；「Ｍ１３クローニングおよび配列
決定」の題名のアメルシャムハンドブック（Ａｍｅｒａ
ｈａｍ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ）、プレンハイム　クレセン
ト　ロンドン（１９８３）；メツシン／、ｒ２ｍみ換え
ＤＮＡ技術情報、Ｎ工Ｈ出版物Ａ７９−９９．２Ｊ、４
３−４８（１９７９）；ノランダーら、Ｇｅｎｅ、　　
２６：１０１（１９８３）；セレッチら、　　Ｎｕｃｌ
、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１１　：　２５９９　（
１９８３）；およびビギンら、Ｐｒｏｃ、　Ｎ＆ｔ１．
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

（ＵＳＡ）、８０：３９６３（１９８３）。　所望のＤ
ＮＡ配列をクローニングするイクターとしてＭ１３線状
ファージを使用する。このようなはクタ−は、チェイン
−ターミネーション法で容易に配列決定される一重鎖Ｄ
ＮＡ鋳型を提供する（チェイン−ターミネーション法は
、次の工程を含む；−重鎖鋳型分子を遊離３′水酸基を
有する短いプライマーストランドでプライミングし、次
いでＤＮＡポリメラーゼ（クレノー７ラグメント）によ
って鋳型ストランドをコピーして鎖延長反応をさせるた
め、四梅全てのデオキシリボヌクレオチドトリホスフェ
ート、即ちａＡＴＰ、　　ａｃＴＰ。

ａＧＴＰ、およびａＴＴＰ　（まとめてｄＮＴＰａ　　
と称する）を使用するが、そのさいｄＮＴＰｓ　　の一
つは放射標識しておく）。この合成反応において、３′
水酸基末端を欠失したヌクレオチド特異性チェイ／−タ
ーミネータ−１例えば２’、３’ジデオキシヌクレオチ
ドトリホスフエート（ａａＮＴＰ）２、使用して、一連
の異なる鎖長を製造する。このり’ミネーターは、正常
の５１末端を有しそのため生長するＤＮＡ鎖に組み込む
ことができるが、３′水酸基末端を欠失し【いる。一旦
ターミネーターがＤＮＡ鎖に組み込まれると鎖の生長が
停止するためもはやデオキシヌクレオチドトリホスフエ
ートヲ付加することはできない。四つの別々の合成反応
（各々四つのヌクレオチｐａＮＴＰθ、即ちａＡＴＰ、
ａＣＴＰ、ａＧＴＰ、およびａＴＴＰの一つのａａＮＴ
Ｐ　　ｆ持つ）を行う。正常なａＮＴＰｅ　　の一つは
放射標識してオ６き、合成されたストランドヲホリアク
リルアミドゲル上でサイズを揃えた後にオートラジオグ
ラフィーを可能ならしめる。四つの反応からの鎖延長物
は、並べて分離用ゲルのレーンにのせ、オートラジオグ
ラフィーからの７ラグメントのパターンがクローン化Ｄ
ＮＡの核酸配列に相当するようにする。

ｆａ２図は、上記で調製した％ｐＢγＩＦＮ−７プラス
ミｒＤＮＡに含まれるｂ工Ｅ’Ｎ−γ遺伝子のヌクレオ
チド配列の説明図であるが、ヌクレオチド番号は５Ｉ末
端の開始部から付しである。遺伝子の相当するアミノ酸
組成も、第２図に示されておシ、そのアミノ酸残基の番
号は遺伝子のコード領域の開始部（ヌクレオチドＡ９４
）から付しである。本発明者らは、成熟蛋白質は星印を
付したＳｅｒ残基（４２１：　　ヌクレオチド４１５４
）から開始し、Ｔｈｒ残基（４１６５：　　ヌクレオチ
ド１４５８９）にわたっていると信じている。

配列決定法のための調製において、ＤＮＡ挿入物を含む
プラスミドＤＮＡ６Ｍ１３ファージベクターにサブクロ
ーニングして一重鎖ＤＮＡ鋳型を作成した。センスおよ
びアンチセンスストランドを配列決定するため、ニレノ
く一サルプライマーを使用した。−回のチェイン−ター
ミネーション法での全長フラグメントの配列決定で得ら
れた結果に頼るよシは、付加的合成プライマーを使用し
てサブクローニングしたＤＮＡフラグメントの長さの中
間部位からチェイン−ターミネーション法を開始した。

合成で製造したプライマーの組成はユニバーサルプライ
マーを用いて得られた配列情報に基づく。この方法によ
り、サブクローニングしたＤＮＡフラグメントの二本の
ストランドが共に配列決定され、そのため配列を確認す
る余計な手間を避けることができる。

上記のチェイン−ターミネーション法を用いる代わシに
、本発明の精神および範囲を離れることなく、クローニ
ングされたウシｃＤＮ入挿入物の配列決定に、他の公知
方法を使用してよいことは、理解されるであろう。例え
ば、マキサムおよびギルバート、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’
　　ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　（ＵＳＡ）。

７４　：　５６０（１９７７）に記載された、化学分解
法を使用してよい。

プラスミドｐＢｒ工ＦＮ−７中に含まれるｂＩＦＮ−ｒ
遺伝子のｃＤＮＡコード領域が機能的ｂＩＦ’Ｎ−ｒを
コードするか否かを調べるため、この遺伝子を発現系中
で発現させ、ウィルスプラーク減少アッセイでテストし
た。工］１’Ｎ−ｒ遺伝子のコード領域に相当するｃＤ
ＮＡを、宿主ａ＠からｂ工Ｆ’Ｎ−ｒの成熟形を直接合
成するようデザインされた発現ベクター中に挿入した。

必須ではないが、好ましくはバクテリア宿主細胞中で発
現させるには、プラスミド発現ベクターを採用する。理
想的にはプラスミドベクターは、λファージＰＬプロモ
ータを含み、そしてバクテリア宿主は例えばＰＩ、転写
の熱感受性ｃ　工１７プレツテーを有する大腸菌の株で
ある。更に、もし大腸菌を宿主として選択したときは、
好ましくは発現ベクターは高コピーＤＮＡ複製のための
複製起点、例えばプラスミドｐＢＲ３２２からのもの、
および形質転換大腸飼主の好適な選択のためのアンピシ
リン耐性遺伝子（Ａｍｐ　）、例えばこれもｐＢＲ３２
２からのもの、を含む。これらの要求を満九す発現ベク
ターの例は、プラスミドｐＰＬ　（ファルマシア　ファ
イン　ケミカルズ社、カタログ４２７−４９４６−０１
）およびプラスミドｐＰＬｃ　２８（ＡＴＣＣ／１６５
３０８２）があげられる。

大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　ｆｔ宿主として使用する場
合、ｂ工ｒＮ−ｒの発現水準を増大させるために、ｂ工
Ｆ’Ｎ−ｒ　ｃＤＮＡの上流に高度に効果的なリポソー
ム結合部位を使用することが望ましい。

リポソーム結合部位の塩基配列は１例えば、テシアー（
Ｔｅｓａｉｅｒ）　他、　　Ｍｕｃｈ、　Ａｃ１ｄｓ、
　Ｒｅｓ、。

１２ニア６６３（１９８４）による、ヒトＩＮ’Ｎ−γ
の発現に使用された塩基配列に基づくことができる。リ
ボノーム結合部位塩基配列は、以下の表１に示す合成オ
リゴヌクレオチドに組み入れる。

合成オリゴヌクレオチドは、スート（３００（Ｌ）ら（
＋ｔｆｌａｌ）、およびヒロセら（前出）によるトリエ
ステル法、あるいは、ホスホジエステル法によって合成
し得る。

表１ Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇａ７ ５′−ＣＧＡ献＾ＣＡＣＡＧＧＡＡＣＡＧＡＴｃＴＡＴ
ＧＴｃＴＴＡＴＧＧ−３〆表１に示したように、上記合
成オリゴヌクレオチドは、Ｃ１ａ　工５’付着端および
、開始＝トンＡＴＧと成熟す工ＦＮ−ｒタンパク質の開
始部分３アミノ酸残基（Ｓｉｒ、　Ｔｙｒ、　Ｇ１．ｙ
）をコードする塩基配列を含む３′　プラント端から構
成される。

Ｃ１ａ　工　　制限酵素切断部位およびＭｅｔ　　開始
コドンとの間のオリゴヌクレオチド部分は、終止コト１
ン（星印で示す）、シャインーダルガルノ部位（Ｓｈｉ
ｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ　ｒｅｇｉｏｎ）　　（第３図
に点線で示す）、およびＢｇ１エエ制限酸素切断部位を
含む、リポソーム結合サイト配列を構成する。５′端お
よび、５′端とＭｅｔ　　開始：７ド／との間のオリゴ
ヌクレオチド部分は、そのオリゴヌクレオチド１をｂ工
ＦＮ−ｒ遺伝子とともに連結させる個々のプラスミドの
構造に対応して、多様な異なる構造をとる可能性がある
ことは、理解されるべきである。

発現ベクターを含む工ＦＮ−γ遺伝子で細菌宿主を形質
転換した後、熱銹導を行なった際の、ｂ工Ｆ’Ｎ−γの
発現をプラーク減少アッセイによって確証する。このタ
イプのアッセイ法の詳細は、ラング３３９（１９８１）
に述べられている。概述すると、上記アッセイでは、９
６ウエルのマイクロタイターフレート（コーニング社カ
タログＡ２５８６０）の各ウェル内で、１０％（ｖ／ｖ
）ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕ
ｍ）　ｆ含むｏスウェルやパーク・メモリアル・インス
テイテユートー１６４０培地（ＲＰＭＩ−１６４０”）
５０マイクロリツトル（１μｇ“）中で、組み換え発現
産物を連続的にｌｏｇ２希釈したものを培養する。各列
の最終ウェルは、培地コントロールとして、発現産物を
全く含まないものを使用する。また、活性既知のヒトエ
ＦＮ−αをポジティグ・コントロールとして使用し、上
記試料と同様に連続的にｌｏｇ　２希釈を行なった。

マデインーダービー・ウシ腎臓細胞（ＭＤＢＫ。

ＡＴＣＣ腐　ＣＣＬ２２）をトリプシン処理により対数
増殖段階から回収し、洗浄して成長培地を除く。１０％
（ｖ／ｖ）仔ウシ胎児血清（”　Ｆ’Ｃ８”）中のＲＰ
Ｍニー１６４００１００μＪ中＋７１＞３　Ｘ　Ｉ　Ｏ
’ＭＤＪ３に細胞を、各ウェル内に加える。マイクロプ
レートは、５％ＣＯ２’ｉ含む湿潤な空気中で３７℃で
２４時間インキュベートする。次に、培地をウェルがら
除去する。あらかじめ感染粒子を定量した水痘性口内炎
ウィルス（’ｖｓｖ’）の解凍したアリコートを希釈し
、上記と同じ培地１００ａ／中３０〜３５感染粒子を各
ウェルに加える。穏やかに振盪しながら３７℃で１時間
インキュイードした後、結合していないウィルスを各ウ
ェルから除去する。

その後、各ウェルＫ、上記と同じ培地中０．５％メチル
セルロース１００μｇを上載せする。さらに３７℃で１
８〜２４時間インキュベートした後、メチルセルロース
を除き、７０％メタノール中００．５％クリスタルバイ
オレットで３分間ウェルを染色する。次に、染色液を、
マイクロタイタープレートを水中に数回浸すことにより
除去する。

続いて、プラークを数える。各試料中のインターフェロ
ン活性は次の式によって算出する二上式に於いて： ＰＤＤ５ｏ−５０チプラーク減少投与量Ｄｔ、＝５０１
プラーク減少希釈率の下限の逆数ＤＨ−５０％プラーク
減少希釈率の上限の逆数ＰＨ−５０１プラーク減少点上
限減少率上限希釈率ラーク数ＰＬ−５０％プ２−り減少
点下限希釈率におけるプラーク数Ｐ５゜−５０チプラ一
ク減少点におけるプラーク数、すなわち全て培地のみで
あるウェルの平均プ２−り数７２上記アッセイ法の使用
により１本発現系が高水準のｂＩＦＮ−γ活性、すなわ
ち、　１ミ＋）＋）ットルあたり１１ａ３００Ｌ＝：、
／ト（”Ｕ／ｍＡ”）を生成することが判明した。ｂＩ
ＦＮ−γ塩基配列を含まない対照プラスミドではバック
グラウンド活性（２Ｕ／ｍＪ）のみが検出された。上記
結果から、第２図に示すように、本発明者らが単離した
遺伝子がｂＩＦＮ−γ遺伝子と一致することが確認され
た。

本発明の方法および産物につき、以下の実施例によって
さらに詳述する。

（実施例１） ポリアデニル・化ｍＲＮＡの調製 １ミリリツトルあたり約１０７細胞の濃度であるウシ後
咽頭リンパ節細胞（Ｂｏｖｉｎｅ　ｒｅｔｒｏｐｈａ−
ｒｙｎｇｅａｌ　１ｙｍｐｈ　ｎｏｄｅ　ｃｅｌｌｓ）
　　（ワシントン州すムナー、ウニバー−ミート・バッ
キング社（Ｗｅｂｅｒ’ｓ　Ｍｅａｔ　Ｐａｃｋｉｎｇ
）より）ｅｌｏｓ（ｖ／ｖ）Ｆｅ２および１ミリリツト
ルあたシフ、５マイクログラム（１μ９／ｙｔｔ”）の
濃度の分裂促進レクチｙＣｏｎＡを含むＲＰＭニー１６
４０培地で培賽した。細胞は気相にｓ　ｓ　ｃｏ２を含
む湿潤な空気中で約１７時間培養した。上記期間後、遠
心沈降によって生存している細胞を回収した。

単核細胞から全ＲＮＡを、実質的にチャーウィン（Ｃｈ
ｉｒｇｗｔｎ）他（前出）による方法によって抽出した
。上記方法において、　ＲＮａｓｅを含む細胞タンパク
質をＲＮａａｅによるＲＮＡ加水分解速度を越える速度
で変性させるために、チオシアン酸グアニジ：ｙ　（ｇ
ｕａｎｌｉｎｉｕｍ　ｔＭｏｃｙａｎａｔｅ）を使用し
た。ｍＲＮＡをエタノール沈殿によって細胞タンパク質
から除き、続いて８Ｍ塩酸グアニジン、２５ｍＭ酢酸ナ
トリウムで再懸濁（抽出）した。

塩酸グアニジンで抽出したＲＮＡを１次に等容の７エノ
ール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５容／
２４容／１容）で再抽出した。上記抽出過程により得ら
れるＲＮＡを含む水層を、次に５０ｍＭ酢酸溶液とし、
０．６容のエタノール添加により沈殿させた。ＲＮＡは
一２０’Ｃで凍結した後遠心沈降により回収した。

続いて、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、前出。

１９７−２−ジに示された方法を用いて、ポリアブ二に
化サレ７ｔ　ｍ　ＲＮ　Ａをオリゴ（ａ’ｒ）−セルロ
ース　クロマトグラフィーカラムを用いて抽出されたタ
ンノξり質から分離した。概述すると、上記カラムは、
２０ｍＭトリ、ｘ、　−Ｈ（Ｊ（ｐＨ７，６）　、　０
．５　ＭＮａ（Ｊ、１ｍＭｚチレンジアミン四酢酸（”
ＥＤＴＡ’　）および０．１　％ドデシル硫酸ナトリウ
ム（”ｓｏｓ’）から成る、開始緩衝液で調製した。Ｒ
ＮＡベレットは水および開始緩衝液に溶解し、カラムに
負荷した。非吸着物質は開始緩衝液による初回の洗浄お
よび０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１１ｒ：含む開始緩衝液によ
る再度の洗浄によって溶出した。吸着されたポリアデニ
ル化ｍ’ＲＮ　Ａは、１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　　（ｐ
Ｈ７，５）、１ｍＭ　　ＥＤＴＡお！び０．０５％　Ｓ
ＤＳから成る。低イオン強度の緩衝液で溶出した。溶出
したポリアデニル化ｍＲＮＡを、／１゜容の酢酸ナトリ
ウム（３Ｍ、ｐＨ５，２）および２．２倍容のエタノー
ルによって一２０℃で沈殿させた。オリゴ（ｄＴ）−セ
ルロースカラムからポリアデニル化ｍＲＮＡ’ｉ溶出さ
せた後、マニアティス（Ｍａｎｉａ−ｔｉｅ　）ら、前
出１９９頁に示された、アガロースゲル電気泳動によっ
て、ポリアデニル化ｍＲＮＡの純度を検定した。

（実施例２） ｍＲＮＡに対応する二本鎖ｃＤＮＡライブラリーを、ガ
プラー（Ｇｕ’ｂｘｅｒ）およびホフ−ｖ　ン（Ｈｏｆ
ｆ−ｍａｎ）、前出によって改良されたマニアテイス（
Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、前出２２９頁に述べられた標準
的方法を用いて、実施例１で精製したｍＲＮＡから調製
した。オリゴ−ｄＴｔ−、ｍＲＮＡのポリアデニル化さ
れたテイルとハイグリッドを形成させ、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ
の第１の鎖の逆転写のためのプライマーとして働らかせ
た。トリ骨髄芽球症ウィルス（”７１ＶＩ）逆転写酵素
を用いて上記ｍＲＮ入を鋳型として第１のｃＤＮＡ鎖を
合成した。概述すると、第１のＣＤＮＡＤＮＡ上、５Ｑ
ｍＭトリスーＨＣＪ（１）Ｈ８，３）、１０ｍＭ　　Ｍ
９Ｃ１２，１０ｍＭジチオトレイトール（’ＤＴＴ”）
ｔ　４ｍＭピロリン酸ナトリウＡ、１．２５ｍＭ　　ａ
Ｇ’ｒＰ、１．２５ｍＭｄＡＴＰ、１．２５ｍＭ　ＴＴ
Ｐ、Ｑ、５ｍＭ　　ａＣＴＰ。

１５〜２０μＣ１の〔α−Ｐ）　ｄＣＴＰ（３１０００
Ｃ１／ｍｍｏ１）、　１００　ｔｔ９／−のオリゴ（ｄ
Ｔ１２−１８）１１５０μ９１ｒａｔ　ｍＲＮＡ（実施
例！より）、１ｍ、Ｉ）たりλ０００ユニットのへＭＹ
逆転写酵素を含む、２０〜４０μｇの反応体積で行なっ
た。反応は４３℃で３０分間行ない、ＥＤＴＡを２０ｍ
Ｍまで加えることにより停止させた。反応産物はフェノ
ールにより抽出し、オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ　）　お
よびベルブ（Ｂｅｒｇ）、　Ｍｏ１．　Ｃａ１１．　Ｂ
ｔｏｌ、、　２　：１６１−１７０（１９８２）に述べ
られた２Ｍ酢酢酸アン−ニウムらエタノールによって沈
殿させた。第２のｃＤＮＡ鎖は、１００．μｌの上と同
様の２０ｍＭトリス−ＨＣｇ（ｐＨ７，５）ｔ　　５　
ｍＭＭｇＣ１２，１０ｍＭ　（ＮＨ４）２Ｓｏ４．１０
０　ｍＭ　　ＫＣｅ。

０．１５ｍＭ　　β−ＮＡＤ、　ｓ　ｏ　ｐＭｔｔｔｌ
　ＢＳ入、４０ｐＭａＮＴＰｓ、８．５ユニツト／　ｔ
ｕｇの大腸菌ＲＮａａｅ　Ｈ（Ｉｉ２．ｃｏｌｉ　ＲＮ
ａｓｅ　Ｈ）、　　２３０　ユニット／ｍＪＤＮＡポリ
メラーゼエ、１０ユニツ）　／ｌｘｌ大腸菌Ｄ　Ｎ　Ａ
リガーゼ（Ｌｃｏｌｉ　ＤＮＡ　　ｌｉｇａｓｅ）を含
む反応液中で合成した。この反応混合液を１２℃で１時
間インキエベートし、さらに２２℃で１時間インキエベ
ートした。次に、反応を停止させるためにＥＤＴＡｔ−
２０ｍＭとなるように添加した。得られた二本鎖ｃ　Ｄ
　Ｎ入は上述のようにフェノールを用いて抽出した。

二本鎖ｃＤＮＡをセファクリルＳ−４００（７アルマシ
ア・ファイン・ケミカルズ社）カラムクロマトグラフィ
ーによってサイズ別に分画し、末端を標識したＩ）ＢＲ
３２２ＤＮＡフラグメントを分子量マーカーとして使用
してアルカリアガロース電気泳動分析によジ確認した。

５００　ｔｌ以下の鎖長を有するＤＮＡ１ｌは、上記小
型ａＤＮＡ画分の不要なりロー二／グを避けるため、除
去した。

上述のように調製した二本鎖ｃＤＮＡ画分をマニアテイ
ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他、前出、２３９頁以後に示さ
れた方法により、ｐＢＲ３２２プラスミド（ファルマシ
ア・ファイン・ケミカルズ社）のＰｓｔ工切断部位に挿
入した。本方法に於いて、二本鎖ｃＤＮＡは３′末端を
ポリ（ａＣ）でティリングした。プラスミドｐＢＲ３２
２はＰａｔ　Ｉ工／ト１ヌクレアーゼで切断し、３′末
端を、ｔ！！す（ｄＧ）でティリングした。ティリング
したプラスミドＤＮＡおよびティリングしたｃＤＮＡを
アニーリング緩衝ｉ（０，ｌ　Ｍ　　Ｎａ（Ｊ、　　ｌ
　ＯｍＭ　トＩＪス−Ｉ（Ｃｇ（ＰＨ１８）および１０
ｍＭ　　ＥＤＴＡ）で７　＝　−＋）　７グし、新しい
組み換えプラスミドヲ形成させた。ここに示した全ての
制限酵素は、米国マサチューセッツ州ベバリーの、ニュ
ー・イングランド働ハイオラプズ社から市販品を入手可
能である。

上１１１Ｆ！（’１み換えプラスミド・を、大腸菌（Ｌ
　ｃｏｌｉ）１９　　濃度を増加させた状態で培養する
ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）（前出）の方法を用、いる
ことにより、大腸＠　（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　　Ｍ　Ｍ　
２９４株に形質転換した。

形質転換宿主は、プレート上にまいて表現型指標として
テトラサイクリンを用いて形質転換体を同定した。本技
術の使用により、本発明者らは約３ａＯＯＯの独立した
形質転換体を得た。

（実施例３） ヒトＩＦＮ−ｙ　　ｃＤＮＡスクリーニングプローブの
調製 ヒト全血液（ポートランド、オレゴン赤十字社からの混
合液）由来の、体積３５０〜４００ｔＪの白血球濃縮液
を混合し、Ｃａ”、　Ｍｌｉｌ”１μ含有リン酸緩衝生
理的食塩水（Ｃａ　　、　Ｍ９　　ｆｒｅｅ　ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｔｉｎｓ、　　’Ｐ
Ｂ８　”　）　　に希釈し、ヒストパーク（Ｈｌｓｔｏ
ｐａｑｕｅ　）（米国ミズーリ州セントルイス、シグマ
・ケミカル−カンパニー）上に載せて、次に、室温で３
０分間６００Ｘ９で遠心した。白血球から成る中間層を
取り出し、ＰＢＳ　で洗浄し、室温で１０分間４００Ｘ
９で遠心した。

細胞は、さらに２回”＋＋　Ｍ９％Ｆ含有ＰＢＳで洗浄
し、各洗浄後に１０分間２００　Ｘ９で遠心した。

次に上記細胞をプラスチック培養フラスコ中のｌＯチウ
シ胎児血清（ｖ／ｖ）および１０μ９１ｒｎｌＣｏｎ　
Ａ　　（ミズーリ州セントルイス、シグマ・ケミカル社
）を含むＲＰＭニー１６４０培地に加−えた。１６時間
後、活性化された細胞６ＲＮＡ調製のために回収した。

全ＲＮＡを単核細胞から抽出し、＊施例１で示した方法
を用いて、オリゴ（ａＴ）−セルロースクロマトグー）
フィーカラムにより、ポリアデニル化ｍＲＮＡを上記全
ＲＮＡから分離した。得られたポリアデニル化ｍＲＮＡ
の純度を、アガロースゲル電気泳動により検定した。ヒ
）ｍＲＮＡに対応する二本鎖ｃＤＮＡライブラリーを実
施例２に示した方法により調製した。得られた鎖長５０
０　’ｂｐ以上の二本鎖ｃＤＮＡ画分を、実施例２で述
べたホモポリマーティリング法によってｐＢＲ３２２の
Ｐａｔ　工切断部位に挿入した。組み換えプラスミドは
、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　　Ｍ　Ｍ　２９４株に形
質転換し、形質転換体はテトラサイクリンを表現型同定
指標として同定した。この方法により、本発明者らは約
Ｉ　Ｘ　１０’　　個の独立な形質転換体を同定した。

スート（８００（１）他、前出、およびヒｏ　セ（Ｈｌ
ｒｏｓｅ　）他、前出に述べられた、標準的トリエステ
ル法により、合成オリゴヌクレオチドプローブを化学的
に合成し、ヒトｃＤＮＡライブラリのスクリーニングに
使用するために　Ｐで放射性標識を施した。

プローブは％第１図のヌクレオチド５６９から５８９に
対応する。次の塩基配列から成るものとした：　５’−
ＣＴＧＧＧＡＴＧＣＴＣＴＴＣＧＡＣＣＴＣＧ−３’０
標識を容易にするために、オリゴヌクレオチドの５′末
端はＯＨ端で合成し、それによってＤＮＡフラグメ／ト
ヲ樺識する際に一般的に行なわなければならないリン酸
処理を省いた。標識法は、１μｌの合成オリゴヌクレオ
チドｅ１６μｌの　Ｐ−ＡＴＰ（７０００Ｃ１／ｍＭ）
、　１Ａｌ（ＩＯＵ）のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
および２μｅの１０にキナーゼ緩衝液工（０，５Ｍ　）
リス−Ｃ１（ｐＨ７，６）ｓ　　Ｏ−Ｉ　Ｍ　　１９０
ｇ２−　５０　ｍ　Ｍ　ジチオトレイトール、１ｍＭ　
　スペルミジンおよび１　ｍＭＥＤＴ　Ａ　）に加える
ことによった。反応は３７℃で３０分間行ない、次に合
成オリゴヌクレオチドをフェノール／クロロホルムで抽
出した。。標識したプローブは、セファデックスＧ−５
０カラム（ファルマシア・ファイン自ケミカルズ社）に
よりクロマドグラフィーあるいは濾過によって標識され
ていないオリゴヌクレオチドから分離した。

ヒトｃＤＮＡライブラリの最初のスクリーニングを実施
するために、形質転換された細菌培養液を、各々約へ０
００個の異なるクローンを有するプールに分割した。プ
ラスミドＤＮＡは、イシューホロウイツツ（工ｓｈ−Ｈ
ｏｒｏｗｉｃｚ）およびプルケ（１９８１）で述べられ
ている標準的なアルカリ分解法によって宿主細菌試料か
ら分離した。単離したプラスミドは標準的方法によｐＰ
ｖｕＩＩおよびＨｌｎｄ　ｍで完全に切断した。次に、
プラスミド分解物を０．８　％アガロースゲル電気泳動
により分画し、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、前出の標
準的方法によりニトロセルロースフィルター上にプロツ
テインクシタ。ニトロセルロースフィルターに結合した
ＤＮＡは、後述の実施例４に示す方法を用いて標、識し
た合成オリゴヌクレオチドグローブとノ・イブリツビ形
成させた。ハイブリッド形成したＤＮＡのバンドが得ら
れた、候補となるクローンのプールを放射性標識した合
成プローグと直接コロニーハイブリッド形成を行なわせ
ることによってスクリーニングし、単独のポジティブな
コロニーを同定した。

前述の方法に従い同定したポジティブなコロニーからプ
ラスミ１ｊＤＮＡを調製し、標準的な制限エンドヌクレ
アーゼ切断法によってマツピングした。ヒトｒ−ＩＦ’
Ｎ　　ａＤＮＡのヌクレオチド配列を第１図に示す。第
１図に示した７　０２１）ｐのヒトＴＦＮ−ｒ　ｃＤＮ
Ａりｏ−ｙｔ、前述の実施例２で調製したウシプラスミ
ドＤＮＡのスクリーニングのためのプローブとして使用
した。

ｃＤＮＡヌクレオチドプローグはマニアテイス（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ）他、前出ｔｏｓ頁および前述の標準的方法
に従い、ニックトランスレーションによって放射性標識
を施した。この方法によれば、プローブは約５　ｘ　ｌ
　０８ＣＰＭ／μ９　Ｄ　Ｎ　Ａｃ７）特異的活性を有
するように標識された。スクリーニング過程での使用に
先立ち、標識したプローブは、１００℃の水中で１０分
間煮沸した後に氷上で冷却して変性させた。

（実施例４） 上記実施例２で調製したｃＤＮＡの最初のスクリーニン
グを実施するために、形質転換した細菌培養液を各々約
２，５００の異なるクローンを有するプールに分割した
。プラスミドＤＮＡはイシューホロウイツツ（工ｓｈ−
Ｈｏｒｏｗｉｌ）　　およびプルヶ（Ｂｕｒｋｅ）、前
出による標準的なアルカリ分解法によって、宿主細菌試
料から分離した。単離したプラスミドはＰａｔ　Ｉ　　
で切断し、１％アガロースゲルで適当な大きさのマーカ
ーとともに電気泳動を行なうことにより１分画した。ア
ガロースゲルはサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、　前出の
方法を用いてニトロセルロースフィルター上にプロッテ
ィングした。

転写過程後、フィルターを空気乾燥し、ＤＮＡフラグメ
ントをニトロセルロースに結合させるために真空下約８
０℃で２時間ベイキングした。

次に、結合したＤＮＡｔｌ−標識したｃＤＮＡプローブ
とハイグリッド形成させた。概述すると。

０、１％サルコシル（ｓａｒｃｏｓｙｌ）、　５　ｘデ
ンハルト溶液（ＩＸ−０，０２チフイコール、０．０２
％ポリビニルピロリドン、０．０２チＢＳＡ）、１００
μ９／　ｒｒｔｌ変性サケ精子ＤＮＡ（シグマタイプｌ
、ナトリウム塩）および０．５１界面活性剤ノニデット
Ｐ４　Ｑ’ｉ含む６　Ｘ　ＮａＣｖｃｉｔ　（ｌ　ｘ　
ＮａＣ６／Ｃ１ｔ−０、ｌ　５　Ｍ　　ＮａＣＪ／　０
．０１５　Ｍ　　クエン酸ナトリウム、ｐＨ７）から成
るプレノ・イブリッド形成緩衝液中で、上記のペイキン
グしたニトロセルロースを５５℃で２−４時間インキュ
ベートした。次に、上と同様のハイブリッド形成溶液中
で、フィルターを３２ｐで標識したｃＤＮＡプローズ（
ｌ　Ｏａｐｍ／−）（実施例３よシ）とともに５５℃で
１６時間インキュベートした。ハイブリッド形成後フィ
ルターを６　ｘ　Ｎａ（Ｊ　／Ｃｉｔ　で室温下で十分
に洗浄し、続いて４２℃で１時間、５５℃で１．５時間
洗浄した。空気乾燥後、フィルターｔ−−７０℃でオー
トラジオグラフィーにかけた。

オートラジオグラフィーから、本発明者らは多数の強度
にハイグリッドを形成したバンドを確認した。強いハイ
ブリッド形成バンドを生成するブラスミＦ’ＤＮＡが得
られた候補となるクローンのプールを、約５００の形質
転換体を有するプールに再分割し、ハイグリシ１形成ス
クリーニング法を繰り返した。強くハイブリッド形成す
るＤＮＡのバンドが見られた、候補となるサブプールは
、次にブレーティングを行なった。得られたコロニーに
つき、前述のハイブリッド形成条件下で、グルンシュタ
イン（Ｇｒｕｎ　５ｔａｉｎ）およびホグネス（Ｈｏｇ
ｎｅｓａ）、前出の周知方法により、放射性標識したヌ
クレオチドプローブで調べた。この過程により、単独の
ポジティブな宿主コロニーｆ、（ｉ１１定した。

（実施例５） スクリーニングしたｃＤＮＡの解析 ｐＢγ工ＦＪｔ−７と命名されたプラスミドを実施例４
で述べた方法により同定されたポジティブなコロニー由
来のｃＤＮＡを用いて調製した。ポジティブな宿主コロ
ニーから取り出したプラスミドＤＮ入由来のｃＤＮＡ挿
入物は、本質的にはアマ−ジャム・ハンｒブック、前出
に示された標準的なチェインターミネーション法に以下
の変更を加えた方法で塩基配列を決定した。上記ｃＤＮ
Ａ挿入物は、Ｐｓｔ工および／またはＲｓａ　工　　で
切断し、単鎖直鎖状ファージベクターＭ１３のｍｐｔｓ
　およびｍｐ１９　株（米国イリノイ州アーリントン・
ハイツ、アマージャム社）にサブクローン化した。

ｍｐｔｓおよびｍｐ１９ファージベクターは、ノーラン
ダー（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ）他、前出に示されたように
、以下の単一クローン化部位を有する：　Ｈｌｎｄ［１
；　Ｓｐｈ　ｌ　；　Ｐｓｔ　　ｌ　；Ｓａｄ　１　；
Ａｃｃ　　ｌ　；ＨｌｎｃＩＩ；　ｘｂａ　１　；Ｂａ
ｍ　Ｈ工；　Ｘｍａ　ｌ　；Ｓｍａ　ｌ　；Ｋｐｎｌ；
５ｓｔｌ；およびＥｃｏＲｌｏｍｐ　１８およびｍｐ１
９ばフタ−の構造は、上記同定された制限酵素切断部位
の順序がｍｐ１９ベクターでは逆になっていることを除
いては、同等であり、従って、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ挿入物の
二本鎖の双方とも上記二つのベクターを用いて有効に塩
基配列を決定することができる。ｃＤＮＡの対応する鎖
を挿入したｍｐｔｓおよびｍｐ１９ベクターは、センス
鎖および非センス鎖の単鎖挿入物を含む複製単鎖ＤＮＡ
鋳型を生成させるために、大腸菌（Ｅ　ｃｏｌｉ）　Ｋ
　ｌ　２株ＪＭ１０７（米国ミズーリ州ベセスダ、ベセ
スダ壷リサーチ・ラボラトリーズ）の形質転換に使用し
た。

合成ユニバーサルプライマー：　５’−ＣＣＣＡＧＴＣ
ＡＣＧＡＣＧＴＴ−３’（米国ウィスコンシン州ミルウ
オーキー、Ｐ−Ｌバイオケミカルズ社）を単鎖鋳型ＤＮ
Ａとアニールさせ、前記「スクリーニングされたｃＤＮ
Ａの特性決定」の項で述べた第１のＤＮＡ鎖合成に使用
した。その後、伸長フラグメンＨ−ゲル電気泳動によっ
て鎖長で分画し、オートラジオグラフィーを行ない、そ
れによってフラグメントのヌクレオチド配列を解析した
。

デオキシアデノシン５′（α−〔Ｓ〕　チオ）トリホス
７エイト（以後’ａＡＴＰ（α−５）１）をジデオキシ
塩基配列決定反応において放射性標識に使用した。また
、アマ−ジャム・ハンドブック３６頁に示されたゲルを
用いず、６チポリアクリルアミドゲル（６俤ポリアクリ
ルアミドゲル、厚さ０．４ｍ、７Ｍ尿素＋１００ｍＭト
リスーホウ酸（ｐＨ８，１）、　　および２ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡを含む）を使用した。

前記のとおり％　ｐＢγ工ＦＮ−７ｃＤＮＡ　　のヌク
レオチド配列を第２図に示す。ｂ工ＦＮ−７遺伝子のコ
ード領域はヌクレオチド４９４（Ｍｅｔ残基）からヌク
レオチド４５９１　（Ｔｈｒ残基）にわたり、成熟タン
パク質はヌクレオチドＡ１５４に対応するアミノ酸残基
（Ｓｅｒ）から開始すると考えられている。ヌクレオチ
ド配列から決定された。

対応するアミノ酸はコドンの上段に示す。

（実施例６） 第２図に示された、Ｂａ６１　制限酵素切断部位（ヌク
レオチ）’Ａ１６２）から上記遺伝子の３′隣接部位内
のＢ９１　Ｉｆ制限醪素切断部位（ヌクレオチド／ｌ６
９６６）にわたるｂＩＦ’Ｎ−ｒ遺伝子のコード領域を
、大腸菌内でのｂＩＦ′Ｎ−γ発現を誘導するために発
現ベクターに挿入した。ΔｐＬＢλ工Ｆ’Ｎ　　と命名
され、第３図に示された上記発現ベクターは、復製開始
部位（ｏｒｉ）およびアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ
　）ｔ”含む、ｐＢＲ３２２ＥＩ３来のものである。ま
た、上記発現プラスミドはｂ工ＦＮ−λの転写の誘導に
機能するＰＬ−λ（ファルマシア社、／ｌ６２７−４９
４６−Ｏｆ）由来の熱訪発ファージラムダＰＬプロモー
タ（斜線部で示す）をも含む。上記発現プラスミドは、
さらに、発現ベクターｐＫＫ２２３−３（７アルマシア
社。

、％２７−４９３５−Ｏｆ）由来のｒｒｎＢ　　オハロ
ン転写ターミネータ−、ＴＩＴ２　ｔ−含む。

第２因に示したＢａｄ　１部位−（ヌクレオチドＡ１６
２）から始まるｂ工ＦＮ−λ遺伝子のコード領域部分は
、ｂＩＦ’Ｎ−λ遺伝子の３′隣接部位内のＢａｌ！１
１　部位（ヌクレオチド４９６６）まで、マニアテイス
（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他、前出１０４頁に述べられてい
るような標準的方法により制限酵素Ｂａｅ１およびＢａ
ｄ　■の使用により第２図に示したｐＢλＩＦ’Ｎ−７
ｃＤＮＡ　　断片から単離した。

成熟タン、Ｒり質のコード領域の５′　末端に正確に対
応するような有効な制限酵素切断部位が見い出されない
ため、成熟タンパク質のコード領域から８ヌクレオチド
下流に位置するＢａｄ　　１　　部位でｃＤＮＡクロー
ンからｂ工Ｆ’Ｎ−λ遺伝子断片を切断した。

ｂＩＦＮ−λ遺伝子のコード領域の５′末端部分を補い
、また翻訳開始コドン（ＡＴＧ）？形成するために合成
オリ！ヌクレオチド１化学的に合成した。表１で示した
オリビヌクレオチドの構造は、さらに、開始コドンから
上流にリポソーム結合部位を含み、　Ｃ１ａ１　５’付
着端を含む。リポソーム結合部位は、ヒトエＦＮ−λの
高水準発現を示す塩基配列に基づいている。

ｂ工Ｆ’Ｎ−λ遺伝子のコード領域１ＢａＪ１　部位で
切断する代りに、第２図に示したｐＢλ工Ｆ’Ｎ−７ｃ
ＤＮＡフラグメントは同遺伝子の５′隣接部位内の制限
酸素切断部位で切断し得る。その後、隣接部位のヌクレ
オチドを標準的手法により順次除去しうる。

発現プラスミドΔｐＬＢλ１１’Ｎ（ＡＴＣＣに寄託番
号４５３．３３３）を、ポリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）他
、前出およびピーコック（Ｐｅａｃｏｃｋ）　　ら、前
出に示されたような標準的形質転換法により、大腸菌（
Ｌ　ｃｏｌｉ）　　ＲＲｌ　（ＡＴＣＣ寄託番号肩３１
３４３）に形質転換した。上記大腸菌株はＰＬプロモー
ターの温度感受性リプレッサーをコードする遺伝子を有
するプラスミドｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ（ＡＴＣＣ寄託番
号／ｌ６３３７６６）を含んでいる。

大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　　ＲＲ１株内にΔｐＬＢλ
工Ｆ’Ｎプラスミドヲ含む培養物を、３２９／ｌトリプ
トンおよび２０　ｇ／ｅｅ母抽出母管出物し、Ｍ９塩を
Ｉ　Ｘ、　Ｍ９ＳＯ４ｔ”　０．１　ｍ　Ｍ、　Ｆｅ０
ｇ３ｔＯ，００１ｍＭ、アンピシリｙｔ−１００１１９
／−含むＳ、工。

培地（Ｍ−９培地）（前述のマニアテス他参照）で３０
℃で１晩培養した。次に、上記培養物をアンピシリンを
含まないＳ、工、培地で１００倍に希釈し、６００ナノ
メートルにおける吸光度０．７まで培養した後、脱抑制
するために４２℃に温度をあげ、４時間培養した。培養
液１　ｍｅ分金種℃で遠心することにより　バレット化
し、ドライアイスとメタノールの混合液に浸すことによ
り凍結した。

次に、イレットｔ−１５０μｇの７ＭグアニジンＭＣＩ
に再懸濁し、ドライアイス／メタノール上で再凍結した
。グアニジン抽出液内の生物学的活性の存在は、前述の
プラーク減少アッセイによって確認した。本発明者らは
、ΔｐＬＢγＩＦＮプラスミドは１．１５ＸｌＯＵ／ｍ
Ｊ以上の生物学的活性を発現することを見い出した。ｂ
ＩＦ’Ｎ−γ遺伝子配列を欠いた対照プラスミドでは、
約２Ｕ／ｍＪのバックグラウンド活性しか検出されなか
った。

以上のことから、第２図で解析したｐＢγＩＦＮ−７ｃ
ＤＮＡ　　はｂ工Ｆ’Ｎ−γ遺伝子に対応することが確
証された。

本発明が述べる分野における技術者にとっては明らかな
ように、本発明は、本発明の趣旨および本質的性質から
離れることなく、上で特異的に述べた以外の形態で具体
化されうる。従って、上記本発明の特別な実施例は全て
の点で例示的であり、制限的なものではないと考えられ
るべきである。

本発明の範囲は、特許請求の範囲に記載されているとお
りであり、上記の記述に含まれる実施例に制限されるも
のではな℃・。

【図面の簡単な説明】

第１図は、合成オリゴヌクレオチドプローズを用いて単
離したヒトガンマインターフェロン（ＩＮＦ−８）ｃＤ
ＮＡのヌクレオチド配列を、ヌクレオチドの位置に対応
する数値およびウシｃＤＮパライブラリのプローブに使
用したｃＤＮＡフラグメント部分に対応する枠のついた
下線とともに示す塩基配列図である。 第２図は、ＩＮＦ’−γ遺伝子をコードするウシプラス
ミドＤＮＡｐＢｒＩＦＮ−７のヌクレオチド配列（下段
）およびアミノ酸配列（上段）を、成熟タンパク賞が開
始する星印部分およびＭθを残基から開始するアミノ酸
の番号に対応する各行止の数字およびヌクレオチド位置
に対応する各桁下の数字およびある制限酵素切断部位に
相当する三角印とともに示す塩基配列図である。 第３図は、プラスミドΔｐＬＢγＩＦＮ＝ｉ示す模式図
である。 （外５名） 手続補正書（方式）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）ウシ・ガンマ−インターフエロンをコードする実
   質的に純粋なＤＮＡ。
2. （２）第２図に示す核酸配列を有する特許請求の範囲第
   １項記載のＤＮＡ。
3. （３）第２図のヌクレオチド１５４番からヌクレオチド
   ５９１番の範囲の核酸配列を有する特許請求の範囲第１
   項記載のＤＮＡ。
4. （４）特許請求の範囲第１、２または３項記載のＤＮＡ
   配列を含む組み換えＤＮＡベクター。
5. （５）特許請求の範囲第４項記載の組み換えＤＮＡベク
   ターで形質転換された微生物の培養体。
6. （６）特許請求の範囲第１ないし第３項のいずれか１項
   に記載の核酸配列によりコードされるポリペプチド。
7. （７）特許請求の範囲第５項記載の培養体により発現さ
   れる組み換えウシ・ガンマ−インターフエロン。
8. （８）特許請求の範囲第４項記載の組み換えＤＮＡベク
   ターにより形質転換された微生物を培養し、ウシ・ガン
   マ−インターフエロンを回収することよりなる、組み換
   えウシ・ガンマ−インターフエロンを製造する方法。
9. （９）プラスミドｐＬＢγＩＦＮ−７（ＡＴＣＣ５３３
   ３３）。