JP3145968B2 - 生物学的に活性なｐｄｇｆ類似因子の真核生物細胞内での発現 - Google Patents
生物学的に活性なｐｄｇｆ類似因子の真核生物細胞内での発現Info
- Publication number
- JP3145968B2 JP3145968B2 JP28366397A JP28366397A JP3145968B2 JP 3145968 B2 JP3145968 B2 JP 3145968B2 JP 28366397 A JP28366397 A JP 28366397A JP 28366397 A JP28366397 A JP 28366397A JP 3145968 B2 JP3145968 B2 JP 3145968B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pdgf
- gene
- yeast
- sis
- chain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/49—Platelet-derived growth factor [PDGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/11011—Alpharetrovirus, e.g. avian leucosis virus
- C12N2740/11022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/12—Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/22—Viral peptide or viral protein
- Y10S930/221—Retrovirus related, or human immunodeficiency virus related, or simian immunodeficiency virus related
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は一般的にはＰＤＧＦ類似
因子の産生に関するものであり、更に詳細には真核生物
における生物学的に活性なＰＤＧＦ類似因子の発現に関
する。 【０００２】 【従来の技術】ヒトのＰＤＧＦ即ち血小板誘導生長因子
(platelet derived growth factor)は間葉誘導細胞に
ついて血清中の主要な有糸分裂促進因子タンパク質 (mi
togenic protein)であることが証明された。この事実は
平滑筋細胞、線維芽細胞及び神経膠細胞の培養物中での
細胞増殖又はＤＮＡ合成（細胞分裂の前提条件）を誘導
する血小板抽出物又は純化されたＰＤＧＦに関する数多
の研究報告に記載されている〔ロス (Ross) 等、PNAS,
71, 1207, 1974; コーラー及びリプトン (Kohlerand Li
pton), Exp. Cell Res., 87, 297, 1974; ウェスタマ
ーク及びウェストソン (Westermark and Westeson), Ex
p. Cell Res., 98, 170; 1976); ヘルジン(Heldin)等、
J. Cell Physiol., 105, 235, 1980);レーヌ及びロス
(Raines andRoss), J. Biol. Chem., 257, 5154, 198
2)〕。更にＰＤＧＦはマイトジェン (mitogen)として細
胞に応答する有効な化学的誘引物質である〔グロテンド
ルスト(Grotendorst)等，J. Cell Physiol., 113, 261,
1982; セパ (Seppa)等、J. Cell Biol., 92, 584, 19
82 〕。この場合はマイトジェンが走化性物質としても
作用する場合と一般的に異なる。ＰＤＧＦの有糸分裂促
進活性にもとづきＰＤＧＦは培養中の哺乳動物細胞の生
育のための限定された培地の重要成分として有用であ
り、動物細胞生物学の研究に多用される価値ある研究用
試薬となっている。 【０００３】生体内においてＰＤＧＦは血小板のアルフ
ァ顆粒内に貯えられる循環物質であることが普通であ
る。動脈内皮の裏面が損傷されると露出された結合組織
への血小板の付着が起ってその顆粒群が放出される。放
出されたＰＤＧＦは線維芽細胞と平滑筋細胞とを傷害個
所へ走化的に誘引し、創傷回復過程の一環として創傷部
における細胞増殖を誘導すると考えられる〔ロス及びグ
ロムセット (Ross and Gromset), N. England Journal
of Medicine, 295, 369, 1976 〕。創傷に対する上記の
応答の一部分としてＰＤＧＦは血小板から放出されてア
テローム性動脈硬化症の進行域の拡大の原因をなす〔ロ
ス及びグロムセット、前掲報文〕ことが推定されている
が該アテローム性動脈硬化症は心筋梗塞及び大脳梗塞の
主原因のひとつである。アテローム形成の予防と治療と
のための方策は過去において該病気の危険要因の減少
化、例えば高血圧症の患者における血圧低下及び高コレ
ステロール血症の患者におけるコレステロールの高値の
低下の方向に集中させることにあった。 【０００４】近時の諸研究の結果ＰＤＧＦ及びシミアン
腫瘍ウィルス (simian sarcoma virus (SSV)〕即ち急性
の形質転換レトロウィルス、の推測された形質転換タン
パク質を包含する二種のタンパク質鎖のひとつが同じか
又は近縁の細胞遺伝子 (cellular genes) から生成され
たらしいことが示された。特にＰＤＧＦの部分的アミノ
酸配列のコンピューターによる分析によりＳＳＶの遺伝
子にもとづく産生物 (gene product) 、即ちｐ２
８sis 、との著しい相同が明かにされた〔ドリトル、ウ
ォターフィルド及びジョンソン (Doolittle, Waterfiel
d and Johnson)、前掲報文〕。更に最近の研究の結果ｐ
２８sis 及びＰＤＧＦは抗原性及び構造的類似性を示す
ことが例証された〔ロビンス (Robbins)等、Nature，３
０５，６０５，１９８３；ニマン (Niman), Nature，３
０７，１８０，１９８４）。 【０００５】既往の研究企画、例えばデバル (Devare)
等 (Cell, ３６，４３，１９８４）が総括した企画によ
り形質転換微生物体の中でｖ−sis 遺伝子が発現された
けれどもデバル等はマイトジェン物質産生に成功するに
至らなかった。最近或る研究者等はＥ．コリ（Ｅ．col
i）中でｐ２８sis が融合タンパク質として産生される
ことを記載した〔ワング (Wang) 等、J. Biol. Chem.,
２５９，１０６４５，１９８４〕。該タンパク質はＰＤ
ＧＦ受容個所 (receptor sites) への結合についてＰＤ
ＧＦと比肩するようにみえる。ＳＳＶで形質転換された
ネズミの細胞はＰＤＧＦに類似のマイトジェン活性を示
すことが証明された〔デュエル (Deuel)等，Science,２
２１，１３４８，１９８３；オーエン (Owen) 等、Scie
nce,２２５，５４，１９８４〕けれども該活性がＳＳＶ
（即ちｐ２８sis ）から産生された遺伝子によるのか否
か明かでない。更にＳＳＶ以外の各種のウィルスにより
形質転換された細胞は培地中へＰＤＧＦ様のマイトジェ
ンを産生する〔ボウエン−ポープ (Bowen-Pope) 等，Ｐ
ＮＡＳ，８１，２３９６，１９８４〕。 【０００６】天然源のＰＤＧＦは出発原料としてのヒト
の血漿又は血小板から単離され得るけれども出発原料の
入手が局限されていることにも部分的原因があるので複
雑で高費用を要する工程となる。更に他の血清成分から
高収率でＰＤＧＦを純化することは困難であるがそれは
量的に著しく少ないことと生化学的諸性質とにもとづく
のである。しかもヒトの血液から導かれた製品の治療上
の使用は例えば肝炎ウィルス、サイトメガロウィルス又
は後天性免疫不全症候群（Aquired Immune Deficiency
Syndrome（ＡＩＤＳ）の原因物質による汚染にもとづく
病気の伝播の危険を伴う。傷害の治療のために線維芽細
胞及び平滑筋細胞の増殖を要するが該傷害の治療の際の
ＰＤＧＦの臨床的応用性にかんがみ及び哺乳動物細胞の
培養のための規定された培地中の重要成分としてのＰＤ
ＧＦの価値にかんがみ、マイトジェン活性をもつ真正の
ＰＤＧＦに類似するタンパク質分子の有用量の製造は明
かに極めて貴重である。 【０００７】加うるに比較的大量のＰＤＧＦの製造能力
は新形成過程におけるｖ−sis タンパク質、即ちｐ２８
sis 、の推定上の役割を明かにするための有用な手段で
ある。更に動脈壁のインタマル層（intamal layer)内の
平滑筋細胞群の局所的集積はアテローム性動脈硬化域の
拡大に対する中心的要因である〔ロス及びグロムセッ
ト、前掲報文〕。従ってアテローム性動脈硬化症の予防
及び治療の一方策は平滑筋細胞の増殖の抑制にある。Ｐ
ＤＧＦの大量生産能はアテローム性動脈硬化症患者にお
けるＰＤＧＦの生体内活性の阻止又は妨害に対する阻止
剤の開発のために、又は特異的アプローチの計画のため
に有用である。 【０００８】 【発明の開示】簡言すると本発明は真核生物細胞内で生
物学的に活性なＰＤＧＦ類似因子の発現及び分泌を指令
し得るＤＮＡ構成体を開示する。該ＤＮＡ構成体は転写
促進因子（転写プロモーター）を含有しており、該プロ
モーターはその下流に“ＰＤＧＦと実質上同じ構造及び
（又は）ＰＤＧＦと同様の有糸分裂促進活性を有するタ
ンパク質と、真核生物細胞からの該タンパク質の分泌を
指令し得る信号配列をコードする遺伝子”を伴う。該遺
伝子は生物学的活性をもつタンパク質をコードするｖ−
sis 遺伝子であるか又は“シミアン腫瘍ウィルスのｖ−
sis 遺伝子の誘導体或はその部分的誘導体”である。更
にｖ−sis 遺伝子の誘導体はＰＤＧＦのＢ鎖と実質上相
同であるｖ−sis 遺伝子の一部分であり得る。加うるに
該遺伝子は生物学的活性をもつタンパク質をコードする
ＰＤＧＦに対するヒトのｃＤＮＡ遺伝子又はその部分的
遺伝子であり得る。 【０００９】本発明の他の態様として真核生物細胞中に
生物学的活性ＰＤＧＦ類似因子の発現及び分泌を指令し
得るＤＮＡ構成体を真核生物宿主の中へ導入することに
より生物学的活性ＰＤＧＦ類似因子を製造する方法を開
示する。該ＤＮＡ構成体は転写プロモーターを含有して
おり、該プロモーターはその下流に“ＰＤＧＦと実質上
同じ構造及び（又は）ＰＤＧＦと同様のマイトジェン活
性を有するタンパク質と、真核生物細胞からの該タンパ
ク質の分泌を指令し得る信号配列をコードする遺伝子”
を伴う。真核生物宿主の中へＤＮＡ構成体を導入した後
に本発明の方法は該真核生物宿主を適切な培地中で生育
させて該真核生物宿主から遺伝子にもとづくタンパク質
製品を単離する。本発明は又かようなＤＮＡ構成体を有
する形質転換された真核細胞宿主をも開示する。 【００１０】本発明は更に真核生物細胞中へ生物学的活
性ＰＤＧＦ類似因子の発現及び分泌を指令し得るＤＮＡ
構成体で形質転換された真核生物細胞によって発現され
た生物学的活性ＰＤＧＦ類似因子を有する細胞群を恒温
培養することによる哺乳動物細胞群の生長促進方法を提
供する。該ＤＮＡ構成体は転写プロモーターを含有して
おり、該プロモーターはその下流に“ＰＤＧＦと実質上
同じ構造及び（又は）ＰＤＧＦと同様の有糸分裂促進活
性を有するタンパク質と、真核生物細胞からの該タンパ
ク質の分泌を指令し得る信号配列をコードする遺伝子”
を伴う。本発明の一具体例において真核生物細胞は酵母
細胞であってよく、ＤＮＡ構成体は染色体外の要素であ
ると言う方が適切である。本発明の他の特徴的態様は下
文及び添付図面を参照して明かとなろう。 【００１１】 【発明の実施のための最良の形態】本発明の説明に先立
ち本明細書中の用語の定義について述べることが理解の
助けとなるであろう。ポリペプチド ： これはアミノ酸のポリマーである。解読枠 (Reading Frame) ： これはアミノ酸の非中断延
長 (uninterrupted stretch)をコードするヌクレオチド
コドン配置である。 mＲＮＡの翻訳に際し正常な解読枠
( リーディングフレイム) が維持されねばならない。例
えば配列ＧＣＵＧＧＵＵＧＵＡＡＧはＧから始めるか、
Ｃから始めるか又はＵから始めるかに依存して３種のリ
ーディングフレイム又は相 (phases) へ翻訳され得るの
で３種の異なるペプチド製品を生成する。テンプレート
(template) の翻訳はＡＵＧコドンにおいて始まり、特
定のアミノ酸に対するコドンについて継続し、翻訳終了
コドン（複数）のうちのひとつにおいて終止する。 【００１２】コード配列： これはＤＮＡ配列であっ
て、適当なリーディングフレイムの中にあり、タンパク
質のアミノ酸群を直接コードする。相補的ＤＮＡ ：又はｃＤＮＡと記される。これは mＲＮ
Ａテンプレート中に存在する配列から酵素化学的に合成
されたＤＮＡ分子又はＤＮＡ配列である。分泌信号配列 ： これは信号ペプチド (signal peptid
e) をコードする遺伝子の部分である。信号ペプチドは
分泌タンパク質内のアミノ酸配列であって細胞の分泌経
路の中へその転置を信号する。信号ペプチドは一般にタ
ンパク質の開始点( アミノ末端) に存在していて２０〜
４０個のアミノ酸の鎖長をもちその中央部に９〜１０個
の疎水性アミノ酸の伸長鎖を有する。しばしば信号ペプ
チドは分泌過程においてタンパク質からタンパク分解反
応によって開裂される。 【００１３】細胞表面受容体： これは細胞表面におけ
るタンパク質分子であって細胞表面に接近する分子と特
異的に相互反応、即ち結合する。該受容体が同系の分子
と結合すると細胞の生理に特異的変化を与える。マイトジェン ： これは細胞に有糸分裂を起こさせるよ
うに刺激する分子である。有糸分裂は無性的体細胞分裂
であって２個の娘細胞を与え、各娘細胞は親細胞と同じ
数の染色体を有する。形質転換 ： これは純化ＤＮＡの導入により受容細胞又
は受容微生物の遺伝子型を安定に相続可能に変化させる
過程である。これは受容微生物の表現型の変化にもとづ
きその典型的検出が可能である。転写 ： これは mＲＮＡテンプレートを構造遺伝子から
産生させる過程である。 【００１４】発現： これは構造遺伝子を用いて開始さ
せてポリペプチドを製造する過程であり、転写と翻訳と
の組合せの過程である。発現ベクターはベクター上に存
在する遺伝子の発現を可能にするように設計された構造
からみちびかれたプラスミドである。プラスミド ： これは完全な“レプリコン (replicon)
”を含有する染色体外の２本鎖ＤＮＡ配列であって該
プラスミドは宿主細胞の中で複製される。プラスミドが
単細胞 (unicellular)の微生物体内に置かれるとこの微
生物の特性はプラスミドのＤＮＡ配列の発現の結果とし
て変化する。即ち形質転換される。例えばテトラサイク
リン耐性 ( tetR ）に対応する遺伝子をもつプラスミド
は形質転換前にテトラサイクリン感受性であった細胞を
テトラサイクリン耐性へ形質転換させる。 【００１５】酵母プロモーター： これは転写を促進す
る酵母の遺伝子から上流に向うＤＮＡ配列である。生物学的活性 ： これは生物学的関係にある（即ち微生
物体内又は試験管内での複写における）分子によって与
えられた活性の或る官能又は或る一組（セット）の活性
である。ＰＤＧＦの場合には該生物学的活性は細胞表面
受容分子への結合、応答型細胞の走化性の導入又は有糸
分裂性の導入を包含する。既述の通りヒトの血小板から
導かれた生長因子（ＰＤＧＦ）は血清中の主要な有糸分
裂促進因子タンパク質であることが証明されている。Ｐ
ＤＧＦは２種のポリペプチド鎖、即ちＡ鎖及びＢ鎖から
成ることが既知であってこれらは二硫化結合によって相
互に保持されて生物学的活性分子を形成している。該Ａ
鎖及びＢ鎖の夫々単独は有糸分裂能を発揮しないらしい
（レーヌ及びロス、前掲報文）。そして還元型ポリペプ
チドの再酸化による活性再構成の試みは未だ成功してい
ない。最近Ｂ鎖のアミノ酸配列はｖ−sis 遺伝子産生物
の一部分、即ちｐ２８sis 、と実質的に相同であること
が示された（ドリトル等，Science, 221, 275, 1983;ウ
ォターフィルド等、Nature，304, 35, 1984;及びジョン
ソン等、Embo, 3, 921, 1984) 。これらの２種タンパク
質の相同性はそれらが同じか又は近縁の細胞遺伝子から
みちびかれたものであることを強く示唆する。 【００１６】生物学的活性のＰＤＧＦはＡ鎖及びＢ鎖の
等モル量を含むことが既知であること、及びＥ．コリ中
のｖ−sis 配列を発現させようとした既往の試みは有糸
分裂促進物質を産生しなかったことを考え合せるならば
微生物体中でＰＤＧＦ遺伝子の部分に相同なｖ−sis 遺
伝子の部分を単に発現させても有糸分裂促進活性を呈す
る分子を与えるに至ることは期待されないであろう。し
かしながら本発明は該上記の既往の企画とは対照的に、
発現された分子群がＰＤＧＦのＢ鎖に一そう近縁である
ように、非相同的配列を有しないｖ−sis 遺伝子又はそ
の部分的遺伝子の発現を企図したのである。更に本発明
の発現系は真核生物の分泌経路を経て遺伝子にもとづく
製品を産生させるように企図したのである。かように企
図したことによって発現されたタンパク質分子群は生物
学的活性を呈するように正常に処置され集積され得る。
事実、本発明は、従来技術における努力とは対照的に、
生物学的活性を有するＰＤＧＦ類似因子の分泌をもたら
したのである。 【００１７】ＰＤＧＦは活性型である場合においては熱
安定性タンパク質であって２８０００〜３１０００ダル
トンの不均一のサイズをもつスペシイズ (heterogenous
ly sized species) から構成され、夫々のスペシイズの
すべてがＤＮＡ合成を刺激する活性をもつ〔レーヌ及び
ロス、前掲報文；デュエル等、J. Biol. Chem., 256,88
96, 1981; アトニアデス (Antoniades),ＰＮＡＳ，78,
7314, 1981〕。分子量２７０００；２８５００；２９
０００及び３１０００ダルトンを有する各スペシイズが
単離され試験されたがその場合に該スペシイズは比較さ
れ得る有糸分裂促進活性及びアミノ酸組成を有すること
が見出された（レーヌ及びロス、前掲報文）。更に該ス
ペシイズは広汎なトリプティックペプチド相同性を示し
た。該スペシイズにおける僅かな寸法変化は炭水化物組
成及びタンパク分解における差異に主としてもとづくも
のである。 【００１８】ＰＤＧＦの研究の際に該ＰＤＧＦは血小板
に富むヒトの血漿から充分に純化されたが、ＰＤＧＦは
２種のポリペプチド鎖即ちＡ鎖（１４０００ダルトン）
及びＢ鎖（１６０００ダルトン）から成り、これらは相
互にジスルフィド結合して生物学的活性二量体分子を形
成することは既述した通りである（レーヌ及びロス、デ
ュエル等、アントニアデス、前掲報文）。文献記載のＰ
ＤＧＦという名称は確定されていない（ドリトル等、ウ
ォターフィルド等、レーヌ及びロス、ジョンソン等、前
掲報文）。ジョンソン等（前掲報文）の命名法が採用さ
れたが該純粋のＰＤＧＦ中に見出された２種のペプチド
を“Ａ鎖”及び“Ｂ鎖”と呼んだ。Ｂ鎖はｐ２８sis と
相同であって以前は“ペプチドＩ”と呼ばれ〔ウォター
フィルド等、前掲報文〕又は“１ａ”と呼ばれた〔ドリ
トル等、前掲報文〕。Ａ鎖は以前は“ペプチド II ”
〔ウォターフィルド等、前掲報文〕又は“２ａ”〔ドリ
トル等、前掲報文〕と呼ばれた。ＰＤＧＦの部分的アミ
ノ酸配列からみちびかれたデータは該２種のポリペプチ
ド鎖（Ａ鎖及びＢ鎖）が或る相同性を呈することを示し
ている〔ドリトル等、前掲報文；ウォターフィルド等、
前掲報文；ジョンソン等、前掲報文；アントニアデス及
びハンカピラ (Hunkapiller), Science, 220,963, 1983
〕。Ａ鎖及びＢ鎖の夫々単独は有糸分裂促進活性を現
わさないらしく還元型ポリペプチドの再酸化による活性
再構成の企画は成功しなかった〔レーヌ及びロス、前掲
報文〕。 【００１９】既述の通りｖ−sis 遺伝子はシミアン腫瘍
ウイルス（ＳＳＶ）の形質転換された遺伝子である。該
ｖ−sis 遺伝子がクローン化されそのＤＮＡ配列が決定
された〔デバル等、ＰＮＡＳ，79, 3179, 1982；デバル
等, ＰＮＡＳ，80, 731, 1983 〕。この配列を分析した
結果、ｐ２８sis と呼ばれる２８０００ダルトンのタン
パク質をコードし得る開放読解枠 (open reading fram
e) が解明された。次に、このタンパク質はＳＳＶ感染
細胞の中に存在することが同定された〔ニマン、前掲報
文；ロビンス、前掲報文〕。ｖ−sis 遺伝子産生物、ｐ
２８sis 、の予測されたアミノ酸配列はＰＤＧＦのＢ鎖
の部分の真正のアミノ酸配列と高度に相同性であること
が見出された〔ジョンソン、前掲報文〕。ＰＤＧＦのＢ
鎖とｖ−sis 遺伝子産生物との相同はｐ２８sis のアミ
ノ酸６７、即ちセリン、において開始されアミノ酸１７
５におけるスレオニン残基に至るまでおよそ１０９個の
アミノ酸に対応して継続する。ｐ２８sis のＢ鎖相同域
に先行し及び後続するアミノ酸配列は完全 (mature) な
ＰＤＧＦのＡ鎖及びＢ鎖のいずれにも相同でない〔ジョ
ンソン等、前掲報文〕。更にＰＤＧＦ及びｐ２８sis は
類似の抗原性のものであることが証明された〔ニマン、
前掲報文；ロビンス、前掲報文〕。ｖ−sis 遺伝子産生
物、ｐ２８sis 、は約２２５個のアミノ酸をもつタンパ
ク質であってＳＳＶ感染細胞中でタンパク分解によって
処理されると約２００００ダルトンのタンパク質（ｐ２
０sis ）を与える〔ニマン、前掲報文；ロビンス、前掲
報文〕。該２００００ダルトンタンパク質はＰＤＧＦに
対する抗血清を用いて免疫学的に沈降し得る。 【００２０】上記の通り原核生物にｖ−sis 配列を発現
させる既往の企画は生物学的活性物質を産生させなかっ
た。更にｖ−sis 遺伝子製品ｐ２８sis 並びにＰＤＧＦ
それ自体は分泌された哺乳動物のタンパク質である。生
物学的活性物質の製造の達成のために本発明はｖ−sis
遺伝子及びｖ−sis 遺伝子誘導体の発現のための真核生
物細胞の分泌径路を利用する。真核生物細胞からのｖ−
sis 遺伝子製品の発現及び分泌は本来の活性ある構造を
もつ分子群を与える処理及び構成を可能とする。大部分
の真核生物の分泌径路は相似であると信ぜられる。特に
哺乳動物細胞と酵母細胞とはその分泌径路が良好に特性
化されて相同である。発現されたポリペプチド上の分泌
信号配列の存在は真核生物における重要な要素であるが
それは分子を分泌径路へ導入し、それによって正常な構
成及び処理へみちびく役目を果たすからである。適切な
転写プロモーターと分泌信号配列とを利用する条件の下
であれば一般にいかなる真核生物もｖ−sis 遺伝子産生
物を生物学的活性形において発現し分泌することができ
る。 【００２１】取扱容易で良好に特性化される真核生物は
酵母細胞である。これらの理由により本発明における適
切な真核生物細胞のモデルの一例として酵母を選択し
た。従ってＰＤＧＦのＢ鎖に相同な１０９アミノ酸をコ
ードするｖ−sis 遺伝子及びそのフラグメント（断片）
を生物学的活性のＰＤＧＦ類似因子の発現を指令し得る
酵母プロモーターを含有する酵母の染色体外要素の中へ
挿入した。本発明に従い酵母プロモーターはその下流に
実質上ＰＤＧＦと同じ構造及び（又は）同じ有糸分裂促
進活性を有するタンパク質をコードするｖ−sis のフラ
グメントを伴う。ＰＤＧＦと実質上同じ構造及び（又
は）実質上同じ有糸分裂促進活性を有するタンパク質を
コードする遺伝子はシミアン腫瘍ウイルス（ＳＳＶ）の
ｖ−sis 遺伝子又はｖ−sis 遺伝子の誘導体又はそれら
の部分的遺伝子を包含するか又はＰＤＧＦに対応するヒ
トのｃＤＮＡ遺伝子又はその部分的遺伝子を包含する。
詳細にはＰＤＧＦのＢ鎖に実質上相同なポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列が好適である。染色体外要素の中
で使用される遺伝子は標準的な組換えＤＮＡ技法を用い
て単離され得る。 【００２２】ヒトのＰＤＧＦのｃＤＮＡ遺伝子はハイブ
リダイゼーションプローブ (hybridization probe)とし
てｖ−sis 遺伝子又はそのフラグメントを用いることに
よりメッセンジャーＲＮＡの適切な給源からつくられた
ヒトｃＤＮＡライブラリイから取り出され得る。 mＲＮ
Ａの好適給源はヒトの臍帯静脈内皮細胞である。これら
の細胞群は短時間だけインビトロで培養し得られ、培地
中へＰＤＧＦを分泌することが公知である〔ジコルレト
(DiCorleto)及びボウエン−ポープ、ＰＮＡＳ, ８０，
１９１９，１９８３〕。該ＰＤＧＦをコードする遺伝子
としてのｃＤＮＡ遺伝子の同定はＤＮＡ配列法によって
遂行され得る。酵母中において使用され得るプロモータ
ーは酵母アルファ因子（ＭＦα１）プロモーター及び酵
母トリオースホスフエートイソメラーゼ（ＴＰＩ）プロ
モーターを包含する。他の酵母遺伝子、例えばアルコー
ルデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ１）、アルコールデヒド
ロゲナーゼ２（ＡＤＨ２）からも又プロモーターを得る
ことができる。 【００２３】本明細書における構成は次の通りである。
即ちｖ−sis 遺伝子産生物を酵母細胞から培地の中へ分
泌させる。このことは酵母の交配フエロモンアルファ因
子（yeast mating pheromone alpha-factor)の分泌信号
配列の使用によって達成される〔クルジャン及びヘルス
コビツ (Kurjan and Herskowitz), Cell, 30, 933, 198
2,ユリウス (Julius) 等、Cell, 36, 309, 1984;及びブ
レイク (Brake)等、ＰＮＡＳ, 81, 4642, 1984〕けれど
も他の分泌信号を使用してもよい。 mＲＮＡの効果的な
転写の終了及びポリアデニル化を確実化するために酵母
のターミネーター配列、例えばトリオースホスフェート
イソメラーゼターミネーターを添加した〔アルベル及び
カワサキ (Alber and Kawasaki), J. Molec. Genet. Ap
pl. 1, 419, 1982〕。 【００２４】本発明の目的である遺伝子を有する適切な
ＤＮＡフラグメントが同定されたならば、それを適切な
プロモーター及び分泌信号配列に結合させる。ＤＮＡフ
ラグメントの結合方法は充分に記述されていて〔マニア
チス (Maniatis) 等、Molecular Cloning, A Laborator
y Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 〕当
業界の技術者によって良好に遂行される。ｖ−sis 発現
構造体の製造の後に該構成体を酵母の発現ベクターの中
へ挿入する。複製のオリジン（源）及び選択され得るマ
ーカー（目印）を有する複製用プラスミドＹＥｐ１３、
即ちＬＥＵ２遺伝子、を初期発現構成体として使用し
た。選択マーカーＬＥＵ２は酵母細胞内でロイシン合成
能を欠失しているのでロイシン不添加生育培地上での生
育能によりＬＥＵ２プラスミド含有細胞の陽性選択を可
能とする。これらの構成体は或る程度の有糸分裂促進活
性を有する産生物の発現を指令するけれども培養物にお
いてより多い有糸分裂促進活性を生ずるために宿主細胞
内で増加された安定性を保つ発現ベクターを使用するこ
とが好ましい。 【００２５】この点において適切な酵母の発現ベクター
はプラスミドｐＣＰＯＴ及びｐＭＰＯＴ２であり、これ
らは解糖酵素トリオースホスフエートイソメラーゼをコ
ードするシゾサッカロミセスポムベ遺伝子 (Schizosacc
haromyces pombe gene) （ＰＯＴ１遺伝子）を包含す
る。ＰＯＴ１遺伝子を包含することはこの宿主細胞の中
に存在する対応遺伝子欠失を補足する能力にもとづき適
切な宿主細胞の中のプラスミドの安定保持を確実にす
る。更にＭＦα１プロモーターをサツカロミセスセレビ
ジエＴＰＩプロモーターによって代替するがこれは転写
と発現とを更に増加させるためである。ＴＰＩプロモー
ター、アルファ因子分泌信号配列、ＰＤＧＦに対応する
ｖ−sis 遺伝子又はヒトのｃＤＮＡ遺伝子の適切なセグ
メント、及び適切なベクターの中のＴＰＩターミネータ
ーを導入したＤＮＡ構成体が調製された後に該ＤＮＡ構
成体をＴＰＩを欠失した酵母宿主の中へ形質転換させ
る。酵母を形質転換させる操作は文献によって周知であ
る。 【００２６】形質転換した酵母細胞は、ｐＣＰＯＴベク
ター使用の場合に、グルコース含有の常用の複合培地上
での生育によって選択され得る。慣用の培地例えばＹＥ
ＰＤ（グルコース２０ｇ、バクト−ペプトン２０ｇ、酵
母抽出物１０ｇを１リットル中に含有する）を使用して
よい。選択されるとｖ−sis 発現構造体を含む形質転換
体を慣用の複合培地上で静止期まで生育させ、細胞群を
分離し、培地を濃縮する。真正のヒトのＰＤＧＦは高度
にカチオン性で疎水性のタンパク質である〔レーヌ及び
ロス、前掲報文；アントニアデス、前掲報文；デユエル
等、１９８１、前掲報文〕ことに注意を払い、想定上の
酵母産生物は類似の特性を有することが期待され、それ
を疏水性クロマトグラフィマトリクス例えばＣ８−セフ
アロース〔フアルマシアフアインケミカルスＡＢ(Pharm
acia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden)〕上で濃縮
した。 【００２７】多数種の試験法を使用した結果ｖ−sis 誘
導体を発現した酵母培養からの生育培地は真正のヒトの
ＰＤＧＦと同一の生物学的活性を有することが判明し
た。酵母以外の真核生物細胞の中の生物学的活性のｖ−
sis 誘導体の発現は適切な発現／規制信号の使用の下で
当業界の技術者によって達成され得る。ｖ−sis 配列の
発現を指令し得る転写プロモーターは特定の真核生物細
胞型の中における効率的及び（又は）規制的な発現を与
える能力に対応して選択される。細胞の分泌過程の中へ
ｖ−sis 遺伝子産生物を指令し得る信号配列は適切な細
胞型の中での作用に対応して選択される。他の有用な規
制信号、例えば転写終了信号、ポリアデニル信号及び転
写増強用配列は適切な細胞型の中でのそれらの作用に対
応して又選択され、その選択は当業技術者にとって明ら
かである。 【００２８】細胞培養技法は培養物中で生育する哺乳動
物細胞の多数及び多種におけるように過去数年の間にか
なりの進歩を遂げた。該進歩の中核は栄養要求量（即ち
ホルモン類及び生育因子類）に関する充分な理解である
〔バーネス及びサトウ (Barnes and Sato), Cell, 22,
649, 1980 〕。培養物中で生育し得る細胞の型はおおま
かに２群に分けられる。即ち正常型と形質転換型とであ
る。いわゆる“正常”細胞は一般に培養物中で不死であ
り、動物に注射されたときに腫瘍を形成せず、正常な二
倍体の核型を保持する。正常細胞は又培養物中で識別さ
れ得る性格の大部分をも保有する。正常細胞のカテゴリ
イに属する細胞は培養物中で制限された数の世代におい
て生育するのみであって“細胞ストレイン (cell strai
ns) ”又は“プライマリイ カルチュア (primary cult
ure)”と称される。或る正常細胞系は形質転換のすべて
の規準に合致しないけれども培養物中で不定に生育す
る。形質転換細胞は培養物中で生育して不死であり、典
型的には識別され得る表現型を喪失し、獲得された核型
異常を呈する。該形質転換細胞は独立的固定生育 (inde
pendent of anchorage for growth)をなし適宜の宿主動
物に注射された時に腫瘍を誘発する。このカテゴリイに
属する細胞はインビトロで生育してＰＤＧＦ受容体を持
ち、培養物中で本発明によるＰＤＧＦ類似因子に対して
反応する。 【００２９】下記の諸例を要約すると例Ｉはプラスミド
ｐＵＣ１３を複製するＥ．コリ中のｐＳＳＶ−１１のｖ
−sis サブクローンの構造を示す。例IIはＭＦα１プロ
モーター及び分泌信号配列に対するｖ−sis の結合を含
むプラスミドｐＶＳαの構造を示す。例 IIIはＰＤＧＦ
のＢ鎖に相同でないｖ−sis 遺伝子産生物、ｐ２
８si s 、の最初の６６アミノ酸を欠失させるために、一
本鎖バクテリオファージＭ１３を使用する技法にもとづ
きｖ−sis 遺伝子の最初の１９５塩基対のオリゴヌクレ
オチド指令欠失変異誘発を示す。得られたファージは正
しい欠失部を有していて m１１ｖｓ２αと命名された。
例 IV は例 II 及びIII に記載されたｖ−sis関連の構
造体の酵母複製ベクターＹＥｐ１３の中への導入及び酵
母ＴＰＩターミネーター配列の付加を示す。これに続い
てＶＳ２α配列をプラスミドｐＣＰＯＴの中へ挿入し、
かようにして宿主細胞内のプラスミドの安定保持を確実
にした。このプラスミドはｐ１１７−２と命名された。
本例はプラスミドｐＶＳＢの構造及び発現ベクターｐＭ
ＰＯＴ２の構造をも示す。例ＶはプラスミドＹＥｐＶＳ
α，ＹＥｐＶＳ２α、ｐ１１７−２及びコントロールプ
ラスミドｐ２７０及びｐＣＰＯＴを用いる酵母宿主細胞
の形質転換及びそれに続く転写分析を示す。例 VIはｖ
−sis 発現形質転換体を含有する培養物からの使用済み
の酵母生育培地の濃縮及びＥＬＩＳＡ、ラジオレセプタ
ー (radio-receptor) 及び有糸分裂促進性試験によるＰ
ＤＧＦ類似物質に対する分析を示す。上記のｖ−sis 関
連遺伝子にもとづく産生物を含有する該酵母生育培地は
真正のヒトのＰＤＧＦの生物学的活性と同一の生物学的
活性を有することが明らかに証明された。 【００３０】下記の諸例は例示のためであって本発明の
範囲を限定するものではない。 【００３１】 【例】他にことわらない限り、標準分子生物学的方法を
使った。制限エンドヌクレアーゼ及び他のＤＮＡ修飾酵
素（すなわちＴ4 ポリヌクレオチドキナーゼ、子牛アル
カリ性ホスファターゼ、クレナウＤＮＡポリメナーゼ）
はベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、ニュー・イン
グランド・バイオラブズ、ベリンガー−マンハイムまた
はコラボラチブ・リサーチから得たもので、他にことわ
らない限り製造業者の提案した通り使った。Ｍ１３ファ
ージ、ｐＵＣプラスミドベクター及び適当な宿主細胞株
はベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズから得た。Ｅ．
コリ培養物はダゲルト・エールリッヒの塩化カルシウム
法〔ジーン、６巻、２３頁、１９７９年）により形質転
換した。酵母培養物はベグズ（ネーチャー、２７５巻、
１０４頁、１９７８年）に記載のように形質転換した。
プラスミド及びＭ１３複製型分子（ＲＦ）ＤＮＡはビル
ンボイム及びドリーの方法（ヌクレイック・アシッズ・
リサーチ、７巻、１５１３頁、１９７９年）の方法によ
りＥ．コリ形質転換細胞からつくった。一本鎖Ｍ１３フ
ァージＤＮＡはＳ．アンダーソン（ヌクレイック・アシ
ッズ・リサーチ、１３巻、３０１５頁、１９８１年）に
より記載のようにつくった。ＤＮＡフラグメントはＪ．
ラングリッジらの方法（アナリチカル・バイオケミスト
リー、１０３巻、２６４頁、１９８０年）によりアガロ
ースゲルから抽出した。ＤＮＡ配列はＭ１３鋳型上でジ
デオキシ法（メッシング、メソドロジー・イン・エンチ
モロジー、１０１巻、２０頁、１９８３年）により行な
った。 【００３２】実施例１ ｐＳＳＶ−１１からＶ−SIS のサブクローニング そのゲノムにＳＳＶを組込んだＳＳＶ−１１を非生産的
感染させた正常のラットの腎臓（ＮＲＫ）細胞からＳＳ
Ｖレトロウィルスゲノムをクローニングした（デバール
ら、上記、１９８２年）。ＳＳＶ ＤＮＡは5.８キロベ
ース（ｋb ）ＥcoＲＩフラグメントとして単離し、つい
でプラスミドｐＢＲ３２２に挿入し、クローンｐＳＳＶ
−１１を得た。このクローンはＳ．アアロンソン（ナシ
ョナル・インスチチュート・オブ・ヘルス、ベセスダ、
ＭＤ）から得た。図１はＳＳＶの5.８キロベースプロウ
イルスゲノムの模式的制限マップである。本発明に関連
した制限位置だけを示す。オープンボックスはｖ−sis
遺伝子のｐ２８sis コーディング部分を示す。図２、図
３はｖ−sis 遺伝子のヌクレオチド配列及び若干の側面
ＳＳＶ配列を示す。ｖ−sis 遺伝子はＳＳＶのエンベロ
ープ（env)遺伝子の推定のＡＴＧ開始コドンの１９ヌク
レオチド３′に挿入される（デバールら、１９８２年、
上記）。ｖ−sis 配列の転写と翻訳はＳＳＶ配列によっ
て指図され、env-sis 融合蛋白質を生じる。図２、図３
に示したヌクレオチド配列は１９８２年（上記）のデバ
ールらにより公表されたものから修正してある。修正は
デバールら（１９８３年、上記）及び本発明者によりな
されたものを含む。デバールら（１９８２年、上記）の
もとの番号付け図表をここで保持してある。図１の制限
位置に割当てた数は図２、図３からのものである。 【００３３】ｖ−sis 遺伝子の部分を含むｐＳＳＶ−１
１のサブクローン（図４）は、Ｅ．コリ複製プラスミド
ｐＵＣ１３中で構築された（ビエイラ、メッシング、ジ
ーン、１９巻、２５９頁、１９８２年；メッシング、メ
ソドロジー、イン・エンチモロジー、１０１巻、２０
頁、１９８３年）。ｐＳＳＶ−１１の５マイクログラム
（μｇ）を制限エンドヌクレアーゼＰstＩで消化し、配
列番号４５４−１６７９（図１）を含む1.２ｋb フラグ
メントをアガロースゲル電気泳動（0.９％）で精製し、
ゲルからセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴ
ＡＢ）とブタノールで抽出した（ラングリッジら、上
記）。またｐＵＣ１３の２μｇをＰstＩで消化し、フェ
ノール／クロロホルム（CHCl3 ) 抽出し、エタノール
(EtOH) で沈殿させた。1.2 ｋb ｖ−sis フラグメント
４０ｎg とＰstカットｐＵＣ１３ ５０ｎg を室温で一
夜Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ４０単位（Ｕ）で連結反応させ
た。連結反応混合物を使って、５−ブロモ、４−クロ
ロ、３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−gal)
およびイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰ
ＴＧ）の存在で、Ｅ．コリＫ−１２細胞株ＪＭ８３を形
質転換した（メッシング、レコンビナント・ＤＮＡテク
ニカル・ブュレタン、ＮＩＨパブリケーションNo. ７９
−００９、２頁、No. ２、４３〜４８頁、１９７９
年）、アンピシリン耐性白色コロニーからつくったプラ
スミドＤＮＡをＰstＩで消化し挿入物の存在を確かめ、
生成プラスミドを p VSIS ／Ｐstと命名した。 【００３４】実施例２ プラスミドｐＶＳαの構築 Ａ．ＭＦα１へ融合のためのＶ−SIS の調製 プラスミドｐＳＳＶ−１１（図４）６００μg を、５０
mＭ NaCl 、１０ mＭ MgCl2、１０ mＭトリス pＨ7.５
（培地塩緩衝液）、１００μg ／ｍl 牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）の２００μl 中で、３７℃で一夜、制限エン
ドヌクレアーゼＢamＨＩおよびＰvu II で消化した。消
化生成物を1.１％アガロースゲルを通し電気泳動し、１
１００塩基対（ｂp ）ＢamＨＩ−Ｐvu II フラグメント
（図４）を切りとり、抽出し、EtOHで沈殿させた。ＤＮ
Ａペレットを７５μl のＨphＩ緩衝液に溶かし、これに
ＢＳＡ１ｍｇ／ｍl ２０μl とＨphＩ 5μl を加えた。
３７℃で一夜消化後、混合物を1.２５％アガロースゲル
を通し電気泳動し、ゲルから３９６ bp ＨphＩ−Ｐvu I
I フラグメントを単離し、EtOHで沈殿させた。ＤＮＡペ
レットをクレナウ緩衝液６ mＭトリス pＨ7.５、６ mＭ
MgCl2、６０ mＭ NaCl ）３０μl に溶かし、ＨphＩ開
裂位置における３′突出たヌクレオチドを、クレナウポ
リメラーゼ５Ｕで３７℃で５分処理することにより除い
た。各１ mＭですべての４デオキシリボヌクレオチドを
含む混合物１μl を加え、反応混合物をさらに１０分培
養した。フェノール／CHCl3 ／エーテル（EtOH）抽出お
よびEtOH沈殿後、ＤＮＡペレットを培地塩緩衝液３０μ
l に溶かし、Ｂgl 5ｕで３７℃で３時間消化した。ＤＮ
Ａを1.２５％アガロースゲルを通し電気泳動し、２６９
ｂp ＨphＩ−Ｂgl II フラグメントを抽出し、EtOHで沈
殿させた。このクレナウブラントフラグメントのＨphＩ
開裂末端はトリヌクレオチド配列ではじまる。 ５′ＡＴＧ……（図４） ３′ＴＡＣ…… 【００３５】Ｂ．ＭＦα１プロモーターおよび分泌リー
ダーフラグメント プラスミドｐ１９２（図５）は、バクテリアプラスミド
ｐＵＣ１３中でクローニングした酵母接合フェロモンα
−因子（ＭＦα１遺伝子）用の遺伝子の一部分からなる
（ビエイラ、メッシング、上記；メッシング、メソドロ
ジー・イン・エンチモロジー、１０１巻、２０頁、１９
８３年）。ゲノムライブラリーからのＭＦα１遺伝子の
クローニングはクルジャン、ヘルスコウイッツ（上記）
により記載されている。原料としてＹＥｐ１３のＢamＨ
Ｉ位置にクローニングした部分Ｓau３Ａフラグメントの
酵母ゲノムライブラリーを使い（ナスマイス、タッチェ
ル、セル、１９巻、７５３頁、１９８０年）、上記遺伝
子を類似の方法でこの実験室で単離した。このライブラ
リーから、マットα２−３４突然変異のための酵母ホモ
接合の二倍体細胞株中のα−因子を表現したプラスミド
を単離した（マンネーら、ジャーナル・セル・バイオロ
ジー、９６巻、１５９２頁、１９８３年）。ＭＦα１遺
伝子で重複した挿入物を含むクローンはクルジャン、ヘ
ルスコウイッツ（上記）によりキャラクタリゼーション
された。 【００３６】ｐＺＡ２（図５）として知られるこのプラ
スミドをＥcoＲ１で切り、ＭＦα１遺伝子からなる１７
００ｂp フラグメントを精製した。ついでこのフラグメ
ントをｐＵＣ１３のＥcoＲ１位置にサブクローニングし
てプラスミドｐ１９２を得た。プラスミドｐ１９２ １
５μｇを培地塩緩衝液３０μl 中でＨind III ２０単位
で３７℃で一夜消化した。反応混合物をクレナウ緩衝液
で６０μl にうすめ、４デオキシリボヌクレオチドを加
えて各々５０μＭの最終濃度にした。氷冷混合物にクレ
ナウポリメラーゼ１０単位を加え、１５℃で１２分培養
した。フェノール／CHCl3 ／Et2O抽出後、水相を凍結乾
燥により１０μl まで濃縮し、ＥcoＲＩ ２０単位で３
７℃で７０分消化した。生成物を0.９％アガロースゲル
を通し電気泳動し、1.２ｋb ＥcoＲＩ−Ｈind III （ブ
ラントした）ＭＦα１フラグメントを抽出し、EtOHで沈
殿させた。このＤＮＡフラグメントはＭＦα１の転写プ
ロモーターおよび分泌シグナル配列を含む。 【００３７】Ｃ．ｖ−sis ３′配列およびクローニング
ベクターｐＵＣ１２の調製；フラグメント連結反応 プラスミドｐＶＳＩＳ／Ｐst 2０μｇを、培地塩緩衝液
４０μl 中でＢgl II およびＸba Iで消化した。１％ア
ガロースを通し、電気泳動後、ＤＮＡの抽出およびEtOH
沈殿で精製したｖ−sis ７５６ｂp Ｂgl II −Ｘba Iフ
ラグメントを与えた（図４）。Ｅ．コリ複製プラスミド
ｐＵＣ１２（５μｇ）をＥcoＲＩおよびＸba Iで消化
し、上記のようにゲル精製した（図４）。 【００３８】図４で、上記の４ＤＮＡフラグメントの等
モル量を、２９６ｂp ＨphＩ−Ｂgl II ｖ−sis フラグ
メント１０ｎg に調節し、リガーゼ緩衝液（６ mＭトリ
ス pＨ7.6、 6.６ mＭ MgCl2、0.４ mＭ ＡＴＰ、２ m
Ｍスペルミジン、２０mＭ ＤＴＴ、１００μｇ／ｍl
ＢＳＡ）１５μl 中で混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ４０
単位で１４℃で一夜連結反応させた。反応混合物を室温
にし、Ｔ4リガーゼをさらに１５０単位加え、さらに１
０時間培養した。連結反応混合物７μl を使ってＥ．コ
リＫ−１２ＲＲ１（ＡＴＣＣNo. ３１３４３；Ｅ．ボリ
バーら、ジーン、２巻、９５頁、１９７７年）を形質転
換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を選んだ。１２の
上記バクテリアコロニーからプラスミドＤＮＡをつく
り、Ｘba Iで消化した。２コロニーは適当なフラグメン
トの整列により予想される〜2.２ｋb バンドを与えた
（図４）。Ｂgl II −Ｘba I制限地図作成によりこれら
をさらに分析してＭＦα１／ｖ−sis 融合から約1.５ｋ
b の予期のバンドを与え、Ｂgl II −Ｘba I ｖ−sis
フラグメントに対して７６０ｂp を与えた。ＤＮＡ配列
分析はＭＦα１／ｖ−sis 結合において望むヌクレオチ
ド配列を立証した。生成プラスミドをｐＶＳαと命名し
た。 【００３９】実施例３ ６６アミノ末端ｖ−sis コドンのオリゴヌクレオチド指
令欠失突然変異誘発ｖ−sis 蛋白質ｐ２８sis とＰＤＧ
Ｆの間の相同は、ｐ２８sis のアミノ酸６７、ＰＤＧＦ
Ｂ鎖の NH2末端残基に相当するセリン残基ではじまる
( ジョンソン、上記) 。ＭＦα１一次翻訳生成物の蛋白
質分解プロセシングはイニシエーターメチオニンからＬ
ys−Ａrg開裂シグナル８５アミノ酸で起る（クルジャ
ン、ヘルスコウイッツ、上記）。ｖ−sis のセリン残基
６７がＭＦα１Ｌys−Ａrgプロセシングシグナルに直ち
に従うようにｐ２８sis の最初の６６コドンが除去され
ているｖ−sis 誘導体が構築された。図６を参照する
と、ｐＶＳαのゲル精製2.２ｋb Ｘba Iフラグメントの
約４０ｎg を、Ｘba I消化アルカリ性ホスファターゼ処
理Ｍ１３ｍp １１ＤＮＡ１２０ｎg と連結反応させた
（メッシング、メソドロジー・イン・エンチモロジー、
上記）。連結反応混合物を使い、Ｘ−gal およびＩＰＴ
Ｇの存在でＥ．コリＫ−１２細胞株ＴＭ１０１（ＡＴＣ
Ｃ３３８７６）を形質転換した。単離した白色プラーク
をとり、ログ相発育ＪＭ１０１細胞の３ml培養物の感染
に使った。複製型（ＲＦ）ＤＮＡをつくり、一本鎖成熟
ファージのプラス鎖形と同一配向で挿入フラグメントを
有しているクローンを同定した。このようなクローンか
ら一本鎖ファージＤＮＡをつくり、ｍ１１ＶＳαと命名
した。 【００４０】ｖ−sis のコドン１−６６を正確に除くた
めに、本質的にゾラーの２プライマー法に従ってオリゴ
ヌクレオチド指令突然変異誘発を行なった（ゾラーら、
マニュアル・フォア・アドバンスト・テクニークス・イ
ン・モレキュラー・クローニング・コース、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー、１９８３年）。
オリゴヌクレオチドＺＣ１３０（３′AGAAACCTATTTTCCT
CGGACCCA５′）をアプライド・バイオシステムズ３８０
−Ａ ＤＮＡ合成器上で合成した。ＺＣ１３０５０pmol
をキナーゼ緩衝液（ＢＲＬ）１０μl 中で、Ｔ4 ポリヌ
クレオチドキナーゼ４単位で３７℃で４５分キナーゼ化
した。酵素を６５℃で１０分加熱して不活性化した。ｍ
１１ＶＳα0.５pmolを記載の条件（ゾラーら、上記）を
使い、キナーゼ化ＺＣ１３０ １pmolおよび一般配列プ
ライマー（ＢＲＬ）1.５pmolとアニーリングしたが、た
だしアニーリング混合物をまず６５℃に１０分加熱し、
３７℃に１０分上げ、ついで氷で迅速に冷した。ついで
アニーリングした混合物をゾラーら（上記）が記載のよ
うにクレナウポリメラーゼで処理し、環状デュプレック
スＤＮＡをつくり出した。延長混合物の部分を使って、
Ｅ．コリＫ１２ＪＭ１０１細胞を形質転換した。得られ
たファージプラークを、ニトロセルロース濾過器上に移
し、ついで32Ｐホスホリル化ＺＣ１３０で６５℃でハイ
ブリッド形成することにより、適当な欠失のためにふる
った。正しく並置した配列は、使った厳重なハイブリッ
ド形成温度で放射性プローブと安定なデュプレックスを
形成した。ふるった形質転換細胞の約１％はオートラジ
オグラフィによりプラスの信号を与えた。クローンをプ
ラーク精製し、制限酵素分析用にＲＦ ＤＮＡをつくっ
た。５つの単離物は１９５ｂp 〜１４５０ｂp Ｈind II
I −Ｂgl II フラグメントの大きさに予期の減少を示し
た（図６）。２の単離物のＤＮＡ配列分析により、正し
い融合結合がなされたことが確かめられ、そこで適当な
翻訳読みフレームを維持した。このファージの一つをｍ
１１ＶＳ２αと命名した。 【００４１】実施例４ 酵母表現ベクター Ａ．プラスミドＹＥｐＶＳαとＹＥｐＶＳ２αの構築 酵母複製ベクターＹＥｐ１３（ブローチら、ジーン、８
巻、１２１頁、１９７９年）を、実施例２および３に記
載のｖ−sis 誘導構築物用の表現ビークルとして使っ
た。ＹＥｐ１３は２ミクロンの複製原と酵母ＬＥＵ２遺
伝子を含む多複製染色体外プラスミドである。これはロ
イシンに欠けた合成培地で発育させるとき、欠陥染色体
ＬＥＵ２遺伝子を有する酵母細胞株中のプラスミドの選
択を可能にする。酵母に表現された異遺伝子に酵母ター
ミネーター配列を加えると、 mＲＮＡの有効な転写終結
とポリアデニル化を確実にする。ｖ−sis 表現単位ＶＳ
αとＶＳ２αを、予めＹＥｐ１３にクローニングしたＴ
ＰＩターミネーターフラグメントに隣接して置いた（下
記）。 【００４２】プラスミドｐ２７０（図７参照）は、酵母
トリオースホスフェートイソメラーゼ（ＴＰＩ）遺伝子
の転写ターミネーター領域を含む。これは次の方式で構
築された。酵母ＴＰＩターミネーターフラグメントはプ
ラスミドｐＦＧ１から得た（アルバー、カワサキ、上
記）。これはＴＰＩ遺伝子の末端から二番目のアミノ酸
コドンから約７００塩基対下流のＥcoＲＩ位置まで囲ん
でいる。まずプラスミドをＥcoＲＩで切り、ついで端を
ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレナウフラグメント）でブラ
ントし、合成ＢamＨＩリンカー（ＣＧＧＡＴＣＣＡ）を
加え、プラスミドｐ１３６をつくるため再連結反応させ
ることにより、ＢamＨＩ位置をｐＦＧ１のこの独特のＥ
coＲＩ位置の代わりに置きかえた。ついでＴＰＩターミ
ネーターをｐ１３６からＸba I−ＢamＨＩフラグメント
として切出した。このフラグメントを、Ｘba IおよびＢ
amＨＩで線状化してあるＹＥｐ１３（ブローチら、上
記）に連結反応させた。生成プラスミドはｐ２１３とし
て知られている。ついでプラスミドをＨind III で消化
し、生成末端をＤＮＡポリメラーゼＩ（クレナウフラグ
メント）でブラントし、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼを使って線
状分子を再環化することにより、Ｈind III 位置をｐ２
１３のＴＰＩターミネーター領域から除去した。一方、
プラスミドｐＭ２２０（下記参照）をＸba IとＢamＨＩ
で消化し、ＴＰＩターミネーターフラグメント（〜７０
０ bp ）を精製し、このフラグメントをＸba IおよびＢ
amＨＩ消化ＹＥｐ１３に挿入することにより、ｐ２７０
を構築できる。 【００４３】図８を参照すると、プラスミドｐ２７０Ｄ
ＮＡをＸba Iで消化し、凝集性ベクター端の再連結反応
を防ぐために子牛アルカリ性ホスファターゼで処理し
た。夫々ｐＶＳαおよびｍ１１ＶＳ２αのＸba I消化、
アガロースゲル精製により、ｖ−sis 表現単位ＶＳαお
よびＶＳ２αをつくった。単離フラグメントの各々を、
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ４０単位の存在でホスファターゼ化
ｐ２７０ベクターのほぼ等モル量と連結反応させ、連結
反応混合物をＥ．コリＫ−１２ＲＲ１中に形質転換させ
た。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性コロニーから
つくり、３′ｖ−sis 配列に隣接したＴＰＩターミネー
ターを有するクローンを同定するために制限酵素分析を
行った。ゲル電気泳動後3.３ｋb または3.１ｋb Ｂgl I
I フラグメントの存在は、夫々ＹＥｐＶＳαおよびＹＥ
ｐＶＳ２αの正しい配向を示した。 【００４４】Ｂ．ＶＳ２α表現単位のｐＣＰＯＴへの挿
入 酵母培養から最大の蛋白質生産を達成するためには、宿
主細胞中で著しく安定に保たれる表現ビークルを使うの
が望ましい。プラスミドｐＣＰＯＴはこのような好まし
い表現ビークルである。ｐＣＰＯＴで形質転換したＥ．
コリＨＢ１０１は、受入番号３９６８５でアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションに預けられている。
プラスミドｐＣＰＯＴは２ミクロンの円形ゲノム（ハー
トレー、ドネルソン、ネーチャー、２８６巻、８６０
頁、１９８０年）、Ｅ．コリプラスミドｐＢＲ３２２複
製および選択配列、解糖酵素トリオースホスフェートイ
ソメラーゼを符号化したシゾサッカロミセス・ポムベＤ
ＮＡ配列（ＰＯＴ１）からなっている。ｐＣＰＯＴ中の
ＰＯＴ１遺伝子の存在は、炭素源としてグルコースを使
う非選択的培地で発育中、適当な宿主バックグラウンド
でプラスミドの安定な維持を確保する。 【００４５】Ｓ．セレビジエＴＰＩプロモーターを使っ
てｐＣＰＯＴ中のＶＳ２α配列の表現を制御した。プラ
スミドｐＭ２２０はＭＦα１シグナル配列に融合したＴ
ＰＩプロモーターを含む。ｐＭ２２０で形質転換した
Ｅ．コリＲＲＩは、受入れ番号３９８５３でアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションに預けられてい
る。図９を参照すると、プラスミドｐＭ２２０をＢgl I
I とＢamＨＩで消化し、0.９％アガロースゲルを通し電
気泳動し、2.２ｋb ＴＰＩプロモーター、ＭＦα１遺伝
子フラグメントを抽出した。精製フラグメントをＰstＩ
で消化し、生成１ｋb Ｂgl−ＰstＩフラグメントをアガ
ロースゲル精製した。プラスミドＹＥｐＶＳ２αをＰst
ＩとＢamＨＩで消化し、1.８ｋb ＭＦα１／ｖ−sis ／
ＴＰＩターミネーター融合フラグメントをゲル単離し
た。プラスミドｐＣＰＯＴをＢamＨＩで消化し、子牛ア
ルカリ性ホスファターゼで処理し、フェノール／CHCl3
抽出し、ついでアガロースゲルを通し電気泳動で精製
し、ゲルから抽出し、EtOHで沈殿させた。 【００４６】上記の３の単離したフラグメント（図９）
のほぼ等モル量を１２℃で一夜連結反応させ、連結反応
混合物を使ってＥ．コリＫ−１２細胞株ＤＨ１（ハナハ
ン、Ｄ．、メセルソン Ｍ．、ジャーナル・モレキュラ
ー・バイオロジー、１６６巻、５７７頁、１９８３年）
をアンピシリン耐性まで形質転換した。プラスミドＤＮ
Ａを形質転換細胞からつくり、制限消化分析を使って挿
入フラグメントの配向を確かめた。〜１５００ｂp Ｂam
ＨＩ−ＳalＩフラグメントの存在は、ＴＰＩターミネー
ターフラグメントのＢamＨＩ凝集性端が図９に示すよう
に配向していることを示す。反対の配向はＢamＨＩ／Ｂ
gl II 融合をつくり出し、ＢamＨＩで開裂されず、そこ
でこのフラグメントを生じない。８００ｂpＳphＩフラ
グメントは、ＴＰＩプロモーターとｖ−sis フラグメン
トがＰstＩ位置で適当に融合していることを示す（図
９）。このプラスミドをｐ１１７−２と命名した。 【００４７】Ｃ．プラスミドｐＶＳＢの構築 ｐＶＳ２αにより符号化した生成物は本物（真正）のヒ
トＰＤＧＦ Ｂ鎖より大きいから、また一層小さい生成
物は形質転換した酵母宿主細胞で一層高い表現水準を生
じるから、３′端で先を切ったｐＶＳ２のｖ−sis 配列
からなるベクターを構築した。この配列により符号化し
たポリペプチドはｐ２８sis のアミノ酸６７〜１７５か
らなり、ＰＤＧＦのＢ鎖に相同である。この“Ｂ鎖”配
列を含む表現ベクターは、ｐＶＳ２α表現単位のエレメ
ントを部分ｖ−sis 遺伝子およびｐ２８sis のアミノ酸
１５８〜１７５を符号化した合成二本鎖ＤＮＡフラグメ
ントと結合することにより構築された。この合成フラグ
メントは、１３ｖ−sis コドンの多くに対し好ましい酵
母コドンをおき代え、また符号化配列の端にストップコ
ドンを供給するように工夫された。このベクターの構築
は図１０と図１１に例示されている。プラスミドＹＥｐ
ＶＳ２αをＰstＩとＢamＨＩで消化し、部分ＭＦα１、
ｖ−sis 、ＴＰＩターミネーター配列からなる1.８ｋb
フラグメントを、アガロースゲル電気泳動で精製した。
ｐＵＣ１９（ノランダーら、ジーン、２６巻、１０１〜
１０６頁、１９８３年）のＨind III 位置に、表１に示
したポリリンカーを挿入したプラスミドｐＩＣ１９Ｒ
（Ｊ．ローレンス・マーシュ博士、ユニバーシティー・
オブ・カリフォルニア、イルビンから得られる）を、Ｐ
stＩとＢamＨＩで消化し、ベクターフラグメントをゲル
精製し、ｐＶＳ２αからの1.８ｋb フラグメントに結合
し、プラスミドｐＶＳ２αＴを得た。 【００４８】 【表１】 【００４９】プラスミドｐＭ２２０をＢgl II とＰstＩ
で消化し、ＴＰＩプロモーターおよびＭＦα１配列の
５′部分からなる約１ｋb フラグメントを単離し、Ｂgl
II ＋ＰstＩ消化ｐＩＣ１９Ｒでクローニングした。得
られたプラスミドをＣ1aＩとＰstＩで消化し、ＴＰＩプ
ロモーターＭＦα１フラグメントをゲル精製した。つい
でプラスミドｐＶＳ２αＴをＣ1aＩとＰstＩで切り、Ｔ
ＰＩプロモーター−ＭＦα１フラグメントに結合した。
2.６ｋb Ｃ1aＩ−ＢamＨＩフラグメントの存在により正
しい構成が同定され、ｐＴＶＳ２αＴと命名された。プ
ラスミドｐＶＳα１０μｇを完結までＸmaＩとＳphＩで
消化した。またｖ−sis 配列の大部分からなる生成した
約4.９ｋb ベクターフラグメントを、アガロースゲル電
気泳動により精製し、ＤＮＡを抽出し、EtOHで沈殿させ
た。 【００５０】ｖ−sis 配列に対し新しい３′末端を供給
するために、アプライド・バイオシステムズ モデル３
８０−Ａ ＤＮＡ合成器上で合成したオリゴヌクレオチ
ドから二重鎖ＤＮＡフラグメントを構築した。オリゴヌ
クレオチドＺＣ２９９（表２） 0.7 pmol を、４０ mＭ
NaCl を含む１０μl 中のオリゴヌクレオチドＺＣ３０
０等モル量と６５℃で５分加熱した。 【００５１】 【表２】 表 ２ ZC299:5' TAAG TGT GAA ATC GTT GCC GCG GCT AGA GCT GTT ACC TAA TCT AGA 3' ZC300:3' GTACA TTC ACA CTT TAG CAA CGG CGC CGA TCT CGA CAA TGG ATT AGA TCT GGCC 5' 【００５２】ついで混合物を３７℃で５分培養し、室温
に冷やした。精製した4.９ｋb ベクターフラグメント0.
２ pmol を加え、混合物を１２℃で１８時間連結反応さ
せ、アンピシリン耐性を獲得するまでＥ．コリＨＢ１０
１（ＡＴＣＣ３３６９４）を形質転換するのに使った。
ＤＮＡはアンピシリン耐性コロニーからつくり、Ｂgl I
I とＸba Iで消化した。アガロースを通し電気泳動後、
約７５０ｂpＢgl II −Ｘba Iの損失と約５００および
２６０ｂp の２個の一層小さいフラグメントの出現によ
り、望むクローン（ｐＶＳαＢとして知られる）を同定
した。プラスミドｐＴＶＳ２αＴ約８μｇを１０μl 容
量中でＸba Iで完結まで消化した。容量をＢgl II 緩衝
液で４０μl まで増し、Ｂgl II ６単位を加え、混合物
を３７℃で培養した。１０μl 試料を１５分および３０
分で５０ mＭＥＤＴＡを含む停止緩衝液に除去し、残り
２０μl を４５分で停止した。生成混合物を0.７％アガ
ロースを通し電気泳動により分離した。約4.６ｋb Ｂgl
II −Ｘba Iベクターフラグメントを切り、ゲルから抽
出し、EtOHで沈殿させた。プラスミドｐＶＳαＢをＢgl
II とＸba Iで消化し、合成３′末端とストップコドン
を含む約２６０ｂp フラグメントをアガロースに通し電
気泳動により単離し、ついでゲルから抽出し、EtOHで沈
殿させた。 【００５３】ｐＴＶＳ２αＴからの4.６ｋb Ｂgl II −
Ｘba IベクターフラグメントとｐＶＳαＢからの２６０
ｂp Ｂgl II −Ｘba Iフラグメントを、Ｔ4 ＤＮＡリガ
ーゼの存在で室温で７時間連結反応させた。反応混合物
をアンピシリン耐性獲得に至るまでＥ．コリＨＢ１０１
を形質転換するのに使った。ＤＮＡを形質転換細胞から
つくり、望む挿入物の存在はアガロースゲル上で５５０
ｂp ＰstＩ−Ｘba Iバンドに対しふるいわけすることに
より確かめた。正しい配置をもつプラスミドをｐＶＳＢ
と命名した。 【００５４】Ｄ．ｐＭＰＯＴ２の構築 酵母中にｖ−sis 誘導の表現のために、酵母２ミクロン
ＤＮＡからのＲＥＰ１、ＲＥＰ２、ＲＥＰ３、ori 配列
およびＳ．ポムベトリオースホスフェートイソメラーゼ
（ＰＯＴ１）遺伝子からなる安定な表現ベクターを構築
した。ＰＯＴ１遺伝子は、酵母宿主がトリオースホスフ
ェートイソメラーゼに対して欠陥のあるとき、複雑な培
地内で発育している形質転換酵母宿主にプラスミド維持
を与える。 【００５５】ＰＯＴ１遺伝子はプラスミドｐＦＡＴＰＯ
Ｔから得た。ｐＦＡＴＰＯＴで形質転換したＳ．セレビ
ジエ細胞株Ｅ１８は、受入れ番号２０６９９でＡＴＣＣ
に預けられている。常法で宿主細胞からプラスミドを精
製できる。プラスミドをＳalＩとＢamＨＩで消化するこ
とによりＰＯＴ１配列をｐＦＡＴＰＯＴから除去した。
この〜１６００ｂp フラグメントを、ＳalＩとＢamＨＩ
で消化することによりまず線状にしてあるｐＩＣ１９Ｒ
に連結反応させた。生成プラスミドのＢamＨＩ、Ｐst
Ｉ、ＳalＩ位置を２工程で破壊し、プラスミドｐＩＣＰ
ＯＴ* を得た。ＰstＩおよびＳalＩで切ることによりＰ
stＩとＳalＩ位置を除去し、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ク
レナウフラグメント）で突出たＰstＩ 3′を消化しクレ
ナウフラグメントを突出たＳalＩ 5′に挿入することに
より末端をブラントした。ついでブラント末端を連結反
応させた。ついでプラスミドをＢamＨＩで切り、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ（クレナウフラグメント）を末端に挿入
し、ブラント末端を再連結反応させることにより、Ｂam
ＨＩ位置を除去した。 【００５６】プラスミドＹＥｐ３（ブローチら、ジー
ン、８巻、１２１〜１３３頁、１９７９年）とＣ１／１
から２ｕ配列を得た。ＥcoＲＩで部分消化によりｐＭＢ
９配列を除去し、ＥcoＲＩ−切断ｐＢＲ３２２で置換す
ることにより、ｐＪＤＢ２４８（ベッグズ、ネーチャ
ー、２７５巻、１０４〜１０９頁、１９７８年）からＣ
１／１を構築した。ＰstＩとＸba Iで消化し、ゲル精製
することにより、ＹＥｐ１３からＲＥＰ３および ori配
列を除去した。Ｘba IとＳphＩで消化し、ゲル精製する
ことにより、Ｃ１／１からＲＥＰ２を得た。ついで２フ
ラグメントを、プラスミドｐＵＣＲＥＰ２、３をつくる
ためＰstＩとＳphＩで線状にしてあるｐＵＣ１８（ノラ
ンダーら、ジーン、２６巻、１０１〜１０６頁、１９８
３年）に結合した。ＥcoＲＩとＸba Iで消化し、１７０
４ｂp フラグメントのゲル精製によって、Ｃ１／１から
ＲＥＰ１を得た。ＥcoＲＩ−Ｘba Iフラグメントを、Ｅ
coＲＩとＸba Iで線状にしてあるｐＵＣ１３中にクロー
ニングした。生成プラスミドをｐＵＣ１３＋ＲＥＰ１と
命名した。ｐＵＣ１３＋ＲＥＰ１プラスミドをＨind II
で切り、ＥcoＲＩリンカー（ベセスダ・リサーチ・ラボ
ラトリーズから得た）の存在で連結反応させた。ついで
ＲＥＰ１遺伝子を約１７２０ bp のＥcoＲＩフラグメン
トとして除去した。このＥcoＲＩフラグメントを、Ｅco
ＲＩとＸba Iで線状にしてあるｐＩＣ７（ｐＵＣ８のＨ
indIII 位置に挿入したチャート１に示したポリリンカ
ー配列からなる）中にクローニングした。生成プラスミ
ドをｐＩＣＲＥＰ 1 No.９と命名した。 【００５７】最終表現ベクターｐＭＰＯＴ２を構築する
ために、ｐＩＣＰＯＴ* を部分Ｈind III 消化および完
全Ｓst I消化により線状にした。プラスミドｐＵＣＲＥ
Ｐ2 、3 をＨind III とＳst Iで切り、ＲＥＰ2 、ＲＥ
Ｐ3 、ori 配列からなるフラグメントをゲル精製し、線
状にしたｐＩＣＰＯＴ* に結合した。ＲＥＰ２、ＲＥＰ
３、ori 、ＰＯＴ１、 ampr 配列からなる生成プラスミ
ドをｐＭＰＯＴ 1 と命名した。ついでＲＥＰ１をｐＩ
ＣＲＥＰ 1 No.９からＢgl II −Ｎar Iフラグメントと
して除去し、Ｂgl II とＮar Iで開裂してあるｐＭＰＯ
Ｔ１に連結反応させた。この連結反応生成物をｐＭＰＯ
Ｔ２と命名した（ＡＴＣＣに預けた、受入れ番号２０７
４４）。プラスミドｐＭＰＯＴ２をＣ1aＩとＢamＨＩで
消化し、ベクターフラグメントを上記のように精製し
た。 【００５８】Ｅ．ｐＭＰＯＴ２へのｖ−sis 表現単位の
挿入 1. ｐＭＰＯＴ２へのＶＳα表現単位の挿入 プラスミドｐＶＳα約１０μｇを２０μl の容量中で完
結までＢst Ｅ IIで消化した。ＰstＩ 5単位を加え、
混合物を３０分培養し、ＥＤＴＡを加えて反応を停止し
た。止めた反応混合物を直ちに１％アガロースゲルを通
し電気泳動し、約８００ｂp の部分ＰstＩ−Ｂst Ｅ
IIバンド（大部分ＭＦα１プレプロ配列とｖ−sis ５′
部分からなる）を切り、ゲルから抽出し、EtOHで沈殿さ
せた。プラスミドｐＴＶＳ２αＴをＰstＩとＢst II で
完結まで消化し、アガロースゲル電気泳動で精製した。
生成した約4.8 ｋb ベクターフラグメントおよび８００
ｂp ＰstＩ−Ｂst Ｅ IIフラグメントを、Ｔ4 ＤＮＡ
リガーゼの存在で室温で６時間連結反応させ、連続反応
生成物をＥ．コリＨＢ１０１のアンピシリン耐性獲得に
至るまでの形質転換のために使った。挿入物の存在を示
す約１４５０ｂp Ｂgl II フラグメントを含んでいるプ
ラスミドを同定した。これをｐＴＶＳαと命名した。プ
ラスミドｐＴＶＳαをＣ1aＩとＢamＨＩで完結まで消化
し、ＶＳα配列を含む約2.９ｋb フラグメントをアガロ
ースを通し電気泳動で単離し、ゲルから抽出し、EtOHで
沈殿させた。約2.９ｋb Ｃ1aＩ−ＢamＨＩ ＶＳフラグ
メントを、ｐＶＳ２αｍ（下記）に対し、記載のように
Ｃ1aＩおよびＢamＨＩ消化ｐＭＰＯＴ２と連結反応させ
た。2.９ｋb Ｃ1aＩ−ＢamＨＩ挿入物を含むプラスミド
を同定し、ｐＶＳαｍと命名した。 2. ＭＰＯＴ２へのＶＳ２αの表現単位の挿入 プラスミドｐＴＶＳ２αＴをＢamＨＩ緩衝液中Ｃ1aＩお
よびＢamＨＩで完結まで消化した。緩衝液を高い塩まで
調節し（マニアチスら、上記）、ＤＮＡをＰvu Iで完結
まで消化した。これはベクター配列を２回切り、ＶＳ２
α配列を含む約2.７ｋb Ｃ1aＩ−ＢamＨＩフラグメント
をアガロースゲル上で分割することを可能にする。この
フラグメントを0.９％アガロースを通し電気泳動し、抽
出し、EtOHで沈殿させた。ついでフラグメントをＴ4 Ｄ
ＮＡリガーゼの存在でＣ1aＩ−ＢamＨＩ消化ｐＭＰＯＴ
２と１３℃で２０時間連結反応させた。連結反応したＤ
ＮＡをアンピシリン耐性獲得に至るまでＥ．コリＨＢ１
０１を形質転換するのに使い、プラスミドＤＮＡは生成
コロニーからつくった。プラスミドを2.７ｋb Ｃ1aＩ−
ＢamＨＩ ＶＳ２αフラグメントを含むものとして同定
し、ｐＶＳ２αｍと命名した。 3. ｐＭＰＯＴ２へのＶＳＢ表現単位の挿入 プラスミドｐＶＳＢをＣ1aＩとＢamＨＩで消化し、“Ｂ
鎖”表現単位を含む2.２ｋb フラグメントをアガロース
ゲル電気泳動で精製し、EtOHで沈殿させた。フラグメン
トをＴ4 ＤＮＡリガーゼの存在で室温で一夜連結反応さ
せ、反応混合物をアンピシリン耐性獲得に至るまでＥ．
コリＨＢ１０１を形質転換するのに使った。ＤＮＡを形
質転換細胞からつくり、挿入物の存在はＣ1aＩとＢamＨ
Ｉで消化し、アガロースゲル電気泳動により立証した。
生成表現ベクターをｐＶＳＢｍと命名した。 【００５９】実施例５ 酵母形質転換；ｖ−sis 転写の分析 Ｓ．セレビジェ細胞株Ｅ８−１１Ｃ（ＭＡＴα leu ２
−３、１１２ pep ４−３；交雑Ｅ２−７Ｂ〔ＡＴＣＣ
２０６８９〕×ＧＫ１００〔ＡＴＣＣ２０６８９〕の半
数体分離物）をプラスミドＹＥｐＶＳα、ＹＥｐＶＳ２
α、ｐ２７０、ｐ−１１７−２、ｐＣＰＯＴで形質転換
した。形質転換細胞を選び、ロイシンに欠けた合成培地
に保った。Ｓ．セレビジェ細胞株Ｅ１１−３Ｃ（ＡＴＣ
Ｃ受入れ番号２０７２７）（ＭＡＴα pep 4 −3 tpi
l）をプラスミドｐＣＰＯＴとｐ−１１７−２で形質転
換した。形質転換細胞を選び、ＹＥＰＤ中に保った。図
10を参照すると、ｖ−sis 関連 mＲＮＡ転写物の存在
は、電気泳動およびつぎの全ＲＮＡのハイブリッド形成
分析により確かめられた。細胞様Ｅ８−１１Ｃ中の上記
形質転換細胞からの全ＲＮＡは、マニアティスら（上
記）による記載のようにグアニジウムチオシアナート抽
出によりつくり、次の変形を施した。１００ｍl 培養物
を１×１０8 細胞／ｍl の密度まで発育させた。細胞を
遠心分離でペレット化し、 H20で３回洗い、グアニジウ
ム溶菌溶液２ｍl を加え、ついで丁度メニスカス下まで
0.５mmガラスビーズを加えた。バーストの間の氷で冷し
て、管を３回１分間旋回させた。溶液をピペットでとり
除き、記載（マニアティスら、上記）のようにCsCl2 を
通し遠心分離によりＲＮＡを単離した。プラスミド形質
転換細胞ｐ２７０、ＹＥｐＶＳα、ＹＥｐＶＳ２α、ｐ
ＣＰＯＴ、ｐ１１７−２からのＲＮＡ１５μｇを、トー
マスにより記載（ＰＮＡＳ、７７巻、５２０１頁、１９
８０年）のように、グリオキシル化し、0.９％アガロー
スゲルを通し電気泳動し、ニトロセルロースに移した。
ｐＶＳＩＳ／Ｐstからの精製ＰstＩｖ−sis フラグメン
トをニックトランスレーションし、濾過器結合ＲＮＡに
ハイブリッド形成し、ハイブリッド形成種をオートラジ
オグラフィで検出した（図１２）。ＹＥｐＶＳαからの
〜１９００ｂp 、ＹＥｐＶＳ２αからの〜１６５０ｂp
、ｐ１１７−２からの〜１７００ｂp の転写バンド
は、ｖ−sis 融合構築物の転写を確かめさせ、構築にお
ける転写の開始と停止の信号の使用を確かめさせた。負
の対照ｐ２７０とｐＣＰＯＴではｖ−sis 関連転写は検
出されなかった。プラスミドｐＶＳαｍ、ｐＶＳ２α
ｍ、ｐＶＳＢｍ、ｐＭＰＯＴ２を使い、Ｓ．セレビジェ
細胞株Ｅ１８を形質転換した。細胞株Ｅ１８は、細胞株
Ｅ１１−３Ｃ（ＡＴＣＣNo. ２０７２７）とΔtpi ２９
の交雑によりつくった二倍体である。ロススタイン（メ
ソドロジー・イン・エンチモロジー、１０１巻、２０２
−２１０頁、１９８３年）によって本質的に記載された
ように、細胞株Ｅ２−７Ｂ（ＡＴＣＣNo. ２０６８９）
のトリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝子を分裂す
ることによりΔtpi ２９はつくられる。 【００６０】実施例６ 酵母により表現された sis関連生成物の分析およびバイ
オアッセイ Ａ．酵母培地の濃縮 ＹＥｐ１３およびｐＣＰＯＴ誘導ｖ−sis 構成を有する
形質転換細胞を、適当な培地で３０℃で（1.２リットル
培養）、回転空気振とう器で２２０rpm でかきまぜて、
静止相まで発育させた。培養物を収穫し、細胞を遠心分
離で除き、培地を疎水性の分子を結合するＣ−８セファ
ロース（ファルマシア・ファイン・ケミカルズＡＢ、ア
プサラ、スエーデン）カラム上で濃縮した。本物のヒト
ＰＤＧＦは高度に陽イオン的で疎水性の蛋白質である
（ヘルディンら、ＰＮＡＳ、７６巻、３７２２頁、１９
７９年、ライネス、ロス、上記）。sis −関連の推定上
の酵母生成物は類似の特性をもつことが期待された。si
s 生成物の予期された疎水特性を利用し、分泌が予期さ
れた酵母培地から濃縮した。Ｃ−８カラムに結合した分
子を、適当な疎水性溶剤でマトリックスから溶出した。 【００６１】形質転換した酵母培養物からの廃発育培地
を５％ EtOH に調節し、２〜３ｍl ／分の流量で８ｍl
Ｃ−８セファロースカラムを通した。ついでカラムを５
％ EtOH １００ｍl で２０ mＭ重炭酸アンモニウム（NH
4HCO3)中に洗った。結合物質を２０％プロパノールで２
０ mＭ NH4HCO3中に溶出し、溶出液を１−２ｍl フラク
ションに集めた。２８０ｎm の光吸収（Ａ280 1.４＝1.
０ｍｇ蛋白質／ｍl ）により、またはローリーらの方法
（ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、１９３
巻、２６５頁、１９５１年）によって、フラクションの
蛋白質含量を分析した。濃縮フラクションを集め、凍結
乾燥し、ついでＰＢＳ（リン酸塩緩衝生理的食塩水、 p
Ｈ7.４）５００〜７００μl に再懸濁した。ＰＯＴ１選
択下（炭素源としてグルコース）発育した細胞株Ｅ−１
１−３Ｃ中の形質転換細胞ｐ１１７−２は、培地でＰＤ
ＧＦ様物質のかなり高水準を生じることが期待され、そ
こで濃縮なしでＰＢＳに対し培地を透析後分析した。形
質転換細胞ｐＶＳαｍ、ｐＶＳ２αｍ、ｐＶＳＢｍ、ｐ
ＭＰＯＴ２からの培地試料を、ＣＭ−セファデックスに
吸着し、１Ｍ NaCl で１Ｍ酢酸、 pＨ4.５に溶出するこ
とにより濃縮した。濃縮培地を0.１Ｍ酢酸、 pＨ７に対
し透析し、濃縮物中のＰＤＧＦ様物質の量をＥＬＩＳＡ
で決定した。 【００６２】Ｂ．酸素結合イムノソルベントアッセイ
（ＥＬＩＳＡ）によるＰＤＧＦ様物質の検出 酵母形質転換細胞によるＰＤＧＦ様物質の表現をＥＬＩ
ＳＡでしらべ、精製ヒトＰＤＧＦで展開した標準曲線と
比較することにより定量した（ライネス、ロス、上
記）。典型的標準曲線は次のようにしてつくった。精製
したヒトＰＤＧＦ、ＰＢＳ中2.５ nｇ／ｍl を、イムロ
ンII（ダイナテク・ラボラトリーズ社）９６ウエルマイ
クロタイタープレート（１００μl ／ウエル）と共に４
℃で一夜培養した。このコーティング溶液を除き、ＰＢ
Ｓ中の0.１％ラビットアルブミン１００μl ／ウエルを
加え、プレートを３７℃で一時間培養した。精製ＰＤＧ
Ｆ試料（0.１〜４０ nｇ／ｍl ）を、0.０５％トイン２
０と１ｍｇ／ｍl ラビットアルブミン（ＲＳＡ）を含む
ＰＢＳ中の山羊anti−ＰＤＧＦＩｇＧ（５μｇ／ｍl ）
と共に別々に培養した。マイクロタイタープレートを0.
９％ NaCl 、0.０５％トイン２０で５回洗い、かわか
し、各試験溶液１００μl をマイクロタイターウエルに
加え、３７℃で２時間培養した。前述のようにプレート
を洗い、0.０５％トイン２０と１ｍｇ／ｍl ＲＳＡを含
むＰＢＳ中で１対１０００にうすめたペルオキシダーゼ
抱合ブタ抗山羊ＩｇＧ（タゴー社）を３７℃で２時間で
加えた。プレートを前述のように洗い、0.０１２％過酸
化水素 ( H2O2 ) を含む新しくつくった0.０４％ｏ−フ
ェニレンジアミン（１００μl ／ウエル）を室温で５０
分で加え、４Ｎ H2SO4 (５０μl ／ウエル）を加えるこ
とにより反応を５０分で止めた。ダイナテクプレートス
キャナーを使い、４９２ｎm の吸光度を測定した。各試
験点は３回測定し、平均±標準誤差としてプロットし
た。酵母培地のＣ−８溶出液および未濃縮培地試料をＰ
ＢＳでうすめ、記載のように分析し、ＰＤＧＦ標準曲線
と比較した。表２は代表的な一連の実験の分析結果のま
とめである。図１３は測定したＣ−８溶出液試料容量範
囲のＥＬＩＳＡを示し、精製ＰＤＧＦからの標準曲線と
比較した用量−応答曲線を形成している。ＭＰＯＴ構築
物に対する生のＥＬＩＳＡデータは示してないが、図１
５と図１６に示したようにラジオレセプター及びマイト
ジェネシスアッセイデータに合体してある。 【００６３】Ｃ．ＰＤＧＦに対するラジオレセプターア
ッセイ（ＲＲＡ） ＰＤＧＦに対するラジオレセプターアッセイ（ボウエン
−ホープ、ロス、ジャーナル・バイオロジカル・ケミス
トリー、２５７巻、５１６１頁、１９８２年）は、酵母
中の生物学的活性ＰＤＧＦ様物質の検出に特異な敏感な
（0.２〜２ｎg ／ｍl ＰＤＧＦ）方法である。このアッ
セイでは、ＰＤＧＦ様物質が、細胞表面ＰＤＧＦ受容体
上の結合位置に対し精製した放射性標識125 Ｉ ＰＤＧ
Ｆと競争する能力を試験する。結果を精製した未標識Ｐ
ＤＧＦで得られる標準曲線と比較して解釈する。他のア
ッセイ法（たとえばＥＬＩＳＡ）で得られた結果との比
較は、結合した物質の定量の他に受容体／配位子相互作
用の強さを示す。アッセイは次のように行なう。コスタ
ール２４ウエルクラスタートレー中の1.５×１０4 細胞
／２cm2 培養ウエルを、１％ヒト血漿誘導血清（ＰＤ
Ｓ）で補足したダルベッコス変性イーグルズ培地（ＤＭ
ＥＭ）中で平板培養することにより、二倍体ヒト繊維芽
細胞のサブ集密的細胞単層をつくる。培養物を氷トレー
上にセットし、氷冷結合リンス（２５ mＭ ＨＥＰＥＳ
で pＨ7.４に緩衝し、0.２５％ＢＳＡを補足したハムの
培地Ｆ−１２）で一度すすぐ。結合培地中の試験物質１
ｍl ／ウエルを加え、培養物を冷却室で振とうプラット
ホーム上で３〜４時間培養した。トレーを氷上に置き、
吸引し、冷結合リンスで一度すすぎ、0.５ｎg ／ｍl
125 Ｉ−ＰＤＧＦを含む１ｍl ／ウエル結合培地と上記
のように１時間培養する。結合リンスの４回すすぎで標
識付けを終わらせ、可溶化緩衝液で抽出することにより
細胞会合した125 Ｉ−ＰＤＧＦを決定する。０、0.０
５、0.１、0.２、0.４、0.８ｎg ／ｍl の精製ＰＤＧＦ
を使い標準曲線を得、試験試料をこれらの値と比較す
る。酵母Ｃ−８溶出液および１×培地試料に対しＲＲＡ
で得た結果を表３に示す。 【００６４】さらに、プラスミドｐＶＳαｍ、ｐＶＳ２
αｍ、ｐＶＳＢｍ、ｐＭＰＯＴ２を含む酵母形質転換細
胞からのＣＭ−セファデックス培地濃縮物によるＰＤＧ
Ｆ受容体結合を、本物のＰＤＧＦと比較した。図１５に
示したように、結果を精製未標識ＰＤＧＦで生じた標準
曲線と比較することにより解釈した。ｖ−sis 構築物で
形質転換した培養物からの培地は、ＰＤＧＦ受容体への
結合に対し125 Ｉ−ＰＤＧＦと競争することがわかる。
ｐＭＰＯＴ２で形質転換した酵母培地は、受容体結合に
対し放射性標識ＰＤＧＦと競争しない。 【００６５】Ｄ．マイトジェネシスアッセイ 培養においてＤＮＡ合成と細胞発育を刺激するＰＤＧＦ
の能力は、その定義と発見の基礎であった。ＰＤＧＦに
応答する培養細胞のＤＮＡ中に 3Ｈ−チミジンを合体す
ること（ライネス、ロス、メソドロジー・イン・エンチ
モロジー、１０９巻、印刷中）は、酵母中に生じるＰＤ
ＧＦ様分子の生物学的活性を示す好ましい方法である。
１０ mＭ酢酸中の試験試料（１００μl ／ウエル）を、
２cm2 コスタール２４−ウエル培養皿中のマウス３Ｔ３
細胞の静止培養物（１ｍl 中２〜３×１０8 細胞／ウエ
ル）に加える。４〜５日細胞を１０％血清中で平板培養
し、培地をこかつ (deplete)させることによって、静止
試験培養物を得ることができる。試験試料を２０時間で
ウエルから除去し、２μＣｉ／ｍl の〔３Ｈ〕−チミジ
ンと５％（容量／容量）子牛血清を含む新しい培地0.５
ｍl ／ウエルでおきかえる。３７℃でさらに２時間培養
後、培地を吸引し除き、ウエルを氷冷５％ＴＣＡ１ｍl
で２回洗い、混合し0.２５Ｎ NaOH 0.８ｍl 中でＴＣＡ
−不溶物質を可溶化し、５ｍl アクアゾル中のこの溶液
0.６ｍl を液体シンチレーションカウンターで数えるこ
とにより、細胞を収穫する。対照ウエル（１０ mＭ酢酸
のみ１００μl ）以上の倍刺激を決め（ふつうは３０〜
５０倍最大刺激）、精製ＰＤＧＦ調製物を使って得た標
準曲線と比較する。 【００６６】表３は酵母中に生じたＰＤＧＦ様物質に対
するマイトジェネシスアッセイで得た結果を示し、上記
アッセイ法によって測定したＰＤＧＦ様物質の活性を比
較してある。図１４はｐ１１７−２の形質転換Ｅ１１−
３ＣおよびｐＶＳα形質転換Ｅ８−１１Ｃからの濃縮培
地により引出されたマイトジェン応答を示し、精製ヒト
ＰＤＧＦで得たものと比較してある。 【００６７】 【表３】表 ３ ｎｇ／ｍｌＰＤＧＦ μg/ml 調 製 物 形質転換細胞 蛋白質 ELISA RRA マイトシ゛ェネシス C-8 溶出液 pVSα/E8-11C 2.00 188 4.6 102 pVS2 α/E8-11C 16.00 864 16〜97 310 p117-2/E11-3C 1.44 120 13.9 87 １×培地 p117-2/E11-3C − 4.2 0.18 2.5 【００６８】さらに、プラスミドｐＶＳαｍ、ｐＶＳ２
αｍ、ｐＶＳＢｍ、ｐＭＰＯＴ２を含む酵母形質転換細
胞からのＣＭ−セファデックス濃縮物により引出された
マイトジェン応答を、本物のＰＤＧＦで得たものと比較
した。図１６を参照すると、ｖ−sis 構築物で形質転換
した培養物からの培地は、静止３Ｔ３細胞による３Ｈ−
チミジンのとりあげを刺激した。上文からわかるよう
に、静止３Ｔ３細胞による３Ｈ−チミジンの取りこみ
は、マイトジェン刺激のしるしとされている。ｐＭＰＯ
Ｔ２で形質転換した酵母細胞からの培地は、マイトジェ
ン活性を示さなかった。示したデータから、ここで構築
した酵母細胞からの発育培地は、本物のヒトＰＤＧＦと
同一の生物学的活性を有することが明らかである。さら
に、これらの活性はＰＯＴ１選択下で発育したｐ１１７
−２形質転換細胞株Ｅ１１−３Ｃからの非濃縮（１×）
培地中で容易に検出できる。ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動およびゲル分別物質のつぎのマイトジェ
ネシスアッセイによって、ＶＳＢ調製物はさらに特徴づ
けられる。ゲルの３０キロダルトン領域からＶＳＢマイ
トジェン活性の９０％が回収される（図１７）。これは
この表現単位が著しく均一で同様に十分にプロセシング
された物質を生じることを示している。この意味で、Ｖ
ＳＢ蛋白質は全く不均一な上記のＶＳ２αおよびＶＳα
蛋白質よりすぐれている。さらに、ＶＳＢ物質は正の化
学誘引物質であり、ＰＤＧＦ生物学的活性の全スペクト
ルを有し得ることを示している。 【００６９】上記の通り、本発明の特別の具体化を例示
の目的で記載してきたが、本発明の精神と範囲から離れ
ることなく種々の変形を行なうことができる。したがっ
て本発明は特許請求の範囲による以外は制限を受けな
い。
因子の産生に関するものであり、更に詳細には真核生物
における生物学的に活性なＰＤＧＦ類似因子の発現に関
する。 【０００２】 【従来の技術】ヒトのＰＤＧＦ即ち血小板誘導生長因子
(platelet derived growth factor)は間葉誘導細胞に
ついて血清中の主要な有糸分裂促進因子タンパク質 (mi
togenic protein)であることが証明された。この事実は
平滑筋細胞、線維芽細胞及び神経膠細胞の培養物中での
細胞増殖又はＤＮＡ合成（細胞分裂の前提条件）を誘導
する血小板抽出物又は純化されたＰＤＧＦに関する数多
の研究報告に記載されている〔ロス (Ross) 等、PNAS,
71, 1207, 1974; コーラー及びリプトン (Kohlerand Li
pton), Exp. Cell Res., 87, 297, 1974; ウェスタマ
ーク及びウェストソン (Westermark and Westeson), Ex
p. Cell Res., 98, 170; 1976); ヘルジン(Heldin)等、
J. Cell Physiol., 105, 235, 1980);レーヌ及びロス
(Raines andRoss), J. Biol. Chem., 257, 5154, 198
2)〕。更にＰＤＧＦはマイトジェン (mitogen)として細
胞に応答する有効な化学的誘引物質である〔グロテンド
ルスト(Grotendorst)等，J. Cell Physiol., 113, 261,
1982; セパ (Seppa)等、J. Cell Biol., 92, 584, 19
82 〕。この場合はマイトジェンが走化性物質としても
作用する場合と一般的に異なる。ＰＤＧＦの有糸分裂促
進活性にもとづきＰＤＧＦは培養中の哺乳動物細胞の生
育のための限定された培地の重要成分として有用であ
り、動物細胞生物学の研究に多用される価値ある研究用
試薬となっている。 【０００３】生体内においてＰＤＧＦは血小板のアルフ
ァ顆粒内に貯えられる循環物質であることが普通であ
る。動脈内皮の裏面が損傷されると露出された結合組織
への血小板の付着が起ってその顆粒群が放出される。放
出されたＰＤＧＦは線維芽細胞と平滑筋細胞とを傷害個
所へ走化的に誘引し、創傷回復過程の一環として創傷部
における細胞増殖を誘導すると考えられる〔ロス及びグ
ロムセット (Ross and Gromset), N. England Journal
of Medicine, 295, 369, 1976 〕。創傷に対する上記の
応答の一部分としてＰＤＧＦは血小板から放出されてア
テローム性動脈硬化症の進行域の拡大の原因をなす〔ロ
ス及びグロムセット、前掲報文〕ことが推定されている
が該アテローム性動脈硬化症は心筋梗塞及び大脳梗塞の
主原因のひとつである。アテローム形成の予防と治療と
のための方策は過去において該病気の危険要因の減少
化、例えば高血圧症の患者における血圧低下及び高コレ
ステロール血症の患者におけるコレステロールの高値の
低下の方向に集中させることにあった。 【０００４】近時の諸研究の結果ＰＤＧＦ及びシミアン
腫瘍ウィルス (simian sarcoma virus (SSV)〕即ち急性
の形質転換レトロウィルス、の推測された形質転換タン
パク質を包含する二種のタンパク質鎖のひとつが同じか
又は近縁の細胞遺伝子 (cellular genes) から生成され
たらしいことが示された。特にＰＤＧＦの部分的アミノ
酸配列のコンピューターによる分析によりＳＳＶの遺伝
子にもとづく産生物 (gene product) 、即ちｐ２
８sis 、との著しい相同が明かにされた〔ドリトル、ウ
ォターフィルド及びジョンソン (Doolittle, Waterfiel
d and Johnson)、前掲報文〕。更に最近の研究の結果ｐ
２８sis 及びＰＤＧＦは抗原性及び構造的類似性を示す
ことが例証された〔ロビンス (Robbins)等、Nature，３
０５，６０５，１９８３；ニマン (Niman), Nature，３
０７，１８０，１９８４）。 【０００５】既往の研究企画、例えばデバル (Devare)
等 (Cell, ３６，４３，１９８４）が総括した企画によ
り形質転換微生物体の中でｖ−sis 遺伝子が発現された
けれどもデバル等はマイトジェン物質産生に成功するに
至らなかった。最近或る研究者等はＥ．コリ（Ｅ．col
i）中でｐ２８sis が融合タンパク質として産生される
ことを記載した〔ワング (Wang) 等、J. Biol. Chem.,
２５９，１０６４５，１９８４〕。該タンパク質はＰＤ
ＧＦ受容個所 (receptor sites) への結合についてＰＤ
ＧＦと比肩するようにみえる。ＳＳＶで形質転換された
ネズミの細胞はＰＤＧＦに類似のマイトジェン活性を示
すことが証明された〔デュエル (Deuel)等，Science,２
２１，１３４８，１９８３；オーエン (Owen) 等、Scie
nce,２２５，５４，１９８４〕けれども該活性がＳＳＶ
（即ちｐ２８sis ）から産生された遺伝子によるのか否
か明かでない。更にＳＳＶ以外の各種のウィルスにより
形質転換された細胞は培地中へＰＤＧＦ様のマイトジェ
ンを産生する〔ボウエン−ポープ (Bowen-Pope) 等，Ｐ
ＮＡＳ，８１，２３９６，１９８４〕。 【０００６】天然源のＰＤＧＦは出発原料としてのヒト
の血漿又は血小板から単離され得るけれども出発原料の
入手が局限されていることにも部分的原因があるので複
雑で高費用を要する工程となる。更に他の血清成分から
高収率でＰＤＧＦを純化することは困難であるがそれは
量的に著しく少ないことと生化学的諸性質とにもとづく
のである。しかもヒトの血液から導かれた製品の治療上
の使用は例えば肝炎ウィルス、サイトメガロウィルス又
は後天性免疫不全症候群（Aquired Immune Deficiency
Syndrome（ＡＩＤＳ）の原因物質による汚染にもとづく
病気の伝播の危険を伴う。傷害の治療のために線維芽細
胞及び平滑筋細胞の増殖を要するが該傷害の治療の際の
ＰＤＧＦの臨床的応用性にかんがみ及び哺乳動物細胞の
培養のための規定された培地中の重要成分としてのＰＤ
ＧＦの価値にかんがみ、マイトジェン活性をもつ真正の
ＰＤＧＦに類似するタンパク質分子の有用量の製造は明
かに極めて貴重である。 【０００７】加うるに比較的大量のＰＤＧＦの製造能力
は新形成過程におけるｖ−sis タンパク質、即ちｐ２８
sis 、の推定上の役割を明かにするための有用な手段で
ある。更に動脈壁のインタマル層（intamal layer)内の
平滑筋細胞群の局所的集積はアテローム性動脈硬化域の
拡大に対する中心的要因である〔ロス及びグロムセッ
ト、前掲報文〕。従ってアテローム性動脈硬化症の予防
及び治療の一方策は平滑筋細胞の増殖の抑制にある。Ｐ
ＤＧＦの大量生産能はアテローム性動脈硬化症患者にお
けるＰＤＧＦの生体内活性の阻止又は妨害に対する阻止
剤の開発のために、又は特異的アプローチの計画のため
に有用である。 【０００８】 【発明の開示】簡言すると本発明は真核生物細胞内で生
物学的に活性なＰＤＧＦ類似因子の発現及び分泌を指令
し得るＤＮＡ構成体を開示する。該ＤＮＡ構成体は転写
促進因子（転写プロモーター）を含有しており、該プロ
モーターはその下流に“ＰＤＧＦと実質上同じ構造及び
（又は）ＰＤＧＦと同様の有糸分裂促進活性を有するタ
ンパク質と、真核生物細胞からの該タンパク質の分泌を
指令し得る信号配列をコードする遺伝子”を伴う。該遺
伝子は生物学的活性をもつタンパク質をコードするｖ−
sis 遺伝子であるか又は“シミアン腫瘍ウィルスのｖ−
sis 遺伝子の誘導体或はその部分的誘導体”である。更
にｖ−sis 遺伝子の誘導体はＰＤＧＦのＢ鎖と実質上相
同であるｖ−sis 遺伝子の一部分であり得る。加うるに
該遺伝子は生物学的活性をもつタンパク質をコードする
ＰＤＧＦに対するヒトのｃＤＮＡ遺伝子又はその部分的
遺伝子であり得る。 【０００９】本発明の他の態様として真核生物細胞中に
生物学的活性ＰＤＧＦ類似因子の発現及び分泌を指令し
得るＤＮＡ構成体を真核生物宿主の中へ導入することに
より生物学的活性ＰＤＧＦ類似因子を製造する方法を開
示する。該ＤＮＡ構成体は転写プロモーターを含有して
おり、該プロモーターはその下流に“ＰＤＧＦと実質上
同じ構造及び（又は）ＰＤＧＦと同様のマイトジェン活
性を有するタンパク質と、真核生物細胞からの該タンパ
ク質の分泌を指令し得る信号配列をコードする遺伝子”
を伴う。真核生物宿主の中へＤＮＡ構成体を導入した後
に本発明の方法は該真核生物宿主を適切な培地中で生育
させて該真核生物宿主から遺伝子にもとづくタンパク質
製品を単離する。本発明は又かようなＤＮＡ構成体を有
する形質転換された真核細胞宿主をも開示する。 【００１０】本発明は更に真核生物細胞中へ生物学的活
性ＰＤＧＦ類似因子の発現及び分泌を指令し得るＤＮＡ
構成体で形質転換された真核生物細胞によって発現され
た生物学的活性ＰＤＧＦ類似因子を有する細胞群を恒温
培養することによる哺乳動物細胞群の生長促進方法を提
供する。該ＤＮＡ構成体は転写プロモーターを含有して
おり、該プロモーターはその下流に“ＰＤＧＦと実質上
同じ構造及び（又は）ＰＤＧＦと同様の有糸分裂促進活
性を有するタンパク質と、真核生物細胞からの該タンパ
ク質の分泌を指令し得る信号配列をコードする遺伝子”
を伴う。本発明の一具体例において真核生物細胞は酵母
細胞であってよく、ＤＮＡ構成体は染色体外の要素であ
ると言う方が適切である。本発明の他の特徴的態様は下
文及び添付図面を参照して明かとなろう。 【００１１】 【発明の実施のための最良の形態】本発明の説明に先立
ち本明細書中の用語の定義について述べることが理解の
助けとなるであろう。ポリペプチド ： これはアミノ酸のポリマーである。解読枠 (Reading Frame) ： これはアミノ酸の非中断延
長 (uninterrupted stretch)をコードするヌクレオチド
コドン配置である。 mＲＮＡの翻訳に際し正常な解読枠
( リーディングフレイム) が維持されねばならない。例
えば配列ＧＣＵＧＧＵＵＧＵＡＡＧはＧから始めるか、
Ｃから始めるか又はＵから始めるかに依存して３種のリ
ーディングフレイム又は相 (phases) へ翻訳され得るの
で３種の異なるペプチド製品を生成する。テンプレート
(template) の翻訳はＡＵＧコドンにおいて始まり、特
定のアミノ酸に対するコドンについて継続し、翻訳終了
コドン（複数）のうちのひとつにおいて終止する。 【００１２】コード配列： これはＤＮＡ配列であっ
て、適当なリーディングフレイムの中にあり、タンパク
質のアミノ酸群を直接コードする。相補的ＤＮＡ ：又はｃＤＮＡと記される。これは mＲＮ
Ａテンプレート中に存在する配列から酵素化学的に合成
されたＤＮＡ分子又はＤＮＡ配列である。分泌信号配列 ： これは信号ペプチド (signal peptid
e) をコードする遺伝子の部分である。信号ペプチドは
分泌タンパク質内のアミノ酸配列であって細胞の分泌経
路の中へその転置を信号する。信号ペプチドは一般にタ
ンパク質の開始点( アミノ末端) に存在していて２０〜
４０個のアミノ酸の鎖長をもちその中央部に９〜１０個
の疎水性アミノ酸の伸長鎖を有する。しばしば信号ペプ
チドは分泌過程においてタンパク質からタンパク分解反
応によって開裂される。 【００１３】細胞表面受容体： これは細胞表面におけ
るタンパク質分子であって細胞表面に接近する分子と特
異的に相互反応、即ち結合する。該受容体が同系の分子
と結合すると細胞の生理に特異的変化を与える。マイトジェン ： これは細胞に有糸分裂を起こさせるよ
うに刺激する分子である。有糸分裂は無性的体細胞分裂
であって２個の娘細胞を与え、各娘細胞は親細胞と同じ
数の染色体を有する。形質転換 ： これは純化ＤＮＡの導入により受容細胞又
は受容微生物の遺伝子型を安定に相続可能に変化させる
過程である。これは受容微生物の表現型の変化にもとづ
きその典型的検出が可能である。転写 ： これは mＲＮＡテンプレートを構造遺伝子から
産生させる過程である。 【００１４】発現： これは構造遺伝子を用いて開始さ
せてポリペプチドを製造する過程であり、転写と翻訳と
の組合せの過程である。発現ベクターはベクター上に存
在する遺伝子の発現を可能にするように設計された構造
からみちびかれたプラスミドである。プラスミド ： これは完全な“レプリコン (replicon)
”を含有する染色体外の２本鎖ＤＮＡ配列であって該
プラスミドは宿主細胞の中で複製される。プラスミドが
単細胞 (unicellular)の微生物体内に置かれるとこの微
生物の特性はプラスミドのＤＮＡ配列の発現の結果とし
て変化する。即ち形質転換される。例えばテトラサイク
リン耐性 ( tetR ）に対応する遺伝子をもつプラスミド
は形質転換前にテトラサイクリン感受性であった細胞を
テトラサイクリン耐性へ形質転換させる。 【００１５】酵母プロモーター： これは転写を促進す
る酵母の遺伝子から上流に向うＤＮＡ配列である。生物学的活性 ： これは生物学的関係にある（即ち微生
物体内又は試験管内での複写における）分子によって与
えられた活性の或る官能又は或る一組（セット）の活性
である。ＰＤＧＦの場合には該生物学的活性は細胞表面
受容分子への結合、応答型細胞の走化性の導入又は有糸
分裂性の導入を包含する。既述の通りヒトの血小板から
導かれた生長因子（ＰＤＧＦ）は血清中の主要な有糸分
裂促進因子タンパク質であることが証明されている。Ｐ
ＤＧＦは２種のポリペプチド鎖、即ちＡ鎖及びＢ鎖から
成ることが既知であってこれらは二硫化結合によって相
互に保持されて生物学的活性分子を形成している。該Ａ
鎖及びＢ鎖の夫々単独は有糸分裂能を発揮しないらしい
（レーヌ及びロス、前掲報文）。そして還元型ポリペプ
チドの再酸化による活性再構成の試みは未だ成功してい
ない。最近Ｂ鎖のアミノ酸配列はｖ−sis 遺伝子産生物
の一部分、即ちｐ２８sis 、と実質的に相同であること
が示された（ドリトル等，Science, 221, 275, 1983;ウ
ォターフィルド等、Nature，304, 35, 1984;及びジョン
ソン等、Embo, 3, 921, 1984) 。これらの２種タンパク
質の相同性はそれらが同じか又は近縁の細胞遺伝子から
みちびかれたものであることを強く示唆する。 【００１６】生物学的活性のＰＤＧＦはＡ鎖及びＢ鎖の
等モル量を含むことが既知であること、及びＥ．コリ中
のｖ−sis 配列を発現させようとした既往の試みは有糸
分裂促進物質を産生しなかったことを考え合せるならば
微生物体中でＰＤＧＦ遺伝子の部分に相同なｖ−sis 遺
伝子の部分を単に発現させても有糸分裂促進活性を呈す
る分子を与えるに至ることは期待されないであろう。し
かしながら本発明は該上記の既往の企画とは対照的に、
発現された分子群がＰＤＧＦのＢ鎖に一そう近縁である
ように、非相同的配列を有しないｖ−sis 遺伝子又はそ
の部分的遺伝子の発現を企図したのである。更に本発明
の発現系は真核生物の分泌経路を経て遺伝子にもとづく
製品を産生させるように企図したのである。かように企
図したことによって発現されたタンパク質分子群は生物
学的活性を呈するように正常に処置され集積され得る。
事実、本発明は、従来技術における努力とは対照的に、
生物学的活性を有するＰＤＧＦ類似因子の分泌をもたら
したのである。 【００１７】ＰＤＧＦは活性型である場合においては熱
安定性タンパク質であって２８０００〜３１０００ダル
トンの不均一のサイズをもつスペシイズ (heterogenous
ly sized species) から構成され、夫々のスペシイズの
すべてがＤＮＡ合成を刺激する活性をもつ〔レーヌ及び
ロス、前掲報文；デュエル等、J. Biol. Chem., 256,88
96, 1981; アトニアデス (Antoniades),ＰＮＡＳ，78,
7314, 1981〕。分子量２７０００；２８５００；２９
０００及び３１０００ダルトンを有する各スペシイズが
単離され試験されたがその場合に該スペシイズは比較さ
れ得る有糸分裂促進活性及びアミノ酸組成を有すること
が見出された（レーヌ及びロス、前掲報文）。更に該ス
ペシイズは広汎なトリプティックペプチド相同性を示し
た。該スペシイズにおける僅かな寸法変化は炭水化物組
成及びタンパク分解における差異に主としてもとづくも
のである。 【００１８】ＰＤＧＦの研究の際に該ＰＤＧＦは血小板
に富むヒトの血漿から充分に純化されたが、ＰＤＧＦは
２種のポリペプチド鎖即ちＡ鎖（１４０００ダルトン）
及びＢ鎖（１６０００ダルトン）から成り、これらは相
互にジスルフィド結合して生物学的活性二量体分子を形
成することは既述した通りである（レーヌ及びロス、デ
ュエル等、アントニアデス、前掲報文）。文献記載のＰ
ＤＧＦという名称は確定されていない（ドリトル等、ウ
ォターフィルド等、レーヌ及びロス、ジョンソン等、前
掲報文）。ジョンソン等（前掲報文）の命名法が採用さ
れたが該純粋のＰＤＧＦ中に見出された２種のペプチド
を“Ａ鎖”及び“Ｂ鎖”と呼んだ。Ｂ鎖はｐ２８sis と
相同であって以前は“ペプチドＩ”と呼ばれ〔ウォター
フィルド等、前掲報文〕又は“１ａ”と呼ばれた〔ドリ
トル等、前掲報文〕。Ａ鎖は以前は“ペプチド II ”
〔ウォターフィルド等、前掲報文〕又は“２ａ”〔ドリ
トル等、前掲報文〕と呼ばれた。ＰＤＧＦの部分的アミ
ノ酸配列からみちびかれたデータは該２種のポリペプチ
ド鎖（Ａ鎖及びＢ鎖）が或る相同性を呈することを示し
ている〔ドリトル等、前掲報文；ウォターフィルド等、
前掲報文；ジョンソン等、前掲報文；アントニアデス及
びハンカピラ (Hunkapiller), Science, 220,963, 1983
〕。Ａ鎖及びＢ鎖の夫々単独は有糸分裂促進活性を現
わさないらしく還元型ポリペプチドの再酸化による活性
再構成の企画は成功しなかった〔レーヌ及びロス、前掲
報文〕。 【００１９】既述の通りｖ−sis 遺伝子はシミアン腫瘍
ウイルス（ＳＳＶ）の形質転換された遺伝子である。該
ｖ−sis 遺伝子がクローン化されそのＤＮＡ配列が決定
された〔デバル等、ＰＮＡＳ，79, 3179, 1982；デバル
等, ＰＮＡＳ，80, 731, 1983 〕。この配列を分析した
結果、ｐ２８sis と呼ばれる２８０００ダルトンのタン
パク質をコードし得る開放読解枠 (open reading fram
e) が解明された。次に、このタンパク質はＳＳＶ感染
細胞の中に存在することが同定された〔ニマン、前掲報
文；ロビンス、前掲報文〕。ｖ−sis 遺伝子産生物、ｐ
２８sis 、の予測されたアミノ酸配列はＰＤＧＦのＢ鎖
の部分の真正のアミノ酸配列と高度に相同性であること
が見出された〔ジョンソン、前掲報文〕。ＰＤＧＦのＢ
鎖とｖ−sis 遺伝子産生物との相同はｐ２８sis のアミ
ノ酸６７、即ちセリン、において開始されアミノ酸１７
５におけるスレオニン残基に至るまでおよそ１０９個の
アミノ酸に対応して継続する。ｐ２８sis のＢ鎖相同域
に先行し及び後続するアミノ酸配列は完全 (mature) な
ＰＤＧＦのＡ鎖及びＢ鎖のいずれにも相同でない〔ジョ
ンソン等、前掲報文〕。更にＰＤＧＦ及びｐ２８sis は
類似の抗原性のものであることが証明された〔ニマン、
前掲報文；ロビンス、前掲報文〕。ｖ−sis 遺伝子産生
物、ｐ２８sis 、は約２２５個のアミノ酸をもつタンパ
ク質であってＳＳＶ感染細胞中でタンパク分解によって
処理されると約２００００ダルトンのタンパク質（ｐ２
０sis ）を与える〔ニマン、前掲報文；ロビンス、前掲
報文〕。該２００００ダルトンタンパク質はＰＤＧＦに
対する抗血清を用いて免疫学的に沈降し得る。 【００２０】上記の通り原核生物にｖ−sis 配列を発現
させる既往の企画は生物学的活性物質を産生させなかっ
た。更にｖ−sis 遺伝子製品ｐ２８sis 並びにＰＤＧＦ
それ自体は分泌された哺乳動物のタンパク質である。生
物学的活性物質の製造の達成のために本発明はｖ−sis
遺伝子及びｖ−sis 遺伝子誘導体の発現のための真核生
物細胞の分泌径路を利用する。真核生物細胞からのｖ−
sis 遺伝子製品の発現及び分泌は本来の活性ある構造を
もつ分子群を与える処理及び構成を可能とする。大部分
の真核生物の分泌径路は相似であると信ぜられる。特に
哺乳動物細胞と酵母細胞とはその分泌径路が良好に特性
化されて相同である。発現されたポリペプチド上の分泌
信号配列の存在は真核生物における重要な要素であるが
それは分子を分泌径路へ導入し、それによって正常な構
成及び処理へみちびく役目を果たすからである。適切な
転写プロモーターと分泌信号配列とを利用する条件の下
であれば一般にいかなる真核生物もｖ−sis 遺伝子産生
物を生物学的活性形において発現し分泌することができ
る。 【００２１】取扱容易で良好に特性化される真核生物は
酵母細胞である。これらの理由により本発明における適
切な真核生物細胞のモデルの一例として酵母を選択し
た。従ってＰＤＧＦのＢ鎖に相同な１０９アミノ酸をコ
ードするｖ−sis 遺伝子及びそのフラグメント（断片）
を生物学的活性のＰＤＧＦ類似因子の発現を指令し得る
酵母プロモーターを含有する酵母の染色体外要素の中へ
挿入した。本発明に従い酵母プロモーターはその下流に
実質上ＰＤＧＦと同じ構造及び（又は）同じ有糸分裂促
進活性を有するタンパク質をコードするｖ−sis のフラ
グメントを伴う。ＰＤＧＦと実質上同じ構造及び（又
は）実質上同じ有糸分裂促進活性を有するタンパク質を
コードする遺伝子はシミアン腫瘍ウイルス（ＳＳＶ）の
ｖ−sis 遺伝子又はｖ−sis 遺伝子の誘導体又はそれら
の部分的遺伝子を包含するか又はＰＤＧＦに対応するヒ
トのｃＤＮＡ遺伝子又はその部分的遺伝子を包含する。
詳細にはＰＤＧＦのＢ鎖に実質上相同なポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列が好適である。染色体外要素の中
で使用される遺伝子は標準的な組換えＤＮＡ技法を用い
て単離され得る。 【００２２】ヒトのＰＤＧＦのｃＤＮＡ遺伝子はハイブ
リダイゼーションプローブ (hybridization probe)とし
てｖ−sis 遺伝子又はそのフラグメントを用いることに
よりメッセンジャーＲＮＡの適切な給源からつくられた
ヒトｃＤＮＡライブラリイから取り出され得る。 mＲＮ
Ａの好適給源はヒトの臍帯静脈内皮細胞である。これら
の細胞群は短時間だけインビトロで培養し得られ、培地
中へＰＤＧＦを分泌することが公知である〔ジコルレト
(DiCorleto)及びボウエン−ポープ、ＰＮＡＳ, ８０，
１９１９，１９８３〕。該ＰＤＧＦをコードする遺伝子
としてのｃＤＮＡ遺伝子の同定はＤＮＡ配列法によって
遂行され得る。酵母中において使用され得るプロモータ
ーは酵母アルファ因子（ＭＦα１）プロモーター及び酵
母トリオースホスフエートイソメラーゼ（ＴＰＩ）プロ
モーターを包含する。他の酵母遺伝子、例えばアルコー
ルデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ１）、アルコールデヒド
ロゲナーゼ２（ＡＤＨ２）からも又プロモーターを得る
ことができる。 【００２３】本明細書における構成は次の通りである。
即ちｖ−sis 遺伝子産生物を酵母細胞から培地の中へ分
泌させる。このことは酵母の交配フエロモンアルファ因
子（yeast mating pheromone alpha-factor)の分泌信号
配列の使用によって達成される〔クルジャン及びヘルス
コビツ (Kurjan and Herskowitz), Cell, 30, 933, 198
2,ユリウス (Julius) 等、Cell, 36, 309, 1984;及びブ
レイク (Brake)等、ＰＮＡＳ, 81, 4642, 1984〕けれど
も他の分泌信号を使用してもよい。 mＲＮＡの効果的な
転写の終了及びポリアデニル化を確実化するために酵母
のターミネーター配列、例えばトリオースホスフェート
イソメラーゼターミネーターを添加した〔アルベル及び
カワサキ (Alber and Kawasaki), J. Molec. Genet. Ap
pl. 1, 419, 1982〕。 【００２４】本発明の目的である遺伝子を有する適切な
ＤＮＡフラグメントが同定されたならば、それを適切な
プロモーター及び分泌信号配列に結合させる。ＤＮＡフ
ラグメントの結合方法は充分に記述されていて〔マニア
チス (Maniatis) 等、Molecular Cloning, A Laborator
y Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 〕当
業界の技術者によって良好に遂行される。ｖ−sis 発現
構造体の製造の後に該構成体を酵母の発現ベクターの中
へ挿入する。複製のオリジン（源）及び選択され得るマ
ーカー（目印）を有する複製用プラスミドＹＥｐ１３、
即ちＬＥＵ２遺伝子、を初期発現構成体として使用し
た。選択マーカーＬＥＵ２は酵母細胞内でロイシン合成
能を欠失しているのでロイシン不添加生育培地上での生
育能によりＬＥＵ２プラスミド含有細胞の陽性選択を可
能とする。これらの構成体は或る程度の有糸分裂促進活
性を有する産生物の発現を指令するけれども培養物にお
いてより多い有糸分裂促進活性を生ずるために宿主細胞
内で増加された安定性を保つ発現ベクターを使用するこ
とが好ましい。 【００２５】この点において適切な酵母の発現ベクター
はプラスミドｐＣＰＯＴ及びｐＭＰＯＴ２であり、これ
らは解糖酵素トリオースホスフエートイソメラーゼをコ
ードするシゾサッカロミセスポムベ遺伝子 (Schizosacc
haromyces pombe gene) （ＰＯＴ１遺伝子）を包含す
る。ＰＯＴ１遺伝子を包含することはこの宿主細胞の中
に存在する対応遺伝子欠失を補足する能力にもとづき適
切な宿主細胞の中のプラスミドの安定保持を確実にす
る。更にＭＦα１プロモーターをサツカロミセスセレビ
ジエＴＰＩプロモーターによって代替するがこれは転写
と発現とを更に増加させるためである。ＴＰＩプロモー
ター、アルファ因子分泌信号配列、ＰＤＧＦに対応する
ｖ−sis 遺伝子又はヒトのｃＤＮＡ遺伝子の適切なセグ
メント、及び適切なベクターの中のＴＰＩターミネータ
ーを導入したＤＮＡ構成体が調製された後に該ＤＮＡ構
成体をＴＰＩを欠失した酵母宿主の中へ形質転換させ
る。酵母を形質転換させる操作は文献によって周知であ
る。 【００２６】形質転換した酵母細胞は、ｐＣＰＯＴベク
ター使用の場合に、グルコース含有の常用の複合培地上
での生育によって選択され得る。慣用の培地例えばＹＥ
ＰＤ（グルコース２０ｇ、バクト−ペプトン２０ｇ、酵
母抽出物１０ｇを１リットル中に含有する）を使用して
よい。選択されるとｖ−sis 発現構造体を含む形質転換
体を慣用の複合培地上で静止期まで生育させ、細胞群を
分離し、培地を濃縮する。真正のヒトのＰＤＧＦは高度
にカチオン性で疎水性のタンパク質である〔レーヌ及び
ロス、前掲報文；アントニアデス、前掲報文；デユエル
等、１９８１、前掲報文〕ことに注意を払い、想定上の
酵母産生物は類似の特性を有することが期待され、それ
を疏水性クロマトグラフィマトリクス例えばＣ８−セフ
アロース〔フアルマシアフアインケミカルスＡＢ(Pharm
acia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden)〕上で濃縮
した。 【００２７】多数種の試験法を使用した結果ｖ−sis 誘
導体を発現した酵母培養からの生育培地は真正のヒトの
ＰＤＧＦと同一の生物学的活性を有することが判明し
た。酵母以外の真核生物細胞の中の生物学的活性のｖ−
sis 誘導体の発現は適切な発現／規制信号の使用の下で
当業界の技術者によって達成され得る。ｖ−sis 配列の
発現を指令し得る転写プロモーターは特定の真核生物細
胞型の中における効率的及び（又は）規制的な発現を与
える能力に対応して選択される。細胞の分泌過程の中へ
ｖ−sis 遺伝子産生物を指令し得る信号配列は適切な細
胞型の中での作用に対応して選択される。他の有用な規
制信号、例えば転写終了信号、ポリアデニル信号及び転
写増強用配列は適切な細胞型の中でのそれらの作用に対
応して又選択され、その選択は当業技術者にとって明ら
かである。 【００２８】細胞培養技法は培養物中で生育する哺乳動
物細胞の多数及び多種におけるように過去数年の間にか
なりの進歩を遂げた。該進歩の中核は栄養要求量（即ち
ホルモン類及び生育因子類）に関する充分な理解である
〔バーネス及びサトウ (Barnes and Sato), Cell, 22,
649, 1980 〕。培養物中で生育し得る細胞の型はおおま
かに２群に分けられる。即ち正常型と形質転換型とであ
る。いわゆる“正常”細胞は一般に培養物中で不死であ
り、動物に注射されたときに腫瘍を形成せず、正常な二
倍体の核型を保持する。正常細胞は又培養物中で識別さ
れ得る性格の大部分をも保有する。正常細胞のカテゴリ
イに属する細胞は培養物中で制限された数の世代におい
て生育するのみであって“細胞ストレイン (cell strai
ns) ”又は“プライマリイ カルチュア (primary cult
ure)”と称される。或る正常細胞系は形質転換のすべて
の規準に合致しないけれども培養物中で不定に生育す
る。形質転換細胞は培養物中で生育して不死であり、典
型的には識別され得る表現型を喪失し、獲得された核型
異常を呈する。該形質転換細胞は独立的固定生育 (inde
pendent of anchorage for growth)をなし適宜の宿主動
物に注射された時に腫瘍を誘発する。このカテゴリイに
属する細胞はインビトロで生育してＰＤＧＦ受容体を持
ち、培養物中で本発明によるＰＤＧＦ類似因子に対して
反応する。 【００２９】下記の諸例を要約すると例Ｉはプラスミド
ｐＵＣ１３を複製するＥ．コリ中のｐＳＳＶ−１１のｖ
−sis サブクローンの構造を示す。例IIはＭＦα１プロ
モーター及び分泌信号配列に対するｖ−sis の結合を含
むプラスミドｐＶＳαの構造を示す。例 IIIはＰＤＧＦ
のＢ鎖に相同でないｖ−sis 遺伝子産生物、ｐ２
８si s 、の最初の６６アミノ酸を欠失させるために、一
本鎖バクテリオファージＭ１３を使用する技法にもとづ
きｖ−sis 遺伝子の最初の１９５塩基対のオリゴヌクレ
オチド指令欠失変異誘発を示す。得られたファージは正
しい欠失部を有していて m１１ｖｓ２αと命名された。
例 IV は例 II 及びIII に記載されたｖ−sis関連の構
造体の酵母複製ベクターＹＥｐ１３の中への導入及び酵
母ＴＰＩターミネーター配列の付加を示す。これに続い
てＶＳ２α配列をプラスミドｐＣＰＯＴの中へ挿入し、
かようにして宿主細胞内のプラスミドの安定保持を確実
にした。このプラスミドはｐ１１７−２と命名された。
本例はプラスミドｐＶＳＢの構造及び発現ベクターｐＭ
ＰＯＴ２の構造をも示す。例ＶはプラスミドＹＥｐＶＳ
α，ＹＥｐＶＳ２α、ｐ１１７−２及びコントロールプ
ラスミドｐ２７０及びｐＣＰＯＴを用いる酵母宿主細胞
の形質転換及びそれに続く転写分析を示す。例 VIはｖ
−sis 発現形質転換体を含有する培養物からの使用済み
の酵母生育培地の濃縮及びＥＬＩＳＡ、ラジオレセプタ
ー (radio-receptor) 及び有糸分裂促進性試験によるＰ
ＤＧＦ類似物質に対する分析を示す。上記のｖ−sis 関
連遺伝子にもとづく産生物を含有する該酵母生育培地は
真正のヒトのＰＤＧＦの生物学的活性と同一の生物学的
活性を有することが明らかに証明された。 【００３０】下記の諸例は例示のためであって本発明の
範囲を限定するものではない。 【００３１】 【例】他にことわらない限り、標準分子生物学的方法を
使った。制限エンドヌクレアーゼ及び他のＤＮＡ修飾酵
素（すなわちＴ4 ポリヌクレオチドキナーゼ、子牛アル
カリ性ホスファターゼ、クレナウＤＮＡポリメナーゼ）
はベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、ニュー・イン
グランド・バイオラブズ、ベリンガー−マンハイムまた
はコラボラチブ・リサーチから得たもので、他にことわ
らない限り製造業者の提案した通り使った。Ｍ１３ファ
ージ、ｐＵＣプラスミドベクター及び適当な宿主細胞株
はベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズから得た。Ｅ．
コリ培養物はダゲルト・エールリッヒの塩化カルシウム
法〔ジーン、６巻、２３頁、１９７９年）により形質転
換した。酵母培養物はベグズ（ネーチャー、２７５巻、
１０４頁、１９７８年）に記載のように形質転換した。
プラスミド及びＭ１３複製型分子（ＲＦ）ＤＮＡはビル
ンボイム及びドリーの方法（ヌクレイック・アシッズ・
リサーチ、７巻、１５１３頁、１９７９年）の方法によ
りＥ．コリ形質転換細胞からつくった。一本鎖Ｍ１３フ
ァージＤＮＡはＳ．アンダーソン（ヌクレイック・アシ
ッズ・リサーチ、１３巻、３０１５頁、１９８１年）に
より記載のようにつくった。ＤＮＡフラグメントはＪ．
ラングリッジらの方法（アナリチカル・バイオケミスト
リー、１０３巻、２６４頁、１９８０年）によりアガロ
ースゲルから抽出した。ＤＮＡ配列はＭ１３鋳型上でジ
デオキシ法（メッシング、メソドロジー・イン・エンチ
モロジー、１０１巻、２０頁、１９８３年）により行な
った。 【００３２】実施例１ ｐＳＳＶ−１１からＶ−SIS のサブクローニング そのゲノムにＳＳＶを組込んだＳＳＶ−１１を非生産的
感染させた正常のラットの腎臓（ＮＲＫ）細胞からＳＳ
Ｖレトロウィルスゲノムをクローニングした（デバール
ら、上記、１９８２年）。ＳＳＶ ＤＮＡは5.８キロベ
ース（ｋb ）ＥcoＲＩフラグメントとして単離し、つい
でプラスミドｐＢＲ３２２に挿入し、クローンｐＳＳＶ
−１１を得た。このクローンはＳ．アアロンソン（ナシ
ョナル・インスチチュート・オブ・ヘルス、ベセスダ、
ＭＤ）から得た。図１はＳＳＶの5.８キロベースプロウ
イルスゲノムの模式的制限マップである。本発明に関連
した制限位置だけを示す。オープンボックスはｖ−sis
遺伝子のｐ２８sis コーディング部分を示す。図２、図
３はｖ−sis 遺伝子のヌクレオチド配列及び若干の側面
ＳＳＶ配列を示す。ｖ−sis 遺伝子はＳＳＶのエンベロ
ープ（env)遺伝子の推定のＡＴＧ開始コドンの１９ヌク
レオチド３′に挿入される（デバールら、１９８２年、
上記）。ｖ−sis 配列の転写と翻訳はＳＳＶ配列によっ
て指図され、env-sis 融合蛋白質を生じる。図２、図３
に示したヌクレオチド配列は１９８２年（上記）のデバ
ールらにより公表されたものから修正してある。修正は
デバールら（１９８３年、上記）及び本発明者によりな
されたものを含む。デバールら（１９８２年、上記）の
もとの番号付け図表をここで保持してある。図１の制限
位置に割当てた数は図２、図３からのものである。 【００３３】ｖ−sis 遺伝子の部分を含むｐＳＳＶ−１
１のサブクローン（図４）は、Ｅ．コリ複製プラスミド
ｐＵＣ１３中で構築された（ビエイラ、メッシング、ジ
ーン、１９巻、２５９頁、１９８２年；メッシング、メ
ソドロジー、イン・エンチモロジー、１０１巻、２０
頁、１９８３年）。ｐＳＳＶ−１１の５マイクログラム
（μｇ）を制限エンドヌクレアーゼＰstＩで消化し、配
列番号４５４−１６７９（図１）を含む1.２ｋb フラグ
メントをアガロースゲル電気泳動（0.９％）で精製し、
ゲルからセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴ
ＡＢ）とブタノールで抽出した（ラングリッジら、上
記）。またｐＵＣ１３の２μｇをＰstＩで消化し、フェ
ノール／クロロホルム（CHCl3 ) 抽出し、エタノール
(EtOH) で沈殿させた。1.2 ｋb ｖ−sis フラグメント
４０ｎg とＰstカットｐＵＣ１３ ５０ｎg を室温で一
夜Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ４０単位（Ｕ）で連結反応させ
た。連結反応混合物を使って、５−ブロモ、４−クロ
ロ、３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−gal)
およびイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰ
ＴＧ）の存在で、Ｅ．コリＫ−１２細胞株ＪＭ８３を形
質転換した（メッシング、レコンビナント・ＤＮＡテク
ニカル・ブュレタン、ＮＩＨパブリケーションNo. ７９
−００９、２頁、No. ２、４３〜４８頁、１９７９
年）、アンピシリン耐性白色コロニーからつくったプラ
スミドＤＮＡをＰstＩで消化し挿入物の存在を確かめ、
生成プラスミドを p VSIS ／Ｐstと命名した。 【００３４】実施例２ プラスミドｐＶＳαの構築 Ａ．ＭＦα１へ融合のためのＶ−SIS の調製 プラスミドｐＳＳＶ−１１（図４）６００μg を、５０
mＭ NaCl 、１０ mＭ MgCl2、１０ mＭトリス pＨ7.５
（培地塩緩衝液）、１００μg ／ｍl 牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）の２００μl 中で、３７℃で一夜、制限エン
ドヌクレアーゼＢamＨＩおよびＰvu II で消化した。消
化生成物を1.１％アガロースゲルを通し電気泳動し、１
１００塩基対（ｂp ）ＢamＨＩ−Ｐvu II フラグメント
（図４）を切りとり、抽出し、EtOHで沈殿させた。ＤＮ
Ａペレットを７５μl のＨphＩ緩衝液に溶かし、これに
ＢＳＡ１ｍｇ／ｍl ２０μl とＨphＩ 5μl を加えた。
３７℃で一夜消化後、混合物を1.２５％アガロースゲル
を通し電気泳動し、ゲルから３９６ bp ＨphＩ−Ｐvu I
I フラグメントを単離し、EtOHで沈殿させた。ＤＮＡペ
レットをクレナウ緩衝液６ mＭトリス pＨ7.５、６ mＭ
MgCl2、６０ mＭ NaCl ）３０μl に溶かし、ＨphＩ開
裂位置における３′突出たヌクレオチドを、クレナウポ
リメラーゼ５Ｕで３７℃で５分処理することにより除い
た。各１ mＭですべての４デオキシリボヌクレオチドを
含む混合物１μl を加え、反応混合物をさらに１０分培
養した。フェノール／CHCl3 ／エーテル（EtOH）抽出お
よびEtOH沈殿後、ＤＮＡペレットを培地塩緩衝液３０μ
l に溶かし、Ｂgl 5ｕで３７℃で３時間消化した。ＤＮ
Ａを1.２５％アガロースゲルを通し電気泳動し、２６９
ｂp ＨphＩ−Ｂgl II フラグメントを抽出し、EtOHで沈
殿させた。このクレナウブラントフラグメントのＨphＩ
開裂末端はトリヌクレオチド配列ではじまる。 ５′ＡＴＧ……（図４） ３′ＴＡＣ…… 【００３５】Ｂ．ＭＦα１プロモーターおよび分泌リー
ダーフラグメント プラスミドｐ１９２（図５）は、バクテリアプラスミド
ｐＵＣ１３中でクローニングした酵母接合フェロモンα
−因子（ＭＦα１遺伝子）用の遺伝子の一部分からなる
（ビエイラ、メッシング、上記；メッシング、メソドロ
ジー・イン・エンチモロジー、１０１巻、２０頁、１９
８３年）。ゲノムライブラリーからのＭＦα１遺伝子の
クローニングはクルジャン、ヘルスコウイッツ（上記）
により記載されている。原料としてＹＥｐ１３のＢamＨ
Ｉ位置にクローニングした部分Ｓau３Ａフラグメントの
酵母ゲノムライブラリーを使い（ナスマイス、タッチェ
ル、セル、１９巻、７５３頁、１９８０年）、上記遺伝
子を類似の方法でこの実験室で単離した。このライブラ
リーから、マットα２−３４突然変異のための酵母ホモ
接合の二倍体細胞株中のα−因子を表現したプラスミド
を単離した（マンネーら、ジャーナル・セル・バイオロ
ジー、９６巻、１５９２頁、１９８３年）。ＭＦα１遺
伝子で重複した挿入物を含むクローンはクルジャン、ヘ
ルスコウイッツ（上記）によりキャラクタリゼーション
された。 【００３６】ｐＺＡ２（図５）として知られるこのプラ
スミドをＥcoＲ１で切り、ＭＦα１遺伝子からなる１７
００ｂp フラグメントを精製した。ついでこのフラグメ
ントをｐＵＣ１３のＥcoＲ１位置にサブクローニングし
てプラスミドｐ１９２を得た。プラスミドｐ１９２ １
５μｇを培地塩緩衝液３０μl 中でＨind III ２０単位
で３７℃で一夜消化した。反応混合物をクレナウ緩衝液
で６０μl にうすめ、４デオキシリボヌクレオチドを加
えて各々５０μＭの最終濃度にした。氷冷混合物にクレ
ナウポリメラーゼ１０単位を加え、１５℃で１２分培養
した。フェノール／CHCl3 ／Et2O抽出後、水相を凍結乾
燥により１０μl まで濃縮し、ＥcoＲＩ ２０単位で３
７℃で７０分消化した。生成物を0.９％アガロースゲル
を通し電気泳動し、1.２ｋb ＥcoＲＩ−Ｈind III （ブ
ラントした）ＭＦα１フラグメントを抽出し、EtOHで沈
殿させた。このＤＮＡフラグメントはＭＦα１の転写プ
ロモーターおよび分泌シグナル配列を含む。 【００３７】Ｃ．ｖ−sis ３′配列およびクローニング
ベクターｐＵＣ１２の調製；フラグメント連結反応 プラスミドｐＶＳＩＳ／Ｐst 2０μｇを、培地塩緩衝液
４０μl 中でＢgl II およびＸba Iで消化した。１％ア
ガロースを通し、電気泳動後、ＤＮＡの抽出およびEtOH
沈殿で精製したｖ−sis ７５６ｂp Ｂgl II −Ｘba Iフ
ラグメントを与えた（図４）。Ｅ．コリ複製プラスミド
ｐＵＣ１２（５μｇ）をＥcoＲＩおよびＸba Iで消化
し、上記のようにゲル精製した（図４）。 【００３８】図４で、上記の４ＤＮＡフラグメントの等
モル量を、２９６ｂp ＨphＩ−Ｂgl II ｖ−sis フラグ
メント１０ｎg に調節し、リガーゼ緩衝液（６ mＭトリ
ス pＨ7.6、 6.６ mＭ MgCl2、0.４ mＭ ＡＴＰ、２ m
Ｍスペルミジン、２０mＭ ＤＴＴ、１００μｇ／ｍl
ＢＳＡ）１５μl 中で混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ４０
単位で１４℃で一夜連結反応させた。反応混合物を室温
にし、Ｔ4リガーゼをさらに１５０単位加え、さらに１
０時間培養した。連結反応混合物７μl を使ってＥ．コ
リＫ−１２ＲＲ１（ＡＴＣＣNo. ３１３４３；Ｅ．ボリ
バーら、ジーン、２巻、９５頁、１９７７年）を形質転
換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を選んだ。１２の
上記バクテリアコロニーからプラスミドＤＮＡをつく
り、Ｘba Iで消化した。２コロニーは適当なフラグメン
トの整列により予想される〜2.２ｋb バンドを与えた
（図４）。Ｂgl II −Ｘba I制限地図作成によりこれら
をさらに分析してＭＦα１／ｖ−sis 融合から約1.５ｋ
b の予期のバンドを与え、Ｂgl II −Ｘba I ｖ−sis
フラグメントに対して７６０ｂp を与えた。ＤＮＡ配列
分析はＭＦα１／ｖ−sis 結合において望むヌクレオチ
ド配列を立証した。生成プラスミドをｐＶＳαと命名し
た。 【００３９】実施例３ ６６アミノ末端ｖ−sis コドンのオリゴヌクレオチド指
令欠失突然変異誘発ｖ−sis 蛋白質ｐ２８sis とＰＤＧ
Ｆの間の相同は、ｐ２８sis のアミノ酸６７、ＰＤＧＦ
Ｂ鎖の NH2末端残基に相当するセリン残基ではじまる
( ジョンソン、上記) 。ＭＦα１一次翻訳生成物の蛋白
質分解プロセシングはイニシエーターメチオニンからＬ
ys−Ａrg開裂シグナル８５アミノ酸で起る（クルジャ
ン、ヘルスコウイッツ、上記）。ｖ−sis のセリン残基
６７がＭＦα１Ｌys−Ａrgプロセシングシグナルに直ち
に従うようにｐ２８sis の最初の６６コドンが除去され
ているｖ−sis 誘導体が構築された。図６を参照する
と、ｐＶＳαのゲル精製2.２ｋb Ｘba Iフラグメントの
約４０ｎg を、Ｘba I消化アルカリ性ホスファターゼ処
理Ｍ１３ｍp １１ＤＮＡ１２０ｎg と連結反応させた
（メッシング、メソドロジー・イン・エンチモロジー、
上記）。連結反応混合物を使い、Ｘ−gal およびＩＰＴ
Ｇの存在でＥ．コリＫ−１２細胞株ＴＭ１０１（ＡＴＣ
Ｃ３３８７６）を形質転換した。単離した白色プラーク
をとり、ログ相発育ＪＭ１０１細胞の３ml培養物の感染
に使った。複製型（ＲＦ）ＤＮＡをつくり、一本鎖成熟
ファージのプラス鎖形と同一配向で挿入フラグメントを
有しているクローンを同定した。このようなクローンか
ら一本鎖ファージＤＮＡをつくり、ｍ１１ＶＳαと命名
した。 【００４０】ｖ−sis のコドン１−６６を正確に除くた
めに、本質的にゾラーの２プライマー法に従ってオリゴ
ヌクレオチド指令突然変異誘発を行なった（ゾラーら、
マニュアル・フォア・アドバンスト・テクニークス・イ
ン・モレキュラー・クローニング・コース、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー、１９８３年）。
オリゴヌクレオチドＺＣ１３０（３′AGAAACCTATTTTCCT
CGGACCCA５′）をアプライド・バイオシステムズ３８０
−Ａ ＤＮＡ合成器上で合成した。ＺＣ１３０５０pmol
をキナーゼ緩衝液（ＢＲＬ）１０μl 中で、Ｔ4 ポリヌ
クレオチドキナーゼ４単位で３７℃で４５分キナーゼ化
した。酵素を６５℃で１０分加熱して不活性化した。ｍ
１１ＶＳα0.５pmolを記載の条件（ゾラーら、上記）を
使い、キナーゼ化ＺＣ１３０ １pmolおよび一般配列プ
ライマー（ＢＲＬ）1.５pmolとアニーリングしたが、た
だしアニーリング混合物をまず６５℃に１０分加熱し、
３７℃に１０分上げ、ついで氷で迅速に冷した。ついで
アニーリングした混合物をゾラーら（上記）が記載のよ
うにクレナウポリメラーゼで処理し、環状デュプレック
スＤＮＡをつくり出した。延長混合物の部分を使って、
Ｅ．コリＫ１２ＪＭ１０１細胞を形質転換した。得られ
たファージプラークを、ニトロセルロース濾過器上に移
し、ついで32Ｐホスホリル化ＺＣ１３０で６５℃でハイ
ブリッド形成することにより、適当な欠失のためにふる
った。正しく並置した配列は、使った厳重なハイブリッ
ド形成温度で放射性プローブと安定なデュプレックスを
形成した。ふるった形質転換細胞の約１％はオートラジ
オグラフィによりプラスの信号を与えた。クローンをプ
ラーク精製し、制限酵素分析用にＲＦ ＤＮＡをつくっ
た。５つの単離物は１９５ｂp 〜１４５０ｂp Ｈind II
I −Ｂgl II フラグメントの大きさに予期の減少を示し
た（図６）。２の単離物のＤＮＡ配列分析により、正し
い融合結合がなされたことが確かめられ、そこで適当な
翻訳読みフレームを維持した。このファージの一つをｍ
１１ＶＳ２αと命名した。 【００４１】実施例４ 酵母表現ベクター Ａ．プラスミドＹＥｐＶＳαとＹＥｐＶＳ２αの構築 酵母複製ベクターＹＥｐ１３（ブローチら、ジーン、８
巻、１２１頁、１９７９年）を、実施例２および３に記
載のｖ−sis 誘導構築物用の表現ビークルとして使っ
た。ＹＥｐ１３は２ミクロンの複製原と酵母ＬＥＵ２遺
伝子を含む多複製染色体外プラスミドである。これはロ
イシンに欠けた合成培地で発育させるとき、欠陥染色体
ＬＥＵ２遺伝子を有する酵母細胞株中のプラスミドの選
択を可能にする。酵母に表現された異遺伝子に酵母ター
ミネーター配列を加えると、 mＲＮＡの有効な転写終結
とポリアデニル化を確実にする。ｖ−sis 表現単位ＶＳ
αとＶＳ２αを、予めＹＥｐ１３にクローニングしたＴ
ＰＩターミネーターフラグメントに隣接して置いた（下
記）。 【００４２】プラスミドｐ２７０（図７参照）は、酵母
トリオースホスフェートイソメラーゼ（ＴＰＩ）遺伝子
の転写ターミネーター領域を含む。これは次の方式で構
築された。酵母ＴＰＩターミネーターフラグメントはプ
ラスミドｐＦＧ１から得た（アルバー、カワサキ、上
記）。これはＴＰＩ遺伝子の末端から二番目のアミノ酸
コドンから約７００塩基対下流のＥcoＲＩ位置まで囲ん
でいる。まずプラスミドをＥcoＲＩで切り、ついで端を
ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレナウフラグメント）でブラ
ントし、合成ＢamＨＩリンカー（ＣＧＧＡＴＣＣＡ）を
加え、プラスミドｐ１３６をつくるため再連結反応させ
ることにより、ＢamＨＩ位置をｐＦＧ１のこの独特のＥ
coＲＩ位置の代わりに置きかえた。ついでＴＰＩターミ
ネーターをｐ１３６からＸba I−ＢamＨＩフラグメント
として切出した。このフラグメントを、Ｘba IおよびＢ
amＨＩで線状化してあるＹＥｐ１３（ブローチら、上
記）に連結反応させた。生成プラスミドはｐ２１３とし
て知られている。ついでプラスミドをＨind III で消化
し、生成末端をＤＮＡポリメラーゼＩ（クレナウフラグ
メント）でブラントし、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼを使って線
状分子を再環化することにより、Ｈind III 位置をｐ２
１３のＴＰＩターミネーター領域から除去した。一方、
プラスミドｐＭ２２０（下記参照）をＸba IとＢamＨＩ
で消化し、ＴＰＩターミネーターフラグメント（〜７０
０ bp ）を精製し、このフラグメントをＸba IおよびＢ
amＨＩ消化ＹＥｐ１３に挿入することにより、ｐ２７０
を構築できる。 【００４３】図８を参照すると、プラスミドｐ２７０Ｄ
ＮＡをＸba Iで消化し、凝集性ベクター端の再連結反応
を防ぐために子牛アルカリ性ホスファターゼで処理し
た。夫々ｐＶＳαおよびｍ１１ＶＳ２αのＸba I消化、
アガロースゲル精製により、ｖ−sis 表現単位ＶＳαお
よびＶＳ２αをつくった。単離フラグメントの各々を、
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ４０単位の存在でホスファターゼ化
ｐ２７０ベクターのほぼ等モル量と連結反応させ、連結
反応混合物をＥ．コリＫ−１２ＲＲ１中に形質転換させ
た。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性コロニーから
つくり、３′ｖ−sis 配列に隣接したＴＰＩターミネー
ターを有するクローンを同定するために制限酵素分析を
行った。ゲル電気泳動後3.３ｋb または3.１ｋb Ｂgl I
I フラグメントの存在は、夫々ＹＥｐＶＳαおよびＹＥ
ｐＶＳ２αの正しい配向を示した。 【００４４】Ｂ．ＶＳ２α表現単位のｐＣＰＯＴへの挿
入 酵母培養から最大の蛋白質生産を達成するためには、宿
主細胞中で著しく安定に保たれる表現ビークルを使うの
が望ましい。プラスミドｐＣＰＯＴはこのような好まし
い表現ビークルである。ｐＣＰＯＴで形質転換したＥ．
コリＨＢ１０１は、受入番号３９６８５でアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションに預けられている。
プラスミドｐＣＰＯＴは２ミクロンの円形ゲノム（ハー
トレー、ドネルソン、ネーチャー、２８６巻、８６０
頁、１９８０年）、Ｅ．コリプラスミドｐＢＲ３２２複
製および選択配列、解糖酵素トリオースホスフェートイ
ソメラーゼを符号化したシゾサッカロミセス・ポムベＤ
ＮＡ配列（ＰＯＴ１）からなっている。ｐＣＰＯＴ中の
ＰＯＴ１遺伝子の存在は、炭素源としてグルコースを使
う非選択的培地で発育中、適当な宿主バックグラウンド
でプラスミドの安定な維持を確保する。 【００４５】Ｓ．セレビジエＴＰＩプロモーターを使っ
てｐＣＰＯＴ中のＶＳ２α配列の表現を制御した。プラ
スミドｐＭ２２０はＭＦα１シグナル配列に融合したＴ
ＰＩプロモーターを含む。ｐＭ２２０で形質転換した
Ｅ．コリＲＲＩは、受入れ番号３９８５３でアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションに預けられてい
る。図９を参照すると、プラスミドｐＭ２２０をＢgl I
I とＢamＨＩで消化し、0.９％アガロースゲルを通し電
気泳動し、2.２ｋb ＴＰＩプロモーター、ＭＦα１遺伝
子フラグメントを抽出した。精製フラグメントをＰstＩ
で消化し、生成１ｋb Ｂgl−ＰstＩフラグメントをアガ
ロースゲル精製した。プラスミドＹＥｐＶＳ２αをＰst
ＩとＢamＨＩで消化し、1.８ｋb ＭＦα１／ｖ−sis ／
ＴＰＩターミネーター融合フラグメントをゲル単離し
た。プラスミドｐＣＰＯＴをＢamＨＩで消化し、子牛ア
ルカリ性ホスファターゼで処理し、フェノール／CHCl3
抽出し、ついでアガロースゲルを通し電気泳動で精製
し、ゲルから抽出し、EtOHで沈殿させた。 【００４６】上記の３の単離したフラグメント（図９）
のほぼ等モル量を１２℃で一夜連結反応させ、連結反応
混合物を使ってＥ．コリＫ−１２細胞株ＤＨ１（ハナハ
ン、Ｄ．、メセルソン Ｍ．、ジャーナル・モレキュラ
ー・バイオロジー、１６６巻、５７７頁、１９８３年）
をアンピシリン耐性まで形質転換した。プラスミドＤＮ
Ａを形質転換細胞からつくり、制限消化分析を使って挿
入フラグメントの配向を確かめた。〜１５００ｂp Ｂam
ＨＩ−ＳalＩフラグメントの存在は、ＴＰＩターミネー
ターフラグメントのＢamＨＩ凝集性端が図９に示すよう
に配向していることを示す。反対の配向はＢamＨＩ／Ｂ
gl II 融合をつくり出し、ＢamＨＩで開裂されず、そこ
でこのフラグメントを生じない。８００ｂpＳphＩフラ
グメントは、ＴＰＩプロモーターとｖ−sis フラグメン
トがＰstＩ位置で適当に融合していることを示す（図
９）。このプラスミドをｐ１１７−２と命名した。 【００４７】Ｃ．プラスミドｐＶＳＢの構築 ｐＶＳ２αにより符号化した生成物は本物（真正）のヒ
トＰＤＧＦ Ｂ鎖より大きいから、また一層小さい生成
物は形質転換した酵母宿主細胞で一層高い表現水準を生
じるから、３′端で先を切ったｐＶＳ２のｖ−sis 配列
からなるベクターを構築した。この配列により符号化し
たポリペプチドはｐ２８sis のアミノ酸６７〜１７５か
らなり、ＰＤＧＦのＢ鎖に相同である。この“Ｂ鎖”配
列を含む表現ベクターは、ｐＶＳ２α表現単位のエレメ
ントを部分ｖ−sis 遺伝子およびｐ２８sis のアミノ酸
１５８〜１７５を符号化した合成二本鎖ＤＮＡフラグメ
ントと結合することにより構築された。この合成フラグ
メントは、１３ｖ−sis コドンの多くに対し好ましい酵
母コドンをおき代え、また符号化配列の端にストップコ
ドンを供給するように工夫された。このベクターの構築
は図１０と図１１に例示されている。プラスミドＹＥｐ
ＶＳ２αをＰstＩとＢamＨＩで消化し、部分ＭＦα１、
ｖ−sis 、ＴＰＩターミネーター配列からなる1.８ｋb
フラグメントを、アガロースゲル電気泳動で精製した。
ｐＵＣ１９（ノランダーら、ジーン、２６巻、１０１〜
１０６頁、１９８３年）のＨind III 位置に、表１に示
したポリリンカーを挿入したプラスミドｐＩＣ１９Ｒ
（Ｊ．ローレンス・マーシュ博士、ユニバーシティー・
オブ・カリフォルニア、イルビンから得られる）を、Ｐ
stＩとＢamＨＩで消化し、ベクターフラグメントをゲル
精製し、ｐＶＳ２αからの1.８ｋb フラグメントに結合
し、プラスミドｐＶＳ２αＴを得た。 【００４８】 【表１】 【００４９】プラスミドｐＭ２２０をＢgl II とＰstＩ
で消化し、ＴＰＩプロモーターおよびＭＦα１配列の
５′部分からなる約１ｋb フラグメントを単離し、Ｂgl
II ＋ＰstＩ消化ｐＩＣ１９Ｒでクローニングした。得
られたプラスミドをＣ1aＩとＰstＩで消化し、ＴＰＩプ
ロモーターＭＦα１フラグメントをゲル精製した。つい
でプラスミドｐＶＳ２αＴをＣ1aＩとＰstＩで切り、Ｔ
ＰＩプロモーター−ＭＦα１フラグメントに結合した。
2.６ｋb Ｃ1aＩ−ＢamＨＩフラグメントの存在により正
しい構成が同定され、ｐＴＶＳ２αＴと命名された。プ
ラスミドｐＶＳα１０μｇを完結までＸmaＩとＳphＩで
消化した。またｖ−sis 配列の大部分からなる生成した
約4.９ｋb ベクターフラグメントを、アガロースゲル電
気泳動により精製し、ＤＮＡを抽出し、EtOHで沈殿させ
た。 【００５０】ｖ−sis 配列に対し新しい３′末端を供給
するために、アプライド・バイオシステムズ モデル３
８０−Ａ ＤＮＡ合成器上で合成したオリゴヌクレオチ
ドから二重鎖ＤＮＡフラグメントを構築した。オリゴヌ
クレオチドＺＣ２９９（表２） 0.7 pmol を、４０ mＭ
NaCl を含む１０μl 中のオリゴヌクレオチドＺＣ３０
０等モル量と６５℃で５分加熱した。 【００５１】 【表２】 表 ２ ZC299:5' TAAG TGT GAA ATC GTT GCC GCG GCT AGA GCT GTT ACC TAA TCT AGA 3' ZC300:3' GTACA TTC ACA CTT TAG CAA CGG CGC CGA TCT CGA CAA TGG ATT AGA TCT GGCC 5' 【００５２】ついで混合物を３７℃で５分培養し、室温
に冷やした。精製した4.９ｋb ベクターフラグメント0.
２ pmol を加え、混合物を１２℃で１８時間連結反応さ
せ、アンピシリン耐性を獲得するまでＥ．コリＨＢ１０
１（ＡＴＣＣ３３６９４）を形質転換するのに使った。
ＤＮＡはアンピシリン耐性コロニーからつくり、Ｂgl I
I とＸba Iで消化した。アガロースを通し電気泳動後、
約７５０ｂpＢgl II −Ｘba Iの損失と約５００および
２６０ｂp の２個の一層小さいフラグメントの出現によ
り、望むクローン（ｐＶＳαＢとして知られる）を同定
した。プラスミドｐＴＶＳ２αＴ約８μｇを１０μl 容
量中でＸba Iで完結まで消化した。容量をＢgl II 緩衝
液で４０μl まで増し、Ｂgl II ６単位を加え、混合物
を３７℃で培養した。１０μl 試料を１５分および３０
分で５０ mＭＥＤＴＡを含む停止緩衝液に除去し、残り
２０μl を４５分で停止した。生成混合物を0.７％アガ
ロースを通し電気泳動により分離した。約4.６ｋb Ｂgl
II −Ｘba Iベクターフラグメントを切り、ゲルから抽
出し、EtOHで沈殿させた。プラスミドｐＶＳαＢをＢgl
II とＸba Iで消化し、合成３′末端とストップコドン
を含む約２６０ｂp フラグメントをアガロースに通し電
気泳動により単離し、ついでゲルから抽出し、EtOHで沈
殿させた。 【００５３】ｐＴＶＳ２αＴからの4.６ｋb Ｂgl II −
Ｘba IベクターフラグメントとｐＶＳαＢからの２６０
ｂp Ｂgl II −Ｘba Iフラグメントを、Ｔ4 ＤＮＡリガ
ーゼの存在で室温で７時間連結反応させた。反応混合物
をアンピシリン耐性獲得に至るまでＥ．コリＨＢ１０１
を形質転換するのに使った。ＤＮＡを形質転換細胞から
つくり、望む挿入物の存在はアガロースゲル上で５５０
ｂp ＰstＩ−Ｘba Iバンドに対しふるいわけすることに
より確かめた。正しい配置をもつプラスミドをｐＶＳＢ
と命名した。 【００５４】Ｄ．ｐＭＰＯＴ２の構築 酵母中にｖ−sis 誘導の表現のために、酵母２ミクロン
ＤＮＡからのＲＥＰ１、ＲＥＰ２、ＲＥＰ３、ori 配列
およびＳ．ポムベトリオースホスフェートイソメラーゼ
（ＰＯＴ１）遺伝子からなる安定な表現ベクターを構築
した。ＰＯＴ１遺伝子は、酵母宿主がトリオースホスフ
ェートイソメラーゼに対して欠陥のあるとき、複雑な培
地内で発育している形質転換酵母宿主にプラスミド維持
を与える。 【００５５】ＰＯＴ１遺伝子はプラスミドｐＦＡＴＰＯ
Ｔから得た。ｐＦＡＴＰＯＴで形質転換したＳ．セレビ
ジエ細胞株Ｅ１８は、受入れ番号２０６９９でＡＴＣＣ
に預けられている。常法で宿主細胞からプラスミドを精
製できる。プラスミドをＳalＩとＢamＨＩで消化するこ
とによりＰＯＴ１配列をｐＦＡＴＰＯＴから除去した。
この〜１６００ｂp フラグメントを、ＳalＩとＢamＨＩ
で消化することによりまず線状にしてあるｐＩＣ１９Ｒ
に連結反応させた。生成プラスミドのＢamＨＩ、Ｐst
Ｉ、ＳalＩ位置を２工程で破壊し、プラスミドｐＩＣＰ
ＯＴ* を得た。ＰstＩおよびＳalＩで切ることによりＰ
stＩとＳalＩ位置を除去し、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ク
レナウフラグメント）で突出たＰstＩ 3′を消化しクレ
ナウフラグメントを突出たＳalＩ 5′に挿入することに
より末端をブラントした。ついでブラント末端を連結反
応させた。ついでプラスミドをＢamＨＩで切り、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ（クレナウフラグメント）を末端に挿入
し、ブラント末端を再連結反応させることにより、Ｂam
ＨＩ位置を除去した。 【００５６】プラスミドＹＥｐ３（ブローチら、ジー
ン、８巻、１２１〜１３３頁、１９７９年）とＣ１／１
から２ｕ配列を得た。ＥcoＲＩで部分消化によりｐＭＢ
９配列を除去し、ＥcoＲＩ−切断ｐＢＲ３２２で置換す
ることにより、ｐＪＤＢ２４８（ベッグズ、ネーチャ
ー、２７５巻、１０４〜１０９頁、１９７８年）からＣ
１／１を構築した。ＰstＩとＸba Iで消化し、ゲル精製
することにより、ＹＥｐ１３からＲＥＰ３および ori配
列を除去した。Ｘba IとＳphＩで消化し、ゲル精製する
ことにより、Ｃ１／１からＲＥＰ２を得た。ついで２フ
ラグメントを、プラスミドｐＵＣＲＥＰ２、３をつくる
ためＰstＩとＳphＩで線状にしてあるｐＵＣ１８（ノラ
ンダーら、ジーン、２６巻、１０１〜１０６頁、１９８
３年）に結合した。ＥcoＲＩとＸba Iで消化し、１７０
４ｂp フラグメントのゲル精製によって、Ｃ１／１から
ＲＥＰ１を得た。ＥcoＲＩ−Ｘba Iフラグメントを、Ｅ
coＲＩとＸba Iで線状にしてあるｐＵＣ１３中にクロー
ニングした。生成プラスミドをｐＵＣ１３＋ＲＥＰ１と
命名した。ｐＵＣ１３＋ＲＥＰ１プラスミドをＨind II
で切り、ＥcoＲＩリンカー（ベセスダ・リサーチ・ラボ
ラトリーズから得た）の存在で連結反応させた。ついで
ＲＥＰ１遺伝子を約１７２０ bp のＥcoＲＩフラグメン
トとして除去した。このＥcoＲＩフラグメントを、Ｅco
ＲＩとＸba Iで線状にしてあるｐＩＣ７（ｐＵＣ８のＨ
indIII 位置に挿入したチャート１に示したポリリンカ
ー配列からなる）中にクローニングした。生成プラスミ
ドをｐＩＣＲＥＰ 1 No.９と命名した。 【００５７】最終表現ベクターｐＭＰＯＴ２を構築する
ために、ｐＩＣＰＯＴ* を部分Ｈind III 消化および完
全Ｓst I消化により線状にした。プラスミドｐＵＣＲＥ
Ｐ2 、3 をＨind III とＳst Iで切り、ＲＥＰ2 、ＲＥ
Ｐ3 、ori 配列からなるフラグメントをゲル精製し、線
状にしたｐＩＣＰＯＴ* に結合した。ＲＥＰ２、ＲＥＰ
３、ori 、ＰＯＴ１、 ampr 配列からなる生成プラスミ
ドをｐＭＰＯＴ 1 と命名した。ついでＲＥＰ１をｐＩ
ＣＲＥＰ 1 No.９からＢgl II −Ｎar Iフラグメントと
して除去し、Ｂgl II とＮar Iで開裂してあるｐＭＰＯ
Ｔ１に連結反応させた。この連結反応生成物をｐＭＰＯ
Ｔ２と命名した（ＡＴＣＣに預けた、受入れ番号２０７
４４）。プラスミドｐＭＰＯＴ２をＣ1aＩとＢamＨＩで
消化し、ベクターフラグメントを上記のように精製し
た。 【００５８】Ｅ．ｐＭＰＯＴ２へのｖ−sis 表現単位の
挿入 1. ｐＭＰＯＴ２へのＶＳα表現単位の挿入 プラスミドｐＶＳα約１０μｇを２０μl の容量中で完
結までＢst Ｅ IIで消化した。ＰstＩ 5単位を加え、
混合物を３０分培養し、ＥＤＴＡを加えて反応を停止し
た。止めた反応混合物を直ちに１％アガロースゲルを通
し電気泳動し、約８００ｂp の部分ＰstＩ−Ｂst Ｅ
IIバンド（大部分ＭＦα１プレプロ配列とｖ−sis ５′
部分からなる）を切り、ゲルから抽出し、EtOHで沈殿さ
せた。プラスミドｐＴＶＳ２αＴをＰstＩとＢst II で
完結まで消化し、アガロースゲル電気泳動で精製した。
生成した約4.8 ｋb ベクターフラグメントおよび８００
ｂp ＰstＩ−Ｂst Ｅ IIフラグメントを、Ｔ4 ＤＮＡ
リガーゼの存在で室温で６時間連結反応させ、連続反応
生成物をＥ．コリＨＢ１０１のアンピシリン耐性獲得に
至るまでの形質転換のために使った。挿入物の存在を示
す約１４５０ｂp Ｂgl II フラグメントを含んでいるプ
ラスミドを同定した。これをｐＴＶＳαと命名した。プ
ラスミドｐＴＶＳαをＣ1aＩとＢamＨＩで完結まで消化
し、ＶＳα配列を含む約2.９ｋb フラグメントをアガロ
ースを通し電気泳動で単離し、ゲルから抽出し、EtOHで
沈殿させた。約2.９ｋb Ｃ1aＩ−ＢamＨＩ ＶＳフラグ
メントを、ｐＶＳ２αｍ（下記）に対し、記載のように
Ｃ1aＩおよびＢamＨＩ消化ｐＭＰＯＴ２と連結反応させ
た。2.９ｋb Ｃ1aＩ−ＢamＨＩ挿入物を含むプラスミド
を同定し、ｐＶＳαｍと命名した。 2. ＭＰＯＴ２へのＶＳ２αの表現単位の挿入 プラスミドｐＴＶＳ２αＴをＢamＨＩ緩衝液中Ｃ1aＩお
よびＢamＨＩで完結まで消化した。緩衝液を高い塩まで
調節し（マニアチスら、上記）、ＤＮＡをＰvu Iで完結
まで消化した。これはベクター配列を２回切り、ＶＳ２
α配列を含む約2.７ｋb Ｃ1aＩ−ＢamＨＩフラグメント
をアガロースゲル上で分割することを可能にする。この
フラグメントを0.９％アガロースを通し電気泳動し、抽
出し、EtOHで沈殿させた。ついでフラグメントをＴ4 Ｄ
ＮＡリガーゼの存在でＣ1aＩ−ＢamＨＩ消化ｐＭＰＯＴ
２と１３℃で２０時間連結反応させた。連結反応したＤ
ＮＡをアンピシリン耐性獲得に至るまでＥ．コリＨＢ１
０１を形質転換するのに使い、プラスミドＤＮＡは生成
コロニーからつくった。プラスミドを2.７ｋb Ｃ1aＩ−
ＢamＨＩ ＶＳ２αフラグメントを含むものとして同定
し、ｐＶＳ２αｍと命名した。 3. ｐＭＰＯＴ２へのＶＳＢ表現単位の挿入 プラスミドｐＶＳＢをＣ1aＩとＢamＨＩで消化し、“Ｂ
鎖”表現単位を含む2.２ｋb フラグメントをアガロース
ゲル電気泳動で精製し、EtOHで沈殿させた。フラグメン
トをＴ4 ＤＮＡリガーゼの存在で室温で一夜連結反応さ
せ、反応混合物をアンピシリン耐性獲得に至るまでＥ．
コリＨＢ１０１を形質転換するのに使った。ＤＮＡを形
質転換細胞からつくり、挿入物の存在はＣ1aＩとＢamＨ
Ｉで消化し、アガロースゲル電気泳動により立証した。
生成表現ベクターをｐＶＳＢｍと命名した。 【００５９】実施例５ 酵母形質転換；ｖ−sis 転写の分析 Ｓ．セレビジェ細胞株Ｅ８−１１Ｃ（ＭＡＴα leu ２
−３、１１２ pep ４−３；交雑Ｅ２−７Ｂ〔ＡＴＣＣ
２０６８９〕×ＧＫ１００〔ＡＴＣＣ２０６８９〕の半
数体分離物）をプラスミドＹＥｐＶＳα、ＹＥｐＶＳ２
α、ｐ２７０、ｐ−１１７−２、ｐＣＰＯＴで形質転換
した。形質転換細胞を選び、ロイシンに欠けた合成培地
に保った。Ｓ．セレビジェ細胞株Ｅ１１−３Ｃ（ＡＴＣ
Ｃ受入れ番号２０７２７）（ＭＡＴα pep 4 −3 tpi
l）をプラスミドｐＣＰＯＴとｐ−１１７−２で形質転
換した。形質転換細胞を選び、ＹＥＰＤ中に保った。図
10を参照すると、ｖ−sis 関連 mＲＮＡ転写物の存在
は、電気泳動およびつぎの全ＲＮＡのハイブリッド形成
分析により確かめられた。細胞様Ｅ８−１１Ｃ中の上記
形質転換細胞からの全ＲＮＡは、マニアティスら（上
記）による記載のようにグアニジウムチオシアナート抽
出によりつくり、次の変形を施した。１００ｍl 培養物
を１×１０8 細胞／ｍl の密度まで発育させた。細胞を
遠心分離でペレット化し、 H20で３回洗い、グアニジウ
ム溶菌溶液２ｍl を加え、ついで丁度メニスカス下まで
0.５mmガラスビーズを加えた。バーストの間の氷で冷し
て、管を３回１分間旋回させた。溶液をピペットでとり
除き、記載（マニアティスら、上記）のようにCsCl2 を
通し遠心分離によりＲＮＡを単離した。プラスミド形質
転換細胞ｐ２７０、ＹＥｐＶＳα、ＹＥｐＶＳ２α、ｐ
ＣＰＯＴ、ｐ１１７−２からのＲＮＡ１５μｇを、トー
マスにより記載（ＰＮＡＳ、７７巻、５２０１頁、１９
８０年）のように、グリオキシル化し、0.９％アガロー
スゲルを通し電気泳動し、ニトロセルロースに移した。
ｐＶＳＩＳ／Ｐstからの精製ＰstＩｖ−sis フラグメン
トをニックトランスレーションし、濾過器結合ＲＮＡに
ハイブリッド形成し、ハイブリッド形成種をオートラジ
オグラフィで検出した（図１２）。ＹＥｐＶＳαからの
〜１９００ｂp 、ＹＥｐＶＳ２αからの〜１６５０ｂp
、ｐ１１７−２からの〜１７００ｂp の転写バンド
は、ｖ−sis 融合構築物の転写を確かめさせ、構築にお
ける転写の開始と停止の信号の使用を確かめさせた。負
の対照ｐ２７０とｐＣＰＯＴではｖ−sis 関連転写は検
出されなかった。プラスミドｐＶＳαｍ、ｐＶＳ２α
ｍ、ｐＶＳＢｍ、ｐＭＰＯＴ２を使い、Ｓ．セレビジェ
細胞株Ｅ１８を形質転換した。細胞株Ｅ１８は、細胞株
Ｅ１１−３Ｃ（ＡＴＣＣNo. ２０７２７）とΔtpi ２９
の交雑によりつくった二倍体である。ロススタイン（メ
ソドロジー・イン・エンチモロジー、１０１巻、２０２
−２１０頁、１９８３年）によって本質的に記載された
ように、細胞株Ｅ２−７Ｂ（ＡＴＣＣNo. ２０６８９）
のトリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝子を分裂す
ることによりΔtpi ２９はつくられる。 【００６０】実施例６ 酵母により表現された sis関連生成物の分析およびバイ
オアッセイ Ａ．酵母培地の濃縮 ＹＥｐ１３およびｐＣＰＯＴ誘導ｖ−sis 構成を有する
形質転換細胞を、適当な培地で３０℃で（1.２リットル
培養）、回転空気振とう器で２２０rpm でかきまぜて、
静止相まで発育させた。培養物を収穫し、細胞を遠心分
離で除き、培地を疎水性の分子を結合するＣ−８セファ
ロース（ファルマシア・ファイン・ケミカルズＡＢ、ア
プサラ、スエーデン）カラム上で濃縮した。本物のヒト
ＰＤＧＦは高度に陽イオン的で疎水性の蛋白質である
（ヘルディンら、ＰＮＡＳ、７６巻、３７２２頁、１９
７９年、ライネス、ロス、上記）。sis −関連の推定上
の酵母生成物は類似の特性をもつことが期待された。si
s 生成物の予期された疎水特性を利用し、分泌が予期さ
れた酵母培地から濃縮した。Ｃ−８カラムに結合した分
子を、適当な疎水性溶剤でマトリックスから溶出した。 【００６１】形質転換した酵母培養物からの廃発育培地
を５％ EtOH に調節し、２〜３ｍl ／分の流量で８ｍl
Ｃ−８セファロースカラムを通した。ついでカラムを５
％ EtOH １００ｍl で２０ mＭ重炭酸アンモニウム（NH
4HCO3)中に洗った。結合物質を２０％プロパノールで２
０ mＭ NH4HCO3中に溶出し、溶出液を１−２ｍl フラク
ションに集めた。２８０ｎm の光吸収（Ａ280 1.４＝1.
０ｍｇ蛋白質／ｍl ）により、またはローリーらの方法
（ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、１９３
巻、２６５頁、１９５１年）によって、フラクションの
蛋白質含量を分析した。濃縮フラクションを集め、凍結
乾燥し、ついでＰＢＳ（リン酸塩緩衝生理的食塩水、 p
Ｈ7.４）５００〜７００μl に再懸濁した。ＰＯＴ１選
択下（炭素源としてグルコース）発育した細胞株Ｅ−１
１−３Ｃ中の形質転換細胞ｐ１１７−２は、培地でＰＤ
ＧＦ様物質のかなり高水準を生じることが期待され、そ
こで濃縮なしでＰＢＳに対し培地を透析後分析した。形
質転換細胞ｐＶＳαｍ、ｐＶＳ２αｍ、ｐＶＳＢｍ、ｐ
ＭＰＯＴ２からの培地試料を、ＣＭ−セファデックスに
吸着し、１Ｍ NaCl で１Ｍ酢酸、 pＨ4.５に溶出するこ
とにより濃縮した。濃縮培地を0.１Ｍ酢酸、 pＨ７に対
し透析し、濃縮物中のＰＤＧＦ様物質の量をＥＬＩＳＡ
で決定した。 【００６２】Ｂ．酸素結合イムノソルベントアッセイ
（ＥＬＩＳＡ）によるＰＤＧＦ様物質の検出 酵母形質転換細胞によるＰＤＧＦ様物質の表現をＥＬＩ
ＳＡでしらべ、精製ヒトＰＤＧＦで展開した標準曲線と
比較することにより定量した（ライネス、ロス、上
記）。典型的標準曲線は次のようにしてつくった。精製
したヒトＰＤＧＦ、ＰＢＳ中2.５ nｇ／ｍl を、イムロ
ンII（ダイナテク・ラボラトリーズ社）９６ウエルマイ
クロタイタープレート（１００μl ／ウエル）と共に４
℃で一夜培養した。このコーティング溶液を除き、ＰＢ
Ｓ中の0.１％ラビットアルブミン１００μl ／ウエルを
加え、プレートを３７℃で一時間培養した。精製ＰＤＧ
Ｆ試料（0.１〜４０ nｇ／ｍl ）を、0.０５％トイン２
０と１ｍｇ／ｍl ラビットアルブミン（ＲＳＡ）を含む
ＰＢＳ中の山羊anti−ＰＤＧＦＩｇＧ（５μｇ／ｍl ）
と共に別々に培養した。マイクロタイタープレートを0.
９％ NaCl 、0.０５％トイン２０で５回洗い、かわか
し、各試験溶液１００μl をマイクロタイターウエルに
加え、３７℃で２時間培養した。前述のようにプレート
を洗い、0.０５％トイン２０と１ｍｇ／ｍl ＲＳＡを含
むＰＢＳ中で１対１０００にうすめたペルオキシダーゼ
抱合ブタ抗山羊ＩｇＧ（タゴー社）を３７℃で２時間で
加えた。プレートを前述のように洗い、0.０１２％過酸
化水素 ( H2O2 ) を含む新しくつくった0.０４％ｏ−フ
ェニレンジアミン（１００μl ／ウエル）を室温で５０
分で加え、４Ｎ H2SO4 (５０μl ／ウエル）を加えるこ
とにより反応を５０分で止めた。ダイナテクプレートス
キャナーを使い、４９２ｎm の吸光度を測定した。各試
験点は３回測定し、平均±標準誤差としてプロットし
た。酵母培地のＣ−８溶出液および未濃縮培地試料をＰ
ＢＳでうすめ、記載のように分析し、ＰＤＧＦ標準曲線
と比較した。表２は代表的な一連の実験の分析結果のま
とめである。図１３は測定したＣ−８溶出液試料容量範
囲のＥＬＩＳＡを示し、精製ＰＤＧＦからの標準曲線と
比較した用量−応答曲線を形成している。ＭＰＯＴ構築
物に対する生のＥＬＩＳＡデータは示してないが、図１
５と図１６に示したようにラジオレセプター及びマイト
ジェネシスアッセイデータに合体してある。 【００６３】Ｃ．ＰＤＧＦに対するラジオレセプターア
ッセイ（ＲＲＡ） ＰＤＧＦに対するラジオレセプターアッセイ（ボウエン
−ホープ、ロス、ジャーナル・バイオロジカル・ケミス
トリー、２５７巻、５１６１頁、１９８２年）は、酵母
中の生物学的活性ＰＤＧＦ様物質の検出に特異な敏感な
（0.２〜２ｎg ／ｍl ＰＤＧＦ）方法である。このアッ
セイでは、ＰＤＧＦ様物質が、細胞表面ＰＤＧＦ受容体
上の結合位置に対し精製した放射性標識125 Ｉ ＰＤＧ
Ｆと競争する能力を試験する。結果を精製した未標識Ｐ
ＤＧＦで得られる標準曲線と比較して解釈する。他のア
ッセイ法（たとえばＥＬＩＳＡ）で得られた結果との比
較は、結合した物質の定量の他に受容体／配位子相互作
用の強さを示す。アッセイは次のように行なう。コスタ
ール２４ウエルクラスタートレー中の1.５×１０4 細胞
／２cm2 培養ウエルを、１％ヒト血漿誘導血清（ＰＤ
Ｓ）で補足したダルベッコス変性イーグルズ培地（ＤＭ
ＥＭ）中で平板培養することにより、二倍体ヒト繊維芽
細胞のサブ集密的細胞単層をつくる。培養物を氷トレー
上にセットし、氷冷結合リンス（２５ mＭ ＨＥＰＥＳ
で pＨ7.４に緩衝し、0.２５％ＢＳＡを補足したハムの
培地Ｆ−１２）で一度すすぐ。結合培地中の試験物質１
ｍl ／ウエルを加え、培養物を冷却室で振とうプラット
ホーム上で３〜４時間培養した。トレーを氷上に置き、
吸引し、冷結合リンスで一度すすぎ、0.５ｎg ／ｍl
125 Ｉ−ＰＤＧＦを含む１ｍl ／ウエル結合培地と上記
のように１時間培養する。結合リンスの４回すすぎで標
識付けを終わらせ、可溶化緩衝液で抽出することにより
細胞会合した125 Ｉ−ＰＤＧＦを決定する。０、0.０
５、0.１、0.２、0.４、0.８ｎg ／ｍl の精製ＰＤＧＦ
を使い標準曲線を得、試験試料をこれらの値と比較す
る。酵母Ｃ−８溶出液および１×培地試料に対しＲＲＡ
で得た結果を表３に示す。 【００６４】さらに、プラスミドｐＶＳαｍ、ｐＶＳ２
αｍ、ｐＶＳＢｍ、ｐＭＰＯＴ２を含む酵母形質転換細
胞からのＣＭ−セファデックス培地濃縮物によるＰＤＧ
Ｆ受容体結合を、本物のＰＤＧＦと比較した。図１５に
示したように、結果を精製未標識ＰＤＧＦで生じた標準
曲線と比較することにより解釈した。ｖ−sis 構築物で
形質転換した培養物からの培地は、ＰＤＧＦ受容体への
結合に対し125 Ｉ−ＰＤＧＦと競争することがわかる。
ｐＭＰＯＴ２で形質転換した酵母培地は、受容体結合に
対し放射性標識ＰＤＧＦと競争しない。 【００６５】Ｄ．マイトジェネシスアッセイ 培養においてＤＮＡ合成と細胞発育を刺激するＰＤＧＦ
の能力は、その定義と発見の基礎であった。ＰＤＧＦに
応答する培養細胞のＤＮＡ中に 3Ｈ−チミジンを合体す
ること（ライネス、ロス、メソドロジー・イン・エンチ
モロジー、１０９巻、印刷中）は、酵母中に生じるＰＤ
ＧＦ様分子の生物学的活性を示す好ましい方法である。
１０ mＭ酢酸中の試験試料（１００μl ／ウエル）を、
２cm2 コスタール２４−ウエル培養皿中のマウス３Ｔ３
細胞の静止培養物（１ｍl 中２〜３×１０8 細胞／ウエ
ル）に加える。４〜５日細胞を１０％血清中で平板培養
し、培地をこかつ (deplete)させることによって、静止
試験培養物を得ることができる。試験試料を２０時間で
ウエルから除去し、２μＣｉ／ｍl の〔３Ｈ〕−チミジ
ンと５％（容量／容量）子牛血清を含む新しい培地0.５
ｍl ／ウエルでおきかえる。３７℃でさらに２時間培養
後、培地を吸引し除き、ウエルを氷冷５％ＴＣＡ１ｍl
で２回洗い、混合し0.２５Ｎ NaOH 0.８ｍl 中でＴＣＡ
−不溶物質を可溶化し、５ｍl アクアゾル中のこの溶液
0.６ｍl を液体シンチレーションカウンターで数えるこ
とにより、細胞を収穫する。対照ウエル（１０ mＭ酢酸
のみ１００μl ）以上の倍刺激を決め（ふつうは３０〜
５０倍最大刺激）、精製ＰＤＧＦ調製物を使って得た標
準曲線と比較する。 【００６６】表３は酵母中に生じたＰＤＧＦ様物質に対
するマイトジェネシスアッセイで得た結果を示し、上記
アッセイ法によって測定したＰＤＧＦ様物質の活性を比
較してある。図１４はｐ１１７−２の形質転換Ｅ１１−
３ＣおよびｐＶＳα形質転換Ｅ８−１１Ｃからの濃縮培
地により引出されたマイトジェン応答を示し、精製ヒト
ＰＤＧＦで得たものと比較してある。 【００６７】 【表３】表 ３ ｎｇ／ｍｌＰＤＧＦ μg/ml 調 製 物 形質転換細胞 蛋白質 ELISA RRA マイトシ゛ェネシス C-8 溶出液 pVSα/E8-11C 2.00 188 4.6 102 pVS2 α/E8-11C 16.00 864 16〜97 310 p117-2/E11-3C 1.44 120 13.9 87 １×培地 p117-2/E11-3C − 4.2 0.18 2.5 【００６８】さらに、プラスミドｐＶＳαｍ、ｐＶＳ２
αｍ、ｐＶＳＢｍ、ｐＭＰＯＴ２を含む酵母形質転換細
胞からのＣＭ−セファデックス濃縮物により引出された
マイトジェン応答を、本物のＰＤＧＦで得たものと比較
した。図１６を参照すると、ｖ−sis 構築物で形質転換
した培養物からの培地は、静止３Ｔ３細胞による３Ｈ−
チミジンのとりあげを刺激した。上文からわかるよう
に、静止３Ｔ３細胞による３Ｈ−チミジンの取りこみ
は、マイトジェン刺激のしるしとされている。ｐＭＰＯ
Ｔ２で形質転換した酵母細胞からの培地は、マイトジェ
ン活性を示さなかった。示したデータから、ここで構築
した酵母細胞からの発育培地は、本物のヒトＰＤＧＦと
同一の生物学的活性を有することが明らかである。さら
に、これらの活性はＰＯＴ１選択下で発育したｐ１１７
−２形質転換細胞株Ｅ１１−３Ｃからの非濃縮（１×）
培地中で容易に検出できる。ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動およびゲル分別物質のつぎのマイトジェ
ネシスアッセイによって、ＶＳＢ調製物はさらに特徴づ
けられる。ゲルの３０キロダルトン領域からＶＳＢマイ
トジェン活性の９０％が回収される（図１７）。これは
この表現単位が著しく均一で同様に十分にプロセシング
された物質を生じることを示している。この意味で、Ｖ
ＳＢ蛋白質は全く不均一な上記のＶＳ２αおよびＶＳα
蛋白質よりすぐれている。さらに、ＶＳＢ物質は正の化
学誘引物質であり、ＰＤＧＦ生物学的活性の全スペクト
ルを有し得ることを示している。 【００６９】上記の通り、本発明の特別の具体化を例示
の目的で記載してきたが、本発明の精神と範囲から離れ
ることなく種々の変形を行なうことができる。したがっ
て本発明は特許請求の範囲による以外は制限を受けな
い。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＳＶのプロウィルスのゲノムの模式的な制限
酵素地図である。 【図２】ＳＳＶゲノムのｖ−sis 域によってコード化さ
れたヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を示す。 【図３】ＳＳＶゲノムのｖ−sis 域によってコード化さ
れたヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を示す。 【図４】ＭＦα１プロモーターを有し、及びｖ−sis 遺
伝子の上流に分泌信号配列を有するプラスミドの構築を
例示する。 【図５】プラスミドｐ１９２の構築を例示する。 【図６】アミノ末端６６ｖ−sis コドンのオリゴヌクレ
オチド指令欠失変異誘発を例示する。 【図７】プラスミドｐ２７０の構築を例示する。 【図８】ＴＰＩターミネーターの上流のｖ−sis 発現単
位の挿入を例示する。 【図９】ＴＰＩプロモーターによるＭＦα１プロモータ
ーの代替及びｐＣＰＯＴベクターの中でのＶＳ２αの構
造体の導入を例示する。 【図１０】プラスミドｐＴＶＳ２αＴの構築を例示す
る。 【図１１】Ｂ鎖発現単位ＶＳＢの構築及びそのｐＭＰＯ
Ｔ２ベクターの中への導入を例示する。 【図１２】ニック翻訳 (nick-translated)ｖ−sis 遺伝
子フラグメントを用いて探査された各種プラスミドによ
り形質転換された酵母宿主から単離された全ＲＮＡの電
気泳動分析及びそれに続くハイブリダイゼーション分析
を示す。 【図１３】プラスミドｐＶＳα、ｐＶＳ２α、ｐ１１７
−２及びｐＣＰＯＴを含有する酵母の形質転換体からの
濃縮培地のＥＬＩＳＡの結果を示す。 【図１４】純化ＰＤＧＦと比較された場合のプラスミド
ｐＶＳα及びｐ１１７−２を含有する酵母の形質転換体
からの濃縮培地の有糸分裂促進活性の投与応答曲線であ
る。 【図１５】真正のＰＤＧＦと比較した場合のプラスミド
ｐＶＳαｍ、ｐＶＳ２αｍ、ｐＶＳＢｍ及びｐＭＰＯＴ
２含有の酵母形質転換体からの濃縮培地と結合したＰＤ
ＧＦレセプターの投与応答曲線である。 【図１６】真正のＰＤＧＦと比較した場合のプラスミド
ｐＶＳαｍ、ｐＶＳ２αｍ、ｐＶＳＢｍ及びｐＭＰＯＴ
２含有酵母形質転換体からの濃縮培地の有糸分裂促進活
性の投与応答曲線である。 【図１７】ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分
別された蛋白質（即ち、ＶＳＢをコードする蛋白質）の
有糸分裂促進活性を例示する図である。
酵素地図である。 【図２】ＳＳＶゲノムのｖ−sis 域によってコード化さ
れたヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を示す。 【図３】ＳＳＶゲノムのｖ−sis 域によってコード化さ
れたヌクレオチド配列および予測アミノ酸配列を示す。 【図４】ＭＦα１プロモーターを有し、及びｖ−sis 遺
伝子の上流に分泌信号配列を有するプラスミドの構築を
例示する。 【図５】プラスミドｐ１９２の構築を例示する。 【図６】アミノ末端６６ｖ−sis コドンのオリゴヌクレ
オチド指令欠失変異誘発を例示する。 【図７】プラスミドｐ２７０の構築を例示する。 【図８】ＴＰＩターミネーターの上流のｖ−sis 発現単
位の挿入を例示する。 【図９】ＴＰＩプロモーターによるＭＦα１プロモータ
ーの代替及びｐＣＰＯＴベクターの中でのＶＳ２αの構
造体の導入を例示する。 【図１０】プラスミドｐＴＶＳ２αＴの構築を例示す
る。 【図１１】Ｂ鎖発現単位ＶＳＢの構築及びそのｐＭＰＯ
Ｔ２ベクターの中への導入を例示する。 【図１２】ニック翻訳 (nick-translated)ｖ−sis 遺伝
子フラグメントを用いて探査された各種プラスミドによ
り形質転換された酵母宿主から単離された全ＲＮＡの電
気泳動分析及びそれに続くハイブリダイゼーション分析
を示す。 【図１３】プラスミドｐＶＳα、ｐＶＳ２α、ｐ１１７
−２及びｐＣＰＯＴを含有する酵母の形質転換体からの
濃縮培地のＥＬＩＳＡの結果を示す。 【図１４】純化ＰＤＧＦと比較された場合のプラスミド
ｐＶＳα及びｐ１１７−２を含有する酵母の形質転換体
からの濃縮培地の有糸分裂促進活性の投与応答曲線であ
る。 【図１５】真正のＰＤＧＦと比較した場合のプラスミド
ｐＶＳαｍ、ｐＶＳ２αｍ、ｐＶＳＢｍ及びｐＭＰＯＴ
２含有の酵母形質転換体からの濃縮培地と結合したＰＤ
ＧＦレセプターの投与応答曲線である。 【図１６】真正のＰＤＧＦと比較した場合のプラスミド
ｐＶＳαｍ、ｐＶＳ２αｍ、ｐＶＳＢｍ及びｐＭＰＯＴ
２含有酵母形質転換体からの濃縮培地の有糸分裂促進活
性の投与応答曲線である。 【図１７】ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分
別された蛋白質（即ち、ＶＳＢをコードする蛋白質）の
有糸分裂促進活性を例示する図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
(Ｃ１２Ｎ 1/19
Ｃ１２Ｒ 1:865）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:865）
(72)発明者 ジェイムズ ダレル ケリー
アメリカ合衆国 ワシントン州 98105
シアトル ノース イースト フィフ
ティファースト ストリート 124
(56)参考文献 ＥＭＢＯ．Ｊ ３［５］（1984，Ｍａ
ｙ）ｐ．921−928
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅｓｅｑ
ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．生物学的に活性なＰＤＧＦ類似因子の製造方法にお
いて、 真核生物細胞内で生物学的に活性なＰＤＧＦ類似因子の
発現及び分泌を指示し得るＤＮＡ構成体であって、転写
プロモーターと、その下流にあるＰＤＧＦのＢ鎖をコー
ドする遺伝子を含み、該遺伝子が、図２及び３のアミノ
酸６７〜１７５又は図２及び３のアミノ酸６７〜１７５
と相同なヒトのＰＤＧＦのＢ鎖と、真核生物細胞からの
ＰＤＧＦのＢ鎖の分泌を指令し得る信号配列とをコード
するものであり、それによって、該Ｂ鎖が、ＰＤＧＦと
実質的に同一の構造及び有糸分裂促進活性を有するタン
パク質を生成する該ＤＮＡ構成体を真核生物宿主細胞の
中へ導入し； 該真核生物宿主細胞を適切な培地の中で生育させ；そし
て該真核生物宿主細胞から該遺伝子にもとづくタンパク
質製晶を単離することを特徴とする前記の方法。 ２．真核生物細胞が酵母細胞であり、プロモーター及び
信号配列が酵母由来のものである請求項１記載の方法。 ３．生物学的に活性なＰＤＧＦ類似因子の製造方法にお
いて、 酵母の中で複製可能であって酵母のトリオースホスフェ
ートイソメラーゼプロモーターを含有するＤＮＡ構成体
であって、該酵母プロモーターが酵母交配フェロモンア
ルファ因子をコードする遺伝子の信号配列をその下流に
伴い、該信号配列が、図２及び３のアミノ酸６７〜１７
５又は図２及び３のアミノ酸６７〜１７５と相同なヒト
のＰＤＧＦのＢ鎖をコードするｖ−ｓｉｓ遺伝子の部分
的遺伝子及び酵母トリオースホスフェートイソメラーゼ
ターミネーターをその下流に夫々伴う該ＤＮＡ構成体を
真核生物宿主細胞の中へ導入し； 該真核生物宿主細胞を適切な培地の中で生育させ；そし
て該真核生物宿主細胞から該遺伝子にもとづくタンパク
質製品を単離することを特徴とする請求項１記載の方
法。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/660,496 US4769328A (en) | 1984-10-12 | 1984-10-12 | Expression of biologically active PDGF analogs in yeast |
| US660496 | 1985-02-25 | ||
| US06/705,175 US4801542A (en) | 1984-10-12 | 1985-02-25 | Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells |
| US705175 | 1985-02-25 | ||
| CA000492370A CA1340212C (en) | 1984-10-12 | 1985-10-07 | Expression of biologically active platelet derived growth factor analogsin eucaryotic cells |
| CA 617115 CA1340846E (en) | 1984-10-12 | 1999-06-11 | Expression of biologically active platelet derived growth factor analogs in eucaryotic cells |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60226637A Division JP2837407B2 (ja) | 1984-10-12 | 1985-10-11 | 生物学的に活性なｐｄｇｆ類似因子の真核生物細胞内での発現 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10117790A JPH10117790A (ja) | 1998-05-12 |
| JP3145968B2 true JP3145968B2 (ja) | 2001-03-12 |
Family
ID=45478613
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60226637A Expired - Lifetime JP2837407B2 (ja) | 1984-10-12 | 1985-10-11 | 生物学的に活性なｐｄｇｆ類似因子の真核生物細胞内での発現 |
| JP28366397A Expired - Lifetime JP3145968B2 (ja) | 1984-10-12 | 1997-10-16 | 生物学的に活性なｐｄｇｆ類似因子の真核生物細胞内での発現 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60226637A Expired - Lifetime JP2837407B2 (ja) | 1984-10-12 | 1985-10-11 | 生物学的に活性なｐｄｇｆ類似因子の真核生物細胞内での発現 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4801542A (ja) |
| EP (1) | EP0177957B2 (ja) |
| JP (2) | JP2837407B2 (ja) |
| AT (2) | ATE188255T1 (ja) |
| AU (2) | AU4845485A (ja) |
| CA (2) | CA1340212C (ja) |
| DE (4) | DE487116T1 (ja) |
| LU (1) | LU90408I2 (ja) |
| NL (1) | NL990016I2 (ja) |
Families Citing this family (46)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3751632T2 (de) * | 1986-08-13 | 1996-06-13 | Zymogenetics Inc | Expression von biologisch-aktiven PDGF-Analogen in eukaryotischen Zellen |
| US5474982A (en) * | 1986-08-13 | 1995-12-12 | Zymogenetics, Inc. | PDGF analogs and methods of use |
| US5019559A (en) * | 1986-11-14 | 1991-05-28 | President And Fellows Of Harvard College | Wound healing using PDGF and IGF-II |
| JPH01502669A (ja) * | 1987-03-13 | 1989-09-14 | アムジエン・インコーポレーテツド | 精製された血小板由来の成長因子及びその精製方法 |
| US5219759A (en) * | 1987-04-22 | 1993-06-15 | Chiron Corporation | Recombinant DNA encoding PDGF A-chain polypeptide and expression vectors |
| US6939849B1 (en) | 1987-04-22 | 2005-09-06 | Chiron Corporation | Recombinant PDGF A-chain homodimers and methods of use |
| EP0288307B1 (en) * | 1987-04-22 | 1996-09-04 | Chiron Corporation | Recombinant production of PDGF A-chain polypeptides |
| US5094941A (en) * | 1987-12-31 | 1992-03-10 | Zymogenetics, Inc. | Monoclonal antibodies to PDGF |
| US5759815A (en) * | 1988-02-11 | 1998-06-02 | Creative Biomolecules, Inc. | Production of platelet derived growth factor (PDGF) an muteins thereof |
| WO1990000178A1 (en) * | 1988-06-30 | 1990-01-11 | Cor Therapeutics, Inc. | Platelet blocking peptides |
| US5037743A (en) * | 1988-08-05 | 1991-08-06 | Zymogenetics, Inc. | BAR1 secretion signal |
| DE3900770A1 (de) * | 1989-01-12 | 1990-07-26 | Juergen Prof Dr Hoppe | Verfahren zur herstellung von pdgf-a und pdgf-aa |
| US6899882B1 (en) * | 1989-03-24 | 2005-05-31 | The Regents Of The University Of California | Endothelial cell growth factor methods of isolation and expression |
| US5686410A (en) * | 1989-07-20 | 1997-11-11 | Novartis Ag | Polypeptide derivatives |
| US5219739A (en) * | 1989-07-27 | 1993-06-15 | Scios Nova Inc. | DNA sequences encoding bVEGF120 and hVEGF121 and methods for the production of bovine and human vascular endothelial cell growth factors, bVEGF120 and hVEGF121 |
| US5272064A (en) * | 1989-12-19 | 1993-12-21 | Amgen Inc. | DNA molecules encoding platelet-derived growth factor B chain analogs and method for expression thereof |
| US6172039B1 (en) | 1990-04-16 | 2001-01-09 | Apex Bioscience, Inc. | Expression of recombinant hemoglobin and hemoglobin variants in yeast |
| DK0547064T3 (da) * | 1990-07-23 | 1995-03-20 | Zymogenetics Inc | Proteaseresistent PDGF og anvendelsesfremgangsmåde |
| US5886141A (en) * | 1990-10-26 | 1999-03-23 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Smooth muscle mitogen peptides and DNA coding therefor |
| GB9101645D0 (en) * | 1991-01-25 | 1991-03-06 | British Bio Technology | Compounds |
| ES2099304T3 (es) * | 1992-02-10 | 1997-05-16 | Takeda Chemical Industries Ltd | Mitogeno de la musculatura lisa y adn que lo codifica. |
| ES2293137T3 (es) | 1995-10-11 | 2008-03-16 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Combinacion de pdgf, kgf,igf e igfbp para curacion de heridas. |
| DE69739319D1 (de) * | 1996-12-13 | 2009-04-30 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Verfahren zur Expression von PDGF oder IGR Proteinen in Hefe |
| EP1025212B1 (en) | 1997-10-14 | 2007-09-26 | Darwin Molecular Corporation | Thymidine kinase mutants and fusion proteins having thymidine kinase and guanylate kinase activities |
| US6194169B1 (en) * | 1998-06-04 | 2001-02-27 | The University Of Kentucky Research Foundation | Enhanced expression of human platelet-derived growth factor in Pichia pastoris |
| IL143266A0 (en) | 1998-11-27 | 2002-04-21 | Darwin Discovery Ltd | Transforming growth factor-beta binding proteins and pharmaceutical compositions for increasing bone mineral content utilizing the same |
| US20040009535A1 (en) | 1998-11-27 | 2004-01-15 | Celltech R&D, Inc. | Compositions and methods for increasing bone mineralization |
| US7063850B1 (en) | 1998-12-22 | 2006-06-20 | University Of Tennessee Research Foundation | Protective antigen of group A Streptococci |
| US6358733B1 (en) * | 2000-05-19 | 2002-03-19 | Apolife, Inc. | Expression of heterologous multi-domain proteins in yeast |
| DE60228477D1 (de) | 2001-05-08 | 2008-10-02 | Darwin Molecular Corp | Verfahren zur regulierung der immunfunktion in primaten unter verwendung des foxp3-proteins |
| WO2003060143A2 (en) * | 2001-10-26 | 2003-07-24 | Id Biomedical Corporation Of Washington | Efficient protein expression system |
| CA2472937C (en) | 2002-01-11 | 2014-06-17 | Biomarin Pharmaceutical, Inc. | Use of p97 as an enzyme delivery system for the delivery of therapeutic lysosomal enzymes |
| US20030139333A1 (en) * | 2002-01-18 | 2003-07-24 | Genetix Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for promoting angiogenesis |
| US20050048041A1 (en) * | 2003-01-13 | 2005-03-03 | Rao Mahendra S. | Persistent expression of candidate molecule in proliferating stem and progenitor cells for delivery of therapeutic products |
| WO2008005533A2 (en) * | 2006-07-06 | 2008-01-10 | Aaron Thomas Tabor | Compositions and methods for genetic modification of cells having cosmetic function to enhance cosmetic appearance |
| KR20100014290A (ko) * | 2006-11-30 | 2010-02-10 | 더 유니버시티 오브 브리티쉬 콜럼비아 | 분자 아주반트로서 ｔａｐ―１ 및/또는 ｔａｐ―２를 포함하는 폭스비리대 치료 |
| BR112012000865A2 (pt) | 2009-07-17 | 2019-09-24 | T Tabor Aaron | "composição e método para a modificação genética cosmética de células substancialmente intactas" |
| JP6208658B2 (ja) | 2011-07-05 | 2017-10-04 | バイオアシス テクノロジーズ インコーポレイテッド | ｐ９７−抗体結合体および使用方法 |
| EP2739649B1 (en) | 2011-08-05 | 2017-09-27 | Bioasis Technologies Inc. | P97 fragments with transfer activity |
| EP2880156B1 (en) | 2012-07-31 | 2017-08-23 | biOasis Technologies Inc | Dephosphorylated lysosomal storage disease proteins and methods of use thereof |
| CN105263958B (zh) | 2013-03-13 | 2019-09-27 | 比奥阿赛斯技术有限公司 | p97片段及其应用 |
| AU2014236208B2 (en) | 2013-03-14 | 2018-07-19 | Genvivo, Inc. | Thymidine kinase diagnostic assay for gene therapy applications |
| JP6603227B2 (ja) | 2014-02-03 | 2019-11-06 | バイオアシス テクノロジーズ インコーポレイテッド | Ｐ９７融合タンパク質 |
| DK3107562T3 (da) | 2014-02-19 | 2019-12-16 | Bioasis Technologies Inc | P97-ids-fusionsproteiner |
| US10058619B2 (en) | 2014-05-01 | 2018-08-28 | Bioasis Technologies, Inc. | P97-polynucleotide conjugates |
| JP6871855B2 (ja) | 2014-10-14 | 2021-05-19 | サムエル リンチ， | 創傷を処置するための組成物 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4350687A (en) * | 1980-02-10 | 1982-09-21 | Research Corporation | Platelet derived cell growth factor |
| AU600885B2 (en) * | 1984-05-25 | 1990-08-30 | Zymogenetics Inc. | Stable DNA constructs |
-
1985
- 1985-02-25 US US06/705,175 patent/US4801542A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-10-07 CA CA000492370A patent/CA1340212C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-10-10 AT AT91121387T patent/ATE188255T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-10-10 DE DE199191121387T patent/DE487116T1/de active Pending
- 1985-10-10 DE DE1999175042 patent/DE19975042I2/de active Active
- 1985-10-10 AT AT85112852T patent/ATE84312T1/de active
- 1985-10-10 DE DE3588218T patent/DE3588218T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-10-10 EP EP85112852A patent/EP0177957B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-10-10 AU AU48454/85A patent/AU4845485A/en not_active Abandoned
- 1985-10-10 DE DE3586960T patent/DE3586960T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-10-11 JP JP60226637A patent/JP2837407B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-05-10 AU AU54885/90A patent/AU638010B2/en not_active Expired
-
1997
- 1997-10-16 JP JP28366397A patent/JP3145968B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-05-28 NL NL990016C patent/NL990016I2/nl unknown
- 1999-06-11 CA CA 617115 patent/CA1340846E/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-25 LU LU90408C patent/LU90408I2/fr unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＥＭＢＯ．Ｊ ３［５］（１９８４，Ｍａｙ）ｐ．９２１−９２８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0177957B2 (en) | 2004-08-25 |
| AU4845485A (en) | 1986-04-17 |
| DE3588218D1 (de) | 2000-02-03 |
| EP0177957A3 (en) | 1988-02-03 |
| ATE84312T1 (de) | 1993-01-15 |
| DE3588218T2 (de) | 2000-05-18 |
| JPS62278A (ja) | 1987-01-06 |
| NL990016I1 (nl) | 1999-08-02 |
| JPH10117790A (ja) | 1998-05-12 |
| DE3586960T3 (de) | 2005-01-20 |
| EP0177957B1 (en) | 1993-01-07 |
| NL990016I2 (nl) | 1999-11-01 |
| AU638010B2 (en) | 1993-06-17 |
| LU90408I2 (fr) | 1999-08-25 |
| AU5488590A (en) | 1991-01-31 |
| DE3586960D1 (ja) | 1993-02-18 |
| DE487116T1 (de) | 1992-10-15 |
| CA1340846E (en) | 1999-12-07 |
| CA1340212C (en) | 1998-12-15 |
| EP0177957A2 (en) | 1986-04-16 |
| DE3586960T2 (de) | 1993-05-13 |
| ATE188255T1 (de) | 2000-01-15 |
| US4801542A (en) | 1989-01-31 |
| DE19975042I2 (de) | 2004-01-29 |
| JP2837407B2 (ja) | 1998-12-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3145968B2 (ja) | 生物学的に活性なｐｄｇｆ類似因子の真核生物細胞内での発現 | |
| US4769328A (en) | Expression of biologically active PDGF analogs in yeast | |
| US4766073A (en) | Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells | |
| FI108796B (fi) | Menetelmä kädellisen granulosyytin/makrofagin pesäkkeitä stimuloiva tekijä -proteiinin valmistamiseksi | |
| SU1834904A3 (ru) | Способ получения последова-. тельности днк, содержащей фрагмент кодирующий человеческий проаполипопротеин а-1 2 | |
| JP2708099B2 (ja) | エリスロポエチン類縁体 | |
| US4966849A (en) | CDNA and genes for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression | |
| US4889919A (en) | Biologically active PDGF derived A-chain homodimers | |
| US5187263A (en) | Expression of biologically active PDGE analogs in eucaryotic cells | |
| EP0235162B1 (en) | Cdna and gene for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression | |
| US5045633A (en) | Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells | |
| NL8900178A (nl) | Groei regulerende clycoproteinen. | |
| US5516896A (en) | Biologically active B-chain homodimers | |
| JPS63119682A (ja) | 細胞増殖刺激剤 | |
| JPH07504645A (ja) | 酵母での組換えヘモグロビンの発現 | |
| EP0487116B1 (en) | Biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells | |
| CZ289498A3 (cs) | Rekombinantní bílkovina GM-CSF lidí a farmaceutický prostředek, který ji obsahuje | |
| JP2763026B2 (ja) | ヒトｂ細胞分化因子をコードする遺伝子系 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |