FI108796B - Menetelmä kädellisen granulosyytin/makrofagin pesäkkeitä stimuloiva tekijä -proteiinin valmistamiseksi - Google Patents

Description

1 108796

Menetelmä kädellisen granulosyytin/makrofagin pesäkkeitä stimuloiva tekijä -proteiinin valmistamiseksi Tämä keksintö koskee proteiinin valmistusta, joka 5 proteiini kykenee stimuloimaan kädellisten hematopoieet-tisten kantasolujen kasvua ja erilaistumista, erityisesti pesäkkeitä stimuloivan tekijän (CSF) valmistusta. Keksintö koskee menetelmää tuottaa CSF-proteiinia yhdistelmä-DNA-tekniikoilla, vektoreita, jotka sisältävät geenin mainitun 10 proteiinin ilmentämiseksi, mainituilla vektoreilla muunnettuja mikro-organismeja ja solulinjoja. Esitetään menetelmä CSF-proteiinin eristämiseksi ja puhdistamiseksi, joko luonnon- tai rekombinaatiolähteistä. Puhdistetun CSF-proteiinin puhtausaste ja aktiivisuustaso ovat minkä ta-15 hansa aiemmin raportoidun yläpuolella.

Verestä löydetyt monet erilaiset solutyypit ovat kaikki peräisin monitehoisista hematopoieettisista kanta-soluista. Kantasoluilla on kaksi funktiota: (1) ne monistavat itseään ja ylläpitävät siten kan- 20 tasolupopulaation kehossa ja (2) ne aikaansaavat jälkeläissoluja, jotka erilaistuvat miksi tahansa kypsäksi verisolutyypiksi.

Solua, joka erilaistuu tiettyä hematopoieettista .· , tietä pitkin, nimitetään esisoluksi. T-lymfosyyttien, B- ·,·. 25 lymfosyyttien, granulosyyttien, punaisten verisolujen, verihiutaleiden ja eosinofiilien esisoluja, sekä aikaisempia esisoluja, jotka voivat yksilöllisesti muodostaa usei-ta kypsiä solutyyppejä, on tutkittu kokeellisesti sekä in vivo että in vitro [Dexter, T. M., J. Pathology 141 (1983) 30 415 - 433]. In vitro on määritetty, että kunkin esisolu- ), j tyypin proliferaatio ja/tai erilaistuminen riippuvat eri- : :: tyisistä "tekijöistä", jotka ovat peräisin eri lähteistä.

, Esimerkiksi punaisten verisolujen myöhemmät esisolut vaa- . tivat tekijän, jota kutsutaan nimellä erytropoietiini.

35 Kypsiä neutrofiilisiä granulosyyttejä, monosyyttejä ja 2 108796 kypsiä makrofageja muodostavien luuydinesisolujen säilymiseen, proliferaatioon ja erilaistumiseen vaadittavia tekijöitä kutsutaan pesäkkeitä stimuloiviksi tekijöiksi (CSF:t).

5 CSF-aktiivisuutta on tutkittu laajalti hiirellä.

Useimmat aikuisen hiiren elimet tuottavat CSF-aktiivisuutta. Koostumukset, jotka sisältävät CSF-aktiivisuutta ja joita on saatu eri kudoksista eri menetelmillä, näyttävät kuitenkin eroavan biokemiallisilta luonteenpiirteiltään. 10 Näin ollen rakenteelliset suhteet eri tekijöiden välillä pysyvät tuntemattomina. Lisäksi CSF-aktiivisuus näyttää toimivan useammassa kuin yhdessä granulosyytin ja makrofa-gin kehitysvaiheessa, ja jälleen on ollut epävarmaa, onko yksittäinen tekijä aiheuttanut kaikki havaitut aktiivisuu-15 det vai vaikuttaako kussakin vaiheessa eri tekijä [Burgess, A. ja Metcalf, D., Blood 56 (1980) 947 - 957]. Ihmisen CSF-aktiivisuutta on saatu istukasta, tietyistä sikiökudoksista, makrofageista ja stimuloiduista T-soluis-ta. T-solulinja (Mo), joka tuottaa yhtä tai useampaa voi-20 makasta CSF-aktiivisuutta, saatiin potilaalta, jolla on karvasoluleukemian T-soluvariaatio (leukaemic reticuloen-dotheliosis) [Golde et ai., Blood 52 (1978) 1 068 -1 072].

CSF-aktiivisuuden kyky stimuloida granulosyytti- ja ;·; 25 makrofagituotantoa osoitti, että farmaseuttiset koostumuk- set, joissa on CSF-aktiivisuutta, ovat kliinisesti käyttö-'···’ kelpoisia tilanteissa, joissa vaaditaan näiden (luuytimen) solutyyppien kasvanutta tuotantoa. Useilla potilailla, joilla oli erittäin korkeat määrät ilmeisen normaaleja 30 kiertäviä granulosyyttejä, on itse asiassa osoitettu ole- • :*: van kasvaimia, jotka tuottavat liikaa CSFrää. Yhdessä ta- pauksessa poistettaessa kasvain kirurgisesti granulosyyt- ' , tiluku aleni nopeasti kohti normaalia tasoa, mikä antaa * » · · » aiheen olettaa, että CSF voi olla käyttökelpoinen kiertä- > * * » » 35 vien granulosyyttien lukumäärien säätämisessä [Hocking, % t * * » » # » * i 3 108796 W., Goodman, J., ja Golde, D., Blood 61 (1983) 600]. Erityisesti CSF-koostumukset ovat käyttökelpoisia kliinisesti syövän kemoterapeuttisen tai säteilyhoidon aiheuttaman selkäydinsuppression hoidossa. Lisäksi CSF-koostumukset 5 ovat käyttökelpoisia vaikeiden infektioiden hoidossa, koska CSF voi kasvattaa ja/tai aktivoida granulosyyttien ja/ tai monosyyttien lukumäärää.

On olemassa useita erilaisia tyyppejä tunnettuja CSF-aktiivisuuksia mukaan luettuna granulosyytti CSF-10 (G-CSF), makrofagi-CSF (M-CSF), granulosyytti-makrofagi CSF (GM-CSF) ja multi-CSF. Tämä keksintö koskee erityisesti GM-CSF:n valmistusta. CSF-proteiinit ovat tunnettuja erilaisista eläinlähteistä. Tämä keksintö koskee kuitenkin erityisesti kädellisten CSF:n valmistusta, tarkemmin ihmi-15 sen CSF:n ja apinan CSF:n valmistusta.

Koostumusten, joissa on CSF-aktiivisuutta, biologista ja biokemiallista karakterisointia ja näiden koostumusten tutkimista kliinisessä yhteydessä on tähän asti estänyt ihmisen ja/tai muiden kädellisten CSF-koostumusten 20 harvinaisuus ja epäpuhtaus. Voidaan ymmärtää, että olisi toivottavaa identifioida proteiini tai proteiinit, jotka aiheuttavat CSF-aktiivisuutta. Lisäksi olisi toivottavaa, jos olisi tällaiselle CSF:lie kädellislähde, edullisesti » * ihmislähde, joka voisi helposti tuottaa näitä proteiineja 25 riittäviä määriä ja riittävän puhtaana biologiseen ja bio- Y* kemialliseen karakterisointiin ja käyttöön terapeuttisina i aineina.

♦ t - * ; Viime aikoina kehitetyt molekyylikloonaustekniikat V; tekevät mahdolliseksi kloonata nukleotidisekvenssi, joka 30 koodittaa proteiinia, ja tuottaa tätä proteiinia kvantita tiivisesti käyttämällä sopivaa isäntävektori-systeemiä I » ‘ Y (Maniatis, T., Molecular Cloning - A Laboratory Manual,

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y., » s. . 1982). Proteiini voidaan sitten ottaa talteen tunnetuilla :*·: 35 erotus- ja puhdistustekniikoilla. Kloonausmenetelmät, joi- 4 108796 ta on tähän mennessä käytetty, voidaan ryhmittää kolmeen yleiseen kategoriaan: (1) menetelmät, jotka pohjautuvat proteiiniraken-teen tuntemukseen, esimerkiksi sen aminohapposekvenssiin; 5 (2) menetelmät, jotka perustuvat kloonatun geenin ilmentämän proteiinin identifiointiin käyttämällä tälle proteiinille spesifistä vasta-ainetta; ja (3) menetelmät, jotka perustuvat RNA-lajin identifiointiin, jolloin laji voidaan kääntää ja saadaan kiin-10 nostavan geenin koodaamaa proteiinia tai aktiivisuutta.

Kaikki nämä menetelmät tulevat vaikeiksi soveltaa, kun kiinnostuksen kohteena olevaa proteiinia, kuten CSF-proteiinia, on saatavilla hyvin alhainen määrä. Siten, jos on vaikeaa saada riittävä määrä puhdistettua proteiinia, 15 on vaikeaa määrittää proteiinin aminohapposekvenssi tai jopa osittaisia sekvenssejä. Samoin ilmennetyn proteiinin identifiointi vasta-aineeseen sitomisella suoritetaan edullisesti käyttämällä monospesifistä, polyklonaalista, korkeatiitteristä antiseerumia. Tällaista antiseerumia ei 20 voida saada puhtaan proteiinin (antigeenin) määrien puuttuessa. Monoklonaalinen vasta-aine tarjoaa vaihtoehtoisen lähestymistavan, mutta vaadittua vasta-ainetta voi myös olla vaikea saada sopivan antigeenin puuttuessa, ja täl-; lainen monoklonaalinen vasta-aine ei ehkä reagoi proteii- ·,·. 25 nin kanssa siinä muodossa, jossa proteiini ilmennetään ,···. saatavilla olevilla yhdistelmä-isäntävektori-systeemeillä.

Lopuksi RNA-lajien translaatio identifioitavan proteiinin * » · tai aktiivisuuden saamiseksi vaatii sen, että kyseistä *’·’ RNA:ta on läsnä RNA-lähteessä riittävässä määrin, että 30 saadaan luotettava proteiini- tai aktiivisuussignaali. ·.: : Tiettyä proteiinia koodattavan RNA:n suhteellinen runsaus v ·’ on yleensä rinnakkaista proteiinin runsaudelle siten, että harvinaista proteiinia koodittaa tavallisesti harvinainen : mRNA.

35 Mo-solulinjaa on käytetty sekä lähtöaineena ihmisen : ’.· CSFrien puhdistukseen että vastaavien lähetti-RNA:iden ; 108796 5 identifiointiin. Jopa tällä suhteellisen hyvällä CSF-ak-tiivisuuden lähteellä on kuitenkin osoittautunut olevan äärimmäisen vaikeata eristää kylliksi proteiinia rakenteellisiin tutkimuksiin.

5 Jotta voitettaisiin ongelmat, jotka ovat luontaisia harvinaista proteiinia, kuten CSFrää, koodaavan nukleoti-disekvenssin kloonauksessa yllä kuvatuilla menetelmillä, kehitettiin uusi menetelmä. Tämä menetelmä vaatii vain, että geenituote tai sen aktiivisuus voidaan luotettavasti 10 mitata. CSF-kokeen sopivia menetelmiä on kuvattu myöhemmin esimerkissä 2. On kehitetty puhdistusmenetelmä, joka mahdollistaa CSF-proteiinin eristämisen ja puhdistamisen sekä rekombinantti- että luonnollisista lähteistä paljon korkeammalla puhtaus- ja aktiivisuustasolla kuin aikaisemmin 15 oli mahdollista.

Keksintö voittaa alan aikaisemmat ongelmat ja antaa käyttöön helpon proteiinilähteen, jolla on CSF-aktiivi-suutta, käyttämällä yhdistelmä-DNA-teknologiaa. Keksintö koskee menetelmää kädellisen granylosyytin/makrofagin pe-20 säkkeitä stimuloiva tekijä (GM-CSF) -proteiinin valmis tamiseksi, jolloin (a) GM-CSF-proteiinilla on aminohappojärjestys, joka on esitetty CSF-Thr:lle kuviossa 1 nuolesta alkaen, :*· : tai •» · V. 25 (b) GM-CSF-proteiinilla on aminohappojärjestys, ,···. joka on esitetty CSF-Ile:lle kuviossa 1 nuolesta alkaen, ”! tai i : : (c) GM-CSF-proteiinilla on aminohappojärjestys, • *’ joka on esitetty CSF-G:lle kuviossa 1 nuolesta alkaen, 30 sekä sen toiminnallisen ekvivalentin valmistamiseksi, joka * · : aminohappojärjestykseltään vastaa luonnossa esiintyvää GM- v ’ CSF:ää, johon on lisätty, jossa on korvattu tai josta on poistettu yksi tai useampia aminohappoja oleellisesti vai- » · kuttamatta luonnollisen GM-CSF:n biologiseen aktiivisuu-35 teen mitattuna ihmisen luuydin -määritysmenetelmällä, jol-: .· loin menetelmälle on tunnusomaista, että viljellään sopi- 6 108796 via, vektorin sisältäviä eukarydottisia tai prokaryootti-sia isäntäsoluja, joka vektori on muodostettu sen sisältämän DNA-sekvenssin ilmentämiseksi, ja DNA-sekvenssi koodaa GM-CSF-proteiinin aminohappojärjestystä, olosuhteissa, 5 jotka mahdollistavat DNA-sekvenssin ilmentämisen, ja eristetään GM-CSF-proteiini soluviljelmästä. Esillä oleva keksintö koskee myös vektoria, joka käsittää geenin joka koodaa edellä määriteltyä GM-CSF-proteiinia, isäntäsolua, joka on transformoitu edellä määritellyllä vektorilla, 10 sekä cDNA:ta, joka vastaa edellä määriteltyä sekvenssiä.

Tämän keksinnön mukaisesti käytetään uutta kloo-naustekniikkaa, joka vaatii vain kokeen CSF-aktiivisuudel-le, CSF-aktiivisuutta omaavaa proteiinia koodaavan cDNA:n kloonaamiseksi. Koska CSF-proteiini valmistetaan kloonis-15 ta tämän keksinnön mukaisesti, voimme olla varmoja, että se on proteiini, jolla on CSF-aktiivisuutta. Keksinnön mukainen transformointivektori, joka sisältää CSF-cDNA:ta, voidaan valmistaa ja eristää menetelmällä, joka käsittää seuraavat vaiheet: 20 valmistetaan RNA solusta, joka tuottaa CSF:ää; valmistetaan polyadenyloitu lähetti-RNA mainitusta RNA:sta; valmistetaan yksisäikeinen cDNA mainitusta lähetti-. RNA:sta; ·.·. 25 muunnetaan yksisäikeinen cDNA kaksisäikeiseksi .···. cDNArksi; sijoitetaan kaksisäikeinen cDNA transformointivek-toreihin ja transformoidaan bakteereita mainitulla vekto-'· ·’ rilla kasvupesäkkeiden muodostamiseksi; 30 muodostetaan 200 - 500 kasvupesäkkeen pooleja ja : eristetään plasmidi-DNA kustakin poolista; v * transfektoidaan plasmidi-DNA sopiviin isäntäsolui- hin CSF-proteiinin ilmentämiseksi; t>ii; viljellään transfektoituja soluja ja tutkitaan su- 35 pernatantista CSF-aktiivisuus; ja 7 108796 valitaan CSF-positiiviset poolit ja seulotaan poolin tekemiseen käytetyt pesäkkeet sen pesäkkeen identifioimiseksi, jossa on CSF-aktiivisuutta.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut CSF-proteii-5 nit ovat luuydinsysteemin solujen kasvu- ja erikoistumis-hormoneja. Ne on aiottu käytettäväksi esimerkiksi kliinisesti selkäydin-suppression hoitoon, erityisesti (sympto-maattisen) granulosytopenian hoitoon, joka on seurausta syövän kemoterapeuttisesta tai säteilyhoidosta.

10 Kuvio 1 esittää DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat keksinnön mukaisesti valmistettua CSF-proteiinia. DNA-sek-venssi esittää täydellisenä koodit yhdelle ihmisen CSF:n variaatiolle, jota nimitetään CSF-Thr:ksi. Toinen alleeli koodaa identtistä tuotetta, paitsi että Thr asemassa nume-15 ro 100 korvataan Ile:llä (CSF-Ile). Muutokset, joita on kuvattu yllä ihmisen sekvenssille, ovat eroille DNA-sek-venssissä, joka koodaa gibbonin CSF:ää (gibboni-apinan CSF; CSF-G). Myös johdetut aminohapposekvenssit kuvataan.

Kuvio 2 on kaavakuva, joka esittää plasmidi pTPL:n 20 valmistusta plasmidi pAdD26SVpA(3):sta.

Kuvio 3 on kaavakuva, joka jatkuu kuviosta 2 ja esittää plasmidi p91023:n valmistusta plasmidi pTPLrstä.

Kuvio 4 on kaavakuva, joka jatkuu kuviosta 3 ja . esittää plasmidia p91023(B).

*.·. 25 Kuvio 6 on kaavamainen esitys vektorista pTALC- 185R.

”! Kuvio 7 on kaavamainen esitys vektorista AJ-14.

♦ * ·

Seuraavat määritelmät annetaan tämän hakemuksen ymmärtämistä helpottamaan. Siinä määrin kuin määritelmät 30 eroavat alalla esiintyvistä merkityksestä, alla olevat • t : määritelmät annetaan tarkistuksen mahdollistamiseksi.

v : Monistus (amplifikaatio) tarkoittaa prosessia, jol- la solut tuottavat geenitoistoja kromosomi-DNA:han.

. CSF on biologinen aktiivisuus, jota määritetään . 35 tässä kuvatuilla kokeilla.

s 108796 CSF-proteiini on kädellisestä lähteestä peräisin oleva proteiini, jolla on CSF-aktiivisuutta. Tämän keksinnön tarkoituksiin termi CSF-proteiini sisältää modifioidun CSF-proteiinin, CSF-proteiinin alleelivariaatiot ja CSF-5 proteiinin, jonka alussa on Met-tähde.

Myötävirtaan tarkoittaa suuntaa, joka kulkee kohti nukleotidisekvenssin 3'-päätä.

Tehostin on nukleotidisekvenssi, joka vahvistaa geenin transkriptiota riippumatta tehostimen asemasta suh-10 teessä geeniin tai sekvenssin orientoitumisesta.

Geeni on deoksiribonukleotidisekvenssi, joka koodaa tiettyä proteiinia. Tässä oleviin tarkoituksiin geeni ei sisällä sivualueita, joita ei käännetä, kuten RNA-trans-kription aloitussignaaleja, polyadenylaation liittymiskoh-15 tia, promoottoreja tai tehostimia.

Ligaatio on fosfodiesterisidoksen muodostusprosessi kahden DNA-säikeen 5'- ja 3'-pään väliin. Tämä voidaan saavuttaa useilla hyvin tunnetuilla entsyymitekniikoilla mukaan lukien tylpän pään ligaatio T4-ligaasilla.

20 Orientaatio viittaa nukleotidien järjestykseen DNA- sekvenssissä. DNA-sekvenssin käännetty orientaatio on sellainen, jossa sekvenssin 5'-3'-järjestys suhteessa toiseen sekvenssiin on käänteinen verrattuna vertauspisteeseen .** . DNA:ssa, josta sekvenssi saatiin. Tällaisiin vertailupis- V. 25 teisiin voivat lukeutua toisten spesifioitujen DNA-sek- venssien transkriptiosuunta lähde-DNA:ssa tai sekvenssin sisältävien, monistettavien vektorien replikaation alku.

i : : ;·; Transkriptio tarkoittaa RNA:n synteesiä DNA-terap- '·“·* laatista.

30 Transformointi tarkoittaa solun genotyypin muunta- · mistä ottamalla soluun eksogeenistä DNA:ta. Transformaa- : : : tiot voidaan havaita joissakin tapauksissa muutoksella solun fenotyypissä. Transformoituja soluja kutsutaan I · transformanteiksi. Soluja ennen transformointia kutsutaan . 35 emosoluiksi.

g 108796 j Translaatio tarkoittaa polypeptidin synteesiä lä- ! hetti-RNA:sta.

j Pesäkkeitä stimuloiva tekijä -aktiivisuus (CSF) voi I olla peräisin lukuisista solulähteistä mukaan lukien käsi- j 5 telty väliaine perifeerisen veren mononukleaarisoluista, keuhkojen ja istukan kudoksista ja luuytimestä, aneemisten potilaiden virtsa, seerumi ja T-lymfosyytin normaalit ja neoplastiset solut ja mononukleaarinen fagosyyttisolulin-ja. Eräs solulinja, joka tuottaa CSF:ää, on Mo-solulinja, 10 joka on talletettu ATCC:hen ja on saatavissa sieltä koodi- i ! numerolla CRL 8066. Tämän solulinjan tuottama CSF tunne taan granulosyytti-makrofagi-CSF:nä (tai GM-CSF:nä), ja se on tietysti ihmisen CSF:ää. Eräs gibboni-CSF:n lähde on T-solulinja, joka on nimetty UCD MLA-144:ksi, ja se on tal-15 letettu ja on saatavilla ATCC:sta koodinumerolla HB 9370, (talletettu 29.9.1983).

CSF-kloonin eristämiseksi tämän keksinnön mukaises-I ti käytettiin uutta menetelmää, joka vaatii vain CSF-ak- tiivisuuden analyysitekniikan. Ensin identifioidaan solu, 20 joka tuottaa CSF-aktiivisuutta, kuten T-lymfosyyttisolut (tai muut lähteet, kuten edellä on esitetty). Sitten solun j t t mRNA otetaan talteen. Edullisesti käytetään T-lymfosyytti- • ·' soluja. Tällaisessa tapauksessa membraaniin sitoutunut mRNA, joka sisältää lymfokiinien mRNA:n, erotetaan solujen • 25 vapaasta mRNA:sta. Tämän erotuksen uskotaan rikastavan kerättyä mRNA:ta 5 -10 kertaa lymfokiinisekvensseille, ja i ;: näin ollen se vähentää halutun CSF-kloonin identifioin- tiin tarvittavia ponnistuksia. Polyadenyloitu lähetti-RNA valmistetaan sitten kromatografisesti oligo-dT-selluloo-,·, 30 salia.

Valmistetaan cDNA-kirjasto mRNA:sta käyttäen vektoria, joka on sopiva transfektioon isäntään, halutun CSF-aktiivisuutta omaavan proteiinin ilmentämiseksi. Ensimmäisen säikeen cDNA valmistetaan käyttäen standardimenetelmiä 35 käyttämällä yllä valmistettua mRNA:ta. Sitten RNA-cDNA- i 10 1 08796 hydridi muunnetaan kaksisäikeiseksi cDNA-muodoksi. Sitten cDNA voidaan insertoida sopivaan vektoriin.

! Edullinen isäntävektori-systeemi CSF-kloonin eris tämiseen perustuu CSF-cDNA:n ekspressioon sopivassa trans-5 formointivektorissa. Sopiva transformointivektori voi olla riippuvainen DNA:n lyhytaikaissta viemisestä nisäkkään soluihin [Mellon, P., V. Parker, Y. Gluzman, T. Maniatis, Cell 27 (1981) 279 - 288]. Haluttujen CSF-transformanttien eristämiseksi ei vaadita, että populaation kaikki solut 10 sisältävät stabiilisti eksogeenisia geenejä, jotka ilmentävät haluttua CSF-tuotetta. On mahdollista viedä lyhytaikaisesti eksogeenisiä geenejä solujen alapopulaatioon siten, että alapopulaatio ilmentää haluttua tuotetta useiden päivien ajan. Koska valikoivaa merkkiä ei vaadita tä-15 män keksinnön mukaiseen DNA-transfektion transformointi-vektoriin ja ekspressiosysteemiin, eksogeeninen DNA voidaan menettää kasvatettaessa soluja 1-2 viikon jakson ajan. Kuitenkin 2-3 päivää sopivien nisäkässolujen transfektion jälkeen toivottujen tuotteiden havaitaan syn-20 tetisoituvan, ja ne voidaan ilmaista.

Edullinen isäntävektorisysteemi perustuu SV40-DNA-molekyylillä, josta puuttuu replikaation alkukohta, trans- • · formoitujen CV-l-apinasolulinjojen kehittämiseen [Gluzman, Y., Cell 23 (1981) 175 - 182]. Transformoidut apinan CV-‘ : 25 1-solut, jotka sisältävät defektiivistä SV40-DNA:ta ja jotka on nimetty COS-soluiksi (CV-1, origin defective, I SV40), eivät sisällä täydellistä SV40-genomin kopiota, mutta tuottavat korkeita pitoisuuksia suurta T-antigeeniä ja sallivat SV40-DNA-replikaation. Ne myös tukevat tehok-. , 30 kaasti varhaisella alueella deleetioita sisältävien SV40:ien ja bakteeriplasmidien, jotka sisältävät SV40: '·' replikaation aloituskohdan, replikaatiota [Myers, R. M. ja ·:··: Tjian, R., PNAS 77 (1980) 6 491 - 6 495]. Näin ollen täl- ·:··· lä systeemillä saadaan menetelmä transfektoidun, eksogee- 35 nisen DNA:n monistamiselle SV40:n välittämän DNA-replikaa- 11 1G8796 tion kautta mRNA-tason ja eksogeenisesta DNArsta ilmennetyn proteiinin lisäämiseksi. Muut samanlaiset systeemit ovat kuitenkin myös käyttökelpoisia.

CSF-ekspressioon käytetyt vektorit sisältävät tyy-5 pillisesti erilaisia elementtejä, kuten tehostimia, promoottoreita, introneita, polyadenylaatiokohtia, 3'-ei-koo-daavia alueita ja translaation aktivaattoreita, kuten myöhemmin on kuvattu.

Vektorit voivat sisältää tehostimia. Tehostimet 10 ovat toiminnallisesti erilaisia kuin promoottorit mutta näyttävät toimivan yhdessä promoottorien kanssa. Niiden funktiota solutasolla ei ymmärretä hyvin, mutta niiden ainutlaatuisena piirteenä on kyky aktivoida tai voimistaa transkriptiota olematta asemasta tai orientaatiosta riip-15 puvaisia. Promoottorien täytyy olla geenistä vastavirtaan, kun taas tehostimia voi olla läsnä vastavirtaan eli 5' -suuntaan promoottorista geenissä intronina tai myötävirtaan geenistä geenin ja polyadenylaatiokohdan välissä eli 3'-suuntaan polyadenylaatiokohdasta. Käänteiset promoot-20 torit eivät toimi, mutta käänteiset tehostimet toimivat. Tehostimet ovat cis-toimivia, so. niillä on vaikutusta promoottoreihin vain, jos niitä on läsnä samassa DNA-säi- • » Λ: keessä. Yleistä tietoa tehostimista on julkaisussa Khoury et ai., Cell 33 (1983) 313 - 314.

25 Edullisia tehostimia käytettäväksi nisäkässolujen : kanssa saadaan eläinviruksista, kuten simian virus 40:stä, i polyomaviruksesta, naudan papillomaviruksesta, retroviruk- sesta tai adenoviruksesta. Ihanteellisesti tehostimen pitäisi olla viruksesta, jolle isäntäsolu on salliva, so.

. . 30 joka normaalisesta infektoi isäntätyypin soluja. Viruste- hostimia voidaan saada helposti julkisesti saatavissa olevista viruksista. Useiden virusten esim. Rousin sarkooma -viruksen ja simian virus 40:n, tehostinalueet, ovat hyvin *: ·: tunnettuja. Katso Luciw et ai., Cell 33 (1983) 705 - 716.

35 On rutiininomaista molekyylibiologiaa leikata nämä alueet 12 1 08796 kyseiselle virukselle julkaistujen restriktiokarttojen perusteella ja, mikäli välttämätöntä, modifioida paikat, jotta tehostin voitaisiin lisätä vektoriin, kuten halutaan. Esimerkiksi katso Kaufman et ai., J. Mol. Biol. 159 5 (1982) 601 - 621, ja Mol. Cell. Biol. 2(11) (1982) 1 304 - 1 319. Vaihtoehtoisesti tehostin voidaan syntetisoida sekvenssitiedoista; virustehostimien koot (yleensä alle noin 150 emäsparia) ovat riittävän pieniä, että tämä voitaisiin saada aikaan käytännöllisesti.

10 Toinen elementti, joka olisi oltava läsnä vektori- kokonaisuudessa, on polyadenylaation lisäyspaikka. Tämä on DNA-sekvenssi, joka sijaitsee myötävirtaan geenin transla-toiduista alueista, vähän myötävirtaan siitä kohdasta, jossa vuorostaan transkriptio loppuu, ja adeniiniribonuk-15 leotideja lisätään polyadeniininukleotidihännän muodostamiseksi lähetti-RNA:n 3'-päähän. Polyadenylaatio on tärkeää lähetti-RNA:n stabilisoinnissa hajoamista vastaan j solussa, tapahtuma, joka vähentää lähetti-RNA:n määrää ja näin ollen tuoteproteiinin määrää.

20 Eukaryoottiset polyadenylaatiopaikat ovat hyvin tunnettuja. Eukaryoottisissa geeneissä on konsensussek-venssi: heksanukleotidi 5'-AAUAAA-3' on 11 - 30 nukleo-tidia kohdasta, jossa polyadenylaatio alkaa. DNA-sekvens-sejä, jotka sisältävät polyadenylaatiokohtia, voidaan saa- • k 25 da viruksista julkaistujen raporttien mukaan. Esimerkkipo-: : lyadenylaatiosekvenssejä voidaan saada hiiren beeta-glo- i biinista, ja simian virus 40:n myöhäisen tai varhaisen * > t . alueen geeneistä, mutta viruksen polyadenylaatiopaikat ovat edullisia. Koska nämä sekvenssit ovat tunnettuja, . 30 niitä voidaan syntetisoida in vitro ja ligatoida vekto- '!!/ reihin tavanomaisella menetelmällä.

Sekvenssi, joka erottaa polyadenylaatiopaikan translaation lopetuskodonista, on edullisesti translatoi-·:··: maton DNA-sekvenssi, kuten ei-promovoitu eukaryoottinen 35 geeni. Koska tällaiset sekvenssit ja geenit eivät sisällä t 13 1 08 796 promoottoria, niitä ei ilmennetä- Sekvenssin tulisi ulottua huomattavalle etäisyydelle, noin 1 000 emäksen kohdalle, lopetuskodonista polyadenylaatiokohtaan. Tämä 3'-translatoimaton sekvenssi lisää yleisesti tuotesaantoja. 5 Vektori voi päättyä noin 30 kiloemästä myötävirtaan kon-sensuspolyadenylaatiosekvenssistä, mutta on edullista säilyttää 3'-sekvenssit, jotka löytyvät myötävirtaan polyade-nylaatiokohdasta sen villityyppisestä ympäristöstä. Nämä sekvenssit ulottuvat tyypillisesti 200 - 600 emäsparia 10 myötävirtaan polyadenylaatiokohdasta.

Intronien läsnäolo translatoimattomalla, luetulla vektorin osuudella voi kasvattaa tuotteen saantoja. Tällaisia introneja voidaan saada muista lähteistä kuin isän-täsoluista tai geenilähteistä. Esimerkiksi hybridi-intro- ; 15 ni, joka käsittää 5'-lisäyspaikan adenoviruksen kolmiosai- sen johtajasekvenssin toisesta intronista ja 3'-lisäys-I paikan immunoglobuliinigeenistä insertoituna myötävirtaan transkription aloituskohdasta adenoviruksen tärkeimmässä myöhäisessä promoottorissa, johtaa kasvaneeseen tuotteen 20 saantoon.

CSF-kloonauksen ja ekspressiovektorin edullisessa ,, toteutuksessa on translationaalinen aktivaattorigeeni.

’·* Translationaaliset aktivaattorit ovat geenejä, jotka koo- ’ daavat joko proteiinia tai RNA-tuotteita, jotka aiheutta- 25 vat toivotun mRNA:n translaation. Paras esimerkki on ade- noviruksen virukseen liittyvä (virus-associated, VA) geeni i (VAI), joka käännetään lyhyeen RNA-lajiin, joka on vuoro- • Y; vaikutuksessa adenoviruksen tärkeimpien myöhäisten mRNA:iden 5'-translatoimattoman alueen sekvenssien kanssa 30 [Thimmappaya et ai., Cell 3 (1982) 543]. Välttämättömät '.‘V sekvenssit VA-RNA:n aikaansaamaan translationaaliseen ak- • * i tivaatioon ovat adenoviruksen myöhäisessä kolmiosaisessa ’mRNA-johtajasekvenssissä. Adenoviruksen kolmiosainen joh-•:"i tajasekvenssi lisätään yhteen adenoviruksen genomin ei- ;·’·( 35 viereisistä alueista, ja se on läsnä adenovirus tärkeim- 14 1 08796 pien myöhäisten transkriptien 5'-päässä. VA-RNA voi olla vuorovaikutuksessa kolmiosaisen johtajasekvenssin sisältävien mRNAriden translaation aktivoimiseksi. Näin ollen edullinen cDNA-kloonaus- ja ekspressiovektori sisältää 5 kolmiosaisen johtajasekvenssin lisätyn muodon ja adenovi-ruksen VA-geenit.

Näitä vektoreita voidaan syntetisoida tekniikoilla, jotka alan ammattimiehet hyvin tuntevat. Vektorien komponentteja, kuten tehostimia, promoottoreita jne., voidaan 10 saada luonnon lähteistä tai niitä voidaan syntetisoida, kuten on kuvattu yllä. Pohjimmaltaan, jos komponentteja löytyy saatavavissa olevasta DNA:sta suuria määriä, esim. komponentit, kuten virustoiminnot, tai jos niitä voidaan syntetisoida, esim. polyadenylaatiopaikat, silloin sopi-15 valla restriktioentsyymien käytöllä voidaan saada suuria vektorimääriä yksinkertaisesti viljelemällä lähdeorganis-mia, hajoittamalla sen DNA sopivalla endonukleaasilla, erottamalla DNA-fragmentit, identifioimalla DNA, joka sisältää kiinnostavaa elementtiä, ja ottamalla se talteen. 20 Tavallisesti kootaan transformointivektoria pieni määrä ja ligatoidaan se sitten sopivaan, itsenäisesti replikoitu-vaan synteesivektoriin, kuten prokaryoottiseen plasmidiin . v tai faagiin. Plasmidia pBR322 voidaan käyttää useimmissa :,ti: tapauksissa. Katso Kaufman et ai., yllä.

25 Synteesivektoreita käytetään ligatoitujen transfor- : mointivektorien kloonaukseen tavanomaisella menetelmällä, ! esimerkiksi sallivan prokaryoottisen organismin transfek- jV, tiolla, synteesivektorin replikoimisella korkeaan kopioi- tumislukuun ja synteesivektorin talteenotolla hajoittamal- , . 30 la solut ja synteesivektorin erotuksella solujätteistä.

• · Ί Vektorit, jotka sisältävät cDNA:ta, joka on valmistettu '· * solusta, joka tuottaa CSF-aktiivisuutta, transfektoidaan sitten E. coliin ja levitetään petrimaljoille noin 2 000 ·;*·· kasvupesäkettä maljaa kohti. Kasvupesäkkeet nostetaan pois 35 nitroselluloosasuodattimelle, ja suodatin siirretään > · » i 15 1 08796 uudelle levylle, jota pidetään pääpesäkkeenä. Kun näitä pesäkkeitä on kasvatettu, tehdään kaksoiskappaleet ja tarkastetaan alkuperäiseen nähden huolellisesti merkitsemällä siten, että kaksoissuodattimien alueet voidaan identifioi-5 da vastaavan päälevyn osuuden avulla.

Kukin kaksoiskappalesuodatin leikataan osiin, jotka sisältävät ennaltamääritetyn lukumäärän kasvupesäkkei-tä osaa kohti, edullisesti noin 200 - 500 pesäkettä osaa kohti. Kasvupesäkkeet kustakin osasta raaputetaan väliai-10 neeseen, kuten L-Broth-väliaineeseen, bakteerit kerätään sentrifugoimalla, ja plasmidi-DNA erotetaan. Plasmidi-DNA ! kustakin osasta transfektoidaan sopivaan isäntään proteii nin ekspressiota varten. Edullinen synteesivektori on E. coli -plasmidin pBR322 mutantti, josta sekvenssit, jotka 15 ovat vahingollisia eukaryoottisille soluille, on poistettu. Katso Kaufman et ai., yllä. Tämän mutantin käyttö torjuu tarpeen poistaa plasmiditähde ennen transfektiota. j Transfektoitujen solujen kasvatuksen jälkeen väliaineesta testataan CSF-aktiivisuus. Positiivinen testi osoittaa, 20 että pesäke, joka sisältää CSF-cDNA:ta, on suodattimen tietyssä osassa.

Jotta voitaisiin määrittää, mikä klooneista alkuperäisen pääsuodattimen osassa sisältää CSF-cDNA:ta, kukin klooni suodatinosassa poimitaan ja kasvatetaan. Sitten 25 viljelmät pannaan matriisille. Valmistetaan yhdistelmät kustakin matriisin vaakasuorasta rivistä ja pystysuorasta ly sarakkeesta. DNA-näytteet valmistetaan kustakin yhdiste- ; tystä viljelmästä ja transfektoidaan isäntäsoluihin eks pressiota varten. Näiden yhdistelmien supernatantit testa-; ,·, 30 taan CSF-aktiivisuuden suhteen. Yhden pystysuoran sarak- * i *'keen yhdistelmän ja vaakasuoran rivin yhdistelmän tulisi * I · tuottaa CSF-aktiivisuutta. Näille yhdistelmille yhteinen *"'* klooni sisältää CSF-cDNA:ta. Jos matriisi sisältää enemmän kuin yhden positiivisen kloonin, useampi kuin yksi sarake 35 ja rivi on positiivinen. Siinä tapauksessa voi olla vält-

t I

tämätöntä edelleen seuloa pieni lukumäärä klooneja.

» 16 1 08796 ; CSF-cDNA poistetaan klooneista restriktioentsyy- S meillä, ja voidaan sekvensoida tunnetuilla tekniikoilla.

I Voidaan helposti nähdä, että tässä kuvattua menetelmää voidaan käyttää CSF-cDNA:n saamiseksi mistä tahansa läh-5 teestä. CSF-cDNA:n täydellinen DNA-sekvenssi kuvataan kuviossa 1 yhdessä ennustetun, translatoidun CSF-proteiini-tuotteen aminohapposekvenssin kanssa.

DNA-sekvenssi, joka koodaa proteiinia, jolla on CSF-aktiivisuutta tämän keksinnön mukaisesti, kuten ku-10 viossa 1 esitetty sekvenssi, voidaan modifioida tavanomaisilla tekniikoilla variaatioiden tuottamiseksi lopulliseen CSF-proteiiniin, jolla on vielä CSF-aktiivisuutta tässä kuvatuissa analyysitesteissä. Näin ollen esimerkiksi kaksi, kolme, neljä tai viisi aminohappoa voidaan korvata 15 muilla aminohapoilla. BE-patentissa nro 898016, joka on tuotu tähän viitteeksi, kuvataan yhtä tällaista tyypillistä tekniikkaa kysteiinin korvaamiseksi esim. seriinillä. Luonnon CSF-cDNA-geeniä edeltää ATG-kodoni. Keksinnön mukaisesti valmistettuja alleeleja kuvataan kuviossa 1. Toi-20 sella havaitsemallamme alleelilla on tymidiinitähde asemassa 365 kuviossa 1 esitetyn sytosiinitähteen sijasta.

. . Kuvion 1 sekvenssissä kuvattu kypsä CSF-proteiini alkaa ;/ sekvenssillä Ala.Pro.Ala.Arg..., jonka alkua osoitetaan nuolella nukleotidin numero 59 jälkeen kuviossa 1. Met-*’ 25 CSF alkaisi sekvenssillä Met.Ala.Pro.Ala.Arg... Kuviossa 1 i * * esitetyllä alleelivariaatiolla on Thr-aminohappotähteessä i numero 100 (alkaen Ala:ssa nuolen jälkeen) ja sitä nimite-.· i : tään CSF-Thr:ksi. Toisella variaatiolla on Ile-tähde ase massa 100 ja sitä nimitetään CSF-Ile:ksi. Tämän keksinnön , ·', 30 mukaisesti valmistetulla, puhdistetulla CSF-proteiinilla 1 ' * * - on spesifistä aktiivisuutta vähintään 10 yksikköä/mg proteiinia ja edullisesti vähintään 4 x 107 yksikköä/mg analy- · * . i · soituna ihmisen luuydinsoluilla.

i • Isäntävektori-systeemit CSF:n ilmentämiseksi voivat 35 olla prokaryoottisia tai eukaryoottisia, mutta CSF:n komp-.leksisuuden vuoksi edullinen ekspressiosysteemi on nisä- 17 1 08796 kässysteemi. Ekspressio saavutetaan helposti transformoimalla prokaryoottiset tai eukaryoottiset solut sopivalla CSF-vektorilla. Yllä kuvatulla menetelmällä saatu DNA-sek-venssi voidaan ilmentää suoraan nisäkässoluissa sopivan 5 promoottorin kontrollin alaisena. Voidaan käyttää alan ammattimiesten hyvin tuntemia heterologisia promoottoreita. CSF:n ilmentämiseksi prokaryoottisissa tai hiivasoluissa johtajasekvenssi (tai erityssekvenssi) täytyy poistaa. Kypsän CSF-proteiinin N-pään kodonin asema esitetään 10 kuviossa 1. Tämä voidaan tehdä käyttämällä standarditek-nikkaa, jota alan ammattimiehet tuntevat. Kun haluttu CSF-cDNA-klooni saadaan, käytetään tunnettuja ja sopivia menetelmiä CSF-proteiinin ilmentämiseksi, esim. insertointia sopivaan vektoriin, ja vektorin transfektiota sopivaan 15 isäntäsoluun, transformoitujen solujen valintaa ja näiden transformanttien viljelyä CSF-aktiivisuuden ilmentämiseksi. Sopiviin isäntäsoluihin lukeutuvat bakteerit, esim. E. coli, hiiva, nisäkässolut, esim. CHO, ja hyönteissolut. Näin tuotetulla CSF-proteiinilla voi olla metioniiniryhmä 20 proteiinin N-päässä (Met-CSF). Prokaryoottisten ja euka-.·.· ryoottisten solujen tuottama kypsä proteiini on muuten identtinen aminohapposekvenssiltään, mutta eukaryoottinen tuote voi olla glykosyloitu samassa määrin tai erilailla kuin luonnon tuote. Erilaisia menetelmiä CSF-proteiinin t · « . 25 saamiseksi kuvataan tämän jälkeen annetuissa esimerkeissä.

> I ·

Muut menetelmät tai materiaalit, esim. vektorit, ovat ilmeisiä alan ammattimiehille esimerkkien ja edellä olevan . . kuvauksen perusteella.

Sopivissa prokaryoottisissa tai eukaryoottisissa *·’ ’ 30 soluissa ilmennetty CSF-proteiini voidaan ottaa talteen "i puhdistus- ja erotustekniikoilla, jotka alan ammattimiehet ·;-*· tuntevat. Kuten on mainittu, tässä keksinnössä esitetään kuitenkin myös puhdistusmenetelmä, joka mahdollistaa CSF-’ \ proteiinin saannin sekä rekombinaatio- että luonnon läh- 35 teistä erittäin puhtaana ja aktiivisena.

ie 108796

Keksinnön puhdistusmenetelmän yhteenveto Tässä esitetään menetelmä CSF-aktiivisuutta omaavan proteiinin puhdistamiseksi. CSF-proteiinilla tämän keksinnön mukaisesti on spesifinen aktiivisuus vähintään noin 5 1 x 107 yksikköä per mg proteiinia, edullisesti vähintään 2 x 107 yksikköä per mg proteiinia ja edullisemmin vähintään 4 x 107 yksikköä per mg proteiinia analysoituna ihmisen luuydinkokeella.

Menetelmä CSF-proteiinin puhdistamiseksi käsittää 10 seuraavaa: saostetaan proteiini ammoniumsulfaatilla 80-%:isella kyllästyksellä, jolloin muodostuu CSF-proteii-nia sisältävä pelletti; suspendoidaan pelletti uudelleen puskuroituun liuokseen, jonka pH on välillä noin 6-8; pannaan puskuroitu liuos, joka sisältää CSF:ää, kromato-15 grafiakolonniin, eluoidaan puskuroidulla liuoksella, joka sisältää natriumkloridia ja otetaan talteen fraktiot, joilla on CSF-aktiivisuutta; yhdistetään aktiiviset fraktiot, pannaan ne C4-käänteisfaasikolonniin ja eluoidaan 0 - 90-%:isella asetonitriiligradientilla aktiivisen frak-20 tion talteenottamiseksi.

.* Kuvio 5 esittää puhdistetun CSF-proteiinin SDS- ,,/· PAGE-analyysiä.

. ‘ Puhdistusmenetelmän yksityiskohtainen kuvaus

Puhdistettava CSF-proteiini voidaan olla peräisin j 25 mistä tahansa yllä kuvatusta luonnonlähteestä alkulähteenä .V. yhdistelmä-DNA-prosessille, esimerkiksi Mo-solulinja tai UCD MLA-144 Gibboni-solulinja.

, , Vaihtoehtoisesti CSF-proteiini voidaan valmistaa käyttämällä keksinnön mukaista yhdistelmä-DNA-tekniikkaa.

» I | * 30 Mistä tahansa lähteestä olevat CSFrt voidaan puhdistaa ·;’·.· tässä kuvatulla menetelmällä. Käsitelty väliaine mistä | tahansa CSF-proteiinilähteestä konsentroidaan edullisesti ultrasuodatuksella proteiinikonsentraatioon vähintään noin • · 0,1 mg proteiinia per ml. Sitten proteiini saostetaan li- 35 säämällä ammoniumsulfaattia 80 %:n kyllästysasteeseen.

19 1 08796

Saatava pelletti suspendoidaan uudelleen vesiliuokseen, joka on puskuroitu pH:hon noin 6-8. Esimerkkeihin sopivista puskureista lukeutuvat Tris-HCl, HEPES, natriumsit-raatti jne.

5 Puskuroitu liuos fraktioidaan pylväskromatografiäl lä. Sopivia materiaaleja käytettäviksi kromatografiakolon-nissa ovat oktyyli-Sepharose, DEAE-Ultrogel, AcA44-Ultro-gel, AcA-54-Ultrogel jne. Yhtä tai useampaa näistä materiaaleista voidaan käyttää peräkkäin korkeamman puhtauden 10 saavuttamiseksi.

Fraktiot kustakin kolonnista kerätään ja analysoidaan CSF-aktiivisuuden suhteen. Aktiiviset fraktiot yhdistetään ja laimennetaan trifluorietikkahapolla (TFA), hep-tafluorivoihapolla (HFBA) tai vastaavalla hapolla ja pan-15 naan C4-käänteisfaasikolonniin. CSF-aktiivisuus eluoidaan sitten käyttämällä 0 - 90 %:n asetonitriiligradienttia TFA:ssa tai HFBA:ssa, edullisesti 0,10 %:n tai vastaavasti 0,15 %:n (v/v) pitoisuudessa riippuen siitä, mitä happoa käytettiin yhdistettyjen fraktioiden panemiseksi kolon-20 niin.

Fraktiot, joissa on GSF-aktiivisuutta, analysoidaan ' ..* SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (13,5-%:inen • geeli), kuten Laemmli, U., Nature 227 (1970) 680 on ku- : i ♦ i vannut. Lisäkäsittelyt käyttämällä yllä mainittuja kroma- i 25 tografiakolonnimateriaaleja voivat edelleen puhdistaa CSF- proteiinin homogeeniseksi.

Puhdistettu CSF-proteiini, joka fraktioitiin SDS-: ,·. PAGE:lla, ilmaisi heterogeenisen CSF-proteiinin, jonka näennäinen molekyylipaino oli noin 15 000 - 26 000 dalto-30 nia. Tämä näennäisen koon heterogeenisuus johtuu proteii-*"· nin laajasta glykosylaatiosta ja on yleinen glykoproteii- nien piirre. Vähemmän puhdistettujen näytteiden fraktioin-ti Mo-solun käsitellystä väliaineesta SDS-PAGE:lla (ei-pelkistävissä olosuhteissa) ja geelistä eluoidun proteii-35 nin analysointi ilmaisi toisen proteiinin läsnäolon, jolla 20 1 08796 oli CSF-aktiivisuutta ja jonka näennäinen molekyylipaino oli noin 28 000 - 30 000.

CSF-aktiivisuus sitoutuu ja eluoituu oktyyli-Sepharosesta, DEAE-Ultrogel:stä ja C4-käänteisfaasikolon-5 nista. Karkeasti 60 % CSF-aktiivisuudesta sitoutuu Con-A-Sepharoseen (40 %:n läpivirtaus) ja voidaan eluoida alfa-metyylimannosidilla.

Yhdistelmä-CSF:n molekyylipainoanalyysi geelisuo-datuksella alhaisessa suolapitoisuudessa ilmaisi, että 10 noin 30 % aktiivisuudesta eluoitui arvioidulla molekyyli-painolla noin 19 000, mutta 70 % materiaalista käyttäytyi kuin dimeerit, ja eluoitui asemassa, joka vastasi molekyy-lipainoa noin 38 000. Jos tähän kolonniin lisätään 1 M NaCl:a, kaikki aktiivisuus eluoituu leveänä piikkinä noin 15 19 000 daltonin kohdalla.

Puhdistettu CSF on stabiili vähintään 16 tuntia, kun sitä on inkuboitu 4 °C:n lämpötilassa (pH 7,4) 4 M guanidiinihydrokloridissa, 10 mM EDTA:ssa, 10 mM 2-merkap-toetanolissa ja 30-%:isessa (v/v) etanolissa. CSF-aktii-, , 20 visuus on myös stabiili 0,l-%:isessa trifluorietikkahapos- sa (THA) (pH 2,0) ja 0,l-%:isessa TFArssa plus 25-%:isessa ' ··' (v/v) asetonitriilissä.

‘ .* Kuten on mainittu, tämän keksinnön mukaisesti val- mistettu CSF-proteiini on tarkoitettu käytettäväksi myelo-i : : 25 suppression hoidossa, kuten (symptomaattinen) veren jyväs- iY: solukato (granulosytopenia), jonka on aiheuttanut esimer- kiksi syövän kemoterapeuttinen tai säteilyhoito. Lisäksi ;CSF-proteiinit on tarkoitettu käytettäväksi vakavan infek-tion hoidossa. Tällaiseen käyttöön indikoitu annos on tyy-30 pillisesti noin 200 - 1 000 pg potilasta kohti. CSF-pro- ' * teiini injektoidaan edullisesti potilaaseen suonensisäi- sesti sopivassa farmakologisessa kantajassa. Esimerkkeihin : tällaisista kantajista lukeutuvat farmakologinen suola liuos ja ihmisen seerumin albumiini farmakologisessa suo-35 laliuoksessa.

2i 1 08796

Lisäksi keksinnön mukaisesti valmistetuilla CSF-proteiineilla on muita aktiivisuuksia ja käyttöjä. On esimerkiksi osoitettu, että hiiren CSF:t aktivoivat neutro-fiilejä. Näin ollen olisi odotettavissa, että myös tämän 5 keksinnön mukaisesti valmistetut kädellisten CSF:t aktivoisivat neutrofiilejä. Siksi CSF:n fysiologiset funktiot voivat olla monikerroksisia. Luuytimessä tämä lymfokiini voi stimuloida efektorisolujen proliferaatiota ja erilaistumista isännän puolustukseen, kun taas periferiassa uudet 10 ja olemassa olevat solut voivat aktivoitua. Paikallisessa immunologisessa reaktiossa CSF voi pitää kiertävät neutro-fiilit tulehdusalueilla tai poissa niiltä. Neutrofiilien epäsopiva paikannus ja/tai aktivointi voi vaikuttaa erilaisten immuunivälitteisten sairauksien, kuten nivelreu- [ 15 man, patofysiologiaan.

I Keksintöä valaistaan edelleen seuraavilla suoritus muodoilla, jotka ovat puhtaasti esimerkinomaisia eikä niiden katsota rajoittavan keksinnön patenttivaatimuksissa kuvattua laajuutta.

20 Esimerkeissä lämpötilat on ilmoitettu celsiusastei- *’·' na, ellei toisin ole mainittu.

Restriktioendonukleaaseja käytetään olosuhteissa ja ’.· tavalla, joita niiden kaupalliset toimittajat suosittele- ·*,,.·* vat. Ligaatioreaktiot suoritetaan, kuten ovat kuvanneet i : 25 Maniatis et ai., yllä sivuilla 245 - 246, joka on tuotu jY: tähän viitteeksi, käyttämällä sen sivulla 246 kuvattua puskuria ja käyttämällä 1 - 100 pg/ml:n DNA-konsentraatio-: ,·. ta 23 °C:n lämpötilassa tylppäpäiselle DNA:lle ja 16 eC:n tl· •Y lämpötilassa "tarttuvapäiselle" DNA:lie. Elektroforeesi * » · 30 tehdään 0,5 - l,5-%:isessa agaroosigeeleissä, jotka sisäl-• · tävät 90 mM Tris-boraattia ja 10 mM EDTA:ta. Kaikki radio- merkityt DNA:t merkitään 32P:llä käytettiinpä mitä tahansa merkitsemistekniikkaa.

"Nopealla preparoinnilla" tarkoitetaan bakteriofa-35 gin tai plasmidi-DNA:n pienimittakaavaista, nopeaa tuotan- 22 1 08796 toa, esimerkiksi, kuten ovat kuvanneet Matianis et ai., supra, s. 365 - 373.

Esimerkki A

Vaihe 1. Mo-solulinjaviljelmät 5 Mo-soluja (ATCC CRL 8066) kasvatettiin rutiinin omaisesti Alfa- (6 % C02) tai Iscoven (10 % C02:ta) -väliaineessa, joka sisälsi 20 % vasikansikiön seerumia (FCS), 2 mM glutamiinia, 100 U/ml streptomysiiniä ja 100 pg/ml penisilliiniä. Soluille pitäisi suorittaa jatkoviljely 10 joka 4-5 päivä. Solut lasketaan ja siirrostetaan Falcon T-175 -pulloihin 100 - 150 ml:aan väliainetta tiheydellä 3 - 4 x 105 solua/ml. Solut kaksinkertaistuvat 20-%:isessa FCS:ssa 4-7 päivän välein. Kasvunopeus ei ole vakio, ja solut näyttävät joskus lopettavan kasvamisen, sitten ne 15 läpikäyvät nopeita kasvujaksoja. Mo-soluja voidaan kasvattaa väliaineessa, jossa ei ole seerumia. Selviäminen on paljon parempi, kun soluja ei pestä, kun ne siirretään FCS:sta seerumittomaan väliaineeseen. Optimaalinen tiheys seerumittomassa väliaineessa (SF) on 5 x 105 solua/ml. So-20 lut kasvavat hiukan (tai vähintään pitävät vakiolukumää-·'·* rän) kolme päivää seerumittomassa väliaineessa, ja sitten niille pitäisi syöttää 20-%lista FCS:ää vähintään neljä V päivää. Tämä kasvuaikataulu (kolme päivää SF:ää, neljä päivää 20-%:ista FCS:ää) voidaan toistaa viikoittain, jos i 25 tarvitaan SF-väliainetta, ilman, että soluille koituu nä- //. kyvää haittaa useisiin kuukausiin.

Vaihe 2. CSF-aktiivisuusanalyysit : ·, A. Luuydinanalyysi

Hanki tuoretta luuydintä. Irrota luupiikit vetämäl-30 lä 20, 22 ja sitten 25 numeron neulan läpi. Laimenna 1:1 'steriilillä fosfaatti-puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) *:·*: (huoneen lämpötila), ja kerrosta Ficoll-Paque:lie (noin 30 ml BM-PBS-liuosta/6 ml Ficollia). Sentrifugoi nopeudel-\ la 1 500 kierrosta minuutissa 40 minuutin ajan huoneen 35 lämpötilassa. Poista rasva ja PBS-kerros ja heitä pois.

23 1 08796

Pipetoi pois tiheydeltään kevyt kerros. Pese 2 x PBS:lla ja laske. Pane solut levylle RPMI:ssa (hankittu GlBCO:lta RPMI 1640:nä), jossa on 10 % HIFCS:ää (lämmöllä inaktivoi-tua FCS:ää), kolme tuntia takertuvien solujen poistami-5 seksi.

Levyn väliaine (tuoreena):

20 % FCS

0,3 % agar liuotettuna H20:hon, jäädytetty 40 °C:seen 10 2 x Iscoven väliaine (1:1 v/v agarin kanssa) 1 % P/S lopullinen konsentraatio 100 U/ml streptomysiiniä 100 pg/ml penisilliiniä 10'4 M alfa-tioglyserolia 2 x Iscoven väliaineessa 15 10"2 M kantaliuoksesta Jäähdytä agar noin 40 °C:seen. Sekoita muihin aineosiin. Jäähdytä vesihauteessa 37 - 38 °C:seen ja pidä tässä lämpötilassa.

; Kolmen tunnin kuluttua pipetoi tarttumattomat solut 20 pois. Sentrifugoi ja laske. Lisää 2 x 105 solua/ml kasva-tusväliainetta ja pidä kontrolloidussa lämpötilassa vesi-·...·' hauteessa 37 - 38 eC:n lämpötilassa. Lisää näytteet (esim.

transfektoitujen solujen väliaine; tavallisesti 10 μ1:η : '.· näyte) ensimmäiseen mikrotiitterilevyn kuoppariviin rin- i 25 nakkaisina. Lisää 100 μΐ solususpensiota kuhunkin kuop- paan. Lisää vielä 50 μΐ solususpensiota kuhunkin ensimmäi- • · sen rivin kuoppaan. Sekoita läpikotaisin ja siirrä 50 μΐ . . liuosta ensimmäisestä rivistä seuraavaan riviin jne. ja • * · W jatka l:3-laimennuksia levyn poikki. Kääri levy parafil- ·’ ’ 30 miin. Inkuboi 10 - 14 päivää 10-%:isessa C02:ssa 37 °C:ssa täysin kostutetussa ilmakehässä ja merkitse kasvupesäk-•: · ·: keet.

Kasvupesäkkeiden merkitsemiseksi lasketaan kussa-‘ 1 kin kuopassa kasvavien pesäkkeiden kokonaislukumäärä. Kus- 35 sakin analyysissä useita kuoppia pidetään levyllä ilman, 24 1 08796 että niissä on näytettä (sokeakoe), jotta saataisiin taus-tapesäkeluku. Sokeakoekuopissa kasvavien pesäkkeiden keskimääräinen lukumäärä vähennetään kustakin näytteitä sisältävien kuoppien pesäkkeiden lukumäärästä. Yksi yksikkö 5 CSF:ä on määrä, joka stimuloi yhden kasvupesäkkeen muodostusta tausta-arvon yläpuolelle per 105 ihmisen luuydinsolua (levyllä 105 solua per ml), kun CSF-konsentraatio on sub-kyllästävä. Sub-kyllästävä konsentraatio määritetään laimentamalla ja vertaamalla pesäkkeiden lukumäärää erilai-10 sissa laimennuksissa sen konsentraation löytämiseksi, joka on juuri kyllästystason alapuolella.

Tähän analyysiin lasketaan pesäkkeet, jotka sisäl- ( tävät granulosyyttejä, monosyyttejä tai kummankintyyppisiä soluja. Solutyypit pesäkkeessä määritetään poimimalla pe-15 säkkeet ja värjäämällä yksittäiset solut.

B. KG-l-soluanalyysi KG-l-soluja [Blood 56(3) 1980], kasvatetaan Isco-ven väliaineessa, jossa on 10 % FCS:ää. Kierrätetään 2 x viikossa, ja ympätään kutakin kiertoa varten 2 x 105 solui-j . . 20 la/ml. Soluja käytetään analyysiin vain kierron 30 - 35 välillä. Analyysi on sama kuin luuytimelle on edellä ku- * · vattu, paitsi että KG-l-soluja viedään levylle agar-seok-sessa 4 x 103 solua/ml.

• · ·

Kussakin kuopassa kasvavien pesäkkeiden lukumäärä i j : 25 määritetään, ja taustaluku vähennetään, kuten yllä kuva- tV: tussa luuydinanalyysissä. Yksi KG-l-CSF-yksikkö/ml on se • · CSF:n konsentraatio, joka stimuloi puolet KG-1-pesäkkeiden : maksimiluvusta (kyllästys) kasvamaan. Maksimiluku saadaan sisällyttämällä CSF:n kyllästystaso useihin kuoppiin.

* · 30 Vaihe 3. Vektorin p91023(B) konstruktio : ’ Transformointivektori oli pAdD26SVpA(3), jonka ovat kuvanneet Kaufman et ai., Mol. Cell. Biol. 2(11) (1982) 1 304 -1 319. Sillä on kuviossa 2 esitetty rakenne. Ly-, hyesti, tämä plasmidi sisältää hiiren dihydrofolaattire- 35 duktaasin (DHFR) cDNA-geenin, joka on adenovirus 2:n (Ad2) j ! ! 25 1 08796 tärkeimmän myöhäisen promoottorin transkriptiokontrollis-sa. 5'-lisäyskohta sisältyy adenovirus-DNArhan ja 3'-li-säyspaikka, joka on peräisin immunoglobuliinigeenistä, on läsnä Ad2:n tärkeimmän myöhäisen promoottorin ja DHFR-koo-5 daussekvenssin välillä. SV40:n aikainen polyadenylaatio-paikka on läsnä myötävirtaan DHFR-koodaussekvenssistä. pAdD26SVpA(3):n prokaryoottiperäinen osa on pSVOd:sta [Mellon, P., Parker, V., Gluzman, Y. ja Maniatis, T.,

Cell 27 (1981) 279 - 288], eikä se sisällä pBR322-sekvens-10 sejä, joiden tiedetään ehkäisevän replikaatiota nisäkkään soluissa [Lusky, M. ja Botchan, M., Nature (London) 293 (1981) 79 - 81].

pAdD26SVpA(3) muunnetaan plasmidi pCVSVL2:ksi, kuten on kuvattu kuviossa 2. pAdD26SVpA(3) muunnetaan plas-15 midi pAdD26SVpA(3)(d):ksi poistamalla yksi kahdesta Pstl-paikasta pAdD26SVpA(3):ssa. Tämä saavutetaan osittaisella j digeroinnilla Pstlrlla (käyttämällä entsyymiaktiivisuuden j vajausta siten, että voidaan saada linearisoitujen plasmi- dien alapopulaatio, jossa vain yksi Pstl-paikka on loh- .. 20 kaistu), sitten käsittelemällä Klenowilla, ligatoimalla » · » « plasmidin uudelleenkierrättämiseksi, transformoimalla E. ··' coli ja seulomalla Pstl-kohdan, joka on sijoittunut 3'- SV40-polyadenylaatiosekvenssiin, poistamiseksi.

Adenoviruksen kolmiosainen johtajasekvenssi ja vi-1 25 rukseen liittyvät geenit (VA-geenit) sijoitettiin i r\· pAdD26SVpA(3)(d):hen, kuten kuviossa 2 on esitetty. Ensin pAdD26SVpA(3)(d) lohkaistiin PvuIIrlla lineaarisen mole-: .·. kyylin tekemiseksi, joka oli avattu kolmiosaisen johtaja- sekvenssin käsittävien kolmen ensimmäisen elementin 3'-30 osuudella. Sitten pJAW 43 [Zain et ai.. Cell 16 (1979) 851] digeroitiin Xhol:lla, käsiteltiin Klenowilla, dige-roitiin PvuIIrlla, ja 140 emäsparin fragmentti, joka si-sälsi toisen ja osan kolmannesta johtajasekvenssistä, ero-tettiin elektroforeesilla akryyliamidigeelillä [6-%:inen 35 Tris-boraattipuskurissa; Maniatis et ai. (1982), supra].

26 1 08796 140 bp:n fragmentti ligatoitiin sitten PvuII-digeroituun pAdD26SVpA(3) (d) :hen. Ligaatiotuotetta käytettiin E. colin | transformoimiseksi tetrasykliiniresistentiksi, ja pesäk keet seulottiin käyttämällä Grunstein-Hogness-menetelmää 5 käyttäen 32P-merkittyä koetinta, joka hybridisoituu 140 emäsparin fragmenttiin. DNA valmistettiin positiivisesti hybridisoituvista pesäkkeistä, jotta voitiin testata, oliko rekonstruoitu PvuII-paikka 5' tai 3' insertoidusta 140 emäsparin DNA:sta, joka oli spesifinen toiselle ja kolman-10 nelle adenoviruksen myöhäiselle johtajasekvenssille.

PvuII:n paikan oikea orientaatio on 140 emäsparin insertin 5'-puolella. Tätä plasmidia merkitään pTPLrnä kuviossa 2.

{ SV40:n AvallD-fragmentti, joka sisältää SV40-tehostinsek- venssin, saatiin digeroimalla SV40-DNA Avail:11a, teke-15 mällä päät tylpiksi PolI:n Klenow-fragmentilla, ligatoi-malla Xhol-kytkijät fragmentteihin, digeroimalla Xhol:llä Xhol-paikan avaamiseksi ja eristämällä neljänneksi suurin (D)-fragmentti geelielektroforeesilla. Tämä fragmentti ligatoitiin sitten Xhol-leikattuun pTPL:ään, jolloin saa-20 tiin plasmidia pCVSVL2-TPL. SV40-D-fragmentin orientaatio pCVSVL2TPL:ssä oli sellainen, että SV40:n myöhäinen pro-moottori on samassa orientaatiossa kuin adenoviruksen tärkein myöhäinen promoottori.

: Adenoviruksen virukseen liittyvien (VA) geenien i 25 tuomiseksi pCVSVL2-TPL:ään konstruoidaan ensin plasmidi j\\ pBR322, joka sisältää adenovirus tyypin 2 HindiII-B-frag mentin. Adenovirus tyyppi 2 -DNA:ta digeroidaan ; . HindIII:lla, ja B-fragmentti eristetään geeli-elektrofo- reesin jälkeen. Sitten tämä fragmentti sijoitetaan ’ ’ 30 pBR322:een, jota on aikaisemmin digeroitu Hindlllrlla. E.

i colin transformoinnin jälkeen ampisilliiniresistentiksi ·:’·.· rekombinantit seulotaan HindiII-B-fragmentin insertoimi- seksi, ja insertoitu orientaatio määritetään restriktio- » > entsyymidigeroinnilla. pBR322-Ad-HindIIIB sisältää adeno-35 viruksen tyyppi 2 HindlllB-framentin orientaatiossa, joka on esitetty kuviossa 3.

27 1 08796

Kuten kuviossa 3 on esitetty, VA-geenit saadaan mukavasti plasmidi pBR322-Ad-HindIIIB:stä digeroimalla Hpalrllä, lisäämällä EcoRl-kytkijöitä ja digeroimalla EcoRlrlla ja ottamalla talteen 1,4 kb:n fragmentti. Frag-5 mentti, jolla on EcoRl-tarttuvat päät, ligatoidaan sitten pTPLrn EcoRl-paikalle (jota oli aikaisemmin digeroitu EcoRlrlla). E. coli HB101:n transformoinnin jälkeen ja tetrasykliiniresistenssin valinnan jälkeen pesäkkeet seulotaan suodatinhybridisaatiolla DNA-koettimeen, joka on 10 spesifinen VA-geeneille. DNA valmistetaan positiivisesti hybridisoituvista klooneista, ja karakterisoidaan restrik-tioendonukleaasidigeroinnilla. Tuoteplasmidia merkitään p91023:lla.

p91023:ssa olevat kaksi EcoRl-paikkaa poistetaan. 15 p91023 leikataan kokonaan EcoRl:llä, jolloin muodostuu kaksi DNA-fragmenttia, yksi noin 7 kb:n ja toinen noin 1,3 kb:n fragmentti, jotka sisältävät VA-geenit. Kummankin j fragmentin päät täytetään käyttämällä Poli:n Klenow-frag- menttia, ja sitten kummatkin fragmentit, so. 1,3 kb:n ja 20 7 kb:n fragmentit, ligatoidaan uudelleen yhteen. Plasmidi * « p91023(A), joka sisältää VA-geenit ja joka on samanlainen kuin p91023 mutta josta kaksi EcoRl-paikkaa on poistettu, V identifioidaan Grunstein-Hogness-seulonnalla VA-geenifrag- : : mentilla ja tavanomaisella restriktiopaikka-analyysillä.

t 25 Sitten yksinäinen Pstl-paikka p91023( A): ssa poistetaan ja .V; korvataan EcoRl-paikalla. p91023(A) leikataan kokonaan

Pstl:llä ja käsitellään sitten Poll:n Klenow-fragmentilla : tasaisten päiden muodostamiseksi. EcoRl-kytkijät ligatoi- \‘Y daan tylppään Pstl-kohtaan p91023(A) :ssa. Lineaarinen * > i 30 p91023(A), johon on kiinnitetty EcoRl-kytkijät tylppään *

Pstl-kohtaan, erotetaan ligatoitumattomista kytkijöistä ja käsitellään loppuun EcoRl:llä ja ligatoidaan sitten uudel-;*·, leen. Plasmidi p91023(B) otetaan talteen ja identifioi- [ \ daan, että sillä on samanlainen rakenne kuin p91023(A):11a 35 mutta EcoRl-paikka aikaisemmassa Pstl-paikassa.

j i i 28 1 08796

Vaihe 4. cDNA-kirjaston valmistus

Mo-soluja indusoitiin 16 - 20 tuntia PHAtlla ja PMAtlla niiden lymfokiinituotannon edistämiseksi. Solut pantiin levylle, 5 x 105 solua millilitrassa Iscoven väli-5 aineessa, jossa oli 20 % FCStää, 0,3 % (v/v) PHA:ta ja 5 ng/ml TPA:ta. Solut kerättiin sentrifugoimalla. Pelle-toidut solut suspendoitiin uudelleen 20 mitään jääkylmää, hypotonista hajoituspuskuria (RSB-puskuri: 0,01 M Tris- HClta, pH 7,4, jossa oli 0,01 M KClta, 0,0015 M MgCl2:a,

10 1 pg/ml sykloheksimidiä, 50 yksikköä/ml RNAsiinia ja 5 mM

ditiotreitolia). Solujen annettiin paisua jäässä viisi minuuttia ja murskattiin sitten mekaanisesti 10 iskulla tiukasti sovitetussa Dounce-lasihomogenisaattorissa. Homo-genaatti sentrifugoitiin alhaisella nopeudella (2 000 15 kierrosta minuutissa Beckman J6 -senrifugissa) tumien ja liukenemattomien solujen poistamiseksi. Supernatanttia pidettiin jäissä, kun taas tumapelletti suspentoitiin uudelleen 10 mitään RSBttä ja sentrifugoitiin uudelleen alhaisella nopeudella. Tämä toinen supernatantti yhdistet-, . 20 tiin ensimmäiseen, ja yhdistettyjä liuoksia sentrifugoi-

t I

tiin alhaisella nopeudella jäännöskontaminaation, joka j ·-·* sisälsi tumia ja liukenemattomia soluja, poistamiseksi.

Tästä sentrifugoinnista saatu supernatantti tehtiin 0,15 Mtseksi KCltn suhteen lisäämällä 2 M KClta ja sentrifugoi-25 tiin sitten suurella nopeudella (25 000 kierrosta/min, : : Beckman Sw 28 -roottori, 30 minuuttia) membraanien pelle- toimiseksi. Membraanipelletti pestiin varovasti kylmällä j RSBtlla ja suspendoitiin sitten 12 mitään RSBttä, joka sisälsi 2 M sakkaroosia ja 0,15 M KClta. Valmistettiin • < t 30 kaksi epäjatkuvaa gradienttia Beckman SW41 -sentrifugiput- » ‘ ’ kissa kerrostamalla 6 ml membraaniliuosta 2 M sakkaroosis- > sa 2 ml tn päälle RSBttä, jossa oli 2,5 M sakkaroosia ja 0,15 M KClta. Putket täytettiin ylös asti panemalla päälle

2,5 ml RSBttä, joka sisälsi 1,3 M sakkaroosia ja 0,15 M

‘ · 35 KClta. Näitä gradientteja pyöritettiin neljä tuntia nopeu- 29 1 08 796

della 27 000 kierr/min (Beckman, SW41-roottori) 4 °C:n I lämpötilassa. Membraanikerros (rajapinnalla 2,0 M ja 1,3 M

sakkaroosin välissä) poistettiin varovasti sivulta käyttämällä numeron 18 neulaa ja injektioruiskua. Membraanifrak-5 tiot kahdesta gradientista yhdistettiin ja laimennettiin yhdellä tilavuudella tislattua vettä, minkä jälkeen ne pantiin 0,5-%:iseen Triton X-100:aan ja 0,5-%:iseen nat-riumdeoksikolaattiin ja uutettiin yhtä suurella tilavuudella fenolia. Vesipitoinen kerros uutettiin uudelleen 10 fenolin ja kloroformin 1:1-seoksella ja lopuksi yhtä suurella tilavuudella kloroformia. Lopuksi membraaniin sitoutunut RNA saostettiin lisäämällä NaCl:a 0,25 M:ksi ja 2,5 tilavuutta kylmää etanolia ja inkuboitiin yön yli -20 °C:n lämpötilassa. Saostettu RNA kerättiin sentrifugoimalla 15 (4 000 kierr/min, 10 min. Beckman J-6 -sentrifugissa) ja suspendoitiin uudelleen 1 ml:aan tislattua vettä. 2 x 109 solusta saatiin noin 1 mg RNA:ta. Lähetti-RNA (mRNA) eristettiin kaikesta RNA:sta kromatografisesti 0,5 ml:n oligo-dT-selluloosakolonnissa. Lyhyesti, RNA lämmitettiin 20 70 °C:n lämpötilaan 5 min ajaksi, jäähdytettiin nopeasti f t

jäissä, laimennettiin sitten 5-kertaiseksi huoneen lämpö-·* tilassa olevalla sitomispuskurilla (0,5 M LiCl, 0,01 M

Tris-HCl, pH 7,4, 0,002 M EDTA ja 0,l-%:inen SDS). RNA

i f » sitomispuskurissa kuljetettiin oligo-dT-selluloosapylvään 25 läpi, joka oli tasapainotettu sitomispuskurilla huoneen *//· lämpötilassa. Kolonni pestiin 5 ml:11a sitomispuskuria, sitten 5 plzlla puskuria, jossa oli 0,15 M LiCl:a, 0,01 M Tris-HCl:a, pH 7,4, 0,002 M EDTA:ta ja 0,1 % SDS:ää. Lo- » · * t , puita mRNA eluoitiin 2 ml:11a 0,01 M Tris-HCl-puskurilla, 30 pH 7,4, jossa oli 0,002 M EDTA:ta ja 0,1 % SDS:ää. mRNA saostettiin lisäämällä NaCl:a 0,25 M:ksi ja 2,5 tilavuutta ‘ ' etanolia ja inkuboitiin yön yli -20 °C:n lämpötilassa.

Saostettu mRNA otettiin talteen sentrifugoimalla (30 000 kierr/min, 30 minuuttia Beckman SW55 -roottorissa). Putki < * 35 kuivattiin huolellisesti ja mRNA-pelletti suspendoidiin 30 1 08796 uudelleen 50 ml:aan vettä. Uudelleensuspendoitu mRNA vietiin 0,25 M NaCl:iin, uutettiin sitten kerran fenolin ja kloroformin 1:1-seoksella ja sitten kolme kertaa kloroformilla. mRNA saostettiin lisäämällä 2,5 tilavuutta etano-5 lia. Seos jäädytettiin ja sulatettiin useita kertoja kuivassa jää/etanoli-hauteessa ja sentrifugoitiin sitten 15 min Eppendorf-sentrifugissa. Putki valutettiin huolellisesti, ja mRNA-pelletti suspendoitiin uudelleen 20 pl:aan tislattua vettä. Lopullinen saanto oli noin 10 30 pg mRNA:ta.

Ensimmäisen säikeen cDNA valmistettiin standardimenetelmillä. Lyhyesti, 10 pg membraani-mRNA:ta laimennettiin 100 pl:aan cDNA-synteesireaktioseosta, joka sisälsi 300 mM Tris:iä, pH 8,4, 140 mM KCl:a, 10 mM MgCl2:a, 10 mM 15 B-merkaptoetanolia, 500 pM sekä dATP:tä, dGTP:tä, dCTP:tä että dTTP:tä, 5 pg oligo-32dT:tä (fosforyloitu ja keskikoko 12 - 18) alukkeena, 150 pCi 32P-dCTP:tä (400 Ci/mmol) ja 20 yksikköä ribonukleaasin inhibiittoria RNAsiinia. Reaktio aloitettiin lisäämällä 100 yksikköä käänteistranskriptaa-20 siä, ja inkuboitiin 30 minuuttia 42 °C:n lämpötilassa.

V: Reaktio lopetettiin lisäämällä EDTA:ta 40 mM:ksi, ja RNA

” ; hajoitettiin inkuboimalla 20 minuuttia 65 °C:n lämpötilas-

V. sa 0,2 M NaOH:ssa. Emäs neutraloitiin lisäämällä 20 pl 2 M

··. Tris:ä, pH 7,4. Reaktioseos uutettiin sitten fenoli/kloro-

: / ! 25 formi-seoksella, uutettiin takaisin 50 pl:lla 10 mM

Tris:ä, pH 7,5, jossa oli 1 mM EDTA:ta (TE:tä), ja vesipi- * > • ·’ toiset faasit yhdistettiin. Ensimmäisen säikeen cDNA muun nettiin kaksisäikeiseksi cDNA:ksi inkuboimalla 12 tuntia : i : 16 °C:n lämpötilassa 40 yksikön kanssa DNA-polymeraasi I:n ; 30 Klenow-fragmenttia 100 pl:ssa reaktioliuosta, joka sisäl- , si 50 mM kaliumfosfaattia, pH 7,4, 2,3 mM DTT:tä, 2-mer- _ . kaptoetanolia, 10 mM MgCl2:a, 150 pM kutakin neljää deoksi- . nukleotiditrifosfaattia ja 25 pCi 32P-dCTP:tä. Reaktio lo- • » * i ',· petettiin uuttamalla fenoli/kloroformilla, ja yhdistymät- ‘ 35 tömät trifosfaatit poistettiin kuljettamalla vesifaasi 31 1 08796 I 1 ml:n Sephadex G-50 -kolonnin läpi. Poistetut fraktiot yhdistettiin ja etanolisaostettiin.

cDNA-pelletti pestiin kylmällä etanolilla ja sus-pendoitiin sitten uudelleen 200 pl:aan 20 mM Tris:ä, pH 5 8,0, jossa oli 1 mM EDTA:ta, 80 μΜ S-adenosyylimetioniinia ja 300 yksikköä EcoRl-metylaasia, 60 minuutiksi 37 °C:n lämpötilassa. Reaktio lopetettiin uuttamalla fenoli/kloro-formi-seoksella, ja metyloitu cDNA kerättiin etanolisaos-tuksella.

10 cDNA-pelletti huuhdottiin 70-%:isella etanolilla ja suspendoitiin sitten uudelleen 200 pl:aan SI-puskuria (Maniatis et ai.) ja inkuboitiin 200 yksikön kanssa SI-nukleaasia 30 eC:n lämpötilassa 30 minuuttia. Reaktio lopetettiin uuttamalla fenoli/kloroformi-seoksella, ja cDNA 15 kerättiin etanolisaostuksella.

Kaksisäikeinen cDNA tehtiin tylpäksi inkuboimalla 100 pl:ssa 20 mM Tris:ä, pH 7,4, jossa oli 50 mM NaCl:a, 10 mM 2-merkaptoetanolia ja 500 μΜ kaikkia neljää deoksi-nukleotidifosfaattia, 25 yksikön kanssa Klenowia huoneen 20 lämpötilassa 30 minuutin ajan. Reaktio lopetettiin uuttamalla fenoli/kloroformilla, ja cDNA kerättiin etanolisaos-' : tuksella.

.·. cDNA ligatoitiin 50 pl:ssa T4-ligaasipuskuria (Ma- ,···. niatis et ai.) 500 pikomoolin kanssa Rl-kytkijöitä, joita 25 toimittaa New England Biolabs (sekvenssi pCGGAATTCCG), käyttämällä 2 000 yksikköä T4-ligaasia yön yli 16 °C:n I I · lämpötilassa. Reaktio lopetettiin inkuboimalla 70 eC:ssa 20 minuuttia ja laimennettiin sitten 300 pl:ksi siten,

: että lopullinen suolakonsentraatio oli 0,1 M NaCl:a, 10 mM

V : 30 MgCl2:a ja 50 mM Tris-HCl:a, pH 7,4. Sitten cDNA:ta käsi- teltiin kaksi minuuttia 37 °C:ssa 700 yksikön kanssa EcoRlrtä. Reaktio lopetettiin uuttamalla fenoli/klorofor-. mi-seoksella, ja cDNA kerättiin etanolisaostuksella. Pel- i V letti suspendoitiin uudelleen 50 pl:aan TE:tä ja kuljetet- 35 tiin 5 ml:n CL-4B-kolonnin läpi. Poistetut fraktiot yhdis- 32 1 0 8 796 tettiin ja etanolisaostettiin. Saostetulle cDNA:lle suoritettiin elektroforeesi l-%:isessa agaroosigeelissä Tris-asetaattipuskurissa, kun läsnä oli 1 pg/ml etidiumbromi-dia.

5 cDNA, joka oli kokoalueella 500 - 4 000 emäsparia, eristettiin geelistä käyttämällä normaalia lasijauhemene-telmää. Eluoitu cDNA uutettiin fenoli/kloroformi-seoksella ja seostettiin etanolilla, ja pelletti (etanolihuuhtelun j jälkeen) suspendoitiin uudelleen 50 pl:aan TE:tä. Lopulli- 10 nen saanto oli 100 - 500 ng cDNA:ta.

Ekspressiovektorin p91023(B) valmistus on kuvattu yllä. EcoRl-digeroitua ja fosfataasikäsiteltyä vektoria (500 ng) ligatoitiin 100 ng:lla cDNA:ta 100 pl:ssa reak-tioliuosta (normaali T4-ligaasireaktio) yön yli 16 °C:n 15 lämpötilassa. Reaktio lopetettiin uuttamalla fenoli/kloro-formiseoksella, ja sitten ligatoitu cDNA kerättiin etano-lisaostuksella, kun kantaja-aineeksi oli lisätty 5 pg tRNA:ta.

Etanolilla seostettu DNA huuhdottiin 70-%:isella 20 etanolilla ja suspendoitiin sitten uudelleen 100 pl:aan TE:tä. Tätä DNA:ta käytettiin 4 μ1:η tasamäärissä E. colin : MC1061 (4 μΐ 100 μ1:η transformoinnissa) transformoimisek- si. Kukin 25 transformoinnista levitettiin 150 petrimal-,* ·. jalle l-%:isen agarin L-broth-väliainessa ja 10 pg/ml:n 25 kanssa tetrasykliiniä (Tet-levy), ja levyjä inkuboitiin yön yli 37 °C:n lämpötilassa. Suunnilleen 2 000 pesäkettä ’ * kasvoi kullakin levyllä, mikä johti noin 50 000 pesäkkeen kokonaismäärään. Kun oli saavutettu noin 0,5 mm halkaisi-·'<’< · ja, pesäkkeet siirrettiin nitroselluloosalevyille (137 mm) V * 30 asettamalla huolellisesti kuiva suodatin levyn pinnalle ja repimällä sitten pehmeästi suodatin irti. Kaikki levyllä olevat pesäkkeet siirrettiin suodattimelle, joka pantiin sitten (pesäkepuoli ylöspäin) tuoreelle Tet-levylle. Kun ’ ·' pesäkkeiden oli annettu kasvaa useita tunteja, valmistet- : · 35 tiin yksi kaksoiskappale kustakin suodattimesta asettamal- 33 1 08796 la juuri kasteltu suodatin täsmälleen alkuperäisen suodattimen päälle, puristamalla niitä yhteen, repimällä ne erilleen ja palauttamalla sitten kukin suodatin tuoreelle Tet-levylle ja inkuboimalla levyjä sitten yön yli 37 °C:n 5 lämpötilassa. Kukin kaksoiskappale merkittiin huolellisesti siten, että se voitaisiin tarkistaa uudelleen alkuperäisen kappaleen kanssa.

Vaihe 5. Plasmidi-DNA-poolin valmistus Kukin 25 kaksoiskappalesuodattimista jaettiin huo-10 lellisesti kahdeksasosiin käyttämällä skalpellia ja merkitsemällä kunkin kahdeksanneksen orientaatio suhteessa alkuperäiseen pääsuodattimeen. Pesäkkeet raaputettiin kultakin osalta 10 ml:aan L-broth-väliainetta. Bakteerit kerättiin sentrifugoimalla (3 000 kierr/min, 10 min, Beckman 15 J-6 -sentrifugi), suspendoitiin uudelleen 0,6 ml:aan I 25-%:ista sakkaroosia 50 M Tris-HCl:ssa, pH 8,0, ja muun- i nettiin protoplasteiksi lisäämällä 0,12 ml 5 mg/ml lysot-syymiä, ja inkuboimalla jäillä 5-10 minuuttia.

Sitten protoplasteja inkuboitiin huoneen lämpöti-20 lassa 10 min, minkä jälkeen lisättiin 0,125 ml 0,5 M EDTArta, ja liuotettiin sitten lisäämällä 0,12 ml : 10-%:ista SDS:ää 50 mM Tris-HCl:ssa, pH 8,0. Liuos sekoi- tettiin varovasti, sitä inkuboitiin huoneen lämpötilassa 15 min, ja sitten proteiini ja kromosomi-DNA seostettiin . .·. 25 lisäämällä 0,3 ml 5 M NaCl:a. Kun oli inkuboitu jäillä 15 ·,·. minuuttia, liuos sentrifugoitiin Eppendorf-sentrifugissa 30 min kylmässä. Supernatantti poistettiin varovasti jät-, , tämällä jäljelle viskoosi DNA/proteiinipelletti ja laimen- ·; * nettiin lisäämällä 2,5 ml vettä. Seos uutettiin 1 ml:11a ’ 30 fenolia, kerrokset erotettiin sentrifugoimalla (10 K, ·:*·· 10 min, Sorvali SS-34 -roottori), ja vesikerros poistet- tiin puhtaaseen putkeen. DNA saostettiin lisäämällä 0,5 ml 5 M NaCl:a ja 7,5 kylmää etanolia, ja seos jäädytettiin • ·’ useita kertoja kylmässä jää-etanolihauteessa. Sakka kerät- 35 tiin sentrifugoimalla (10 K, 15 min, Sorvali SS-34 -root- 34 1 08796 tori), suspendoitiin uudelleen 0,3 ml:aan 0,3 M natrium-asetaattia ja saostettiin uudelleen (Eppendorf-putkessa) lisäämällä 1 ml etanolia. 10 - 15 minuutin kuluttua kuivassa jää-etanolihauteessa, saostettu DNA kerättiin sent-5 rifugoimalla (5 min, Eppendorf), ja lopullinen pelletti suspendoitiin uudelleen 100 pl:aan steriiliä TE:tä (10 mM Tris pH 8, jossa oli 1 mM EDTA:ta). Tyypillisestä valmisteesta saatiin 5 - 10 pg plasmidi-DNA:ta. Kukin valmiste sisälsi DNA:ta 200 - 500 pesäkkeestä alkuperäisellä suo-10 dattimella. Valmistettiin kaikkiaan 200 DNA-näytettä 25 suodattimesta.

Vaihe 6. CSF-kloonin eristäminen

Kukin vaiheen 5 DNA-näytteestä transfektoitiin erikseen M6 COS-apinasoluihin, kuten myöhemmin on kuvattu. 15 M6-soluja kasvatetaan rutiinimaisesti Dulbecco'n modifioidussa Eaglen väliaineessa (DME, saatavissa Gibcolta), joka sisältää 10 % lämmöllä inaktivoitua vasikansikiön seerumia (HIFCS), jaetaan kahdesti viikossa 1:6-laimennuksella. Kaksikymmentäneljä tuntia M6-solujen 1:6-jakamisen jälkeen 20 ne ovat valmiit transfektioon. Kaksikymmentäneljä tuntia ennen tranfektiota 1,2 x 108 M6-solua (jako 1:6) ympätään : Cell Factoryyn (saatavilla Nuncilta) 1,5 litrassa DME:tä, jossa on 10 % HIFCS:ää. Välittömästi ennen transfektiota . ··. neste imetään levyiltä, ja levyt pestään kahdesti 7 ml:11a . 25 seerumitonta (SF) DME:tä. DNA liuotetaan 0,1 M Tris:iin t » *

!'! (pH 7,3) ja lisätään DME-väliaineeseen, joka sisältää 2 mM

* ' glutamiinia, 100 pg/ml streptomysiiniä, 100 U/ml penisil liiniä ja 0,25 mg/ml DEAE-dekstraania, kaikkiaan 4 ml:n : kanssa Tris-DNA-liuosta. 4 ml väliainetta, joka sisältää V · 30 liuenneen DNA:n, lisätään levylle, jossa on M6 COS-soluja ja inkuboidaan 12 tuntia.

Inkuboinnin jälkeen solut huuhdotaan kerran tai kahdesti 7 ml:11a SFDME:tä. Sitten lisättiin 5 ml DME:tä, : jossa on 10 % HIFCS:ää, 100 U/ml penisilliiniä, 100 pg/ml 35 streptomysiiniä, 2 mM glutamiinia ja 0,1 mM klorokiinia, ja soluja inkuboitiin kaksi ja puoli tuntia.

35 1 O 8 796

Kahden ja puolen tunnin kuluttua huuhdo kerran SFDME:11a ja lisää 10 ml DME, jossa on 10 % HIFCS:tä, levyä kohti. 30 tunnin jälkeen ime väliaine pois ja syötä 4 ml/levy DME:tä, jossa on 10 % HIFCSiä. Ota talteen pois-5 tamalla käsitelty väliaine 24 - 26 tunnin lisäinkuboinnin j älkeen.

Käsitellystä väliaineesta kustakin transfektiosta analysoitiin CSF-aktiivisuus käyttämällä KG-1-analyysiä. Kullekin näytteelle, jolla oli positiivinen CSF-aktiivi-10 suus, täytyi identifioida CSF-aktiivisuuden aiheuttanut klooni alkuperäisellä ensisuodattimella. Esimerkiksi yhdelle transfektiolle, jolla oli positiivinen CSF-aktiivisuus, poimittiin kaikki alkuperäisen ensisuodattimen osan pesäkkeet, joista transfektio-DNA-näyte oli peräisin. Noin 15 320 näistä pesäkkeistä poimittiin 3 ml:aan L-Broth-väli- ainetta, jossa oli 10 pg/ml tetrasykliiniä. Viljelmiä kasvatettiin yön yli. 320 pesäkettä pantiin 18 x 18-matrii-siin. Valmistettiin yhdistelmät kustakin matriisin vaakasuorasta rivistä ja pystysuorasta sarakkeesta (36 yhdis-20 telmää kaikkiaan) (huom: viimeisessä vaakasuorassa rivissä Y: oli vain 14 kloonia). DNA-näytteet valmistettiin kustakin : yhdistetystä viljelmästä ja käytettiin sitten COS-solujen ·.·. transfektioon. Näiden transfektioiden supernatantit analy- ,···. soitiin käyttämällä KG-l-pesäkeanalyysiä. Saatiin kaksi Y. 25 positiivista tulosta tästä transfektiosarjasta: yksi pys- !'! tysuorassa sarakkeessa, toinen vaakasuorassa rivissä.

t : : ‘ ’ Näille yhdistelmille yhteinen viljelmä sisälsi CSF-kloo- nin.

: Kaksitoista yksittäistä kloonia tästä viljelmästä V : 30 eristettiin, ja miniprep-DNA valmistettiin 10 ml:n viljel- mistä L-Broth-väliaineessa, kuten on kuvattu yllä. 10 μ1:η DNA-näytteitä näistä valmisteista digeroitiin EcoRltllä, ja saadut DNA-fragmentit analysoitiin agaroosigeelielekt-• ·' roforeesilla. Yhdeksällä kahdestatoista kloonista oli yh- 35 teinen noin 750 emäsparin insertti. DNA:t neljästä näistä kloonista ja jäljellä olevat kolme kloonia yhdistettiin M6 36 1 08796 COS-soluihin, kuten on kuvattu yllä. Näiden transfektioi-den supernatanteista tutkittiin KG-l-kokeella ja luuydin-kokeella CSF. Neljä kloonia, jotka kukin sisälsivät 750 emäsparin fragmentin, kaikki ohjasivat M6-solujen ekspres-5 siota korkeita CSF-aktiivisuuden tasoja jommalla kummalla kokeella, kun taas muut kolme kloonia eivät ohjanneet. Näin ollen CSF-kloonausalueen täytyy sijaita 750 emäsparin insertissä.

DNA-sekvenssi, joka koodaa CSFrää, poistettiin 10 transformointivektorista positiivisessa kloonissa digeroi- malla EcoRlrllä ja sekvensoitiin käyttämällä normaaleja dideoksisekvensointimenetelmiä, kun oli jatkokloonattu fragmentteja M13-vektoreihin kuviossa 1 esitetyn sekvenssin saamiseksi. Plasmidia p91023(B)-CSF, jonka oli ensin 15 osoitettu ohjaavan CSF-ekspressiota COS-soluissa, on merkitty pCSF-l:ksi. Tämä plasmidi on talletettu American Type Culture Collection -talletuslaitokseen E. colin MC1061-kantaan talletusnumerolla ATCC 39754 2. heinäkuuta 1984.

20 Vaihe 7. CSF-proteiinin ekspressio ; M6 COS -apinasoluja, jotka on transformoitu vekto- : rilla p9l023(B), joka sisältää CSF-cDNA:ta eristettynä />’· vaiheessa 6, kasvatetaan, kuten on kuvattu vaiheessa 6 CSF-proteiinin tuottamiseksi viljelyväliaineeseen.

( ,·, 25 Yksi milligramma tästä DNArsta (pCSF-1) liuotettiin 1 ml:aan 0,1 M Tris:iä, pH 7,3, ja lisättiin 600 ml:aan i : : ' ' DME:tä, joka sisälsi 2 mM glutamiinia, 100 U/ml strepto mysiiniä, 100 pg/ml penisilliiniä (P/S) ja 0,25 mg/ml ’· · DEAE-dekstraania (molekyylipaino 500 000, Pharmacialta).

V 30 600 ml DNA-DEAE-dekstraaniliuosta lisätään M6 COS -solui- hin Cell Factoryssä ja inkuboidaan 37 °C:ssa 12 tuntia. Tämän inkuboinnin jälkeen solut huuhdotaan kerran 900 ml:11a SFDME:tä ja inkuboidaan sitten 2,5 tuntia 600 ml:11a DME:tä, joka sisältää 0,1 mM klorokiinia, 10 % '·"· 35 H1FCS:ää, 2 mM glutamiinia ja P/S:ää. Kun klorokiinia si sältämä väliaine oli imetty pois, solut huuhdotaan 37 1 08796 SFDME: 11a ja syötetään 1 500 ml:11a DME, jossa on 10 % HIFCS:ää. 30 tunnin kuluttua solut pestään SFDME:11a, väliaine korvataan 800 ml:11a SFDME:ää, ja transfektoitujen solujen annetaan vaikuttaa väliaineeseen 24 tuntia 37 °C:n 5 lämpötilassa. Käsitelty väliaine imetään pois ja korvataan toisella 800 ml:11a SFDME:tä. Solujen annetaan vaikuttaa tähän väliaineeseen 24 tuntia, ja sitten käsitelty väliaine otetaan talteen. Heti kun on mahdollista talteenoton jälkeen, käsitelty väliainenäyte konsentroidaan 20-kertai-10 seksi paineistetulla ultrasuodatuksella käyttämällä Amico-nin 2,5 litran kammiota YM5-membräänin kanssa (5 000 MW:n läpäisyraja).

Vaihe 8. Yhdistelmä-CSF:n puhdistus 200 ml konsentroitua, käsiteltyä väliainetta 15 (4 litrasta lähtömateriaalia = vaihe 7) kyllästettiin 30-%:isesti ammoniumsulfaatilla lisäämällä kiinteää ammo-niumsulfaattia, ja saostettu proteiini poistettiin sentri-| fugoimalla. Supernatantti kyllästettiin 80-%:isesti ammo niumsulfaatilla lisäämällä vielä kiinteää ammoniumsulfaat-20 tia, ja saostettu proteiini kerättiin sentrifugoimalla.

I ·

Pelletti suspendoitiin uudelleen 5 ml:aan 20 mM natrium-: sitraattia, pH 6,1, joka sisälsi 1 M NaCl:a. Liuotettu proteiini pantiin 1,6 x 100 cm:n kolonniin, jossa oli Ult-rogel AcA54:ää, joka oli tasapainotettu samalla puskuril- ,·. 25 la. CSF-aktiivisuus eluoitui kolonnista näennäisellä mole- • · · kyylipainolla 19 kilodaltöniä tai noin 90 ml:n jälkeen. On l * · ’ ' havaittu, että jos geelisuodatus suoritetaan alhaisella ionivahvuudella, CSF-aktiivisuus eluoituu kolonnista kah- i · r tl» ··· · dessa paikassa näennäisillä molekyylipainoilla noin 19 V · 30 kilodaltonia ja 38 kilodaltonia, mikä antaa olettaa, että > GM-CSF voi helposti muodostaa dimeerejä. Aktiiviset frak-tiot yhdistettiin ja vietiin 0,15-%:iseen TFA:han (lisää-• mällä 10-%:ista TFA:ta) ja pantiin Vydac C4 -kolonniin ! (0,46 x 25 cm), joka oli tasapainotettu 0,l-%:isella 35 TFA:lla. Kolonni kehitettiin lineaarisella asetonitriili- 38 1 08796 gradientilla 0 - 90 % (1 ml/min, 340 ml yhteensä) 0,1 % TFAtssa.

CSF-aktiivisuus eluoitui 39- ja 43-%:isen asetonit-riilin välillä (fraktiot 16 - 20). 20 μ1:η näyte fraktios-5 ta 19 analysoitiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforee- silla [13,5-%:inen geeli, Laenunli, Nature 227 (1970) 680] Havaittiin yksittäinen leveä proteiinivyöhyke, jonka näennäinen molekyylipaino oli 18 - 26 daltöniä. CSF:n melko leveä kokoalue on glykoproteiinien yleinen piirre, ja sen 10 ajatellaan heijastavan laajaa mutta vaihtelevaa hiilihyd-raattiadditiota. Proteiinille fraktiosta 19 tehdään Edman-hajoittaminen käyttämällä Applied Biosystemsin kaasufaasi-mikrosekvensaattoria. Käytetystä noin 20 pg:sta proteiinia saatiin ensimmäisten 16 aminohapon sekvenssi (A-P-A-R-S-15 P-S-P-S-T-Q-P-W-E-H). Tämän yksittäisen proteiinisekvens- sin korkea saanto antaa olettaa vahvasti, että CSF-prote-iini fraktiossa 19 oli puhdistettu homogeeniseksi. Bioana-lyysi osoitti, että fraktiossa 19 oli 3 x 107 yksikköä per A280-absorbanssiyksikköä. Koska tyypillisten proteiinien 20 ekstinktiokerroin vesiliuoksessa on 0,8 - 1,2 A280-absor-banssiyksikköä per milligramma proteiinia, puhdistetun ; ' ; CSF:n spesifinen aktiivisuus on välillä noin 1 x 107 - 4 x 107 yksikköä/mg analysoituna ihmisen luuydinsoluanalyy-, siä käyttäen.

I 25 Esimerkki B

j , . -

Gibbonin CSF:n kloonaus ( : : ’ * Vaihe 1. mRNA:n valmistus gibbonin T-soluista

Gibbonin T-solulinjanäytettä, jota merkitään UCS- : MLA 144, viljeltiin useita viikkoja RPMI 1640:ssa (toimit- J t i ·’ 30 taa Gibco) ja 20-%:isessa vasikansikiön seerumissa (FCS), kunnes saatiin kaikkiaan 1 x 109 solua. Solut indusoitiin tuottamaan korkeita määriä CSF:ta aktivoimalla 24 tuntia, kun läsnä oli 10 ng/ml 12-0-tetradekanoyyliforboli-13-i asetaattia (TPA) RPMI 1640:ssä, jossa oli 1 % FCS:ää. So- “*·' 35 lut otettiin talteen sentrifugoimalla (1 000 kierrosta 39 1 08 796 minuutissa, 5 min), pestiin kerran fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja otettiin lopulta talteen sentrifugoimalla.

Membraaniin sitoutunut polysomi (MBP) -mRNA valmis-5 tettiin näistä soluista käyttämällä samaa menetelmää kuin on kuvattu esimerkissä A Mo-solu-RNA:n valmistukselle. Vaihe 2. Ensimmäisen säikeen cDNA-reaktio 6 pg MBP-mRNA:ta (vaiheesta 1) laimennettiin 50 pl:aan cDNA-synteesireaktioseosta (katso esimerkki A -10 vaihe 4), ja reaktio aloitettiin lisäämällä käänteistrans-kriptaasia. Kun oli inkuboitu 30 minuuttia 42 °C:n lämpötilassa, reaktio lopetettiin lisäämällä EDTA:ta 50 mM:ksi, I ja laimennettiin vedellä 100 pl:ksi. Seos uutettiin feno- ! li/kloroformilla ja edelleen kloroformilla. cDNA-RNA-hyb- 1 15 ridit erotettiin yhdistymättömistä trifosfaateista kroma- i tografisesti 2 ml:n Sepharose C1-4B -kolonnissa. Poistetut I fraktiot yhdistettiin, ja hybridit otettiin talteen etano- lisaostuksilla. Lopullinen saanto oli 570 ng.

Vaihe 3. Toisen säikeen cDNA-reaktio | 20 Ensimmäisen säikeen cDNA-pelletti (vaihe 2) suspen- I ·,·. doitiin uudelleen 50 ml:aan vettä, ja toisen säikeen syn- ,·· teesi suoritettiin normaalissa reaktioseoksessa E. colin !’! polymeraasi I:llä, E. colin ligaasilla ja RNAasi H: 11a.

Reaktiota inkuboitiin yön yli 16 eC:n lämpötilassa ja sit- 25 ten yksi tunti 37 eC:ssa. Reaktio lopetettiin lisäämällä 1 · ·’ EDTA:ta ja uutettiin fenoli/kloroforntilla. cDNA erotettiin '.V yhdistymättömistä trifosfaateista kromatografisesti

Sepharose CL4B -kolonnissa, poistetut fraktiot yhdistet- : : : tiin, ja cDNA otettiin talteen etanolisaostuksella.

;' ·': 30 Vaihe 4. Yhdistelmä-cDNA:n valmistus ' . cDNA-pelletti (vaihe 3) suspendoitiin uudelleen • » · » » ’ 75 pl:aan vettä. Homopolymeeriset C-"hännät" lisättiin cDNA:n päihin lisäämällä 10 pl cDNA-liuosta 25 pl:aan standardireaktioseosta, jossa oli terminaalista transfe-·;·· 35 raasia, ja inkuboimalla 30 °C:ssa viisi minuuttia. Reaktio i i «o 108796 lopetettiin lisäämällä EDTA:ta 40 mM:ksi ja lämpö-inakti-voimalla 68 eC:ssa 10 minuuttia. 10 ng tätä hännällistä cDNA hybridisoitiin 50 ng:aan G-häntäistä pBR322:ta (toimittaa NEN) 10 pl:ssa 10 mM Tris-puskuria, pH 7,5, jossa 5 oli 1 mM EDTA:ta ja 100 mM NaCl:a. Hybridisaatioreaktiota inkuboitiin 10 minuuttia 68 °C:n lämpötilassa ja sitten kaksi tuntia 57 °C:n lämpötilassa.

Vaihe 5. Bakteeritransformointi E. coli -kantaa MC1061 kasvatettiin L-broth-väliai-10 neessa, jäähdytettiin jäässä, otettiin talteen sentrifu-goimalla ja käsiteltiin CaCl2:lla niiden valmistamiseksi transformointia varten. Viittä mikrolitraa cDNA-hybridi-saatioreaktioseosta inkuboitiin sitten 200 μ1:η kanssa CaCl2-käsiteltyjä bakteereita. Suoritettiin viisitoista 15 tällaista transformointia käyttämällä kaikki hybridisoitu cDNA ja levitettiin 1 % agaria L-Broth-väliainetta sisältäville 15 cm:n levyille, jotka sisälsivät 10 pg/ml tetrasykliiniä. Noin 1 000 pesäkettä kasvoi kullakin levyllä.

Vaihe 6. Kaksoiskappaleen kasvatus 20 10 000 pesäkettä transformoinnista poimittiin kukin hammastikulla, siirrettiin tuoreille levyille (500 per . 1. levy ristikossa) ja kasvatettiin yön yli 37 °C:n lämpöti lassa. Sitten pesäkkeet nostettiin kultakin levyltä pu- .‘t ristamalla kuiva nitroselluloosasuodatin lujasti levyn ! 25 pintaa vasten. Kaksi kopiosuodatinta valmistettiin kusta- i : : ; | kin näistä ykkössuodattimista. Ykkössuodattimia varastoi- t f · tiin 4 °C:n lämpötilassa, ja kopiosuodattimia käsiteltiin emäksellä ja kypsytettiin niiden valmistamiseksi hybridi- I » ,!,i i säätiötä varten.

: 30 Vaihe 7. 3^P-merkittyjen hybridisaatiokoettimien ··*··' valmistus . cDNA-insertti pCSF-l:stä eristettiin digeroimalla » · . restriktioentsyymillä EcoRl ja elektroforeesilla agaroosi- I i * ! V geelissä Tris-asetaattia ja etidiumbromidia käyttäen.

‘35 cDNA-fragmentin sisältävä vyöhyke leikattiin geelistä ja puhdistettiin lasij auhetekniikalla.

41 1 08796 300 ng cDNA-fragmenttia lisättiin sitten 1 plraan 10 x T4-DNA-polymeraasipuskuria (0,33 M Tris-asetaatti, pH 7,9, 0,66 M kaliumasetaatti, 0,1 M magnesiumasetaatti ja 10 mM ditiotreitoli), ja kolmeen yksikköön T4-DNA-polyme-5 raasia (New England Biolabs) ja laimennettiin vedellä 10 pl:ksi. Kun oli inkuboitu 5-10 minuuttia 37 °C:n lämpötilassa, tämä seos yhdistettiin 1 pl:aan 10 x T4-DNA-polymeraasipuskuria, 1 pl:aan 2 mM liuosta dCTP:tä, dTTP:tä, dGTPitä kutakin, 10 pl:aan 32PdATP:tä (10 pCi/pl, 10 3 000 Ci/mmol) ja kolmeen yksikköön Tr-DNA-polymeraasia.

Reaktioseosta inkuboitiin 20 minuuttia 37 °C:n lämpötilassa. Sitten lisättiin 1 μΐ 2 mM dATP:tä, ja reaktioseosta inkuboitiin vielä 10 minuuttia 37 eC:n lämpötilassa.

Yhdistymättömät trifosfaatit erotettiin merkitystä 15 cDNA:sta kromatografisesti Sephadex G100 -kolonnissa. Toinen koetin valmistettiin synteettisestä oligonukleotidis-ta, jolla on seuraava sekvenssi: ATC TGG CTG CAC AG, joka on komplementaarinen CSF-koodausalueen aminopään 20 kanssa. Tämä oligonukleotidi merkittiin 32PdATP:lla sen 5'-päästä käyttäen normaalia polynukleotidikinaasireaktiota.

• , Vaihe 8. CSF:n cDNA-kloonien eristäminen

Normaalissa hybridisaation seulontamenetelmässä noin 45 kloonia hybridisoitui T4-merkityn pCSF-l-cDNA:n 25 kanssa. Näistä noin 20 hybridisoitui myös merkittyyn oli-''*<* gonukleotidikoettimeen. Näistä yhden koodaava alue on sek- !.v vensoitu, ja sekvenssitiedot paljastivat joitakin emäs- substituutioita, joista jotkut johtavat aminohappoeroon i '. ; ilmennetyssä proteiinissa. Näitä eroja kuvataan kuviossa ; 30 1 esimerkissä A kloonatun ihmisen CSF-geenin DNA-sekvens- sin yläpuolella.

• i I T » » » t i » * i < \ t 1 * > I · t 42 1 08796

Esimerkki C

CSF:n kloonaus periferisen veren lymfosyytti-mRNA:sta

Vaihe 1. mRNA:n valmistus perifeerisen veren lym-5 fosyyteistä

Perifeerisen veren lymfosyytit valmistettiin neljästä plasmafereesin sivutuotteesta (toimittaa Punainen Risti) fraktioimalla Ficoll-Hypaque-gradientilla. Alhainen tiheys RPMI-1640:ssä 5-%:isen vasikansikiön seerumin, 10 0,17-%:isen fytohemagglutiniinin ja 10 ng/ml forbolimyris- taattiasetaatin (PMA) läsnä ollessa tiheydessä 2 x 106 so-lua/ml (kaikkiaan saatiin 6 x 109 solua). Solut otettiin talteen sentrifugoimalla (1 000 kierr/min, 5 min), pestiin j kerran fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja 15 kerättiin lopulta sentrifugoimalla. Sytoplasminen RNA val mistettiin hellävaraisella hajoitusmenetelmällä, jossa solut suspendoitiin uudelleen 50 ml:aan kylmää Triton-hajoituspuskuria (140 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris, pH 8,6, 0,5 % Triton X-100) 10 mM:n kanssa ditiotreitolia 20 (DTT) ja 50 yksikön/ml kanssa RNAasia (toimittaa Biotec).

V Tämä liuos jaettiin kahteen yhtä suureen osaan, ja kumpi kin osa kerrostettiin 10 ml hajoituspuskurikerroksen, joka f * * V; sisälsi 20 % sakkaroosia, päälle. Solutumat poistettiin i ", sentrifugoimalla kylmässä (4 °C, 400 kierr/min, viisi mi- * . t 25 nuuttia). Ylempi kerros (sytoplasmauute) poistettiin varo-vasti, ja natriumdodekyylisulfaattia (SOS) lisättiin 1 %:n lopulliseksi konsentraatioksi. Tämä liuos uutettiin kahdesti yhtä suurella tilavuudella fenoli/kloroformia (1:1 : seos), ja RNA säestettiin lisäämällä 2,5 tilavuutta kylmää > ? * ’ ‘ 30 etanolia. Seostettu RNA kerättiin sentrifugoimalla i "j (15 min, 4 000 kierr/min) ja suspendoitiin uudelleen 0,01 M Tris:iin, pH 7,5, jossa oli 1 mM EDTA:ta ja 0,25 M NaCl:a (TE-puskuri + 0,25 M NaCl) ja saostettiin uudelleen

* lisäämällä 2,5 tilavuutta kylmää etanolia. Lopulta RNA

35 otettiin talteen sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen 5 ml:aan vettä. Lopullinen saanto oli 7,5 mg.

43 1 08 7 96 Lähetti-RNA eristettiin kaikesta sytoplasma-RNA: sta oligo-dT-selluloosaselektiolla. 2,5 mg kaikesta RNAtsta lämmitettiin 65 °C:seen viideksi minuutiksi. NaCl:a lisättiin 0,5 Miksi, ja RNAin annettiin jäähtyä huoneen lämpö-5 tilaan. Tämä RNA kuljetettiin 1 ml:n oligo-dT-selluloo-j sakolonnin läpi, joka oli tasapainotettu TE-puskurilla, jossa oli 0,5 M NaClia (sitornispuskuri). Sitoutumaton RNA poistettiin pesemällä kolonni suurella määrällä sitomis-puskuria. Sidottu lähetti-RNA eluoitiin 3 ml:11a vettä ja 10 saostettiin lisäämällä 0,2 ml 4 M NaClia ja 2,5 tilavuutta kylmää etanolia. Saostettu mRNA kerättiin sentrifugoimalla (30 minuuttia, 25 000 kierr/min). Lopullinen pelletti (noin 100 pg) suspendoitiin uudelleen 50 pl:aan vettä.

Vaihe 2. Ensimmäisen säikeen cDNA-reaktio 15 20 pg PBL-mRNA:ta laimennettiin 50 pl:aan cDNA-

j synteesireaktioliuosta joka sisälsi 100 mM Tris:iä, pH

8,4, jossa oli 140 mM KCl:a, 10 mM MgCl2:a, 10 mM 2-merkap-toetanolia, 400 pM dATP:tä, dGTP:tä, dCTPitä ja dTTP:tä kutakin, 5 pg oligo-dT:tä (keskikoko 12 - 18) alukkeena, V. 20 25 pCi 32PdCTP:tä (400 pCi/mmol) ja 20 yksikköä ribonuk- · , leaasi-inhibiittoria, RNAsiinia. Reaktio aloitettiin li- säämällä 60 yksikköä käänteistranskriptaasia 37 °C:ssa ja ..I inkuboimalla 30 minuuttia 42 °C:n lämpötilassa. Reaktio lopetettiin lisäämällä EDTA:ta 40 mM:n pitoisuuteen ja 25 uutettiin yhtä suurella tilavuudella vedellä kyllästettyä fenolia. Fenolifaasi uutettiin takaisin 50 piillä TE-pus-kuria. Vesifaasit yhdistettiin. cDNA-RNA-hybridit erotet-jJ : tiin yhdistymättömistä trifosfaateista kuljettamalla yh- : distetty vesif aasi 5 ml: n Sepharose CL-4B -kolonnin yli 30 (toimittaa Sigma), joka oli tasapainotettu TE:11a. Kolon-

Mill nista poistetut fraktiot yhdistettiin, tuotiin 250 mM NaCl:iin, ja nukleiinihapot saostettiin lisäämällä 2,5 : .· tilavuutta kylmää etanolia. Hybridit kerättiin sentrifu- j goimalla 30 minuuttia nopeudella 40 000 kierr/min. Lopul- 35 linen pelletti (2,5 pg cDNAita) suspendoitiin uudelleen 50 pl:aan vettä.

44 1 08796

Vaihe 3.7 Toisen säikeen cDNA-reaktlo Toisen säikeen cDNA syntetisoitiin entsyymien E. colin DNA-polymeraasi I:n, E. colin DNA-ligaasin ja E. Colin RNAasi H:n yhteisvaikutuksella. Reaktioseos (50 μΐ) 5 sisälsi 20 mM Tris:ä, pH 8,0, jossa oli 4 mM MgCl2:a, 1,2 mM EDTA:ta, 25 μΜ NAD:tä, 100 μΜ dATP:tä, dGTP:tä, dCTPttä ja dTTP:tä kutakin ja 50 pCi 32P-dCTP:tä (3 000 Ci/mmol). Reaktio suoritettiin lisäämällä kolme yksikköä DNA-polymeraasi I:tä, 0,5 yksikköä DNA-ligaasia ja 0,75 10 yksikköä RNAasia H ja inkuboimalla 16 °C:n lämpötilassa 18 tuntia, sitten 37 °C:ssa yksi tunti, ja lopetettiin sitten lisäämällä EDTA:ta 40 mM:ksi ja uutettiin yhtä suurella tilavuudella fenolia. Fenolifaasi uutettiin takaisin 50 pl:lla TE:tä, vesifaasit yhdistettiin, ja cDNA erotet-15 tiin yhdistymättömistä trifosfaateista kromatografisesti | Sepharose CL-4B -kolonnilla, kuten on kuvattu yllä ensim mäiselle säikeelle. 32P:n yhdistämiseen perustuen ensimmäisen säikeen cDNA muunnettiin kvantitatiivisesti kaksisäi-keiseksi muodoksi.

20 Valhe 4. Yhdistelmä-cDNA:n valmistus

Homopolymeerisiä C-"häntiä" lisättiin cDNA:n päihin lämmittämällä varovasti 400 ng cDNA:ta 50 pl:ssa reaktio-seosta, joka sisälsi 1 mM merkaptoetanolia, 1 mM CoCl2:a ja yhdeksän yksikköä terminaalista deoksinukleotidyylitrans-25 feraasia, 30 °C:n lämpötilassa viisi minuuttia. Reaktio ·',·.· lopetettiin lisäämällä EDTA:ta 40 mM:ksi ja lämmittämällä 68 °C:een 10 minuutiksi. 200 ng tätä hännällistä cDNA:ta : hybridisoitiin 500 ng:n kanssa G-hännällistä pAT153:a • * > · (toimitettu Amershamilta) 100 pl:ssa 10 mM Tris-puskuria, * . 30 pH 7,5, jossa oli 1 mM EDTA:ta ja 100 mM NaCl:a. Hybridi- I l I i · ] saatioreaktio suoritettiin 57 °C:ssa kaksi tuntia viiden minuutin 68 eC:n lämpötilassa esi-inkuboinnin jälkeen. Vaihe 5. Bakteeritransformointi ;··} cDNA-hybridisaatioreaktiotuotetta käytettiin suo- 35 raan E. coli -kannan MC1061 transformoimiseksi. Tuoretta bakteerisolupesäkettä käytettiin ymppäämään 50 ml L-broth- 45 1 08796 väliainetta ja kasvatettiin useita tunteja, kunnes optinen tiheys 550 nm:n kohdalla oli 0,25. Solut jäädytettiin jäillä ja otettiin talteen sentrifugoimalla (2 000 kierr/min, 10 min). Pelletti suspendoitiin uudelleen 5 10 ml:aan kylmää 0,1 M CaCl2:a ja suspension annettiin olla jäissä 10 minuuttia. Solut kerättiin sentrifugoimalla (2 000 kierr/min, viisi minuuttia) ja suspendoitiin uudelleen 2,5 ml:aan 0,1 M CaCl2. 10 μΐ cDNA-hybridisaatioreak-tiota inkuboitiin sitten 200 μ1:η kanssa CaCl2-käsiteltyjä 10 bakteereja 30 minuuttia jäissä ja sitten kaksi minuuttia 37 eC:n lämpötilassa, ja sen jälkeen lisättiin 0 - 8 ml L-Broth-väliainetta ja lopuksi inkuboitiin 30 minuuttia 37 °C:n lämpötilassa.

Kaksikymmentä näistä transformoinneista suoritet-15 tiin käyttämällä kaikki hybridisoitu cDNA. Kukin transfor-mointiseos levitettiin l-%:isille agar-L-broth-levyille (15 cm:n halkaisija), jotka sisälsivät 10 pg/ml tetrasyk-| liiniä. Kahdestakymmenestä transformoinnista kaikkiaan 20 tällaista levyä levitettiin ja inkuboitiin yön yli 37 ®C:n . . 20 lämpötilassa. Keskimäärin noin 1 500 bakteeripesäkettä

( * J

kasvoi kullakin levyllä kaikkiaan 30 000 klooniksi.

Vaihe 6. Kaksoiskappaleiden kasvatus

Kullakin levyllä kasvavat alkuperäiset pesäkkeet siirrettiin 137 mm:n nitroselluloosasuodattimille paina-1 25 maila kuivaa suodatinta pesäkkeiden päälle ja nostamalla : : : ne pois levyltä. Kaksi identtistä kopiota valmistettiin kustakin alkuperäissuodattimesta normaaleilla replica : plating -menetelmillä, joissa kukin alkuperäinen suodatin sijoitettiin huolellisesti pesäkepuoli ylöspäin steriilil-30 le suodatinpaperineliölle (Whatman 3 MM), joka oli nelikulmaisen lasinpalan päällä. Uusi esikasteltu nitrosellu-: ”· loosasuodatin suunnattiin huolellisesti ykkössuodattimen päälle, peitettiin toisella steriilillä suodatinpaperine-liöllä ja koko sandwich puristettiin yhteen lujasti toi-35 sella lasinkappaleella. Kerrostetut suodattimet numeroitiin ja kolme neulanreikää painettiin niiden läpi asymmet- ! 46 1 08796 i risesti siten, että ne voitaisiin suunnata tarkasti jälleen tulevaisuudessa. Kaksoiskappale poistettiin sitten ykköskappaleelta ja pantiin pesäkepuoli ylöspäin uudelle tetrasykliiniä sisältävälle L-Broth-agarlevylle. Toinen 5 kopiokappale valmistettiin välittömästi identtisellä tavalla. Kukin ykkössuodatin palautettiin levylle, ja kaikkia levyjä inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa useita tunteja, kunnes bakteeripesäkkeet olivat saavuttaneet noin 1 mm:n halkaisijan. Alkuperäiset ykkössuodattimet varas-10 toitiin 4 °C:n lämpötilassa, ja kaksoiskappaleet valmistettiin hybridisointiin, kuten on esitetty alla.

Vaihe 7. Suodattimien valmistus hybridisointiin Kukin kopiosuodatin (vaihe 6) pantiin pesäkepuoli ylöspäin suodatinpaperille (Whatman 3 MM) ja kasteltiin 15 0,5 M NaOH:ssa ja 1,5 M NaClrssa useita minuutteja. Suo dattimet siirrettiin neutralisointisuodatinpapereille, kasteltiin 1 M Tris-puskurilla, pH 7,5, jossa oli 1,5 M J NaCl:a, kaksi minuuttia ja siirrettiin sitten toiselle I neutralointisuodattimien sarjalle 5-10 minuutiksi. Lo- 20 puita suodattimet pantiin suodattimille, jotka oli kasteltu SSC-puskuriin (0,015 M natriumsitraatti, 0,15 NaCl, pH 7,4) viideksi minuutiksi, kuivattiin ilmalla ja kypsytet-tiin vakuumissa 80 °C:n lämpötilassa 1-2 tuntia.

Vaihe 8. CSFin cDNA-kloonien eristys ; '•t·* 25 Rinnakkaissuodattimet käsiteltiin käyttäen alukkee- 'V.· na radioaktiivisesti merkittyä pCSF-l-cDNA-inserttiä, joka valmistettiin, kuten on kuvattu yllä esimerkissä B. Noin i 20 pesäkettä hybridisoitui cDNA:n kanssa. Kaksitoista näistä poimittiin ykkössuodattimelta ja kasvatettiin yön ' , 30 yli L-Broth-väliaineessa jatkoanalyysia varten. DNA-näyt- [ teiden (nopea valmistus) restriktioentsyymiuutteet (Pstl) näistä klooneista osoittivat, että kolme oli miltei täysi-pitkiä. Yksi näistä on sekvensoitu. Tämän kloonin CSF-koo- dausalueen sekvenssi oli identtinen vastaavan pCSF-1 sek- 35 venssin kanssa [so. sillä oli T asemassa 365-CSF(Ile)].

47 1 0 8 7 9 6

Esimerkki D

CSF:n puhdistus Mo-solulinjasta

Mo-seerumitonta käsiteltyä väliainetta (40 litraa) inkuboitiin 55 °C:ssa 30 minuuttia HTLV-II-viruksen, joka 5 on liittynyt solulinjaan, inaktivoimiseksi. Tätä väliainetta konsentroitiin paineistetulla ultrasuodatuksella käyttämällä Pellicon Casette -laitetta membraanin PTGC kanssa (0,14 neliömetriä), jossa on 10 000 molekyylipainon läpäisyraja. Proteiini konsentroitiin edelleen ammonium-10 sulfaattisaostuksella (80 %:n kyllästys). Lopullinen pro-teiinipelletti (800 mg) suspendoitiin uudelleen 100 mitään 20 mM tris(hydroksimetyyli)aminometaanihydrokloridia (Tris-HCl), pH 7,4, ja dialysoitiin samaa puskuria vastaan (kolme kertaa, neljän litran vaihdot kullakin kerralla). 15 Dialysoitu proteiini pantiin 2,5 x 10 cm DEAE (dietyyli-aminoetyyli)-Ultrogel -kolonniin, joka oli tasapainotettu samalla puskurilla. Kolonni pestiin 800 ml:11a 20 mM Tris-HCl ta, pH 7,4, minkä jälkeen CSF-aktiivisuus eluoitiin 800 ml:11a 20 mM Tris-HCl-puskuria, pH 7,4, joka sisälsi 20 0,12 M NaClta. 10 mltn fraktiot otettiin talteen, ja niis tä analysoitiin CSF. Aktiiviset fraktiot (3) yhdistettiin • ja konsentroitiin 6-kertaiseksi (5 mltksi) paineistetulla ultrasuodatuksella (Amicon YM5-membraani, 5 000 molekyyli-painon läpäisyraja). Konsentroitu näyte DEAE-kolonnista , 25 pantiin 1,6 x 100 cm AcA44-Ultrogel (akryyliamidiagaroosi- * /-S Ultrogel, jossa on 10 - 130 kilodaltönin fraktiointi) -kolonniin, joka oli tasapainotettu 20 mM N-2-hydroksi-etyylipiperatsiini-N-2-etaanisulfonihapolla (HEPES), pH , 7,4, jossa oli 50 mM NaClta ja 0,01 % polyetyleeniglykolia 30 (PEG-8000). CSF-aktiivisuus eluoitui kolonnista näennäi- ’ * sellä 30 kilodaltonin molekyylipainolla. Aktiiviset frak- • tiot yhdistettiin ja saatettiin 0,15-%:isiksi (v/v) tri- fluorietikkahapon (TFA) suhteen lisäämällä 10-%:sta TFAtta , ja pantiin Vydac C4 -käänteisfaasikolonniin (1 x 25 cm).

35 Kolonni kehitettiin lineaarisella gradientilla 0 - 90 % 48 1 08796 asetonitriiliä 0,l-%:isessa TFA:ssa (v/v) 4 ml/min (1 000 ml kaikkiaan). CSF-aktiivisuus eluoitui noin 47 % (v/v) kohdalla asetonitriiliä. Yhdistetyt aktiiviset fraktiot saatetiin 0,05-%:isiksi (v/v) heptafluorivoihapon 5 (HFBA) suhteen lisäämällä puoli tilavuutta 0,15-%:ista (v/v) HFBA:ta ja pantiin Vydac C4 -kolonniin (0,46 x 25 cm), joka oli tasapainotettu 0,15-%:lla (v/v) HFBA:11a. Kolonni kehitettiin lineaarisella gradientilla 0 - 90 % (v/v) asetonitriiliä 0,15-%:isessa (v/v) HFBA:ssa 10 1 ml/min. (kok. 340 ml). CSF-aktiivisuus eluoitui noin ! 53 %:n (v/v) kohdalla asetonitriiliä. Fraktiot 37 - 44 i (1 ml kutakin) havaittiin aktiivisiksi. 0,15 ml fraktiota 40 konsentroitiin 4-kertaiseksi (käyttämällä SAVANT Speed Vac Concentrator -laitetta) ja 40 μΐ 2 x SDS-geelinäyte-15 puskuria lisättiin (0,125 M Tris-HCl, pH 6,8, jossa oli 4 % SDS:ää, 20 % glyserolia ja 0,004 % bromifenolisinis-tä). Näitä näytteitä keitettiin kaksi minuuttia ja pantiin | 13,5-%:iseen [Laemmli, U., Nature 227 (1970) 680] SDS-gee- liin (katso kuvio 2). Fraktiossa (nro 40) määritettiin 20 olevan 110 000 luuydin-CSF-yksikköä/ml. Tämä vastaa noin 3,0 x 107 yksikköä per A280-absorbanssiyksikkö. Koska tyy-pillisten proteiinien ekstinktiokertoimet ovat välillä ·' 0,8-1,2 A280-yksikköä per milligramma, puhdistetulla CSFrlla oli spesifinen aktiivisuus välillä noin 1 x 107 -2 5 4 x 107 yksikköä per mg luuydinkokeessa. 1 pg:n näyttelle puhdistettua GM-CSF:ää tehtiin Edman-hajoitus käyttämällä Applied Biosystems Gas Phase Microsequenator -laitetta, j /; Tähteiden 3-5 sekvenssin määritettiin olevan Ala Arg

Ser.

* 30 Esimerkki E

1 ‘ CSF-sekvenssin yhteistransformointi ja monistus ’* · CHO-soluissa

Plasmidi p91023(B)-CSF vietiiin CHO-DHFR-vajavai- ____; siin soluihin DUKX-B11 [Chasin ja Urlaub, PNAS 77 (1980) 35 4 216] protoplastifuusiolla, kuten on kuvattu [Sandri- 49 108796

Goldin et ai., Mol. Cell. Biol. 1 (1981) 743 - 752]. CHO-solujen kasvu ja ylläpito on kuvattu [Kaufman ja Sharp., J. Mol. Biol. 150 (1981) 601 - 621], Protoplastifuusiota varten p91023(B)-CSF-l vietiin E. coli HB 101:een, ja bak-5 teereita kasvatettiin 50 ml:ssa m9-suoloja, jotka sisältävät 0,5 % kasaminohappoja, 0,4 % glukoosia, 0,012 % MgS04:a, 5 pg/ml tiamiinia ja 10 pg/ml tetrasykliiniä, ab-sorbanssiin 0,6 aallonpituudella 600 nm. Kloramfenikolia lisättiin 250 pg/ml:n pitoisuuteen, ja viljelmää inkuboi-10 tiin 37 °C:n lämpötilassa vielä 16 tuntia plasmidin kopio-luvun monistamiseksi. Soluja sentrifugoitiin 3 000 x g:ssä 10 min 4 °C:n lämpötilassa, ja ne suspendoitiin 2,5 ml:aan jäähdytettyä 20-%:ista sakkaroosia 50 mMrssa Tris-Cl:a, pH | 8,0. Lysotsyymiä lisättiin (0,5 ml 5 mg/1 liuosta 0,25 M

j 15 Tris-Cl:ssa, pH 8,0), ja seosta pidettiin jäässä 5 min.

EDTA:ta (1 ml 0,25 M EDTA, pH 8,0) lisättiin vielä viiden minuutin ajan jäässä, minkä jälkeen 1,0 ml 0,05 M Tris-I Cl:a, pH 8,0, lisättiin hitaasti. Suspensiota inkuboitiin 15 minuuttia 37 °C:n lämpötilassa, kunnes bakteerit muut-20 tuivat protoplasteiksi. Suspensio laimennettiin sitten hitaasti 20 ml:11a esilämmitettyä väliainetta, joka sisälsi 10 % sakkaroosia ja 10 mM MgCl2:a ja pidettiin 37 °C:n lämpötilassa 15 min. Protoplastien liuos (noin 109/ml) li-'···' sättiin CHO-DHFR-vajavaisiin DUKX-B11-soluihin kuusikuop- = \v 25 paisella levyllä (noin 1 x 106 solua/kuoppa) suhteessa noin ',ν 1 - 2 x 104 protoplastia/solu, ja protoplastit pelletoitiin soluille sentrifugoimalla nopeudella 2 000 kierr/min 8 min • IEC model K -sentrifugin keinuvassa mikrotiitterilevyroot- »ii i torissa. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti poistettiin • t 30 imemällä. Kahden millilitran määrä polyetyleeniglykoli- liuosta [50 g PEG-1450 (Baker Chem. Co.) 50 ml:ssa väli- » : » > | ainetta] lisättiin kuhunkin kuusikuoppaisen levyn kuop-: paan. Solut sentrifugoitiin jälleen nopeudella 2 000 . kierr/min 90 sekuntia, polyetyleeniglykoliliuos poistet- 35 tiin, ja levyt huuhdottiin kolme kertaa 4 ml:11a väliai- so 1 08796 netta/kuoppa. Sitten solut trypsinisoitiin, suspendoitiin 10 ml:aan väliainetta, joka sisälsi 10 % vasikansikiön seerumia, ja sentrifugoitiin kartionmuotoisessa putkessa nopeudella 500 kierr/min kliinisessä sentrifugissa. Pelle-5 toidut solut kolmesta kuopasta yhdistettiin ja pantiin levylle 10 cm:n kudosviljelyastiaan. Tuoretta väliainetta, joka sisälsi 100 pg/ml kanamysiiniä, tymidiiniä, adenok-siinia, deoksiadenosiinia, penisilliiniä ja streptomysiiniä, ja l0-%:ista dialysoitua vasikansikiön seerumia li-| 10 sättiin kullekin levylle. Kanamysiini lisättiin, jotta eh käistäisiin niiden bakteerien kasvu, jotka olivat välttyneet konversiolta protoplasteiksi.

Kaksi päivää myöhemmin solut jatkoviljeltiin 1:15 I alfa-väliaineeseen 10-%:n kanssa dialysoitua vasikansikiön ! 15 seerumia, penisilliiniä ja streptomysiiniä, mutta ilman j nukleosideja. Soluille annettiin sitten taas samaa selek- | tiivistä väliainetta (ilman nukleosideja) 4-5 päivän ku luttua.

Kasvupesäkkeet ilmestyivät 10 - 12 jatkoviljelyn ·,·. 20 jälkeen selektiivisessä väliaineessa. Noudatettiin kahta ohjelmaa metotreksaatti (MTX) -selektiolle ja monistuksel-le. Ensimmäisessä ohjelmassa yksinäiset, itsenäiset kloo-natut transformantit eristettiin DHFR-ekspression perus-teella, ja sen jälkeen kutakin kloonia lisättiin olosuh-25 teissä, joissa vieraan DNA:n kopioiluku monistui, so. kas-v vatettiin kasvavissa metotreksaattikonsentraatioissa. Toi sessa ohjelmassa monien itsenäisten transformanttien pooli I eristettiin DHFR-ekspression perusteella, ja poolia lisät- tiin yhdessä olosuhteissa, joissa vieras DNA monistui, so.

• i 30 kasvatettiin kasvavissa metotreksaattikonsentraatioissa.

·*»♦*

Yksittäiset kloonit eristettiin massavalitusta populaa-’ * tiosta, ja ne analysoitiin GM-CSF-ekspression suhteen.

jV; Niitä klooneja, jotka osoittivat korkeimpia GM-CSF-tasoja, kasvatettiin jälleen olosuhteissa, joissa vieras DNA rao-35 nistuu lisää (so. kasvatettiin kasvavissa metotreksaatti-konsentraatiossa viljelyväliaineessa).

j 51 1 08796

Yhdessä kokeessa seitsemän DHFR+-transformanttia yhdistettiin alfa-väliaineeseen, josta puuttuivat nukleo-sidit. Näitä soluja kasvatettiin sen jälkeen vaiheittain kasvavissa MTX-konsentraatioissa lähtien 0,02 pMrsta, sit-5 ten vaiheet 0,1, 0,5 ja 2,0 mM MTX:a. Kun näistä soluista analysoitiin GM-CSF-aktiivisuus KG-l-soluanalyysilla, ne tuottivat 3 000 - 12 000 yksikköä per ml. Valittu populaatio kloonattiin 0,5 μΜ MTX:ssa ja 2,0 μΜ MTXissa. 0,5 μΜ MTX:ssa (010, D2 ja B6) saadut kloonit valittiin sitten 10 kasvatukseen 2,0 μΜ MTXrssa. Kun analysoitiin GM-CSF-aktiivisuus KG-l-soluanalyysissä, kloonatut solulinjat tuottivat 15 000 - 300 000 yksikköä per ml GM-CSF-aktiivisuut-ta. Tämän esimerkin mukaan valmistetulla GM-CSF:llä on | I kuviossa 1 CSF-Thr:lle annettu aminohapposekvenssi.

15 Esimerkki F

GM-CSF-ekspressio E. colissa GM-CSF ilmennettiin E. colissa vektorista pTALC-185R, jonka kaavakuva on esitetty kuviossa 6. GM-CSF-koo-daussekvenssi alkaa synteettisellä sekvenssillä 20 ATG.CCA.CCA.CCT.CCT.TCT.CCA.TCT.CCA.TCT.ACT, joka määrit- tää kypsän GM-CSF:n ensimmäiset 11 aminohappotähdettä. Jäljelle jäävä osa GM-CSF-koodaussekvenssistä pTALC- .* 185R:ssä on identtinen pCSF-l:n kanssa, nukleotidit 97 - > > · 447, joita seuraa sekvenssi TAR.TAR.TAG. Välittömästi kolli 25 moispäättäjän jälkeen on pUC-18-monikytkijä. Tetrasyklii- ! : ; niresistenssigeeni pBR322:sta on insertoitu vastakkaises sa orientaatiossa CSF-geenin kanssa, 100 emästä myötävir-: taan pUC-18-monikytkijästä. Tetrasykliiniresistenssigeeni , ·>, kantaa omaa promoot tori aan. Jatkaen vastapäivään on seu- 30 raavaksi beetalaktamaasin geeni, jonka jälkeen on pUC-18 ' * (CoLel) -replikaation aloituskohta.

Plasmidin lopullinen rakenteellinen piirre ennen palaamista CSF-sekvensseihin on PL-promoottori. Tämä pro-moottori on oleellisesti sellainen kuin A. Skazman ja M.

> » 35 Rosenberg (kirjassa "Molecular cloning, a laboratory manual" (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, sivu 419) 52 1 0 8 7 9 6 ovat kuvanneet. PL-promoottori saa aikaan CSF-ekspression termisen induktion jälkeen sopivassa E. coli -isäntäkan-nassa.

Kaikkiin kantakonstruktioihin käytetty emokanta oli 5 W3110 lacI°L8 [R. Brent ja M. Ptashne, PNAS 78 (1981) 4 204 - 4 208].

j lambda-DNA-fragmentti (lambda-nukleotidit 34 499 - 38 214) integroitiin kromosomiin W3110 lacI°L8 lacZ-lokuk-seen. Integraatio suoritettiin käyttämällä integraatiovek-10 toria, joka koostuu pBR325--sekvensseistä, joissa on klor-amfenikoli- ja ampisilliini-resistenssigeenit sekä pBR322-toiston aloituskohta [F. Bolivar, Gene 4 (1978) 121 -136]. lambda-DNA-fragmentti insertoidaan IacZ-geeniin, joka itse on läsnä plasmidissa fragmenttina, joka ulottuu 15 BstEil-paikasta Lacl:ssa Tthilll-paikkaan myötävirtaan lacZ:sta. lambda-DNA:n integraatio lacZ:n kromosomikopioon saavutettiin homologisella rekombinaatiolla, ja lac*, am-pisilliini-herkkiä, kloramfenikoliresistenttejä pesäkkeitä löydettiin. Toinen rekombinaatiotapahtuma, joka johtaa . 20 kaikkien ylimääräisten plasmidisekvenssien poistoon, mut ta joka jättää DNA-fragmentin integroituneeksi, seulottiin laktoosi-MacConkey-levyillä. Alkuperäinen lac*, amps, camR-.· fenotyyppi muuttui lac', amp*, earn3-fenotyypiksi toisen •,rekombinaatiotapahtuman jälkeen. Tuloksena olevaa kantaa ’· 25 kutsutaan GL400:si ja se oli lambda* 30 °C:ssa ja lambdas : 42 eC:ssa. Tämä fenotyyppi osoittaa CI857-alleelin funktio naalisen kromosomikopion olemassaoloa.

; GL400 tehtiin lon" PL-transduktiolla lysaatista, :·. ioka kasvatettiin kannalla SG20252 (lacAul69, araAl39 30 rpsl ΙοηΔ 100:: TnlO). TnlO kypsytettiin seulomalla Tets:n ' suhteen selektiivisillä väliaineilla [S. Maloney, W. Nunn, :'*ί J. Bacteriol. 145 (1981) 1 110 - 1 112].

; .·, Lopullista isäntäkantaa kutsuttiin Gl413:ksi [lacl°L8, LacZA (lambdaCI, REX, N), ΙοηΔίΟΟ].

35 pTALC-185R transformoitiin GI413:iin. Kannan yön yli viljelmää kasvatettiin 30 eC:ssa 5 ml:ssa induktioväliainet- i 53 108796 ta, joka sisälsi 7 pg/ml tetrasykliiniä. Induktioväliaine sisältää litraa kohti: 20 g kasaminohappoja 6 g Na2HP04.47H20 5 3 g KH2P04 0,5 g NaCl 1 g NH4C1 1 % glyserolia 2 mg vitamiinia B1 10 2 mg CaCl2.2H20 0,2 g MgCl2.6H20 Tätä väliainetta (25 ml), joka sisälsi 7 pg/ml tetrasykliiniä, ympättiin 125 piillä yön yli viljelmää ja ravistettiin 30 °C:n lämpötilassa vesihauteessa, kunnes vil-15 jelmä oli saavuttanut tiheyden A550 = 0 , 5. Sitten se siirrettiin nopeasti 40 °C:n vesihauteeseen, ja sitä ravistettiin vielä kaksi tuntia GM-CSF-synteesin sallimiseksi. Solut otettiin talteen ja niiden CSF-pitoisuus tarkistettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Näissä 20 olosuhteissa GM-CSF akkumuloituu noin 5 %:iin soluproteii-nista.

! ·' Esimerkki G

GM-CSF:n ekspressio Saccharomyces cerevisiaessa . .: A. Vektorin konstruktio 25 Konstruoitiin plasmidi, joka sisälsi urasiilin bio- ί ; ; synteettisessä reitissä olevan entsyymin (URA3) geenin se- lektiogeeninä ja 2u-replikaation aloituskohdan. Tämä plas-, midi saatiin Ylp5:stä [Botstein et ai., Gene 8 (1979) 17 - 24] lisäämällä fragmentti, joka sisälsi replikaation aloi- * * * f 30 tuskohdan hiivan 2 mikrometrin plasmidista.

’ B. Glyseraldehydifosfaattidehydrogenaasin (GPDH) * geenin eristäminen t

Kaksi GPDH:n geeniä on eristetty hiivasta [Holland ja Holland, Journal of Biological Chemistry, 255 (1980) 35 2 596 - 2 605]. Oligonukleotidi-koetinta, joka syntetisoi tiin julkaistusta sekvenssistä, käytettiin GPDH-geenin 54 108796 eristämiseksi hiivan genomisen DNA.: n plasmidikir j astosta standardimenetelmillä. Plasmidi, joka sisälsi koko GAP491-geenin, on talletettu aikaisemmin (ATCC nro 39 777).

C. Glyseraldehydifosfaattidehydrogenaasipromootto-5 rin valmistus heterologiseen geeniekspressioon

Konstruoitiin plasmidi, joka sallii GPDH-promoottorin luonnollisen jakamisen halutun heterologisen rakenteellisen geenin alusta. Tämä saavutettiin viemällä Kpnl-paikka välittömästi GPDH:n rakenteellisen geenin initi-10 aattorimetioniinin kodonin viereen. Promoottori-"kasetti" in-sertoitiin sitten hiivan ekspressiovektoriin YOpl.

D. Alfa-faktorin geenin eristys

Alfa-faktoria vastaavan feromonin geeni on eristetty hiivasta [Kurjan ja Herskowitz, Cell 30 (1982) 933 - 943]. 15 Tästä sekvenssistä syntetisoitua oligonukleotidikoetinta käy tettiin geenin eristämiseen hiivan genomisen DNA:n plasmidikir j astosta standardimenetelmillä.

E. CSF-ekspressioplasmidin valmistus

Yllä kuvatuista elementeistä ja ihmisen CSF-20 geenistä konstruoitiin ekspressiovektori (AJ14, kuvio 7) standardimenetelmillä. Tässä vektorissa CSF:n normaali johta-jasekvenssi on poistettu ja kypsää CSF:ää koodaava sekvenssi on insertoitu faktorin alfa pre-pro-sekvenssin viereen. Lii-: toskohdat GPDH-promoottorin, alfa-faktori pre-pro-sekvenssin 25 ja kypsän CSF-sekvenssin välillä täsmennetään (alla), ja ne ; on vahvistettu dideoksinukleotidisekvensoinnilla.

’*··. AAATAAACAAAATG. CGTTTTCCTTCA AAA AGA GAG GCG GAA

GCT.GCA CCC GCC CGC TCG...

I t I

F. GM-CSF:n ekspressio 30 Plasmidi AJ14 transformoitiin Saccharomyces cere- visiae -kantaan. Soluja viljeltiin CSF-.n tuottamiseksi.

Yllä olevan mukaisesti havainnollistetaan ' ! seuraavat keksinnön spesifiset toteutukset: ;·, 1'. Menetelmä CSF-cDNA: ta sisältävän trans- 35 formointivektorin valmistamiseksi ja eristämiseksi, ·;* jolloin menetelmä käsittää: • » * * » · 55 1 08796 RNA:n valmistuksen solusta, joka tuottaa CSF:ää; polyadenyloidun lähetti-RNA:n valmistuksen mainitusta RNA:sta; yksisäikeisen cDNA:n valmistuksen mainitusta lähet-5 ti-RNA:sta; yksisäikeisen cDNA:n muuttamisen kaksisäikeiseksi cDNArksi; kaksisäikeinen cDNA:n insertoimisen transformointi-vektoreihin ja bakteerien transformoinnin mainitulla vekto-10 rilla kasvupesäkkeiden muodostamiseksi; 200 - 500 pesäkettä käsittävien poolien poimimisen ja plasmadi-DNA:n eristämisen kustakin poolista; plasmadi -DNA.: n transfektoinnin sopiviin isän-täsoluihin CSF-proteiinin ilmentämiseksi; 15 transfektoitujen solujen viljelyn ja supernatant in CSF-aktiivisuuden analysoinnin; ja CSF-positiivisten poolien valinnan ja niiden pesäkkeiden seulonnan, joita käytettiin poolien valmistukseen, sen pesäkkeen identifioimiseksi, jolla on CSF-20 aktiivisuutta.

2'. Kohdan 1' menetelmä, jossa mainittu solu, joka tuottaa CSF:ää, on T-lymfosyyttisolu.

3'. Eukaryoottinen solu, joka erittää proteiinia ja joka on transformoitu kohdan 1' menetelmällä valmiste-25 tulla ekspressiovektorilla.

"V 4'. Kohdan 5' solu, joka on nisäkässolu.

5'. Kohdan l':n menetelmä, joka käsittää lisäksi ' : CSF-proteiinia koodaavan DNA eristämisen pesäkkeestä, jolla on CSF-aktiivisuutta, ja mainitun CSF:ää koodaavan DNA.:n \ 30 insertoinnin ekspressiovektoriin, jolla on CSF-DNA:n nähden heterologinen promoottori.

6' . Kohdan 5' menetelmällä valmistetun ekspres- , siovektorin transformoima solu.

, · · » 7'. Kohdan 6' solu, joka on prokaryoottinen solu.

• 35 8'. Kohdan 6' solu, joka on eukaryoottinen solu.

;';': 9'. cDNA, j oka koodaa CSF:ää 56 108796 10'. cDNA., jolla on kuviossa 1 esitetty nukleoti-disekvenssi.

11'. Ekspressiovektori, joka käsittää CSF:ää koo-daava cDNA.:n.

5 12'. Ekspressiovektori, joka käsittää kuviossa 1 esitetyn nukleotidisekvenssin.

13'. Transformoitu solu, joka käsittää kohdan 11' ekspressiovektorin tai sen alleelisen variaation.

14'. Transformoitu solu, joka käsittää kohdan 12' 10 ekspressiovektorin.

15'. Kohdan 13' solu, joka on prokaryoottinen solu. 16' . Kohdan 14' solu, joka on prokaryoottinen solu. 17*. Kohdan 13' solu, joka on eukaryoottinen solu. 18'. Kohdan 14' solu, joka on eukaryoottinen solu. 15 19'. Kohdan 17' solu, joka on hiivasolu.

20'. Kohdan 18' solu, joka on hiivasolu.

21'. Kohdan 17' solu, joka on nisäkässolu.

22'. Kohdan 18' solu, joka on nisäkässolu.

23'. Kohdan 17' solu, joka on hyönteissolu.

20 24'. Kohdan 18' solu, joka on hyönteissolu.

25'. CSF-proteiini, joka on tehty ilmentämällä CSF:ää koodaavaa cDNA.:ta transformoidussa solussa.

26'. Kohdan 25' proteiini, jossa mainittu solu on prokaryoottinen solu.

25 27'. Kohdan 25' proteiini, jossa mainittu solu V eukaryoottinen solu.

·,,/ 28'. Kohdan 27' proteiini, jossa mainittu solu on : * : hiivasolu.

29'. Kohdan 27' proteiini, jossa mainittu solu on .*, 3 0 nisäkässolu.

30'. Kohdan 27' proteiini, jossa mainittu solu on hyönteissolu.

31'. CSF-proteiini, josta puuttuu oleellisesti luontaista alkuperää oleva proteiini.

3 5 32'. Kohdan 31' CSF-proteiini, josta puuttuu oleellisesti ihmisalkuperää oleva proteiini.

» » » l I > » 57 108796 33'. CSF-proteiini, josta oleellisesti puuttuu glykosylaatio.

34'. CSF-proteiini, joka on glykosyloitu CSF-proteiinia koodaavan cDNA:n ekspressiolla transformoidussa 5 eukaryoottisessa solussa.

35'. Kohdan 34' proteiini, jossa mainittu euka-ryoottinen solu on nisäkässolu tai hyönteissolu.

36'. CSF-proteiini, joka on tehty ekspressoimalla cDNA:ta, jolla on kuviossa 1 esitetty nukleotidisekvenssi.

10 37'. Kohdan 36' proteiini, jossa mainittu solu on prokaryoottinen solu.

38'. Kohdan 35' proteiini, jossa mainittu solu on eukaryoottinen solu.

39'. Kohdan 38' proteiini, jossa mainittu solu on 15 hiivasolu.

40' Kohdan 38' proteiini, jossa mainittu solu on nisäkässolu.

41'. Kohdan 38' proteiini, jossa mainittu solu on I hyönteissolu.

20 42'. Ihmisen CSF-proteiini, jolla on oleellisesti kuviossa 1 esitetty aminohapposekvenssi tai sen alleeliva-riaatio.

43'. Kohdan 42' CSF-proteiini, jossa mainittu CSF

on CSF(Thr).

25 44'. Kohdan 42' CSF-proteiini, jossa mainittu CSF

V on CSF(Ile).

45'. Kohdan 42' CSF-proteiini, jossa mainittu CSF . on Met-CSF.

46'. Kohdan 42' CSF-proteiini, jossa mainittu CSF 30 on CSF:N ja Met-CSF:n seos.

47'. Gibbonin CSF, jolla on oleellisesti kuviossa 1 esitetty aminohapposekvenssi tai sen alleelivariaatio.

48'. Kohdan 47' CSF-proteiini, jossa mainittu CSF

1 > I · » onCSF(Thr).

i

35 49'. Kohdan 47' CSF-proteiini, jossa mainittu CSF

;·; on CSF (Ile) .

i 58 108796 50'. Kohdan 47' CSF-proteiini, jossa mainittu CSF on Met-CSF.

51'. Kohdan 47' CSF-proteiini, jossa mainittu CSF on CSF:n ja Met-CSF:n seos.

5 52 1 . Menetelmä CSF-proteiinin puhdistamiseksi ve sipitoiseen väliaineeseen suspendoidusta proteiiniseokses-ta, jolloin mainittu menetelmä käsittää vaiheet, joissa: proteiini saostetaan ammoniumsulfaatilla 80-%:isella kyllästyksellä pelletin muodostamiseksi, joka si-10 sältää CSF-proteiinia; pelletti suspendoidaan uudelleen puskuroituun liuokseen, jonka pH on noin 6-8; puskuroitu liuos, joka sisältää CSF:ää, viedään kromatografiakolonniin, eluoidaan CSF-aktiivisuus pusku-15 roidulla liuoksella, joka sisältää natriumkloridia, ja kerätään ne fraktiot, joissa on CSF-aktiivisuutta: ja yhdistetään aktiiviset fraktiot, pannaan yhdistetyt fraktiot C4-käänteisfaasikolonniin ja eluoidaan CSF-aktiivisuus 0 - 90 %:n asetonitriiligradientilla CSF- 20 aktiivisuutta sisältävien fraktioiden keräämiseksi.

53'. kohdan 52' menetelmä, jossa mainittu puskuri on tris(hydroksimetyyli)aminometaanihydrokloridi, N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N-2-etaani-sulfonihappo tai natriumsitraatti.

25 54'. Kohdan 52' menetelmä, jossa kromatografiako- » ': lonni täytetään oktyyli-Sepraharosella, dietyyliamino- : etyyli-Uitrogel:llä tai akryyliamidi-agaroosi-Ultrogel:llä.

| : ' 55'. Kohdan 52' menetelmä, jossa ennen yhdistet- ; tyjen fraktioiden panemista C4-kolonniin yhdistetyt frakti- : 30 ot käsitellään asetonitriiligradientilla trifluorietikka- happoliuoksessa tai vastaavasti heptafluorivoihappoliuok-sessa.

. 56'. Kohdan 52' menetelmä, jossa trifluorietikka- = * » * hapon tai heptafluorivoihapon konsentraatio eluointiliuok-35 sessa on 0,10 % tai vastaavasti 0,15 (v/v).

> » * I »

I t I

59 108796 57'. Kohdan 52' menetelmä, jossa CSF-proteiinia sisältävä vesipitoinen väliaine käsitellään ensin ammoniumsulfaatilla 30 %:n kyllästyksellä ja proteiinin ja supema-tantin saostamiseksi jäljellä olevia vaiheita varten.

5 58'. Kohdan 56' menetelmä, jossa pelletin muodos tamiseksi tehdyn proteiinin ammoniumsulfaattisaostusvaiheen jälkeen menetelmä käsittää seuraavaa: suspendoidaan pelletti uudelleen Tris-HCl-! liuokseen ja dialysoidaan jäljellä olevaa liosta; ! 10 pannaan dialysoitu liuos DEAE-Ultrogel-kolonniin; eluoidaan kolonnia Tris-HCl-liuoksella, joka sisältää vähintään 0,1 M NaCl:a, ja kerätään CSF-aktiivisuutta sisältävät fraktiot; yhdistetään aktiiviset fraktiot ja pannaan yhdis-15 tetyt fraktiot kolonniin, joka sisältää AcA44-Ultrogel:iä, joka on tasapainotettu HEPES-liuoksella, joka sisältää NaCl:a ja polyetyleeniglykolia; eluoidaan kolonni HEPES-liuoksella, jossa on NaCl:a ja polyetyleeniglykolia, ja kerätään CSF- 20 aktiivisuutta sisältävät fraktiot; yhdistetään CSF-aktiivisuutta sisältävät fraktiot ja käsitellään yhdistettyjä fraktioita trifluorietikkaha-polla; pannaan trifluorietikkahapolla käsitelty pooli 25 C4-käänteisfaasikolonniin, eluoidaan 0 - 90 %:n asetonit- .1 riiligradientilla trifluorietikkahappoliuoksessa ja kerä- ii(: tään CSF-aktiivisuutta sisältävät fraktiot; ; yhdistetään CSF-aktiivisuutta sisältävät frakti- ot, käsitellään yhdistettyjä fraktioita heptafluorivoiha-, ,·. 30 polla ja pannaan käsitelty liuos toiseen C4- käänteisfaasikolonniin; ja • f · eluoidaan toista C4-käänteisfaasikolonnia 0-90 , %:n asetonitriiligradientilla heptafluorivoihappoliuoksessa . 1 > i 1 niiden fraktioiden keräämiseksi, joilla on CSF-35 aktiivisuutta.

I t 1 ' 1 » 60 108796 59'. 52':n menetelmä, jossa sen vaiheen jälkeen, jossa saostetaan proteiini ammoniumsulfaatilla pelletin muodostamiseksi, menetelmä käsittää seuraavaa: suspendoidaan pelletti uudelleen natriumsitraat-5 tiliuokseen, joka sisältää NaCl:a, ja pannaan liuos kolonniin, joka sisältää akryyliamidi-agaroosi-Ultrogel:iä, joka on tasapainotettu samalla puskurilla; eluoidaan kolonni natriumsitraatti- ja NaCl-liuoksella ja kerätään fraktiot, joilla on CSF-aktiivisuutta; 10 yhdistetään fraktiot, joilla on CSF-aktiivisuutta, käsitellään trifluorietikkahapolla ja pannaan käsitelty liuos C4-käänteisfaasikolonniin; ja eluoidaan kolonni 0 - 90 %:n asetonitriiligradien-tilla trifluorietikkahappoliuoksessa niiden fraktioiden ke-15 räämiseksi, joilla on CSF-aktiivisuutta.

60'. Kohdan 52' menetelmä, jossa mainittu CSF puhdistetaan Mo-solun käsitellystä väliaineesta.

61'. Kohdan 52' menetelmä, jossa mainittu CSF puhdistetaan väliaineesta, joka saadaan viljelemällä soluja, 20 jotka on transfektoitu yhdistelmävektorilla, joka sisältää ilmennettävän CSF-geenin.

62'. Kohdan 52' menetelmä, jossa mainittu CSF puhdistetaan väliaineesta, joka saadaan viljelemällä COS-soluja, jotka on transfektoitu p91023(B)-CSF:llä.

25 63'. Menetelmä kädellisen pesäkettä stimuloiva te- kijä (CSF) -proteiinin tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää : tällaista proteiinia koodaavan geenin sijoittamisen sopivaan vektoriin, mainitun vektorin, joka sisältää mainitun geenin, transformoinnin eukaryoottisiin tai prokaryoottisiin isän-3 0 täsoluihin ja mainitun CSF-proteiinin ekspression ja eristämisen.

' 64'. Kohdan 63' mukainen menetelmä, jossa CSF- proteiini on ihmisen granulosyytti-makrofagi-CSF.

65'. Kohdan 63' mukainen menetelmä, jossa CSF-3 5 proteiinilla on aminohapposekvenssi, joka on esitetty CSF-Heille kuviossa 1.

< > t i * Λ1 1 08796 O 1 66'. Kohdan 63' mukainen menetelmä, jossa CSF-proteiini on gibboni-apinan granulosyytti-makrofagi-CSF.

671 . Kohdan 631 mukainen menetelmä, jossa CSF-proteiinilla on aminohapposekvenssi, joka on esitetty CSF-5 G:lie kuviossa 1.

68'. Kohdan 63' mukainen menetelmä, jossa CSF- proteiini on proteiini, joka vastaa aminohapposekvenssissä luonnollisesti esiintyvää CSF:ää, paitsi että yksi tai useampia aminohappoja on lisätty, substituoitu tai poistettu vai-10 kuttamalla oleellisesti luonnon CSF:n biologiseen aktiivisuuteen .

69'. Kohdan 68' mukainen menetelmä, jossa CSF- proteiini vastaa aminohapposekvenssissä luonnon CSF-proteiinia, paitsi että yksi tai useampia kysteiinitähteitä 15 on korvattu muiden aminohappojen tähteillä.

70'. Kohdan 69' mukainen menetelmä, jossa CSF- proteiinilla on luonnon CSF:n aminhapposekvenssi, paitsi että sitä edeltää metioniinitähde.

20 t 2

. I

2

Claims (27)

62 108796

1. Menetelmä kädellisen granulosyytin/makrofagin pesäkkeitä stimuloiva tekijä (GM-CSF) -proteiinin valmis-5 tamiseksi, jolloin (a) GM-CSF-proteiinilla on aminohappojärjestys, joka on esitetty CSF-Thr:lle kuviossa 1 nuolesta alkaen, tai (b) GM-CSF-proteiinilla on aminohappojärjestys, 10 joka on esitetty CSF-Ile:lle kuviossa 1 nuolesta alkaen, tai (c) GM-CSF-proteiinilla on aminohappojärjestys, joka on esitetty CSF-G:lle kuviossa 1 nuolesta alkaen, sekä sen toiminnallisen ekvivalentin valmistamiseksi, joka 15 aminohappojärjestykseltään vastaa luonnossa esiintyvää GM- CSF:ää, johon on lisätty, jossa on korvattu tai josta on poistettu yksi tai useampia aminohappoja oleellisesti vaikuttamatta luonnollisen GM-CSF:n biologiseen aktiivisuuteen mitattuna ihmisen luuydin -määritysmenetelmällä, 20 tunnettu siitä, että viljellään sopivia, vektorin sisältäviä eukaryoottisia tai prokaryoottisia isäntäsolu-ja, joka vektori on muodostettu sen sisältämän DNA-sek- , . venssin ilmentämiseksi, ja DNA-sekvenssi koodaa GM-CSF- * * · proteiinin aminohappojärjestystä, olosuhteissa, jotka mah- * * 25 dollistavat DNA-sekvenssin ilmentämisen, ja eristetään GM-CSF-proteiini.

·,,,· 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, * tunnettu siitä, että aminohappojärjestys koodatun : : proteiinin aminohappojärjestyksen lisäksi käsittää N-pääs- 30 sään kuviossa 1 esitetyn, nuolta edeltävän signaaliseksi venssin.

.··*. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että GM-CSF-proteiini on proteii-’ ni, joka aminohappojärjestykseltään vastaa luonnossa ’·*' 35 esiintyvää GM-CSF:ää, jolloin kuitenkin koodatussa tuot- i » * » * III, 1 t » » t 63 1 08796 teessä luonnollista aminohappojärjestystä edeltää metio-niini sen N-päässä.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi käsittää ku- 5 viossa 1 CSF-Thr:lle, CSF-Ile:lle tai CSF-G:lle esitetyn sekvenssin, joka alkaa nuolen jälkeen ja loppuu aminohappoa 127 vastaavaan kodoniin.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saatu GM-CSF-proteiini on

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saatu GM-CSF-proteiini on

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saatu GM-CSF-proteiini on CSF-Thr tai sen toiminnallinen ekvivalentti, jossa yksi, kaksi, kolme, neljä tai viisi aminohappoa on korvattu toi- 20 silla aminohapoilla.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saatu GM-CSF-proteiini on CSF-Thr.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että isäntäsolu on Escherichia : coli -solu.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, ,·. tunnettu siitä, että isäntäsolu on hiivasolu.

10 CSF-lle tai sen toiminnallinen ekvivalentti, jossa yksi, kaksi, kolme, neljä tai viisi aminohappoa on korvattu toisilla aminohapoilla.

11. Vektori, tunnettu siitä, että se kä-30 sittää geenin, joka koodaa kädellisen GM-CSF proteiinia, jolla on kuviossa 1 nuolen jälkeen CSF-Thr:lie, CSF- lle: lie tai CSF-G:lle esitetty aminohapposekvenssi, tai > sen funktionaalista ekvivalenttia, johon on lisätty, jossa V · on korvattu tai josta on poistettu yksi tai useampia ami- ; 35 nohappoja oleellisesti vaikuttamatta luonnollisen GM-CSF:n 64 1 0 8 7 9 6 biologiseen aktiivisuuteen mitattuna ihmisen luuydin -määritysmenetelmällä .

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen vektori, tunnettu siitä, että geeni koodaa proteiinia, jol- 5 la on kuviossa 1 nuolen jälkeen CSF-Thr:lle tai CSF- Ilerlle esitetty aminohapposekvenssi, tai sen funktionaalista ekvivalenttia, kuten vaatimuksessa 11 on määritelty.

13. Patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen vektori, tunnettu siitä, että kädellisen GM-CSF:n funktio- 10 naalisella ekvivalentilla puhdistettuna on aktiivisuus, joka on vähintään 1 x 107 yksikköä/mg proteiinia luuydin määritysmenetelmällä määritettynä.

14. Patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen vektori, tunnettu siitä, että geeni koodaa proteiinia, 15 jolla on kuviossa 1 nuolen jälkeen CSF-Thr:lle esitetty aminohapposekvenssi.

15. Patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen vektori, tunnettu siitä, että geeni koodaa proteiinia, jolla on kuviossa 1 nuolen jälkeen CSF-Ile:lle esitetty ami- 20 nohapposekvenssi.

15 CSF-lle.

16. Patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen vektori, tunnettu siitä, että geeni koodaa proteiinia, jolla on kuviossa 1 nuolen jälkeen CSF-G:lle esitetty aminohapposekvenssi . : 25

17. Patenttivaatimuksen 14, 15 tai 16 mukainen vek- : tori, tunnettu siitä, että geenin koodaaman pro teiinin aminohappojärjestys lisäksi käsittää N-päässään kuviossa 1 esitetyn, nuolta edeltävän signaalisekvenssin.

18. Patenttivaatimuksen 14, 15 tai 16 mukainen vek- 30 tori, tunnettu siitä, että geenin koodaaman pro teiinin aminohappojärjestys lisäksi käsittää N-päässään metioniinin.

19. Patenttivaatimuksen 11 mukainen vektori, ' tunnettu siitä, että geeni käsittää kuviossa 1

35 CSF-Thr:lle tai CSF-Ile:lle esitetyn sekvenssin, joka ai- 65 108796 kaa nuolen jälkeen ja loppuu aminohappoa 127 vastaavaan kodoniin.

20. Patenttivaatimuksen 11 mukainen vektori, tunnettu siitä, että geeni on tunnuksella ATCC 5 39754 talletetun plasmidin p91023B-CSF koodaava DNA.

21. Plasmidi p91023B-CSF, ATCC 39754.

22. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on bakteeri-, hiiva- tai nisäkässolu, joka on transformoitu jonkin patenttivaatimuksen 11-21 mukaisella vektorilla.

23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu jonkin patenttivaatimuksen 12 - 15 tai 19 - 21 mukaisella vektorilla.

24. Patenttivaatimuksen 22 mukainen isäntäsolu, 15 tunnettu siitä, että se on E. coli.

25. Patenttivaatimuksen 22 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on kiinanhamsterin munasarjan solu.

26. cDNA, tunnettu siitä, että se vastaa 20 jossakin patenttivaatimuksista 1-10 esitettyä sekvenssiä.

27. cDNA tunnettu siitä, että se vastaa , . jossakin patenxtivaatimuksista 11 - 16 esitettyä geeniä. I i « » I t » • I * i * f * · t I t * * » t * t f • ( • ! » * * k • * I I t t · « I t t t I t t t » » > Mt!» 66 1 08796