KR910001809B1

KR910001809B1 - Csf 단백질 생산방법 및 정제방법

Info

Publication number: KR910001809B1
Application number: KR1019860700138A
Authority: KR
Inventors: 씨. 클라크 스티븐; 제이. 카우프만 란달; 지. 웡 고르돈; 에이. 왕 엘라자베스
Original assignee: 산도즈 파마슈티칼스 코오포레이숀; 제랄드 디. 샤르킨
Priority date: 1984-07-06
Filing date: 1985-07-04
Publication date: 1991-03-26
Also published as: GR851643B; NO1996016I1; MY102902A; UA39161C2; JP2594768B2; FI108796B; JP2594743B2; JPH07163351A; DK102886D0; JP2540509B2; EP0337359A2; KR860700264A; DK172679B1; JPS61502682A; NO961452D0; CA1341618C; DK168709B1; AU628069B2; CA1340852C; NO943300L

Abstract

내용 없음.

Description

CSF 단백질 생산방법 및 정제방법

제1도는 본 발명에 의한 CSF 단백질을 암호하는 DNA 서열을 나타낸다. 상기 DNA 서열은 CSF-Thr로 지칭되는 인체 CSF의 하나의 변이에 대한 코드를 전부 나타낸다. 다른 대립 유전자는 100으로 표시된 위치에서 Thr이 Ile로 대치된다(CSF-Ile)는 것을 제외하고는 동일한 생성물을 코드한다. 인체 서열에 대해 전술한 변이는 긴팔 원숭이 (gibbon) CSF(CSF-G)를 암호하는 DNA 서열에서와는 다르다. 연역한 아미노산 서열이 또한 표시되어 있다.

제2도는 플라스미드 pAdD26SVpA(3)으로부터의 플라스미드 pTPL 제조를 도식적으로 예시한다.

제3도는 제2도에 계속되는 도식으로서 플라스미드 pTPL로부터 플라스미드 p91023의 제조를 예시한다.

제4도는 제3도에 계속되는 도식으로서, 플라스미드 p91023(B)를 예시한다.

제5도는 정제된 CSF 단백질의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다.

제6도는 벡터 pTALc-l85R의 도식적인 도면이다.

제7도는 벡터 AJ-14의 도식적인 도면이다.

발명의 분야

본 발명은 영장류 조혈 선대(progenitor) 세포의 생장과 분화를 자극시킬 수 있는 단백질, 특히 콜로니자극인자(Colony Stimulating factor, CSF)의 생산에 관한 것이다. 본 발명은 재조합 DNA 기술에 의해 CSF 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것으로 그 단백질을 발현하는 유전자가 함유된 벡터와, 그 벡터로써 형질 전환된 미생물과 셀라인 그리고 그에 따라 생산된 CSF 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 자연적 또는 재조합 출처로부터 CSF 단백질을 분리하고 정제하는 방법을 제공하는 것으로, 그 정제 CSF 단백질은 종래에 보고된 것 보다 높은 활성수준과 순도를 가진다.

발명의 배경

혈중에서 발견되는 많은 종류의 세포 유형은 모두 다능성 조혈 스템(Stem)세포로 부터 유도된다. 스템세포는 두개 기능을 수행한다 : (1) 그들은 자가 증식함으로써 체내에서 스템 세포군을 유지한다. (2) 그들은 성숙 혈액 세포형태의 특정으로 분화되는 후대(progeny) 세포를 제공한다. 특별한 조혈성 경로에 따라 분화하는 세포를 선대 세포라고 한다. T 임파구, B 임파구, 과립구, 적혈구, 혈소판과 호산구에 대한 선대세포 뿐만 아니라 몇가지 성숙세포 유형을 결과하는 초기(earlier) 선대세포를 생체내 및 시험관 내에서 모두 실험적으로 연구하여 왔다. (Dexter, T. M. 1983 J. Pathology 141 415-433). 각 선대세포유형의 증식 및/또는 분화는 여러가지 출처에서 유도되는 특정 "인자"에 의한다는 것이 시험관 내에서 밝혀졌다. 예를들어, 적혈구의 후기(later) 선대세포는 적혈구 생성소라는 인자를 필요로 한다. 성숙 호중 과립구, 단립구 및 성숙 대식 세포구를 형성하는 골수성 선대세포의 생존, 증식 및 분화에 필요한 인자를 콜로니 자극인자(CSF)로 칭한다.

CSF 활성은 쥐에서 집중적으로 연구되어 왔다. 대부분의 성인쥐의 기관은 CSF 활성을 나타낸다. 그러나, 여러가지 조직으로 부터 그리고 여러가지 방법으로 얻어진, CSF 활성을 가지는 조성물은 그들의 생화학적 특성을 달리하는 것으로 나타난다. 따라서, 상이한 인자간의 구조적인 관계가 아직은 밝혀지지 않았다. 또한 CSF 활성은 과립구와 대식 세포구 발생의 하나 이상의 단계에서 작용하는 것으로 밝혀졌으며 또 단일 인자가 관찰된 활성 모두를 담당하는 것인가 또는, 상이한 여러 인자가 각 단계에 있어서 작용하는 것인가는 아직 확인되지 않았다. (Burgess, A. 및 Metcalf, D. 1980 Blood 56 947-957).

인체의 활성 CSF는 태반, 특정한 태아조직, 대식 세포구와 자극된 T 세포에서부터 얻어진다. 하나 이상의 유력한 CSF 활성을 생성하는 T 세포 계통(Mo)은 모발(hairy) 세포 백혈병 (백혈구성 세망대피종)의 T세포변종을 가진 환자에게서 확립되었다. (Golde 등의 1978 Blood 52 1068-1072).

과립구와 대식세포구 생산을 자극하는 CS 활성 능력은 CSF 활성을 갖는 약학 조성물이 이러한(골수성)세포유형의 생산증가가 필요한 경우에 임상적으로 유용하다는 것을 지적한다. 실제로, 대단히 높은 수준의 정상 순환 과립구를 가진 몇몇 환자가 CSF를 과생산하는 종양을 가지는 것으로 밝혀졌다. 한 경우에, 종양의 외과 제거 즉시, 과립구의 수는 정상 수준으로 급격히 감소되는데, 이것은 CSF가 순환 과립구의 수를 조절하기에 유용함을 강력히 암시하는 것이다(Hocking W., Goodman, J., and Golde, D Blood, 61 600(1983)). 특히 CSF 조성물은 암의 화학용법 또는 방사치료에 의한 척수억압의 치료에 임상학적으로 유용하다. 또한, CSF 조성물은 CSF가 과립구 및/또는 단립구의 수를 증가 및 또는 활성화시키기 때문에 심각한 감염질환을 치료하는데 있어서 유용하다.

과립구-CSF(G-CSF), 대식 세포구-CSF(M-CSF), 과립구-대식세포구 CSF(GM-CSF)와 다중-CSF를 비롯하여 여러 상이한 유형의 공지된 CSF활성이 있다 본 발명은 특히 GM-CSF에 관한 것이다. CSF 단백질은 여러 동물 출처로 부터 밝혀져 있다. 그러나, 본 발명은 특히 영장류 CSF, 보다 특히는 인간 CSF와 원숭이 CSF에 관한 것이다.

CSF 활성을 갖는 조성물의 생물학적 및 생화학적 특성과 그 임상학적 경우에서의 이 조성물에 대한 연구에 있어서 인체 및/또는 다른 영장류 CSF 조성물의 부족함과 불순물이 현재까지고 방해의 원인이 되어 왔다.

상기 단백질 또는 CSF 활성을 담당하는 단백질을 동정하는 것이 바람직할 것이다. 또한, 이러한 단백질들을 대량으로, 생물학적 및 생화학적 특성화에 그리고 치료제제로서 사용하기에 충분한 순도로 용이하게 생산할 수 있는, 영장류, 바람직하게는 인체의 CSF 출처를 획득함이 바람직할 것이다.

최근 개발된 분자 클로닝 기술에 의해, 적절한 숙주-벡터 시스템을 사용하여 단백질을 암호화 하는 뉴크레오티드 서열을 클론시키고 상기 단백질을 생성하는 것이 가능하다[Maniatis, T. Molecular Cloning-A Laboratoru Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)]. 상기 단백질은 공지된 분리 및 정제 기술에 의해 회수될 수 있다. 현재 사용되고 있는 클로닝 법은 세가지 일반적인 범주로 나눌 수 있다.

(1) 단백질 구조, 예를 들어, 이것의 아미노산 서열의 인지에 근거한 방법 ;

(2) 그 단백질에 대한 특이 항체를 사용하여, 클론된 유전자에 의해 발현된 단백질의 동정에 근거한 방법 ;

(3) 번역되어 관심대상의 유전자에 의해 암호화 된 단백질 또는 활성을 나타낼 수 있는 RNA 종류의 동정에 근거한 방법.

CSF 단백질과 같은 관심 대상의 단백질을 매우 소량으로만 이용할 수 밖에 없을때는 상기의 각 방법들을 적용하기가 어려워진다. 따라서, 정제 단백질의 적절한 양을 얻는 것이 어려워진다면, 아미노산 서열이나 또는 그 단백질의 부분적 서열조차도 결정하기 어렵게 된다. 유사하게 발현 단백질의 항체 결합에 의한 동정은 고-역가 단-특이성 (monospecific) 다중 클론성 항 혈청을 사용하여 수행하는 것이 바람직하다. 상기 항 혈청은 많은 순수한 단백질(항원)이 없을 경우에는 얻어질 수 없다. 단일 클론성 항체가 대안적인 방법을 제공하지만, 적합한 항원이 없을 때는 또한 필요한 항체의 수득이 어렵고, 그 단일클론성 항체는 단백질이 이용할 수 있는 제조합 숙주-벡터 시스템에 의해 발현되는 형태로 단백질과 반응하지 않을 수 있다. 결국, 동정될 수 있는 단백질 또는 활성을 산출하는 RNA종의 번역은 문제의 RNA가 확실한 단백질 또는 활성 시그널을 제공하기에 충분한 양으로 RNA 출처에 존재하는 것을 필요로 한다. 특정 단백질을 암호하는 RNA 의 상대적 양은 일반적으로 그 단백질의 양에 필적되므로, 희박한 단백질을 보통 희박한 mRNA에 의해 암호된다.

Mo 셀라인은 인체의 CSF를 정제하기 위한, 그리고 상응 mRNA를 동정하기 위한 출발물질로 둘 다 사용되어 왔다. 그리나, CSF 활성의 이 비교적 양호한 출처로도, 구조적 연구를 위해서 충분한 그 단백질을 분리하기는 대단히 어렵다는 것이 인정되었다. CSF와 같은 희박한 단백질을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 상기 방법으로 크로닝하는데 있어서의 본래의 문제를 극복하기 위하여, 새로운 방법이 개발되었다. 이 방법은 그 유전자 생산물 또는 이것의 활성이 확실하게 측정될 수 있는 것만을 필요로 한다. CSF 분석의 적합한 방법은 하기의 실시예(2)에 설명되어 있다. 그리고 또, 종래 보다도 훨씬 높은 순도와 활성으로 CSF 단백질을 재조합 또는 자연적 출추려 부터 분리하고 정제시킬 수 있는 정제방법이 개발되었다.

재조합 DNA 과정의 요해

본 발명은 재조합 DNA 기술을 사용하여 선행기술의 문제들을 극복하며 CSF 활성을 갖는 단백질의 출처를 제공한다. 본 발명에 의해, CSF 활성 분석만을 필요로 하는 신규의 클로닝 기술을 사용하여 CSF 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 cDNA를 클론한다. 따라서, 본 발명은 CSF 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 cDNA(즉, CSF/cDNA), 그 CSF/cDNA를 함유하는 재조합 벡터로 형질 생물 또는 셀라인 및 그 미생물 또는 셀라인을 배양하여 상기 CSF/ cDNA를 발현시킴으로써 CSF 단백질을 생성하는 방법을 제공한다. CSF 단백질이 본 발명에 의한 클론으로부터 생산되기 때문에, 이것이 CSF 활성을 가지는 단백질이라는 것을 본 발명자들은 확신할 수 있다. 본 발명은 또한 CSF/cDNA를 함유하는 형질 전환 벡터를 제조하고 분리하는 하기의 방법을 제공한다 :

CSF를 생성하는 세포로부터 RNA를 제조함 ; 상기 RNA로부터 폴리아데닐화된 mRNA를 제조함 ; 상기 mRNA로부터 일본쇄 cDNA를 제조함 ; 상기 일본쇄 cDNA를 이본쇄 cDNA로 전환시킴 : 상기 이본쇄 cDNA를 형질전환 벡터에 삽입하고 그 벡터로써 박테리아를 형질전환시켜 콜로니를 형성함 ; 200 내지 500콜로니 각각의 푸울(pool)을 선발하고 각 푸울로부터 플라스미드 DNA를 분리시킴 ; 플라스미드 DNA를 CSF 단백질의 발현을 위한 적합한 숙주세포에 이입(transfectin)시킴 ; 이입된 세포를 배양하고 CSF활성에 대하여 상청액을 분석함 ; CSF 양성 푸울을 선택하고 푸을 제조하는데에 사용되는 콜로니를 스크리닝 하여 CSF 활성을 갖는 콜로니를 동정함 ;

본 발명의 CSF 단백질은 척수 계통의 세포에 대한 생장 및 분화 호르몬이다. 그들은 예를 들어, 암의 화학법 또는 방사치료 후의 척수 억압, 특히(징후의) 과립구 감소증의 치료를 위한 임상학적 용도로서 적시된다.

방법의 상세한 설명

본건의 이해를 돕기 위하여 하기 어휘의 정의를 보충 설명한다. 하기 어휘들은 그 어휘들의 정의가 당해기술상 범위내에서 통용되는 의미와는 다른 정도로 조정될 수 있다.

'증폭(Amplification)'은 세포가 그것의 염색체 DNA 내에서 유전자 복제를 생산하는 과정을 의미한다.

'CSF'는 본 명세서에서 설명되는 분석에 의해 정의되는 생물학적 활성체이다.

'CSF 단백질'은 CSF 활성을 나타내는, 영장류의 출처로부터의 단백질이다. 본 발명에 있어서의 'CSF 단백질'의 용어는 변형된 CSF 단백질, CSF 단백질의 대립 유전자 변이와 MET 잔기가 선행된 CSF 단백질을 포괄하는 의미이다.

'아래로(하부로, Downstream)'는 뉴클레오티드 서열의 3'말단을 향해 진행하는 방향을 의미한다.

'증진자(enhancer)'는 유전자에 관한 증진자의 위치와 무관하게 또는 그 서열의 방향과는 무관하게 유전자의 전사를 강력히 추진하는 뉴클레오티드 서열이다.

'유전자'는 소정 단백질을 코딩하는 데옥시리보뉴클레오티드 서열이다. 본 명세서의 목적상, 유전자는 RNA 전사 개시 시그널, 폴리아데닐화 부가위치, 프로모터, 또는 증진자와 같은 비번역되는 측면(flanking) 부분을 포함하지 않는 것으로 한다.

'결찰(ligation)'은 두개 DNA 본쇄의 5'와 3'말단 사이의 인산 디에스테르 결합을 형성하는 과정을 말한다. 이것은 T4리가제에 의한 뭉툭한(blunt) 말단 결찰을 포함하는 여러가지의 널리 공지된 효소공법으로 수행될 수 있다.

'방향'은 DNA 서열에서 뉴클레오티드의 순서를 말한다. DNA 서열의 역방향은 서열이 얻어지는 DNA에서 한 기준점과 비교할때 그 서열의 5'에서 3'순서가 다른 서열에 대해서 거꾸로 일때의 것을 의미한다. 상기 기준점은 그 DNA 출처에서 다른 특수 DNA 서열의 전사방향 또는 상기 서열을 함유한 복제성 벡터의 복제 원점을 포함한다.

'전사'는 DNA 주형으로부터 RNA가 합성되는 것을 의미한다.

'형질전환'은 외생 DNA의 세포때 취입 (uptake)에 의해 세포의 유전자형을 변화시키는 것을 의미한다. 형질전환은 세포 표현형의 변화에 의해 때로는 검측될 수 있다. 형질 전환된 세포는 형질 전환체로 호칭된다. 형질 전환 이전의 세포(pre-transformation cell)는 모(母)세포로 호칭된다.

'번역' 은 mRNA로부터 폴리펩티드의 합성을 의미한다.

콜로니-자극 인자 CSF 활성은 말초 혈액 단핵세포, 폐와 태반조직, 그리고 골수로부터의 조절된 매질과 빈혈 환자로부터의 소변, 혈청, 및 T-임파구와 단핵식세포의 정상 및 종양성 세포를 비롯한 많은 세포성출처로부터 유도될 수 있다. CSF를 생산하는 한 셀라인은 코드번호제 CRL 8066호로 ATCC에 기탁되고 분양될 수 있는 Mo셀 라인이다. 이 셀라인에 의해 생산된 CSF는 과립구 대식세포 CSF(또는 GM-CSF)로서 알려져 있으며 이것은 물론 인체 CSF이다. 긴팔 원숭이 CSF(Gibbon CSF)의 한 출처는 1983년 9월29일 코드번호 제 HB 9370호로 ATCC에 기탁되고 분양될 수 있는, UCD MLA-144로 지명된 T-셀 라인이다.

본 발명에 의한 CSF 클론을 분리하기 위하여 CSF 활성에 대한 분석 기술만을 요하는 신규방법이 사용되었다. 첫째, T-임파구세포(또는 상술된 바와 같은 기타 출처)와 같이 CSF를 생산하는 세포를 동정한다. 그리고, 그 세포의 mRNA를 수득한다. 바람직하게는 T-임파구 세포를 사용한다. 그 경우에는 림포킨에 대한 mRNA를 함유하는 생체막 결합(membrane bound)mRNA를 그 세포중에서 유리 mRNA로부터 분리한다. 이러한 분리로 인하여 림포킨 서열에 대한 수집 mRNA를 5-10배로 증가시키는 것으로 믿어지므로 따라서 목적의 CSF 클론을 동정하는데에 관한 노력을 감소시킬 수 있다. 다음 올리고 dT 셀룰로오즈상의 크로마토그래피로써 폴리아데닐화 mRNA를 제조한다. 숙주내의 이입에 적합한 벡터 사용으로 mRNA로부터 cDNA 라이브러리를 제조하여 CSF 활성을 가지는 바람직한 단백질을 발현시킨다. 먼저, 쇄 cDNA 본쇄를 상기의 mRNA를 사용하는 표준 방법으로 제조한 다음 mRNA/cDNA 하이브리드를 이본쇄 cDNA형태로 전환시킨다. 이 cDNA는 적합한 벡터내로 삽입될 수 있다.

CSF 클론의 분리에 바람직한 숙주-벡터 시스템은 적합한 형질전환 벡터 중에서의 CSF cDNA의 발현에 의거한다. 적합한 형질전환 벡터는 포유동물 세포 내로 DNA의 순간적인 도입에 대해 신뢰할 수 있는 것이다. (Mellon, P., Parker, Y. Gluzman, T. Maniatis 1981 Cell 27 279-288), 바람직한 CSF 형질 전환체를 분리하기 위하여, 모든 세포 개체군이 상기 바람직한 CSF 생성물을 발현하는 외생 유전자를 확고히 포함하는 것이 필요하지는 않다. 외생 유전자를 세포의 아개체군(subpopulation)에 순간적으로 도입시켜서 수일의 기간동안 아개체군이 바람직한 생성물을 발현하도록 할 수 있다. 본 발명에 따라 선택성 마커가 본DNA 이입과 발현 시스템을 위한 형질 전환 벡터에서 필요치 않기 때문에, 외생 DNA는 1-2주일간의 세포 생장시 손실될 수 있다. 그러나, 적합한 포유동물 세포의 이입의 2-3일후, 상기 바람직한 생성물은 합성되어서 검출될 수 있는 것으로 밝혀졌다.

숙주-벡터 시스템 선택은 복제-원점-결함성 SV 40 DNA 분자로 형질전환된 CV-1 원숭이 셀 라인 발달에 근거한다. (Gluzman, Y., Cell 23 175-182, 1981), COS로 지명된, 결함 SV 40 DNA를 함유하고 있는 형질 전환된 원숭이 CV-1 세포(CV-1, 원점 결함성, SV 40)는 SV 40 게놈의 완전한 복사체를 함유하지는 않지만, 고 수준의 큰 T 항원을 생성하며 SV 40 DNA 복제를 허용한다. 그들은 또한 선행부분(early region)에서 결실을 가지는 SV 40의 복제와 SV 40 복제 원점을 가지는 박테리아 플라스미드의복제를 효과적으로 지지한다(Myers, R. M. ＆ Tjian, R, 1980 PNAS 77 6491-6495). 따라서, 이 시스템은 SV 40이 매개된 DNA 복제를 통해서 이입된 외생 DNA를 증폭시키는 방법을 제공하여 상기 외생 DNA로부터의 mRNA 발현된 단백질 수준을 증가시킨다. 그러나, 다른 유사한 시스템이 또한 사용될 수있다.

CSF 발현에 사용되는 벡터는 하기에서 설명되는바, 전형적으로 증진자(enhancer), 프로모터, 인트론, 폴리아데닐화 부위, 3' 비코딩 부분과 번역 활성자와 같은 여러 요소를 함유한다.

본 명세서에서 벡터는 증진자를 포함할 수 있다. 증진자는 기능적으로 프로모터와는 구별되지만, 프로모터와 함께 작동하는 것으로 나타난다. 세포내 수준상에서의 그들의 기능은 잘 알져지지 않았지만 그들의 고유한 특징은 위치 또는 방향과 관계없이 전사를 활성화시키거나 또는 가능하게 하는 능력이다. 프로모터는 유전자의 상부에 있어야 하지만 증진자는 상부나 그 프로모터의 5'에, 인트론으로서 유전자 내에 또는 유전자와 폴리아데닐화 부위 사이의 유전자로 부터의 하부나 그 폴리아데닐화 부위로 부터의 3'에 존재할 수 있다. 역진된 프로모터는 작용하지 않지만, 역전된 증진자는 작용한다. 증진자는 cis-작용 즉, 그들은 같은 DNA 본쇄에 존재할 때에만 프로모터에 영향을 미친다. 증진자의 일반적인 논술에 대해서는 Khoury 등의 Cell 33 : 313-314(1983)을 참조한다.

포유동물 세포와 함께 사용하기에 바람직한 증진자는 시미안 비루스 40, 폴리오마 비루스, 송아지 파필로마비루스, 테트로비루스 또는 아데노비루스와 같은 동물 비루스로 부터 취한다. 이상적으로, 증진자는 숙주세포가 그에 허용되는 비루스, 즉 그 숙주종의 세포를 정상적으로 감염시키는 비루스로 부터 취해져야 한다. 비루스 증진자는 공개적으로 이용할 수 있는 비루스들로 부터 쉽게 얻을 수 있다. 몇가지 비루스, 예컨대, 로우스 사르코마 비루스와 시미안 비루스 40의 증진자 부분이 널리 공지되어 있다. Luciw 등의 Cell 33 : 705-716(1983) 참조. 문제의 비루스에 대한 공개된 제한 지도를 기초로 한 이들 부분을 절단하여 필요하다면, 이 부위들로 하여금 그 증진자가 필요한 벡터 내로 접합될 수 있도록 변화시키는 것은 일반적인 분자 생물학의 문제이다. 참조예 : Kaufman 등의 J. Mol. Biol., 159 : 601-621(1982)와 Mol. Cell Biol.2(11) : 1304-1319(1982). 대안적으로, 그 증진자는 서열의 데이타로부터 합성될 수 있다. 비루스 증진자의 크기 (일반적으로 약 150 염기쌍 이하)는 실제적을 사용될 수 있을 만큼 작다.

벡터 조립에 존재해야 하는 다른 요소는 폴리아데닐화 봉합(splicing) (또는 부가) 부위이다 이것은 한 유전자의 번역 부분으로부터 하부에 위치하는 DNA 서열이며 이것의 바로 하부에는 차례로 전사 정지 및 아데닐 리보뉴클레오티드가 결합되어서, mRNA의 3' 말단에서 폴린아데닐 뉴클레오티드 꼬리를 이룬다. 폴리아데닐화는 세포내의 분해에 대해 mRNA가 안정화 되기 위해서 중요한데, 세포내에서 분해되면 결과적으로 mRNA의 수준과 생성 단백질의 수준이 감소된다.

진핵 폴리아데닐화 부위가 널리 공지되어 있다. 일관된 서열은 진행 유전자 중에 존재한다 : 헥사뉴클레오티드 5'-AAUAAA-3'는 폴리아데닐화가 출발하는 지점으로부터 11-30 뉴클레오티드에서 발견된다. 폴리아데닐화 부위를 함유하는 DNA 서열은 공개된 논문들에 따라서 비루스로 부터 얻을 수 있다. 예시의 폴리아데닐화 서열은 쥐의 베타-글로빈과 시미안 비루스 40 후행(late) 또는 선행(early)부분 유전자로 부터 얻을 수 있지만 비루스 폴리아데닐화 부위가 바람직하다. 이 서열들이 공지되었기 때문에, 그들은 실험관내에서 합성될 수 있고 통상의 방식으로 그 벡터에 결찰될 수 있다.

번역 정지 코돈으로부터 폴리아데닐화 부위를 분리시키는 서열은 비촉진된(unpromoted) 진핵세포유전자와 같은 비번역된 DNA 서열인 것이 바람직하다. 상기 서열과 유전자가 프로모터를 가지지 않기 때문에, 그들은 발현되지 않을 것이다. 그 서열은 상당한 거리로, 약 1,000 염기 정도까지, 정지코돈으로 부터 폴러아데닐화 부위까지 연장되어야 한다. 이러한 3' 비번역된 서열은 일반적으로 생성물 수율을 증가시키는 결과를 낳는다. 상기 벡터는 전체를 폴리아데닐화 서열로부터 하부로 약 30염기쌍에서 부터 말단화 될 수 있지만 이것의 야생형에서 폴리아데닐화로 부터의 하부에서 발견된 3' 서열을 이의 야생형에서 유지하는 것이 바람직하다. 이 서열들은 전형적으로 폴리아데닐화 부위로 부터의 하부에 약 200 내지 600염기쌍을 연장시킨다.

벡터의 비번역된 전사부분에서 인트론의 존재로 인해 생성물 수득을 증가시킬 수 있다. 그 인트론은 숙주세포 또는 유전자 출처보다는 다른 출처에서 얻어질 수 있다. 예컨대, 아데노비루스 3부 리더 (tripartite leader)의 둘째 인트론으로부터 5' 봉합 부위와 아덴노비루스 주요 흥행 프로모터에서의 전사 개시 부위로부터 하부로 삽입된 면역 글로부린 유전자로부터의 3' 봉합 부위를 함유하는 하이브리드 인트론은 생성물의 수득을 증가시킨다.

CSF 클로닝과 표현 벡터의 바람직한 예에서 번역 활성자 유전자가 존재한다. 번역 활성자는 목적 mRNA 번역에 영향을 주는 단백질 또는 RNA 생성물을 암호하는 유전자이다. 최상의 예는 아데노비루스 주요 후행 mRNA의 5' 비번역 부분에서의 서열과 상호 작용하는 짧은 RNA종으로 전사되는 아데노비루스-연합(VA) 유전자(VAI)이다. (Thimmappaya 등의 1982 Cell 3 543).

VA RNA에 의한 번역 활성화에 필요한 서열은 아데노비루스 후행 mRNA 3부 리더 내에 존재한다. 아데노비루스 3부 리더는 아데노비루스 게놈의 비인접 부분으로 부터 함께 봉합되며 이 아데노비루스 주요 후행 전자물의 5' 말단상에 존재한다. VA RNA는 3부 리더 서열을 함유하는 mRNA의 번역을 활성화 하도록 상호 작용할 수 있다. 따라서, 바람직한 cDNA 클로닝과 발현 벡터는 3부 리더 및 아데노비루스 VA유전자의 봉합형태를 가진다.

이 벡터들은 당해 분야의 전문가들에게 공지된 기술로 합성될 수 있다. 증진자, 프로모터등과 같은 벡터의 성분은 자연적 출처로부터 얻어가 또는 전술한 바와같이 합성될 수 있다. 기본적으로, 상기 성분들이 유용될 수 있는 DNA에서 대량으로 발견된다면(예, 비루스 작용과 같은 성분들), 또는 그들이 합성될 수 있다면(예, 폴리아데닐화 부위), 적합한 제한 효소의 사용으로, 출처 유기물을 단순히 배양하고 이의 DNA를 적합한 엔도뉴클레아제로 분해하고, DNA 단편을 분리하고, 관심대상요소를 함유하는 DNA를 동정하고 및 이것을 회수함으로써 대량의 벡터를 수득할 수 있다. 일상적으로, 형질 전환 벡터는 소량으로 조합되고 원핵 플라스미드 또는 파아지와 같은 적합한 자가 복제하는 합성 벡터에 결합될 것이다. pBR 322 플라스미드는 대부분의 경우에서 사용될 수 있다. (Kaufman 등의 op.cit.참조)

합성 벡터를 사용하여 통상 방식으로 예를들면, 적절한 원핵 유기체의 이입, 그 합성 벡터의 고복제 수증식 세포용해에 의한 합성 벡터 회수 및 세포 파편으로 부터의 합성 벡터 분리에 의해 결찰된 혈질 전환벡터를 클론시킨다.

CSF 활성을 나타내는 세포로부터 제조된 cDNA를 함유하는 벡터를 E. coil에 이입시키고 약 2000 콜로니를 각 페트리 접시상에 평판시킨다. 그 콜로니들을 니트로셀룰로오즈 필터상에 올려놓고 그 필터를 기본체(master)로서 보존되는 새로운 플레이트에 옮긴다. 이 콜로니를 생장시킨뒤 리플리카(replica)를 만들고 그 리플리카 필터의 부위가 이에 상응하는 기본 플레이트의 해당 부분과 동일할 수 있도록 주의깊게 표시하여 그 원본과 함께 정렬시킨다.

각 리플리카 필터를 각 단편당 예정된 수의 콜로니, 바람직하게는 약 200-500 콜로니가 함유되는 단편들로 절단한다. 간 단편으로 부터의 콜로니는 L-브로스와 같은 배지로 스크랩시키고, 그 박테리아를 원심분리로 회수하며 플라스미드 DNA를 분리한다. 각 단편들로부터의 플라시미드 DNA를 단백질 발현용의 적합한 숙주로 이입시킨다. 본 명세서에서 바람직한 합성 벡터는 진행 세포에 유해한 서열이 삭제된 E.coli 플라스미드 pBR 322의 변이이다. (Kaufman 등의 op.cit. 참조) 이러한 변이의 사용으로 이입전에 플라스미드 잔기를 삭제할 필요가 배제된다. 이입 세포를 생장시킨뒤, 그 배지를 CSF 활성에 대해 분석한다. 양성 분석은 CSF/cDNA를 함유하는 콜로니가 필터의 특정한 부분상에 있다는 것을 지적한다.

원본(master)필터의 단편에서 어떠한 것의 콜로니가 CSF/cDNA출 함유하는 가를 결정하기 위해, 필터단편상의 각 클론을 취하여 생장시킨다. 그 배양체를 메트릭스에 놓는다. 이 메트릭스의 각 수평렬과 수직컬럼으로 부터 푸울(pool)을 제조한다. 각 푸울로 부터 DNA 샘플을 제조하고 발현용 숙주 세포로 이입시킨다. 이 푸울로 부터의 상청액을 CSF 활성에 대해 분석한다. 수직 컬럼 푸울과 수평렬 푸울은 CSF 활성을 나타내어야 한다. 이 푸울들에 공통되는 클론은 CSF/cDNA를 함유할 것이다. 상기 메트릭스가 하나 이상의 양성 클론을 함유한다면, 하나 이상의 컬럼과 열이 양성일 것이다. 그런 경우에, 소수 클론의 또 다른 스크리닝이 필요할 것이다.

CSF/cDNA를 제한 효소로써 상기 클론으로부터 절단하고 공지 기술에 의해 서열화 할 수 있다. 본 명세서에 설명된 방법을 사용하여 임의의 출처로부터 CSF/cDNA 수득할 수 있다. 본 발명에 의한 CSF/cDNA의 완전한 DNA 서열이 번역된 CSF 단백질 생성물의 예측 아미노산 서열과 함께 제1도에 표시되어 있다.

제1도에서와 같이, 본 발명에 의한 CSF 활성을 나타내는 단백질을 암호하는 DNA 서열을 통상의 기술로 변형시켜 본 명세서에서 설명된 분석 시험에서 여전히 CSF 활성을 가지는 최종 CSF 단백질에서의 변이를 생성 할 수 있다. 따라서, 예를 들면 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산들이 다른 아미노산에 의해 치환될수 있다. 벨기에 특허 제 898,016호는 시스테인을 예를 들면 세린으로 치환하는 전형적인 방법을 기술하고 있다.

본 발명에 의한 CSF/cDNA는 ATG 코돈에 의해 선행된 자연적 CSF/cDNA 유전자 및 CSF 단백질의 대립 유전자 변이를 코딩하는 CSF/cDNA를 포함한다. 하나의 대립 유전자가 제1도에 나타나 있다. 본 발명자들이 발견한 다른 대립 유전자는 제1도에 나타낸 시토신 잔기 대신에 365위치에서 티미딘 잔기를 갖는다. 본 발명의 CSF 단백질은 CSF 단백질의 1-메티오닌 유도체(Met-CSF)와 CSF 단백질의 대립 유전자변이를 포함한다. 제1도에서의 서열로 나타난 성숙 CSF 단백질은 Ala.Pro.Ala.Arg …로 시작되고 제1도에서 뉴클레오티드 번호 59뒤에 화살표로 그 도입부가 표시되었다. Met-CSF는 Met.Ala.Pro.Ala.Arg‥‥서열로 시작한다. 제1도에 나타낸 대립 유전자 변이는 아미노산 잔기번호 100에서 Thr을 가지며(화살표 뒤의 Ala에서 시작) CSF(Thr)로 지칭될 수 있다. 한가지 다른 변이는 100위치에서 Ile 잔기를 가지며 CSF(Ile)로서 지칭될 수 있다. 본 발명의 정체 CSF 단백질은 인체 골수 세포로 분석할때 단백질 10⁷유니트/mg, 바람직하게는 최소한 14×10⁷유니트/mg 특이 활성을 나타낸다.

CSF 발현을 위한 숙주-벡터 시스템은 원핵 또는 진핵일 수 있지만, CSF의 복합성으로 인해 대해서는 포유동물의 시스템이 바람직한 발현 시스템이 된다. 적합한 CSF 벡터로 원핵 또는 진핵 세포를 형질 전환시킴으로써 발현을 쉽게 달성한다. 상기 방법으로 얻은 DNA 서열을 적합한 프로모터의 통제하에 포유동물세포에서 직접 발현할 수 있다. 당해 분야 전문가에게 공지된 이형 프로모터가 사용될 수 있다. 원핵 또는 효모 세포에서 CSF를 발현하기 위해, 리더 서열(또는 분리 서열)은 제거되어야만 한다. 성숙 CSF 단백질의 N-말단에 대한 코돈의 위치가 제1도에 표시되어 있다. 이것은 당해 분야의 숙련자에 공지된 일반 기술에 의해 이루어질 수 있다. 목적의 CSF/cDNA 클론이 얻어지면, 적합한 공지방법을 사용하여 CSF 단백질을 발현하도록 하는데, 예를 들면 적합한 벡터에 삽입하고 그 벡터를 적합한 숙주 세포에 이입시키고 형질 전환된 세포를 선택하여 CSF 활성을 표현하는 형질 전환주를 배양한다. 적합한 숙주 세포는 E.coli와 같은 박테리아, 효모, CHO와 같은 포유동물, 곤충세포이다. 그렇게 생산된 CSF 단백질은 단백질의 N-말단에서 메티오닌기를 가질 수 있다(여기에서는 Met-CSF로 일컬음). 그렇지 않으면 원핵 및 진핵세포에 의해 생산된 성숙 단백질은 아미노산 서열에 있어서 같지만, 진핵 생성물은 천연 생물에서와 같은 정도로 또는 다른 정도로 글리코실화될 것이다 여러가지 통상적인 CSF 단백질의 수득 방법이 하기 실시예에 예시되어 있다. 다른 방법이나 물질, 예컨대 벡터들은 실시예와 전술한 것을 근거로 하여 당해 분야 기술자에게는 용이하게 이해될 것이다.

적합한 원핵 또는 진핵 세포에서 발현되는 CSF 단백질은 당해분야 기술자에게 공지된 정제 및 분리기술로써 회수될 수 있다. 그러나, 본 발명은 또한 재조합 및 자연적인 출처로부터의 CSF 단백질을 고순도와 활성으로 얻을 수 있게 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 정제 방법의 요해

본 발명은 종전 기술의 문제를 극복하여 CSF 활성을 갖는 단백질을 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의한 CSF 단백질은 인체 골수 분석을 실시할때 단백질의 mg당 최소 약 1×10⁷유니트, 바람직하게는 최소 약 2×10⁷유니트, 보다 바람직하게는 최소 약 4×10⁷유니트의 특이활성을 가진다.

본 발명에 의해, CSF 단백질을 정제하는 방법은 함유하는 펠릿을 형성하고 ; 80% 포화의 황산암모늄으로 단백질을 침전시켜 CSF 단백질을 약 6 내지 8pH의 완충 용액중에서 그 펠릿을 재 현탁시키고 ; CSF함유의 완충용액을 크로마토그래프 컬럼에 적용시켜 염화나트륨 함유의 완충용액으로 용출시키고서 CSF 활성의 분획을 수거하고 ; 그 활성-분획들을 혼주하고(pool), 그들을 C4역상 컬럼에 적용, 0에서 90%의 아세토니트릴 구배액으로 용출하여 활성 분획을 수거하는 것을 특징으로 한다.

정제 과정에 대한 도면의 간단한 설명

제5도는 정제된 CSF 단백질의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다.

본 발명에 의한 정제과정의 상세한 설명

본 발명 방법에 의해 정제되는 CSF 단백질은 재조합 DNA 방법에 대한 출발 출처로서 전술한 임의의 자연적 출처, 예를 들어 Mo셀 라인 또는 UCD MLA-144 gibbon 셀 라인으로부터 유도될 수 있다.

대안적으로, CSF 단백질은 본 발명의 재조합 DNA 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 임의의 출처로부터의 CSF는 본 발명 방법에 의해 정제될 수 있다. CSF 단백질의 임의의 출처로부터에 조절된 배지는 초여과에 의해서 1ml당 최소 약 0.1mg의 단백질 농도로 농축되는 것이 바람직하다. 다음 암모늄 설페이트를 가함으로서 80% 포화의 황산암모늄을 가하여 상기 단백질을 침전시킨다. 결과된 펠릿을 약 6 내지 8의 pH에서 완충된 수용성 용액에서 재현탁시킨다. 적합한 완충액의 예에는 Tris-HCI, HEPES, 소듐 시트레이트등이 있다.

완충 용액을 컬럼 크로마토그래피로 분획시킨다. 크로마토그래프 컴럼에 사용하기 위한 적합한 물질은 옥틸세파로즈, DEAE-울트로겔, AcA44-울트로겔, ACA54-울트로겔 등이다. 이러한 물질들을 후속적으로 사용하여 보다 높은 순도를 수득할 수 있다.

각 컬럼으로부터의 분획을 수거하고 CSF 활성에 대해 분석한다. 활성 분획을 혼주하고 트리플루오로아세트산(TEA), 헵타플루오로부티르산(HFBA)등으로 희석하고 C4역상 컬럼에 적용시킨다. 다음 CSF 활성체를 0-90% 아세토니트릴 구배액을 가지는 TEA, 또는 HFBA로 용출시키는데, 그 컬럼에 혼주 분획을 적용시키기 위해 산을 사용하는가에 따라서 바람직하게는 각각 0.1% 또는 0.15%(v/v)로 용출시킨다.

CSF 활성을 가지는 분획을 SDS 폴리아크릴아미도 겔 전기영동(Lammli 등의 U.Noture 227,680(1970)에 의해 설명된 바와 같은 13.5%겔)으로 분석한다. 전술한 크로마토그래프 컬럼 물질을 사용하여 부가 처리함으로써 CSF 단백질을 더욱 정제시켜 동종성으로 만든다.

SDS-PAGE에 의해 분획된 정제 CSF 단백질은 약 15,000 내지 26,000 달톤의 가시 분자량을 갖는 이형의 CSF 단백질을 나타낸다. 이러한 가시적 크기의 이형성을 단백질의 광범위한 글리코실화에 기인되며 이것은 글리코 단백질의 공통 특징이다. Mo 세포 조건 배지로부터의 SDS-PAGE(비환원 조건하)에 의한, 덜 정제된 샘플의 분획과 그 겔로부터 용출된 단백질의 분석으로 약 28,000 내지 30,000가지 분자량의 CSF활성을 가지는 이차 단백질의 존재를 밝힌다.

CSF 활성체가 결합하고 옥틸세파로즈, DEAE 울트로겔과 C4 역상 컬럼으로부터 용출된다. 약 60%의 CSF 활성체가 Con-A 세파로즈(4o% 유출)에 결합하고 알파 메틸만노시드로 용출된다.

저염에서의 겔 여과에 의한 재조합 CSF의 분자량 분석으로 약 19,000분자량을 가진 약 30% 활성체가 용출되지만 다이머로서 적용하는 70% 물질이 악 38,000분자량에 해당하는 위치에서 용출되는 것을 나타낸다. 1M Nacl이 이 컬럼에 포함된다면, 모든 활성체는 약 19,000달톤에서 넓은 피트로 용출된다.

정제 CSF는 4M 구아니딘 하이드로클로라이드 ; 10mM EDTA ; 10mM 2-메르캅토에탄을 : 그리고30%(v/v) 에탄올에서 4℃(pH 7.4)로 항은 보존시킬때 최소 16시간동안 안정하다. CSF 활성체는 또한 0.1% 트리플루오로아세트산(TEA) (pH 2,0)과 0.1% TEA+25%(v/v)아세토니트릴에 안정하다.

전술한 바와같이, 본 발명에 의한 CSF 단백질은 (징후의) 과립구 감소증과 같은, 예컨대 암의 화학법이나 방사치료에 의해 발생된 척수-억제의 치료를 위해 사용될 수 있음이 밝혀졌다. 덧붙여, 본 발명의 CSF 단백질은 심한 감염의 치료에 사용될 수 있음도 밝혀졌다. 그러한 사용을 위해서 한 환자당 약 200 내지 1000㎍의 투여량으로 적시되는 것이 일반적이다. CSF 단백질은 적합한 약학적 담체내에서 환저에게 정맥내 주입되는 것이 바람직하다. 상기 담체의 예로는 약제학적 염수와 인체 혈청 알부민을 함유한 염수가 있다.

또한, 본 발명의 CSF 단백질은 다른 활성과 용도를 가진다. 예로, 쥐의 CSF는 호중구를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다. 그러므로, 본 발명의 영장류 CSF는 또한 호중구를 활성화시킬 것으로 기대된다. 그러므로, CSF는 생리학적 기능은 여러가지로 다중적일 수 있다. 골수에서, 이러한 림포킨은 숙주 방어를 위한 작용세포(effector cell)의 증식 및 분화를 촉진시키는 반면에 말초에서는, 신규의 자극된 세포가 활성화 될수 있다. 국소적 면역 반응에서 CSF는 염증성 부위에서 또는 그 부위와 떨어진 곳에서 순환 호중구를 보유할 수 있다. 호중구의 비적합한 국소화 및/또는 활성화는 류마티스성 관절염과 같은 여러가지 면역-매개질병의 질병 생리학과 관련될 수 있다.

본 발명은 또한 하기 실시예들을 참고로 하면 보다 잘 이해될 것이며, 그 실시 예들은 순수하게 실험적인 것이며 청구범위에서 설명되는 바의 본 발명의 진정한 범위를 국한시키는 것은 아니다.

다른 언급이 없는 한, 실시예에서의 온도는 ℃이다

제한 엔도뉴클레아제는 통상 공급자들에 의해 귄유되는 조건과 방식하에서 사용된다. 결찰 반응은 Maniatis 등의 상기 문헌 245-6에 설명된 바와 같이 실시하는 것인데, 그것은 246페이지 설명의 완충제를 사용하여 무딘 말단 DNA에 대해서는 23℃온도에서 그리고 "점착성 말단의"(sticky ended) DAN에 대해서는 16℃에서 1-100㎍/ml의 DNA 농도를 사용한다. 전기영동은 90mM 트리스-보레이트, 10mM EDTA를 함유하는 0.5-1.5% 아가로즈 겔에서 실시한다. 모든 방사표지 DNA는 어떠한 표지 방법이 사용되었을지라도³²P로 표지된다.

"급생성(rapid prep)"은 박테리오파이지 또는 플라스미드 DNA(예. Maniatis 등의 상기 문헌 p365-373에서 설명된 것)의 빠른, 소규모 생산을 의미한다.

단계 1. Mo 셀라인 배양물

20% 태아 송아지 혈청 (FCS), 2mM 글루타민, 100U/ml의 스트렙토 마이신과 100㎍/ml의 페닐실린을 함유한 알파(AlpHa) (6% CO₂₎또는 아이스코프(lscove)(10% CO₂) 배지에서 Mo 셀(ATCC CRL 8066)을 관례적으로 생장시킨다. 이 셀을 4-5일마다 아배양시킨다. 셀을 계수하고 3-4×10⁵셀/ml 농도로 100-150ml 배지를 가진 팔콘(Falcon) T-175 플라스크에서 시이드(seed)한다. 셀은 4-7일마다 20% FCS에서2배화될 것이다. 생장률은 일정하지 않고 셀은 때때로 생장을 멈춘것처럼 보이다가 급격히 생장한다. Mo 셀은 혈청이 없는 배지에서 생장될 수 있다. FCS로부터 혈청없는 배지로 전이될때 셀을 세척하지 않는다면 생존은 훨씬 우수해진다. 혈청없는 배지(SF)의 광학밀도는 5×10⁵셀/ml이다. 셀은 혈청없는 배지에서 3일간 약간의 생장을 할것이며(또는 최소한 일정수를 유지) 최소 4일간은 20% FCS를 공급해야 한다. 이 생장스케줄(3일 SF, 4인 20% FCS)은 SF 배지가 필요하다면 몇달간 세포에 전혀 해로운 영향을 주지 않고 매주 반복될 수 있다.

단계 2. CSF 활성 분석

A. 골수분석

신선한 골수를 언는다. 20, 22, 25게이지 바늘로써 골편을 부순다. 멸균 포스페이트-완충염수(PBS)로써 1 : 1로 희석하고(실온), Ficoll Paque(6ml Ficoll상에 약 30m1 BM-PBS)상에 적층시킨다. 실온에서 40분간 1500rpm으로 회전시킨다. 지방을 제거하고 PBS 층을 버린다. 열은 밀도층을 피펫으로 제거한다. PBS로 2회 세척하고 계수한다. RPMI(GIBCO에서 RPMI 1640으로 시판) +10% HIFCS(가열 비활성화된 FCS)에서 셀을 세시간 동안 평판화시켜서 착생 셀을 제거한다.

평판 배지 (신선하게 제조) :

20% FCS

H₂O에 용해된 0.3% 아가, 40℃로 냉온

2×Iscoves(아가와는 1 : 1v/v)

l00U/ml 스트렙토마이신, l00ug/ml 페니실린의 1% P/S 최종농도 10^-2M

알파 티오글리세롤

약 40°로 아가를 식힌다. 다른 성분들과 혼합한다.

H₂O 조에서 37-38°로 식히고 그 온도를 유지시킨다.

3시간 후, 비 착생 세포를 피펫으로 제거한다. 회전시키고서 계수한다. 평판 배지의 2×10⁵셀/ml를 가하고 37-38°에서 조절된 온도의 수조에서 유지시킨다. 한쌍의 마이크로타이터 플레이트의 첫번째 열의 웰(well)에 샘플(예. 감염 세포로부터의 배지 ; 대개는 10㎕의 샘플)을 가한다. 100μl 셀 현탁액을 각 웰에 가한다. 첫번째 열의 각 웰에 셀 현탁액의 50㎕을 추가로 가한다. 완전히 혼합하고 첫번째 열로부터 50㎕용액을 다음열로 옮기는 식으로 1 : 3의 희석을 전체 플레이트를 거쳐 계속한다. 그 플레이트를 파라필름으로 감싼다. 10% CO₂, 37℃에서 충분히 보습된 대기하에서 10-14일간 항온 보존한 뒤 콜로니를 계수한다.

콜로니 수를 측정하기 위해, 각 웰에서 생장된 콜로니의 총 수를 계수한다. 각 분선에 있어서, 배경(백그라운드) 콜로니 수를 얻기 위하여 샘플을 포함하지 않은(블랭크) 몇개의 웰을 평판화시킨다. 블랭크 웰에서 생장한 콜로니의 평균수를 샘플이 포함된 웰의 각각에서 발견된 콜로니의 수에서 뺀다. CSF의 한 단위는 CFS 농도가 아-포화되었을때 10⁵인체 골수 세포(10⁵셀/ml로 평판화 됨)당 배경수준 이상의 하나의 콜로니를 형성하는 것을 촉진시키는 양이다. 아-포화 농도는 희석하는 것과 포화 수준 바로 이하의 농도를 발견하기 위한 여러 희석물에서 콜로니수를 비교하는 것에 의해 결정된다.

이 분석을 위해, 과립구, 단립구 또는 그 두가지 세포를 모두 포함하는 콜로니를 계수한다. 콜리니에서 이 종류의 세포는 콜로니의 선발과 각 세포의 염색으로 결정된다.

B. KG-1 셀 분

KG-1 셀(Blood, Vol.56, No.3(1980))을 Iscove 배지 +l0% FCS에서 생장시키는데 매주 2회 배지를 갈아주며 각 배지 교환에 대해서 2×10⁵셀/ml로 시이드한다. 30-35 교환 사이의 셀만을 분석에 사용한다. 그 분석은 KG-1 세포가 4×10³셀/ml로 아가 혼합물에 평판된다는 것을 제외하고는 상술된 골수에서와 같다.

각 월에서 생장한 콜로니수를 측정하고 상술한 골수 분석에서와 같이 배경 계수를 감한다. 한 KG-1CSF 단위/ml는 생장하는 KG-1 콜로니의 최대수(포화)의 절반을 촉진시키는 CSF의 농도이다. 최대 수는 몇개 웰에서 CSF의 포화 수준을 포함시킴으로써 얻는다.

단계 3. 벡터 p91023(B)의 제조

형질 전환 벡터는 Kaufman등의 Mol.Cell Biol.2(11) 1304-1319(1982)에서 설명된 pAdD26SVpA(3)이다. 이것은 제2도에 예시된 구조를 갖는다. 간단하게 이 플라스미드는 아데노비루스 2(Ad2) 주요 후행 프로모터의 전사 조절하게 존재하는 쥐의 디하이드로플레이트 리덕타제(DHFR)을 포함한다. 5' 봉합 부위는 아데노비루스 DNA에 포함되고, 면역 글로부린 유전자로부터 유도된, 3' 봉합부위는 Ad2 주요 후행 프로모터와 DHFR 암호 서열사이에 존재한다. SV 40 선행 폴리아데닐화 부위는 DHFR 암호 서열의 하부에 존재한다. pAdD26SVpA(3)의 원핵-유도 단편은 pSVOd로부터 유래되며 (Mellon, P., Parker, V.,Gluzman, Y.and Maniatis, T.1981.Cell 27 : 279-288) 포유동물 세포에서 복제를 억제하는 것으로 공지된 pBR322 서열을 함유하지 않는다. (Lueky, M.,과 Botchan, M.1981, Nature(London) 293 : 79-81.)

pAdD26SVpA(3)을 제2도에 예시된 바와 같이 플라스미드 pCVSVL2로 전환시킨다. pAdD26SVpA(3)은 pAdD26SVpA(3)에서 두개의 Pst 1 주위중 하나를 삭제함으로써 pAdD26SVpA(3) (d)로 전환시킨다. 이것은 Pst 1으로 부분 절단하고 효소 활성이 부족한 것을 사용하여 오직 하나의 Pst 1 부위가 절단된 선형플라스미드 아개체군을 수득한 다음 클레노우(Klenow)로써 처리하고, 이 플라스미드를 결찰하여 재환형화하고 되도록 결찰시키고, E.coli를 형질 전환시키며, SV 40 폴리아데닐화 서열의 3'에 소재한 Pst 1 부위의 삭제를 스크리닝 하는 것으로써 이루어진다.

아데노비루스 3부 리더와 비루스 연관 유전자(VA 유전자)를 제2도에 나타낸 바와 같이 pAdD26SVpA(3) (d)에 삽입시킨다. 첫째, pAdD26SVpA(3) (d)를 PvuII로써 절단하여 3부 리더를 포함하는 세개 요소중 첫번째의 3' 위치내에서 개열된 선형 분자를 만든다. 그리고 pJAW 43(Zain등의 1979, Cell 16 851)을 Xho1으로 절단하고 클레노우로 처리, PvuII로 절단시킨후 3부 리더의 삼차 리더부분과 이차리더를 함유하는 140염기쌍 분체를 아크릴아미드 겔 전기영동(트리스 보레이트 완충액중의 6% ; Maniatis 등의 상기 문헌(1982))에 의해 분리시킨다. 140 염기쌍 분체를 PvuII 분해 pAdD26SVpA(3) (d)에 결찰시킨다. 그 결찰 생성물을 사용하여 E.coli를 테트라사이클린 내성체로 형질 전환시키고 140염기쌍 분체에 하이브리드화 되는 표지된 프로브(탐침자)를 사용하는 Grunstein-Hogness 방법으로 콜로니를 스크리닝 한다. 양성적으로 하이브리드화 된 콜로니로부터 DNA를 준비하여 재 조립된 PvuII 부위가 2차와 3차의 아데노비루스 후행리더에 특이적인, 삽입 140염기쌍 DNA의 5' 또는 3'에 존재하는 가를 테스트 한다. 정확한 배향에서, PvuII 부위는 140염기쌍 삽입체의 5'측에 있다. 이 플라스미드는 제2도에서 pTPL로 지명된다.

SV 40 증진자 서열을 함유하는 SV 40의 AVaII D 본체는 SV 40 DNA를 AVaII로 절단하고, PolI의 클레노우 분체로 말단을 뭉툭하게 하고, Xho 1 연결체를 그 분체에 결찰시키고, Xho로 절단하여 Xho 1 부위를 개열시키며, 겔 전기영동에 의해 네번째로 큰(D) 분체를 분리시킴으로써 얻은 다음 이 분체를 Xho 1 절단 pTPL에 결찰시키고, 플라스미드 pCVSVL2-TPL을 만든다. pCVSVL2-TPL에서 SV 40D 분체의 방향은 SV 40 후행 프로모터가 아데노비루스 주요 후행 프로모터에서와 같은 방향이 되도록 배향된다.

아데노비루스 비루스 연관(VA) 유전자를 pCVSVL2-TPL에 도입시키기 위해, 먼저 아데노비루스 유형 2Hind III B 분체가 포함된 pBR 322를 제조한다. 아데노비루스 유형 2 DNA를 Hind III으로 절단시키고 B분체를 전기영동후에 분리시킨다. 다음, 이 분체를 이미 Hind III으로 절단되어 있는 pBR 322에 삽입한다. E.coli를 암피실린에 내성체로 형질전환 시킨후, Hind III B 분체의 삽입에 대하여 형질 전환주를 스크리닝 하고, 삽입된 배향을 제한 효소 분해로써 결정한다. pBR 322-Ad Hind III B는 제3도에 표시된 방향으로 아데노비루스 유형 2 Hind III B 분체를 포함한다.

제3도에 나타낸 바와 같이, 통상적으로 플라스미드 pBR 322-Ad Hind III B, Hpa I으로 분해하고 EcoR1 연결체를 가하고, EcoR1으로 분해하며, 1.4kb 분체를 회수함으로써 VA 유전자를 수득한다. EcoR1 점착성 말단을 가지는 분체를 pTPL(이미 EcoR1로 분해되었음)의 EcoR1 부위로 결찰한다. E.coli HB101의 형질 전환 및 테트라사이클린 내성에 대한 선별후에, 콜로니들을 VA 유전자 특이성의 DNA 프로브(탐침자)에 여과 하이브리드화 함으로써 스크리닝 한다. 양성적으로 하이브리드화 된 클론으로부터DNA를 제저하고, 제한 엔도뉴클레아제 분해로 특성을 규명한다. 그 생성 플라스미드를 p91023으로 지명한다. p91023에서 2개의 EcoR1 부위를 제거한다. p91023을 EcoR1으로 완전히 절단하여, 두개의 DNA 분체를 만드는데, 하나는 약 7kb이고 다른 하나는 VA 유전자가 함유된 약 1.3kb 분체이다. Pol I의 클레노우 분체를 사용하여 상기 두개 분체의 말단들을 채운후, 그 두개 분체, 즉, 1.3kb, 7kb 분체를 함께 재결찰시킨다. VA 유전자를 함유하며 p91023과 유사하나 2개의 EcoR1 부위가 삭제된 플라스미드 p91023(A)를 VA 유전자 분체를 사용한 Grunstein-Hogness 스크리닝과 통상의 제한 부위 분석으로써 동정한다.

p91023(A)에서 하나의 Pst I 부위를 제거하고 EcoR1 부위로 치환시킨다. p91023(A)를 Pst1으로 절단하여 Pol I의 클레노우 분체로 처리하여 평활 말단을 만든다. EcoR1 연결체를 p91023(A)와 무딘 Pst1 부위에 결찰시킨다. EcoR1 연결체가 무딘 Pst 1 부위에 접합된 선형의 p91023(A)를 비결찰된 연결체로부터 분리하고, EcoR1로 완전히 절단한 후 다시 결찰시킨다. 플라스미드 p91023(B)를 회수하여 p91023(A)와 유사한 구조를 가지지만, 이전의 Pst 1 부위에 위치한 EcoR1 부위들 가지는 가를 확인한다.

단계 4. cDNA 라이브러리의 제조

Mo셀을 16-20 시간동안 pHA와 PMA로써 유도하여 그들의 림포킨 생산을 증강시킨다. 셀을 20% FCS, 0.3%(v/v) pHA와 5ng/ml TPA를 포함하는 Iscove의 배지에서 5×10⁵셀/ml로 평판화 시킨다. 그 셀을 원심 분리로써 모은다. 펠릿화 된 셀을 20ml의 빙냉된 저장성 용해 완충제(RSB 완충제 : 0.01M 트리스-염산, pH 7.4,0.01M KCl,0.0015M MgCl₂, 1㎍/ml 사이클로 헥스이미드, 50유니트/ml RNAsin과 5mM 디티오트레이톨)에 재현탁시킨다. 그 셀을 얼음중에서 5분간 팽윤시키고 단단히 고정된 다운스 글래스분쇄기로 10번 타격하여 기계적으로 파열시킨다. 균질물을 저속도(Bectman J6 원심분리기에서 2000RPM)로 원심분리하여 핵과 비용해된 셀을 제거한다. 상청액을 얼음상에 놓고 핵 펠릿을 10ml의 RSB에 재현탁시기고 저속에서 재원심 분리시킨다. 이차의 상청액을 상기 일차 상청액과 일단 혼주하고 혼합된 상청액을 저속도에서 원심분리하여 핵과 비용해된 셀로 오염된 잔류물을 제거한다.

이러한 원심분리로부터의 상청액에 2M의 KCl을 가하여 0.15M KCI이 되게 하고 고속도(25,000RPM 30분간 벡크만 Sw 회전기)로 원심분리하여 생체막을 펠릿화 시킨다. 생체막 펠릿을 냉각 RSB로 주의하여 세척하고 2M의 자당과 0.15M KCI을 함유하는 RSB 12ml에 재현탁시킨다. 벡크만 Sw 41 원심분리 튜브에서 2.5M 자당과 0.15M KCl의 RSB 2ml상에 상기 생체액을 함유하는 2M 자당 용액 6ml를 적층시켜서 두개의 불연속 구배액을 제조한다. 그 튜브를 1.3M 자당과 0.15M KCl이 함유된 RSB 2.5ml로써 중복 적층시킴으로써 상부까지 채운다. 이 구배액을 4시간동안 27,000RPM(벡크만, Sw 41 회전기으로 4℃에서 회전시킨다. 생체막층(2.0M파 1.3M자당 사이의 경계면)을 18게이지 바늘과 주사기를 사용하여 측면으로부터 주의하여 제거한다. 두개 구배액으로부터의 생체막 분획을 혼주하고 동일 부피의 증류수로 희석한 다음 0.5% 트리톤 X-100과 0.5% 트리톤 X-100과 0.5% 소듐 데옥시클레이트에 넣고 동량 부피의 페놀로 추출한다. 수용성 층을 페놀과 클로로포름이 1 : 1 혼합물로 재추출하고 마지막으로 동 부피의 클로로포름으로 추출한다.

최종적으로 생체막 결합 RNA를 0.25M과 25부피의 냉 에탄올에 염화나트륨을 가하여 침전시키고 -20℃에서 하룻밤 동안 항온 보존시킨다. 침전된 RNA를 원심분리(10분간 4000RPM, 벡크만 J-6 원심분리기)하고 1ml의 증류수에 재힌탁시킨다. 2×10⁹셀로부터, 약 1mg의 RNA를 수득하였다. mRNA를 0.5ml올리고 dT-셀룰로오즈 컬럼상에서 크로마토그래프화 함으로써 전체 RNA로부터 분리시킨다. 간단하게 RNA를 70℃로 5분간 가열하고, 바르게 얼음상에서 냉각시킨 다음 실온에서 5배의 결합 완충제(0.5M LiCl, 0.01M 트리스-염산, pH 7.4, 0.002M EDTA, 0.1% SDS)로 희석한다. 결합 완충제중의 RNA를 실온에서 결합 완충제로 평형된 올리고 dT-셀룰로오즈 컬럼상에 등과시킨다. 그 컬럼을 5ml의 결합 완충제로 세척한 후 0.15M LiCl, 0.01M 트리스-염산 pH 7.4, 0.002M EDTA 및 0.1% SRS의 5㎕로 세척한다. 마지막으로, mRNA를 2ml의 0.01M 트리스-염산 pH 7.4, 0.002M EDTA와 0.1% SDS로 용출시킨다. NaCl을 0.25M이 되도록 가하고 2.5부피의 에탄올을 가하고 -20℃에서 하룻밤 동안 항온 보존시킴으로써 mRNA를 침전시킨다. 침전 mRNA를 원심분리 (30분간 벡크만 SW 55회전기)하여 수거한다. 그 튜브를 조심스럽게 배수시키고 mRNA 펠릿을 50ml물에 재현탁시킨다. 재현탁된 mRNA에 0.25M 염화나트륨을 가하고 페놀과 클로로포름의 1 : 1 혼합물로 1회 그리고 클로로포름으로 3회 추출한다. 2.5부피 에탄올을 가하여 mRNA를 침전시킨다. 그 혼합물을 드라이 아이스/에탄을 조에서 몇차례 냉동 및 해빙시킨후 15시간 Eppendorf 원심분리기에서 원심분리한다 그 튜브를 조심스럽게 배수시키고 mRNA 펠릿을 20㎕의 증류수에 재현탁시킨다. 최종 산물은 약 30㎍의 mRNA이었다.

제1분쇄 cDNA를 표준 방법으로 제조한다. 간단하게, 10㎍의 생체막 mRNA를 300mM 트리스 pH 9.4, 140mM KCl 10mM MgC1₂, 10mM B-메르캅토에탄을 각 500μM의 dATP dGTP dCTP와 dTTP, 프라이머로서 5㎍의 올리고-dt(포스포릴레이트 되고 평균 12-18의 크기), 150㎕ Ci의³²P dCTP(400Ci/mM) 및 20유니트의 리보뉴클레아제 억제제 RNAsin이 포함된 100㎕의 cDNA 합성 반응 혼합물에 희석시킨다. 100유니트의 역 전사 효소를 가함으로써 그 반응을 개시시키고 30분간 42℃에서 항온 보존시킨다. 그 반응은 40mM의 EDTA를 가함으로써 중지시키고 RNA를 0.2M수산화나트륨 중에서 20분간 65℃ 항온 보존시킴로써 분해시킨다. 20㎕의 2M 트리스, pH 7.4를 가하여 그 염기를 중화시킨다. 그 반응 혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출시키고 50㎕의 l0mM트리스 pH 7.5, 1mM EDTA(TE)로써 재추출시키고 수성상을 혼주한다. 제1본 쇄 cDNA를 12시간동안 16℃에서 50mM 인산칼륨, pH 7.4, 2.3mM DTT, 2-메르캅토 에탄올, 10mM MgCl₂, 각각 150㎕의 4가지 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 및 25μCi의 32pdCTP이 함유된 100㎕의 반응 혼함물중의 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 분체 40유니트와 함께 항온 보존시킴으로써 이본쇄로 전환시킨다.

페놀/클로로포름으로 추출시킴으로씨 그 반응을 정지시키고 비결합된 트리포스페이트를 제거하기 위해 그수성상을 1ml 세파덱스 G-50 컬럼상으로 통과시킨다. 그 배제된 분획을 혼주하고 에탄올을 침전시킨다. cDNA 펠릿을 냉 에탄올로 세척하고 200㎕의 20mM 트리스 pH 8.0, 1mM EDTA, 80μM, S-아데노실-메티오닌과 300유니트의 EcoR1 메틸라제중에 60분간 37℃에서 재현탁시킨다. 페놀/클로로포름으로 추출함으로씨 그 반응을 중지시키고 메틸화된 cDNA를 에탄올 침전에 의해 수거한다.

cDNA 펠릿을 70% 에탄올로 헹구고 200㎕ S1완충제(Maniatis등)에 재현탁시키고서 200유니트의 S1-뉴클레아제와 함께 30℃에서 30분간 항온 보존시킨다. 페놀/클로로포름으로 추출함으로써 그 반응을 정지시키고 에탄올 침전에 의해 cDNA를 수거한다.

이본쇄 cDNA는 100㎕의 20mM 트리스, pH 7.4, 50mM 염화나트륨, 10mM 2메르캅토에탄올과 500μM의 4가지 모든 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 25유니트의 클레노우와 함께 실온으로 30분간 항온 보존시킴으로써 평활 말단으로 만든다. 이 페놀/클로로포름으로 추출하여 반응을 정지시키고 에탄올 침전으로 cDNA를 수거한다.

2000유니트의 T4 리가제를 사용하여 50㎕의 T4 리가제 완충제(Maniatis등)중에서 500pM의 R1 연결체(New England Biolabs에서 판매, 서열 : pCGGAATTCCG)와 cDNA를 하룻밤 동안 16℃에서 결찰시킨다. 70°에서 20분간 항온 보존시켜 반응을 정지시킨 다음, 300㎕로 희석하여 최종 염 농도가 0.1M 염화나트륨, 10mM, MgCl₂, 50mM 트리스-Cl,pH 7.4가 되게 한다 cDNA를 2분간 37°에서 700유니트의 EcoR1으로 분해시킨다. 그 반응을 정지시키기 위해 페놀/클로로포름으로 추출하여 반응을 정지시키고 cDNA를에탄을 침전에 의해 수거한다. 펠릿을 50㎕의 TE에 재현탁시키고 5ml Cl-4B 컬럼으로 통과시킨다. 배제된 분획을 혼주하고 에탄올을 침전시킨다. 침전된 cDNA를 1㎕/ml 에티늄 브로마이드의 존재하의 트리스아세테이트 완충제중에 1% 아가로즈 겔을 통해 전기영동시킨다. 500-4000염기쌍 크기의 cDNA를 표준 글래스 분말 방법에 의해 그 겔로부터 분리시킨다. 용출된 cDNA를 페놀/클로로포름으로 추출시키고 에탄올을 침전시킨후 팬릿을 (에탄을 세정후) 50㎕의 TE에 재현탁시킨다. 그 최종 산물은 100-500mg의 cDNA이었다.

발현벡터 p91023(B)의 제조가 전술되었다. EcoR1 절단되고 포스페타제 처리된 벡터(500ng)를 16°에서 하룻밤 동안 100㎕ 반응(표준 T4 리가제반응)으로 100ng cDNA와 결찰시킨다. 그 반응은 페놀/클로로포름으로의 추출에 의해 정지시키고 운반자로서 5㎍의 tRNA를 가한 후 결찰된 cDNA를 에탄올 침전시킴으로써 수거한다.

에탄올 침전된 DNA를 70% 에탄올로 세정하고 100㎕의 TE에 재현탁시킨다. 이 DNA를 4μl의 부분표본으로 사용하여 E.coli MC1061을 형질 전환시킨다. (100㎕ 형질 전환에서 4㎕) . 25개 형질 전환물을 각각1% 아가, L-브로스와 10㎍/ml 테트라사이클린(Tet 플레이트)의 150mm 페트리디쉬상에 도말시킨후 37°에서 하룻밤동안 항온 보존시킨다. 약 2000콜로니가 각 플레이트 상에서 생장하여 총 약 50,000콜로니가 되었다. 지름이 약 0.5mm 달한후, 그 콜로니를 플레이트 표면상의 건조필터에 조심스럽게 옮겨서 니트로셀룰로스 디스크에 전이시키고 그 필터를 부드럽게 제거한다. 플레이트 상의 모든 콜로니들을 신선한 Tet 플레이트상에 놓여진(콜로니 측면에 편중)필터로 전이시킨다. 그 콜로니들을 몇시간동안 생장하도록 한 후, 하나의 리플리카를 각 필터로부터 제조하기 위하여 신선한 습식 필터를 본래의 필터 위에 정확하게 올려 놓고서 그들을 함께 압축시킨뒤 제거하고 각 필터를 신선한 Tet 플레이트에 환원시키고 그 플레이트를 37°에서 하룻밤동안 항온 보존시킨다. 각 리플리카를 본래의 필터와 재정렬되도록 주의하여 표시한다.

단계 5. 플라스미드 DNA 푸을 제조

25리플리카 필터 각각을 스켈펄을 사용하여 8개로 절단하고 원래의 필터에 대한 각 8개의 배향을 기록한다. 그 콜로니들을 각 절단편으로부터 10ml의 L-브로스에 스크랩한다. 박테리아를 원심분리(3000rpm 10분. 벡크만 J-6 원심분리기)하여 0.6ml의 25% 자당, 50M 트리스-염산 pH 8.0에 재현탁한 후, 0.12ml의 5mg/ml 리소자임을 가하며 5-10분간 얼음중에서 항온 보존시켜서 프로토플라스트로 전환시킨다. 프로토플라스트를 실온에서 10분간 원심분리시킨 뒤 0.125ml의 0.5M의 EDTA를 가하고서 50mM 트리스-염산, pH 8.0중의 0.12ml의 10% SDS를 가함으로써 용해시킨다. 용해물을 가볍게 혼합하고 실온에서 15분간 항온 보존시킨후 단백질과 염색체 DNA를 0.3ml의 5M 염화나트륨을 가하여 침전시킨다. 15분간 얼음중에서 항온 보존한 후, 그 용해물을 30분간 냉온하에 Eppendorf 원심분리기로 원심분리한다. 그 상청액을 조심스럽게 제거하고 점성 DNA/단백질 펠릿을 2.5ml의 물을 가하여 희석한다. 그 혼합물을 1ml의 페놀로 추출하고 그 층을 원심분리(10분간 10K, Sorvall SS-34 회전기)로써 분리하고 수성층을 신선한 튜브로 옮긴다. 0.5ml의 5M 염화나트륨과 7.5ml의 냉 에탄올을 가하고 그 혼합물을 드라이아이스 에탄을 조에서 몇시간 동안 냉동시킴으로써 DNA를 침전시킨다. 그 침전물을 원심분리 (10K, 15분, Sorvall SS-34)하여 수거하고 0.3ml의 0.3M 소듐 아세테이트 재현탁시키고 1ml의 에탄올을 가함으로써(에펜도르프 튜브에서)재침전시킨다. 10-15분후, 드라이아이스 에탄을 조에서, 침전된 DNA를 원심분리(5분, 에펜도르프에서)함으로써 수거한 후 최종 펠릿을 100μl의 멸균 TE(10mM 트리스 pH 8, 1mM EDTA)에 재현탁시킨다. 전형적인 제조로, 5-10μg의 플라스미드 DNA가 수득되었다. 각 제조물은 원래의 필터상의 200-500 콜로니로부터의 DNA를 함유하였다. 총 200DNA 샘플을 25개 필터로부터 제조한다.

단계 6. CSF 클론의 분리

단계 5로부터의 각 DNA 샘플을 후술하는 바와같이 M6 COS 원숭이 세포로 각각 이입시킨다.

M6 셀은 10%의 가열 비활성화 된 태아 송아지 혈청 (HIFCS)를 함유하는 Dulbecco 변형의 Eagle배지(Gibco사로부터 시판되는 DME)중에서 통상적으로 생장시키고, 1주일에 2회 1 : 6의 희석으로 분리한다. 1 : 6 분리한지 24시간후에, M6 세포는 이입되기 쉽다. 이입 24시간 전에 1.2×10⁸M6셀(1 : 6 분리)을 1.5리터의 DME＋10%중에 셀 펙토리(Nunc사로부터 시판되는 Cell Factory)로 시이드 한다. 이입 바로전에, 플레이트를 대기( )시키고 7ml의 무혈청(SF)DME로 2회 세척한다. DNA를 0.1M 트리스(pH 7.3)에 용해시키고 2mM 글루타민, 100㎕/ml 스트렙토마이신, 100u/ml 페니실린과 0.25mg/ml DEAE 에넥스트란이포함된 DME 배지에 가하고 트리스-DNA용액에 총 4ml가 되게 한다. 용해된 DNA가 함유된 4ml의 배지를 M6 COS 셀이 함유된 플레이트에 가하고 12시간동안 항온 보존시킨다. 항온 보존 후, 그 셀을 7ml SFDME로 1회 또는 2회 세정한다. 10% HIFCS를 가진 5ml DME, 100U/ml 페니실린, 100㎍/ml틴의 스트렙토마이신, 2mM 글루타민과 0.1mM의 클로로킨을 가하고 그 셀을 2.5시간 동안 항온 보존한다. 2.5시간후, SF DME로 1회 헹군후 10ml＋10% HIFCS/플레이트를 가한다. 30분후 배지를 대기시키고 4ml/플레이트 DME＋10% HIFCS를 공급한다. 24-26시간 다시 항온 보존시킨후 조절된 배지를 제거하여 수거한다.

각 이입으로부터의 조절된 배지를 KG-1 분석에 의해 CSF 활성에 대해서 분석한다. 각 샘플에 대하여, CSF 활성이 기인되는 원본의 필터상의 클론이 양성의 CSF 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 예컨대 CSF 활성에 대해 양성인 한 이입물에 대하여, 이입 DNA 샘플이 유래된 원본 필터의 절편의 모든 콜로니가 채택되었다. 이 콜로니들중 일부인 320개가 10㎍/ml 테프라사이클린이 가해진 L-브로스 3ml중에서 채택되었다. 하룻밤동안 배양한다. 320콜로니들을 18×18 메트릭스에 놓는다. 매트릭스의 수평렬과 수직 컬럼으로부터 푸울을 제조한다(총 36푸울) (주의 : 마지막 수평렬은 14개 콜로니만을 가진다) DNA 샘플을 각 푸울 배양체로부터 제조하고 COS 세포를 이입시키기 위해 사용한다. 이 이입물로부터의 상청액을 KG-1 콜로니 분석에 의해 분석한다. 두개 양성체를 이입물의 셋트로부터 얻는다 : 하나는 수직 컬럼에서, 다른 하나는 수평렬에서 얻는다. 이 푸울에 공통의 배양체는 CSF 클론을 함유한다.

이 배양체로부터의 12개의 각 클론을 분리하고 전술한 바와같이 L-브로스 중의 10ml 배양체로부터 DNA를 제조한다. 상기 제조물로부터의 DNA 10㎕샘플을 EcoR1로 절단하고 그 결과의 DNA 분체를 아가로즈 겔 전기영동으로 분석한다. 12개중 9개 클론이 약 750염기쌍 삽입체를 갖는다. 상기 클론 4개로부터의 DNA와 나머지 세개 클론을 전술한 바와같이, M6 COS 셀에 도입시킨다. 이 이입물로부터의 상청액을 CSF에 대한 골수 분석 뿐만 아니라 KG-1 분석으로써 분석한다. 그 두개 분석에서 밝혀진 것은 4개 클론은 각각 높은 수준의 CSF 활성의 M6 COS 셀에 의한 표현을 유도하는 750염기쌍 분체를 함유하지만 다른 세개 클론은 그것을 함유하지 않는다. 따라서, CSF에 대한 암호부위는 750염기쌍 삽입체 내에 존재하여야만 한다. CSF를 암호하는 DNA 서열은 양성 클론에서 형질 전환 벡터로부터, EcoR1으로 절단하여 떼어내고 제1도에서의 서열을 얻기 위하여 M13 벡터로 분체를 서브 클론시킨뒤 표준의 디데옥시 서열화 방법에의해 서열시킨다. 먼저, COS 세포에서 CSF 발현을 유도하는 것으로 밝혀진 플라스미드, p91023(B)-CSF pSCF-1으로 지명한다. 이 플라스미드는 1984년 7월 2일 기탁번호 ATCC 39754하에 E. coil-MC 1061의 변이주로 미국 배양체 수집소(ATCC)에 기탁되었다. 또한 상기 균주는 1986년 3월 6일 수리번호 KCTC 8187p호로 한국 과학 기술원에 수탁 신청 수리되었다.

단계 7. CSF 단백질의 발현

단계 6에서 분리된 CSF/cDNA 함유 벡터 p91023(B)로 형질 전환된 M6 COS 원숭이 셀을 단계 6에서와 같이 생장시켜서 배양 배지에서 CSF 단백질을 생산케 한다.

즉, 1mg의 이러한 DNA(pCSF-1)를 1ml의 0.1M트리스, pH 7.3에 용해시키고 2mM 글루타민, 100U/ml 스트렙토마이신, 10㎍/ml의 페니실린(P/S)와 0.25mg/ml의 DEAE 덱스트란(분자량 500,000)이 함유된 600ml DME에 가한다. 600ml의 DNA DEAE 댁스트란 용액을 셀 펙토리중의 M6 COS 셀에 가하고 12시간 동안 항온 보존 시킨다. 항온 보존후, 그 셀을 900ml의 DME로 1회 세정하고 0.1mM 클로로킨, 10% HIFCS,2mM 글루타민과 P/S가 함유된 DME 600ml와 함께 2.5시간동안 항온 보존한다. 클로로킨 함유 배지를 대기시킨후 그 셀을 SF DME로 세정하고 10% HIFCS의 DME 1500ml를 공급한다. 30시간후 그 셀을 SF DME로 세척하고, 그 배지를 800ml의 SF DME로 대치시키고 상기 이입된 셀을 24시간 동안 37℃에서 배지를 조절하도록 한다. 조절된 배지를 대기시키고 800ml의 SF DME로 대치시킨다. 그 셀을 24시간동안 이 배지에 적응시킨 다음 적응된 배지를 수거한다. 수거한 후 가능한 빨리, 그 조절된 배지 샘플을 YM5 멤브레인(5,000분자량 차단 장치)의 Amicon 2.5리터 쳄버를 사용하여 압축 초여과시켜서 20배로 농축시킨다.

단계 8. 재조합 CSF의 정제

농축 조절 배지(4리터의 출발물질-단계 7로부터)의 200ml에 고체의 황산암모늄을 가하여 30% 포화의 황산암모늄을 만들고 침전된 단백질을 원심분리에 의해 제거한다. 그 상청액을 고체의 황산암모늄을 가해 80% 포화시키고 그 침진 단백질을 원심분리로써 수거한다. 그 펠릿을 1M의 염화나트륨이 포함된 20mM 소듐 스트레이트, pH 6.1의 5ml에 재현탁 시킨다. 용해된 단백질을 같은 완충제에서 평형된 울트로겔 AcA54의 1.6×100cm 컬럼에 적용시킨다. 그 컬럼으로부터 19K 달톤의 가시분자량을 가지거나 90ml이후에 CSF 활성체가 용출되었다. 겔 여과가 저 이온 강도에서 실시될때, CSF활성체는 약 19K 달톤과 38K 달톤의 분자량의 두개 위치에서 그 컬럼으로부터 용출되는 것이 관출되었는데, 이것은 GM-CSF가 쉽게 다이머를 형성할 수 있음을 암시한다. 그 활성 분획을 혼주하고 0.15% TFA로 만들고(10% TFA를 가함으로써), 0.1% TFA에서 평형된 Vydac C4컬럼 (0.46×25cm)에 적용시킨다. 그 컬럼을 0.1% TFA중의0-9% 아세토니트릴(1ml/분, 총 340ml)의 선형 구배액으로 전개시킨다, CSF 활성은 39와 43% 아세토니트릴(분획 16-20) 사이에서 용출된다. 분획 19의 20㎕ 샘플을 SDS 포리아크릴아미드 겔 전기영동(Lammli 등의 Nature 227,680(1970)에 설명된 바와같은 13.5%겔)에 의해 분석한다. 18-26K 달톤의 분자량의 단일한 넓은 단백질 밴드가 관찰되었다. CSF에 대하여 보다 더 넓은 크기는 글리코 단백질의 일반특징이며 광범위하지만 가변성의 탄수화물이 첨가되어 있다는 것을 반영하는 것으로 간주된다. 분획 19로부터의 단백질을 응용 바이오시스템 가스상 마이크로시퀴네이터(microsequenator)를 사용하여 Edman 분해시킨다. 약 20μg의 적용 단백질로부터 선두의 16아미노산의 서열이 얻어졌다(A-P-A-R-S-P-S-P-S-T-Q-P-W-E-H) . 이러한 단일 단백질 서열의 높은 수율은 분획 19에서 CSF 단백질이 균질하게 정제되었음을 강력히 시사한다. 생 분석 (Bioassay)은 분획 19가 A₂₈₀흡수 단위당 3×10⁷유니트를 가지고 있음을 지적 하였다.

수용성 용액에서 전형적인 단백질이 1mg의 단백질당 0.8 내지 1.2A₂₈₀흡수 단위의 흡광 계수 범위를 나타내기 때문에, 정제된 CSF의 특이활성은 인체 골수 세포 분석을 사용하여 분석할때 약 1×10⁷내지 약 4×10⁷유니트/mg이다.

[실시예 B]

GIBBON CSF의 클로닝

단계 1. 긴팔 원숭이 (Gibbon) T-셀로부터 mRNA의 제조

UCD-MLA 144로 지명된 긴팔 원숭이 T-셀라인의 샘플을 RPMI 1640(Gibco사에서 시판)과 20% 태아 송아지 혈청에서 수주일간 배양하여 총 1×10⁹셀을 얻는다.

RPMI 1640 1% FCS에서 12-0-테트라데카노일 포르볼 13-아세테이트(TPA) 1ml당 10ng의 존재하에 24시간동안 활성화 시킴으로써 CSF을 고수율로 생산하도록 상기 셀을 유도한다. 그 셀을 원심분리(1000rpm., 5분)로써 수거하고 인산염 완충 함수(PBS)로 1회 세척한 후 최종 원심분리로 수거한다.

생체막 결합 폴리솜(MBP) mRNA를 Mo 셀 RNA의 제조에 대해 실시예 A에서 설명된 바와 같은 방법을 사용하여 상기 셀로부터 제조한다.

단계 2. 제1본쇄 cDNA 반응

6㎍의 MBP mRNA(단계 1로부터)를 50㎕의 cDNA 합성 반응 혼합물(실시예 A-단계 4참조)에 희석하고 그 반응을 역전사 효소를 가해 개시시킨다. 30분간 42℃에서 항온 보존시킨후, 그 반응은 EDTA를 50mM로 가하고 정지시키고 물로 100㎕가 되게 희석한다. 그 혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출한 후, 다시 클로로포름으로 추출시킨다. cDNA/RNA 하이브리드를 2ml의 세파로즈 CL-4B 컬럼상의 크로마토그래피화에 의해 비결합된 트리포스페이트로부터 분리한다. 그 배제 분획들을 혼주하고 에탄올 침전으로써 하이브리드를 수거한다. 최종산물은 570ng이었다.

단계 3. 제2본쇄 cDNA 반응

제1본쇄 cDNA 펠릿(단계 2)을 50ml 물에 재현탁시키고 E.coli 폴리머라제 I, E.coli 리가제와 RNAseH와 함께 표준 반응 혼합물중에서 제2본쇄 합성을 실시한다. 그 반응을 16°에서 하룻밤동안 항온 보존시킨후 1시간동안 37°로 항온 보존시킨다. EDTA를 가하여 반응을 중지시키고 페놀/콜로로포름으로 추출시킨다. cDNA를 세파로즈 CL-4B 컬럼상의 크로마토그래프에 의해 비결합된 트리포스페이트로부터 분리하고 그 배제된 분획들을 혼주한 후 에탄올 침전으로 cDNA를 수거한다.

단계 4. 재조합 cDNA 제조

cDNA 펠릿(단계 3)을 75㎕의 물에 재현탁시킨다. 단일중합체 C "꼬리"를 10㎕의 cDNA용액을 25㎕의 표준 반응 용액에 말단 트랜스퍼라제와 함께 가하고서 30°에서 5분간 항온 보존시킴으로써 cDNA의 말단에 가한다. 그 반응은 EDTA를 40mM로 가하며 68°에서 10분간 가열 불활성시킴으로써 중단시킨다. 꼬리화 cDNA의 10ng을 10μl의 10mM트리스, pH 7.5, ImM EDTA와 100mM 염화나트륨 중에서 50nmg G-꼬리화 된 pBR 322(NEN사에서 시판)과 함께 아닐링시킨다. 아닐링 반응을 10분간 68°에서 그리고 2시간 동안 57°에서 항온 보존시킨다.

단계 5. 박테리아 형질 전환

E.coli종 MC1061을 L-브로스에서 생장시키고 얼음중에서 냉각하고, 원심분리로 수거한 뒤 CaCl₂로 처리하여 형질 전환을 위하여 준비한다.

5㎕의 cDNA아닐링 반응을 200㎕의 CaCl₂-처리된 박테리아와 함께 항온 보존시킨다. 15의 상기 형질전환을, 모든 아닐링 된 cDNA를 사용하여 실시하고 10㎍/ml테트라사이클린이 함유된 15cm, 1% 아가L-브로스 플레이트상에 도달시킨다. 약 1000콜로니가 각 플래이트에서 생장하였다.

단계 6. 리플리카 플레이팅

상기 형질 전관체로부터의 10,000콜로니를 집게로 각각 집어내어 신선한 플레이트에 전이시킨다(하나의 그리드(grid)에서 1플레이트당 500). 그 플레이트 표면상에 견고하게 건조 니트로셀룰로오즈 필터를 압착시켜서 각 플레이트로부터 그 콜로니들을 집어올린다. 이 원본 필터 각각으로부터 두개의 리플리카 필터를 제조한다. 원본 필터를 4°에서 보관하고 그 리플리카 필터는 염기로 처리한 후 그을려서 하이브리드화를 위해 준비한다.

단계 7. 32p 표지된 하이브리드화 프로브(탐지자)의 제조

pCSF-1로부터 제한 효소 EcoR1로 분해시키고 트리스 아세테이트와 에티듐 브로마이드로써 아가로즈겔중에서 전기 영동시켜 cDNA 삽입체를 분리한다. cDNA분체를 함유한 밴드를 겔로부터 절단하고 유리 분말기술로 정제한다.

300ng의 cDNA분체를 1㎕의 10×T4 DNA 폴리머라제 완충제(0.33M 트리스 아세테이트, pH 7.9, 0.66M 포타슘 아세테이트, 0.1M 마그네슘 아세테이트와 10mM 디티오트레이톨)와 3유니트의 T4 DNA 폴리머라제(New England Biolabs)에 가하고 물로 10㎕가 되게 희석한다. 5-10분간 37°에서 항온 보존한후, 이 혼합물을 1㎕의 10×T4 DNA 폴리머라제 완충제 ; dCTP, dTTP, dGTP의 각 2mM 용액의 1㎕ ; 32p DATP의 10㎕ (10μCi/㎕, 3,000Ci/mmole) ; 그리고 3단위의 Tr DNA 폴리머라제와 결합시킨다. 그 반응을 20분간 37°로 항온 보존시킨다. 1㎕의 2mM dATP를 가하고 그 반응을 다시 10분간 37°에서 항온 보존시킨다.

비결합 트리포스페이트를 세파덱스 G100컬럼상의 크로마토그래프에 의해 표지된 cDNA로부터 분리시킨다. 이차 프로브를 CSF 암호부위의 아미노 말단에 상보하는 하기 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드로부터 제조한다.

ATC TGG CTG CAC AG

이 올리고뉴클레오티드를 표준 폴리뉴클레오티드 키나제 반응에 의해서³²p dATP로 이것의 5'말단에서 표시한다.

단계 8. CSF cDNA클론의 분리

표준 하이브리드화 스크리닝 방법에서, 일부 45개 클론을 T4 표지된 pCSF-1cDNA와 하이브리드화 시킨다. 이것들 중 약 20개가 또한 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브에 또한 하이브리드화 된다. 이중의 하나의 코딩 부분을 서열화하는데, 서열 데이타는 염기 치환수를 나타내며 그중의 일부는 발현된 단백질에서 아미노산 차이를 넣는다. 이러한 차이를 제1도에 나타내었고 인체 CSF 유전자의 DNA서열이 실시예 A에서 클론되었다.

[실시예 C]

말초 혈액 임파구 mRNA로부터의 CSF 클로닝

단계 1. 말초혈액 임파구로부터의 mRNA 제조

말초 혈액 임파구들을 Ficoll-Hypaque 구배액 상의 분획화에 의해 4개의 혈장 반출법 부산물(Red Cross에서 시판)로부터 제조한다. 5% 태아송아지 혈청, 0.17% 피토헤마글루티닌, 10ng/ml의 포르발 미리 스테이트 아세테이트(PMA)의 존재하에 RPMI-1640에서의 옅은 밀도는 2×10⁶셀/ml의 밀도이다(총 6x10⁹셀이 수득되었음).

원심분리하여 (1000rpm, 5분)셀을 수거하고 포스페이트 완충 함수(PBS)로 1회 세척하고 최종적으로 원심 분리하여 수거한다. 세포질 RNA를 가벼운 용해 과정으로써 제조하는데, 그 셀을 50ml 냉트리온 용해환충제(140mM 염화나트륨, 1.5mM MgC1₂, 10mM트리스, pH 8.6, 0.5% 트리톤 X-100)에서 10mM 디티오트레이틀(DTT)와 50유니트/ml RNAsin(Biotec에서 시판)과 함께 재현탁시킨다.

이 용해물을 2등분으로 나누고 각 부분을 20% 자당이 함유된 용해 완충제의 10ml 큐숀상에 적층시킨다. 그 셀핵을 냉각하에 원심 분리하여 제거한다(4°, 5분간 400rpm) .

상층(시토플라스믹 추출물)을 조심스럽게 제거하고 소듐 도데실설페이트(SDS)를 가해 최종 농도가 1%가 되게 한다. 이 용액을 동부피의 페놀 클로로포름(1 : 1혼합물)으로 2회 세척하고 RNA를 2.5부피의 냉 에탄올로써 침전시킨다. 그 침전된 RNA를 원심 분리로 수거하고(15분, 4000rpm) 0.01M트리스, pH 7.5, 1mM EDTA, 0.25M 염화나트륨(TE 완충제+0.25M 염화나트륨)에 재현탁시키고 2.5부피의 냉 에탄올을 가해 재침전시킨다. 마지막으로, 원심 분리하여 RNA를 수거하고 5ml 물에 재현탁시킨다. 최종 수율은 7.5mg이었다.

mRNA를 올리고 dT 셀룰로오즈 상에서의 선택에 의해 전체 세포질 RNA로부터 분리한다. 2.5mg의 총RNA를 65°로 5분간 가열시킨다. 이 RNA를 TE+0.5mM의 염화나트륨(결합 완충제)에 평형된 올리고 dT셀룰로즈의 1ml 컬럼상에 통과시킨다. 그 컬럼을 결합 완충제로 세척하여 비결합된 RNA를 제거한다. 결합된 mRNA를 3ml 물로 용출시키고 0.2ml의 4M 염화나트륨과 2.5부피의 냉 에탄올을 가하여 침전시킨다. 침전된 mRNA를 원심 분리 (25,000rpm에서 30분간)하여 수거한다. 최종 펠릿(약 100ug)을 50㎕의 물에 재현탁시킨다.

단계 2. 제1본쇄 cDNA반응

20㎍의 PBL mRNA를 100mM 트리스, pH 8.4, 140mM KCl, 10mM MgCl₂, 10mM 2-메르캅토에탄올, dATP, dGTP, dCTP와 dTTP의 각 400μM, 프라이머로서 5㎍의 올리고-dT(평균 크기 12-18), 25μ Ci 의³²p dCTP(400μ Ci/mmole)와 20유니트의 리보뉴클레아제 억제제 RNAsin이 포함된 cDNA 합성 반응물 50㎕로 희석한다. 이 반응은 60유니트의 역 전사효소를 37°에서 가하여 개시시키고 30분간 42°에서 항온 보존시킨다. 이 반응을 EDTA를 40mM로 가하여 정지시키고 동 부피의 물 포화된 페놀로 추출시킨다. 그 페놀상을 50㎖의 TE 완충제로 역 추출시킨다. 수성상을 혼주한다. cDNA/RNA 하이브리드를 TE로 평형된 5㎕ 세파로즈 CL-4B컬럼 (Sigma에서 시판)상에 그 혼주된 수성상을 통과시킴으로써 비결합된 트리포스페이트로부터 분리시킨다. 그 컬럼에서 배제된 분획들을 혼주하여 250mM NaCl을 가하고헥산을 2.5부피의 냉 에탄올을 가하여 침전시킨다. 그 하이브리드를 30분간 40,000rpm에서 원심분리하여 수거한다. 최종 펠릿(2.5㎍ dml) 50㎕물에 재현탁시킨다.

단계 3. 제2본쇄 cDNA반응

효소 E.coli DNA 폴리머라제 I, E.coli DNA리가제와 E.coli RNAse H의 결합 작용에 의해 제2본쇄 cDNA를 합성한다. 그 반응 혼합물(50㎕)은 20mM트리스, pH 8.0, 4mM MgCl₂, 1.2mM EDTA, 25μM NAD 각 100μM의 dATP, dGTP, dCTP와 dTTP ; 그리고 50μCI³²P dCTP(3,000 Ci/mM)을 함유한다. 그 반응은 3유니트의 DNA 폴리머라제 I, 0.5유니트의 DNA 리가제와 0.75단위의 RNAse H를 가하여 16°에서 18시간 동안 그리고 37°에서 1시간 동안 항온 보존하여 실시하고 EDTA를 40mM로 가하여 정지시킨후 동부피의 페놀로 추출한다. 그 페놀상을 50㎕의 TE로 역추출하고 그 수성성을 혼주하며 cDNA를 제1본쇄에 대해 전술한 세파로즈 CL-4B 컬럼상의 크로마토 그래프화에 의해 비 결합된 트리포스페이트로부터 분리한다.³²P의 결합에 의해 제1본쇄 cDNA를 정량적으로 이본쇄 형태로 전환시킨다.

단계 4. 재조합 cDNA 제조

단일 중합성 C "꼬리"들을 1mM 2-메르칼토에탄올, 1mM CaCl₂와 9단위의 말단 데옥시뉴클레오티딜트랜스퍼라제가 함유된 50㎕반응 혼합물 중에서 400ng의 cDNA를 5분간 30°로 가볍게 가열시킴으로써 cDNA의 말단에 가한다. 그 반응을 EDTA 40mM로 가하여 68°로 10분간 가열함으로써 정지시킨다. 200ng의 상기 꼬리화 cDNA를 100㎕의 10mM 트리스, pH 7.5, 1mM EDTA와 100mM 염화나트륨 중에서500ng의 G-꼬리화 된 pAT 153(Amersham에서 시판)과 함께 아닐링 한다.

아닐링 반응은 68°에서 5분간의 예비항온 보존후 57°에서 2시간 동안 실시한다.

단계 5. 박테리아 형질 전환

cDNA 아닐링 반응 산물을 직접적으로 사용하여 E.coli중의 MC1061을 형질 전환시킨다. 박테리아 셀의 신선한 콜로니를 500㎕의 L-브로스를 접종시키기 위해 사용하여 550nm에서 광학 밀도가 0.25가 될 때까지 몇시간 동안 생장시킨다. 그 셀을 얼음상에서 냉온시키고 원심분리하여 (2000rpm, 10분간)수거한다.

그 펠릿을 10㎕의 냉 0.1M CaCl₂에 재현탁시키고 10분간 얼음 위에 놓는다. 그 셀을 원심분리(5분간 2000rpm)하여 수거하고 2.5㎖의 0.1M CaCl₂에 재현탁시킨다. 10㎕의 cDNA 아닐링 반응을 200㎕의 CaCl₂로 처리된 박테리아와 30분간 얼음상에서 항온 보존한 후 2분간 37°로 항온 보존하고서 0.8㎖의 L-브로스를 가한 후 최종적으로 30분간 37°로 항온 보존시킨다.

20개의 형질전환을 실시하는데 아닐링된 cDNA모두를 이용한다. 각 형질 전환 혼합물을 10㎍/ml의 테트라사이클린이 포함된 1% 아가 L-브로스 플레이트(15cm직경)상에 도말시킨다. 20개의 형질전환으로부터, 총 20개의 상기 플레이트를 도말시키고 37°로 하룻밤 동안 항온 보존시킨다. 대략 1,500 박테리아 콜로니가 각 플레이트상에서 생장하였고 전체적으로는 30,000 콜로니가 생장되었다.

단계 6. 리플리카 플레이팅

각 플레이트 상에서 생장한 원본의 콜로니들을 그 콜로니들의 상부에 건조필름을 압축시켜 그 플레이트로부터 들어 올려서 137mm 니트로셀룰로즈 필터에 전이시킨다. 두개의 동일한 리플리카를 포준 플레이트화 방법으로 각 원본 플레이트로부터 제조하는데, 각 원본 필터는 4각형 유리 조각위에 놓인 멸균된 사각 필터지(Whatman 3MM)상에 콜로니측을 위로하여 조심스럽게 올려놓는다. 새로운 예비-보습된 니트로 셀를로오즈 필터를 그 원본 필터 상부에 주의하여 정렬시키고 이차 멸균된 사각 필터지로 덮고 그 완전한 샌드위치를 두번째 유리조각과 함께 단단하게 압착시킨다. 샌드위치 필터들을 번호에 달고 그들이 다시 뒤에 정확하게 정렬될 수 있도록 3개의 작은 구멍을 비대칭적으로 뚫는다. 리플리카를 그 원본에서 제거하여 새로운 테트라사이클린 함유의 L-브로스 아가 플레이트 상에 콜로니 측을 위로하여 놓는다. 이차 리플리카를 동일한 양깃으로 곧 바로 제조한다. 각 원본 필터를 플레이트로 복귀시키고 그 플레이트 모두를 37°에서 박테리아 콜로니가 약 1mm 지름이 될 때까지 항온 보존시킨다. 원본 필터를 4°에서 보관하고 그 리플리카를 후술하는 하이브리드화를 위해 준비한다.

단계 7. 하이브리드화를 위한 필터의 제조

각 리플리카 필터(단계 6)를 0.5M NaOH, 1.5M NaCl에 7분간 적신 필터지(Whatman 3MM)상에 콜로니측을 위로하여 놓는다. 그 필터를 1m 트리스, pH 7.5, 1.5M NaCl에 적신 중화 필터지에 2분간 전이시킨후 중화 필터의 이차 셋트에 5-10분간 전이시킨다. 마지막으로, 그 필터를 SSC 완충제(0.015M 소듐시트레이트, 0.15M NaCl, pH 7.4)에 담근 필터위에 5분간 놓고서, 공건조시킨후 80°에서 1-2시간 동안 진공하에서 구워 말린다.

단계 8. CSF cDNA클론의 분리

한쌍의 여과지를 실시예 B에서 전술된 바와 같이 제조되는 방사활성적으로 표지된 pCSF-1 cDNA 삽입체로 탐지한다. 20개의 일부 콜로니들이 cDNA와 하이브리드화 되었다. 이중 12개를 원본의 필터에서 뽑아내어 다시 분석하기 위해 L-브로스에서 하룻밤 생장시킨다. 이 클론으로부터의 DNA 샘플(급생산)의 제한 효소분해(Pst 1)는 3개가 거의 충부한 길이임을 나타낸다. 이중의 하나가 서열화되었다. 이 클론의 CSF 암호 부분의 서열은 상응하는 pCSF-1의 서열과 같다(즉, 365-CSF(Ile) 위치에서 T를 가짐).

[실시예 D]

Mo 셀라인으로부터의 CSF정제

그 셀라인과 관련된 HTLV-II 비루스를 불활성화하기 위해 Mo혈청이 없는 조절된 배지(40리터)를 55°에서 30분간 항온 보존한다. 이 배지를 10,000분자량 차단의 막 PTGC(1.5f²)와 함께 펠리콘 카세트(Pellicon Casette)를 사용하는 압축 초여과에 의해 농축시킨다. 그 단백질을 황산 암모늄 침전(80% 포화)에 의해 다시 농축시킨다. 최종 단백질 펠릿(800mg)을 200mM트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄 하이드로클로라이드(트리스-HCI), pH 7.4의 100ml에 재현탁시키고 같은 완충제에 대해 투석한다(각회 4리터 변화로써 3회).

투석된 단백질을 같은 완충제에서 평형된 DEAE(디에틸아미노에틸) -울트로겔의 2.5×10cm 컬럼에 적용시킨다. 그 컬럼을 20mM트리스-염산, pH 7.4 800ml로 세척하고 CSF 활성체를 0.12M 염화나트륨이 포함된 20mM 트리스-염산, pH 7.4의 800ml로 용출시킨다. 10ml분획을 수거하고 CSF에 대해 분석한다. 활성 분획(3)을 혼주하고 압축 초여과(Amicon YM 5 멤브레인, 5,000분자량 차단)에 의해 6배(5ml)로 농축시킨다. DEAE 컬럼으로부터의 농축된 샘플을 20mM의 N-2-하이드록시에틸피페라진-N-2-에탄설폰산(HEPES), pH 7.4, 50mM NaCl과 0.01% 플리에틸렌글리콜(PEG-8000)에서 평형된 1.6×100cm AcA 44울트로 겔(10 내지 130k 달톤 분획을 갖는 아크릴아미드 아가로즈 울트로 겔) 컬럼에 적용시킨다. CSF 활성이 30k 달톤의 분자량으로 그 컬럼으로부터 용출된다. 활성분획을 혼주하고 10% TFA를 가해서 0.15%(v/v) 트리플루오로아세트산(TFA)로 만들고 Vydac C4 역상 컬럼 (1×25cm)에 적용시킨다. 0.1% TFA(v/v)중의 0-90% 아세토니트릴의 선형 구배액으로 그 컬럼을 4ml/분(총 1,000ml ) 전개시킨다.

CSF 활성체가 약 47%(v/v) 아세토니트릴에서 용출된다. 혼주된 활성 분획들을 2분의 1부피의 0.15%(v/v) 헵타 플루오로부티르산(HFBA)을 가하여 0.05%(v/v) HFBA로 만들고 0.15%(v/v)에서 평형된Vydac C4컬럼 (0.46×25cm)에 적용시킨다 그 컬럼을 0.15%(v/v) HFBA중의 0-90%(v/v) 아세토니트릴의 선형 구배액으로 1ml/분(총 340ml)에서 전개시킨다. CSF 활성이 약 53%(v/v) 아세토니트릴에서 용출된다. 분획 37-44(각 1ml )가 활성인 것으로 나타났다. 0.15ml의 부획 40을 4배로 농축시키고(SAVANT Speed Vac농축기 사용함) 40㎕의 2×SDS겔 샘플 완충제를 가한다. (0.125M트리스-염산, pH 6.8, 4% SDS, 20% 글리세롤과 0.004% 브로모페놀블루). 이 샘플들을 2분간 비등시켜서 13.5% Lammli, U.Nature 227, 680(1970)SDS겔에 적용시킨다(제2도 참조).

110,000골수 CSF 유니트 ml를 가지는 분획(40%)이 측정되었다. 이것은 A₂₈₀흉수 유니트 당 약 3.0×10⁶에 해당한다. 일반적인 단백질이 0.8 내지 1.2A₂₈₀유니트 mg의 흡광 계수를 가지기 때문에 정제된 CSF는 골수분석에서 약 1×10⁷내지 약 4×10⁷유니트/mg의 특이 활성을 가진다. 1㎍의 정제 CM-CSF의 샘플을 응용 바이오시스템 가스상 마이크로 시쿼네이터를 사용하여 Edman 분해시킨다. 3에서 5의 잔기의 서열이 Ala ARg Ser임이 결정되었다.

[실시예 E]

공지된 바의 프로토플라스트 융합(Sandri-Goldin 등의 Mol. Cell. Bio. 1 743-752, 1981)에 의해, CHO셀 플라스미드 p91023(B)-CSF에서 형질 전환되고 증폭된 CSF 서열을 CHO DHFR 결함 셀 DUKX-B11(Chasin ＆ Urlab PNAS 77 : 4216, 1980)에 도입시킨다. CHO셀의 생장과 보관은 공지되어 있다(Kaufman ＆ Sharp, J.MOl. Bio 150 601-621, 1981) .

프로토플라스트 융합을 위해, p91023(B)-CSF-1을 E.coli HB 101이 도입시키고 0.5% 카사이니오산, 0.4% 포도당, 0.012% MgSO₄, 5㎍/ml 티아민, 10㎍/ml 테트라사이클린이 함유된 50ml의 m9염에서 60nm에서 0.6 흡광도를 갖을 때까지 생장시킨다. 클로로암페닐칼을 250㎍/ml에 가하고 그 플라스미드 복제수를 증폭시키기 위하여 16시간 동안 그 배양체를 37°에서 항온 보존시킨다. 그 셀을 3,000×g에서 10분간 4℃로 원심 분리시키고 50mM 트리스-염소 pH 8.0에서 냉각된 20% 자당 2.5ml에 현탁시킨다. 리소자임을 가하고(0.25M 트리스-염소 pH 8.0에서 5mg/ml의 0.5ml) 그 혼합물을 5분간 얼음 상에서 유지시킨다. EDTA(0.25M EDTA pH 8.0의 1ml )를 5분간 얼음상에서 가하고 1.0ml의 0.05M 트리스-염소 pH 8.0을 서서히 가한다. 그 현탁액을 박테리아가 프로토 플라스크로 전환될 때까지 37°에서 15분간 항온 보존시킨다. 그 현탁액을 10% 자당과 10mm MgCl₂가 함유된 예비 가온된 배지 20ml로 서서히 희석하여 37°에서 15분간 유지시킨다. 프로토플라스트 용액(약 10⁹/ml )을 약 1-2×10⁴프로토플라스트/셀의 비율로 6-웰 플레이트(약 1×10⁶셀/웰)에서 CHO, DHFR결함 DUKY-B11 셀에 가하고서 그 프로토플라스트를 8분간 20RPM으로 IEC 모델 K원심 분리의 스윙 마이크로타이터 디쉬 회전기에서 원심 분리하여 그 셀상에 펠릿화한다. 원심 분리후, 그 상청액을 대기시켜 제거한다. 50ml 배지중의 50g PE0-1450 (Baker Chem.Co .)

폴리에틸렌 글리콜용액 2ml를 6웰 플레이트의 각 웰에 가한다. 그 셀을 다시 90초간 2000RPM에서 원심 분리하고 폴리에틸렌 글리콜용액을 제거하고 그 플레이트를 4ml의 배지/웨프로 3회 헹군다. 셀을 트립신화하고 10% 태아 송아지 혈청이 함유된 l0ml배지에 현탁시키고 임상 원심 분리기에서 500RPM으호 원추형 튜브에서 원심 분리시킨다. 3개 웰로부터의 펠릿상을 푸울하고 10cm 조직 배양 디쉬에 평판시킨다. 100㎍/ml의 카나마이신, 티미딘, 아데녹신, 데옥시아데노신, 페니실린과 스트렙토 마이신과 10% 투석된 태아 송아지 혈청이 함유된 신선한 배지를 각 플레이트에 가한다. 카나마이신을 프로토플라스트로 전환되지 않은 박테리아의 생장을 억제하기 위해 포함된다.

2일 후에, 그 셀을 10% 투석된 태아 송아지 혈청, 페니실린과 스트펩토마이신이 함유되지만, 뉴클레이시드가 결핍된 알파-배지로 아배양한다. 4-5일후 셀을 같은 선택성 배지(뉴클레오시드가 결핍됨)로 다시 공급한다.

선택성 배지로 아배양한지 10-12일 후 콜로니가 나타난다. 메토트렉 세이트(MTX) 선발과 증폭에 대한 두가지 기획이 수반된다. 첫번째 기획에서, 단일 독립 클론화 형질 전환체를 DHFR발현을 기준으로 분리하고 연속적으로, 외래 DNA의 복제수, 즉, 생장을 증대시키는 조건하에 각 클론을 점증 농도의 메토트랙에서 증식시킨다. 두번째 기획에서, 다수의 독립 형질 전환체의 푸울을 DHFR 발현을 기준으로 분리하고 외래 DNA, 즉 생장을 증대시키는 조건하에 메토트랙세이트의 점증농도로 함께 증식시킨다. 각 클론을 질량 선택된 개체군으로부터 분리시키고 GM-CSF 표현에 대해서 분석한다. 고수준의 GM-CSF 발현을 나타내는 클론들을 다시, 외래 DNA 즉, 생장을 더욱 증대시키기 위한 조건하에 배양 배지중의 메토트랙세이트의 점증 농도로 배양한다. 한 실험에서, 7개의 DHFH⁺헝질 전환체를 뉴클레오시드가 결핍된 알파 배지로 혼주한다 이 셀을 0.02μM에서 시작하여, 0.1, 0.5와 0.2μM MTX로 단계적으로 점증하는 농도의 MTX에서 연속적으로 배양한다. KG-1셀 분석에서 GM-CSF에 대해 분석할 때, 이 셀은 3,000 내지 12,000 유니트 ml로 생산되었다. 선택된 개체군을 0.5μM MTX와 2.0μM MTX에서 클로닝한다. 0.5μM MTX에서 수득된 클론들(010, D2, B6)을 연속적으로 2.0μM MTX에서 생장시키기 위해 선택한다. KG-1셀 분석에서 GM-CSF 활성에 대해 분석할 때, 클론화 셀라인은 15,000 내지 300,000단위/ml의 GM-CSF 활성을 생산하였다. 본 실시예에 의해 생산된 GM-CSF는 제1도에서의 CSF-Thr에 대해 주어진 아미노산 서열을 가진다.

[실시예 F]

E.coli에서 GM-CSF의 발현

GM-CSF를 벡터 pTALC-l85R로부터 E.coli에서 발현시킨다. 그 도식 설명을 제6도에 제공하였다. GM-CSF 암호 서열은 ATG.CCA.CCA.CCT.CCT.TCT.CCA TCT.CCA.TCT.ACT합성 서열로 시작하는데, 이것은 성숙 GM-CSF의 최초 11개 아미노산 잔기를 결정한다. pTALC-l85R에서 나머지 GM-CSF 암호 서열은 pCSF-1의 뉴클레오티드 97-447와 같고 TAR.TAR.TAG가 따른다. 상기 삼중 종결체 바로 뒤에 pUC-18 다중 연결체가 존재한다. PBR 322로부터의 테트라사이클린 내성 유전자를 CSF 유전자에 반대 방향으로 pUC-18 다중연결체에서 100염기 하부에 삽입한다. 테트라사이클린 내성 유전자는 그 자신의 프로모터를 지닌다. 시계반대방향으로, β-락타마제에 대한 유전자 뒤에 pUC-18(COLE1)이 존재한다

CSF 서열로 복귀되기 전에 그 플라스미드의 최종 구조적 특징은 PL프로모터이다. 이 프로모터는 기본적으로 Skatzman과 M. Rosenberg의 "Molecular cloning, a laboratory manual"(1982), Cold Spring Harbor Laboratory, p4l9에서 설명된 것과 같다. CSF 발현은 적합한 E.coli 숙주중에서 열 유도한 후 PL 프로모터에 의해 주도된다.

모든 균주제 조립에 사용되는 모(母)균주는 W3110 lacI⁰L8이다 (R.Brent와 M.Ptashne PNAs 78(1981)4204-4208).

λDNA의 분체 (λ뉴클레오티드 34490-38214)를 W3110 lacI⁰L8의 염색체로 lacZ 소재지에 통합시킨다. 이 통합은 클로르암페니콜과 암피실린에 내성은 물론 pBR322 복제시점에 대한 유전자를 수반하는 pBR325서열로 구성된 통합 벡터를 사용하여 수행한다(F.Bolivar gene 4(1978) 121-136). λDNA분체를 lacZ유전자에 삽입시키는데, 그 유전자는 lacI의 BstEil부위에서 부터 lacZ의 하부 TthillI부위까지 연장된 분체로서 그 플라스미드 상에 존재한다.

lacZ의 염색체 복사체로의 λDNA의 통합은 동질성 재조합에 의해 수행되며, lac⁺, 암피실린에 민감하고 콜로니, 클로로암페니콜에 내성인 콜로니들이 발견되었다. 모든 과외의 플라스미드 서열의 제거를 유도하지만 통합된 λDNA분체를 남기는 이차 재조합 현상을 락토즈-MacConkey 플레이트상에서 스크리닝한다. 최초의 lac⁺, amp^S, cam^R표현형은 이차 재조합 후에는 lac^-, amp^s, can^s표현형 으로 변화한다.

결과의 변종은 GL 400으로 지칭되며 30°에서 λ^R이며 4°에서 λ^S이다. 이러한 표현형은 CI⁸⁵⁷대립형질의 기능염색체 복사체의 존재를 입증한다.

변종 SG 20252상에서 생장된 용해물로부터의 PL 형질도입으로 GL 400을 lon△되게 한다(lac△u169, ara△139 rps1 lon△100 : Tn10) . 선택성 배지상에서 Tet에 대해 스크리닝 하여 Tn10을 제거한다(S.Maloy, W.nunn J.Bacteriol.145(1981) 1110-1112).

최종 숙주 균주는 소위 GI413이다(lacl⁰L8, lacZ(CI, REX, N), lon100) PTALC-l85R을 G1413으로 형질 전환시킨다. 이러한 균주를 7μg ml^-1테트라사이클린이 함유된 30℃의 유도배지 5ml에서 하룻밤 생장시킨다. 유도배지는 1리터당 20g의 카사이니노산, 6g Na₂HPO₄, 7H₂0, 3g KH₂PO₄, 0.5g의 NaCl, 1g의NH₄Cl, 1% 글리세롤, 2mg의 비타민 B1, 2mg의 CaCl₂.2H₂0, 0.2g의 MgCl₂.6H₂O를 포함한다.

7μg m l^-1테트라사이클린이 함유된 상기 배지(25ml)를 하룻밤 동안 배양된 배양체 25μl로 접종시키고 그 배양체가 A₅₅₀0.5의 밀도에 달할 때까지 수조에서 30°하에 흔든다. 이것을 40° 수조에 재빨리 옮기고서 다시 2시간 동안 흔들어서 GM-CSF가 합성되도록 한다. 셀을 수거하고 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 CSF 함량을 제조한다. 이 조건하에 GM-CSF는 약 5%의 세포성 단백질을 축적시킨다.

[실시예 G]

사카로마이세스 세레비시아에서 GM-CSF의 발현

A. 벡터 제조

선택 유전자로서 우라실 생합성 경로(URA 3)에서의 효소에 대한 유전자와 2μ복제 원점이 함유된 플라스미드를 조립한다. 효모의 2마이크론의 플라스미드로부터 복제 원점이 함유된 분체를 가하여^Y1p⁵(Botstein 등의 gene 8, pp. 17-24(1979))로부터 상기 플라스미드를 유도한다.

B. 글리세르알데히드 포스페이트 디하이드로게나제(GPDH)에 대한 유전자의 분리

GPDH에 대한 두개 유전자는 효모로부터 분리되었다. (Holland and Holland Journal of Biological Chemistry 255pp 2596-1605(1980)) 공지된 서열로부터 합성된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 표준 방법에 의한 효모 게놈 DNA의 플라스미드 라이버리로부터 GPDH유전자를 분리한다. 전체 GAP 491 유전자가 함유된 플라스미드는 ATCC 제39777호로 기탁되었다. 또한 상기 플라스미드가 함유된 Escherichia coli 1603은 1986년 3월 6일 수리번호 KCTC 8188P호로 한국 과학기술원에 수탁 신청 수리되었다.

C. 이형 유전자 발현을 위한 글리세르알데히드 포스페이트 디하이드로 게나제 프로모터의 제조

GPDH 프로모터를 바람직한 이형 구조 유전자의 출발점으로부터 자연적으로 위치시킬 수 있는 플라스미드를 제조한다. 이것은 GPDH 구조유전자의 개시 메티오닌 로돈에 바로 인접하게 Kpn I부위를 도입시킴으로써 완수한다. 프로모터 "카세트(Cassette)"를 효모 발현벡터 Y0p1으로 삽입한다.

D. α인자에 대한 유전자의 분리

α인자 교미(mating) 페르몬의 유전자가 효모로부터 분리되었다(Kurjan과 Herskowitz Cell. Vol.30, pp. 993-943(1982)). 이 서열로부터 합성된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 표준방법에 의해 효모게놈 DNA의 플라스미드는 라이브러리로부터 상기 유전자를 분리한다.

E. CSF발현 플라스미드의 제조

전술한 요소, 인체 CSF유전자로부터 표현방법에 의하여 발현 벡터 AJ14, 제7)를 조립한다. 이 벡터에서, CSF기 자연 리더 서열을 제거하고 성숙 CSF를 암호하는 서열을 α인자 대선구(pre-pro) 서열에 인접하도록 삽입한다. GPDH 프로모터, α인자 대선구 서열 및 성숙 CSF서열 사이의 접합부들을 하기에 적요하며 디데옥시뉴클레오티드 서열화에 의해 확인되었다. AAATAAACAAATG. CGTTTTCCTTCA... AAA AGA GAG GCG GAA GCT.GCA CCC GCC CGC TCG…

F. GM-CSF의 발현

플라스미드 AJ 14를 사카로마이세스 세레비시아의 변종으로 형질전환시킨다. 셀을 배양하여 CSF를 생성한다.

전술한 바에 의해, 본 발명의 하기의 특별한 구체예들이 예상되며 본 발명의 일부분을 이룬다 :

1. CSF를 생성하는 세포로부터 RNA를 제조하고 ; 상기 RNA로부터 폴리아데닐화 mRNA를 제조하고 ; 상기 mRNA로부터 일본쇄 cDNA를 제조하고 ; 상기 일본쇄 cDNA를 이본쇄·cDNA로 전환시키고 ; 이본쇄 cDNA를 형질 전환벡터에 삽입하고 그 벡터로써 박테리아를 형질전환시켜 콜로니를 형성시키고 ; 200 내지 500콜로니들의 각각의 푸울을 선발하고 각 푸울로부터 플라스미드 DNA를 분리시키고 ; 상기 플라스미드 DNA를 CSF 단백질 발현에 적합한 숙주 세포에 이입하고 ; 이입된 셀을 배양하여 CSF 활성에 대해 그 상청액을 분석하고 ; CSF양성 푸울을 선발하고 푸울 제조에 사용된 콜로니를 스크리닝하여 CSF활성을 갖는 콜로니를 동정하는 것을 특징으로 하는, CSF/cDNA 함유 형질전환 벡터의 제조 및 분리방법.

2. 제1에 있어서, CSF를 생산하는 상기 셀이 T임파구 셀인 방법.

3. 단백질을 분비하며, 제1의 방법에 의해 제조된 발현 벡터에 의해 형질전환된 진핵 셀.

4. 제3에 있어서, 상기 셀이 포유동물 셀인 것.

5. 제1에 있어서, CSF 활성을 가지는 콜로니로부터 CSF 단백질을 암호하는 DNA를 분리하고, CSF를 암호하는 상기 DNA를 CSF DNA와 이형인 프로모터를 가진 발현 벡터에 삽입시키는 것을 또한 포함하는방법.

6. 제5의 방법으로 제조된 상기 발현 벡터에 의해 형질 전환된 셀.

7. 제6에 있어서 그 셀이 원핵인 셀.

8. 제6에 있어서 그 셀이 진핵인 셀.

9. CSF를 암호하는 cDNA

10. 제1도에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 cDNA.

11. CSF를 암호하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터.

12. 제1도에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터.

13. 제11의 발현벡터 또는 그것의 대립 유전자 변이를 포함하는 형질 전환된 셀.

14. 제12의 발현벡터를 포함하는 형질 전환된 셀.

15. 제13에 있어서, 상기 셀이 원핵인 셀.

16. 제14에 있어서, 상기 셀이 원핵인 셀.

17. 제13에 있어서, 상기 셀이 진핵인 셀.

18, 제14에 있어서, 상기 셀이 진핵인 셀.

19. 제17에 있어서, 상기 셀이 효모 셀인 셀.

20. 제18에 있어서, 상기 셀이 효모 셀인 셀.

21. 제17에 있어서, 상기 셀이 포유동물 셀인 셀.

22. 제18에 있어서, 상기 셀이 포유동물 세포인 셀.

23, 제17에 있어서, 상기 셀이 곤충 셀인 셀.

24. 제18에 있어서, 상기 셀이 곤충 셀인 셀.

25. 형질전환된 셀에서 CSF를 암호하는 cDNA를 발현시킴으로써 제조된 CSF 단백질.

26. 제25에 있어서, 상기 셀이 원핵 셀인 단백질.

27. 제25에 있어서, 상기 셀이 진핵 셀인 단백질.

28. 제27에 있어서, 상기 셀이 포유동물 효모 셀인 단백질.

29. 제27에 있어서, 상기 셀이 포유동물 셀인 단백질.

30. 제27에 있어서, 상기 셀이 곤충 셀인 단백질.

31. 자연적으로 발원된 단백질의 거의 없는 CSF 단백질.

32. 제31에 있어서, 인체 기원의 단백질이 거의 없는 CSF 단백질.

33. 글리코실화가 거의 되지 않은 CSF 단백질.

34. 형질 전환된 진핵 셀에서, CSF 단백질을 암호하는 cDNA의 발현에 의해 글리코실화된 CSF 단백질.

35. 제34에 있어서, 상기 진핵 셀이 포유동물 또는 곤충 셀인 CSF 단백질.

36. 제1도에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 가지는 cDNA를 발현시켜 제조된 단백질.

37. 제36에 있어서,상기 셀이 원핵 셀인 단백질.

38. 제35에 있어서, 상기 셀이 진핵 셀인 단백질.

39. 제38에 있어서, 상기셀이 효모 셀인 단백질.

40. 제38에 있어서, 상기 셀이 포유동물 셀인 단백질.

41. 제38에 있어서, 상기 셀이 곤충동물 셀인 단백질.

42. 제1도에 나타낸 아미노산 서열 또는 그것의 대립 유전자 변이를 가지는 인체 CSF 단백질.

43. 제42에 있어서, 상기 CSF가 CSF(THr)인 CSF 단백질.

44. 제42에 있어서, 상기 CSF가 CSF(Ile)인 CSF 단백질.

45. 제42에 있어서, 상기 CSF가 Met-CSF인 CSF 단백질.

46, 제42에 있어써, 상기 CSF가 CSF와 Met-CSF의 혼합물인 CSF 단백질.

47 척수-억압 치료량의 CSF 단백질과 약학적 담체를 함유하는 것을 특징으로 하는, 척수-억압 치료를 위한 치료 조성물.

48. CSF 단백질펀 척수-억압중의 포유동물을 치료하는 방법.

49. 48에 있어서, 상기 치료단계가 약학적 담체와 CSF 단백질을 함유하는 조성물을 포유동물에 정맥 주사하는 것을 특징으로 하는 방법.

50. 유효량의 CSF 단백질로써 포유동물을 치료하는 것을 포함하는, 포유동물의 교환 과립수 증가치료방법.

51. 제1도에 나타낸 아미노산 서열 또는 그것의 대립 유전자 변이를 갖는 긴팔 원숭이(gibbon) CSF.

52. 제51에 있어서, 상기 CSF가 CSF(Thr)인 CSF 단백질.

53. 제51에 있어서, 상기 CSF가 CSF(Ile)인 CSF 단백질.

54. 제51에 있어서, 상기 CSF가 Met-CSF인 CSF 단백질.

55. 제51에 있어서, 상기 CSF가 CSF와 Met-CSF의 혼합물인 CSF 단백질.

56. 80% 포화의 황산암모늄으로 단백질을 80% 침전시켜 CSF 단백질이 함유된 펠릿을 형성시키고 ; 상기 펠릿을 약 6 내지 8의 pH에서 완충된 용액에 재현탁시키고 ; CSF 함유의 완충 용액을 크로마토그래프 컬럼에 적용시키고, 염화나트륨 함유의 완충용액으로 CSF 활성체를 용출시켜 CSF 활성체를 갖는 분획을 수거하며 ; 상기 활성 분획을 혼주하고, 그 혼주된 분획들을 C4 역상 컬럼에 적용시킨 후 0 내지 90% 아세토니트릴 구배액으로 CSF 활정체를 용출시켜 CSF 활성체가 함유된 분획을 수거하는 것을 특징으로 하는, 수용성 배지에 현탁된 단백질 혼합물로부터 CSF 단백질을 정제하는 방법.

57. 제56에 있어서, 상기 완충제가 트리스(하이드록시 메틸) 아미노 메탄 하이드로클로라이드, N-2-하이드록시에틸피페라진-N-2-에탄설폰산과 소듐 시트레이트로부터 선택되는 방법.

58. 제56에 있어서, 크로마토그래프 컬럼이 옥틸세파로즈, 디에틸아미노-에틸-울트로겔 또는 아크릴아미드-아가로즈-울트로겔과 함께 적재되는 방법.

59. 제56에 있어서, C4 컬럼에 혼주 분획을 적용시키기 전에, 혼주분획을 각각 트리플루오로아세트산 용액 또는 헵타플루오로부티르산 용액중에서 아세토니트릴 구배액으로 처리하는 방법.

60. 제59에 있어서, 용출액중의 트리플루오로아세트산 또는 헵타 플루오로 부티르산의 농도가 각 0.10%또는 0.15%(v/v)인 방법.

61. 제56에 있어서, CSF 단백질을 함유한 수용성 배지가 30% 포화 황산 암모늄으로 처리되어 단백질이 침전되는 것을 특징으로 하는 방법.

62. 제56에 있어서, 황산 암모늄으로 단백질을 침전시켜서 펠릿을 형성시키는 단계 이후에 트리스-염산용액에 펠릿을 재현탁시키고 그 결과의 용액을 투석시키고 ; 상기 투석 용액을 DEAE-울트라겔의 컬럼상에 적용시키고 ; 적어도 0.1M의 NaCl을 함유하는 트러스-염산용액을 컬럼을 용출시켜 CSF 활성을 함유하는 분획을 수거하며 ; 활성분획을 혼주하고 염산과 폴리에틸렌 글리콜을 함유하는 HEPES 용액으로 평형된 AcA 44-울트로겔 함유의 컬럼에 상기 혼주된 분획을 적용시키고 ; NaCl과 폴리에틸렌 글리콜의 HEPES 용액으로 그 컬럼을 용출시키고, CSF 활성체가 함유된 분획을 수거하고 CSF 활성체 함유의 분획을 혼주하여 그 혼주 분획들을 트리 플루오로아세트산으로 처리하며 ; C4 역상 컬럼에 트리플루오로아세트산 처리된 푸울을 적용시키고서, 트리플루오로아세트산 용액중의 0 내지 90% 아세토니트릴 구배액으로 용출시키고 CSF 활성체를 함유한 분획을 수거하며 CSF 활성체를 함유한 분획을 혼주하고, 그 혼주된 분획을 헵타플루오로 부티르산으로 처리하며 그 처리용액을 이차의 C4 역상 컬럼에 적용시키며 ; 그 이차 C4 역상컬럼을 헵타플루오로부티르산 용액을 용출하여 CSF 활성체를 갖는 분획을 회수하는 것을 특징으로 하는 방법.

63. 제56에 있어서, 황산암모늄으로 그 단백질을 침전시켜 펠릿을 형성시킨 후, NaCl 함유의 소듐 시트레이트 용액에 상기 펠릿을 재현탁시키고 이 용액을 같은 완충제에서 평형된 아크릴아미드-아가로즈-울트로겔 함유의 컬럼에 적용시키고 ; 그 컬럼을 소듐 시트레이트와 NaCl 용액으로 용출시켜 CSF 활성체를 갖는 분획을 수거하며 ; CSF 활성 분획을 혼주하여 트리플루오로아세트산으로 처리하고서 C4 역상 컬럼에 그 처리용액을 적용시키며 ; 트리플루오로아세트산 용액중의 0 내지 90% 아세토니트릴 구배액으로 그 컬럼을 용출시켜 CSF 활성의 분획을 수거하는 것을 특징으로 하는 방법.

64. 골수 분석에서 적어도 약 1×10⁷유니트/mg의 특이 활성을 가지는 CSF 단백질.

65. 제64에 있어서, 약 15,000 내지 26,000 달톤의 분자량을 갖는 CSF 단백질.

66. 제64에 있어서, 골수 분석에서 적어도 약 4×10⁷유니트/mg(단백질)의 특이 활성을 갖는 CSF 단백질.

67. 제56에 있어서, 상기 CSF가 Mo 셀 조절 배지로부터 정제되는 방법.

68. 제56에 있어서, 발현성 CSF 유전자가 함유된 재조합 벡터로 이입된 셀을 배양하여 얻는 배지로부터 상기 CSF가 정제되는 방법.

69. 제56에 있어서 p91023(B)-CSF로 이입된 COS 셀을 배양하여 얻은 배지로부터 상기 CSF가 정제되는 방법.

70. 영장류 CSF단백질을 암호하는 유전자를 적합한 벡터내로 삽입하고, 이 벡터를 진핵 또는 원핵 숙주 셀 내로 형질 전환시키고서 상기 CSF 단백질을 분리하는 것을 특징으로 하는, 영장류 콜로니 자극 인자(CSF)의 생성방법.

71. 제70에 있어서, 상기 CSF 단백질이 인체 과립구-마이크로파아지 CSF인 방법 .

72. 제70에 있어서, 상기 CSF 단백질이 제1도에서 CSF-Thr에 대해 나타낸 아미노산 서열을 갖는 방법.

73 제70에 있러서, 상기 CSF 단백질이 제1도에서 CSF-ile에 대해 나타낸 아미노산 서열을 갖는 방법.

74. 제70에 있어서, 상기 CSF 단백질이 Gibbon 원숭이 과립구-대식구 CSF인 방법 .

75. 제70에 있어서, 상기 CSF 단백질이 제1도에서 CSF-G에 대해서 나타낸 아미노산 서열을 갖는 방법.

76. 제70에 있어서, 자연 발원된 CSF의 생물학적 활성에 거의 영향을 주지 않으면서 하나 이상의 아미노산이 부가, 치환 또는 제거된 것을 제외하고 상기 CSF 단백질이 아미노산 서열에 있어서, 자연 발원된 CSF에 해당하는 방법 .

77. 제76에 있어서, 하나 이상의 시스테인 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것을 제외하고는 상기 CSF 단백질이 자연발원 CSF 단백질 아미노산 서열과 같은 방법.

78. 제77에 있어서, 메티오닌 잔기가 선행되는 것을 제외하고는 상기 CSF 단백질이 자연발원의 아미노산 서열을 가지는 방법.

79. 성숙 형태의 제42, 43, 45, 46의 CSF 단백질.

80. 시그널 잠재 출발 부위를 함유하는 제42, 43, 45, 46의 CSF 단백질.

81. 127 아미노산을 가지는 CSF 단백질.

82. ATCC 제39754호로 ATCC에 기탁된 E.coli MC1061을 발현함으로써 또는 그에 기탁된 플라스미드 p91023(B)-CSF의 127 아미노산 CSF 암호 뉴클레오티드 서열을 발현함으로써 얻을 수 있는 CSF 단백질.

Claims

CSF 단백질을 암호하는 하기 서열의 유전자가 삽입된 벡터로서 형질 전환된 진핵 또는 원핵 숙주세포로부터 발현된 상기 CSF 단백질을 분리하는 것을 특징으로 하는 재조합 CSF 단백질의 생산 방법.
제1항에 있어서, E.coli, CHO 또는 효모로부터 발현시키는 것을 특징으로 하는 방법.
CSF를 생산하는 세포로부터 RNA를 제조하고 ; 상기 RNA로부터 폴리아데닐화 mRNA를 제조하고 ; 상기 mRNA로부터 일본쇄 cDNA를 제조하고 ; 상기 일본쇄 cDNA를 이본쇄 cDNA로 전환시키고 ; 상기 이본쇄 cDNA를 형질전환 벡터에 삽입하고 상기 벡터로써 박테리아를 형질 전환시켜 콜로니를 형성시키고 ; 각 200 내지 500콜로니의 푸울을 선발하여 각 푸울로부터 플라스미드 DNA를 분리하고 ; CSF 단백질을 발현시키기에 적합한 숙주 세포에 상기 플라스미드 DNA를 이입시키고 ; 이입된 셀을 배양하여 CSF활성에 대해 그 상청액을 분석하고 ; CSF 양성 푸울을 선발하고, 이 푸울 제조에 사용된 콜로니를 스크리닝하여 CSF 활성을 갖는 콜로니를 동정하는 것을 특징으로 하는, CSF/cDNA 함유의 형질 전환 벡터의 제조 및 분리방법.
80% 포화 황산 암모늄 설페이트로써 단백질을 침전시켜 CSF 단백질이 함유된 펠릿을 형성하고 ; 그 펠릿을 약 6 내지 8의 pH인 완충제 용액에 재현탁하고 ; CSF 함유의 완충 용액을 크로마토그래프 컬럼에 적용하고, 염화나트륨 함유의 완충 용액으로 CSF 활성을 용출시켜 활성을 갖는 분획을 수거하고 ; 그 활성분획을 혼주하고, 그 혼주된 분획플을 C₄역상 컬럼에 적용시킨 후 0 내지 90% 아세토니트릴 구배액으로 CSF 활성체를 용출시져 CSF 활성체가 함유된 분획을 수거하는 것을 특징으로 하는, 수용성 배지에 현탁된 단백질 혼합물로부터 단백질을 정제하는 방법.