SA94150015A - انتاج وتنقية الليمفوكين - Google Patents

Abstract

إنتاج وتنقية الليمفوكين lymphokine الملخصيتعلق هذا الاختراع بطريقة لإنتاج وعزل الحامل الوراثي المتحول transformation المحتوي على عامل تشيط مستمرة البروتين CSF/cDNA CSF ) colony stimulating factor ) . الطريقة تشتمل على إعداد RNA من خلية تنتج CSF ، وإعداد RNA polyadenylated messenger من RNAالمذكور ، وإعداد شريط stranded أحادي cDNA من messenger RNA المذكور ، وتحويل الشريط الأحادي cDNA إلى شريط ثنائي cDNA ، إضافة الشريط الثنائي cDNA للناقل المتحول والبكتيريا المتحولة transforming bacteria مع الناقل المذكور لإنتاج مستعمرات colonies ، واختيار بقع pools لها مستعمرات من 200 إلى 500 لكل واحدة وعزل plasmid DNA من كل بقعة ، تحويل plasmid DNA إلى خلايا مستضيفة host مناسبة لتسريع بروتين CSF ، زرع الخلايا المتحولة وعمل اختبار المحلول الطافي supernatant لقياس نشاط CSF ، واختيار بقعة ايجابية من CSF وحجب المستعمرات المستخدمة لإنتاج البقع لاختيار المستعمرة المحتوية على نشاط CSF. كذلك فإن الموصوف هو شفرة coding cDNA لبروتين له نشاط CSF ( أي CSF/cDNA ) ، وكائن حي مجهري a microorganism أو خيط خلية محولة cell line transformed مع مجموعة ناقلة recombinant vector يحتوي CSF/cDNA ، وطريقة لإنتاج بروتين CSF بالتعبير CSF/cDNA المذكور بواسطة عمل استزراع culturing للكائن المجهري microorganism أو الخلية. الاختراع يقدم أيضا طريقة لتنقية بروتين CSF والبروتين المنقى كذلك.

Description

Y lymphokine ‏إنتاج وتتقية الليمفوكين‎ ‏الوصف الكامل‎ ‏خلفية الاختراع:‎ ‏يتعلق هذا الاختراع بإنتاج بروتين له القدرة على تتشيط نمو وتمييز‎ ‏كما يتعلق‎ . primate hemutopoietic ‏الخلايا المكونة للدم السابق تولدها‎ . ) CSF ( colony stimulating factor ‏بصفة خاصة بعامل تنشيط مستعمرة البروتين‎ ‏طريقة لإنتاج بروتين‎ dae) ‏صوره على‎ saa) ‏م كما يعمل هذا الاختراع في‎ ‏الذي يدخل صناعياً إلى الخلية من أجل أن يغير من‎ DNA ‏بواسطة عمليات‎ . ‏الطبيعي‎ DNA ‏النوع الوراثي والمناخي على الخلية ؛ ويلتف على طول‎ ‏كما يتعلق الاختراع بالحوامل الوراثية المحتوية على جين وذلك للعمل على‎ ‏بالكائتات‎ Loaf ‏تعديل ذلك الجين للبروتين المذكور ؛ كما يتعلق الاختراع‎ ‏المحولة بتلك الحوامسل‎ cell lines trasformed ‏الحية الدقيقة وخطوط الخلايا‎ ٠ ‏المتكون.‎ (CSF) ‏المذكورة كما يتعلق كذلك ببروتين‎ vectors ‏الوراثية‎ ‎La ‏إن أنواع الخلايا المختلفة الموجودة في الدم كلها مشتقة من‎ ٠ ‏المكونة لخلايا الدم . وخلايا النخاع العظمي هذه‎ stem cells ‏النخاع العظمي‎ ‏أنها تعيد تكوين نفسيا بالتالي فإنها تحافظ على نوعية‎ - )١( ‏لها وظيفتين:‎ ‏أنها تعمل على إعداد خلايا نسل‎ - (Y) ‏النخاع في الجسم ؛‎ LDA ١ ‏الناضجة‎ BL Bs ‏مفوضة بالتمييز إلى أنواع‎ progeny cells ‏والخلايا المفوضة بالتمييز في المسار الخاص المكونة‎ . mature blood cell ‏وقد تمت دراسة الخلايا‎ . progenitor cell ‏لخلايا الدم تسمى الخلايا الجد‎ ‏والخلايا‎ 3 lymphocytes ‏والليمغوسثت‎ 1 lymphocytes ‏الجد لخلايا الليمفوسيت‎ platelets ‏؛ كرات الدم الحمراء ؛ الصفائح الدموية‎ granulocytes ‏المحببة‎ v, ‏بالإضافة إلى الخلايا الجبد‎ eosinophils ‏والخلايا المحبة لصيغة الأيوسين‎ v ‏المبكرة التي يمكن أن تعطي فرديا بصفة مستقلة العديد من أنواع‎

Lala vivo ‏تجريبياً سواء داخلياً‎ - da alll ‏الخلايا‎ ‏وقد تم التحديد خارجيا‎ . (Dexter, T.M. 1983 J. pathology 141 415-433 ( vitro ‏و أو تنوع كل من نوع من الخلايا الجد يعتمد على‎ proliferation ‏أن تكاثر‎ ‏اشتقت من مصادر مختلفة . على سبيل المقال فإن‎ factors ‏عوامل خاصة‎ ° ‏الخلايا الجد الأخيرة لكرات الدم الحمراء تتطلب عامل ارتهروبوتيين‎ . ) ‏العامل المساعد على تكوين كرات الدم الحمراء‎ ( erythropoietin ‏؛ وتكاثر وتنوع الخلايا الجد النخاعيةٍ‎ surval ) ‏والعوامل المطلوبة لحياة ( لبقاء‎ ‏محببة ناضجة متعادلة تجبساه صبغة الأيومسين‎ WIA ‏المفوضة بتكوين‎ « macrophages ‏وخلايا ماكروفاج‎ monocytes Cu gi ga LDL A 5 » granulocytes ٠ ‏هذه العوامل تسمى عوامل تتنشسيط مس__تعمرة البروئيسسن‎ .( CSFs) colony stimulating factors ‏على نطاق كبير بالفئران . فوجد بداخل معظم‎ CSF ‏وقد درس نشاط‎ ‏البالغة ؛ مع هذا فقد تم الحصسول على تركيبات تحتوي على شاط‎ of dl) la Shad ‏من أنسجة مختلفة بطرق مختلفة يبدو أنها تختلف في‎ 0587 ١ ‏الكيميائية الحيوية . كذلك فإن العلاقات التركيبية بين العوامل المختلفة ما‎ ‏يبدو أنه يعمل بأكثشر‎ CSF ‏زالت غير معروفة ؛ علاوة على ذلك فإن نشاط‎ ‏من خطوة لتطوير الخلايا المحببة والماكروفاج ومرة أخرى فإنه ليس‎ ‏الملحوظة‎ dh a ‏من المؤكد ما إذ١ كان عامل واحد مسسئول عن كل‎ ‏أو ما إذا كان عامل مختلف يعمل على كل خطسسوة‎ oy. .( Burgess, A. and Metcalf, D. 1980 Blood 56 947-957 ( ¢ placenta ‏في الإنسان من المشقيمة‎ CSF ‏وقد تم الحصول على نشاط‎ ‏المنتشسطة . وقد تم‎ T ‏بعض أنسجة الجنين ؛ خلايا الماكروفاج ؛ والخلايا‎ ‏تحدث واحد أو أكثر من أنقطة‎ (Mo ‏خاصة بالفئران‎ ( T ‏إتشاء خط من الخلايا‎

¢ 7 القوية وذلك من مريسض مصاب بسرطان الدم من نوعية الخلايا ‎.T (leukaemic reticuloen dotheliosis (Golde et al 1978 Blood 52 1068-1072 (‏ دلت قدرة نشاط ‎CSF‏ على نشيط إنتاج الخلايا ‎iad‏ ‏والماكروفاج على أن التركيبات الصيدلية ‎pharmaceutical compositions‏ القتسي © لها نشاط ‎CSF‏ مفيدة أكلينيكيا ‎clinically useful‏ عندما يتطلب زيادة إنتاج هذه النوعية من الخلايا ( ‎myeloid‏ التخاعية ) . في الحقيقة وقد ظهر أن العديد من المرضى المصابين بشدة بمستويات عالية من الخلايا المحبيبة التي تدور بصفة طبيعية في الدم - عندهم أورام ‎tumors‏ تكون ‎sua 5%, 5K‏ ‎CSF‏ وفي حالة واحدة بمجرد استئصال الورم حدث انخفاض سريع في عدد الخلايا المحببة تجاه المستوى الطبيعي مما يؤكد بشدة على أن ‎CSF‏ ‏يمكن أن يكون مفيداً في تتظيم أعداد الخلايا المحبيبة التدور في الدم ‎Hocking, W., Goodman, J., and Golde, D.

Blood 61 600 ( 1983)‏ ) وعلى وجه الخصوص فإن تركيبات ‎CSF‏ مفيدة أكلينيكيا في علاج ‎ill‏ التخاعي ‎myelo-suppression‏ الناتج عن العلاج الكيماوي ‎chemotherapeutical‏ أو ‎١‏ الإشعاعي للسرطان ‎irradiation‏ . بالإضافة إلى ذلك فإن تركيبات ‎CSF‏ مفيدة في علاج الكثير من حالات العدوى لأن ‎CSF‏ يمكن أن يزيد من و أو ينتشط عدد الخلايا و / أو المونوسيت ‎monocytes‏ يوجد أنواع مختلفة من عديدة من ‎CSF hil‏ المعروفة تشظشمل؛ ‎CSE‏ الخلايا المحبية والماكروفاج ) ‎GM-CSF‏ ) و ‎CSF‏ المتعدد ‎multi-CSF‏ ¢ ‎vy,‏ ويتعلق الاختراع الحالي ب ‎GM-CSF‏ . وبروتينات ‎CSF‏ معروفة من مصادر حيوانية مختلفة . مع هذا فإن الاختراع الحالي متعلق ب ‎GM-CSF‏ ‏الأولى ؛ وأكثر خصوصاً ‎GM-CSF‏ الخاص يبالإنسان و ‎GM-CSF‏ الخاص بالقرد ‎.ape‏

° والتميييز الحيوي ‎biological‏ والكيميائي الحيوي ‎biochemical‏ ‏لتركيبات لها نشاط ‎CSF‏ ودراسة هذه التركيبات في الوضع الإكلينيكي أصبح من الصعب اليوم لندرة وعدم نقاء تركيبات 057 البشرية و / أو تركيبات 7 الأخرى . وأنه من المتوقع أن يكون من المطلوب التعرف على البروتين أو البروتينات المسئولة عن نشاط ‎CSF‏ . علاوة على ذلك فإنه من المطلوب ‎٠‏ ‏وجود مصدر يفضل أن يكون بشري لمثل هذا ‎CSF‏ يمكنه بسسهولة أن يمد بهذه البروتينات في كميات ودرجة تقاء كافية للتمييز الحيوي الكيميائي وللإستعمال كعوامل علاجية ‎therapeutic‏ ‏وحديثاً هناك ( طرق ) مطورة للاتحاد الجزيني ‎molecular cloning‏ جعلت من الممكن اتحاد تتابع نيوكليوتيدي ‎Jay - uncleotide‏ ضمن الكود الداخلي لبروتين ويكون مثل هذا البروتين بكمية باستعمال نظام حامل خاص بالعاثل ‎Maniatis, T. et.MolecularCloning-A Laboratory Manual‏ ( ‎Cold Spring Harbor, N.Y. 1982 (‏ ويمكن إعادة تجميع طرق الاتحاد المستعملة اليوم في ثلاث أساليب فصل ‎separation‏ وتتقية ‎purification‏ ‏معروفة ؛ ويمكن تجميع طرق الاتحاد المستعملة اليوم في ثلاث مجموعات عامة: ‎)١(‏ طرق تعتمد على معرفة تركيب البروتين مثل تتابع الحمض الأميني الخاص به ؛ (7) طرق تعتمد على التعرف على البروتين الذي . نسخ عن طريق الجين المتحد باستعمال مضاد حيوي خاص لهذا البروتين ؛ )*( طرق تعتمد على التعرف على فصائل ‎RNA‏ التي يمكن نقلها لإنتاج ‎vy,‏ البروتين أو التشاط الذي يحمل الكود الخاص به - الجين موضوع الاهتمام. ويصبح من الصعب تطبيق كل من هذه الطوائشف من الطسرق عند توفر البروتين موضوع الاهتمام ‎die‏ بروتين ‎CSF‏ في كمية صغيرة جداً . كذلك فإنه من الصعب الحصول على كمية كافية من البروتين المنقي ؛ ثم يكون من الصعب تحديد تتابع الحمض الأمينتي أو حتى التتابعات

ا" الجزئية للبروتين . بالمثل فإن التعرف على البروتين المنسوخ باتحاد الجسم المضاد ‎antibody‏ يفضتل أن يتم بامستعمال مضاد للسيرم 0 متعدد الأقطاب خاص فردي عالي المستوى ولايمسكن الحصول على مثل هذا المضاد للسيرم بدون وجود كميات من البروتين النقي ( الأنتيجين ‎(antigen‏ . والجسم المضاد أحادي القطب يعطي وسيلة بديلة ولكن الجسم المضاد المطلوب يمكن ‎Lad‏ أن يكون من الصسعب الحصول عليه في غياب الأنتجين المناسب ومثل هذا الجسم المضاد أحادي القطب يمكن أن لا يتفاعل مع البروتين في الصورة التي فيها يتم نسسغ البروتين عن طريق توفير أنظمة حوامل خاصة بالعافل - تغير من ‎٠‏ النوع الوراشقي والمناخي على الخلية . وفي النهاية فإن نقل فصائل ‎RNA‏ ‏لإنتاج البروتين الذي يمكن التعرف عليه أو التشساط - يتطلب أن الل ‎RNA‏ موضوع التساؤل يكون موجوداً في مصدر ال ‎RNA‏ بوفرة كافية لتعطي البروتين الموثقوق فيه أو إشارة النتشاط ‎activity signal‏ . وبصفة عامة فإن التوتر النسبي ل ‎RNA‏ يدخل ضمن الكود الداخلي لبروتين ‎٠‏ معين - توفر البروتين ؛ بحيث أن البروتين التادر غالباً يقل كوييا 01 بواسطة ‎mRNA‏ نادر ‎rare‏ ‏وقد تم استعمال خط خلايا ‎Mo‏ سواء في صورة مادة أولية -

لتقية ‎CSFs‏ البشضسرية وللتعرف على ‎RNAs‏ حاملة الرسالة ‎A LE‏ ‎corresponding messenger‏ - مع هذا حتى مع هذا المصدر الجيد ‎Lia Leu‏

.»| 68# فقد ثبت أنه من الصعب جداً فصل البروتين الكاقي للدراسات التركيبية. وقد ناقفت براءة الاختراع الأمريكية رقم 17807 التتقهة الجزيئة ‎partial purification‏ ل ‎CSF‏ وفي رموز عامة عملية لتغيير النوع الوراثي والمناخي على الخلية التي يزعم أنها تكون هذا . مع هذا فقد ذكر أن المادة المتقاة من المحتمل أن تحتوي على أقل من 9650 من ‎CSF‏ ‎Yo‏ وعملية تغيير النوع الوراثي والمناخي على الخلية - المزعومة تعتمد

'

على معلومات تركيبية لم تكن موجودة قبل الاختراع ‎dal‏ . وبراءة الاختراع البريطاتية ‎AY) 041 (UK)‏ +,¥ متعلقة بعملية فصسل ‎CSF‏ بشري

من ‎LDA‏ هجين ‎hybridoma cells‏ . مع هذا فإنه ليس من الواضح بأي ‎CSF‏ ‏يتعلق هذا ‎thal‏ ولم يمكن ترسيب خلايا هجين وبالتالي لم يتم التحفق

‎٠‏ من هذا الكلام.

‏وللتغلب على المتشاكل المصاحبة لاتحاد التتابع النيوكليوتيدي

‎CSF Jia ‏الذي يدخل ضمن الكود الداخلي لبروتين نادر‎ nucleotide sequence ‏بالطرق التي وصفت أعلاه فقد طورت طريقة جديدة . هذه الطريقة تتطلب‎

‏فقط أن الناتج الجيني أو نتشاطه يمكن قياسه بدقة . وقد ومسفت طرق

‏1 مناسبة لتقييم ‎GM-CSF‏ في المثال ؟ بعد ذلك. الوصف العام للاختراع:

‏في الجانب الأول من الاختراع الحالي يتغلب على مشاكل التقنية =

‏7 السابقة ويقدم مصدراً جاهزاً لبروتين له نتشاط ‎GM-CSF‏ بامستعمال طريقة ‎DNA‏ صناعيا للخلية لكي يغير من النوع الورائثي والمناخي على

‎ye‏ الخلية ويلتف على طول ‎DNA‏ الطبيعي . وطبقاً للاختراع ‎Nall‏ تستعمل وسيلة اتحاد جديدة تتطلب قط فحص شاط ‎GM-CSF‏ . كذلك يقدم الاختراع الحالي جين ‎cDNA‏ يحمل الكود الداخلي لبروتين له نشاط ‎GM-CSF‏ ( وبمعنى ‎GM-CSF/cDNA‏ ) كائن حي دقيق خاص بالعائل أو خط ‎LDA‏ محول بواسطة حامل للتغيير من التوع الوراثي والمناخي على

‎vy.‏ الخلية يحتوي على هذا 014-057/00118 ‎Jie‏ حوامل تغيير النوع الوراثي والمناخي على الخلية وطريقة لإنتاج بروتين ‎GM-CSF‏ عن طريق سخ ‎GM-CSF/DNA‏ المذكور باستزراع كائن حي دقيق أو خط خلايا . ونظراً

‏لأن بروتين ‎GM-CSF‏ يتم تكونه من ‎clone‏ قطب طبقاً للاختراع ‎Mall‏ فحن نستطيع التأكد من أنه بروتين له نشاط ‎GM-CSF‏ بالإضافة لذلك يتضمن

A

¢ GM-CSF/cDNA ‏الاختراع طريقة لتحضير وعزل حامل التحول المحتوي على‎ ‏والطريقة المذكورة تتضمن:‎ ‏؛‎ GM-CSF ‏من خلية تكون‎ RNA ‏تحضير‎ ‏مضاف إليه بولي أديتيلات‎ ( RNA ‏تحضر حامل رسالة‎ ْ ‏المذكور ؛‎ RNA ‏من‎ polyadenylated messenger RNA ° ‏المنكسور‎ RNA ‏من‎ single stranded ‏من شريط واحد‎ cDNA ‏تحضير‎ — ‏حامل الرسالة ؛‎ ‏مزدوج الأشرطة ؛‎ cDNA ‏من شريط واحد إلى‎ cDNA ‏تحويل‎ - ‏مزدوجة الأشرطة في حوامل تحول وتحول‎ cDNA ‏إدخال‎ - ¢ colonies ‏البكتيريا بواسطة الحامل المذكور لتكون المستعمرات‎ Ya ‏مستعمرة وعزل‎ Or — You ‏كل منهما حوالي‎ Pools ‏التقاط بقع‎ - ‏من كل بقعة ؛‎ RNA Plasmid ‏بلادزميد‎ ‏؛‎ CSF ‏مناسب لنسخ بروتين‎ host ‏إلى خلايا عائل‎ DNA ‏نقل بلازميد‎ -

GM-CSF ‏الخلايا المتقولة وفحص العائم لنشاط‎ culturing ‏استزراع‎ - ‏إيجابية وفحص المستعمرات‎ GM-CSF ‏في عمل اختيار بقع‎

CSF ‏المستعملة في عمل البقعة للتعرف على المستعمرة التي لها نشاط‎ ‏لهذا الاختراع هي هرمونات نمو وتتوع لخلايا‎ GM-CSF ‏وبروتينات‎ - ‏أكلينيكياً‎ Jani oD ‏الجهاز النخاعي . فهي على سبيل المثال توصف‎ ‏البيصساء‎ UD ali ) ‏لعلاج التثبيط النخاعي خصوصاً ( عرضياً‎ cancer ‏المحببة الناتج عن العلاج الكيماوي أو الإشعاعي للسرطان‎ 0 ‏شرح مختصر للرسومات:‎ ala ‏نتتضمن الكود‎ DNA illustrates ‏يوضح تتابعات‎ :١ ‏التشكل‎ ‎lj al ‏في‎ DNA ‏للاختراع الحالي . يدخل تتابع‎ lh GM-CSF ‏لبروتين‎ ‏هناك‎ . CSF-Thr ‏البشري يسمى باسم‎ GM-CSF ‏الكاملة لنوع واحد من‎ q identical product ‏أ خر يحتوي على الشفرة الخاصة بالناتج المطابق‎ allele ‏نظير‎ ‎. ) CSFlle ( ‏يستبدل بواسسطة‎ ٠٠١ ‏عند الموضع رقم‎ Thr ‏عدا أن‎ Lad

DNA ‏والتغييرات الموضحة فوق التتابع البشري هي للاختلافات في تتابع‎

GM-CSF ( ‏لحيوان العبون‎ GM-CSF ‏الذي يحتوي على الشفرة الخاصسة ب‎ ‏تتابعات‎ deduced ‏اختزال‎ . (CSF-G) ( Gibbon ape ‏الخاص بقرد العبون‎ » ‏موضحة.‎ Lad ‏الحمض أ لأميني‎ ‏من بلازميد‎ pTPL ‏؟: تخطيط يوضسح تحضير بلازميد‎ JCA .pAdD26SVpA(3) ‏الشكل ؟: تخطا يط مسثمر من الشسكل 7 ويوضح تحضير بلازميد‎

TPL ‏من بلازميد‎ p91023 ٠ ‏الشكل 4: تخطيط مستمر من الشكل * ويوضح بلازميد (9102308م.‎ pTALC-185R ‏تخطيط لحامل‎ J fas :١ ‏الشكل‎ ‏تمل تخطيط لحامل 37-14م.‎ sy ‏الشكل‎ ‏الوصف التفصيلى:‎ ‏التعريفات الآتية مقدمة لتسهيل فهم هذه الحالة . إلى حد أن‎ ‏التعريفات تختلف عن المعنى الذي يدور داخل التقنية ؛ والتعريفات أسفله‎ ‏للمقارنة.‎ ‎all ‏يعني عملية بواسطتها الخلايا التي تكون‎ tamplification ‏تكبير‎ ‎.chromosomal ‏الكروموزومي‎ DNA ‏تتكرر داخل‎ : ٍ A ‏هو نشاط حيوي يعرف بالفحوصات كما وصف هنا.‎ :GM-CSF « GM-CSF ‏هو بروتين من مصدر أولي له قاط‎ :GM-CSF ‏بروتين‎ ‏و لأغراض | لاخترا 2 الحالي فإن مصطلح بروتين‎

Ye ¢ ( ‏معدل ( مطور‎ GM-CSF ‏يشتمل بروتين‎ GM-CSF

GM-CSF ‏وبروتين‎ GM-CSF ‏صورة متشابهة من بروتين‎

MET ‏مسبوق ب متبقي‎ ‏في‎ TOA lel ‏يعني الاتجاه المتجه ناحية‎ downstream: Ji ‏(إلى‎ Jou ‏النيوكليوتيد.‎ 4 5 ‏يعني تتابع نيوكليوتيدي بمكن أن يقوي نقل الجيسن‎ tan enhancer ‏مساعد‎ ‏بصرف النظر عن موضع المساعد بالفسبة للجين أو‎ ‏اتجاه التتابع.‎ deoxyribonucleotide ‏يعني تتابع ديوكسي ريبوكليوتيد‎ gene ‏جين‎ ‏يتضمن الشفرة الخاصة ببروتين معين . وللأغراض‎ 0 ‏مناطق‎ Jo EY ‏فإن الشفرة سوف‎ Ua ‏الموجودة‎ ‏مواضع‎ RNA ‏طرفية غير متقولة مثل إشارات بدء نقل‎ ‏أو‎ promoters ‏بإنقات‎ ¢ polyadenylation ‏إضافقة‎ ‎.enhancers ‏مستحدثات‎ ‏الربط ومنتد1]: هو عملية تكوين رابطة فوسفو داي استر‎ Ve . DNA ‏في شويطي‎ vo ‏بين النهايات‎ phosphldiester > ‏ى| وهذا يمكن أن يتم بواسطة أساليب أنتزيمية عكديدة‎ ‏معروفة تشمل الربط عريض النهاية عن طريق‎ .14 ligase ‏ليجاز‎ ‏اتجاءه‎ . DNA ‏يعني اتجاه النيوكليوتيدات في تتابع‎ orientation ‏الاتجاه‎ Yo ‏هو الذي يكون اتجباءه‎ DNA ‏مقلوب ( معكوس ) لتتابع‎ ‏إلى “' في التتابع بالنسبة لتتابع آخر مقلوباً عند‎ Ce ‏الذي تم الحصسول‎ DNA ‏مقارنته بنقطة الرجوع في‎ ‏على التتابع منه . ونقط الرجوع هذه يمكن أن تمل‎ ‏أو‎ DNA Jains ‏المخصصة‎ DNA Glad ‏اتجاه تحول‎ vo

١١ ‏حوامل قابلة للتكاقر‎ (SS) dls Jal ‏تحتوي على التتابع.‎

DNA ‏من نسخة‎ RNA ‏التقليد (النسخة) 0 :: يعني تخليق‎ ‏التحول 0 يعني تحول نوع وراثي للخلية عن طريق الالتقاط‎ ‏الخارجي . ويمكن تحديد التحول في‎ DNA ‏الخلوي ل‎ 1 ‏بعض الحالات عن طريق التغيير في النوع المناخي‎ ‏والخلايا المحولة تسمى محولات . خلايا ما قبل التحول‎ ‏يشار إليها باسم الخلايا الأم.‎ ‏حامل مبلغ الرسالة.‎ RNA ‏النقل (الترجمة) 0 يعني تخليق بولي بيبتيد من‎

Sai wags Shand ale ‏ويمكن أن يشتق‎ ٠١ ‏من عدد من المصادر الخلوية تشمل‎ (GM-CSF) (GM-Colony-stimulating) ‏وسط مكيف من الخلايا وحيدة النواة الموجودة في أطراف الدم ( الدم‎ ‏والنخاع العظمي‎ placental tissue ‏الطرفي ) ؛ الرئة 8 ؛ ونسيج المشيمة‎ ‏سيرم‎ ¢ anemic ‏من المرضى المصابين بالأنتيميا‎ urine ‏البول‎ ¢ bone marrow ‏خلايا طبيعية وسرطانية 0600185016 من النوع الليمفوسيت‎ serum yo . lineage ‏وحيدة النواة‎ phagocyte ‏الفاجوسيت‎ LOLA ‏وسلالة‎ T-lymphocyte © ‏هو خط خلايا 140 المرسب‎ GM-CSF ‏خط خلايا واحد هو الذي يكون‎

CSF 5. 814066 ‏تحت الرقم الكودي‎ ATCC ‏بواسطة ومتوفرة من‎ ‏البشري واحد مصادر‎ CSF ‏المتكون عن طريق خط الخلايا هذا هو بالطبع‎ ‏والمرسب ب‎ UCD MLA-144 ‏المسمى‎ T ‏في العبون هو خط خلايا‎ GM-CSF | ٠٠ ‏سيتمبر ؛‎ XA ‏مرسب في‎ HB 9370 ‏تحت الرقم الكودي‎ ATCC ‏ومتوفر من‎ . a) GAY ‏للاختراع الحالي ؛ استعملت‎ ih GM-CSF Isolate ‏ولغرض فصل‎ ‏أولاً: يتم‎ GM-CSF ‏وسيلة جديدة تتطلب فقط طريقة فحص لنشاط‎

يل

التعرف على الخلايا التي تكون نشاط ‎GM-CSF‏ مثقل ‎LDA‏ ليمفوسيت ‎T-lymphocyte‏ ( أو مصادر أخرى مثل التي ذكرت أعلاه ) . ثم يحمصد ‎mRNA‏ الخاص بالخلية ؛ يفضل استعمال خلايا الليمفوسيت ‎T-lymphocyte‏ . في هذه الحالة يتم فصل ‎mRNA‏ المتحد بغشاء الخلية الذي يحتوي على

‎mRNA °‏ لليمفوكينات 1700101066 من ‎mRNA‏ الحر في الخلايا . ويعتقد أن هذا الفصل يقوي ‎MRNA‏ المجمع ‎٠١ — © collected‏ مرات لتتعابعات الليمفوكين وكذلك يقلل من الجهد المبذول للتعرف على ‎GM-CSF‏ المطلوب . ثم يحضر ‎polyadenylated RNA‏ حامل للرسالة عن ط_ريق كر وماتوغر افو ‎chromatography‏ فوق سيليلوز أوليجى ‎.oligo dt cellulose‏

‎١‏ يحضر ‎cDNA‏ من ‎mRNA‏ باستعمال حامل مناسب للنقل إلى العافل للعمل على تعديل البروتين المطلوب الذي له نشاط ‎GM-CSF‏ . أولاً يحضر شريط ‎cDNA‏ باستعمال طرق تموذجية باستعمال ‎mRNA‏ المحضر أعلاه . ثم يحول هجين ‎RNA/CDNA hybrid‏ إلى صورة ‎cDNA‏ مزدوج الأشرطة . وبعد ذلك يمكن أن يدخل ‎DNA‏ إلى ‎dala‏ مناسب.

‎GM-CSF ‏المفضل لفصسل‎ host-vector ‏الحامل‎ - Jal) ‏يعتمد نظام‎ yo ‏في حامل التحول المناسب . وحامل التحول‎ GM-CSF « cDNA ‏على نسخ‎ ‏إلى الخلايا الثديية‎ DNA ‏المناسب يمكن أن يعتمد على الإدخال المؤقت ل‎ (Mellon. ‏.لا تلوط .لط‎ Gluzman, 1. Maniatis 1981 cell « mammalian cells ‏المطلوبة ؛ فإنه ليس من‎ GM-CSF ‏ولغرض فصل محولات‎ . 27 279-288)

‏المطلوب أن الخلايا تحتوي على جينات خارجية تعمل على تعديل الناتج ‎GM-CSF‏ المطلوب وأنه من الممكن إدخال جينات خارجية بصفة مؤقتة إلى تحت أنواع الخلايا بحيث أن تحت أنواع الخلايا هذه سوف تنسخ ( تعمل على تعديل ) الناتج المطلوب على فترة عدة أيام . ونظراً لأن الدلالة الممكن اختيارها ليمت ضرورية في حامل التحول لنقل ال ‎DNA‏ ونظام

Vy ‏الخارجي يمكن أن يفقد مع نمو‎ DNA ‏النسخ طبقاً للاختراع الحالي فإن‎ ‏أيام بعد تقل‎ Pm ‏أسبوع . مع هذا فإنه بعد ؟‎ ١ - ١ ‏الخلايا على فترة‎ ‏الخلايا الثديية المناسبة فقد وجد النواتج المطلوبة تخلق ويمكن‎ ‏تحديدها.‎ ‎| ‏تطور خطضوط‎ lon ey ‏ونظام العائل - الحامل الأمثل‎ ° ‏خلايا القرد 07-1 المحولة بواسطة جزئ تكاقر فاقد الأمسسل‎ ‏تحتوي خلايا القرد المحولة‎ . (Gluzman, Y., Cell 23 175-182, 1981) 005 (SV40) « ‏؛ ناقص الأصسل‎ CV-1 ‏ناقص يسمى‎ SV40-DNA ‏على‎ CV-1 ‏ولكن تكون مستويات‎ 51740 genome ‏لا تحتوي على نسخة كاملة للجينوم‎ ‏وهي أيضا‎ . 5740 DNA ‏كبير وتسمح بتكاشر‎ 1 antigen ‏عالية من أنتيجين‎ ٠ . ‏تدعم بكفاءة تكاثتر الأجبزاء المحذوفة 5740 في المنتطقة المبكرة‎ ‏التي تحتوي على 5740 أصمسسل‎ bacterial plasmids ‏والبلازميدات البكتيرية‎ ‏كذلك فإن هذا‎ . (Myers, RM. & Tjian, R. 1980 PNAS 77 6491-6495) ‏التكاثر‎ ‎DNA ‏الخارجي المنتقول عن طريق تكاثر‎ DNA ‏النظام يقدم وسيلة لتكبيير‎ ‏والبروتيسن‎ mRNA ‏في وسط (المحدث بواسطة) 53740 بغرض زيادة مستوى‎ ١ ‏خارجي . مع هذا يستعمل أيضاً أنظمة أخرى مشابهة.‎ DNA ‏المنسوخ من‎ - ‏على‎ GM-CSF ‏وبصفة نموذجية تحتوي الحوامل المستعملة في تسخ‎ ¢ introns promoters ‏بادئلت‎ ¢ enhancers ‏عناصر مختلفة (متنوعة ) مثل مساعدات‎ ‏مناطق ؟' ليس لها شفرة ومنتشطات نقل كما‎ polyadenylation ‏مواضع‎ ‏وصف أسفله.‎ ٠ ‏والمساعدات‎ . enhancers ‏مساعدات‎ Joi ‏والحوامل هنا يمكن أن‎

SE ‏تختلف وظيفياً عن البادئات ولكن يبدو أنها تعمل بالاشتراك مع‎ ‏ووظيفتها على مستوى الخلية ليس مفهوماً ولكن خاصيتها الفريدة هي القدرة‎ ‏النسخ ) بدون الاعتماد على‎ ( potentate ‏على تتشيط أو تثقوية التقليد‎

Ve ‏الموضع أو الاتحاد . وتحتاج البادئات أن تكون إلى أعلى من الجين بينما‎ ‏أو م" من البادئ داخل الجيسن في‎ Jef ‏المساعدات يمكن أن توجد إلى‎ ‏إلى أسفل من الجين الذي بين الجين ؛ وموضع‎ intron ‏صورة‎ ‎Jal ‏من موضع إضافة بولي‎ VY ‏إضافة بولي أدينيل أو‎ ‏ليست وظيفية ولكن المساعدات‎ inverted ‏والبادئات المعكوسة‎ . polyadenylation» ‏بمعنى أن لها‎ cis-acting ‏المعكوسة وظيفية المساعدات تعمل في صورة سيس‎

DNA ‏تأثير على المساعدات فقط إذا كانت موجودة على نفس شريط‎ . Khoury etet al, Cell 33:313-314 (1983) ‏العامة للمساعدات أنظر‎ El ‏وتم الحصول على المساعدات المفضلة للاستعمال مع الخلايا الثديية من‎ ‏؛ فيروس بولي‎ 460 Simian Virus ‏فيروس سيميان‎ Jie ‏فيروسات حيوانية‎ ‏أو‎ bovine papilloma virus ‏فيروس ورم الجلد البقر‎ ¢ polyoma virus ‏يومياً‎ ‏وبصفة نموذجية فإن المساعد يجب أن يكون من‎ . adenovirus ‏أدينوفيروس‎ ‎. ‏فبروسات تسمح به خلية العائل بمعنى الذي يصيب عادة الخلايا من النوع ع1‎ ‏ويمكن بسهولة الحصول على مساعدات فيروسية من فيروسات متوفرة‎

Rous sarcoma ‏فيروس‎ (fie ‏بصفة شائعة . ومناطق المساعد لفيروسات عديدة‎ vo - 706 : PY ‏وزملاؤه ؛ الخلية‎ Luciw ‏وفيروس سيميان £1 معروفة جيدا أنظر‎ ٠. ‏وبصفة روتينية في البيولوجية‎ etal, cell 33: 705-716 )1983( (YAAT) ‏ال‎ ‏استئصال هذه المناطق على أساس خرائط التحديد‎ molecular biology ‏الجزيئية‎ ‏المنتشورة للفيروس موضوع التساؤل وإذا لمزم تعديد المواضع للتمكين من‎ ‏توصيل المساعد في الحامل كما هو مطلوب . وعلى سبيل المقال أنظر‎ ٠ (YAAY) 271-51: 48 ‏وزملاؤه ؛ جورنال البيولوجية الجزيئيمة‎ Kaufman

Mol. Cell Biol. 2 )11(: 1304-1319 (1982) et al, J. Mol. Biol, 159:601-621 ‏بديلاً عن ذلك يمكن أن يخلق المساعد من تفاصيل التتابع - أحجام‎ . (1982) ‏صغيرة ) بدرجبة‎ ( bp 150 ‏المساعدات الفيروسية ( عموماً أقل من حوالي‎ ‏كافية بحيث أنه يمكن أن يتم ذلك عمليا.‎ +»

yo ‏عنصر آخر يجب أن يكون موجودا في جمعية الحامل هو موضع‎ ‏وهذا عبسارة‎ . polyadenylation ‏أو إضافة ) بولي أدينئيل‎ ( splicing ‏توصيل‎ ‏موجود إلى أسفل من المناطق المنقولة في الجين - إلى‎ DNA ‏عن تتابع‎ ‏أسفل على مسافة قصيرة عندها يقف التقليد وتضاف ريبونيوكليوتيدات‎

‎adenine ribonucleotides 5‏ لتكون ذيل نيوكليوتيد بولي أدينين ‎polyadenine‏ ‎nucleotide‏ عند النهاية ‎VY‏ في ‎RNA‏ حامل الرسالة وإضافة البولي أدينئيل ‎polyadenylation‏ مهمة في تثبييت حامل رسالة ‎RNA‏ ضد التحلل ‎degradation‏ ‏في الخلية ؛ حدث يقلل من مستوى ‎RNA‏ حامل ‎AL al‏ وبالتالي مسستوى الناتج البروتيني.

‏0 مواضع إضافة بولي أدينيل ‎plyladenylation‏ في الأنوية الحقيقية معروفة .يوجد تتابع ‎concensus‏ على الجينات في الأنوية الحقيقية : ‎La‏ ‏نيوكليوتيسد ‎51-AAUAAA-31 hexanucleotide‏ يوجد على بعد ‎١١‏ -.*؟ نيوكليوتيد من النقطة التي يبدأ ‎Leia‏ إضافة بولي أديتيسل ‎polyadenylation‏ . ويمكن الحصول على تتابعات ‎DNA‏ يحتوي على مواضع إضافة بولي ‎Ji‏

‎polyadenylation yo‏ من فيروسات طبقاً للتقارير المنتشورة . ويمكن الحصول على تتابعات إضافة بولي ‎Ji‏ 0 )0 تا من بيتا جلوبين ‎beta-globin‏ ‏الفأر وفيروسيميان 80 مناطق الجينات المتأخرة أو المتقدمة ولكن يفضل .. مواضع إضافة بولي أدينيل ‎polyadenylation‏ الفيروسية . نظرا لأن هذه التتابعات معروفة ؛ يمكن أن تخلق خارجياً وتربط بالحوامل بصورة

‎Ye‏ مناسبة.

‏والتتابع الذي يفصل موضع إضافة بوني أدينيل ‎polyadenylation‏ عن

‏شفرة إيقاف النتقل يفضل أن يكون تتابع ‎DNA‏ غير منتقول ‎Jie untranslated‏

‏جين النواة الحقيقية الغهير محفز . ونظرا لأن هذه التتابعات والجينات غير

‏| مزودة ببادئ فإنها لا تتسخ . يجب أن يمتد التتابع لمسافة معلومة تصل إلى

‎FURR FN‏ قاعدة من شفرة الوقف إلى موضع إضافة بولي أدينيل ‎polyadenylation‏ ¢ وعموماً فإن تتابع ب ‎yall‏ منقول يؤدي إلى زيادة إنتاجية الناتج ويمكن أن ينتهي الحامل من حوالي 30 ‎bp‏ إلى أسفل من تتابع إضافة بولي أدينيل ‎polyadenylation‏ ولكن يفضل أن يحتفظ بنتابعات ‎٠9‏ ‏م الموجودة إلى ‎Jind‏ من موضع بولي أدينيل ‎polyadenylation‏ في البيفة المتوحشة ‎wild-type‏ . وبصفة نموذجية تمتد هذه التتابعات من ‎5٠٠0‏ إلى ‎>٠٠‏ ‏زوج قاعدة إلى أسفل من موضع إضافة البولي أديتيل ‎polyadenylation‏ ‏ووجود ‎introns‏ الجزء الغير منقول المقلد في الحامل يمكن أن يزيد من انتاجية الناتج . ويمكن الحصول على هذه 101005 من مصادر أخرى عن خلايا الخلايا أو مصادر الجين . فمثلاً يؤدي ‎introns‏ الهجين المتضمسن موضع التوصل ‎V0‏ من ‎intron‏ الثاني في ‎adenovirus tripartite leader‏ وموضع التوصيل ‎١١‏ من جين الجلوبيولين المناعي ‎immunoglabulin‏ الذي يتم إدخاله إلى أسفل من موضع بدء التقليد في ‎adenovirus major latepromoter‏ إلى زيادة إنتاجية الناتج . ‎yo‏ وفي مضمون مفضل لإنتاج ‎GM-CSF‏ وحامل التسخ يوجد جين منشط للنقل . ومنشطات النقل هي جينات تتضمن الشفرة الخاصسة بالبروتين أو نواتج ‎RNA‏ التي على نقل ‎mRNA‏ المطلوب . وأفضل مثال هو الجين المرتبط ب ‎(VAL)-(VA) adenovirus‏ الذي يقلد في فصائل ‎RNA‏ القصير الذي يتداخل (يتفاعل) مع التتابعات في المنطقة الغير منقولة ما في ‎Late mRNAs‏ ‎(Thimmappaya et al, 1982 Cell 31,543( Y.‏ ¢ والتتابعات الضرورية لتتنشيط ‎Jail‏ ‏بواسطة ‎VA RNA‏ تقع داخل ‎mRNA tripartite leaderadenovirus late‏ وتوصسل ‎les adenovirus tripartite leader‏ من مناطق غير متلاصقة في جينوم ‎adenovirus genome‏ وموجودة على ‎Yo dll‏ في نسخ ‎adenovirus‏ الكييسر المتأخرة . ويمكن أن يتداخل (يتفاعل) ‎lay ul VA RNA‏ نقل ‎mRNA‏ الذي

VY

‏المفضسل‎ cDNA ‏كذلك يحوي اتحاد‎ . tripartite leader ‏يحتوي على تتابع‎ ‏وجينات‎ tripartite leader ‏وحامل النسسخ على الصسورة الموصلة في‎ .VA RNA adenovirus ‏أدينوفيروس‎ ‏يمكن أن تخلق هذه الحوامل بطرق معروقة جيداً لهؤلاء المهرة في‎ ‏الفن ويمكن الحصول على مكونات الحوامل مثل مساعدات ؛ بادثشات وما‎ ٠ ‏شابه من مصادر طبيعية أو تخلق كما وصف أعلاه . وأساساً فإنه إذا وجدت‎ ‏بكمية كبيرة مثل مكونات مثل وظائف فيروسية أو إذا‎ DNA ‏المكونات في‎ ‏مواضع إضافة بولي أديتيل «مثتتةالجدعفة راد‎ Ja ‏كان يمكن تخليقها‎ ‏حينئذ فإنه مع الاستعمال المناسب لأنزيمات التحديد يمكن الحصول على كميات‎ ‏كبيرة من الحامل ببساطة عن طريق استزراع مصدر الكائن الحي الدقيق‎ ٠ ‏مناسب ؛ فصل‎ endonuclease ‏الخاص به بواسطة أندوني و كلييز‎ DNA ‏وهضم‎ ‏المحتوي على العنصر المطلوب وتكرر‎ DNA ‏والتعرف على‎ DNA ‏أجزاء‎ ‏العملية . وعادة ينسخ حامل التحول بكمية صغيرة وثم يربط مع حامل‎ ‏بلازميد نواة أولية أو‎ a ) ‏تخليق مناسب متناسل أتوماتيكياً ( من تلقاء نفسه‎ ‏في معظم الحسالات ؛ أنظر‎ pBR322 ‏فاج 00886 ويمكن استعمال بلازميد‎ ve

Kaufman et al.,oP. cit. ‏وتستعمل حوامل التخليق لاتحاد حوامل التحول المربوطة بصورة‎ ‏عن طريق نقل كائن حي دقيق ذو نواة أولية؛ تكاشر حامل‎ ie ‏مناسبة‎ ‏التخليق إلى عدد عالي الشفرة وإعادة تخليق عن طريق تحلل الخلية‎ ‏وفصل حامل التخليق من بقايا الخلية.‎ vy, ‏المحضر من الخلية الذي له تشاط‎ cDNA ‏تتقل الحوامل المحتوية على‎ ‏بمعدل‎ Petri dishes ‏ويوضع على شرائح على أطباق بتري‎ E.coli ‏إلى‎ GM-CSF ‏على مرشح نيتروسسليلوز‎ Gl pari wall ‏ميرلا مستعمرة في الطبق تترك‎ ‏وبعد‎ . master ‏إلى شريحة جديدة تحفظ كرئيلس‎ xd yell ‏وينقل‎ nitrocellulose

YA

‏استزراع هذه المستعمرات يتم عمل ذريات وتنضم إلى الأصلية بعناية بحيتث‎

OE ‏يتم التعرف على أجزاء من مرشحات التناسل عن طريق الجزء‎ ‏في الشريحة الرئيسية.‎ ‏يقطع كل مرشح تكاثر إلى أجزاء تحتوي على عدد سبق تحديده م‎ ‏مستعمرة لكل جزء ؛ يتم‎ 550 = You ‏المستعمرات لكل جزء ويفضل حوالي‎ 5 ‏تجمسع‎ » L-Broth ‏مسح المستعمرات من كل جزء في وسط مقل شوربة‎ ‏ثم يتم نقل بلازميد‎ . DNA ‏البكتيريا بالطضرد المركزي ويتم فصل بلازميد‎ ‏من كل جزء إلى عامل مناسب لنسخ البروتين . وحامل التخليق‎ DNA ‏الذي حذف منه‎ 25. coli ‏في‎ pBR322 ‏المفضسل هنا هو سلالة من بلازميد‎ « Kaufman et al, op. cit ‏التتابعات التي هي ضارة للخلية ذات النواة الحقيقية . أنظر‎ > ٠ ‏يوضح استعمال هذه السلالة أي حاجة لحذف بقايا البلازميد قبل التقل ؛‎ ‏ويشير الفقحص‎ . CSF ‏وبعد استزراع الخلايا المتقولة يختبر الوسط لنشاط‎ ‏الإيجابي أن المستعمرة المحتوية على 057/0078 هي على جزء خاص من‎ ‏المرشح.‎ ‏ولتحديد أي من الأقطاب على جزء المرشح الرئيسي الأمصسلي يحتوي‎ Vo ‏كل قطب على جزء المرشح يلتقط وينمي . ثم توضع‎ . GM-CSF/eDNA ‏تحضر بقع من صف أفقي وعامود رأسي من‎ . matrix ‏المزارع في‎ ‏من كل مزرعة مجمعة وتتقل إلى خلايا‎ DNA Clie past. matrix . GM-CSF hail ‏للنسخ . فحصت المواد العائمة من هذه البقع‎ JA) ‏؛‎ GM-CSF ‏عامود رأسي واحد وبقع صف أفقي نقفاط‎ daly ‏يجب أن يكون‎ ٠ ‏وإذا كانت‎ « GM-CSF/cDNA ‏وسوف يحتوي القطب الشائع لهذه القع على‎ ‏تحتوي على أكثر من قطب إيجابي واحد ؛ فسوف يكون هناك‎ matrix ‏أكثر من عامود وصف واحد إيجابي . في هذه الحالة يكون من‎ ‏الضروري مزيد من فحص عدد صغير من الأقطاب.‎

يستأصل ‎GM-CSF/cDNA‏ من الأقطاب عن أنزيمات تحديد ويمكن أن يتتبع بطرق معروفة . ويمكن بسهولة أن يقدر أن الطريقة المومصسوفة هنا يمكن أن تستعمل للحصصول على ‎GM-CSF‏ من أي مصدر . وتتابع ‎DNA‏ ‏الكامل الخاص ب 014-057/00178 طبقاً للاختراع موضح في الشكل ‎١‏ مع م تتابع الحمض الأميني المتوقع الخاص بناتج البروتين ‎GM-CSF‏ المتقول ؛ ويمكن تعديل ( تطوير ) تتابع ‎DNA‏ الذي به سفرة البروتين الذي له نشاط ‎lls GM-CSF‏ للاختراع الحالي مثل الموضح في الشكل ‎١‏ عن طريق طوق مناسبة لتكوين تتوعات ( خلافات ) مكافئة وظيفية في بروتين ‎GM-CSF‏ ‏النهائي الذي أضيف فيه واحد أو أكثر من الأحماض الأميئنية ؛ تستبدل أو ‎٠‏ تنتزع بدون التأثير على نشاط ‎GM-CSF‏ الأولى من تجربة النخاع العظمي (البتشري) الموصوفة هنا . كذلك على سيل المثال يمكن استدال ت ‎CF‏ ‏؟؛ أو © أحماض أمينية ‎amino acids‏ بواسطة أحماض أمينية أخرى . تصسف براءة الاختراع البلجيكية رقم 494,015 المدرجة هنا بعد الإستئذان طريقة واحدة نموذجية لاستبدال سيستين ‎cysteine‏ بواسطة ‎Sia‏ سيرين ‎.serine‏ ‏يشمل ‎lia GM-CSF/cDNA‏ لهذا الاختراع جين ‎GM-CSF/cDNA‏ ‏مسبوق بواسطة كودون ‎ATG codou‏ وشفرة ‎GM-CSF/CDNA‏ لأنواع ‎Atlas‏ من بروتين ‎GM-CSF‏ . وقرين 11616ه واحد موضح بلكامل في الشكل ‎١‏ ؛ قرين آخر اكتشفناه له بقية تيميدين ‎thymidine‏ عند الموضع ‎Ya 0 ْ‏ من شق الثيميدين ‎thymidine‏ الموضح في الشسكل ‎Jody.)‏ ‎٠‏ - بروتين ‎GM-CSF‏ لهذا الاختراع ‎(Fi da‏ ميثيونين ‎l-methionine ١-‏ من بروتين ‎(Met-CSF)GM-CSF‏ وأنواع متماثلة لبروتين ‎GM-CSF‏ . وبروتين ‎GM-CSF‏ الناضج بالتتابع في الشكل ايبدأ بالتتابع ***خملحم ‎Ala* Ala*‏ بدايته مشار إليها بالسهم بعد العدد النيوكليوتيدي 59 في الشكل ‎١‏ . وسوف يبدأ ‎GM-CSF‏ بالتتابع ****ويم ‎Met* Ala* Pro*‏ والأنواع المتمائلة موضحة ‎Ye‏ بالكامل في الشسكل ‎le)‏ شق حمض أميني رقم ‎٠٠١‏ ( بداية من ‎Ala‏ بعد السهم )

‏ويمكن‎ ٠٠١ ‏عند الموضع‎ lle ‏نوع آخر له شق‎ . CSF-Thr ‏ويمكن أن يشار إليه‎ ‏للاختراع الحالي له نشاط‎ GM-CSF ‏أن يشار إليه باسم 658116 . بروتين‎ ane ‏وحدة‎ ٠١ x 4 ‏وحدة / مجم من البروتين على الأقل ويفضل‎ Ve ‏خاص‎ ‏على الأقل عند الفحص بخلايا النتخاع العظمي البشرية.‎ ‏يمكن أن تكون لنواة أولية‎ GM-CSF mud ‏وأنظمة العائل - الحامل‎ ‏يكون نظام النسخ الثديي المفضل . ويتم‎ GM-CSF ‏أو حقيقية ؛ ولكن مزيج من‎ ‏بسهولة النسخ عن طريق تحويل خلايا ذات أنوية أولية أو أنوية حقيقية‎ .014-057 ‏بواسطة حامل‎ ‏الذي تم الحصول عليه بالطريقة الموصوفة‎ DNA ‏ويمكن نتسخ تتابع‎ ‏أعلاه مباشرة في الخلايا التديية تحت سيطرة بادئ مناسب . ويمكن‎ ٠ ‏معروفة جيداً لهؤلاء المهرة في الفن ؛ ولكي‎ AL Se ‏استعمال بادئات غير‎ ‏خميرة يجب انتزاع‎ LDA ‏في خلايا ذات نواة أولية أو‎ GM-CSF ‏ينسخ‎ ‏في‎ - N ‏التتابع المرشد ( أو التتابع المفرز ) . وموضع الكودون في النهاية‎ ‏ويمكن أن يتم ذلك باإستعمال طرق‎ . ١ ‏موضح في الشكل‎ GM-CSF ‏بروتين‎ ‎GM-CSF ‏نموذجية معروفة لهؤلاء المهرة في الفن . بمجرد الحصول على‎ ١+0 . ‏متاسب ونقل الحامل إلى خلية عاثل مناسب ؛ اختيار‎ Jala ‏مثل إدخال‎ . GM-CSF ‏الخلايا المحولة وزراعة هذه المحولات للعمل على تعديل نشساط‎ ‏وخلايا‎ CHO ‏؛ الخميرة “تديية مقل‎ E.coli Jin ‏تشمل خلايا العائل المناسبة‎ ‏المتكون يمكن أن يكون به‎ GM-CSF ‏كذلك فإن بروتين‎ cl yal . ) Met-CSF ‏مجموعة ميثيوتنين عند النهاية 17 - في البروتين ( هنا يسمى‎ Y. ‏والبروتين الناضج المتكون بواسطة الخلايا ذات الأنوؤية الأولية والأنورية‎ ‏الحقيقية سوف يكون مطابق في تتابع الحمض الأميني ولكن الناتج ذو النواة‎ ‏إلى نفس الحد أو حد مختلف كما في‎ glycosylated ‏الحقيقية يمكن أن يكون‎

GM-CSF ‏الناتج الطبيعي . وهناك طرق مختلفة للحصسول على بروتين‎

‎lid‏ للاختراع موضحة في الأمثلة فيما بعد . طرق أخرى أو مواد ‎Jt‏ ‏حوامل سوف تكون واضحة بسهولة لهؤلاء المهرة في الفن على ‎old‏ ‏الأمئلة والوصف القادم. يمكن إعادة تنتشيط بروتين 014-087 الذي تم نسخه في خلإيا ذات م أنوية أولية أو أنوية حقيقية عن طريق طرق تتقيبة وفصمل معروفة لهؤلاء المهرة في الفن . مع هذا فقد اكتشفت أيضاً عملية تتقية مفضلة تساعد بروتين ‎GM-CSF‏ من كل من مصادر تغييبر النسوع الورائي والمناخي على الخلية ومصادر طبيعية لكي يتم الحصول عليه في درجة نقاء ونتشاط عالية ووصفت أسفله. ‎"١‏ ملخص لعملية التنقية المفضلة: يغطي الاختراع الحالي مشاكل التقنية السابقة ويقدم طريقة لتتقية بروتين له نشاط ‎GM-CSF‏ . وبروتين ‎lis GM-CSF‏ للاختراع الحالي له نشاط خاص ‎٠١ XY‏ وحدة على الأقل / مجم من البروتين ويفضل على الأفضل " ‎٠١‏ وحدة / مجم من البروتين وذلك عندما يفحص في تجربة ‎ye‏ النخاع العظمي البشري. وطبقاً للاختراع الحالي طريقة لتنقية بروتين 014-088 تتضمن ‏ . ترسيب البروتين بواسطة كبريثات أموتنيوم ‎ammonium sulfate‏ عند درجسة تشبع 7680 لتكوين كريات تحتوي على بروتين ‎GM-CSF‏ ؛ إعادة تعليق الكريات في محلول متعادل عند أس هيدروجيني ‎pH‏ بمعدل حوالي + إلى ‎٠‏ حوالي ‎A‏ . استعمال المحلول المتعادل المحتوي على ‎GM-CSF‏ على عامود كروماتوغرافي والإستحلاب بواسطة محلول متعادل يحتوي على كلوريد صوديوم ‎sodium chloride‏ وجمع الأجزاء التي لها تشاط ‎GM-CSF‏ « جمع الأجزاء النشطة ؛ استعمالها على عامود الطبقة العكسية ‎C4 reverse phase‏

والاستحلاب بواسطة .أسيتو ‎acetonitrile Ji yi‏ جهد ‎jaa‏ — 9690 لجمع الجزء النشط. وصف مختصر للرسوم المتعلقة بعملية التنقية: الشكل © يوضح تحليل ‎SDS-PAGE‏ للبروتين المتقي ‎CSF‏ ‏° وصف تفصيلي لعملية التنقية: لتنقية بروتين ‎GM-CSF‏ طبقا لعملية الاختراع - يمكن أن يشتق من أي من المصادر الطبيعية الموصوفة أعلاه كمصادر أولية لعملية ‎DNA Jad‏ صناعيا للخلية لأجل تغيير ‎Sos dp sd‏ والمناخي على الخلية ويلتف على طول ‎DNA‏ الطبيعي ‎fie.‏ خط خلايا 140 أو خلل_ط خلايا ‎.UCD MLA-144 Gibbon ٠‏ بديلاً عن ذلك يمكن تكون بروتين ‎GM-CSF‏ باستعمال طرق ‎Ja‏ ‎DNA‏ إلى الخلية من أجل تغيير النوع الوراثي والمناخي على الخلية ‎lg‏ ‏ويمكن أن ينفي ‎GM-CSFs‏ من أي مصدر ‎١‏ لاختراع الحالي ‎٠‏ ويفضل أن ‎ye‏ يكون الوسط المناسب (المكيف) من أي مصدر ‎GM-CSF‏ مركزا عن طريق فوق الترشيح إلى تركيز بروتين ‎١01‏ مجم بروتين / مل على الأقل ثم يرسب البروتين بإضافة كبريتات أمونيوم حتى 9680 تشبع ؛ يعاد تعليق الكرية الناتجة في محلول ماني متعادل عند أس هيدروجيني ‎pH‏ في المعدل من حوالي + إلى ‎A‏ . وتشضمل أمقلة المحاليل المعادلة المناسبة ترايس ‎y,‏ هيدروكلوريد ‎HEPES, Tris-Hel‏ « سترات صوديوم ‎sodium citrate‏ وما شابه. ويجعل المحلول المتعادل وظيفيا عن طريق ‎Jy 8 giles S‏ العامود . والمواد لمناسبة للاستعمال في كروماتوغرافي العامود هي ‎Ji of‏ سسيؤفاروز ى| ‎DEAE » octylsephrose‏ التروجيل ‎ultrogel‏ ؛ ‎AcA-44‏ التروجيل وما شابه .

YY

‏ويمكن استعمال واحد أو أكثر من هذه المواد على التوالي للحصول على‎ ‏درجة تقاء أعلى.‎ ‏جمعت أجزاء‎ . GM-CSF ‏جمعت وظائف من كل عامود وفحصت لنشاط‎ « (TFA) trifuoroacetic acid ‏النشاط وخففت بواسطة ثالث فلورو حمض أسيتيك‎ ‎٠‏ هيبتا فلورو حمض بيوتيريك ‎(HFBA) preferably‏ أو ما شابه ؛ واستعملت على عامود الطبقة العكسية ,© . ثم استحلب نشاط ‎CSF‏ بامستعمال أسيتو نيتريل 6 جهد صفر - 9690 في ‎TFA‏ أو ‎HFBA‏ « ويفضسل في تركيز ‎960.٠0‏ أو 960,15 (حجم / حجم ) على التوالي ؛ اعتماداً على حسب الحمض الذي استعمل لجمع الأجزاء المتجمعة على العامود. ‎١‏ حللت الأجزاء التي لها نشاط ‎GM-CSF‏ عن طريق الفصسل الكهربي بالبولي أكريل أميد جيل ‎SDS polyacrylamide gel‏ ( ,9617 جيل كما وصسف بواسطة ))1970( 680 ,227 ‎Tammi, U. Nature‏ . معالجات إضافية باستعمال مواد عامود الكروماتوغرافي المذكور يمكن أن تزيد من تتقية بروتين ‎GM-CSF‏ لجين التجانس. ‎vo‏ وقد أعطى بروتين ‎GM-CSF‏ المجزاً بواسطة ‎SDS PAGE‏ بروتين ‎GM-CSF‏ غير متجانس له وزن جزيئي ظاهري في معدل حوالي 19,0060 حتى ‎٠‏ ‏حوالي 16,000 دالتقون . وعدم تجانس الحجم الظاهري هذا ناتج عن ‎extensive glycosylation‏ للبروتين وهي صفة عامة للجليكو بروتين . وأعطلت تجزأة العينات الأقل نقاء من الوسط المكيف لخلايا ‎Mo‏ بواسطة ‎SDS PAGE‏ ‎Ye‏ (تحت ظروف غير اختزالية) وفحص البروتين المستحلب من الجيل - وجود بروتين ثاني له نشاط 057 له وزن جزيئي ظاهري حوالي 78.0060 إلى م ‏ويتحد نشاط ‎GM-CSF‏ ويستحلب من أوكتيسل سيفاروز ‎DEAE, octylsepharose‏ التروجيل وعامود الطبقة العكعسية 04 . يتعد

Y¢ 9650 ) sepharose ‏سيفاروز‎ Con-A ‏مع‎ GM-CSF ‏عشوائياً % من نشاط‎ ‏ويمكن أن يستجلب بواسطة ميقتيسل مانوريد‎ ( flow through ‏سريان‎ ‎.methylmannoside ‏الذي يتم إدخاله للخلية لكي‎ CSF ‏أعطى تحليل الوزن الجزيئي ل‎ ‏م يغير من النوع الوراثي والمناخي على الخلية - عن طريق ترشيح الجيل‎ ‏من التشاط يستحلب بواسطة وزن‎ 967٠0 ‏أو حوالي‎ patie ‏في تركيز ملح‎ ‏ولكن 96760 من المادة يتصرف في صورة‎ ١9,0660 dea Cena ‏جزيئي‎ ‏وإذا‎ . YA ee ‏يستحلب عند الموضع المقابل لوزن جزيئي حوالي‎ + 355 ‏مول كلوريد صوديوم في هذا العامود » فإن كل النشاط يستحلب في‎ ١ ‏تضمن‎ ‏دالكون.‎ ١ ‏قمة عريضة عند حوالي‎ : ‏على الأقل عند تحضينه عند "م‎ del) 7 ‏المنقى ثابت لمدة‎ GM-CSF ‏في ؟ مولار جوانيدين هيدروكلوريد‎ ) 1.6 pH ‏أس هيدروجيني‎ ( ‏مليمولار ؟-‎ ٠١ 12018 ‏مليمولار » إديتا‎ ١ ‏في‎ guanidine hydrochloroide . ethanol Js) ) ‏في 9670 ( حجم / حجم‎ 2-mercaptoethanol ‏ميركابتو ايثانول‎ trifluroacetic acid ‏أيضاً ثابت في ثالث فلورو حمض أسيتيك‎ CSF ‏ونشاط‎ yo ‏أسيتونيتريل‎ + ١ TFA ‏؟ ) و‎ pH ‏أس هيدروجيني‎ ( (TFA) 960١ .) ‏حجم [ حجم‎ ( 9670 acetonitrile ‏طبقاً للاختراع الحالي بوصسف‎ GM-CSF ‏وكما قيل سابقاً فإن بروتين‎ ‏نقص خلايا‎ Jie myelosuppression ‏النخاعي‎ bill ‏للاستعمال في علاج‎ ‏على‎ ) symptomatic ‏(عرضياً‎ granulocytopenia ‏كرات الدم البيضاء المحببة‎ ٠ radiation ‏أو الإشعاعي‎ chemotherapeutical ‏سبيل المثال بسبب العلاج الكيماوي‎ ‏الخاصة بالاختراع‎ GM-CSF ‏للسرطان . بالإضافة إلى ذلك فإن بروتينات‎ ‏توصف للاستعمال في علاج العدوى (الإصابات الشديدة) ولهذا الاستعمال كما هو‎ ٠٠٠١ ‏إلى‎ 7٠0 ‏مشار فإن الجرعات النموذجية الموصوفة هي حوالي‎

Yo ‏في المريض في الوريد‎ GM-CSF ‏ميكروجرام / مريض . ويفضل حقن بروتين‎ ‏على هذه الحوامل محلول الملح‎ AL SY ‏في حامل صيدلي مناسب ؛ وتشمل‎ ‏الإنسان في محلول ملح.‎ serum ‏الصسيدلي وزولال سيرم‎ ‏الخاصة بالاختراع لها‎ GM-CSF ‏بروتينات‎ old ‏بالإضافة إلى ذلك‎ ‏ينشط خلايا‎ murine GM-CSFs ‏أنشطة واستعمالات أخرى . فمثلاً قد بين أن‎

GM-CSFs ‏كرات الدم البيضاء المتعادلة للصيغة . كذلك فإنه من المتوقع أن‎ ‏خلايا كرات الدم البيضاء‎ Lad ‏الأول الخاص بالاختراع الحالي سوف ينشط‎ ‏متضاعفة . ففي‎ GM-CSFs ‏المتعادلة للصيغة ؛ لذلك فإن الوظائف الفسيولوجية ل‎ gy lS ‏هذا الليمغوكين يمكن أن ينبسه‎ bone marrow ‏النخاع العظمي‎

Tyan ‏الخلايا المؤثرة على مناعة العائل ؛ بينما في أطراف الدم يمكن‎ ٠

GM-CSF ‏خلايا جديدة ومتواجدة في استجابة متاعية محددة يمكن أن يحتفظ‎ ‏بخلايا كرات الدم البيضاء المتعادلة للصيغة التي تدور في الدم في أو بعيداً‎ ‏عن مناطق الالتهاب . ويمكن أن يحدث تحديد غير مضوط و أو‎ ‏تتشيط لكرات الدم البيضاء المتعادلة للصيغة في الفسيولوجيا المرضية لنوعية من‎ ‏م الاضطرابات المحدثة بالجهاز المناعي مثل الروماتويد المفصلي.‎ ‏علاوة على ذلك يفهم الاختراع بالرجوع إلى المضامين التوضيحية الآتية‎ ‏على أنها محددة للإطار الحقيقسي‎ BE ‏التي هي تمثيلية فقط ويجب ألا‎ ‏للاختراع كما وصف في عناصر الحماية.‎ ‏وفي الأمثلة إذا لم يخصص غير ذلك فإن درجات الحرارة يعبر عنها "م.‎ ‏تستعمل اندونيوكليوتييزات تحديد تحت الظروف وبالطريقة الموضحة‎ >. ‏بها بواسطة الموردين التجاريين . تفاعلات الربط تجري كما وصف بواسطة‎ : ‏؛ الاختراع المدرج هنا بعد الاستئذان بامستعمال‎ Maniatis et al.,supra at 245-6

GS ‏فيه واستعمال‎ YET ‏كما وصف في صفة‎ buffar ) ‏البفر ( محلول منظم‎

DNA ‏ميكروجرام / مل في درجة حرارة 77م بالنسبة ل‎ ٠٠١ - ١ ‏من‎ DNA

عرض النهاية 6٠م‏ بالنسبة ل ‎DNA‏ ذو النهاية العضوية . أجبري الفصسل الكهربي في جيل أجاروز ‎١,5‏ - 961,5 يحتوي على 40 مليمول ترايس بورات ؛ ‎٠١‏ مليمول إديتا ‎JS.

EDTA‏ 0118 المحمل إشضعاعياً محمل بواسطة ‎Pp‏ مهما كان نوع ( طريقة ) التحميل المستعملة. ‎paxil)” °‏ السريع ‎"rapid prep‏ قصد 43 إنتاج على نطاق صسغير للبإكتكروفاج ‎bacteriophage‏ أو بلازميد ‎DNA plasmid‏ مثل كما وصف بواسطة ‎supra, at p. 365-373‏ .لخ ‎Maniatis et.‏ المثال أ خطوة ‎١‏ : مزارع خط ‎Mo LDA‏ ‎Ve‏ نميت خلايا ‎(ATCC CRL 8066) Mo‏ بصفة روتينية في ألفا ( ثاني أوكسيد كربون 966 ) أو وسط اسكوفي ‎iscovels‏ ( ثاني أوكسيد كربون + )%( يحتوي على سيرم ‎serum‏ جنين البقر 9670 ‎(FCS)‏ ؟ مليمولار جلوتامين ‎٠٠١ ¢ glutamine‏ وحدة / مل ستربتوميسين 507601007010 و ‎٠٠١‏ ميكرو جرام / مل بنسلين ‎penicillin‏ يجب استزراع الخلايا (تحت استزراع) كل ؛ - ‎٠‏ أيام . ‎yo‏ تعد الخلايا وتبذر في كئوس فالكون ‎Falcon flasks‏ 1-175 في ‎You - ٠٠١‏ مل من وسط ‎ALK‏ - ؟ ‎Yoox‏ خلية / مل سوف تتضاعف الخلايا في ‎FCS‏ ‎7٠‏ كل 4 - ‎pV‏ معدل النمو ليس ثابتاً ويمكن أن تظهر الخلايا في بعض الأحيان أن نموها يتوقف ثم يعود مرة ثانية في صورة دفعات . يمكن أن تتمي خلايا 140 في وسط خالي من السيرم . والبقاء يكون أفضل عندما .الا تغسل الخلايا عند نقلها من 705 إلى وسط خالي من السيرم . والكثافة ‎Jie)‏ في وسط خالي من السيرم ‎"٠١ X 0 = (SF)‏ خلية / مل سوف تتمو الخلايا بدرجة طفيفة ( أو على الأقل تحتفظ بعدد ثابت ) لمدة “ أيام في وسط خالي من السيرم وثم تغذى بواسطة ‎FCS‏ 9670 لمدة ؛ أيام على

الأقل . يمكن تكرار خط النمو هذا ‎ (‏ أيام ‎«SF‏ § أيام 960705 ) أسبوعيا إذا لزم وسط ‎SF‏ بدون ضرر واضح للخلايا أو عدة شهور. خطوة ¥ : تجربة نشاط ‎GM-CSF‏ ‏= تجربة نخاع العظام : أحصل على نخاع عظمي طازج . اكسرشويكات بالسحب من خلايا إبرة فتحة ‎7١‏ ؛ 77 ثم ‎Yo‏ خفف ‎١:١‏ بواسطة محلول ملح معقم متعادل بالفوسفات ‎(PBS)‏ (درجة حرارة الحجرة) وضعها في طبقة فوق ‎Ficoll-Paque‏ ‏( حوالي ‎Vo‏ مل ‎BM-PBS‏ فوق ‎١‏ مل ‎(Ficoll‏ . أعزل بمعدل ++ ‎Yo‏ 0111 لمدة ‎fo‏ دقيقة في درجة حرارة الحجرة . أنزع الدهون وطبقة ‎PBS‏ وأعزلها ‎٠‏ أسحب من خلال سحابة طبقة قليلة الكثافة ؛ أغسل ‎2x‏ بواسطة ‎PBS‏ وعد ضع الخلايا في وسط ‎RPMI‏ ( المتشترى من جيبكو ‎GIBCO‏ في 1640 ‎RPMI‏ ( ‎FCS) 96٠0 111705 +‏ موقف نشاطه بالحرارة ) لمدة * ساعات لانتزاع الخلايا الملتصقة. الوسط المستعمل في الشرائح (طازج): ‎yo‏ 9701025 96 أجار مذاب في ماء مبرد لدرجة ‎SE‏ ‎901١ 5‏ تركيز نهائي ‎٠٠١‏ وحدة / مل ستربتوميسين ؛ ‎٠٠١‏ ميكروجرام مل بنسلين. 41 ألا ثيوجليسرول في 10721 ‎2x Iscoves from‏ ‎٠.‏ برد الأجار لحوالي 556 أم ؛ خلط المكونات الأخرى. برد في حمام ماء لحوالي 7 - 78م وأمسك في درجة الحرارة هذه. بعد " ساعات اسحب من خلال سحابة الخلايا الغير ملتصةة . أعزل وعد . أضيف ‎7٠١ XY‏ خلية / مل من وسط الشريحة واحفظ في حمام بارد ذو درجة حرارة منظمة عند ‎١7‏ - 78م . أضيف عينات

YA

‏ميكرولتر العينة ) إلى الصف‎ ٠١ ‏؛ غالبا‎ Alp ia ‏وسط من خلايا‎ Je) ‏من‎ fly Seow ‏في أزواج . أضيق‎ microtiter ‏الأول من أوعية شريحة‎

Wa ‏ميكرولتر إضافية من معلق‎ ٠٠ ‏معلق خلايا إلى كل وعاء . أضيف‎ ‏ميكرولتر من المحلول‎ 5٠ ‏وانقل‎ Ll ‏إلى كل وعاء في الصف الأول . اخلط‎ ‏؟ على‎ : ١ ‏مه .من الصق الأول إلى الصف الثاني .. الخ واستمر تخفيفات‎ ‏يوماً في ثاني‎ ١4 = ٠١ ‏الشريحة . لف الشريحة في فيلم من الخارج ؛ حضن‎ ‏7م في غلاف مجفف تماماً وأرصد المستعمرات.‎ 96٠0 ‏أوكسيد كربون‎ ‏لرصد المستعمرات يعد العدد الكلي من المستعمرات الذي ينمو في كل‎ ‏وعاء في كل تجربة ؛ توضع عدة أوعية على شرائح بدون عينة‎ ‏([صورية ) للحصول على عدد لمستعمرة ( خلفية ) . يتم طرح متوسط‎ ٠ ‏عدد المستعمرات التي تتمو في الأوعية الصورية من عدد المستعمرات‎ ‏هي‎ GM-CSF ‏الموجودة في كل من الأوعية المحتوية على عينات . وحدة‎

TV ‏الكمية التي تتبه تكوين مستعمرة واحدة فوق المستوى الأساسي لكل‎ ‏مل ) عندما‎ / 7٠١ ‏عظمي بشري ( توضع على شرائح بمعدل‎ glia ‏خلية‎ ‏يكون تركيز 614-0575 تحت درجة التشبع . يتم تحديد تركيز تحت التشقبع‎ \e ‏بالتغفيف ومقارنة المستعمرات في تركيزات مختلفة لإيجاد التركيز الذي هو‎ ‏تحت مستوى التشبع بالضبط.‎ ‏ولهذه التجربة يتم عد المستعمرات التي تحتوي على خلايا كرات دم‎ ‏ويتم تحديد أنواع‎ LOAN ‏التوعين من‎ BS ‏بيضاء محببة ؛ مونوسيت أو‎ ‏الخلايا في هذه المستعمرات بالتقاط مستعمرات وصيغ الخلايا الفردية.‎ _ 1626-1 ‏تجرية خلية‎ -¥

Cells (Blood, Vol. (Y3A+) ¥ ‏تتمي خلايا 66-1 ( الدم - جزء 0% » رقم‎ ‏مر 2# في الأسبوع وبذر لكل‎ 96٠0 FCS + 1860788 ‏في وسط‎ ( No. 3 )1980( ‏خلية / مل ) . استعملت الخلايا للتجربة بين المرور‎ ٠١ XY ‏مرور بمعدل‎

Yq ‏والتجربة كانت تماما كما في تجربة النخاع العظمي التي وصفت‎ . ©© - ©

Ve xf ‏وضعت على شرائح في خليط أجار بمعدل‎ KG-1 LDA ‏أعلاه فيما أن‎ ‏خلية / مل ؛ يتم تحديد عدد المستعمرات التي تنمو في كل وعاء ويتم طرح‎ ‏العدد الأساسي كما في تجربة النغاع العظمي الموصموقفة أعلاه تعرف‎ ‏الذي ينبه نصف الحد الأقصسى‎ CSF ‏مل بتركيز‎ / KG-1 GM-CSF ‏وحدة‎ © ‏لعدد (تشبع) مستعمرات 1606-1 لكي تنمو . ويتم الحصسول على الحد‎ ‏في عدة أوعية.‎ GM-CSF ‏الأقصى للعدد باحتواء مستوى تشبع‎ p91023(B) Jala ‏خطوة ¥ : تركيب (تكوين)‎

Cell Biol. 2(11):130- ‏بواسطة‎ pAdD26SvpA(3) ‏وصف حامل التحول‎

VO Sl ‏وكان له التركيب الموضح في‎ . 1319 ]1982 [ Kaufman at al. Mol. ٠ ‏ثاني هيدروفولات ريدككاز‎ plasmid ‏باختصار يحتوي هذا البلازميد‎ ‏الذي هو تحت التحكم‎ cDNA ‏في جين‎ (DHFR) ‏الفأر‎ dihydrofolate reductase ‏وموضع التوصيل م"‎ Promoteradenovirus 2 (Ad2) major late ‏النقلي ل‎ ‏أدينوفيروس 8 وموضع التوصيل ¥ مشتق من‎ DNA ‏موجود في‎

Jatepromoter Ad2major ‏المتاعي موجود بين‎ immunoglobulin ‏جين أميون جلوبولين‎ ve ‏وموضع إضافة البولي أدينيل المبكرة 51740 موجود‎ DHFR ‏والتتابع الكودي‎ ‏المشتق من‎ (3) pAdD26SVPA ‏جزء‎ . DHFR coding ‏من التتابع الكودي‎ Jind ‏إلى‎ ‎Maniatis, T. 1981. Cell 27:279-288) pBVOd (mellon, P. Parker, V., Gluzman Y.

Soda df ‏المعروف‎ pBR322 ‏ولا يحتوي على التتابعات‎ 0 .1981, Nature (London) 293:70-81 (Lusky, 11. and Botchan. M. ‏الخلايا الثديية‎ ٠٠ ‏كما هو موضح‎ pCVSVL2-TPL ‏إلى بلازميد‎ pAdD26SVPAG) ‏يحول‎ ‏(3إذم267طهوهم‎ (d) ‏يحول إلى بلازميد‎ pAdD26SvpA(3) . ¥ ‏في الشكل‎ agli ‏في 080026508 . ويتم ذلك‎ Pstl ‏بحذف واحد أو ¥ من مواضع‎ ‏باستعمال نقص نشاط الأنزيم بحيث يتم الحصسول‎ ( Pstl ‏الجزئي بواسطة‎

Ye ‏واحد‎ Pstl ‏من بلازميدات خطية فيها ينشطر موضع‎ subpopulation ‏على‎ ‎cae Dl ‏الربط لإعادة دوران‎ « Klenow ‏فقط ) ؛ ثم المعالجة بواسطة‎ ‏من‎ VV ‏الموجود في الموضع‎ Pst] ‏والفحص لحذف موضع‎ Eo coli ‏تحول‎ ‎SV40 ‏تتابع إضافة بولي أدينيل‎ ‏والجينات المرتبطة‎ adenovirus tripartite leader ‏وتم إدخال جينات‎ ° ‏كما هو موضح في الشكل ؟ أو‎ pAD26SYPAQ) (d) ‏بالفيروس ( جينات 7 ) في‎ ‏(00265083,م بواسطة ال لعمل جزئ خطي مفتوح‎ (d) ‏لا يتم انتشار‎ ‏قم‎ tripartite leader ‏في العناصر الثلاثشة الأولى التي تتضمن‎ Foal ‏داخل‎ ‏المعالج‎ Xho 1 ‏بواسطة‎ pJAW 43 (Zain et. AL, 1979), Cell 16 851) ‏يتم هضم‎ ‏زوج قاعدة‎ ٠50 ‏وتم فصل جزئ من‎ Pyull ‏كما هضم بواسطة‎ klenow ‏بواسسطة‎ - ٠ ‏عن طريق الفصل الكهربي على‎ Cll leaders ‏يحتوي على الثاني وجزء من‎ al. [1982] ‏في بفر ترايس بورات‎ 5 ( acrylamide gel ‏جيل أكريل أميد‎ pAdD26SvpA(3) (d) ‏تم ربط الجز « 60 140 مع‎ » supra) Maniatis et, Tris borate ‏مقامة‎ UE. coli ‏استعمل ناتج الربط لتحويل‎ « Pyull ‏المهيضوم بواسطة‎

Grunstein-Hogness ‏وفحصت المستعمرات باستعمال طريقة‎ tetracycline ‏تتراسيكلين‎ ye ‏زوج قاعدة . تم تحضير‎ ٠480 ‏باستعمال قضيب تهجين محمل 320 إلى جزء‎

Sell Pull ‏من مستعمرات هجين إيجابية لإختبار ما إذا كان الموضع‎ DNA adenovirus late leaders ‏زوج قاعدة الخاص ب‎ ٠4١ DNA ‏في‎ vo ‏تكوينه م‎ ‏على الجانب 0 في‎ Pull ‏الثاني والثالث . وفي الاتجاه الصحيح في الموضع‎

X ‏الشكل‎ TPL ‏الحشو 140 زوج قاعدة . هذا البلازميد يسمى‎ x, ‏على التتابع‎ (gs Taal 5740 ‏تم الحصول على الجزء في‎ ‏؛ تعريض النهايات‎ Ava 11 ‏بواسطة‎ 5740 DNA ‏المساعد 51740 بهضم‎ ‏مع الأجزاء ؛ الهم‎ Xhol ‏ربط روابط‎ Pol 1 ‏في‎ klenow ‏بواسطة جزء‎ ‏وفصل الجزء الأكبر (0) عن طريق‎ Xhol ‏لفتح الموضع‎ Xhol ‏بواسطة‎

١ ‏لينتج البلازميد‎ Xho 1 cut pTPL ‏الفصل الكهربي بالجيل هذا الجزء ربط مع‎ ‏بحيث أن‎ pCVSVL2-TPL ‏كان اتجاه الجزء © 51740 في‎ . pCVSVL2-TPL .adenovirus late promoter ‏مثل‎ sla ‏كان في نفس‎ 51740 late promoter

TPL- pCVSVL2 ‏في‎ (VA) adenovirus ‏لإدخال الجينات المرتبطة بفيروس‎

Hind 111 8 type 2 ‏الذي يحتوي على الجزء‎ pBR322 ‏أولا يتم تركيب بلازميد‎ © ‏في أدينوفيروس ؛ والجزء 3 يفصل بعد الفصل الكهربي بالجيل . ثم يدخل هذا‎

E. coli ‏بعد تحول‎ . Hind TI ‏الذي هضم سابقا بواسطة‎ pBR322 ‏الجزء في‎ ‏إلى مقاومة أمبيسيلين يتم فحص المواد التي يتم إدخالها - وذلك لإدخال جزء‎ ‏ويتم تحديد الاتجاه الذي يتم إدخاله عن طريق هضم أنزيم التحديد‎ TTB ‏في‎ adenovirus type 2 Hind IIIB ‏على جزء‎ Ad Hind [II 8 ‏يحتوي‎ pBR322 0 ٠ .“ ‏الاتجاه المتوقع في الشكل‎ ‏من بلازميد‎ VA ‏كما هو موضح في الشكل * يتم الحصول على جينات‎ . 1.4kb ‏وإعادة تتشفيط جزء‎ EcoRI ‏بالهضم بواسطة‎ pBR322-Ad Hind III B pTPL ‏في‎ EcoRI ‏في الموضع‎ EcoRI ‏ثم يربط الجزء الذي له نهايات عريضة‎ ‏بعد تحول 118101 ناه» .2 والاختبار‎ ) EcoRI ‏الذي هضم سابقاً بواسطة‎ ( ١ ial ‏لمقارنة التتراسيكلين ؛ ثم فحص المستعمرات عن طريق تهجين‎ ‏من أقطاب ايجابية‎ DNA ‏يتم تحضير‎ . VA ‏بجينات‎ (ald DNA ‏مع قضيب‎ ‏هجينيا وتتميز بهيضم أندونيوكلييز التحديد . والناتج البلازميد يسمى‎ .p91023 ‏حتى التهاية بواسطة‎ p91023 ‏يتم قطع‎ . p91023 ‏في‎ 2 EcoRI ‏ينتتزع‎ 9 ‏تحتوي‎ 1.3kb ‏واحد حوالي 700 والآخر حوالي‎ DNA ‏؛ وتوليد جزأي‎ EcoRI ‏في‎ klenow ‏؛ تملاً نهايات كل من الجزأين باستعمال جزء‎ VA ‏على جينات‎ 91023 (A) ‏بلازميتد‎ . lea 1.3kb « Tkb ‏وثم يعاد ربط كل من الجزأين‎ Poll

تحتوي على جينات ‎VA‏ وممائل ل ‎Grunstein-Hogness‏ بواسطة جزء جين ‎VA‏ وعن طريق تحليل موضع التحديد المناسب. ثم ينتزع موضع ‎Pstl‏ الفردي في ‎p91023 (A)‏ ويستبدل بواسطة موضع ‎EcoRI‏ . يقطع ‎p91023 (A)‏ حتى التهاية بواسطة ‎Patl‏ ثم يعالج ‎eo‏ بواسطة جزء ‎klenow‏ في ‎Poll‏ لتكوين نهايات مسطحة ؛ يتم ربط الروابط ‎EcoRI‏ مع موضع 0811 العرضسي في ‎(A) . 091023 (A)‏ 091023 الخطي ؛ مع روابط ‎EcoRI‏ المتصل عند الموضع ‎Pat]‏ يتم فصسله من الروابط الغهير مربوطة وتهضم حتى النهاية بواسطة 56011 وثم يعاد ربطها . يعاد تتفشيط بلازميد (8) 091023 ويتم التعرف ليكون له تركيب مماقل ل ‎p91023 (A)‏ ‎٠‏ ولكن موضع ‎ECORI‏ الموجود عند الموضع ‎Pstl‏ السابق. خطوة ؛ : تحير ‎cDNA Library‏ تم الحث على خلايا ‎Mo‏ لمدة ‎٠١ - ١١‏ ساعة بواسطة ‎PMA sPHA‏ للمساعدة على إنتاج الليمفوكين الخاص بهم . وضعت الخلايا بمعدل ‎Nexo‏ خلية / مل في وسط 5 مع ‎PHA 46٠١ FCS‏ 960.7 (حجم ‎No‏ حجم) و ‎TPA‏ © نانوجرام / مل . جمعت الخلايا بالطرد المركزي . أعيد تعليق ‎centrifugation‏ الخلايا المتكورة في ‎٠‏ "مل من بفر تحليل متنخفض الضغط الأسموزي مبرد بالئلج ( بفر 888: 8,01 مول ترايس هيدروكلوريد ‎hydrochloride‏ « أس هيدروجيتي ‎pH‏ 07.4 01 مول كلوريد بوتاسيوم ‎00٠6 ¢ potassium chloride‏ كلوريد ماغنيسيوم ‎Ve‏ ميكروجرام / ‎٠‏ .مل هكساميد ‎cycloheximide ila‏ « +0 وحدة / مل ‎gRNAsin‏ © مليمولار ثاني تيوتريتول ‎(cithiothreitol‏ . سمح للخلايا أن تخفض على التلج لمدة ‎٠‏ ‏دقائق ثم فجرت ميكانيكياً بواسطة ‎٠١‏ صدمات من مجنس زجاجبسي ‎recentrifuged at low speed‏ مركب جيداً »أجرى طرد مركزي للسائل المتجانس في سرعة منخفضة ( 000 ‎ARPM‏ جهاز طرد مركزي بيكمان

YY abl ‏لانتزاع الأنوية والخلايا الغير محللة . علق العائم . على‎ ) 16 Beckman ‏مل أو 853 وأعيد الطرد المركزي‎ ٠١ ‏بينما أعيد تعليق الكرية النووية في‎ ‏في سرعة منخفضة . جمع هذا العائم الثاني مع الأول وأجبرى طرد‎ ‏مركزي للعائمية المتحدين في سرعة منخفضة لإزالة التلوث المتبقي مع‎ ‏كلوريد‎ Vo ‏م الأنوية والخلايا الغهير محللة ؛ أحضر العائم من هذا إلى‎ potassium chloride ‏بإضافة ؟ كلوريد بوتاسيوم‎ potassium chloride ‏بوتاسيوم‎ ‏جهاز طرد مركزي‎ (RPM 76,000 ( ‏ثم الطرد المركزي بسرعة عالية‎ . ) ‏دقيقة ) لتكوين كور على الأغشية ( لتكوير الأغشية‎ Ye ‏لمدة‎ SW 28 rotor ‏مل من‎ VY ‏غسلت برفق كرية الغشاء بواسطة 858 بارد ثم أعيد تعليق في‎ potassium chloride ‏كلوريد بوتاسيوم‎ »,5 sucrose ‏يحتوي على ؟ سكروز‎ 858 ٠

SW41 Beckman ‏ثم تحضير جهدين غير متواصلين في أنابيب طرد مركزي بيكمان‎ ‏فوق‎ sucrose ‏بأن يوضع في طبقات + مل من محلول الغشاء في ¥ سكروز‎ ‏مع 0,¥ سكروز 008 و 0+ كلوريد بوتاسيوم‎ RSB ‏مل من‎ ¥ ‏إلى حافتها ( قمتها ) بأن يوضع في طبقات‎ al) ‏ملئت‎ . potassium chloride ‏سكروز وضع و مل كلوريد‎ ١ ‏يحتوي على‎ RSB ‏مل من‎ Y,0 ‏مع‎ ye ‏لمدة € سساعات بمعدل‎ gradients ‏دورت هذه‎ . potassium chloride ‏بوتاسيوم‎ ‎RPM 0‏ ( بيكمان ‎Beckman‏ « جهاز دوار 59741 ) عند أم . انتزعت © برفق طبقة الغشاء ( عند الوجه المقابل بين و ‎١,‏ مول سكروز ‎(sucrose‏ ‏من الوجه باستعمال أبرة ‎YA‏ وسرنجة ‎gauge needle‏ . جمعث أجزاء الغفاء ‎٠‏ .من ‎gradients‏ 2 وخففت بواسطة ‎١‏ حجم من ماء مقطر ثم أحضرت إلى ترايتون ‎X-100 Triton‏ 960,6 وصوديوم ديوكسي كولات ‎sodium deoxycholate‏ ثم استخلص بواسطة حجم مساو من الفينول ‎phenol‏ . أعيد استخلاص الطبقة المائية بواسطة خليط ‎١ : ١‏ من فيتول 1600م وكلوروفورم ‎chloroform‏ وفي النهاية حجم مساو من الكلوروفورم ‎chloroform‏ . في ‎vo‏ النهاية رسب ‎RNA‏ المتحد مع الغشاء بإضافة كلوريد صوديوم حتى 7*9 و

Ye ‏جمع‎ a Yr - ‏بارد وحضن طول الليل عند‎ ethanol ‏ص حجم من ايثانول‎ ‏دقائق ؛ في جهاز‎ ٠ ‏لمدة‎ RPM 50068 0( ‏المرسب بالطرد المركزي‎ RNA ‏مل من الماء‎ ١ ‏وأعيد تعليقه في‎ ) 1-6 Beckman ‏طرد مركزي بيكمان‎

RNA ‏مجم‎ ١ ‏خلية ؛ تم الحصول تقريباً على‎ 7٠١ XY ‏المقطر ) ومن‎ ‏الكلي عن طريق‎ RNA ‏من‎ (mRNA) ‏حامل الرسالة‎ RNA ‏تم عزل‎ 2 . 01 ‏فوق 0,+ مل من عامود أوليجبو‎ chromatography ‏كروماتوغرافي‎ ‏دقائق . رج‎ ٠ sa dove ‏إلى‎ RNA ‏؛ باختصار سخن‎ cellulose ‏سيليلوز‎ ‏بسرعة فوق التثلج ثم خفف 0 أضعاف بواسطة الاتحاد مع بفر في درجة‎ ‏ترايس‎ .,0٠ (LiCl ‏كلوريد‎ asf ‏مول‎ v0) . ‏حرارة الحجرة‎ ‏إديقا‎ ٠,6١7 5 ‏أس هيدروجيتي 11و‎ » Tris hydrochloride ‏هيدروكلوريد‎ ٠ ‏حتى‎ Nacl ‏بإضافة كلوريد صسوديوم‎ mRNA ‏رسب‎ ٠ ( SDS 90.١ ‏01و‎ ‎Ca Ye - ‏وحضانة طول الليل عند‎ ethanol ‏مول و 0,¥ حجم من ايثانول‎ 8 ‏دقيقة في‎ ٠ ‏لمدة‎ 1801/4 70006٠ ( ‏المرسب بالطرد المركزي‎ MRNA ‏جمع‎ ‎Gat ‏صبت الأنبوبة بعناية وأعيد‎ . ) 59755 Beckman ‏جهاز دوار بيكمان‎ ‏المعاد تحويله إلى معلق‎ mRNA ‏من الماء . أحضر‎ dae ‏في‎ mRNA ‏كرية‎ ١ ‏ثم استخلص مرة واحدة بواسطة‎ sodium chloride ‏كلوريد صوديوم‎ +, YO ‏إلى‎ ‎- ‏تم ¥ مرات‎ chloroform ‏وكلوروفورم‎ phenol ‏من فينول‎ ٠١1 ‏خليط‎ ‏حجم من‎ Y,0 ‏بإضسافة‎ mRNA ‏رسب‎ ٠ chloroform ‏بواسطة كلوروقوم‎ ‏جمد الخليط ونشر عدة مرات في حمام ثلج / إيقانول‎ ethanol ‏الإيثانول‎ ‏دقيقة في جهاز طرد مركزي‎ ١٠١ ‏جاف ثم أجرى له طرد مركزي‎ ehanol vy, ‏إلى معلق‎ mRNA ‏الأنبوبة بعناية وأعيد تحويل كرية‎ Cua. Eppendorf ‏ميكروجرام‎ *٠ ‏ميكرولتر من الماء المقطر . كان الإنتاج النهائي‎ Yo ‏في‎ ‎MRNA ‏تقريباً من‎

Yo

Coin ‏تم تحضير الشريط الأول باستعمال طرق نموذجية . باختصار‎ ‏ميكرولتر من خليط‎ ٠٠١ ‏الخاص بالغشاء في‎ mRNA ‏ميكروجرام من‎ ٠ ‏أس‎ Tris ‏مليمولار ترايس‎ Veo ‏يحتوي على‎ cDNA ‏تفاعل تخليق‎ ٠١ ‏لالس‎ KCl ‏كلوريد بوتامووم‎ Vs ala ٠60. 1,4 pH ‏هيدروجيني‎ ‏ميركابتو أيتانول‎ Meade ٠١ » 348012 ‏م مليمولار كلوريد ماغنسيوم‎ 6 « dTTP s dCTP, dGTP daft ‏من‎ JS ‏ميكرومولار من‎ 95٠0 ١ mercaptoethanol ‏ومتوسط‎ phosphorylated ‏مضاف له فوسفوريك‎ ( dT ‏ميكروجرام من أوليجو‎ ( Ci/mmol Z+ } 32p dCTP ‏من‎ uCi YO « primer ‏في صورة‎ ) ٠8-١7 ‏حجم‎ ‏.بدئ التقاعل‎ RNAsin ribonuclease ‏ريبونيوكلييز‎ fla ‏وحدة من‎ Yo ‏و‎ ‏وحدة من أنزيم التحول العكسي وحضن لمدة ٠؟ دقيقة في‎ ٠٠١ ‏ض بإضافة‎

RNA ‏حتى 50 مليمول وحلل‎ EDTA Li ‏بإضافة‎ Joli PINE A ‏مول هيدروكسيد صسوديوم‎ ١, ‏في‎ a 10 ‏دقيقة عند‎ Ye ‏بالتحضين لمدة‎ -hydroxid sodium ¢ Tris ‏ميكرواتر من ؟ مول ترايس‎ ٠١ ‏تم معادلة القاعدة بإبضاقة‎ [digi lg ‏ثم استخلص خليط التفاعل‎ . ٠,1 pH ‏أس هيدروجيني‎ Ve ‏مليمول‎ ٠١ ‏كلوروفورم ؛ واستخلص مرة ثانية بواسطة 50 ميكرولتر من‎ (TE) EDTA ‏مليمولار إبيقا‎ ١ » V,0 pH Jas ‏أس‎ ¢ Tris ‏ترايس‎ ‏مزدوج‎ cDNA ‏الأول إلى‎ cDNA ‏وجمعت القواعد المائية . حول شريط‎ ‏وحدة من جزء ض‎ fr ‏ساعة عند ١١م مع‎ ١" ‏الأشرطة بالحضانة لمدة‎ ‏ميكرواقر من تفاعل‎ ٠٠١ ‏في‎ ١ DNA polymerase ‏من بوليمراز‎ Klenow ٠ « potassium phosphate ‏مليسمول فوسفات بوتاسيوم‎ 5 ٠ ‏يحتوي على‎ ‏ميركابتو إيقانئول‎ =Y « DTT ‏مليمولار‎ 1,١ 1,5 pH ‏أس هيدروجيني‎ ‏مليمولار كلوريد ماغنسيوم 6 ميكرو عياري‎ ٠ 2-mercaptoethanol a UCH ‏ميكرو‎ YO ‏من كل من ؛ديوكسي ريبونيوكليوتيد ثالث فوسفات و‎ ‏كلوروفورم‎ / Job ‏أوقف التقكاع ل بالإخلاص بواسطة‎ . 3200001 vo

‎chloroform‏ وانتزع ثالث فوسفات ‎phosphate‏ الغير مندمج بالمرور فوق ‎١‏ مل من عامود سيفادكس ‎sephadex‏ 6-50 . جمعت الأجزاء المبعدة ورسب الإيثانول ‎.ethanol‏ ‏غسلت كرية ‎cDNA‏ بالإيشانول البارد ثم أعيد التحويل إلى معلق

م في ‎Yoo‏ ميكرولتر ان من ‎Yo‏ مللي عياري ترايس ‎Tris‏ ؛ أس هيدروجيني ‎PH‏ ‎٠٠‏ مللي عياري إديتا 8002078 ميكرو عياري -5 أديتوسيل ميثيونين ‎s-adenosyl-Methionine‏ و ‎7٠١‏ وحدة من ‎EcoRI‏ مييلاز ‎methylated‏ ‏لمدة ‎Yh‏ دقيقة عند ‎sory‏ . أوقف التفاعل بالإستخلاص بواسطة فينول / كلوروفورم وجمع ‎CDNA‏ مضاف له ميقيل ‎methyl‏ بترسيب الإيثاتول.

‎٠٠١‏ شطفت كرية ‎cDNA‏ بواسطة إيثانول ‎ethanol‏ 9670 ثم أعيد التحويل إلى معلق في ‎٠٠٠‏ ميكرولتر من بفر 51 ( ‎Maniatis‏ وزملاؤه ) وحضن مع ‎٠٠١‏ ‏وحدة من 51- نيوكلييز ‎nuclease‏ عند ١7م‏ لمدة ‎٠‏ دقيقة . أوقف التفاعل الاستخلاص بواسطة فينول / كلوروفورم وجمع ‎cDNA‏ الإيثانول.

‏تم تعريض ‎CDNA‏ مزدوج الأشرطة بالتحضين في ‎٠٠١‏ ميكرولتر مق

‎vo‏ 76 مللي عياري ترايس ‎Tris‏ ؛ أس هيدروجيني ‎5٠0 7,5 pH‏ مللي مولار كلوريد ‎٠١ «chloride sodium psd ga‏ مللي مسولار "- ميركابتو . . إيثانول ‎50٠0 g2-mercaptoethanol‏ ميكرو مولار من كل الأربعة ديوككسي ريبونيوكليوتيد ثالث فوسفات ‎deoxynucleotide triphosphates‏ مع ‎Yo‏ وحدة من ‎kienow‏ في درجة حرارة الحجرة لمدة ‎١‏ دقيقة . أوقذ التفاعسل

‎٠‏ بالاستخلاص بواسطة ‎dsb‏ / كلوروفورم وجمع ‎cDNA‏ بترسيب الإيثانول ‎-ethanol‏

‏ربط ‎cDNA‏ في ‎٠‏ © ميكرولتر من بفر 14 ليجاز ‎Maniatis) ligase‏ وزملاؤه ( بواسطة ‎pMoles ©٠0٠0‏ من روابط ‎R1‏ المشتراة من معامل انجلتسرا ‎England‏ ‏( تتابع : ‎pCGGAATTCCG‏ ) باستعمال ‎٠٠0٠١٠‏ وحدة من 14 ليجباز طول

ب الليل عند ‎٠١‏ م . أوقف التفاعل بالتحضين عند ١١م‏ لمدة ‎٠١‏ دقيقة ثم خفف إلى 00 ميكرولتر بحيث أن التركيز النهائي للملح كان ‎١01‏ مولار كلوريد صوديوم ؛ ‎٠١‏ مللي مولار كلوريد ماغنيسيوم »؛ ‎5٠‏ مللي مولار ترايس كلوريد ؛ أس هيدروجيني 7,4 . هضم ‎cDNA‏ بعد ذلك لمدة ؟ دقيقة م عند ‎a VY‏ بواسطة ‎٠٠١‏ وحدة من ‎EcoRI‏ . أوقف التفاعل بالاستخلاص بواسطة فينول / كلوروفورم وجمع ‎CDNA‏ بترسيب الإيثانول . أعيد تحويل الكرية إلى معلق في ‎5٠‏ ميكرولتر من ‎TE‏ وأمرارها فوق © مل من عامود 8 . جمعت الأجزاء المبعدة ورسبت بالإيثانول . أجرى فصل كهربي ل ‎cDNA‏ المرسب خلال جيل أجاروز ‎90١ agarose gel‏ في بفر ترايس أسيتات ‎Tris 8061818 ٠‏ في وجود ‎١‏ ميكروجرام ‎dof‏ إيثيديوم بروميد ‎ethidium bromide‏ . تم فصل ‎cDNA‏ في معدل حجم 9500 - ‎deve‏ زوج قاعدة من الجيل باستعمال طريقة مسحوق الزجاج النموذجية .استخلص 0148 المستحلب بواسطة فينول /كلوروفورم ؛ رسب بالإيثانول وأعيد تحويل الكرية إلى مععلق ( بعد الشطف بالإيثانول ) في ‎5٠‏ ميكرولتر من ‎TE‏ كان الإنتاج ‎ed‏ ‏م١‏ 1000 = ‎cDNA malas dove‏ تحضير حامل النسخ ‎p91023 (B)‏ وصف أعلاه . ربط الحامل المهضسوم ب ‎ECORI‏ والمعالج ‎٠٠٠ ( phosphatase Lu dll‏ نانو جرام ) -- بواسطة ١٠٠نانو‏ جرام من ‎cDNA‏ في ‎٠٠١‏ ميكرولتر من التفاعل ( تفاعل 74 ليجاز النموذجي ) طول الليل عند ‎٠١‏ م .أوقف التفاعل بالاستخلاص بواسطة ‎٠.‏ فينول / كلوروفورم ثم جمع ‎cDNA‏ المربوط - عن طريق ترسيب الإيثانول بعد إضافة © ميكروجرام من ‎RNA‏ كحامل. شطف ‎DNA‏ المرسب بالإيثانول ‎ethanol‏ بواسطة ايثانول ‎967٠0‏ ثم أعيد تحويله إلى معلق في ‎٠٠١‏ ميكرولتر من ‎TE‏ . استعمل هذا 0118 في ‎{lia‏ ‏ميكرولتر من ‎transform E.coli MC1016‏ ( ء ميكرولتر في ‎٠٠١‏ ميكرولتر تحول )

YA

96١ ‏مم مع أجار‎ Vou ‏محول على طبق بتري‎ Yo ‏تم نشر (انتشار) كل من‎ ‏وحضن طول‎ (Tet ‏ميكروجرام / مل تتراسيكلين ( شريحة‎ ٠١ ‏-1ء‎ dud ‏مستعمرة على كل شريحة ؛ مكونة عدد‎ Yoo ‏الليل عند 27م . نمت تقريباً‎ ‏مستعمرة ؛ وبعد الوصول إلى 6 مم تقريباً في القطر ؛ نقلت‎ ٠.006 ‏كلي‎ ‏مم ) بوضع مرشح‎ ١١ ( nitrocellulose ‏م المستعمرات إلى أقراص نيتروسيليلوز‎ ‏برفق . نقلت كل‎ Sol ‏جاف بعناية على سطح الشريحة ثم تقتشفير‎ ‏المستعمرات التي على الشريحة إلى المرشح الذي وضع بعد ذلك (المستعمرة‎ ‏طازجة . وبعد السماح للمستعمرات أن تتمو عدة‎ Tet ‏إلى أعلى) فوق شريحة‎ ‏يوضع مرشح مرطب طازج‎ mde ‏ساعات . ثم تحضير سلالة واحدة من كل‎ ‏؛ تقشيرهم ثم إعادة كل مرشح‎ Las ‏ضغطهم‎ pa ‏بالضبط فوق المرشح الأصلي‎ ‏وضعت‎ . a VY ‏الطازجة وتحضن الشرائح طول الليل في‎ Tet ‏إلى شريحة‎ ‏علامة بعناية ( بحذر ) على كل سلالة (ذرية) بحيت تطابق مع المرشح‎ ‏الأمسلي.‎ ‎Plasmid DNA Pool ‏خطوة ه : تحضير بقعة بلازميد‎ ‏مرشح تكاثر بعناية (بحذر) إلى أثمان باستعمال‎ Yo ‏قسم كل من ال‎ Ve ‏مقص وملاحقة اتجاه كل ثمن بالنسبة للمرشح الرئيسي الأعمصسلي . مسحت‎ - ‏جمعت البكتيريا‎ . 1.- Broth ‏مل من شوربة‎ ٠١ ‏المستعمرات من كل جزء في‎ ‏دقائق « جهاز‎ ٠١ » RPM 7٠٠١ ( centrifugation ‏بالقوة الطاردة المركزية‎ ‏أعيد تحويلها إلى معلق في‎ ) 16 Beckman ‏بيكمان‎ centrifuge ‏طرد مركزي‎ ¢ Tris-HCI ‏مولار ترايس هيدر وكلوريد‎ ٠. ‏؛‎ %Y0 sucrose ‏مل من سكروز‎ ١ 0 ٠ ) protoplasts ‏وحولت إلى خلايا أولية (بروتوبلاست‎ A pH ‏أس هيدروجيني‎ ّ Fh ‏مجم / مل - والحضانة فوق‎ © lysozyme ‏مل من ليزوزيم‎ +) Y ‏بإضافة‎ ‏مرة أخغعرى‎ protoplasts ‏دقائق . أعيد تحضين البروتوبلاست‎ ٠١ - ‏لمدة ه‎

EDTA ‏مل من إديقتا‎ ١,176 ‏في درجة حرارة الحجرة لمدة دقائق بعد إضافة‎ ‏مللي مولار‎ 59٠ ‏في‎ 96٠0 SDS ‏مل من‎ + NY ‏مولار ثم حللت بإضافة‎ 9 Yo

ترايس هيدروكلوريك 1151101 ‎mM‏ ¢ أس هيدروجيني ‎A pH‏ خلط الليمان 68 ( ناتج التحلل ) برفق ؛ حضن عند درجة حرارة الحجرة لمدة ٠دقيقة‏ تم رسب البروتين و ‎DNA‏ الكروموزومي بإضافة ‎١,“‏ مل من كلوريد صوديوم ‎chloride sodium‏ © مولار. 2 بعد التحضين فوق ‎ch‏ لمدة ‎١5‏ دقيقة ¢ أجرى طرد مركزي للناتج التحليل جهاز طضرد مركزي إيبندروف ‎Eppendorf‏ لمدة ‎١‏ دقيقة في البارد . انتزع بعناية العام خلف كرية ‎DNA‏ / البروتين اللزجة وخفف بإضافة ‎٠,١‏ ‏مل من الماء . استخلص الخليط بواسطة ‎١‏ مل من الفينول ‎phenol‏ » فصلت الطبقات بالطرد المركزي ( ‎٠١‏ كيلو لمدة ‎٠١‏ دقائق في جهاز دوار 55-34 ‎(Sorvall‏ ‎٠‏ وانتزعت الطبقة المائية إلى أنبوبة طازجة ¢ رسب ‎DNA‏ بإضافة 20+ مل من كلوريد صوديوم © مولار و ‎V,0‏ مل من الإيثاتول ‎ethanol‏ البارد وتجميد الخليط عدة مرات في ‎ples‏ إيثانول تلجي جاف ‎dry ice ethanol bath‏ ¢ جمع الراسب بالطرد المركزي ( ‎٠١‏ كيلو لمدة ‎١١‏ دقيقة في 55-34 ‎Sorvall‏ ) أعيد تحويله إلى معلق في ‎٠,"‏ مل من أسيقات صوديوم ‎٠,١ sodium acdtate‏ م١‏ مولار وأعيد ترسيبه ( في أنبوبة إيبندروف ‎Eppendrof tube‏ ) بإضافة ‎١‏ مل من الإيثانول . بعد ‎١5 - ٠١‏ دقيقة في حمام الإيثانول ‎al)‏ الجبساف ؛ جمع ‎DNA‏ المرسب بالقوة الطاردة المركزية ( © دقائق ؛ في جهاز إيبندروف - 0001 ) وأعيد تحويل الكرية إلى معلق في ‎٠٠١‏ ميكرولتر من ‎TE‏ معقم ‎٠١ (‏ مللي مولار ترايس ‎mM Tris‏ ؛ أس هيدروجيني 11م 6 ‎١١‏ مللي مولار .+ إديتا ‎(EDTA‏ وتم الحصول على 0 = ‎٠١‏ ميكروجرام من بلازميد ‎DNA‏ من مستحضر نموذجي أحتوى كل مستحضر على ‎DNA‏ من ‎Yoo‏ - 5050 مستعمرة على المرشح الأصلي ؛ وتم تحضير عدد كلي ‎Yoo‏ عينة 018 من ال ‎Yo‏ ‏مرشقح.

خطوة > : عزل (فصل) ‎GM-CSF‏ ‏نقلت كل من عينات ‎DNA‏ من الخطوة 0 على حدة إلى خلايا القرد ‎M6 COS‏ كما وصف أسفله. نميت بصفة روتينية خلايا ‎M6‏ في وسط ‎Eagle's‏ المعدل ب ‎DME ( Dlbecco's ©‏ متوفر من جيبكو ‎(Gibco‏ يحتوي على سيرم ‎Serum‏ جنين البقر ‎76٠١‏ موقف نشاطه بالحرارة ‎(HIFCS)‏ ؛ تنقسم مرتين في الأسبوع في تخفيف ‎١ : ١‏ . وبعد الانقسام بحوالي 4 ؟ ساعة فإن خلايا 116 ‎١‏ : + تكون جاهزة للنقل . وقبل النقل بحوالي ‎YE‏ ساعة بذرت خلايا ‎ME‏ 7ب أ ‎6:0١ split )‏ ) في مصنع ‎LDA‏ ( متوفر من ‎Nunc‏ ) في ‎١,5‏ لتقرمن ‎96٠0 HIFCS+DME ٠‏ . وفي ‎Jd‏ قبل النقل ( قبل النقل فوراً) شفطت الشرائح وغسلت مرتين بواسطة 1 مل من ‎(SEYDME‏ خالي من السيرم. أذيب ‎١ DNA‏ مولار ترايس ( أس هيدروجيني ‎pH‏ 7,7 ) وأضيف إلى وسط ‎DME‏ يحتوي على ؟ مللي ‎Wow‏ جلوتامين ‎glutamine‏ لم2 ٠ميكروجرام‏ / مل ستربتوميسين ‎٠٠١ «streptomycin‏ وحدة / مل ‎Calis‏ ‎penicillin yo‏ و75 مجم / مل ديكستران ‎DEAD Dextran‏ يصل إلى حجم كلي ؛ مل مع محلول ترايس ‎DNA Tris‏ . أضيف ‎det‏ من ‎ul‏ المحتوي على . ‎DNA‏ المذاب إلى الشريحة المحتوية على خلايا ‎COS‏ 146 وحضن لمدة ‎VY‏ ‏ساعة . بعد الحضانة شطفت الخلايا مرة أو مرتين بواسطة ‎١‏ مل 01305 57 ثم أضيف © مل من ‎DME‏ مع ‎٠٠١ ¢ 96٠0 HIFCS‏ وحدة / مل بنسلين ‎penicillin‏ ‎٠١١ YL‏ ميكروجرام [ مل ستربتوميسين ‎١ ¢ streptomycin‏ مللي مولار جلوتامين ‎glutamine‏ و ‎Ma ١.١‏ مولار كلموروكين ‎chloroquin‏ وحضنت الخلايا لمدة ‎Yo‏ ساعة.

١

DME + ‏مل‎ ٠١ ‏بعد 7,5 ساعة أشطف مرة بواسطة 8570118 وأضيف‎ ‏ساعة إضافية‎ YT - YE ‏أحصد بانتزاع الوسط المكيف بعد‎ . 960 HIFCS ‏من التحضين (الحضانة).‎ ‏باستعمال تجربة‎ GM-CSF ‏لنتقاط‎ Ji ‏فحص الوسط المكيف من كل‎ ‏؛ تم التعرف على القطب على‎ GM-CSF ‏لكل عينة إيجابية لنشاط‎ 1660-1

Jd ‏على سبييل‎ . GM-CSF ‏المرشح الرئيسي الأصلي المسئول عن نشاط‎ ‏التقطت كل المستعمرات في جزء‎ GM-CSF ‏لتقل واحد إيجابي لنشاط‎

YY. ‏التقط حوالي‎ . DNA ‏المرشح الرئيسي الأصلي الذي اشتق منه عينة‎ ‏ميكروجرام | مل‎ + L- Btoth ‏من هذه المستعمرات في ¥ مل من شوربة‎ ‏مستعمرة في‎ VY ‏تتراسيكلين ؛ نميت المستعمرات طول الليل وضعت ل‎ ٠ ‏تم تحضير بقع تجمعات من كل صف أفقي وعامود رأسي في‎ . VA XA matrix clones ٠ ‏عدد كلي + بقعة ) ( ملحوظة: الصف الأفقي الأخير به‎ ( matrix ‏من كل مستعمرة متجمعة ثم استعلمت لتقل‎ DNA ‏فقط ) تم تحضير عينات‎ ‏تم فحص المواد العائمة من هذه المنقولات باستعمال تجسرية‎ » COS LDA : ‏مستعمرة 1606-1 وتم الحصول على ؟ إيجابي من هذه المجموعة من المتقولات‎ VO ‏واحد في العامود الرأسي والأخرى في الصف الأفقي . والمزرعة العامة لهذه‎

GM-CSF clone ‏القع ( التجمعات ) احتوت على قطب‎

DNA miniprep ‏فردي من هذه المزرعة وتم تحضير‎ clone VY ‏تم عزل‎ ‏كما وصف أعلاه . تسم فحص المواد‎ L- Broth ‏مل في شوربة‎ ٠١ ‏من مزارع‎ gail ‏العائمة من هذه المنقولات باستعمال تجربة 66-1 بالإضافة إلى تجربة‎ ٠ ‏جزء زوج‎ Vor ‏الأربعة أحتوى كل منها على‎ clones ‏و‎ . GM-CSF ‏العظضمي ل‎ le ‏التي لها مستويات‎ 146 COS ‏قاعدة كلها وجهت النسخ بواسطة خلايا‎ ‏الثلاة‎ clones ‏التجربتين بينما‎ (saa) ‏كما هو محدد في‎ GM-CSF ‏من نشاط‎

$Y ‏يجب أن‎ GM-CSF ‏الأخرى لم توجه . كذلك فإن منطقة الشفرة الخامسة ب‎ ‏زوج قاعدة.‎ 15٠ ‏تكون موجودة داخل حشو من‎

Jala ‏من‎ GM-CSF ‏الخاص بشفرة‎ DND ‏وقد انتزع التتابع الكودي‎ ‏واتبع باستعمال طرق‎ EcoRI ‏التحول في القطب الإيجابي عن طريق هضم‎ ‏نموذجية بعد أجزاء تحت الاستقطاب (الاتحاد) في‎ dideoxy ‏تتايع داي ديوكسي‎ © ‏وبلازميد‎ . ١ ‏حوامل 1413 للحصول على التتابع الموضح في الشكل‎ ‏في خلايا 005 قد‎ GM-CSF ‏الذي بين أولا أنه يوجه نسخ‎ p91023(B)-CSF ‏سمي 0051-1 وهذا البلازميد قد رسب بواسطة تجمع المزرعة الأمريكية‎ ‏في‎ ATCC 34754 ‏تحت رقم ترسيب‎ ECORI ‏النوع في سلالة 1401061 في‎ ١18م5 ‏"يوليو‎ ٠

GM-CSF ‏نسخ يروتين‎ : V ‏خطوة‎ ‎p91023(B) ‏المحولة بواسطة حامل‎ M6 COS ‏القرد‎ LOLA ‏نميت‎ ‎> ‏في خطوة كما وصف في خطوة‎ GM-CSF/cDNA ‏المحتوي على‎ ‏في وسط المزرعة.‎ GM-CSF ‏لتكوين بروتين‎ ‏مولار ترايس‎ ١,١ ‏مل من‎ ١ ‏في‎ (PCSF-1) ‏مجم من هذا‎ ١ ‏أقصد أذيب‎ ٠ ‏يحتوي على‎ DME ‏“,لا وأضيف إلى 00 مل من‎ pH ‏؛ أس هيدروجيني‎ Tris ‏وحدة | مل ستربتوميسين‎ ٠٠١ ¢ 2- mM glutamine ‏مولار جلوتامين‎ ALY ‏مجم‎ +, Yo ‏و‎ )0/5( penicilline ‏ميكروجرام / مل بنسلين‎ ٠٠١ «streptomycin . ) Pharmacia dla Jl ‏من‎ 55000060٠ ‏وزن جزيثي‎ ( DEAE Dextran ‏مل ديكستران‎ ‏في‎ M6 COS ‏ديكستران إلى خلايا‎ DEAEDNA ‏أضيف 00 مل من محلول‎ ٠ ‏ساعة . بعد الحضانة شطفت‎ VY ‏مصنع الخلايا وحضن في ١7م لمدة‎ ‏يحتوي على )+ ملي مولار‎ SFDME ‏مل‎ A+ + ‏الخلايا مرة بواسطة‎ ‏مللي مولار جلوتامين‎ ١ » 96٠0 111705 , chloroquin ‏كلوروكيمن‎ ‏(بنسلين ستربتوميسين ) . بعد شطف الوسط المحتوي على‎ P/S ‏و‎ glutamine

كلوروكين شطنت الخلايا بواسطة 10118 517 وغذي ‎٠5٠0١0‏ مل من ‎DME‏ ‏بواسطة 111705 ‎96٠0‏ . بعد ‎١‏ ساعة غسلت ‎SF DME dha ug ID all‏ وسمح للخلايا المنتقولة أن تتكيف مع الوسط لمدة ؛ ؟" سساعة عند ١م‏ . شطف الوسط المكيف واستبدل بواسطة 8500 مل أخرى من ‎SF-DME‏ . م سمح للخلايا أن تتكيف مع هذا الوسط لمدة ؛ "#"ساعة ثم جميع الوسط المكيف وفي أسرع وقت ممكن بعد الحصد ركزت عينة الأوساط المكيفة ‎Ye‏ ضعف عن طريق فوق الترشيح المضغوط باستعمال غرقة أميكون ‎Ye‏ - وغشاء ( 8.550 ‎YMS MW cutoff‏ ). خطوة ‎A‏ : تنقية ‎GM-CSF‏ الذي يتم ادخاله للخلية ليغير من النسوع ‎٠‏ - الوراثي والمناخي على الخلية. أحضر ‎٠٠١0‏ مل من الوسط المكيف المركز ( من ؟ لتر من ‎sal all‏ الأولية . خطوة ‎١‏ ) إلى كبريتات أمونيوم ‎٠ ammonium sulfate‏ 967 تشبع بإضافة كبريتات أمونيوم ‎ammonium sulfate‏ صلبة وانتزع البروتيسن المرسب بالقوة الطاردة المركزية . أحضر العائم إلى كبريتات أمونيوم ‎Av‏ ‎Ne‏ تشبع بإضافة مزيد من كبريتسات الأمونيوم ‎ammonium sulfate‏ وجمع البروتين المرسب بالقوة الطاردة المركزية . أعيد تحول الكرية إلى معلق ‎٠‏ ‏في © مل من سترات صوديوم ‎٠١ sodium citrate‏ مللي مولار ؛ أس هيدورجيني ‎١ pH‏ يحتوي على ‎١‏ مولار كلوريد مصسوديوم ‎chloride sodium‏ . استعمل البروتين المذاب على عامود ‎١,6‏ ل ‎٠٠١‏ سم من التروجيل ‎Ultrogel‏ ‏.| 4كذعه موزون في نفس البفر . استحلب نشاط ‎GM-CSF‏ من العامود بواسطة وزن جزيئي ظاهري ‎١4‏ كيلو دالتون ‎Daltons‏ أو بعد حوالي ‎9٠0‏ مل وقد لوحظ أنه إذا أجرى ترشيح الجيل في قوة أيونية متخفضة ؛ يستحلب نشاط ‎GM-CSF‏ من العامود في موضعين - مع أوزان جزيئية ظاهرية حوالي te ‏يمكن‎ GM-CSF ‏كيلو دالقون ¢ مؤكداً أن‎ FA ‏و‎ Daltons ‏كيلو دالتون‎ 4

TFA ‏جمعت الأجزاء النشطة وأحضرت ال‎ . (dimers ‏بسهولة أن يكون‎

Yo x ‏(بحتى‎ Vydac C4 ‏واستعملت على عامود‎ ) 96٠0 TFA ‏بإضافة‎ ( ‏من صسفر‎ linear gradient ‏؛ زود العامود بواسطة‎ 960.1 TFA ‏سم موزون في‎

TFA ‏كلي ) في‎ levis ‏مل / دقيقة ؛‎ ١ ( acatonitrils ‏من أسيتونيتريل‎ 40 — 0 acatonitrils ‏استحلب نشاط 034-057 بين 4 — 961 اسيتونيتريل‎ . 9661 ‏ميكرولتر من الجزء 14 عن طريق‎ ٠١ ‏حللت عينة‎ ) ٠٠ - ١١ ١ ‏أجزا‎ (

SDS ‏ل‎ polyacrylamide gel ‏الفصسل الكهمربي بالبولي أكريل أميد جيل‎ ‏للصصسمفقك‎ Nature 227, 680 )1970(( ‏جيل 901,5 كما وصف بواسطة‎ ) ‏كيلو‎ 1 - ١8 ‏ا لوحظ حلقة بروتين فردية عريضة لها وزن جزيئي ظاهري‎ ٠ ‏الأكثر عرضاً هو صفة شضائعة للجليك و‎ GM-CSF ‏دالتقون ومعدل حجم‎ ‏بروتينات ؛ ومن المعتقد أنه يعكس إضافة ممتدة ومتتوعة للكربوهيدرات‎ ‏باسستعمال‎ Edman ‏لتحلل‎ ١9 ‏عرض البروتين في الجزء‎ . carbohydrate ‏ميكروجرام تقريباً من‎ ٠١ ‏ومن‎ Applied Biosystems gas phase microsequenator ‏البروتين المستعمل ؛ تم الحصول على تتابع الخمسة عشر حمض أميني الأولى‎ vo sl ‏ويؤكد الإنتاج العالي لتتابع‎ (A-P-A-R-S-P-S-P-S-T-Q-P-W-E-H) ‏قد نقي حتى‎ ١4 ‏في الجزء‎ GM-CSF ‏الفردي - بقوة على أن بروتين‎ ‏وحدة | ويم‎ Ve x 2 ‏له‎ ٠١ ‏التجانس ؛ أشار الفحص الحيوي أن الجزء‎ ‏وحدات أدمصساص . نظراً لأن البروتينات التموذجية في المحلول المائي لها‎ ‏وويظ وحدة أدذمصاص | مجم من‎ ١7 ‏إلى‎ ١,8 ) ‏معدل أمعامل خمود ( انتهاء‎ v, ox) ‏المنقي ما بين حوالي‎ GM-CSF ‏البروتين . والنتشاط الخاص ل‎ ‏وحدة / مجم عن طريق الفحص باستعمال تجربة النخاع‎ "٠١# ‏وحوالي ؛‎ ‏العظمي البشري.‎

: co ‏المثال ب‎

Gibbon ‏الخاص بحيوان الغيبون‎ GM-CSF ‏اتحاد‎ ‏من خلايا 7 في حيوان الغيبون‎ mRNA ‏تحضير‎ : ١ ‏خطوة‎ ‏زرعت عينة من خط خلايا 1 الخاصة بحيوان الغييسون المسامة‎ ) Bibco ‏يشتري من جيبكو‎ ( RPMI 1640 ‏لعدة أسابيع في‎ UCD-MLAK 144 ٠

WL all ‏حتى تم الحصول على عدد كلي من‎ (FCS) 967١ ‏وسيرم جنين البقر‎ ‏بالتتشيط لمدة‎ CSF ‏؛ وحثت الخلايا على تكوين مستويات عالية من‎ ٠١ x) decanoyl ‏نانتوجرام / مل -12-0 رابع ديكانتويل‎ ٠١ ‏ساعة في وجود‎ YE . 961 PCS + RPMI 1540 ‏في‎ (TPA) acetate ‏أسيتات‎ ='¥ phorbol ‏فوربول‎ ‏دقائق ¢ غسلت‎ 0 crpm ٠٠٠١ ( ‏بالقوة الطاردة المركزية‎ LSAT Ga as ٠٠ ‏وفي النهاية جمعت بالقوة‎ (PBS) ‏مرة بواسطة محلول ملح متعادل بالفوسفات‎ ‏الطاردة المركزية.‎ ‏من هذه الخلايا‎ (MBP) ‏بولي زيم متحد الغشاء‎ mRNA ‏تم تحضير‎

Mo ‏باستعمال نفس الطريقة الموصوفة في المثال أ لتحضير م811 في خلايا‎ ‏الثاني‎ cDNA ‏خطوة “ : تفاعل شريط‎ Vo . ‏الأول ) خطوة ؟ ) إلى معلق في‎ cDNA ‏أعيد تحويل كرية شريط‎ ‏مل من الماء وأجرى تخليق الشريط الثاني في خليط تفاعل نموتنجي‎ ٠ ‏؛ حضت التفاعل‎ RNAse H ‏في 2.0011 ليجاز 5.0011 و‎ ١ ‏بواسطة بوليمراز‎ ‏؛ أوقف التفاعل‎ YY ‏ساعة عند‎ ١ ‏طول الليل عند ١١٠7م ؛ ثم حضن لمدة‎ ‏بإضافة إديتا 201 واستخلص بواسطة فينول / كلوروفورم‎ vy, ‏من ثالث فوسفات الغير مندمج عن طريق‎ cDNA ‏؛ فصل‎ phenol/chloroform

CDNA ‏كروماتوغرافي فوق عامود 01-48 ؛ جمعت الأجزاء المبعدة وجمع‎ .ethanol ‏بترسيب الإيثانون‎

خطوة £ : تحضير ‎DNA‏ الذي يتم إدخاله للخلية ليغير من النسوع الوراثي والمناخي على الخلية ويلتف على طول ‎DNA‏ الطبيعي. أعيد تحويل كربة ‎cDNA‏ (خطوة ) إلى معلق في ‎VO‏ ميكرولتر من الماء أضيفت ‎Homopolymeric C "tails"‏ إلى نهايات ‎cDNA‏ بإضافة ‎٠١‏ ‏م ميكرولتر من محلول ‎cDNA‏ إلى ‎Yo‏ ميكرولتر من خليط التفاعل النمونجي مع ترانسفيراز نهائي ‎transferase‏ والتحضين عند ١7م‏ لمدة ‎٠‏ دقافق؛ أوقف التفاعل بإضافة إديتا ‎EDTA‏ حتى 50 مللي مولار وإيقاف ‎Lal‏ ‏بالحرارة عند 8م لمدة ‎٠١‏ دقائق . ١٠نانوجرام‏ من ‎cDNA‏ المضاف له نيل ‎was annealed‏ بواسطة ‎ol ea sil 5 ٠‏ مسن ‎GL mall pBR322‏ له ذيل -6 . ‎٠‏ يشتري من 10577 في ١٠ميكرولتر‏ من ترايس ‎٠١ Tris‏ مللي مولار ؛ أس هيدروجيني ‎٠,8 pH‏ إديتا ‎la) EDTA‏ مولار وكلوريد صوديوم ‎Ale ٠٠١ sodium chloride‏ مولار . حضن التفاعل ‎was annealed‏ لمدة ‎٠١‏ ‏دقائق عند 18م ؛ ثم لمدة ساعتين عند ‎#١‏ "م. خطوة © : التحول البكتيري نميت سلالة 1061 140 في ‎Ecoli‏ في شوربة ‎L- Broth‏ مبردة فوق للج ء حصدت بالقوة الطاردة المركزية وعولجبست بكلوريد كالسيوم لتحضيرها للتحول . حضن © ميكرولتر من تفاعل ‎cDNA annealing‏ بواسطة ‎٠٠‏ ميكرولتر من بكتيريا عولجت بكلوريد كالسيوم . أجريت ‎(V0)‏ تحول باستعمال كل ‎annealed cDNA‏ وتم انتشاره فوق شرائح 10 سم من شوربة ‎“٠‏ أجار ‎agar L-‏ 901 تحتوي على ‎٠١‏ ميكرولتر / مل تتراسككلين ‎tetracycline‏ . نمت ‎٠٠٠١‏ مستعمرة تقريباً فوق كل شريحة. خطوة ‎١‏ : شرائح التكاتم التقطت كل من ‎٠٠.٠٠١‏ مستعمرة من التحول بواسطة ملقط ‎١‏ ) نقلت إلى شرائح طازجة ( 00* لكل شريحة في شبكة ) ونميت طول الليل عند ‎CTY‏

رفعت المستعمرات من كل شريحة عن طريق ضغط مرشح نيترو سيليلوز ‎nitrocellulose‏ جاف بقوة سطح الشريحة . تمت تحضير مرشحين ‎HSE‏ من كل من هذه المرشحات الرئيسية . خزنت المرشضحات الرئيسية عند 4 أم وعولجت مرشحات التكاثر بقاعدة وأعيدت ثانياً لتحضيرها للتهجين. هه خطوة ‎V‏ : تحضير قضبان تهجين محملة ب ‎Zp‏ ‏تم عزل حشو ‎cDNA‏ من ‎pCSF-1‏ بالهضم بواسطة أنزيم تحديد الخاص ب ‎E.coli‏ والفصل الكهربي في جيل أجاروز ‎agarose gel‏ مع ترايس أسيتات وايتيديوم بروميد ‎Tris acetate and ethidium bromide‏ . قطعت الحلقة المحتوية على جزء ‎cDNA‏ من الجيل ونقيت بطريقة الزجاج المسحوق ‎٠‏ ( المجروش ). أضيف بعد ذلك ‎Veo‏ نانوجرام من جزء ‎cDNA‏ إلى ‎١‏ ميكرولتر من بفر بوليمراز ‎١,77 ( 10x TADNA‏ مولار ترايس أسيتات ‎Tris acetate‏ ¢ أس هيدرو جيني ‎pH‏ 0,4 أسيتات بوتاسيوم ‎potassium acetate‏ 17 مولاراء؛ ‎١‏ مولار أسيتات ماغنسيوم ‎magnesium acetate‏ و ‎٠١‏ مللي مولار ثاني م ثيويوريتول ‎dithiothreitol‏ ) و ¥ وحدات من بوليمرات ‎DNA polymerase‏ 14 ( معامل انجلترا ) وخففت بالماء حتى ‎٠١‏ ميكرولتر بعد الحضانة لمدة ه - ‎٠١‏ ‏دقائق عند 7١72م‏ . تم اتحاد هذا الخيط بواسطة ‎١‏ ميكرولتر من بفر بوليمراز ‎١ 10 x 14 DNA polymerase‏ ميكرولتر من محلول ¥ مللي مولار من كل من ‎dGTP, dTTP, dCTP‏ و ‎٠١‏ ميكرولتر من ‎٠١ ( 32PAATP‏ وحدات ‎٠٠١ « Cilui‏ ‎٠‏ - مليمول ‎CF‏ و * وحدات من بوليمراز ‎TrDNA‏ . ثم تحضين التفاعل لمدة ‎٠١‏ ‏دقائق إضافية عند ‎١‏ م. فصلت ثالث فوسفات ‎triphosphates‏ الغير مندمجة من ‎cDNA‏ المحمل عن طريق كروماتوغرافي فوق عامود سيفادكس ‎Sephadex‏ 6100 . تم تحضير قضيب ثاني من أوليجو نيوكليوتيد ‎oligonucleotide‏ مخلق له التتابسع :

$A ‏الذي هو تكميلي للنهاية الأمينو في منطقة شسفرة‎ ATC TGG CTG CAC AG ‏عند نهاية‎ PP dATP ‏حمل هذا الأوليجو نيوكليوتيد»000616010عزاه ب‎ . CSF ‏النموذجي.‎ polynucleotide kinase ‏و باستعمال تفاعل بولي نيوكليوتيد كيناز‎

GM-CSF ¢DNA ‏عزل أقطاب‎ : A ‏خطوة‎ ‏مع‎ clones £0 ‏بنفس طريقة فحص الهجين النموذجي ؛ تم تهجين‎ ° ‏تقريباً هجنت أيضاً إلى قضيب‎ 7٠ ‏المحمول ب 74 ؛ من هذه‎ pCSF-1 cDNA ‏أوليجو نيوكليوتيد المحمل . أتبعت منطقة القفرة في واحدة من هذه‎ ‏وأظهرت تفاصيل التتابع عدد من البدائل الأساسية (قاعدية) ؛ بعضها أدى إلى‎ ‏اختلاف الحمض الأميني في البروتين المنسوخ . وهذه الاختلافات موضحة في‎ ‏البشسري المتحد في‎ GM-CSF ‏الخاص بجين‎ DNA ‏فوق تتابع‎ ١ ‏الشكل‎ ٠ ‏المّال أ.‎

LYMPHOCYTE ‏الخاص بالخلايا الليمفوسيت‎ mRNA ‏من‎ GM-CSF ‏اتحاد‎ ‏في أطراف الدم‎

LYMPHOCYTE ‏من خلايا الليمفوسيت‎ mRNA ‏تحضير‎ : ١ ‏خطوة‎ Vo ‏في أطراف الدم.‎ ‏من 4 نواتج‎ pall ‏من أطراف‎ Lymphocyte ‏ليمفوسيت‎ LIA ‏تم تحضير‎ ) ‏فصل بلازما ) ( تشتري من الهلال الأحمر‎ ( plamapheresis ‏بلازما فيربس‎ ‏في‎ RPMI 1540 ‏الكثافة الخفيفة في وسط‎ ficoll Hypaque gradient ‏بالتجزئة فوق‎ ‏؛ فيتوهيمو أجليوتينيسن‎ %0 fetal calfserum ‏وجود سيرم جنين البقر‎ Yu ‏نانوجرام / مل فوربول ميريسات أسيتات‎ ٠١ ‏و‎ 960,117 phytohemmaglutinin ‏خلية/ مل ( تم الححصسول على‎ ١٠١» ‏بكثافة ؟‎ (PMA) phorbal myristate acetate ‏الخلايا بالقوة الطاردة المركزية‎ Ga as ) ‏خلية‎ ٠١ » + ‏عدد كلي‎

‎rpm ٠٠١ (‏ / دقيقة ) غسلت مرة بواسطة محلول ملح متعادل ‎(PBS liu silly‏ وفي النهاية جمعت بالقوة الطاردة المركزية. تم تحضير ‎RNA‏ السيتوبلازمي ‎Cytoplasmic‏ عن طريق طريقة التحلل برفق التي فيها أعيد تحويل الخلايا إلى معلق في ‎5٠‏ مل من بفر تحلل 0 ترايتون ‎Triton‏ بارد (كلوريد صوديوم 560 مللي مولار ؛ كليوريد ماغنسيوم مللي مولار ترايس ‎٠١‏ ملي مولار 0 أس هيدروجيني 011 ‎AT‏ ؛ ترايتون ‎X-100 Triton‏ 960,5 ) مع ثاني تيويوريتول ‎se) + (DTT) dithiothreitol‏ ‎JY se‏ و ‎٠ RNAsIn‏ © وحدة / مل ( يشتري من بيوتيك ‎(Biotec‏ . سم ناتسج التحليل هذا في جزأين متساوين ووضع كل جزء في طبقات فوق وسادة ‎٠١‏ ‎de ٠‏ من بفر تحلل يحتوي على سكروز 9670 . انتزعت أنوية الخلايا بالقوة الطاردة المركزية في البارد ( ؛أم ء 500 «مء لمدة © دقائق ) انتزعت برفق الطبقة العليا ( خلاصة السيتوبلازم ‎cytoplasmic‏ ( وأضيف صوديوم دوديكيل سلفات ‎(SDS) sodium dodecyl sulfate‏ حتى تركيز نهائي ‎90١‏ . استخلص هذا المحلول مرتين بواسطة حجم مساو من فينول كلوروفورم ‎٠‏ (خليط ‎١ : ١‏ ) ورسب 88 بإضافة 0,¥ حجم من ‎ds)‏ بارد . جمع ‎RNA‏ المرسب بالقوة الطاردة المركزيسة ( ‎١١‏ دقيقة بمعدل ‎(rpm 5٠٠١‏ وأعيد تحويله إلى معلق في ترايس ‎١.01 Tris‏ مولار ؛ أس هيدروجيني ‎PH‏ ‎V,0‏ ¢ إديتا ‎١ EDTA‏ مللي مولار ؛ كلوريد صوديوم ‎+,Yo chloride sodium‏ مولار ( بفر 11 ؛ كلوريد صوديوم ‎١,75‏ مولار ) وأعيد ترسيبه بإضاغفة ‎Yo‏ ‎٠.‏ حجم من الإيثاتول ‎ethanol‏ البارد . في التهاية جمع ‎RNA‏ بالقوة الطاردة المركزية وأعيد تحويله إلى معلق في © مل من الماء وكان الإنتاج النهائي ‎٠,5‏ ‏مجم. ‏تم عزل ‎RNA‏ حامل الرسالة مسن ‎RNA‏ السيتوبلتزمي ‎cytoplasmic‏ ‎ASH‏ عن طريق الاختيار فوق أوليجو ‎dT‏ سيليلوز ‎cellulose‏ . سخن ‎Y,0‏ مجم ou

V0 ‏دقائق . أضيف كلوريد صوديوم إلى‎ ٠ ‏الكلي إلى 66م لمدة‎ RNA ‏من‎ ‏هذا‎ RNA ‏أن يبرد لدرجة حرارة الحجسرة . وتم امرار‎ RNA ‏مولار وسمح ل‎ ‏مولار‎ 0,0 + TE ‏سيليلوز موزون في‎ dT ‏مل من أوليجو‎ ١ ‏فوق عامود‎ ‏الغير متحد بغسل العامود بشدة‎ RNA ‏كلوريد صوديوم ( بفر اتحاد ) . انتزع‎ ‏حامل الرسالة المتحد مع ¥ مل من الماء‎ RNA ‏هه بواسطة بفر اتحاد . استحلب‎ ‏من كلوريد صسوديوم ءٌ مولار و 0,¥ حجم من‎ der, YALL ‏ورسب‎ ‏دقيقة‎ We ( ‏المرسب بالقوة الطاردة المركزية‎ mRNA ‏الإيثانول البارد ؛ جمع‎ ) ‏ميكروجرام‎ ٠٠١ ‏وأعيد تحويل الكرية النهائية ( تقريباً‎ . (rpm 75,0060 ‏بمعدل‎ ‏ميكرولتر من الماء.‎ 5٠ ‏إلى معلق في‎ ‏الأول‎ cDNA ‏خطوة ؟ : تفاعل شريط‎ ١ ‏ميكرولتر من تفاعسل‎ ٠٠ ‏في‎ 031, MRNA ‏ميكروجرام من‎ Yo ‏خفف‎ ‏؛ أس هيدروجيني‎ Tris ‏مللي مولار ترايس‎ ٠٠١ ‏المحتوي على‎ cDNA ‏تخليق‎ ‏مولار‎ A ٠١ ¢ potassium chloride ‏مللي مولار كلوريد بوتاسيوم‎ ١160 » AE ‏مللي مولار "- ميركابتو‎ ٠١ » magnesium chloride ‏كلوريد ماغنيسسيوم‎ dATP , dGTP, dCTP ‏ميكرو مولار من كل من‎ 5560 mercaptoethanol ‏ليثانول‎ ٠م‎ (VAY ‏متوسط حجم‎ ( dT ‏»؛ © ميكروجرام من أوليجبو‎ and dTTP

CC نمةدحو"١و‎ ( ‏عامسسلت‎ £++ ( 32P dCTP ‏من‎ uCi 76 « primer ‏صورة‎ ‏وحدة من‎ ٠١ ‏يدئ التفاعل بإضافة‎ RN Asin ribonuclease ‏متبط ريبونيوكلييز‎ ‏أوقف‎ . EY ‏دقيقة عند‎ saad ‏وحضن‎ SFY ‏أنزيم التحول العكسي عند‎ ‏مولار واستخلص بواسطة حجم‎ J 560 ‏التفاعل بإضافة إديتا 20714 إلى‎ vy. ‏المشبع بالماء . أعيد استخلاص الفينول مرة ثاتية‎ phenol ‏مساو من الفيتول‎ ‏؛ جمعت القواعد المائية . فصلت هجائقن‎ TE ‏ميكرولتر من بفر‎ 5٠ ‏بواسطة‎ ‏الغير متدمج بإمرار الطبقة‎ triphosphates ‏من ثالث فوسفات‎ cDNA/RNA ‏يشتري من‎ ( CL 4B Sepharose ‏المائية المتجمعة فوق © مل من عامود سيفاروز‎ ‏متوازن بواسطة ( مع ) 18 . جمعت الأجزاء التي أبعدت من‎ ) Sigma ‏سيجما‎ vo

‏ملي مولار كلوريد صوديوم ورسبت الأحماض‎ You ‏العامود أحضرت إلى‎ ‏النووية بإضافة 0,¥ حجم من الإيثانول البارد . جمعت الهجائن بالطرد‎ ‏أعيد تحويل الكرية النهائية‎ rpm 50.000 ‏دقيقة بمعدل‎ *٠ ‏المركزي لمدة‎ ‏ميكرولتر من الماء.‎ ٠٠ ‏في‎ (cDNA ‏ميكروجرام من‎ ,© ( ‏الثاني‎ cDNA ‏خطوة “ : تفاعل شريط‎ ° ١ ‏المزدوج لأنزيمات بوليمراز‎ Sl ‏الثاني‎ cDNA ‏خلق شريط‎ ‏في 82.6011 احتوى‎ RNAse H ‏و‎ E.coli ‏في‎ DNA ‏وليجاز‎ «E.coli ‏في‎ DNA ‏مللي مولار ترايس ؛ أس هيدروجيني‎ ٠١ ‏ميكرولتر ) على‎ ٠٠ ( ‏خليط التفاعل‎

Yo ¢ EDTA ‏مللي مولار ويتا‎ ٠١١ ¢ ‏مولار‎ lof ‏كلوريد ماغنيسيوم‎ » A dTTP ‏و‎ dCTP , dGTP , dATP ‏ميكرومولار من كل من‎ ٠٠١ ‏ء‎ NAD Nas Sia 3. ‏.أجرى التفاعل بإضافة ؟‎ (Ci/mmole ٠.٠٠٠١ ) 320 dCTP ‏من‎ uCi 560 ‏و‎ ‎RNAse 11 ‏وحدة‎ +,¥Y0 ‏وحدة ليجاز م0118 و‎ +,0 ¢ RNA ‏وحدات من بوليمراز‎ ‏ساعة ؛ ثم أوقف‎ ١ ‏ساعة . ثم عند ”م لمدة‎ ١8 ‏لمدة‎ aT ‏وحضن عند‎ . ‏مولار واستخلص بواسطة حجم مساو من الفينول‎ Je 560 ‏بإضافة إديتا إلى‎ ‏جمعت‎ «TE ‏أعيد استخلاص طبقة الفينول بواسطة 00 ميكرواقر من‎ ١و‎ - ‏من ثالث فوسفات الغير مندمسج عن طريق‎ cDNA ‏الطبقات المائية وفصل‎ 01-48 Sepharose ‏فوق عامود سيفاروز‎ chromatography ‏كروماتوغرافي‎ ‏حول كميات‎ 32P ‏كما وصف أعلاه للشريط الأول . واعتمادا على إندماج‎ ‏الأول إلى الصورة مزدوجة الأشرطة.‎ cDNA ‏شريط‎ ‏الذي يتم إدخاله للخلية لكي يغير من‎ (DNA ‏خطوة ؛ : تحضير‎ 0 ‏الطبيعي.‎ DNA ‏النوع الوراثي والمناخي على الخلية ويلتف حول‎ ‏بالتسخين برفق‎ cDNA ‏إلى نهايات‎ Homopolymeric © ‏أضيق ذيول‎ ‏ميكرولتر من خليط تفاعل يحتوي‎ 5٠ ‏نانوجرام من 0118 في‎ 20s oY ¢ 2-mercaptoethanol Js— 3G ‏نانو مولار من ¥ ميركابتو‎ ١ ‏على‎ ‏مللي مولار من 00012 و 4 وحدات من ترانسفؤيراز ديوكسي نيوكليوتيد‎ ١ ‏النهاتي عند ١7م لمدة © دقائق . أوقف‎ terminal deoxynucleotidyl transferase ٠١ ‏بإضافة إديتا 207 إلى £0 مللي مولار وسخن حتى 18م لمدة‎ Jeli 250٠0 ‏بواسطة‎ was annealed ‏المضاف له ثيل‎ cDNA mal yagi Yoo ‏دقائق ؛‎ 0 ) Amersham ‏المضاف له ذيل -6 ( يشترى من أميرقام‎ PAT 153 ‏نانوجرام من‎ ‏مللي مولار ؛ أس هيدروجيني 7,5 ؛ إديتا‎ ٠١ Tris ‏ميكرولتر من ترايس‎ ٠٠١ ‏في‎ ‎annealing Jeli ‏مللي مولار . أجرى‎ ٠٠١ ‏مللي مولار » وكلوريد صوديوم‎ ١ ‏أم لمدة ساعتين بعد © دقائشق فترة حضانة سابقة عند 8 أم.‎ #١ ‏عند‎ ‏خطوة © : التحول البكتيسري‎ Va

MC1061 E.coli ‏مباشرة لتحويل سلالة‎ cDNA annealing ‏استعمل ناتج تفاعل‎ ‏مل من شوربة‎ © ٠ ‏استعملت مستعمرة طازجة من الخلايا البكتيرية لتلقيح‎ 00. ‏عند‎ +, Yo ‏ونميت لعدة ساعات حتى كانت الكثافة الضوئية‎ L-Broth ‏فوق التلج وحصدت بالقوة الطاردة المركزية‎ LSA ‏بردت‎ nm ‏نانومتر‎ ‏مل من‎ ٠١ ‏دقائق ) . أعيد تحويل الكرية إلى معلق في‎ ٠١ ‏«م لمدة‎ ٠٠٠١ ‏م(‎ ‎٠ ‏مولار وسمح لها أن تبقى فوق الثلج لمدة‎ ١0٠ ‏كلوريد الكالسيوم البارد‎ ) ‏لمدة دقائق‎ rpm ٠٠٠١ ( ‏دقائق . جمعت الخلايا بالقوة الطاردة المركزية‎ ٠ ‏مولار ء‎ ١٠ ‏مل من كلوريد كالسيوم‎ Yo ‏وأعيد تحويلها إلى معلق في‎ ‏ميكرولتر من‎ ٠٠١ ‏مع‎ cDNA anneading ‏ميكرولتر من تفاعل‎ ٠١ ‏حضن‎ ‏بكتيريا عولجت بواسطة كلوريد كالسيوم لمدة © دقيقة فوق الثلج ؛ ثم لمدة‎ © ‏والتحضين‎ L- Borth ‏مل من شوربة‎ +A ‏دقيقة عند 7١م - يلي ذلك بإضافة‎ " ‏دقيقة عند ١7م . وفي المتوسط نمت 1,550 مستعمرة‎ ١ ‏النهائي لمدة‎ ‏بكتيرية على شريحة حتى وصل العدد الكلي 70.0060 مستعمرة.‎ oy ‏التكاثر على الشرائج‎ : ١ ‏خطوة‎ ‏نقلت المستعمرات الأصسلية النامية على كل شريحة إلى مرشحات‎ ‏مم عن طريق ضغط مرشح جافق فوق‎ ١١ nitrocellulose ‏نيتروسيليلوز‎ ‏المستعمرات ورفعهم من على الشريحة . تم تحضير سلالتين متطابقتين من‎ ‏م كل مرشح أصلي عن طريق ( طرق نموذجية للتكاثر على الشرائح ) طرق‎ ‏نموذجية للتكاثر على الشرائح فيها وضع بعناية كل مرشح أصلي والمستعمرة‎ ‏مثبتاً على‎ - (Whatman 3 MM) ‏إلى أعلى على مربع معقم من ورق ترشيح‎ ‏قطعة مربعة من الزجاج يثبت بعناية مرشح نيتروسيليلوز جديد سبق ترطيبه‎ ‏فوق المرشح الرئيسي ويغطى بواسطة مربع ثاني معقم من ورق الترقيح‎ ‏بقوة مع قطعة ثاني من الزجاج . أعطيت‎ Lee ‏ويضغط السندوتش الكامل بعد ذلك‎ ٠ ‏المرشحات المضغوطة في صورة سندوتشات أرقام وقد عمل ©“ تقوب في‎ ‏حجم رأس الدبوس من خلالهم بصورة غير متماثئلة بحيث يتم جمعهم معاً في‎ ‏المستقبل ؛ نتزعت السلالات من الأم ووضعت والمستعمرة إلى أعلى فوق‎ ‏شريحة شوربة أجار تحتوي على تتراسيكلين . وتم تحضير سلالة ثانية في‎ ‏الحال بنفس الطريقة . أعيد كل مرشح رئيسي إلى شريحة وحضتت كل‎ ve ‏مم‎ ١ ‏الشرائح عند 77م لعدة ساعات حتى وصلت المستعمرات البكتيرية إلى‎ . . ‏تقريبا في القطر ؛ خزنت المرشحات الأم الأصلية 4 أم وتم تحضير السلالات‎ ‏للتهجين كما وصف أسفله.‎ ‏خطوة 7 : تحضير المرشحات للتهجين‎ ‏وضع كل مرشح تكاثر ( خطوة 6 ) والمستعمرة إلى أعلى فوق ورقة‎ Ye ‏مغموسة في هيدروكسيد صسوديوم 1,0 مولار‎ (Whatman 3 MM) ‏ترشيح‎ ‏دقائق . نقلت المرشحات إلى ورق‎ ١ ‏مولار لمدة‎ ٠,5 ‏كلوريد صوديوم‎ ‏مد‎ pH ‏ترشيح التعادل ؛ غمست في ترايس « 1 أس هيدروجيني‎ ‏مولار لمدة ؟ دقيقة ؛ ثم نقلت إلى‎ 1,0 sodium chloride ‏كلوريد صوديوم‎ ‏دقائق . في النهاية وضعت‎ mos JA Gl ‏مجموعة مرشحات تعادل‎ YO ot sodium Citrate a s— sea ‏سترات‎ ) SSC ‏المرشحات فوق مرشحات مغموسة في بفر‎ ‏لمدة‎ ) 4 pH ‏صوديوم 8 مولارا أس هيدروجيني‎ dye Io ‏مولار‎ ٠ "-١ ‏دقائق جففت بالهواء ومرة أخرى تحت ضغط عند ١م لمدة‎ © ‏ساعة.‎ ‎GM-CSF lL bd ‏عزل‎ : A ‏خطوة‎ ° pCSF-1 cDNA ‏حولت مرشحات في أزواج إلى قضبان بواسطة حشو من‎ ٠١ ‏؛ محضر كما وصسف أعلاه في المثال ب ؛ التقطت‎ dade ‏محمل بمادة‎ ‏من هذه من المرشح الرئيسي ونميست‎ VY ‏التقط‎ . cDNA ‏مستعمرة هجين مع‎ ‏لمزيد من التحليل ؛ أشارت مكونات هضسم‎ 1- borth ‏طول الليل في شوربة‎ ‏تحضير سريع ) من هذه الأقطاب أن هناك‎ ( DNA ‏لعينات‎ (Pst 1) ‏أنزيم التحديد‎ ٠

GM-CSF ‏قرب الطول الكامل ؛ أتبع واحد من هذه وكان تتابع منطقة شفرة‎ * .365-057-116 ‏مطابقاً لتتابع 0057 المقابل ولكن به 7 عند الموضع‎ clona ‏في هذا‎ ‏المنال د‎ ‏أدخل‎ CHO ‏في بلازميد خلايا‎ GM-CSF ‏التحول المساعد وتكبير تتابع‎ (Chasin ‏ع‎ CHO DHFR leafy ‏في خلايا 01716161311 التي‎ p91023(B)-CSF yo

LS protoplast ‏عن طريق اتحاد البروتوبلاست‎ Urlaub PNAS 77:4216, 1980) ‏وقد وصف نمو‎ (Sandri-Goldin et al., Mol. Cell. Bio. 1 743-752, 1981) ‏وصف‎ ‎(Kaufman & Sharp, J. Mol. CHO Bio 150 601-621 1981) ‏وثبات ) بقاء ) خلديا‎

E.coli 13101 ‏إلى‎ p91023(B)-CSF-1 ‏بالنسية لآحاد البروتوبلاست أدخسل‎ ‏مل من أملاح 9« تحتوي على أحماض كوسامينو‎ © ٠ ‏ونميت البكتيريا في‎ © ‏حتسى‎ - tetracycline ‏مل تتراسهككلين‎ / مارجوركيم٠١و‎ 960.6 casamino acid ‏حتى‎ Chloramphenical ‏أضيف كلور و أمفينكول‎ nm 1٠١ ‏عند‎ ٠,4 ‏امتصاص‎ ‏ميكروجرام / مل وحضتت المزرعة عند 77م لمدة 7١ساعة إضافية‎ YOu ‏لتكبير عدد نسخ البلازميد . أجرى طرد مركزي للخلايا بمعدل 00860 ع* لمدة‎ oo ‏مل من سكروز 9670 مبرد - في ترايس‎ Yio ‏دقائق عند ؟ أم وعلقت في‎ ٠ ‏ضيف‎ ApH ‏مللي مولار ؛ أس هيدروجيني‎ © ٠ Tris chloride ‏كلوريد‎ ‏مل من محلول © مجم / مل في ترايس كلوريد‎ ١.5 ( Lysozyme ‏ليزوزيم‎ ‎. ‏وعلق الخليط فوق التلج لمدة © دقائق‎ (A ‏.؛ مولار ؛ أس هيدروجيني‎ 8 ‏لمدة‎ (A ‏مل من إديتا 725 مولار ؛ أس هيدروجيني‎ ١ ( EDTA ‏م أضيف إديتا‎ ٠,٠6 ‏مل من ترايس كلوريد‎ ١ ‏دقائق إضافية فوق الثلج ؛ ثم أضيف ببطء‎ © ‏حتى مولت‎ a TY ‏دقيقة عند‎ Ve ‏حضن المعلق لمدة‎ oA ‏مولار ؛ أس هيدروجيني‎ ٠١ ‏ثم خفف المعلق ببطء بواسطة‎ . protoplasts ‏البكتيريا إلى بروتوبلاست‎ ‏وكلوريد ماغنسيوم‎ 906٠0 ‏مل من وسط سبق تسخينه يحتوي على سكروز‎ ‏دقيقة . أضيف محلول‎ ١١5 ‏لمدة‎ ATTY ‏مم وسخن عند‎ ٠١ magnissium chloride ٠

DUKX-B11 a « CHO ‏ب" / مل تقريباً )إلى‎ ) protoplasts ‏البروتوبلاست‎ ‏خلية / وعاء تقريباً ) بنسبة‎ ٠١ XY - ١ ( ‏في + شرائح‎ DHFR ‏التي يتقصها‎ ‏بروتوبلاست / خلية تقريبا وكورت البروتوبلاست في الخلايا‎ ٠١» ‏؟‎ -١ ‏تدم لمدة 8 دقائق في جهاز دوار‎ ٠٠٠0١0 ‏عن طريق الطرد المركزي بمعدل‎ ‏بعد الطرد المركزي انتزع العائم بالشنغطء‎ TEC ‏موديل‎ swinging microtiter dish ve ٠0 polyethylene glycol ‏جليكول‎ ola ‏أضيف كمية ؟ مل من محلول بولي‎ + ‏في © مل من وسط - إلى كل وعاء من‎ (PEO-1450, (Baker Chem. Co.) ‏مم من‎ 0 ‏لمدة‎ RPM 7٠٠١ ‏أوعية ) أجرى طرد مركزي مرة ثانية للخلايا بمعدل‎ ‏وشطفت‎ polyethylene glycol ‏ثانية ؛ انتزع محلول البولي (يثيلين جليكول‎ ‏الشرائح “ مرات بواسطة ؛ مل من الوسط / وعاء . أضيف تربيسين للخلايا‎ ٠ ‏؛ وأجبري طرد‎ 96٠١ ‏مل من الأوساط المحتوية على سيرم جنين البقر‎ ٠١ ‏في‎ ‏في جهاز طرد مركزي‎ 18014 0٠٠ ‏مركزي في أنبوبة مخروطية بمعدل‎ ‏جمعت الخلايا المكورة من ¥ أوعية ووضعت في طبق‎ . 8 clinical ‏أكلينكي‎ ‎/ ‏ميكروجرام‎ ٠٠١ ‏سم . أضيف وسط طازج يحتوي على‎ ٠١ ‏مزرعة أنسجة‎ ¢ adenoxine ‏أدينوكسين‎ » thymidine (pa sad ¢ kanamycin ‏مل من كاناميسين‎ Yo

ديوكسي أدينوسين ‎deoxyadenosine‏ » بنسلين وسوربتوبيسين ‎penicillin and streptomycin‏ وسيرم جنين البقر ‎96٠0 calf serum‏ أجرى له عملية دياليسيز ‎dialyzed‏ إلى كل شريحة . وقد ضم الكاناميسسين ‎kanamycin‏ ‏ليمنع نمو البكتيريا التي هربت من التحول إلى بروتوبلاست ‎protoplasts‏ ° بعد يومين زرعت الخلايا ‎١5 : ١‏ في أوساط ‎Wh‏ بواسطة سيرم جنين البقر ‎al 96٠0‏ 5 له دياليسيز ‎dialyzed‏ ¢ بنسلين ‎penicillin‏ ¢ ستر بتوميسين ‎streptomycin‏ ولكن يتقص النيوكليوزيدات ‎nucleosides‏ ¢ كزيت الخلايا مرة ثانية بواسطة نفس الأوساط الاختيارية ( التي يتقصها النيوكليوتيزيدات ‎lacking nucleosides‏ ) بعد ؛ - 6 أيام. ‎y‏ ظهرت المستعمرات بعد ‎VY - ٠١‏ يوم بعد تحت الأستزراع في أوساط اختيارية وقد أتبع تخطيطين خطين لاختيار الميتوتريكسات ‎(MTX) methotrexate‏ وتكبيره . في التخطيط الأول تم عزل محولات فردية متحدة على أساس سخ ‎DHFR‏ يلي ذلك أن كل ‎cione‏ أمتد تحت ظروق لتكبير عدد ‎DNA fill‏ الأجنبي بمعنى التمو في تركيزات متزايدة من الميثوتريكسات . في التخطيط الثاني ‎Lone ‏ومدت‎ DHFR ‏.تم عزل بقعة من تحولات مستقلة عديدة على أساس نسخ‎ ١ ‏الأجنبي بمعنى النمو من تركيزات متزايدة من‎ DNA ‏تحت ظروف لتكبير ال‎ ‏الفردية من الكتلة المختارة وحللت من أجل‎ clones ‏الميثوتريكسات . ثم تم عزل‎

GM-CSF ‏من نسسخ‎ Ale ‏التي لها مستويات‎ slones ‏نميت هذه‎ . GM-CSF ‏نسخ‎ ‏الأجنبي ( بمعنى النمو في تركيزات‎ DNA ‏مرة ثانية تحت ظروف التكبير‎ ‎.) ‏في أوساط المزرعة‎ methotrexate Clay ig Tall ‏متزايدة من‎ YL ‏في تجربة واحد جمعت 7 تحولات 01171 في وسط ألفا بنقصسه ‏! النيوكليوزيدات ‎nucleosides‏ ¢ نميت هذه الخلاديا بعد ذلك في تركيزات متصاعدة متزايدة من ‎MTX‏ بداية من عند ‎٠507‏ ميكرو مولار ثم التسلسل حتى ‎١‏ ¢ 69 و ؟ ميكرو مولار ‎MTX‏ . وعند الفحص لنشاط ‎GM-CSF‏ في تجربة ov خلية ‎KG-1‏ كونت هذه ‎LDN‏ من ‎Fees‏ حتى ‎١1,٠٠١٠‏ وحدة / مل . تم اتحاد المجموعة المختارة ‎١,5‏ ميكرو مولار 11176 وفي ¥ ميكرو مولار ‎SMTX‏ التي تم الحصول عليها في 0,+ ميكرو مولار ‎D2, and B6) MTX‏ ,010( اختيرت بعد ذلك للنمو في ‎MTX‏ ¥ ميكرومولار ؛ وعندما فحصت لنشاط ‎GM-CSF‏ ‎٠‏ في تجربة خلية 1266-1 ؛ تكونت خطوط الخلايا المتحدة من ‎15,٠080‏ حتى ‎Yr, ov»‏ وحدة / من نشاط ‎GM-CSF‏ و ‎GM-CSF‏ المتكون طبقاً لهذا ‎Jt‏ له ‏تتابع الحمض الأميني المعطي ل 57-1 في الشكل ‎.١‏ ‎Ja)‏ ه نسخ ‎GM-CSF‏ في ‎E coli‏ من حامل 011.0-1857 وقد قدم وصسف ‎GM-CSF ‏تخطيطي له في الشكل > يبداً التتابع الكودي الذي يحمل شسفرة‎ ٠ ‎ATG CCACCACCTCCTTCT CCATCT CCATCT ACT ‏بالتتابع التحليقي‎ ‏الذي يحدد شقوق الحمض الأميني الإحدى عشر الأولى في ‎GM-CSF‏ الناضج ‏وبقية التتابع الذي يحمل شفرة ‎GM-CSF‏ في ‎PTALC-185R‏ مطابق لمثيله في ‎Pest]‏ ؛ نيوكليوتيدات 46 - 447 أتبعت بالتتابع ‎TTA TAA TAG‏ وبعد ‎«١‏ النهاية الثلاثية مباشرة يوجد رابطة متعددة ‎pUC-18‏ وقد أدخل الجين المقاوم ‏للتتراسيكلين ‎tetracycline‏ من ‎pBR322‏ في الاتجاه المقابل (العكسي) للجين ‎CSF‏ ؛ ‎- ‏ويحمل الجين المقاوم‎ pUC-18 ‏قاعدة إلى اسفل من الرابطة المتعددة‎ ٠ ‏للتراسيكلين ‎tetracycline‏ بادئه الخاص . بداية عكس عقارب الساعة يأتي بعد ‏ذلك الجين الخاص ب ‎B‏ لاكتاماز ‎lactamase‏ يليه ‎Jal pUC-18 (CoLEI)‏ ‎٠‏ التكاثر. ‎GM-CST ‏قبل العودة لتتابعات‎ Plasmid ‏والصفة التركيبية النهائية للبلازميد‎

A. skatzman and ‏وهذا البادئ هو أساساً كما وصف بواسطة‎ . PL ‏هي البادئ‎

M. Rosenberg (in "Molecular cloning, a laboratory manual" (1982), Cold Spring oA ‏بعد الحسث‎ PL ‏يقوده البادئ‎ CSF ‏ونسخغخ‎ Harbor Laboratory, page 419) ‏المناسبة.‎ E coli ‏الحراري في سلالة العافل‎ ‏والسالالة الأبوية المستعملة لكل تركيبات السلالة كانت‎ -W3110 lacl’L8 (R. Brent and M. Ptashne PNAS 78 (1981) 4204-4208.

T2494 nucleotides ‏نيوكليوزيدات‎ 3. DNA ‏وقد أكتمل بواسطة الجزء‎ ° ‏وقد‎ lacZ ‏عند الموضع‎ W3110 lacl’L8 chromosome ‏الكروزوم‎ ( VAYYE ‏حتى‎ ‏تحمل‎ pBR322 ‏حدث التكامل باستعمال حامل التكامل المكون من تتابعات‎ ‏والأمبيسلين‎ © hloramphenicol ‏الجينات الخاصة بمقاومة الكلورو امقفينكول‎ (F. Bolivar Gene 4 (1978) 121-136) pBR322 ‏بالإضافة إلى أصل التكاثر‎ ampicillin ‏في الجين 7م18 الذي هو نفسه موجود على‎ 3. DNA ‏وقد أدخل الجزء‎ ٠ ‏إلى‎ Tthilll ‏حتى الموضع‎ Laci ‏البلازميد كجزء ممتد من الموضع 11 في‎ ‘ Jac? ‏أسفل فى‎ ‏فسي‎ chromosomal ‏نسخ كروموزومي‎ MA DNA ‏وقد تحقق تكامل‎ ‏حساسة‎ Lac” ‏الإاتحاد المتجانس ووجدت مستعمرات‎ sale) ‏عن طريق‎ lacZ ‏تم فحص‎ ¢ chloramphenicol ‏مقاومة للكلوروامفينتكول‎ ampicillin ‏للإمبيسلين‎ ١ . ‏الاتحاد يؤدي إلى انتزاع كل تتابعات البلازميد الزائدة ولكن‎ sale ‏حدث ثاني‎ ‏على شرائح لاككوز ماكونكسي‎ - SU SA DNA ‏يترك جزء‎ camR ¢ ‏كطصتة‎ « lac” ‏وقد تغير النوع المناخي الأول‎ . lactose MacConkey ‏بعد حدث إعادة الاتحاد الثاني . وقد‎ cam® » amp® ‏إلى النوع المناخي عقل‎ ‏يوضح هذا‎ . £Y ‏و 1 عند‎ ٠ ‏عند‎ AR ‏وكان‎ GL 400 ‏السلالة المتكونة‎ Cue wy,

CIP ‏النوع المناخي وجود نسخ كروموزومي وظيفي من النظير‎ ‏وقد جعل .61400-71 عن طريق الحث التحولي من ناتج التحلل‎ ‏وقد‎ 5020252 (lac? ‏,169نا‎ ara? 139 rpsl lon? 100:: tn10) ‏النامي على سلالة‎

- تمت معالجة 1010 بواسطة الفحص من أجل ©1716 على أوساط اختيارية ‎Maloy, W.

Nunn J.

Bacteriol. 145 (1981) 1110-1112)‏ .5). ‎CY‏ سسس_الالة العالة النيافكسية ‎REX, N), lon? 100)‏ باع 7 ‎(lacl°L8, LacZ‏ 01413. ° حولت ‎Pralc-185R‏ إلى 61413 . تميت مزرعة طول الليل من هذه السلالة عند ١7م‏ في © مل من وسط الحث يحتوي على ‎١‏ ميكروجرام من -١تتراسيكلين ‎oT tetracycline‏ وسط حث يحتوي لكل لتر: ‎٠‏ جم أحماض كوساميتو 7 جم ‎Na;HPO,7H,0‏ ‎VY.‏ جم ‎KH,PO;‏ ‎aa ©‏ كلوريد صوديوم جليسيرول ‎70١‏ ‎oY‏ مجم فيتامين ‎Bl‏ ‎٠"‏ مجم 0:.211:0ة ‎١,7 ١‏ جم ‎MgCL6H,0‏ ‏طعم هذا الوسط (* ؟مل) الذي يحتوي على ‎١“‏ ميكروجرام ‎JENS SY‏ تتراسيكلين بواسطة ‎VY YO‏ ميكرولتر من مزرعة طول الليل ورج عند ١*م‏ في حمام ماء حتى وصلت المزرعة إلى كثافة ‎Ass0.5‏ وحدرك بسرعة ‎Jl)‏ ‏بسرعة) إلى حمام ماء ‎fe‏ م ورج لمدة ساعتين إضافيتين للسماح ‎Gilad‏ ‎GM-CSF +.‏ . حصلت الخلايا ورجت لاحتوائها على ‎CSF‏ عن طريق الفصسد الكهربي بالبولي أكرزيل أميد جيل ‎polyacrylamide gel‏ ل ‎SDS‏ تحت هذه الظروف يتراكم ‎GM-CSF‏ حتى 965 تقريباً من البروتين الخلوي.

>" المثقال و نسخ ‎GM-CSF‏ في ‎Saccharomyces cerevisiae‏ = تركيب الحجامل ركب الحامل الذي أحتوى على الجين الخاص بالأنتزيم في مسار التخليق الحيوي لليوراسيل ‎(URA3) uracil‏ على هيئة جين اختبار و ؟ وحدة من أصل التناسل . أشتق هذا الجين من )1979( 17-24 ‎Y1p5 (Botstein et al., Gene 8, pp.‏ مع إضافة جزء يحتوي على أصل التكائر من بلازميد ؟ ميكرون في الخميرة. ‎Glyceraldehyde Phosphate Dehydrogenese (GPDH) va‏ تم عزل جينين ل ‎GPDH‏ من الخميرة ‎(Holland and Holland Joural of‏ ‎Biological Chemistry 255 pp 2596-2605 (1980)‏ . استعمل قضيب أوليجبو نيوكليوتيد المخلق من التتابع المنتشور لعزل جين ‎GPDH‏ من ‎Ae PL‏ الخاص ب ‎DNA‏ النووي الخاص بالخميرة بطرق نموذجية وقد رسب بلازميد يحتوي على جين 680491 الكامل ‎(ATCC No. 39777) lids‏ 0— تحضير بادئ جليسرالدهيد فوسفات ديهيدروجيناز ‎Glyceraldehyde‏ . ‎feud! Phosphate Dehydrogenese (GPDH)‏ الجين الغير متماتل. ركب بلازميد يسمح بالفراغ الطبيعي لبادئ ‎GPDH‏ من بداية الجيسن التركيبي الغير متمائل المطلوب . وقد تم ذلك بإدخال الموضع ‎Kpnl‏ في الحال فا قريبا من كودون الميثيوتنين ‎methionine codon‏ البادئ في جين ‎GPDH‏ ‏التركيبي . وبعد ذلك أدخل " التسجيل " البادئ في حامل نسخ الخميرة امه 7. ‎—A‏ عزل الجين الخاص بالعامل ألفا تم عزل الجين الخاص بعامل الاتحاد ‎factor mating pheromone Wi‏ من الخميرة )1982( 933-943 ‎(Kurjan and Herskowitz.

Cell, Vol. 30, pp.‏ امس_تعمل i ‏قضيب أوليجو نيوكليوتيد المخلق من هذا التتابع لعزل الجين من بلازميد‎

Algal ‏الخاص بنواة الخميرة عن طريق طرق‎ DNA

GM-CSF ‏ه- تحضير بلازميد نسخ‎ ‏البشري ؛ تم تركيب حامل‎ CSF ‏من العناصر التي وصفت أعلاه ؛ وجين‎ ‏الشكل ) بطرق نموذجية ؛ في هذا الحامل انتزع التتابسع‎ CATIA) ‏التسخ‎ 0 ‏الناضسج‎ CSF ‏وأدخل التتابع الذي يحمل شفرة‎ CSF ‏الطبيعي المرشد ل‎ ‏قريبا من قبل التتابع الأولى للعامل ألفا - وقد اختصرت فقط الأمصال بين‎ ‏الناضج أسفله‎ CSF ‏وما قبل التتابع الأولي للعامل ألفا - وتتابع‎ GPDH ‏البادئ‎ ‏وأكد عليها بتتابع ثاني ديوكسي نيوكليوتيد.‎

AAATAAACAAAATG.CGTTTTCCTTCA........ AAA ٠١

AGA GAG GCG GAA GCT. GCA CCC GCC CGC TCG ...........

GM-CSF fwd —YV strain of Saccharomyces cerevisiae Cells ‏من‎ Aue ‏إلى‎ AJ14 ‏ول البلازميد‎ z

CSF ‏الخلايا لتكون‎ ce

Claims (1)

1. 41+ ‎fA‏ ‏عناص الحمايسة ‎-١ ١‏ حامل ‎vector‏ يتضمن جين يحمل الشفرة الخاصة بالبروتين ‎١‏ لأولى ‎GM-CSF Y‏ الذي له تتابع الحمض الأميني المشار إليه في الشكل ‎١‏ بعد ‎v‏ السهم بالنسبة ل ‎CSF-Ile « CSF-Thr‏ و ‎CSF-G‏ أو أنواع متأخرة ‎allelic‏ ‏أو أخرى مساوية لها وظيفيا التي فيها واحد أو أككر من الأحماض ‎o‏ الأمينية ‎amino acid‏ قد أضيف ؛ أستبدل أو انتزع بدون التأثير أساسا على ‎id‏ نشاط ‎GM-CSF‏ الأولى في تجربة نخاع العظام البشري ‎‘bone marrow‏ ‎١‏ ؟- حامل ‎vector‏ طبقاً لعنصر الحماية رقم ‎١‏ ؛ الذي فيه الجين الذي يحمل ‎Y‏ الشفرة الخاصسة ببروتين ]4 تتابع الحمض الأميني ‎amino acid‏ } لمشسار ‎al‏ ‏1 في الشكل ‎١‏ بعد السهم بالنسبة ل ‎CSF-Thr‏ أو ‎CSF-lle‏ أنواع متأخرة ‎allelic ¢‏ أو أخرى مساوية لها وظيفيا كما مومعروف في عنصسر هه الحماية ‎.١‏ ‎vector dala -* ١‏ طبقاً لعنصر الحماية ‎١‏ أو ؟ ؛ الذي فيه أنواع مساية ب وظيفياً ل ‎GM-CSF‏ الأولى عندما تتقي يكون لها نشاط ‎٠١ x)‏ خلية / ‎v‏ مجم على الأقل من البروتين في تجربة ‎gL AM‏ العظمي ‎bone marrow‏ 3 البتشري. ‎١‏ ؛- حامل ‎vector‏ طبقاً لعخصر الحماية ‎١‏ أو ؟ ؛ الذي فيه الجين يحمل الشفرة 7 الخاصة بالبروتين الذي له تتابع الحمض الأميني ‎amino acid‏ المشار إليه في 1 الشكل ‎١‏ بعد السهم بالنسبة ل :57-71.

   “> ‎=o \‏ حامل ‎vector‏ طبقاً لعنصسر الحماية ‎١‏ أو ّ الذي فيه الجين يحمل الشفرة ‎y‏ الخاصة ببروتين له تتابع الحمض الأميني ‎amino acid‏ المشار إليه في . الشكل ‎١‏ بعد السهم بالنسبة ل ‎(CSF-Tle‏ ‎ —V \‏ حامل ‎vector‏ طبقاً تلعتصر الحماية ف الذي فيه الجين ‎Jen‏ الشسفرة \ الخاصة ببروتين له تتابع الحمض الأميتي ‎amino acid‏ المشار إليه في ‎١ JS 0‏ بعد السهم بالنسبة ل ‎(CSF-G‏ ‎vector Jala =A‏ طبقاً لعنصر الحماية 4 ؛ © أو + الذي فيه تتابع الحمسض ¥ الأميني ‎amino acid‏ للبروتين الذي يحمل الجين الشفرة الخامصمسة به - ‎v‏ بتضمن بالإضافة إلى ذلك عند النهاية ‎N-terminus‏ التتابع الدال الذي يسبق : السهم في الشسكل ‎.١‏ ‎١‏ 9— حامل ‎El vector‏ لعتصر الحماية 5 أو ¢ الذي فيه تتابع الحمض ¥ | لأميني ‎amino acid‏ للبروتي: الذي يحما 1 الجين الشصفرة الخاصسة بيه — ‎v‏ تضمن بالإضافة إلى ذلك شق ميثيونين ‎methionine‏ عند ‎Tiles‏ 4 ‎N-terminus ¢‏ ‎vector dels -٠١ ١‏ طبقا لعنصر الحماية ‎١‏ ؛ الذي فيه الجين يشمل التتابع كما ‎Y‏ بدئ في الشكل ‎١‏ . بدايته بعد ‎POS‏ ونهايته عند الكوندون ‎LL) condon‏ 7 للحمض الأميني ‎YY amino acid‏ ١بالنسبة‏ ل ‎CSF-Thr‏ أرى ‎.CSF-Ile‏ ‎lida vector dala -١١ ١‏ لعخصر الحماية ‎١‏ ؛ الذي فيه الجين يقل ‎DNA‏ ‎y‏ حامل الشفرة الخاصة ببلازميد ‎B Plasmid‏ 091023 المرسب تحت ‎ATCC 39754 7‏ ‎١‏ ؟١-‏ بلازميد ‎Plasmid‏ 8 91023م المرسب تحث 39754 ‎ATCC‏ ‎-١١ ١‏ خلية عائل ]1105 محولة بواسطة حامل ‎vector‏ طبقاً لأي واحد من عناصسر 7 الحماية ‎١‏ إلى ‎AY‏ at alice ‏لأي واحد من‎ tik vector ‏خلية عائل 1082 محولة بواسطة حامل‎ —V ¢ ١ .١١ ‏إلى‎ 4 go cf ‏؛ © (اعتمادا على عنصر الحماية »)؛‎ Alea x ‎-١٠# ١‏ خلية عائل ‎host‏ طبقاً لعنصر الحماية ؟١‏ أو ‎VY‏ ذات نواة أوليمة

   ‎.Procaryotic 7‏

   ‎E.coli ‏هي‎ ٠١ ‏طبقاً لعنخنصر الحماية‎ host ‏خلية عائل‎ -5 ١ ‎-١١ ١‏ خلية ‎host ile‏ طبقا لعنصر الحماية ‎١7‏ أو ‎١“‏ هي ذات نواة حقيقية

   ‎.eucaryotic Y‏ ‎yeast ‏هي الخميرة‎ ١6 ‏لعنصر الحماية‎ lik host Jile ‏خلية‎ —YA 0١ mammalian Aud ‏هي‎ ١١6 ‏لعنصر الحماية‎ lid host ‏خلية عائل‎ —13 ١ ‏هي خلية المبيسض‎ VAR lead) ‏لعخنصر‎ ks host ‏خلية عائل‎ -70 .Chinese Hamster Ovary Y ‏7 لأي واحد من عناصر الحماية ‎١١‏ إلى ‎١9‏ وعزل بروتين ‎GM-CSF‏ ‎Y‏ لعنصر الحماية ‎١9‏ أو أي من عناصر الحماية ؟١‏ حتى ‎١9‏ اعتماداً على ‎v‏ عنصر الحماية ‎VY‏ وعزيل بروتين ‎.GM-CSF‏ ‎CDNA -7* ١‏ يقابل الجين الذي سابقا (قبل ذلك) في أي واحد من عناصسر ‎Y‏ الحماية ‎١‏ إلى ‎.٠١‏ ‎CDNA -74 ١‏ يقابل الجين الذي ذكر سابقاً في أي واحد من عناصر الحماية 7 77 (اعتماداً على عنصر الحماية ‎XY‏ ( »+ 80+ و ‎Noe‏ ‎CDNA -7© ١‏ الخاص ببلازميد ‎p91023‏ المرسب تحت 39754 ‎ATCC‏