CN105246337B - 用于基因治疗应用的胸苷激酶诊断分析 - Google Patents

用于基因治疗应用的胸苷激酶诊断分析 Download PDF

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Abstract

提供了编码改进的单纯疱疹病毒胸苷激酶的核酸序列，包括它们在诊断和治疗应用中的用途。可以使用保守突变、非保守突变或二者使胸苷激酶突变。还提供了基因治疗系统，包括病毒和逆转录病毒颗粒。

Description

用于基因治疗应用的胸苷激酶诊断分析
交叉引用
本申请要求2013年3月14日提交的美国临时申请号61/784,901的权益，该临时申请通过引用全文并入本文。
本申请涉及以下共同未决的专利申请：与本申请同日提交的申请序列号[尚未指定]，代理卷号30863-722.201，该申请通过引用全文并入本文。
发明背景
增殖性疾病如癌症对社会构成了严峻挑战。癌性生长，包括恶性癌性生长，具有独特的特征，例如不可控的细胞增殖(其导致，例如恶性组织的不受调控的生长)，入侵局部以及甚至远端组织的能力，缺乏分化，缺乏可检测的症状，以及最显著的是，缺乏有效的治疗和预防。
癌症可在任何年龄在任何器官的任何组织中发展。癌症的病因学尚未被明确地界定，但诸如遗传易感性、染色体断裂病症、病毒、环境因素和免疫失调等机制均已与恶性细胞生长和转化相关联。癌症包括一大类别的医学状况，影响到全球数百万的个人。癌细胞可能出现在身体的几乎任何器官和/或组织中。在世界范围内，每年超过1千万人被诊断出患有癌症，并且据估计到2020年，这一数字将增加至每年1500万新发病例。癌症导致每年600万例死亡或全世界死亡数的12％。
发明内容
本文提供了用于鉴定能够从基因疗法治疗中受益的受试者或患者的方法和组合物。更具体地说，本文提供了用于鉴定以足够的量表达包含在基因治疗剂中的治疗性蛋白质的受试者或患者的方法和组合物。优选地，所述治疗性蛋白质是酶，更具体地是病毒胸苷激酶或突变的病毒胸苷激酶。
因此，本文提供了用于鉴定能够从基因疗法治疗中受益的患者的方法，所述方法包括：将包含HSV-TK多核苷酸的基因治疗逆转录病毒颗粒施用于所述患者；将与放射性示踪剂连接的HSV-TK底物施用于所述患者；测量存在于所述患者中的放射性信号的相对量和位置；以及确定所述患者的病变的位置，其中将具有以下特征的患者鉴定为能够从基因疗法治疗中受益：放射性信号在某一阈值之上，以及所述放射性信号的位置与所述患者的步骤(d)中测定的病变相关。
在一些实施方案中，所述HSV-TK底物选自：FHBG(9-[4-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)，FHPG(9-([3-氟-1-羟基-2-丙氧基]甲基)鸟嘌呤)，FGCV(氟更昔洛韦)，FPCV(氟喷昔洛韦)，FIAU(1-(2'-脱氧-2'-氟-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶)，FEAU(氟-5-乙基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FMAU(氟-5-甲基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FHOMP(6-((1-氟-3-羟基丙-2-基氧基)甲基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮)，更昔洛韦，缬更昔洛韦，阿昔洛韦，伐昔洛韦(valacivlovir)，喷昔洛韦，在N-1处具有4-羟基-3-(羟基甲基)丁基侧链的放射性标记的嘧啶(HHG-5-FEP)或带有2,3-二羟基丙基、阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦样侧链的5-(2-)羟基乙基)-和5-(3-羟基丙基)-取代的嘧啶衍生物。在其他实施方案中，所述HSV-TK底物是FHBG(9-(4-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)。
在其他实施方案中，所述放射性示踪剂是18F、64Cu、99mTe、11C、14C、124I、123I、131I、15O、13N和/或82RbCl。在其他实施方案中，所述放射性示踪剂是18F。
在一个实施方案中，所述HSV-TK底物是[18F]FHBG(9-(4-18F-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)。在其他实施方案中，使用正电子发射断层成像(PET)扫描来测量放射性示踪剂信号。
在其他实施方案中，所述阈值水平是至少2.0SUV(标准摄取值)以上或比PET扫描背景高至少20％，或者是约1.0SUV至约3.0SUV，或比PET扫描背景高约20％至约40％。
在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括采用HSV-TK逆转录病毒颗粒治疗所述患者。
在其他实施方案中，使编码的HSV-TK多核苷酸的病毒核定位序列(NLS)突变。在其他实施方案中，使胸苷激酶多核苷酸突变以在所表达的胸苷激酶蛋白的氨基末端处或附近包含核输出序列(NES)。在一个实施方案中，使所述胸苷激酶多核苷酸突变以提高所表达的胸苷激酶蛋白的底物结合。在另一个实施方案中，所述突变是A168H。
在其他实施方案中，本文公开的方法进一步包括使所述胸苷激酶多核苷酸突变以除去病毒核定位序列(NLS)并且在所表达的胸苷激酶蛋白的氨基末端处或附近包含核输出序列(NES)。在一些实施方案中，所述HSV-胸苷激酶多核苷酸是SEQ ID NO:18。
在一个实施方案中，本文公开的方法进一步包括在病毒包膜上表达的靶向蛋白。在一些实施方案中，所述靶向蛋白与胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖或RGD结合。在其他实施方案中，所述靶向蛋白与胶原蛋白结合。在其他实施方案中，所述靶向蛋白是SEQ ID NO:25。
本文还提供了用于鉴定需要治疗病变并能够从基因疗法治疗中受益的患者或受试者的方法和组合物：a)施用包含HSV-TK多核苷酸的基因治疗逆转录病毒颗粒并采用编码HSV-胸苷激酶的多核苷酸转导来自所述患者的细胞；b)使用与放射性示踪剂连接的HSV-TK底物处理所述细胞；c)测量存在于靶组织中的放射性信号的相对量；d)鉴定其中放射性标记的HSV-TK底物的水平在阈值之上的患者；e)确定所述患者的病变的位置；以及f)当所述患者中测量的放射性信号在某一阈值之上并且所测量的放射性信号的位置与所述患者的步骤(e)中测定的病变相关时，使用包含HSV-TK多核苷酸的基因治疗逆转录病毒颗粒治疗所述患者或受试者。
本文提供了用于测量转导的HSV-胸苷的酶活性的方法和组合物，所述方法包括：a)施用包含HSV-TK多核苷酸的基因治疗逆转录病毒颗粒并使用编码HSV-胸苷激酶的多核苷酸转导来自患者的细胞；b)使用与放射性示踪剂连接的HSV-TK底物处理所述细胞；以及c)测量存在于靶组织中的放射性信号的相对量。
此外，本文提供了用于确定施用基因治疗颗粒后受试者或患者中的示踪剂信号的水平，并在所述示踪剂信号的水平在设定的阈值之上时选择所述受试者或患者用于采用所述基因治疗颗粒的治疗的方法和组合物。在一些实施方案中，该示踪剂是放射性、发光或荧光信号。在一些实施方案中，放射性示踪剂元素是18F、64Cu、99mTe、11C、14C、124I、123I、131I、15O、13N和/或82RbCl。
在其他实施方案中，本文提供了用于确定施用胸苷激酶基因治疗构建体后受试者或患者中的放射性示踪剂信号的水平，并在所述示踪剂信号的水平在设定的阈值之上时选择所述受试者或患者用于采用所述基因治疗构建体的治疗的方法和组合物。在一些实施方案中，该示踪剂是放射性示踪剂。在其他实施方案中，放射性示踪剂元素是18F、64Cu、99mTe、11C、14C、124I、123I、131I、15O、13N和/或82RbCl。在其他实施方案中，所述放射性示踪剂元素与核苷或合成核苷靶标偶联以形成放射性靶标。在一些实施方案中，该核苷靶标是FHBG(9-[4-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)，FHPG(9-([3-氟-1-羟基-2-丙氧基]甲基)鸟嘌呤)，FGCV(氟更昔洛韦)，FPCV(氟喷昔洛韦)，FIAU(1-(2'-脱氧-2'-氟-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶)，FEAU(氟-5-乙基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FMAU(氟-5-甲基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FHOMP(6-((1-氟-3-羟基丙-2-基氧基)甲基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮)，更昔洛韦，缬更昔洛韦，阿昔洛韦，伐昔洛韦，喷昔洛韦，在N-1处具有4-羟基-3-(羟基甲基)丁基侧链的放射性标记的嘧啶(HHG-5-FEP)或带有2,3-二羟基丙基、阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦样侧链的5-(2-)羟基乙基)-和5-(3-羟基丙基)-取代的嘧啶衍生物。优选地，所述放射性靶标是[18F]FHBG(9-(4-18F-氟-3-[羟基甲基]丁基)鸟嘌呤)。
本文还提供了包括以下步骤的方法：(a)确定受试者中[18F]FHBG信号的水平；以及(b)为采用组合物的治疗选择受试者，其中FHBG的水平在阈值水平之上。在一些实施方案中，所述阈值水平是至少约2.0SUV(标准摄取值)或比PET扫描背景信号高至少20％。
此外，本文提供了包括以下步骤的方法：(a)确定受试者中[18F]FHBG信号的水平；(b)从采用组合物的治疗中排除受试者，其中所述受试者中FHBG的水平是大于约2.0SUV或比PET扫描背景信号高大于约20％；以及(c)向所述受试者施用抗癌剂。
在一些实施方案中，本发明提供了用于鉴定对癌症治疗敏感的受试者的方法，所述方法包括：a)鉴定所述受试者中[18F]FHBG的表达；b)治疗所述受试者。
本文提供了测量以下物质介导的旁观者效应的方法：HSV-TK-FHBG(9-[4-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)，FHPG(9-([3-氟-1-羟基-2-丙氧基]甲基)鸟嘌呤)，FGCV(氟更昔洛韦)，FPCV(氟喷昔洛韦)，FIAU(1-(2'-脱氧-2'-氟-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶)，FEAU(氟-5-乙基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FMAU(氟-5-甲基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FHOMP(6-((1-氟-3-羟基丙-2-基氧基)甲基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮)，更昔洛韦，缬更昔洛韦，阿昔洛韦，伐昔洛韦，喷昔洛韦，在N-1处具有4-羟基-3-(羟基甲基)丁基侧链的放射性标记的嘧啶(HHG-5-FEP)或带有2,3-二羟基丙基、阿昔洛韦样、更昔洛韦样和喷昔洛韦样侧链的5-(2-)羟基乙基)-和5-(3-羟基丙基)-取代的嘧啶衍生物，所述方法包括：a)采用编码HSV-TK和第一荧光蛋白的多核苷酸转导细胞；b)采用编码与第一荧光或生物发光蛋白在光学上可辨别的第二或生物发光蛋白的多核苷酸转导所述细胞；c)采用在由HSV-TK磷酸化时变成细胞毒性的药剂处理所述细胞；以及d)测量所述第一荧光蛋白和第二荧光蛋白的相对表达量。在一个实施方案中，步骤d)包括Perkin Elmer读板仪(Plate reader)、荧光计、荧光激活细胞分选仪(fluorescent activated cell sorter，FACS)、细胞计数仪(cellometer)或分光光度计。在另一个实施方案中，步骤d)包括测量受试者体内的第二荧光或生物发光蛋白的荧光输出。
附图说明
本发明的新颖特征在所附的权利要求书中特别地提出。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在这些附图中：
图1图示了9-[4-[18F]氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤([18F]FHBG)的结构及其抑制机理。
图2是在4.53mCi静脉内注射[18F]FHBG后的四个不同时间段，健康人受试者中[18F]FHBG生物分布的全身冠状图片。
图3是IA期临床试验的示意图。
图4是IB期临床试验的示意图。
图5是患者对采用AAV逆转录病毒载体颗粒中的HSV-TK治疗的反应。
图6在PET扫描(上部的图)、CT扫描(中部的图)和信号融合(下部的图)中测量了患者对施用[18F]FHBG的反应。
图7是动物中HSV-TK逆转录病毒载体颗粒的生物分布的荧光图片。
图8是施用Reximmune C1和C2的大鼠的5mm切片的冠状三小时图片的对比。左侧的肿瘤表达Reximmune-C2，而右侧的肿瘤为Reximmune-C1。
图9是图8的图形表示，其示出了在1和3小时图片的肿瘤中的均值的平均值。误差条是平均值的标准误差。B12是表达Reximmune-C2的肿瘤，而A9是表达Reximmune-C1的肿瘤。C6是天然细胞系肿瘤。
具体实施方式
本文提供了用于鉴定对采用基因治疗递送系统的治疗敏感的患者的方法和组合物。本文还提供了用于鉴定能够从基因疗法治疗中受益的受试者或患者的方法和组合物。此外，本文提供了用于鉴定以足够的量表达包含在基因治疗构建体中的治疗性蛋白质的受试者或患者的方法和组合物。对能够表达足够量的治疗性蛋白质的受试者或患者的鉴定使从业者能够筛选和鉴定可从特定基因疗法治疗中受益的患者。如此，可在早期鉴定出能够通过基因治疗颗粒递送抗癌剂以治疗例如原发性和转移性病变的患者和受试者。
在一些实施方案中，由包含在病毒颗粒中的基因治疗构建体表达的抗癌剂可通过静脉内输注施用于患者。在其他实施方案中，由基因治疗构建体表达的抗癌剂通过动脉间输注施用于患者。在其他实施方案中，包含抗癌剂的病毒颗粒可瘤内施用。在其他实施方案中，由基因治疗构建体表达的抗癌剂可在体外选择性地转导至靶细胞。
在其他实施方案中，由基因治疗构建体表达的抗癌剂可靶向至原发性和转移性病变，从而将肿瘤杀伤基因递送至原发性和转移性病变，同时使正常细胞和组织不受影响。在一些实施方案中，基因治疗构建体的靶向是特异性的。在其他实施方案中，基因治疗构建体的靶向是针对细胞表面或者细胞外蛋白质的。在一些实施方案中，该细胞表面或者细胞外蛋白质是胶原蛋白。在其他实施方案中，基因治疗构建体的靶向是针对由肿瘤细胞表达的特异性蛋白质。这样的抗癌剂提供了可特别地靶向癌细胞的强有力的工具，从而减轻了其他已知癌症治疗的不期望的副作用。
在一些实施方案中，所述基因治疗构建体是逆转录病毒。逆转录病毒通常具有三种常见的开放阅读框，即gag、pol和env，它们分别编码基质、gag和核壳体结构蛋白，编码包括逆转录酶、整合酶和蛋白酶在内的酶，以及编码包膜蛋白和跨膜融合蛋白。通常，逆转录病毒载体颗粒由提供必需的gag、pol和env基因产物的包装细胞系所产生(Miller等人,Human Gene Therapy,Vol.1,pgs.5-14(1990))。这种方法导致产生逆转录病毒载体颗粒，该颗粒转导哺乳动物细胞，但当它们整合到该细胞的基因组中后便无法进一步复制。
在一些实施方案中，所述逆转录病毒包含至少一种由基因治疗构建体递送的治疗性蛋白质或者载荷(payload)。在一些实施方案中，该治疗性蛋白质或者载荷是酶。在其他实施方案中，该治疗性蛋白质或者载荷是胸苷激酶。在其他实施方案中，该胸苷激酶是HSV(单纯疱疹病毒)胸苷激酶。在其他实施方案中，该胸苷激酶是HSV(单纯疱疹病毒)胸苷激酶-1。
在一些实施方案中，针对体内和体外最大基因表达和肿瘤杀伤活性(包括癌症基因治疗)对HSV-TK基因治疗构建体进行优化。在一些实施方案中，对HSV-TK基因进行密码子优化。在其他实施方案中，所述HSV-TK基因治疗构建体靶向至特定的肿瘤细胞或组织。在其他实施方案中，所述HSV-TK基因治疗构建体靶向至在肿瘤细胞中特异性表达的细胞表面蛋白质。在其他实施方案中，所述HSV-TK基因治疗构建体靶向至在肿瘤组织或细胞中表达的细胞表面蛋白质。在其他实施方案中，所述HSV-TK基因治疗构建体靶向至胶原蛋白。
当在细胞中体内表达时，HSV-TK酶促裂解共施用的核苷药剂，例如更昔洛韦、喷昔洛韦、缬更昔洛韦、阿昔洛韦和伐昔洛韦，并随后将共施用的药剂转化成细胞毒性剂。哺乳动物胸苷激酶对这些共施用的药剂是不敏感的。因此，在HSV-TK基因表达后，仅肿瘤细胞被赋予细胞毒性剂敏感性。更昔洛韦由所得HSV-TK转化成单磷酸化产物，该单磷酸化产物随后由宿主激酶转化成二磷酸和三磷酸，从而导致细胞毒性和肿瘤细胞死亡。病毒胸苷激酶治疗先前已经在包括神经胶质瘤、肝细胞瘤和黑素瘤在内的数种癌症的治疗中显示出具有前景。
HSV-TK还将例如9-[4-18F-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤([18F]FHBG)(图1)的核苷类似物选择性地磷酸化，它从FHBG分子上切下放射性示踪剂18F。因此HSV-TK表达可采用正电子发射断层成像(PET)扫描进行严密监测。
相应地，本文提供了用于确定施用基因治疗载体后受试者或患者中的示踪剂信号的水平，并在所述示踪剂信号的水平在设定的阈值之上时选择所述受试者或患者用于采用所述基因治疗载体的治疗的方法和组合物。在一些实施方案中，该示踪剂是放射性、发光或荧光信号。在一些实施方案中，放射性示踪剂元素是18F、64Cu、99mTe、11C、14C、124I、123I、131I、15O、13N和/或82RbCl。
在其他实施方案中，本文提供了用于确定施用胸苷激酶基因治疗载体后受试者或患者中的放射性示踪剂信号的水平，并在所述示踪剂信号的水平在设定的阈值之上时选择所述受试者或患者用于采用所述基因治疗载体的治疗的方法和组合物。在一些实施方案中，该示踪剂是放射性示踪剂。在其他实施方案中，放射性示踪剂元素是18F、64Cu、99mTe、11C、14C、124I、123I、131I、15O、13N和/或82RbCl。在其他实施方案中，该放射性示踪剂元素与核苷或合成核苷靶标偶联以形成放射性靶标。在一些实施方案中，该核苷靶标是FHBG(9-[4-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)，FHPG(9-([3-氟-1-羟基-2-丙氧基]甲基)鸟嘌呤)，FGCV(氟更昔洛韦)，FPCV(氟喷昔洛韦)，FIAU(1-(2'-脱氧-2'-氟-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶)，FEAU(氟-5-乙基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FMAU(氟-5-甲基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FHOMP(6-((1-氟-3-羟基丙-2-基氧基)甲基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮)，更昔洛韦，缬更昔洛韦，阿昔洛韦，伐昔洛韦，喷昔洛韦，在N-1处具有4-羟基-3-(羟基甲基)丁基侧链的放射性标记的嘧啶(HHG-5-FEP)或带有2,3-二羟基丙基、阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦样侧链的5-(2-)羟基乙基)-和5-(3-羟基丙基)-取代的嘧啶衍生物。优选地，该放射性靶标是[18F]FHBG(9-(4-18F-氟-3-[羟基甲基]丁基)鸟嘌呤)。
本文还提供了包括以下步骤的方法：(a)确定受试者中[18F]FHBG信号的水平；以及(b)为采用基因治疗组合物的治疗选择受试者，在所述受试者中[18F]FHBG的水平是至少约2.0SUV或比PET扫描背景高至少20％。
此外，本文提供了包括以下步骤的方法：(a)确定受试者中[18F]FHBG信号的水平；(b)包括受试者用于采用组合物的治疗，其中所述受试者中FHBG的水平在PET扫描下大于约2.0SUV；以及(c)向所述受试者施用抗癌剂。
在一些实施方案中，本发明提供了用于鉴定对癌症治疗敏感的受试者的方法，所述方法包括：a)鉴定所述受试者中[18F]FHBG的表达；b)治疗所述受试者。
本文提供了测量以下物质介导的旁观者效应的方法：HSV-TK介导的FHBG(9-[4-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)，FHPG(9-([3-氟-1-羟基-2-丙氧基]甲基)鸟嘌呤)，FGCV(氟更昔洛韦)，FPCV(氟喷昔洛韦)，FIAU(1-(2'-脱氧-2'-氟-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶)，FEAU(氟-5-乙基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FMAU(氟-5-甲基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FHOMP(6-((1-氟-3-羟基丙-2-基氧基)甲基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮)，更昔洛韦，缬更昔洛韦，阿昔洛韦，伐昔洛韦，喷昔洛韦，在N-1处具有4-羟基-3-(羟基甲基)丁基侧链的放射性标记的嘧啶(HHG-5-FEP)或带有2,3-二羟基丙基、阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦样侧链的5-(2-)羟基乙基)-和5-(3-羟基丙基)-取代的嘧啶衍生物，所述方法包括：a)采用编码HSV-TK和第一荧光蛋白的多核苷酸转导细胞；b)采用编码与第一荧光或生物发光蛋白在光学上可辨别的第二荧光或生物发光蛋白的多核苷酸转导所述细胞；c)采用在由HSV-TK磷酸化时变成细胞毒性的药剂处理所述细胞；以及d)测量所述第一荧光蛋白和第二荧光蛋白的相对表达量。在一个实施方案中，步骤d)包括Perkin Elmer读板仪、荧光计、荧光激活细胞分选仪(FACS)、细胞计数仪或分光光度计。在另一个实施方案中，步骤d)包括测量受试者体内的第二荧光或生物发光蛋白的荧光输出。
本文还提供了用于确定受试者中[18F]FHBG信号的水平并选择其中[18F]FHBG的水平是至少约2.0SUV或比PET扫描背景高至少20％的受试者用于采用基因治疗组合物的治疗的方法。
定义
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义相同的含义。除非另外指出，在本文整个公开内容中涉及的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、GenBank序列、网站和其他出版的材料均通过引用全文并入本文。在对于本文术语存在多种定义的情况下，以本部分中的定义为准。当提及URL或其他这样的标识符或地址时，应当理解，这样的标识符可能改变并且网络上的特定信息可能时有时无，但可通过搜索因特网找到等同的信息。对其的提及证实了该信息的可获得性和公共传播性。
如本文所用的，“核酸”是指包含至少两个共价连接的核苷酸或核苷酸类似物亚单位的多核苷酸。核酸通常是脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，或者DNA或RNA的类似物。核苷酸类似物可商购获得，并且制备包含此类核苷酸类似物的多核苷酸的方法是已知的(Lin等人(1994)Nucl.Acids Res.22:5220-5234；Jellinek等人(1995)Biochemistry 34:11363-11372；Pagratis等人(1997)Nature Biotechnol.15:68-73)。核酸通常是单链的、双链的或它们的混合物。对于本文而言，除非另外说明，核酸是双链的，或根据上下文是显而易见的。
如本文所用的，“DNA”意在包括DNA分子的所有类型和大小，包括cDNA、质粒以及包含修饰的核苷酸和核苷酸类似物的DNA。
如本文所用的，“核苷酸”包括核苷单磷酸、核苷二磷酸和核苷三磷酸。核苷酸还包括修饰的核苷酸，例如但不限于硫代磷酸核苷酸和脱氮嘌呤核苷酸以及其他核苷酸类似物。
如本文所用的术语“多核苷酸”意指任意长度的核苷酸的聚合形式，并包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。该术语还包括单链和双链DNA，以及单链和双链RNA。该术语还包括修饰的多核苷酸例如甲基化或封端多核苷酸。
如本文所用的，术语“受试者”是指向其中引入大DNA分子的动物、植物、昆虫和禽类，包括更高等的生物，例如哺乳动物和禽类，包括人、灵长类动物、啮齿类动物、牛、猪、兔、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、豚鼠、猫、狗、马、鸡以及其他生物。
如本文所用的，“施用于受试者”是这样的程序，通过该程序将一种或多种递送药剂和/或大核酸分子一起或单独地引入到受试者中或施加到受试者上，以使得存在于受试者中的靶细胞最终与该药剂和/或大核酸分子接触。
如本文所用的，“递送载体”或“递送媒介物(delivery vehicle)”或“治疗载体”或“治疗系统”是指携带外源核酸分子并将该外源核酸分子转运到靶细胞或组织的病毒和非病毒颗粒。病毒媒介物包括但不限于：逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、疱疹病毒和腺相关病毒。非病毒媒介物包括但不限于：微粒、纳米颗粒、病毒体和脂质体。如本文所用的“靶向”是指与递送媒介物相关联并将该媒介物靶向至细胞或组织的配体的使用。配体包括但不限于抗体、受体和胶原结合域。
如本文所用的，“递送”(可与“转导”互换使用)指这样的过程，通过该过程将外源核酸分子转移到细胞内使得它们位于该细胞内部。核酸的递送是与核酸的表达不同的过程。
如本文所用的，“多克隆位点(MCS)”是质粒中包含多个限制酶切位点的核酸区域，其中任何限制酶切位点均可以与标准重组技术结合使用以消化该载体。“限制酶消化”是指采用仅在核酸分子的特定位置起作用的酶进行的核酸分子的催化切割。这些限制酶中的许多可商购获得。此类酶的使用是本领域技术人员广泛了解的。通常，使用在MCS内切割的限制酶将载体线性化或片段化以使得外源序列能够与载体连接。
如本文所用的，“复制起点”(通常命名为“ori”)是复制开始的特定的核酸序列。或者，如果宿主细胞是酵母，则可以采用自主复制序列(ARS)。
如本文所用的，“选择性或可筛选的标记”赋予细胞可识别的变化，从而使得容易鉴别含有表达载体的细胞。通常，选择性标记是赋予允许选择的性质的标记。正选择性标记是其中该标记的存在允许其选择的标记，而负选择性标记是其中其存在阻止其选择的标记。正选择性标记的实例是抗药性标记。
通常，包含药物选择标记有助于转化体的克隆和鉴定，例如赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博来霉素和组氨醇的抗性的基因是有用的选择性标记。除了赋予允许基于条件的实施来辨别转化体的表型的标记，还考虑其他类型的标记，包括可筛选的标记，如GFP，其基础是色度分析。在一些实施方案中，使用可筛选的酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还已知如何采用免疫标记，其可能与FACS分析结合。所用的标记并不认为是重要的，只要它能够与编码基因产物的核酸同时被表达即可。选择性和可筛选的标记的其他实例是本领域技术人员公知的。
如本文所用的，“表达”是指这样的过程，通过该过程核酸被翻译成肽或被转录成RNA，例如RNA可被翻译成肽、多肽或蛋白质。如果核酸来源于基因组DNA，则表达包括(如果选择合适的真核宿主细胞或生物)mRNA的剪接。对于将在宿主细胞中表达的异源核酸，它必须在初始时被递送到细胞内，并随后一旦进入细胞，则最终停留在细胞核中。
如本文所用的，“治疗过程”是指在限定的时间段内周期性或定时施用本文公开的载体。这样的时间段为至少一天、至少两天、至少三天、至少五天、至少一周、至少两周、至少三周、至少一个月、至少两个月或至少六个月。施用还可以以长期方式进行，即非限定的时间段。所述周期性或定时施用包括一天一次、一天两次、一天三次或其他设定的定时施用。
如本文所用的，术语“共施用”、“与……联合施用”及其语法等同词等意在涵盖向单个患者施用所选治疗剂，并且旨在包括其中通过相同或不同的施用途径或者在相同或不同的时间施用所述药剂的治疗方案。在一些实施方案中，如本申请中公开的治疗剂将与其他药剂共施用。这些术语包括将两种或更多种药剂施用于动物，以使得药剂和/或它们的代谢物二者同时存在于动物中。它们包括以单独的组合物同时施用，以单独的组合物在不同的时间施用，和/或以其中存在两种药剂的组合物施用。因此，在一些实施方案中，治疗剂和其他药剂以单一组合物施用。在一些实施方案中，治疗剂和其他药剂在组合物中混合。在进一步的实施方案中，治疗剂和其他药剂以单独的剂量在单独的时间施用。
术语“宿主细胞”表示可被用作或已被用作多个用于产生递送载体的构建体的接受体的例如微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。该术语包括已被转染的原始细胞的子代。因此，如本文所用的“宿主细胞”通常是指已经用外源DNA序列转染的细胞。应当理解，由于天然的、偶然的或有意的突变，单个亲本细胞的子代可不一定与原始亲本在形态或基因组或总DNA互补序列上完全相同。
如本文所用的，“基因治疗”包括将异源DNA转移到患有寻求治疗或诊断的病症或病况的哺乳动物尤其是人的某些细胞(靶细胞)。所述DNA以某种方式被引入到所选择的靶细胞中，以使得异源DNA被表达并由此产生编码的治疗性产物。在一些实施方案中，异源DNA直接或间接地介导编码治疗性产物的DNA的表达。在一些实施方案中，所述异源DNA编码产物，例如直接或间接地介导治疗性产物的表达的肽或RNA。在一些实施方案中，基因治疗用于递送编码基因产物的核酸以替代有缺陷的基因或补充由其中引入该核酸的哺乳动物或细胞产生的基因产物。在一些实施方案中，所引入的核酸因此编码通常不在哺乳动物宿主中产生或不以治疗有效量或在治疗上有用的时间产生的治疗性化合物，例如生长因子或其抑制剂，或者肿瘤坏死因子或其抑制剂，如受体。在一些实施方案中，编码治疗性产物的异源DNA在引入至患病宿主的细胞之前进行修饰以增强或以其他方式改变产物或其表达。
如本文所用的，“异源核酸序列”通常是这样的DNA：其编码的RNA和蛋白质不由DNA在其中表达的细胞在体内正常产生，或者其为介导或编码通过影响转录、翻译或其他可调节生化过程来改变内源性DNA表达的介体。异源DNA在本文中涵盖本领域技术人员将认识到或认为对DNA在其中表达的细胞是异源或外来的任何DNA。异源DNA的实例包括但不限于，编码可追踪的标记蛋白质(如赋予抗药性的蛋白质)的DNA，编码治疗有效物质(如抗癌剂、酶和激素)的DNA，以及编码其他类型蛋白质(如抗体)的DNA。在一些实施方案中，由异源DNA编码的抗体在已引入异源DNA的细胞表面上分泌或表达。
如本文所用的，术语“胸苷激酶突变体”不仅指本文描述的特定蛋白质(以及编码这些蛋白质的核酸序列)，而且还指其衍生物(其可包括保持生物活性的初级蛋白质的各种结构形式)。
如本文所用的，“未突变的胸苷激酶”指天然或野生型胸苷激酶多肽序列。
如本文所用的，“自杀基因”指编码一种产物的核酸，其中该产物单独或在其他化合物的存在下导致细胞死亡。
如本文所用的，术语“突变”或“被另一个核苷酸替代”意指在某一位置的核苷酸在该位置被除了在未突变或先前已经突变的序列中出现的核苷酸之外的核苷酸所替代。也就是说，在一些情况下，可在不同的核苷酸中进行特定的修饰。在一些实施方案中，进行替代以使得相关的剪接供体和/或受体位点不再存在于基因中。
如本文所用的，“极性氨基酸”指氨基酸残基Asp(N)、Cys(C)、Gln(Q)、Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)或Tyr(Y)。
如本文所用的，“非极性氨基酸”指氨基酸残基Ala(A)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Trp(W)或Val(V)。
如本文所用的，“碱性氨基酸”指氨基酸残基Arg(R)、His(H)或Lys(K)。
如本文所用的，“酸性氨基酸”指氨基酸残基Asp(D)或Glu(E)。
基因治疗
基因治疗包括将异源DNA转移到患有寻求治疗或诊断的病症或病况的哺乳动物尤其是人的某些细胞。所述DNA以某种方式被引入到所选择的靶细胞中，以使得异源DNA得到表达并由此产生编码的治疗性产物。
在一些实施方案中，所述异源DNA直接或间接地介导编码治疗性产物的DNA的表达。在一些实施方案中，所述异源DNA编码产物，例如直接或间接地介导治疗性产物的表达的肽或RNA。在一些实施方案中，所引入的核酸因此编码通常不在哺乳动物宿主中产生或不以治疗有效量或在治疗上有用的时间产生的治疗性化合物，如生长因子或其抑制剂，或者肿瘤坏死因子或其抑制剂，如受体。
非病毒和病毒方法已用于将异源治疗性DNA递送至细胞内，包括来源于逆转录病毒的病毒载体颗粒、腺病毒、腺相关病毒颗粒、孢疹病毒颗粒、痘苗病毒、慢病毒、痘病毒、塞姆利基(Semliki)病毒和假型病毒。
相应地，本文提供了用于在体内、离体或体外将基因转移至细胞用于基因治疗的病毒构建体。这样的病毒载体颗粒包括但不限于，逆转录病毒载体颗粒、腺病毒载体颗粒、腺相关病毒颗粒、孢疹病毒颗粒、假型病毒、慢病毒载体颗粒、痘病毒载体颗粒、痘苗病毒载体颗粒和非病毒载体。优选地，所述病毒载体颗粒是逆转录病毒载体颗粒。
逆转录病毒构建体
在一些实施方案中，用于基因治疗用途的载体颗粒是逆转录病毒载体颗粒。在其他实施方案中，所述逆转录病毒载体颗粒来源于莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒并属于LN系列的载体，例如上文提到的和在下列文献中进一步描述的那些：Bender等人,J.Virol.,Vol.61,pgs.1639-1649(1987)；以及Miller等人,Biotechniques,Vol.7,pgs 980-990(1989)。这样的载体具有来源于小鼠肉瘤病毒的包装信号的一部分，以及突变的gag起始密码子。如本文所用的术语“突变的”意指gag起始密码子已经缺失或改变，使得gag蛋白质或其片段或截短体没有被表达。
在一些实施方案中，所述逆转录病毒载体颗粒包含修饰的包膜，包括编码将在所需细胞中表达的至少一种异源多肽的至少一种多核苷酸。在一个实施方案中，所述异源多肽可以是治疗剂。该治疗剂是胸苷激酶，更优选HSV-TK。
在其他实施方案中，治疗剂包括但不限于生长因子例如表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、红细胞生成素、G-CSF、GM-CSF、TGFα、TGF-β和成纤维细胞生长因子，细胞因子，包括但不限于，白介素和肿瘤坏死因子。其他治疗剂包括但不限于抗凝剂、抗血小板剂、抗炎剂、肿瘤抑制蛋白质、凝血因子(包括因子VII、因子VIII和因子IX)、蛋白S、蛋白C、抗凝血酶III和von Willebrand因子。
在一些实施方案中，编码治疗剂的多核苷酸在合适的启动子的控制下。可以采用的合适的启动子包括但不限于，逆转录病毒LTR；SV40启动子；巨细胞病毒(CMV)启动子；劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子；组蛋白启动子；polIII启动子、β-肌动蛋白启动子；诱导型启动子，如MMTV启动子、金属硫蛋白启动子；热激启动子；腺病毒启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；B19细小病毒启动子；人球蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子，如单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；逆转录病毒LTR；人生长激素启动子和MxIFN诱导型启动子。该启动子还可以是控制编码治疗剂的多核苷酸的天然启动子。
编码修饰的包膜多肽和治疗剂的多核苷酸可通过本领域技术人员已知的基因工程技术置于合适的载体中。当修饰的载体是逆转录病毒载体颗粒时，将编码修饰的包膜多肽和治疗剂的多核苷酸置于合适的逆转录病毒质粒载体中。
逆转录病毒质粒载体包含一个或多个启动子。可采用的合适的启动子包括但不限于，逆转录病毒LTR；SV40启动子；以及在Miller等人,Biotechniques,Vol.7,No.9,980-990(1989)中描述的人巨细胞病毒(CMV)启动子，或任何其他启动子(例如，细胞启动子如真核细胞启动子，包括但不限于组蛋白、pol III和β-肌动蛋白启动子)。可采用的其他病毒启动子包括但不限于腺病毒启动子、TK启动子和B19细小病毒启动子。根据本文中包含的教导，合适的启动子的选择对于本领域技术人员而言是显而易见的。
在一个实施方案中，包含编码修饰的包膜的多核苷酸和编码治疗剂的多核苷酸的逆转录病毒质粒载体用于转导包装细胞系以形成生产细胞系，该生产细胞系将产生感染性逆转录病毒载体颗粒。在一个实施方案中，该包装细胞系是“预包装(pre-packaging)”细胞系，其包含编码gag和pol逆转录病毒蛋白而非包膜或env蛋白的多核苷酸。这样的细胞系在采用逆转录病毒质粒载体转导时，产生感染性逆转录病毒颗粒，该颗粒包含修饰的或嵌合的包膜和编码治疗剂的多核苷酸。所述载体可通过本领域已知的任何手段转导包装细胞。这样的手段包括但不限于：电穿孔，以及脂质体(例如上文所述的)的使用，以及CaPO4沉淀。这样的生产细胞产生感染性逆转录病毒载体颗粒，该颗粒包含修饰的包膜、野生型逆转录病毒包膜、编码修饰的或嵌合的包膜的多核苷酸以及编码治疗剂的多核苷酸。
在另一个实施方案中，提供了一种包装细胞，该包装细胞包含编码根据本发明的修饰的嵌合包膜的核酸序列，并可进一步包含编码gag和pol蛋白质的核酸序列。通过向这样的包装细胞引入逆转录病毒载体颗粒或逆转录病毒质粒载体(在每种情况下包含编码治疗剂的多核苷酸)来产生包含根据本发明的修饰的包膜的用于产生病毒颗粒的生产细胞。因此，该生产细胞系产生包含修饰的嵌合包膜和编码治疗剂的多核苷酸的感染性逆转录病毒颗粒。
靶向逆转录病毒载体递送
在一些实施方案中，本文提供了载体颗粒，其具有修饰的病毒表面蛋白质，例如，修饰的病毒包膜多肽，用于将载体颗粒靶向至细胞外基质组分。该病毒表面蛋白质被修饰为包含含有与细胞外基质组分结合的结合区的靶向多肽。
在一些实施方案中，所述靶向多肽插入到逆转录病毒包膜中的天然(即未修饰的)肽结合区的两个连续编码的氨基酸残基之间。在其他实施方案中，可以除去受体结合区的氨基酸残基并用靶向多肽替代。
作为修饰受体结合区的替代，或除了修饰的受体肽结合区之外，逆转录病毒颗粒可具有在包膜蛋白质的其他区域中的修饰，以使得包膜的其他区域可包括靶向多肽，例如，分泌信号“前导”序列、铰链区或主体部分。这样的修饰可包括逆转录病毒包膜中氨基酸残基的缺失或置换，其中除了包膜的受体结合区外的来自该区域的氨基酸残基被去除并被靶向多肽替代，或者将靶向多肽置于除了病毒包膜的受体肽结合区外的区域中的连续编码的氨基酸残基之间。
在另外的替代实施方案中，所述逆转录病毒包膜在其经修饰以包括与细胞外基质组分结合的靶向多肽之前，可以是包含不同向性的区域的包膜。例如，该逆转录病毒包膜可以是包含具有同向性部分、双向性部分和/或异向性部分的gp 70蛋白质的莫洛尼鼠白血病病毒包膜。
通常情况下，所述靶向多肽包括与细胞外基质组分结合的结合区，该细胞外基质组分包括但不限于，胶原蛋白(包括I型胶原蛋白和IV型胶原蛋白)、层粘连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖以及与纤连蛋白结合的序列，如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或RGD序列。可包含在靶向多肽中的结合区包括但不限于多肽结构域，该多肽结构域是在vonWillebrand因子或其衍生物内的功能结构域，其中此类多肽结构域与胶原蛋白结合。在一个实施方案中，所述结合区是具有如下结构式的多肽：Trp-Arg-Glu-Pro-Ser-Phe-Met-Ala-Leu-Ser.(SEQ ID NO:25)。
除了结合区之外，所述靶向多肽可能进一步包含置于结合区氨基端和/或羧基端处的一个或多个氨基酸残基的接头序列，由此这样的接头增加了已修饰的包膜多肽的旋转柔性和/或使空间位阻最小化。
HSV-TK
胸苷激酶是将天然核苷底物以及核苷类似物磷酸化的补救途径酶。通常，胸苷激酶通过将诸如更昔洛韦或阿昔洛韦等核苷类似物施用于表达胸苷激酶的细胞而在治疗上应用，其中胸苷激酶将核苷类似物磷酸化，产生能够杀死该细胞的毒性产物。
如本文所用的编码外源胸苷激酶的多核苷酸序列可以由很多种胸苷激酶制备。在一些实施方案中，胸苷激酶突变体来源于疱疹病毒科(Herpesviridae)胸苷激酶，包括例如灵长类动物疱疹病毒和非灵长类动物疱疹病毒，如禽类疱疹病毒。合适的疱疹病毒的代表性实例包括，例如1型单纯疱疹病毒(HSV)、2型单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、狨猴疱疹病毒、1型猫疱疹病毒、假性狂犬病病毒、1型马疱疹病毒、1型牛疱疹病毒、火鸡疱疹病毒、马雷克病病毒(Marek's disease virus)、疱疹病毒saimir和EB(Epstein-Barr)病毒。
对TK基因的改进
在一些实施方案中，本文公开了编码HSV-TK的多核苷酸序列。在一些实施方案中，该多核苷酸序列编码野生型HSV-TK氨基酸序列。在一些实施方案中，该多核苷酸序列编码突变的HSV-TK氨基酸序列。
可用于制备本文提供的优化的多核苷酸序列的示例性程序包括但不限于：密码子优化；剪接位点的校正、多聚吡啶序列(poly-pyrimidine tract)和过量GC含量的去除；单Kozak序列的添加、不需要的Kozak序列的去除；包含用于亚克隆到逆转录病毒或其他载体内的限制位点；核定位序列的去除或核输出序列的添加；突变序列的添加；双终止密码子序列的添加；标签、接头和融合序列的添加；提交至基因合成公司的序列文件的准备；将合成的基因亚克隆到逆转录病毒载体内；将荧光蛋白基因包含到逆转录病毒载体内；将选择性标记基因包含到逆转录病毒载体内；Maxiprep质粒DNA的制备；逆转录病毒生产细胞或其他细胞的转染；逆转录病毒的实验室、中试或GMP规模生产；用逆转录病毒对靶细胞的转染；GCV或类似的前药介导的细胞杀伤试验；次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸苷(HAT)选择试验；用于产生逆转录病毒转导的细胞系的选择性标记药物选择程序；用于检测和记录逆转录病毒转导的靶细胞的荧光显微术和照相术；逆转录病毒转导的靶细胞的定量荧光检测；Western蛋白表达试验；HSV-TK分析所需的其他程序和试验；或它们的组合。本文描述了这些方法的方案，其可商购获得或描述于公开的文献和数据库中。
在一些实施方案中，本文描述了获得改进的HSV-TK序列的方法。在一些实施方案中，该方法包括：a)剪接位点的校正和/或去除；和/或b)对单Kozak序列的调节。在一些实施方案中，任选地，该方法进一步包括用于HSV-TK序列的亚克隆的限制位点的纳入。在一些实施方案中，任选地或另外，该方法进一步包括胞核定位序列的去除。
本文提供了编码来自人单纯病毒的病毒胸苷激酶(HSV-TK)的突变形式的多核苷酸序列，其中所编码的HSV-TK在氨基酸残基25、26、32、33、167、168或其组合处突变，其中该多核苷酸序列与SEQ ID NO:1或3的多核苷酸序列相比是突变的。在这样的序列中，可能发生1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个突变。
修饰可以是保守的或非保守的突变。可进行突变以使得所编码的氨基酸被修饰成极性、非极性、碱性或酸性氨基酸。
本文提供了编码来自人单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)的突变形式的多核苷酸序列，其中所编码的HSV-TK包含核输出序列。本文提供了编码来自人单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)的突变形式的多核苷酸序列，其中所编码的HSV-TK与野生型HSV-TK相比在功能上得到改善，并且包含A168H dmNES(CL系统＝与LTR启动子区域适当地融合的CMV增强子)，其中NES指核输出序列。在一个实施方案中，突变的HSV-TKA168HdmNES是用于包含在Reximmune-C2中的突变的HSV-TK基因。在一个实施方案中，NES来源于MAP激酶激酶(MAPKK)。在其他实施方案中，NES的多核苷酸序列是CTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGCTGGAACTGGATGGC(SEQ ID NO:23)。在其他实施方案中，该NES多肽序列是LQKKLEELELDG(SEQ ID NO:24)。
在一些实施方案中，本文公开了编码人单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)的多核苷酸序列的突变，其中不对野生型HSV-TK的多肽序列进行突变。
核苷酸位置的提及参考SEQ ID NO:1(野生型(wt)HSV1-TK核苷酸序列)或SEQ IDNO:3(Reximmune-C HSV-TK中的HSV-TK；HSV-TK核定位信号(NLS)的SR39突变体和R25G-R26S突变)中的位置。
在一个实施方案中，提供了约束突变HSV-TK SR39突变区的可克隆双链寡核苷酸的Sac I-Kpn I限制位点。参见，例如，SEQ ID NO:6和7，其中Sac I和Kpn I位点分别示于左边和右边。粗体加下划线表示可进行突变的位点。SEQ ID NO:8和9示出了用Sac I和Kpn I切割后的示例性序列。可用于进行突变的示例性的正向和反向引物如SEQ ID NO:10和11所示。
提供了示例性优化的HSV-TK多核苷酸序列，例如，作为SEQ ID NO:12-22。
然而，当这样提及时，本发明并不旨在限于如SEQ ID NO:1或3中示出的确切序列，而包括其变体和衍生物。因此，考虑对其他胸苷激酶序列中核苷酸位置的鉴定(即，在本领域技术人员认为与SEQ ID NO:1或3中所示的位置相对应的位置处的核苷酸的鉴定)。
在一些实施方案中，通过记录遗传密码以使得密码子变化为编码相同氨基酸残基的不同密码子而替代核苷酸。在一些实施方案中，在HSV-TK编码核酸序列的编码区内替代核苷酸，但核酸序列保持野生型HSV-TK蛋白质表达。
在这样的实施方案中，5/21密码子在第三位置包含“C或G”(24％)；0/21密码子在第三位置包含“C”(0％)；5/21密码子在第三位置包含“G”(24％)；以及16/21密码子在第三位置包含“A或T”(76％)。
在其他实施方案中，16/21密码子在第三位置包含“C或G”(76％)；11/21密码子在第三位置包含“C”(52％)；5/21密码子在第三位置包含“G”(24％)；以及5/21密码子在第三位置包含“A或T”(24％)。
在一些实施方案中，下列稀有密码子不用于或避免用于编码HSV-TK的多核苷酸的编码区或其变体：针对丙氨酸的GCG；针对精氨酸的CGA或CGT；针对亮氨酸的TTA或CTA；针对脯氨酸的CCG；针对丝氨酸的TCG；针对苏氨酸的ACG；以及针对缬氨酸的GTA。
在一些实施方案中，如本文所述改变密码子导致活性提高约2％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或者更高的百分比。
在一些实施方案中，本文公开了编码胸苷激酶的核酸序列，其中与剪接供体位点对应的至少一个核苷酸被另一个核苷酸所替代。在进一步的实施方案中，剪接受体位点的核苷酸没有被改变。在一些实施方案中，与剪接受体位点对应的至少一个核苷酸被另一个核苷酸所替代。
在一些实施方案中，本文公开了编码胸苷激酶的核酸序列，其中与多核苷酸序列(例如，SEQ ID NO:1或3)的329和330位处的剪接供体位点核苷酸对应的至少一个核苷酸被另一个核苷酸所替代。在一些实施方案中，在327和555位的两个核苷酸均被其他核苷酸所替代。例如，327位可突变成选自G至A的氨基酸残基。可替代地或另外地，555位可突变成选自G至A的氨基酸残基。在一个实施方案中，修饰的HSV-TK具有SEQ ID NO:18的多核苷酸序列，其中的HSV-TK通过以下方式得到改善：
HSV-TK NESdmNLS A168H,CO&SC
NES＝来自MAP激酶激酶(MAPKK)的核输出序列
dmNLS＝双突变的HSV-TK核定位序列
CO＝密码子优化的
SC＝在327和555处校正的剪接供体/受体位点，下划线序列
SEQ ID NO:18
gtcaGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCCTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGCTGGAACTGGATGGCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCaCTGCGgCCaGGATCTCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGaCCaCACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAaGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATtACaATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCaCCaCACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCaCCaCCaCCaGCaCTGACCCTGATCTTCGACCGgCACCCaATCGCaCACCTGCTGTGCTACCCgGCaGCaCGCTACCTGATGGGCtccATGACaCCaCAaGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCaCCaACaCTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCaCCaCAGGGCGCCGAGCCaCAGAGCAACGCCGGaCCaCGaCCaCACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGgGCaCCaGAGCTGCTGGCaCCaAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCtccATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGtcaCCgGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACaACaCCCGGCAGCATCCCaACaATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCCAACTAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTgtca
在一些实施方案中，本文公开了一种编码胸苷激酶的核酸序列，其中下述核苷酸被另一核苷酸替代：对应于野生型序列的554和555位的剪接受体位点核苷酸的核苷酸中的至少一个，或者对应于野生型序列的662和663位的剪接受体位点核苷酸的核苷酸中的至少一个，或者对应于野生型序列的541和542位的剪接受体位点的核苷酸中的至少一个。例如，541位可突变成选自G至A的氨基酸残基。542位可突变成选自G至A的氨基酸残基。554位可突变成选自G至A的氨基酸残基。555位可突变成选自G至A的氨基酸残基。662位可突变成选自G至A的氨基酸残基。663位可突变成选自G至A的氨基酸残基。
Kozak序列位于mRNA内的AUG起始密码子的侧翼并且影响真核核糖体对起始密码子的识别。在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含不多于一个Kozak序列。在一些实施方案中，该Kozak序列位于DNA序列的编码部分的上游。在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸的Kozak序列被修饰为在哺乳动物细胞中以较高的翻译起始效率产生Kozak序列。在一些实施方案中，Kozak序列的修饰在编码的HSV-TK多肽产物中不产生氨基酸置换。在一些实施方案中，该Kozak序列的修饰导致在编码的HSV-TK多肽产物中的至少一个氨基酸置换。在一个实施方案中，修饰的HSV-TK具有SEQ ID NO:18或22的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、60、75、80、85、90、95、100个或更多个密码子置换。在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、60、75、80、85、90、95、100个或更多个密码子置换，其中该密码子置换包括在哺乳动物细胞中比在该位置的野生型密码子具有更高使用频率的密码子置换。然而，在一些实施方案中，可以根据具体情况针对各个氨基酸选择较不利的密码子。
在一些实施方案中，包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、60、75、80、85、90、95、100个或更多个密码子置换的编码HSV-TK的多核苷酸序列与SEQ ID NO:1或3具有小于约65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，其中序列同一性利用全局比对法在编码序列的全长上来确定。在一些实施方案中，相应的编码多肽序列与HSV-TK氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:2或4)具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、60、75、80、85、90、95、100个或更多个密码子置换，其中该密码子置换包括用在哺乳动物细胞中具有最高使用频率的密码子置换在该位置的野生型密码子。在一些实施方案中，相应的编码多肽序列与HSV-TK氨基酸序列(例如SEQ ID NO:2或4)具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、60、75、80、85、90、95、100个或更多个密码子置换，其中置换的密码子具有大于或等于约0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35或更高的使用频率。在一些实施方案中，相应的编码多肽序列与HSV-TK氨基酸序列(例如SEQ ID NO:2或4)具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含少于约45、40、35、30、25、20个或更少的密码子，其中密码子具有小于约0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25的使用频率。在一些实施方案中，相应的编码多肽序列与HSV-TK氨基酸序列(例如SEQ ID NO:2或4)具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含至少78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或更多的密码子，所述密码子具有大于或等于约0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35或更高的使用频率。在一些实施方案中，相应的编码多肽序列与HSV-TK氨基酸序列(例如SEQ ID NO:2或4)具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含至少35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或更多的密码子，所述密码子在哺乳动物细胞中具有最高的使用频率。在一些实施方案中，相应的编码多肽序列与HSV-TK氨基酸序列(例如SEQ ID NO:2或4)具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含少于约21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％或更少的密码子，所述密码子具有小于约0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25的使用频率。在一些实施方案中，该多核苷酸序列包含少于约21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％或更少的密码子，所述密码子在哺乳动物细胞中具有小于约0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25的使用频率。在一些实施方案中，相应的编码多肽序列与HSV-TK氨基酸序列(例如SEQ ID NO:2或4)具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含密码子置换，其中至少35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的密码子相比于野生型序列已发生改变。在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含密码子置换，其中至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的密码子已改变为相比于野生型序列在哺乳动物细胞中具有更高的使用频率的密码子。在一些实施方案中，相应的编码多肽序列与HSV-TK氨基酸序列(例如SEQ ID NO:2或4)具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，编码HSV-TK的多核苷酸序列包含密码子置换，其中至少19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的密码子已改变成与野生型序列相比在哺乳动物细胞中具有最高使用频率的密码子。在一些实施方案中，相应的编码多肽序列与HSV-TK氨基酸序列(例如SEQ ID NO:2或4)具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
来自所选的疱疹病毒的病毒胸苷激酶基因可以如下所述容易地分离和突变，以构建编码包含一个或多个突变的编码胸苷激酶的核酸分子，该胸苷激酶相比于未突变的野生型胸苷激酶，提高了胸苷激酶的生物活性。可使用本领域已知的任何试验(包括，例如测定核苷类似物的摄取速率或确定核苷或核苷类似物的磷酸化速率)容易地测定胸苷激酶的生物活性。此外，可以容易地选择以其他生物学性质如热稳定性和蛋白质稳定性为特征的胸苷激酶突变体。
在一些实施方案中，修饰编码HSV-TK的多核苷酸序列以去除或修饰预测的信号序列。在一些实施方案中，修饰多核苷酸以去除或修饰核定位序列(NLS)。在一些实施方案中，修饰多核苷酸以去除核定位序列。在一些实施方案中，修饰多核苷酸以修饰NLS而使其不再起到将HSV-TK只定位到细胞核的作用。
在一些实施方案中，HSV-TK多肽序列在氨基酸残基167、168或二者处突变。在一个实例中，该序列在氨基酸残基167处突变。在另一个实例中，该序列在氨基酸残基168处突变。在另一个实例中，该序列在氨基酸残基167和168处突变。氨基酸残基167可以突变成丝氨酸或苯丙氨酸。氨基酸残基168可以突变成组氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、丝氨酸或苯丙氨酸。在一些实施方案中，HSV-TK多肽序列在氨基酸残基25和/或26处突变。在氨基酸残基25和/或26处可以突变为选自甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，HSV-TK多肽序列在氨基酸残基32和/或33处突变。氨基酸残基32和/或33可以突变为选自甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，HSV-TK多肽在氨基酸残基25、26、32和/或33处突变。氨基酸残基25、26、32和/或33可以突变成选自甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸的氨基酸。可以对比SEQ ID NO:2或4的多肽序列进行氨基酸残基修饰。
根据本发明，提供了由上述核酸分子编码的突变胸苷激酶酶，以及能够表达此类分子的载体。在一些实施方案中，提供了包含与本发明的核酸分子可操作地连接的启动子的表达载体。在一些实施方案中，该载体是能够引导核酸分子的表达的病毒载体。这样的病毒载体的代表性实例包括单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、痘载体、细小病毒载体、杆状病毒载体和逆转录病毒载体。在一些实施方案中，提供了能够引导核酸分子的表达的病毒载体，该核酸分子编码包含一个或多个突变的胸苷激酶，至少一个突变编码氨基酸置换，与未突变的(即，野生型)胸苷激酶相比，其提高了胸苷激酶的生物活性。
在一些实施方案中，本文提供的核酸分子编码这样的胸苷激酶，该胸苷激酶能够以比由野生型胸苷激酶进行的核苷类似物的磷酸化水平高至少10％的水平将核苷类似物磷酸化。在一些实施方案中，该胸苷激酶能够以比由野生型胸苷激酶进行的核苷类似物的磷酸化水平高至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％或至少500％的水平将核苷类似物磷酸化。合适的核苷类似物的代表性实例包括更昔洛韦、阿昔洛韦、泛昔洛韦、布昔洛韦、喷昔洛韦、伐昔洛韦、三氟胸苷、1-[2-脱氧,2-氟,β-D-呋喃阿拉伯糖基]-5-碘尿嘧啶、ara-A、araT、1-β-D-呋喃阿拉伯糖基胸腺嘧啶、5-乙基-2'-脱氧尿苷、5-碘-5'-氨基-2,5'-二脱氧尿苷、碘苷(idoxuridine)、AZT、AIU、双脱氧胞苷和AraC。在一些实施方案中，改进的TK突变体缺乏胸苷激酶活性。
在一些实施方案中，公开的HSV-TK突变体的Km值胸苷激酶活性为至少2.5μm。在一些实施方案中，公开的HSV-TK突变体的Km值为至少5μm、至少10μm、至少15μm、至少20μm、至少25μm、至少30μm、至少40μm、至少50μm、至少60μm、至少70μm、至少80μm、至少90μm、至少100μm、至少150μm、至少200μm、至少250μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少600μm、至少700μm、至少800μm、至少900μm或至少1000μm。在一些实施方案中，公开的HSV-TK突变体相对于野生型HSV-TK的Km百分比为至少至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％或至少500％。
在本发明的一个实施方案中，提供了HSV-TK突变体的截短的衍生物。例如，定点诱变可以容易地进行以删除胸苷激酶突变体的N末端45个氨基酸，由此构建保留其生物活性的突变体的截短形式。
针对胸苷激酶突变体的衍生物的表达而构建的核苷酸序列中的突变应保持编码序列的阅读框相位。此外，该突变优选地不产生可杂交产生二级mRNA结构(如环或发夹)的互补区域，该二级mRNA结构将不利地影响受体mRNA的翻译。此类衍生物可以使用很多种技术容易地构建，包括上文讨论的那些技术。
在一些实施方案中，HSV-TK多肽序列在氨基酸残基167、168或二者处突变。在一个实例中，该序列在氨基酸残基167处突变。在另一个实例中，该序列在氨基酸残基168处突变。在另一个实例中，该序列在氨基酸残基167和168处突变。氨基酸残基167可以突变成丝氨酸或苯丙氨酸。氨基酸残基168可以突变成组氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、丝氨酸或苯丙氨酸。在一些实施方案中，HSV-TK多肽序列在氨基酸残基25和/或26处突变。在氨基酸残基25和/或26处可以突变为选自甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，HSV-TK多肽序列在氨基酸残基32和/或33处突变。氨基酸残基32和/或33可以突变为选自甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，HSV-TK多肽在氨基酸残基25、26、32和/或33处突变。氨基酸残基25、26、32和/或33可以突变成选自甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸的氨基酸。可以相比于SEQ ID NO:2或4的多肽序列进行氨基酸残基修饰。
根据本发明，提供了由上述核酸分子编码的突变胸苷激酶酶，以及能够表达此类分子的载体。在一些实施方案中，提供了包含与本发明的核酸分子可操作地连接的启动子的表达载体。在一些实施方案中，该载体是能够引导核酸分子的表达的病毒载体。这样的病毒载体的代表性实例包括单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、痘载体、细小病毒载体、杆状病毒载体和逆转录病毒载体。在一些实施方案中，提供了能够引导核酸分子的表达的病毒载体，该核酸分子编码包含一个或多个突变的胸苷激酶酶，至少一个突变编码氨基酸置换，与未突变的(即，野生型)胸苷激酶相比，其提高了胸苷激酶的生物活性。
在一些实施方案中，本文提供的核酸分子编码这样的胸苷激酶，该胸苷激酶能够以比由野生型胸苷激酶进行的核苷类似物的磷酸化水平高至少10％的水平将核苷类似物磷酸化。在一些实施方案中，胸苷激酶能够以比由野生型胸苷激酶进行的核苷类似物的磷酸化水平高至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％或至少500％的水平将核苷类似物磷酸化。合适的核苷类似物的代表性实例包括更昔洛韦、阿昔洛韦、泛昔洛韦、布昔洛韦、喷昔洛韦、伐昔洛韦、三氟胸苷、1-[2-脱氧,2-氟,β-D-呋喃阿拉伯糖基]-5-碘尿嘧啶、ara-A、araT、1-β-D-呋喃阿拉伯糖基胸腺嘧啶、5-乙基-2'-脱氧尿苷、5-碘-5'-氨基-2,5'-二脱氧尿苷、碘苷、AZT、AIU、双脱氧胞苷和AraC。在一些实施方案中，改进的TK突变体缺乏胸苷激酶活性。
在本发明的一个实施方案中，提供了胸苷激酶突变体的截短的衍生物。例如，定点诱变可以容易地进行以删除胸苷激酶突变体的N末端45个氨基酸，由此构建保留其生物活性的突变体的截短形式。
针对胸苷激酶突变体的衍生物的表达而构建的核苷酸序列中的突变应保持编码序列的阅读框相位。此外，该突变优选地不产生可杂交产生二级mRNA结构(如环或发夹)的互补区域，该二级mRNA结构将不利地影响受体mRNA的翻译。此类衍生物可以使用很多种技术容易地构建，包括上文讨论的那些技术。
通过使用本文描述的方法，本发明人确定优化的HSV-TK基因的大多数候选物显示与逆转录病毒表达系统兼容，并产生了生物学上有用的逆转录病毒滴度。
此外，并入了这些优化中的大多数的优化的HSV-TK基因(SEQ ID NO：18)表现出前药GCV酶活性和选择性供其在逆转录病毒转导递送后杀死癌细胞的能力。经密码子优化和剪接校正的突变HSV-TK基因A168H显示具有最高的GCV介导的癌症杀伤活性(SEQ ID NO：12、16、18或22)。这种HSV-TK基因A168H和在氨基酸159-161处从LIF突变为IFL的相同形式表现出GCV介导的癌细胞杀伤活性。
经密码子优化和剪接校正的突变HSV-TK基因A167F(SEQ ID NO:13、17或19)在逆转录病毒转导递送后具有非常高的GCV介导的癌症杀伤活性，但更惊人的是不具有胸苷激酶活性，如通过在用HAT培养基选择的3T3TK(-)细胞中进行逆转录病毒转导递送后表达该基因所确定的。据我们所知，这是曾经生物学评价的对GCV活化而言最具GCV选择性、且不具有胸苷活性(HAT试验)的HSV-TK合成基因产物。
双突变HSV-TK基因A167F+A168H(SEQ ID NO:14)出人意料地消除GCV和胸苷酶活性二者，即表现出非常小的GCV介导的癌症杀伤活性和非常小的胸苷活性(HAT试验)。
本发明人确定，可产生基因的功能性HSV-TK融合体，所述基因如细菌胞嘧啶脱氨酶、酵母胞嘧啶脱氨酶、新霉素磷酸转移酶，并可包括接头序列和保留HSV-TK GCV介导的癌细胞杀伤活性。
在一个实施方案中，可制备具有GCV介导的癌症杀伤活性的密码子优化的HSV-TK基因，其保留未与一个或多个其他治疗性基因融合的一个或多个核定位序列。
本文所述的优化的HSV-TK基因的另外的修饰和/或评价可以包括以下的一个或多个：HSV-TK内的已知核定位序列的去除；提高的前药GCV酶活性和选择性供其提高下述能力：杀死癌细胞，评估多个标签的应用，将HSV-TK的蛋白质和接头与其他基因和蛋白质融合，HSV-TK优化的基因与其他优化的自杀和癌症杀伤基因在癌细胞中的共表达，在Reximmune-C型逆转录病毒载体系统中包括优化的HSV-TK基因；Reximmune-C型GMP产物的产生和测试，或它们的任意组合。
在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸序列包含核输出信号。例如，多核苷酸序列可以包含TK168dmNES。
在另一个实施方案中，用于本文所述方法的逆转录病毒载体包含一个或多个剪接位点修饰。
在另一个实施方案中，用于本文所述方法的逆转录病毒载体包含HSV-TK A167Fsm(SEQ ID NO:13)。
在另一个实施方案中，用于本文所述方法的逆转录病毒载体包含HSV-TK A168Hsm(SEQ ID NO:12)。
在另一个实施方案中，用于本文所述方法的逆转录病毒载体包含HSV-TK A167Fdm(SEQ ID NO:17)。
在另一个实施方案中，用于本文所述方法的逆转录病毒载体包含HSV-TK A168dm(SEQ ID NO:16)。
在另一个实施方案中，用于本文所述方法的逆转录病毒载体包含HSV-TK A167Fdm和NES(SEQ ID NO:19)。
在另一个实施方案中，用于本文所述方法的逆转录病毒载体包含HSV-TK A168Hdm和NES(SEQ ID NO:18)。在这样的实施方案中，该序列包含HSV-TK A168H。
在另一个实施方案中，用于本文所述方法的逆转录病毒载体包含HSV-TK，其中这样的载体包含升级的底物结合域和mNLS/NES组。
在另一个实施方案中，用于本文所述方法的逆转录病毒载体包含HSV-TK，其中该载体包含选择性标记、发光(glowing)基因和/或一种或多种杀伤基因。
在另一个实施方案中，用于本文所述方法的逆转录病毒载体包含至少两个修饰。
通过使用本文描述的方法，本发明人确定优化的HSV-TK基因的大部分显示与逆转录病毒表达系统兼容，并产生在生物学上有用的逆转录病毒滴度。
经密码子优化和剪接校正的突变HSV-TK基因A167F(SEQ ID NO:13、17或19)在逆转录病毒转导递送后具有非常高的GCV介导的癌症杀伤活性，但更惊人的是不具有胸苷激酶活性，如通过在用HAT培养基选择的3T3TK(-)细胞中进行逆转录病毒转导递送后表达该基因所确定的。这是高度GCV选择性的HSV-TK合成基因。
双突变HSV-TK基因A167F+A168H(SEQ ID NO:14)表现出非常小的GCV介导的癌症杀伤活性和非常小的胸苷活性；因此，合适的双突变体可具有令人惊奇的空特性(nullproperties)。
本发明人确定，可产生基因的功能性HSV-TK融合体，所述基因如细菌胞嘧啶脱氨酶、酵母胞嘧啶脱氨酶、新霉素磷酸转移酶，并可包括接头序列和保留HSV-TK GCV介导的癌细胞杀伤活性。
在一个实施方案中，可制备具有GCV介导的癌症杀伤活性的完全密码子优化的HSV-TK基因，其保留未与一个或多个其他治疗性基因融合的一个或多个核定位序列。
本文所述的优化的HSV-TH基因的另外的修饰和/或评价可以包括以下的一个或多个：HSV-TK内的已知核定位序列的去除；提高的前药GCV酶活性和选择性供其以下能力：杀死癌细胞，评估多个标签的应用，将HSV-TK的蛋白质和接头与其他基因和蛋白质融合，HSV-TK优化的基因与其他优化的自杀和癌症杀伤基因在癌细胞中的共表达，在Reximmune-C逆转录病毒载体系统中包括优化的HSV-TK基因；Reximmune-C GMP产物的产生和测试，或它们的任意组合。
治疗载体可单独施用或与其他治疗性处理或活性剂联合施用。可以使用的其他活性剂的实例包括但不限于：化疗剂、抗炎剂、蛋白酶抑制剂如HIV蛋白酶抑制剂、核苷类似物如AZT。在一些实施方案中，治疗方法进一步包括在施用治疗性病毒颗粒之前、与其同时或之后，向受试者施用化疗剂、生物剂或者放射治疗。本领域技术人员将会理解，本文所述的逆转录病毒颗粒可以通过与一种或多种药剂相同的途径施用(例如，逆转录病毒载体和该药剂均静脉内施用)或者通过不同的途径施用(例如，逆转录病毒载体静脉内施用，而所述一种或多种药剂口服施用)。
治疗性病毒颗粒的剂量优选在包括没有或几乎没有毒性的ED50的循环浓度的范围内。该剂量可根据所使用的剂型和使用的施用途径在该范围内变化。治疗有效剂量可最初根据细胞培养试验来估计。剂量可以在动物模型中调配以达到如在细胞培养物中测定的包括IC50(即，达到半数最大感染或半数最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。这样的信息可用于更准确地确定在人类中的有用剂量。例如，可以通过RT-qPCR或ddPCR方法来测量血浆中的水平。
可以采用多种方式来确定待施用于需要治疗的受试者的本文所公开的逆转录病毒颗粒的有效量或治疗有效量。举例而言，该量可基于动物模型中的病毒滴度或功效。或者，可将临床试验中所使用的剂量方案用作通用准则。
在一些实施方案中，每日剂量可以以单一剂量施用或在一天中的不同小时分份施用。在一些实施方案中，可能需要较高的剂量并且该剂量可在获得最佳初始反应时随时间的推移而减少。在一些实施方案中，治疗可以是连续数天、数周或数年，或者可以以中间的休息期间隔开。在一些实施方案中，根据个体可能正在接受的其他治疗而修改剂量。然而，治疗方法绝不限于逆转录病毒颗粒的特定浓度或范围，并且可以针对正在治疗的每个个体以及针对所用的每种衍生物而变化。
可能需要剂量的个体化以对给定的个体达到最大效果。在一些实施方案中，施用于正在治疗的个体的剂量根据个体的年龄、疾病的严重程度或阶段以及对治疗过程的反应而变化。在一些实施方案中，用于确定剂量的临床参数包括但不限于：肿瘤大小，在针对特定恶性肿瘤的临床测试中使用的肿瘤标志物的水平的改变。在一些实施方案中，治疗医师确定将用于给定个体的治疗有效量。在一些实施方案中，本文公开的治疗根据需要适时施用由治疗医师判断的必需的时间段。
治疗载体包括但不限于：对感兴趣的细胞或系统具有特异性的，可全身性或区域性(局部)递送至需要治疗的受试者的治疗性逆转录病毒颗粒。例如，治疗载体可全身静脉内施用。或者，治疗载体也可动脉内施用。治疗载体也可局部、静脉内、动脉内、瘤内、结肠内(intracolonically)、气管内、腹膜内、鼻内、血管内、鞘内、颅内、髓内、胸膜内、皮内、皮下、肌内、眼内、骨内和/或滑膜内或立体定位地(sterotactically)施用。也可以使用递送模式的组合，例如，患者可以以全身性和区域性(局部)两种方式接受治疗载体，以改善对治疗载体治疗的肿瘤反应。
在一些实施方案中，将多个治疗过程(例如，第一和第二治疗过程)施用于需要治疗的受试者。在一些实施方案中，第一和/或第二治疗过程静脉内施用。在其他实施方案中，第一和/或第二治疗过程通过动脉内输注施用，该输注包括但不限于通过肝动脉、大脑动脉、冠状动脉、肺动脉、髂动脉、腹腔干动脉、胃动脉、脾动脉、肾动脉、性腺动脉、锁骨下动脉、椎动脉、腋动脉、肱动脉、桡动脉、尺动脉、颈动脉、股动脉、肠系膜下动脉和/或肠系膜上动脉的输注。动脉内输注可以使用血管内程序、经皮程序或开放手术方法来完成。在一些实施方案中，第一和第二治疗过程可以顺序施用。在其他实施方案中，第一和第二治疗过程可以同时施用。在其他实施方案中，任选的第三治疗过程可以与第一和第二治疗过程顺序或同时施用。
在一些实施方案中，本文公开的治疗载体可累积以高剂量与顺序或同时施用的治疗过程联合施用。例如，在一些实施方案中，有此需要的患者可全身施用，例如静脉内施用累积至少1x 109TVP、至少1x 1010TVP、至少1x 1011TVP、至少1x 1012TVP、至少1x 1013TVP、至少1x 1014TVP、至少1x 1015TVP、至少1x 1016TVP、至少1x 1017TVP、至少1x 1018TVP、至少1x1019TVP、至少1x 1020TVP、至少1x 1021TVP或至少1x 1022TVP的递送载体的第一疗程。第一治疗过程可以全身施用。或者，第一治疗过程可以以局部方式，例如动脉内施用，例如，有此需要的患者可以通过动脉内输注施用累积至少1x 109TVP、至少1x 1010TVP、至少1x 1011TVP、至少1x 1012TVP、至少1x 1013TVP、至少1x 1014TVP、至少1x 1015TVP、至少1x 1016TVP、至少1x 1017TVP、至少1x 1018TVP、至少1x 1019TVP、至少1x 1020TVP、至少1x 1021TVP或至少1x1022TVP的递送载体。
在其他实施方案中，有此需要的受试者可以接受高剂量递送载体的全身和动脉内输注施用的组合，顺序或同时进行。例如，有此需要的患者可以首先全身施用累积至少1x109TVP、至少1x 1010TVP、至少1x 1011TVP、至少1x 1012TVP、至少1x 1013TVP、至少1x1014TVP、至少1x 1015、至少1x 1016TVP、至少1x 1017TVP、至少1x 1018TVP、至少1x 1019TVP、至少1x 1020TVP、至少1x 1021TVP或至少1x 1022TVP的递送载体，接着进行动脉内输注，例如肝动脉输注施用累积至少1x 109TVP、至少1x 1010TVP、至少1x 1011TVP、至少1x 1012TVP、至少1x 1013TVP、至少1x 1014TVP、至少1x 1015TVP、至少1x 1016TVP、至少1x 1017TVP、至少1x1018TVP、至少1x 1019TVP、至少1x 1020TVP、至少1x 1021TVP或至少1x 1022TVP的递送载体的附加治疗过程。在又一实施方案中，有此需要的患者可以接受高剂量递送载体的动脉内输注和全身施用的组合。例如，有此需要的患者可首先通过动脉内输注施用累积至少1x109TVP、至少1x 1010TVP、至少1x 1011TVP、至少1x 1012TVP、至少1x 1013TVP、至少1x1014TVP、至少1x 1015TVP、至少1x 1016TVP、至少1x 1017TVP、至少1x 1018TVP、至少1x1019TVP、至少1x 1020TVP、至少1x 1021TVP或至少1x 1022TVP的递送载体，接着进行全身施用累积至少1x 109TVP、至少1x 1010TVP、至少1x 1011TVP、至少1x 1012TVP、至少1x 1013TVP、至少1x 1014TVP、至少1x 1015TVP、至少1x 1016TVP、至少1x 1017TVP、至少1x 1018TVP、至少1x1019TVP、至少1x 1020TVP、至少1x 1021TVP或至少1x 1022TVP的递送载体的附加治疗过程。治疗过程还可以同时施用，即，高剂量递送载体，例如累积至少1x 109TVP、至少1x 1010TVP、至少1x 1011TVP、至少1x 1012TVP、至少1x 1013TVP、至少1x 1014TVP、至少1x 1015TVP、至少1x1016TVP、至少1x 1017TVP、至少1x 1018TVP、至少1x 1019TVP、至少1x 1020TVP、至少1x1021TVP或至少1x 1022TVP的递送载体的治疗过程与动脉内输注，例如肝动脉输注施用累积至少1x 109TVP、至少1x 1010TVP、至少1x 1011TVP、至少1x 1012TVP、至少1x 1013TVP、至少1x1014TVP、至少1x 1015TVP、至少1x 1016TVP、至少1x 1017TVP、至少1x 1018TVP、至少1x1019TVP、至少1x 1020TVP、至少1x 1021TVP或至少1x 1022TVP的递送载体的治疗过程一起施用。
在其他实施方案中，有此需要的受试者可以额外地(与第一和第二治疗过程顺序地或同时)接受累积剂量的递送载体，例如，累积至少1x109TVP、至少1x 1010TVP、至少1x1011TVP、至少1x 1012TVP、至少1x 1013TVP、至少1x 1014TVP、至少1x 1015TVP、至少1x1016TVP、至少1x 1017TVP、至少1x 1018TVP、至少1x 1019TVP、至少1x 1020TVP、至少1x1021TVP或至少1x 1022TVP的递送载体的附加治疗过程(例如，第三治疗过程、第四治疗过程、第五治疗过程)。
在一些实施方案中，需要治疗的受试者全身(例如静脉内)施用至少1x 1011TVP的剂量，随后通过动脉内输注(例如肝动脉输注)施用至少1x1011TVP的剂量。在其他实施方案中，需要治疗的患者可以全身(例如静脉内)施用至少1x 1012TVP的累积剂量，随后通过动脉内输注(例如肝动脉输注)施用至少1x 1012TVP的剂量。在一个实施方案中，需要治疗的患者可以全身(例如静脉内)施用至少1x 1013TVP的剂量，随后通过动脉内输注(例如肝动脉输注)施用至少1x 1013TVP的剂量。在其他实施方案中，需要治疗的患者可以全身(例如静脉内)施用至少1x 1014TVP的剂量，同时通过动脉内输注(例如肝动脉输注)施用至少1x1014TVP的剂量。在其他实施方案中，需要治疗的患者可以与通过动脉内输注(例如肝动脉输注)施用至少1x 1015TVP的剂量一起，全身(例如静脉内)施用至少1x1015TVP的剂量。在其他实施方案中，需要治疗的患者可以全身(例如静脉内)施用至少1x 1016TVP的剂量，同时通过动脉内输注(例如肝动脉输注)施用至少1x 1016TVP的剂量。在其他实施方案中，需要治疗的患者可以与通过动脉内输注(例如肝动脉输注)施用至少1x 1017TVP的剂量一起全身(例如静脉内)施用至少1x 1017TVP的剂量。
需要治疗的受试者还可以全身或局部(例如动脉内输注，诸如肝动脉输注)施用递送载体的治疗过程限定的时间段。在一些实施方案中，该时间段可以是至少一天、至少两天、至少三天、至少四天、至少五天、至少六天、至少七天、至少一周、至少两周、至少三周、至少四周、至少五周、至少六周、至少七周、至少八周、至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少六个月、至少七个月、至少八个月、至少九个月、至少十个月、至少十一个月、至少一年、至少两年、至少三年、至少四年或者至少五年。施用还可以以长期方式进行，即未限定或无限的时间段。
所述治疗载体的施用还可以以周期性方式发生，例如一天至少一次、一天至少两次、一天至少三次、一天至少四次、一天至少五次。所述递送载体的周期性施用可能依赖于递送载体的时间以及施用方式。例如，肠胃外施用可在整个延长的时间段内一天仅进行一次，而递送载体的口服施用可一天进行多于一次，其中递送载体的施用在较短的时间段内进行。
在一个实施方案中，允许受试者在第一治疗过程与第二治疗过程之间休息1到2天。在一些实施方案中，允许受试者在第一治疗过程与第二治疗过程之间休息2到4天。在其他实施方案中，允许受试者在第一治疗过程与第二治疗过程之间休息至少2天。在其他实施方案中，允许受试者在第一治疗过程与第二治疗过程之间休息至少4天。在其他实施方案中，允许受试者在第一治疗过程与第二治疗过程之间休息至少6天。在一些实施方案中，允许受试者在第一治疗过程与第二治疗过程之间休息至少1周。在其他实施方案中，允许受试者在第一治疗过程与第二治疗过程之间休息至少2周。在一个实施方案中，允许受试者在第一治疗过程与第二治疗过程之间休息至少一个月。在一些实施方案中，允许受试者在第二治疗过程与任选的第三治疗过程之间休息至少1-7天。在其他实施方案中，允许受试者在第二治疗过程与任选的第三治疗过程之间休息至少1-2周。
诊断对胸苷激酶基因疗法治疗敏感的患者
成像检查，包括放射性示踪剂、反差成像技术和其他成像技术的使用，可以用于鉴定对包括胸苷激酶基因治疗在内的基因疗法治疗敏感并因此更可能从这样的治疗措施中受益的患者。
在优选的实施方案中，使用正电子发射断层成像(PET)扫描来鉴定能够转导含有用于体内表达的胸苷激酶构建体的逆转录病毒载体颗粒的患者。PET扫描通过检测由置于生物活性分子上的放射性示踪剂间接发射的γ射线对而产生体内功能过程的三维图像。PET扫描检测由带正电的颗粒(正电子)发射的能量。
向施用含有胸苷激酶多核苷酸的逆转录病毒载体颗粒的患者共施用能够被表达的胸苷激酶切割的放射性示踪剂。实例是[18F]FHBG(9-[4-[18F]氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)，其为HSV-TK酶的高亲和性底物，对于哺乳动物TK酶具有相对较低的亲和力。参见Yaghoubi和Gambhir,Nat.Protocol 1:3069-75(2006)；Green等人,J.Nucl.Med.45:1560-70(2004)。[18F]FHBG被HSV1-TK或HSV1-sr39TK磷酸化，其随后被捕获在表达胸苷激酶的细胞内。因此，在施用含有胸苷激酶多核苷酸的逆转录病毒载体(包括本文描述的突变的和/或优化的胸苷激酶构建体)的患者中，这种底物的体内裂解指示出由受试者和患者对逆转录病毒载体颗粒的有效转导，并因此指示出患者或受试者对胸苷激酶介导的基因治疗的敏感性的开始。
或者，用于测量病毒TK活性的其他方法包括采用5-甲基-5,6-二氢胸苷以及相关化合物的化学交换饱和转移磁共振成像。
因此，在本文公开的一些实施方案中，提供了用于检测在施用含有编码胸苷激酶蛋白的多核苷酸的逆转录病毒颗粒的患者中的胸苷激酶表达的方法和组合物。在一些实施方案中，该胸苷激酶来源于疱疹病毒科胸苷激酶。在一些实施方案中，该胸苷激酶是HSV-TK。在其他实施方案中，该胸苷激酶是HSV-TK1。在其他实施方案中，该胸苷激酶是HSV-TK1的优化形式。
在一些实施方案中，将HSV-TK基因进行密码子优化以用于有效的表达和/或转导。在其他实施方案中，改变胸苷激酶的氨基末端以去除或消除病毒胸苷激酶序列的核定位序列(NLS)。在其他实施方案中，胸苷激酶核苷酸序列包括与氨基末端连接的核输出序列(NES)。在一些实施方案中，该核输出序列是LQKKLEELELDG(SEQ ID NO:24)。
在其他实施方案中，对胸苷激酶编码序列进行突变以提高表达的胸苷激酶蛋白的底物结合。在其他实施方案中，该胸苷激酶编码序列包括A168H突变。
包括HSV-TK蛋白在内的胸苷激酶所靶向的底物的其他实例包括：FHPG(9-([3-氟-1-羟基-2-丙氧基]甲基)鸟嘌呤)，FGCV(氟更昔洛韦)，FPCV(氟喷昔洛韦)，FIAU(1-(2'-脱氧-2'-氟-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶)，FEAU(氟-5-乙基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FMAU(氟-5-甲基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FHOMP(6-((1-氟-3-羟基丙-2-基氧基)甲基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮)，更昔洛韦，缬更昔洛韦，阿昔洛韦，伐昔洛韦，喷昔洛韦，在N-1处具有4-羟基-3-(羟基甲基)丁基侧链的放射性标记的嘧啶(HHG-5-FEP)或带有2,3-二羟基丙基、阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦样侧链的5-(2-)羟基乙基)-和5-(3-羟基丙基)-取代的嘧啶衍生物。可用于确定诸如胸苷激酶的治疗性蛋白质是否在采用本文描述的胸苷激酶基因治疗载体治疗的个体中表达的放射性示踪剂的实例还可以包括18F、64Cu、99mTe、11C、14C、124I、123I、131I、15O、13N和/或82RbCl。
9-[4-18F-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤(FHBG)的PET临床试验可以在以下网站上找到：www.clinicaltrials.gov。在临床应用中采用PET测量FHBG的方法可以在临床试验NCT00871702、NCT00185848和NCT01082926中找到。
简言之，患者将在第1天接受治疗性药物产品剂量。在第3至6天，优选第4天，或在接受该剂量的如本文公开的编码修饰的HSV-TK的治疗性药物产品之后的时间段，他们将静脉内输注[18F]FHBG，并在1-5小时后，优选0.5、1.0、1.5、2、2.5、3.0、3.5或4.0小时后，或在为了扫描而施用后的其他合适的时间，针对在显示HSV-1TK被表达的肿瘤部位中的累积通过PET扫描成像。显示FHBG摄取的患者将入选该试验；不显示FHBG摄取的患者将如本文所公开的被排除。FHBG的量将被测定且基于先前的研究。针对FHBG/PET的另外的方案可以在例如下面的参考文献15-39中找到。
因此，本文提供了用于测量标记的胸苷激酶(包括HSV-TK)底物的方法和组合物，该胸苷激酶底物包括FHBG(9-[4-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)，FHPG(9-([3-氟-1-羟基-2-丙氧基]甲基)鸟嘌呤)，FGCV(氟更昔洛韦)，FPCV(氟喷昔洛韦)，FIAU(1-(2'-脱氧-2'-氟-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶)，FEAU(氟-5-乙基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FMAU(氟-5-甲基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FHOMP(6-((1-氟-3-羟基丙-2-基氧基)甲基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮)，更昔洛韦，缬更昔洛韦，阿昔洛韦，伐昔洛韦，喷昔洛韦，在N-1处具有4-羟基-3-(羟基甲基)丁基侧链的放射性标记的嘧啶(HHG-5-FEP)或带有2,3-二羟基丙基、阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦样侧链的5-(2-)羟基乙基)-和5-(3-羟基丙基)-取代的嘧啶衍生物，该方法包括：a)采用编码HSV-TK的多核苷酸转导细胞；b)使用与放射性示踪剂连接的HSV-TK底物处理所述细胞；以及c)测量存在于靶组织中的放射性信号的相对量。在一个实施方案中，步骤c)包括使用PET(正电子发射断层成像)扫描来测量受试者体内放射性示踪剂的输出。
本文还提供了用于鉴定能够从基因疗法治疗中受益的患者或受试者的方法和组合物，其包括测量标记的胸苷激酶(包括HSV-TK)底物，包括FHBG(9-[4-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)，FHPG(9-([3-氟-1-羟基-2-丙氧基]甲基)鸟嘌呤)，FGCV(氟更昔洛韦)，FPCV(氟喷昔洛韦)，FIAU(1-(2'-脱氧-2'-氟-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶)，FEAU(氟-5-乙基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FMAU(氟-5-甲基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FHOMP(6-((1-氟-3-羟基丙-2-基氧基)甲基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮)，更昔洛韦，缬更昔洛韦，阿昔洛韦，伐昔洛韦，喷昔洛韦，在N-1处具有4-羟基-3-(羟基甲基)丁基侧链的放射性标记的嘧啶(HHG-5-FEP)或带有2,3-二羟基丙基、阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦样侧链的5-(2-)羟基乙基)-和5-(3-羟基丙基)-取代的嘧啶衍生物。在一些实施方案中，所述方法包括：a)施用包含HSV-TK多核苷酸的基因治疗逆转录病毒颗粒并采用编码HSV-胸苷激酶的多核苷酸转导细胞；b)用与放射性示踪剂连接的HSV-TK底物处理所述细胞；c)测量存在于靶组织中的放射性信号的相对量；以及d)鉴定放射性标记的HSV-TK底物的水平在设定的阈值之上的患者。在一个实施方案中，步骤c)包括使用PET(正电子发射断层成像)扫描来测量受试者体内放射性示踪剂的输出。在一些实施方案中，能够从基因治疗方案中受益的患者包括在PET扫描中显示在设定阈值之上的水平的患者或受试者。在一些实施方案中，放射性HSV-TK底物的水平是至少约2.0SUV或比PET扫描背景高至少20％。在一些实施方案中，放射性HSV-TK底物的水平是至少约1.9SUV或比PET扫描背景高至少20％。在其他实施方案中，放射性HSV-TK底物的水平是至少约1.0SUV、约1.5SUV、约2.0SUV或约2.5SUV或更多，或比PET扫描背景高至少10％、比PET扫描背景高至少20％、比PET扫描背景高至少30％、比PET扫描背景高至少40％或比PET扫描背景高至少50％或更多。
在一些实施方案中，本文提供了用于鉴定需要治疗良性或转移性病变且能够从基因疗法治疗中受益的患者或受试者的方法和组合物。在一些实施方案中，用于鉴定能够从用于治疗良性或转移性病变的基因治疗中受益的患者的方法包括在施用基因疗法治疗之后测量标记的胸苷激酶(包括HSV-TK)底物，包括FHBG(9-[4-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)，FHPG(9-([3-氟-1-羟基-2-丙氧基]甲基)鸟嘌呤)，FGCV(氟更昔洛韦)，FPCV(氟喷昔洛韦)，FIAU(1-(2'-脱氧-2'-氟-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶)，FEAU(氟-5-乙基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FMAU(氟-5-甲基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FHOMP(6-((1-氟-3-羟基丙-2-基氧基)甲基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮)，更昔洛韦，缬更昔洛韦，阿昔洛韦，伐昔洛韦，喷昔洛韦，在N-1处具有4-羟基-3-(羟基甲基)丁基侧链的放射性标记的嘧啶(HHG-5-FEP)或带有2,3-二羟基丙基、阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦样侧链的5-(2-)羟基乙基)-和5-(3-羟基丙基)-取代的嘧啶衍生物。在一些实施方案中，所述方法包括：a)施用包含HSV-TK多核苷酸的基因治疗逆转录病毒颗粒并采用编码HSV-胸苷激酶的多核苷酸转导细胞；b)用与放射性示踪剂连接的HSV-TK底物处理所述细胞；c)测量存在于靶组织中的放射性信号的相对量；d)鉴定放射性标记的HSV-TK底物的水平在设定的阈值之上的患者；以及e)采用该基因治疗逆转录病毒颗粒治疗所述患者或受试者。在一个实施方案中，步骤c)包括使用PET(正电子发射断层成像)扫描来测量受试者体内放射性示踪剂的输出。在一些实施方案中，能够从基因治疗方案中受益的患者包括在PET扫描中显示在设定阈值之上的水平的患者或受试者。在一些实施方案中，[18F]FHBG信号的水平是至少约2.0SUV或比PET扫描背景高至少20％。在一些实施方案中，放射性HSV-TK底物的水平是至少约1.9SUV或比PET扫描背景高至少20％。在其他实施方案中，放射性HSV-TK底物的水平是至少约1.0SUV、约1.5SUV、约2.0SUV或约2.5SUV或更多，或比PET扫描背景高至少10％、比PET扫描背景高至少20％、比PET扫描背景高至少30％、比PET扫描背景高至少40％或比PET扫描背景高至少50％或更多。
本文还提供了包括以下步骤的方法：(a)测定受试者中[18F]FHBG信号的水平；以及(b)为采用组合物的治疗选择受试者，在所述受试者中FHBG的水平是至少约2.0SUV或比PET扫描背景高至少20％。在一些实施方案中，放射性HSV-TK底物的水平是至少约1.9SUV或比PET扫描背景高至少20％。在其他实施方案中，放射性HSV-TK底物的水平是至少约1.0SUV、约1.5SUV、约2.0SUV或约2.5SUV或更多，或比PET扫描背景高至少10％、比PET扫描背景高至少20％、比PET扫描背景高至少30％、比PET扫描背景高至少40％或比PET扫描背景高至少50％或更多。
本文另外提供了包括以下步骤的方法：(a)测定受试者中[18F]FHBG信号的水平；(b)从采用组合物的治疗中排除受试者，其中所述受试者中FHBG的水平是大于约2.0SUV或比PET扫描背景高至少20％以上；以及(c)向所述受试者施用抗癌剂。在一些实施方案中，放射性HSV-TK底物的水平是至少约1.9SUV或比PET扫描背景高至少20％。在其他实施方案中，放射性HSV-TK底物的水平是至少约1.0SUV、约1.5SUV、约2.0SUV或约2.5SUV或更多，或比PET扫描背景高至少10％、比PET扫描背景高至少20％、比PET扫描背景高至少30％、比PET扫描背景高至少40％或比PET扫描背景高至少50％或更多。
在一些实施方案中，本发明提供了用于鉴定对癌症治疗敏感的受试者的方法，该方法包括：a)鉴定受试者中[18F]FHBG的表达；b)治疗该受试者。
本文还提供了使用荧光成像系统测量HSV-TK介导的以下物质的磷酸化的组合物和方法：FHBG(9-[4-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)，FHPG(9-([3-氟-1-羟基-2-丙氧基]甲基)鸟嘌呤)，FGCV(氟更昔洛韦)，FPCV(氟喷昔洛韦)，FIAU(1-(2'-脱氧-2'-氟-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶)，FEAU(氟-5-乙基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FMAU(氟-5-甲基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FHOMP(6-((1-氟-3-羟基丙-2-基氧基)甲基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮)，更昔洛韦，缬更昔洛韦，阿昔洛韦，伐昔洛韦，喷昔洛韦，在N-1处具有4-羟基-3-(羟基甲基)丁基侧链的放射性标记的嘧啶(HHG-5-FEP)或带有2,3-二羟基丙基、阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦样侧链的5-(2-)羟基乙基)-和5-(3-羟基丙基)-取代的嘧啶衍生物。在一些实施方案中，所述方法包括：a)采用编码HSV-TK和第一荧光蛋白的多核苷酸转导细胞；b)采用编码与第一荧光或生物发光蛋白在光学上可辨别的第二荧光或生物发光蛋白的多核苷酸转导所述细胞；c)采用在由HSV-TK磷酸化时变成细胞毒性的药剂处理所述细胞；以及d)测量所述第一荧光蛋白和第二荧光蛋白的相对表达量。在一个实施方案中，步骤d)包括Perkin Elmer读板仪、荧光计、荧光激活细胞分选仪(FACS)、细胞计数仪或分光光度计。在另一个实施方案中，步骤d)包括使用荧光或生物发光成像系统测量受试者体内的第二荧光或生物发光蛋白的荧光输出。
胸苷激酶诊断应用
在一些实施方案中，本文公开了为治疗选择患者或将患者从治疗中排除的方法。在一个实施方案中，进行胸苷激酶基因治疗。在其他实施方案中，该胸苷激酶是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)。在其他实施方案中，该胸苷激酶是HSV-TK1。
如本文描述的，[18F]FHBG和其他HSV-TK标记的底物可以用作为基因治疗选择或排除受试者的标记。例如，在施用包含编码HSV-TK的多核苷酸的逆转录病毒载体颗粒之后，表达HSV-TK的细胞将选择性地将核苷酸类似物9-[4-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤([18F]FHBG)磷酸化。参见，例如，Yaghoubi和Gambhir,Nat.Protocols 1:3069-75(2006)。在某一阈值之上的[18F]FHBG成像可随后用于鉴定HSV-TK阳性细胞，以及为基因治疗选择或排除患者。
因此，在一个实施方案中，向受试者施用基因治疗组合物，其中该基因治疗组合物编码HSV-TK多肽。受试者在预定的时间段之后施用标记的核苷类似物HSV-TK底物，并对该受试者进行监测直到在受试者中达到标记的底物的背景。测量标记物活性，并将其与检测受试者的病变的扫描进行比较。如果成像活性：1)在设定的阈值之上；并且2)与受试者的病变位置相关，则该受试者为HSV-TK基因治疗的候选者。
在一些实施方案中，核苷酸类似物是FHBG(9-[4-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)，FHPG(9-([3-氟-1-羟基-2-丙氧基]甲基)鸟嘌呤)，FGCV(氟更昔洛韦)，FPCV(氟喷昔洛韦)，FIAU(1-(2'-脱氧-2'-氟-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶)，FEAU(氟-5-乙基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FMAU(氟-5-甲基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FHOMP(6-((1-氟-3-羟基丙-2-基氧基)甲基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮)，更昔洛韦，缬更昔洛韦，阿昔洛韦，伐昔洛韦，喷昔洛韦，在N-1处具有4-羟基-3-(羟基甲基)丁基侧链的放射性标记的嘧啶(HHG-5-FEP)或带有2,3-二羟基丙基、阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦样侧链的5-(2-)羟基乙基)-和5-(3-羟基丙基)-取代的嘧啶衍生物。在一些实施方案中，标记物为18F、64Cu、99mTe、11C、14C、124I、123I、131I、15O、13N和/或82RbCl。优选地，标记的核苷类似物HSV-TK底物是[18F]FHBG((9-[4-18F-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)。
在一些实施方案中，受试者中的清除模式决定了用于测量背景以及测定例如[18F]FHBG成像活性的时间延迟的长度。在人类中，例如，[18F]FHBG背景从下腹部以外的大多数组织迅速减少，如图2中所示。可见，在施用[18F]FHBG之后的7.6与42.6分钟之间，该水平在肝脏、肾脏和膀胱中较高。这与例如心脏和肺(其在施用后几乎不显示背景[18F]FHBG信号)形成对比。在45.3分钟至80.3分钟之后，肝脏和肾脏中的[18F]FHBG水平已经显著下降，而膀胱中为持续的高信号。从83.3分钟到155.6分钟，肝脏和肾脏中的水平甚至进一步下降，而膀胱中维持高信号水平。因此，根据器官和受试个体，可能需要一些时间来使背景水平下降以便测量HSV-TK基因表达。在下腹部区域以外的器官系统中测量可以不需要时间，如在心脏和肺中所示的。在这些器官系统中，用于基因治疗适用性的足够的阈值可以是，例如至少1.0SUV以上、至少1.5SUV以上、至少2.0SUV以上、至少2.5SUV以上、至少3.0SUV以上、至少3.5SUV以上或至少4.0SUV以上。
相比之下，在例如肝脏和肾脏中，可能需要一定的延迟以便使在背景水平之上的信号成像。参见Yaghoubi等人,Nat.Protocols vol.1,p.3073。由于这些器官系统中的背景信号，当在预定量的时间之后测量时，用于确定基因疗法治疗的适用性的足够的阈值可以是，例如比背景高至少10％、比背景高至少15％、比背景高至少20％、比背景高至少25％、比背景高至少30％、比背景高至少35％、比背景高至少40％、比背景高至少45％、比背景高至少50％、比背景高至少55％、比背景高至少60％、比背景高至少65％、比背景高至少70％、比背景高至少75％、比背景高至少80％、比背景高至少85％、比背景高至少90％、比背景高至少95％或比背景高至少100％或更高。例如，如图2中所见，肝脏中的背景信号在施用[18F]FHBG之后的至少1至1-1/2小时之后大大减少。因此，肝脏中的[18F]FHBG信号测量结果不应被采用直到[18F]FHBG信号水平已经下降至背景，约1至1-1/2小时，这取决于每个个体受试者中的清除率。
在一些器官系统中，HSV-TK基因表达可能是不可测量的，例如，在膀胱中，其随着时间的推移维持高背景信号水平。
在其他实施方案中，测量施用的[18F]FHBG与测量的[18F]FHBG信号的比值，以确定受试者是否应当被包括在基因治疗方案中或从基因治疗方案中排除。例如，如果受试者注射了例如500MBq的[18F]FHBG，且超过了例如50MBq的[18F]FHBG信号的阈值，则该受试者能够由将是治疗性的本文描述的构建体产生治疗有效量的磷酸化的更昔洛韦或其衍生物，表明受试者可以在基因治疗情况下作出反应。在这样的实施方案中，受试者是采用本文描述的基因治疗构建体治疗的候选者。
在其他实施方案中，受试者注射了100-750MBq或100-600MBq或100-500MBq或200-500MBq或200-400MBq，或者2.0至15.5MBq/kg或2.0至12.0MBq/kg或2.0至10.0MBq/kg或2.0至7.5MBq/kg的[18F]FHBG，且超过了例如10-100MBq或10-90MBq或10-80MBq或10-70MBq或10-60MBq或20-50MBq或20-40MBq的[18F]FHBG信号的阈值。在一些实施方案中，受试者注射了200-500MBq的[18F]FHBG，且超过了例如20-50MBq的[18F]FHBG信号的阈值。在一些实施方案中，注射的[18F]FHBG信号与测量的[18F]FHBG信号的比值是2:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1或50:1。在一些实施方案中，注射的[18F]FHBG信号与测量的[18F]FHBG信号的比值为约2:1至约50:1、约2:1至约40:1、约5:1至约30:1、约5:1至约20:1、约5:1至约10:1或约10:1。
在另一个实施方案中，如果受试者产生足够的磷酸化的FHBG以产生大于2.0SUV或比PET扫描背景高至少20％的信号，则该受试者很可能由本文描述的构建体产生了治疗有效量的TK，并且该受试者很可能在基因治疗情况下作出反应。在一些实施方案中，可选择受试者用于与本文描述的另一种抗癌剂或治疗的联合治疗。
在其他实施方案中，受试者产生了足够的磷酸化的FHBG以产生大于约1.5SUV、大于约2.0SUV、大于约2.5SUV、大于约3.0SUV、大于约4.0SUV或大于约5.0SUV的信号。在其他实施方案中，受试者产生了比背景高至少10％，比背景高至少20％，比背景高至少30％，比背景高至少40％，或比背景高至少50％或更多的信号。
癌症
癌症的非限制性实例可以包括：急性成淋巴细胞性白血病、急性髓样白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤(如小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚瘤(supratentorial primitive neuroectodermaltumor)、视通路和下丘脑神经胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤、伯基特淋巴瘤(Burkittlymphoma)、未知原始起源的癌、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童期癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因肉瘤(Ewing'ssarcoma)、生殖细胞肿瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌(例如非小细胞和小细胞肺癌)、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、潜伏原发转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、骨髓增生异常综合征、髓样白血病、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口癌(oral cancer)、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌(pharyngealcancer)、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、浆细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、梅克尔细胞皮肤癌(skincarcinoma merkel cell)、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、T细胞淋巴瘤、喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞肿瘤(妊娠期)、未知原发部位的癌症、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症(macroglobulinemia)以及维尔姆斯瘤(Wilms tumor)。
在其他实施方案中，待治疗的癌症选自：原发性肝细胞癌、肝脏转移性乳腺癌、肝脏转移性胰腺癌、肝脏转移性胃癌、肝脏转移性食管癌、肝脏转移性肺癌、肝脏转移性黑素瘤、肝脏转移性卵巢癌以及肝脏转移性肾癌。
制剂
包含治疗载体的药物组合物可以通过将所选量的治疗载体与一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂混合以任何常规方式进行配制。例如，治疗载体可以悬浮于载体如PBS(磷酸盐缓冲盐水)中。活性化合物可以通过任何合适的途径，例如，口服、肠胃外、静脉内、皮内、皮下，或局部，以液体、半液体或固体形式施用，并以适于每种施用途径的方式配制。
在一些实施方案中，治疗载体和生理上可接受的盐和溶剂化物被配制用于通过吸入或吹入(通过嘴或鼻子)施用或用于口服、颊部、肠胃外或直肠施用。在一些实施方案中，对于通过吸入的施用，治疗载体通过使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体以气雾剂喷雾形式从加压包装或喷雾器中递送。在一些实施方案中，加压的气雾剂剂量单位或阀递送计量的量。在一些实施方案中，用于在吸入器或吹入器中使用的胶囊和药筒(例如明胶的)被配制成含有治疗性化合物和合适的粉末基料如乳糖或淀粉的粉末混合物。
在一些实施方案中，药物组合物被配制为作为通过采用药学上可接受的赋形剂以常规手段制备的片剂或胶囊来口服施用，该赋形剂例如是粘合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)。在一些实施方案中，片剂通过本领域公知的方法包衣。在一些实施方案中，用于口服施用的液体制剂为例如溶液、糖浆或悬浮液的形式，或该液体制剂被配制成在使用前用水或其他合适的载体重建的干燥产物。在一些实施方案中，此类液体制剂通过采用药学上可接受的添加剂以常规手段制备，该添加剂例如是悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水载体(例如，杏仁油、油酯、乙醇或分级分离的植物油)；以及防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。在一些实施方案中，适当时，该制剂还含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。在一些实施方案中，药物组合物被配制成口服施用以提供活性化合物的控制释放。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于以常规方式配制的片剂或锭剂(lozenge)形式经颊部施用。
在一些实施方案中，治疗载体被配制用于通过注射例如通过团注或连续输注而肠胃外施用。在一些实施方案中，用于注射的制剂为具有添加的防腐剂的单位剂型，例如在安瓿或多剂量容器中。在一些实施方案中，所述组合物被配制成在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液。在一些实施方案中，所述制剂包含配方剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，在一些实施方案中，活性成分为在使用前用合适的载体例如无菌无热原水重建的冻干粉末形式。
在一些实施方案中，治疗载体被配制成贮库型(depot)制剂。在一些实施方案中，此类长效制剂通过植入(例如，皮下、肌内或直接进入肿瘤或紧密靠近肿瘤)或通过肌内注射施用。因此，例如，在一些实施方案中，治疗性化合物与合适的聚合或疏水性材料(例如，作为在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂一起配制，或配制为微溶性衍生物，例如作为微溶性盐。
在一些实施方案中，活性剂被配制用于局部或局限性应用，例如用于皮肤和粘膜的局部应用，例如在眼中，以凝胶、乳膏和洗剂的形式，并应用于眼部或用于脑池内或脊柱内应用。在一些实施方案中，此类溶液，特别是旨在用于眼睛应用的那些溶液，与合适的盐一起被配制成0.01％-10％的等渗溶液(pH约5-9)。在一些实施方案中，所述化合物被配制成用于局部应用的气雾剂，例如通过吸入。
药物组合物中的活性化合物的浓度将依赖于活性化合物的吸收、失活和排泄率，剂量时间表，和给药量，以及本领域技术人员已知的其他因素。
在一些实施方案中，组合物存在于包装或分配器装置中，其包含一个或多个含有活性成分的单位剂型。在一些实施方案中，该包装可以包含金属或塑料箔，例如泡罩包装。在一些实施方案中，该包装或分配器装置随附给药说明。
在一些实施方案中，活性剂被包装成含有包装材料、本文提供的药剂以及指示该药剂所针对的病症的标签的制品。
动物模型
在一些实施方案中，上文描述的逆转录病毒载体颗粒在体内施用于动物，作为用于研究基因疗法治疗的有效性的动物模型的一部分。在一些实施方案中，逆转录病毒载体颗粒以变化的剂量施用于相同物种的不同动物。随后评价动物中期望的治疗剂或诊断剂的体内表达。在一些实施方案中，根据从这些评价中获得的数据，本领域普通技术人员确定将施用于人类患者的逆转录病毒载体颗粒的量。
试剂盒
还提供了包含用于在本文描述的方法中使用的组合物的试剂盒或药物递送系统。对于施用本文公开的逆转录病毒颗粒所必需的所有必要的材料和试剂均可以装在试剂盒中(例如，包装细胞构建体或细胞系，细胞因子表达载体)。试剂盒的组分可以以如上所述的多种制剂提供。一种或多种治疗性逆转录病毒颗粒可以与一种或多种药剂(例如，化疗剂)配制成单一的药学上可接受的组合物或单独的药学上可接受的组合物。
这些试剂盒或药物递送系统的组分还可以以干燥或冻干形式提供。当试剂或组分作为干燥形式提供时，通常通过添加合适的溶剂来进行重建，该溶剂也可以在另外的容器装置中提供。
试剂盒的容器装置通常可以包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器和/或可向其中放置至少一种物质的其他容器装置。
本文公开的试剂盒还可以包括关于逆转录病毒颗粒的剂量和或施用信息的说明。该说明可以包括实施本文描述的任何方法(包括治疗方法)的说明。该说明可另外包括可能发生的满意的临床终点或任何不良症状的指示，或者监管机构如美国食品与药品管理局(FDA)针对人类受试者使用所要求的其他信息。
所述说明可以在“印刷品”上，例如在试剂盒内或贴在试剂盒上的纸张或纸板上，或在贴在试剂盒或包装材料上的标签上，或附着于含有试剂盒组分的小瓶或试管上。该说明可以另外包含在计算机可读介质上，例如磁盘(软盘或硬盘)、光盘例如CD-或DVD-ROM/RAM，磁带，电子存储介质如RAM和ROM，这些介质的IC端和混合物，诸如磁性/光学存储介质。
在一些实施方案中，试剂盒或药物递送系统包括用于包含在严密限制空间中的小瓶以供商业销售的装置，例如，其中保留期望的小瓶的注射或吹塑塑料容器。不论容器的数目或类型如何，该试剂盒还可以包含或包装有用于辅助将最终的复合组合物注射/施用或放置到受试者体内的仪器。这样的仪器可以是敷抹器、吸入器、注射器、移液管、镊子、量匙、滴眼管或任何这样的医学上批准的递送工具。
包装和试剂盒可以进一步包括具体列举例如产品描述、施用模式和/或治疗适应证的标签。本文提供的包装可以包括如本文描述的任何组合物。该包装可以进一步包括用于治疗一种或多种疾病和/或病况的标签。
术语“包装材料”是指容纳试剂盒组分的物理结构。包装材料可以无菌地保持组分，且可以由通常用于此类目的的材料(例如，纸、波纹纤维(corrugated fiber)、玻璃、塑料、箔、安瓿等)制成。标签或包装插页可以包括合适的书面说明。因此，试剂盒可以另外包括关于在本文描述的任何方法中使用试剂盒组分的标签或说明。试剂盒可以包括在包装中的化合物或分配器以及关于在本文描述的方法中施用化合物的说明。
实施例
为了本领域技术人员可以更好地实施本文描述的组合物和方法，提供了下列实施例用于说明性目的。
实施例1：临床试验
进行剂量递增试验，以评价Reximmune-C2(胸苷激酶和GM-CSF基因)在患有原发性肝细胞癌或转移至肝的肿瘤的难治性受试者中的安全性、药代动力学和药效学。
背景和基本原理
Reximmune-C2由含有编码感兴趣的治疗性蛋白质的内部载荷的遗传传递平台组成。该遗传传递平台已经在全球280多名受试者中给药；约270名受试者用含有dnG1作为载荷(Rexin-G)的载体治疗，并且16名受试者用胸苷激酶(vTK)和免疫刺激物粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)作为载荷(Reximmune-C)治疗。该遗传传递平台是高度工程化的非重组小鼠莫洛尼病毒载体(MoMLV)。先前，进行了在患有难治性原发性或转移性实体瘤的受试者中研究Rexin-G和Reximmune-C的组合的1期剂量递增试验(Genevieve试验)。此项提出的I期临床试验(命名为Genevieve 2试验)是使用胸苷激酶加GM-CSF组合中胸苷激酶的改进形式研究单独Reximmune-C2——没有Rexin-G——所进行试验的延伸。
在最初的Genevieve试验中，招募了十六名受试者，在全部3个剂量水平中，最高剂量组中的平均暴露量为8.0x 1010cfu(#pts＝7)，且最长持续时间为6个周期(3-6周期的范围)。对于该研究的A部分，治疗由先前确定的安全且有效(最佳)剂量的Rexin-G和递增剂量的Reximmune-C组成。具体地，在第1、3、5、8、10和12天Rexin-G 2x1011cfu，在第3天Reximmune-C 1.0、2.0或3.0x 1010cfu(分别为剂量水平I、II、III)，以及在第6-19天伐昔洛韦1gm口服一天三次，作为一个周期。对于该研究的B部分，没有毒性的或毒性已经降低至1级或更低的受试者可以接受额外的长达总计6个治疗周期的治疗周期。
在任何剂量水平下均没有剂量限制性毒性。在该研究中报告了16名受试者的不相关不良事件，但是事件的数目较少(在大多数情况下，每个优选项发生1或2次)，且多数是1级或2级。2名受试者中发生了相关的非严重不良事件，且两者都是2级。四名受试者经历了严重不良事件，认为其全部与研究药物无关。
该1期试验的继续部分的基本原理是：(1)胸苷激酶本身可证明是有效的抗癌剂，特别是在其肿瘤证明有旁观者效应的受试者中。(2)至今，将遗传传递平台施用于国际组的受试者已经证实了极其高度的安全性；以及(3)动物中的生物分布提示肝脏的高生物分布。此外，加入GM-CSF可以促进免疫效应以及通过募集合适的免疫细胞经由肿瘤相关抗原的增强的肿瘤细胞杀伤。
病毒颗粒的生物分布在肝脏中最高，然后是脾脏，之后是肺——这是最初着重于肝细胞肿瘤的基本原理，在肝细胞肿瘤中剂量强度应该是最高的。还存在对于这些癌症的有效抗癌剂的尚未满足的迫切临床需要。
应理解，本文公开的实施方案不限于特定的方法和组分，且如所述的其他过程可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，且并不旨在限制本发明的范围。必需注意的是，除非上下文另外清楚地指出，如本文和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包含复数引用。因此，例如，提及“蛋白质”即提及一种或多种蛋白质，且包括本领域技术人员已知的其等同物等。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。描述了特定的方法、装置和材料，尽管在实施或测试本发明中可以使用与本文描述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料。
本文引用的所有出版物均通过引用并入于此，包括所有的期刊文章、书籍、手册、公开的专利申请以及授权的专利。另外，提供了在说明书、实施例和所附权利要求书中采用的某些术语和短语的含义。定义并不意在在本质上进行限制，而是用于提供对本发明的某些方面的更清楚的理解。
实施例2：用于基因治疗应用的TK诊断试验
动物和人类研究先前已经证明了通过使用[18F]-FHBG进行的PET成像测量vTK表达的实用性。这些成像工具将在获得合适的剂量和暴露中用作个性化替代测试，并在IB部分中使用以确定哪些受试者具有从药物候选物中受益的最佳机会。
该临床试验分为两个阶段：IA期，其中Reximmune-C2在五天中的三天中作为单一静脉剂量施用，且在3-8天后通过[18F]FHBG PET扫描潜在地监测HSV-TK-m2表达的存在(图3中示出了IA期的示意图)。不论PET扫描结果如何，在第8天开始缬更昔洛韦(更昔洛韦的口服形式)给药，持续5天。接下来是约一周的休药期。每个周期将具有三周的持续时间。
在第一和后续的组群中将有三名患者，直到患者经历了剂量限制性毒性(DLT)或归因于研究药物的NCI-CTC 2级毒性的两种情况(除了恶心/呕吐、疲劳、厌食、脱发或贫血之外)。如果没有DLT，则患者将转至下一个剂量水平。如果有DLT，则该组群将扩大至6名患者，且如果2名或更多名患者表现出DLT则将不超过该剂量水平。
一旦达到最大施用剂量(MAD)，则接着以没有DLT的组群剂量开始进行改进的Fibonacci时间表，并且继续直到在某剂量水平的两名患者中观察到剂量限制性毒性。一旦限定了推荐的2期剂量(RP2D)，则将招募6-12名患者。
IB期被设计用于考察Reximmune-C2在基于IA期数据具有定义的肿瘤类型和阶段并且在一个剂量(RP2D)的Reximmune-C2后第三至六天呈[18F]FHBG扫描阳性的患者中的活性。如果扫描是阳性的，则患者被收入该方案的IB期治疗阶段，并且在5天内给予三个剂量的RP2D，随后在该阶段的第8天开始施用5天的缬更昔洛韦，然后是一周的休药期。每个周期具有三周的持续时间。在一个单一剂量的Reximmune-C2之后具有阴性[18F]FHBG PET扫描的患者将给予5天的缬更昔洛韦，并且不再继续该研究。
患者DLT将被定义为归因于Reximmune-C2并且在施用药物的第一个周期(3周)期间发生的任何下列事件的出现：
4级嗜中性粒细胞减少(即嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)<500个细胞/mm3)持续连续7天或更多天，或发热性嗜中性粒细胞减少(即，发热≥38.5℃且ANC<1000个细胞/mm3)；4级血小板减少症(<25,000个细胞/mm3或需要血小板输注的出血事件)；3级或更高级别的恶心和/或呕吐，尽管使用了足够的/最大的医疗干预和/或预防；任何3级或更高级别的非血液毒性(除了3级注射部位反应、脱发、疲劳之外)；由于从与Reximmune-C2治疗相关的毒性中恢复的延迟而引起的大于3周的再治疗延迟；以及3级或更高级别的超敏反应，尽管适当地使用了术前用药法(根据常见毒性标准被定义为“有症状的支气管痉挛、需要肠胃外用药、有或没有荨麻疹；变态反应相关水肿-神经性水肿”)。
Reximmune-C2通过输液泵经15-60分钟(取决于剂量)静脉内输注。Reximmune-C2在储存于-80℃±10℃的30ml小瓶中提供。
在这个I期试验中，将研究Reximmune-C2的递增剂量的安全性、药代动力学和药效学。针对Reximmune C2，将确定最大耐受剂量并将限定推荐的2期剂量。将描述对于Reximmune C2治疗的任何抗肿瘤活性和临床反应。
该试验中的起始剂量基于：对相关的载体平台药品Rexin-G和Reximmune-C的人类临床安全性经验，以及针对Reximmune-C2的21天大鼠GLP毒理学研究结果。
目标
该研究的主要目标是确定Reximmune-C2的最大耐受剂量(MTD)、剂量限制性毒性(DLT)、安全性以及推荐的2期剂量(RP2D)，其中在参与该研究的已被诊断为患有晚期原发性或肝转移性肿瘤的患者中经三周的周期(包括：在第1周的五天内静脉内给予一系列的三个剂量，随后在第2周给予5个日剂量的缬更昔洛韦)施用Reximmune-C2。
次要目标包括：(i)评价Reximmune-C2的血浆药代动力学；(ii)通过系列[18F]FHBGPET和/或SPECT成像来评估来自Reximmune-C2的HSV-TK-m2蛋白表达的替代；(iii)描述和评估Reximmune-C2的抗肿瘤活性的任何初步证据；以及(iv)为逆转录病毒载体gp70env的抗体，外周血淋巴细胞(PBL)中的可复制逆转录病毒，载体整合入PBL的基因组DNA，以及使hGM-CSF蛋白循环提供临床研究测试。
方法
研究设计：平行组，开放标签剂量递增，三中心临床试验。
分层：无。
治疗：Reximmune-C2将作为静脉内输注施用于不同的患者。在IA期——研究Reximmune-C2——剂量将在患者组群之间递增直到观察到DLT。在RP2D，将招募另外的患者。在IB期，将通过[18F]FHBG PET针对HSV-TK-m2的表达预筛选患者。表达HSV-TK-m2的那些患者将接受附加剂量的Reximmune-C2。患者将不被预用药，除非发生超敏反应。
统计方法：描述性统计将用于统计分析。
样本大小确定：无法定义精确的样本大小，因为其依赖于观察到的毒性。对于每个时间表，三到六名受试者的组群将在每个剂量水平下进行治疗，直到定义了MTD。一旦确定MTD，则该剂量水平将扩大至最多12名患者，这些患者将被治疗以更好地定义该剂量和时间表的耐受性和药代动力学。预期45-70名受试者将参加，其中33到46个在IA部分。
入选标准
受试者必须满足适于随机进入该研究的所有下列入选标准：
1.诊断为具有组织学记录的肝脏晚期原发性或转移性成人实体瘤，其对于标准治疗是难治性的，或对其不存在治愈性的标准治疗。
2.射线照相可测量或可评估的病变的证据。
3.任何先前的放射治疗、化疗或手术程序的所有急性毒性作用必须已经降低至国立癌症研究所(NCI)常见毒性标准(CTC)(4.0版)级别<1。
4.年龄必须>18岁。
5.除了激素治疗之外的抗肿瘤治疗的最后给药必须>21天。外部光束放射治疗必须已经<25％包含骨髓的骨骼。
6.患者可以是乙型肝炎和丙型肝炎阳性。(患者可以继续他们的抗病毒药物治疗)。
7.如果患者已经进行脑照射并且稳定6周，则患者可具有任何数目的颅内转移。患者可服用抗癫痫药物，但绝不能使用类固醇。
8.Karnofsky行为状态必须≥70。
9.至少3个月的预期寿命。
10.患者必须能够行进至圣卢克医疗中心(St.Luke’s Medical Center)进行PET扫描。
11.要求的基线实验数据包括：
12.签署知情同意书，表明他们知道他们疾病的肿瘤性质，并且已被通知随后的程序、治疗的实验性质、替代选择、潜在的益处、副作用、风险和不适。
13.愿意并且能够遵守预定的访视、治疗计划和实验室检测。
下列任何一项的存在将从研究入组中排除受试者：
1.同时采用包括任何其他试验药的任何抗癌治疗进行治疗。
2.筛选6周内已知有颅内水肿或CVA。
3.孕妇或哺乳期女性。女性受试者必须同意使用有效的避孕措施，必须是手术绝育的，或必须是绝经后的。男性受试者必须同意使用有效的避孕措施或是手术绝育的。有效避孕措施的定义将基于研究者或指定助理的判断。所有高危女性受试者必须在研究治疗开始之前7天之内为妊娠试验阴性。
4.临床上显著的心脏病(纽约心脏协会(New York Heart Association)，III或IV级)。
5.痴呆或将阻止知情同意的改变的精神状态。
6.可能增加与研究参与或研究药物施用相关的风险，或者可能妨碍对研究结果的解释以及根据主要研究者的判断将使受试者不适合该研究的其他严重的、急性或慢性的医学或精神状况或实验室异常。
7.已知对更昔洛韦类抗病毒药物具有副反应。
8.已知是HIV阳性的患者。
9.患者在筛查时不得服用类固醇。
起始剂量和时间表的基本原理
Reximmune-C已经在16名患者中在1.0、2.0或3.0x1010cfu的范围内给药(在周期的第3天分别为剂量水平I、II、III)。在任何剂量水平下均没有剂量限制性毒性。在该研究中报告了16名患者的不相关不良事件，但是事件的数目较少(在大多数情况下，每个优选项发生1或2次)，且多数是1级或2级。2名患者中发生了相关的非严重不良事件，且两者都是2级。四名患者经历了严重不良事件，认为其全部与研究药物无关。在确定Reximmune-C的最佳剂量和时间表之前结束试验。在该试验(新的Genevieve-2试验)中，初始给药将基于21天毒理学和HSV-TK-m1研究。未来给药将使用总病毒颗粒(TVP)(其为比cfu每毫升更加准确的滴度量度)进行。
该时间表基于Reximmune-C2暴露不会转导所有肿瘤细胞的基本原理。因此，患者将在5天的时间内每个周期给药三次。
在暴露于GDS与HSV-TK-m2(和hGM-CSF)表达之间的时间估计为48至72小时。因此，第三次Reximmune-C2给药后72小时，将开始给予缬更昔洛韦。剂量(其将针对肾功能进行调节)将以常规的抗病毒剂量水平给予。由于缬更昔洛韦的潜在毒性和公开的观察结果(5天的更昔洛韦应足以杀死大多数含有HSV-TK-m2的细胞)，因此选择了5天的治疗。由于Reximmune-C2和缬更昔洛韦两者的潜在毒性，这之后将为约9天的休药期。hGM-CSF在缬更昔洛韦添加时可以为足够的浓度以影响可能在肿瘤细胞凋亡期间出现的任何肿瘤相关抗原(TAA)的呈现。
在第一个周期的第一次和第三次剂量后以及在第二个周期的第一次剂量后，取血浆样品用于药代动力学分析。
由于主要分布在肝脏，因此将仔细地监测肝脏的毒性，并且由于其相关性，也监测骨髓的毒性。
这一临床方案需要将Reximmune-C2经由静脉内输注施用于患有晚期恶性肿瘤(原发性肝细胞或转移至肝脏的肿瘤)的患者。将具有两部分：IA期(每三周剂量递增3次剂量/周)和IB期(一个剂量的Reximmune-C2后的预筛选和[18F]FHBG扫描)。如果PET扫描是阳性的，则患者将继续该研究。如果PET扫描是阴性的，则患者将接受5天的缬更昔洛韦并且将不继续该试验。对于IA期，剂量递增将遵循加速滴定设计，将每剂量水平的三名患者合并，直到观察到归因于研究药物的一种DLT情况或两种NCI-CTC 2级毒性情况(除了恶心/呕吐、疲劳、厌食、脱发或贫血)。此后，临床方案中的剂量将遵循改进的Fibonacci时间表，直到达到剂量限制性毒性。
试验设计
这是1期开放标签的四中心剂量递增试验。剂量将增加直到观察到DLT，并且定义MTD。
Reximmune-C2将作为静脉内输注经15-60分钟施用。预期33-70名患者将在研究过程中进行治疗。
对于IA期，Reximmune-C2的剂量将从6.0x1011TVP递增。在加速剂量递增阶段，将在每个剂量水平下选入三名患者的组群。剂量递增增量将为100％，直到观察到DLT或两个2级CTC或更多毒性。当加速剂量递增结束时，在标准剂量递增中新的患者的剂量递增将遵循改进的Fibonacci方案(即67％、50％、40％、33％和25％的剂量增量)。每个剂量水平下最少三名患者将入选。对于IB期，Reximmune-C2的剂量将是RP2D。将评估DLT。如果在剂量水平下，在六名患者中的≥2个中观察到DLT，则将不会进行进一步的剂量递增。该剂量水平将定义最大施用剂量(MAD)。
刚好低于MAD的剂量将被认为是MTD。一旦定义了MTD，则该剂量水平可以扩大至最多十二名患者，以进一步表征作为用于2期临床研究的推荐剂量的药代动力学和药效学参数以及适用性。
患者的治疗
仅熟悉程序的合格人员(最小化对他们自己和环境的不当暴露)可以承担在合适的环境中生物治疗剂的准备、处理和安全处置。
Reximmune C2是含有编码HSV-TK-m2和hGM-CSF的基因的莫洛尼鼠不可复制逆转录载体颗粒。该药物产品含有DMEM(低葡萄糖)、RD逆转录载体颗粒、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、人血清白蛋白、正丁酸、镁以及其他赋形剂。
药物产品在一个小瓶大小中可用：具有20mm抛光层(finish)的30mL的1型透明玻璃小瓶(含有25mL的≥1.0x1010TVP)。小瓶用20mm的特氟隆(Teflon)涂覆的血清塞子和20mm的钳口涂漆的翻盖封闭。
Reximmune-C2将由输液泵经15分钟静脉内施用高达100mL的体积，经30分钟静脉内施用>100mL到200mL的体积，经45分钟静脉内施用>200mL到300mL的体积，以及经60分钟静脉内施用>300mL到400mL的体积。超过400mL的体积将在由研究者和格伦伊格尔斯医疗监护仪(Gleneagles Medical Monitor)确定的速率下施用。一旦确定了时间表的MTD，则如果指明(并且在研究者与格伦伊格尔斯医疗监护仪之间达成一致时)可以改变施用时间。
缬更昔洛韦口服施用，且应当与食物一起服用。应仔细监测血清肌酸酐或肌酸酐清除率水平。剂量调整需要基于如下表所示的肌酸酐清除率。缬更昔洛韦给药可以在该周期的第7天至第9天开始，但必须给予连续5天。
肌酸酐清除率可以通过下列公式由血清肌酸酐计算得到：
对于男性＝{(140–年龄[年])x(体重[kg])}/{(72)x(0.011x血清肌酸酐[微摩尔/L])}
对于女性＝0.85x男性值。
表I.肾损伤患者的缬更昔洛韦给药
1期研究的目的是确定试验药的MTD、DLT、安全性和RP2D。因此，毒性效果是主要研究终点，且将持续进行评估。如果患者患有可以容易地测量并再评估的疾病，则将获得反应信息。这些评估将在每个周期中进行。此外，必须注意间隔至少6周的两次检查之间的反应，以便被记录为确认的治疗反应。
·毒性可评价——如果所有患者均接受任何研究药物，则他们将是毒性可评价的。
·反应可评价——已经接受至少单个周期的治疗且进行肿瘤再评估的所有患者均将被认为是反应可评价的。另外，患有早期进展性疾病的那些患者也将被认为是反应可评价的。进行了至少两个治疗周期的治疗的患者的反应将被评价。
抗肿瘤疗效的确定将基于根据免疫相关反应标准(irRC)评价系统作出的客观肿瘤评估，并且由研究者作出的治疗决策将基于这些评估。
鉴于Reximmune-C2中GM-CSF转基因的存在，以及导致肿瘤效果的免疫应答的可能性，免疫应答标准将用于临床反应。使用免疫应答标准与RECIST 1.1的原因如下：(1)对于免疫治疗可测量的抗肿瘤活性的出现可能需要比细胞毒性治疗更长的时间；(2)对免疫治疗的反应在常规PD之后发生；(3)免疫治疗的中止在一些情况下可能是不合适的，除非确认了PD(如通常针对反应所完成的)；(4)推荐对于“临床上不足的”PD的允许量(例如，在其他反应性病变存在下的小的新病变)；以及(5)持久的SD可以代表抗肿瘤活性。
下文列出了RECIST 1.1与免疫相关应答标准之间的比较：
表II.WHO RECIST与免疫相关应答标准的比较
评估的时机和类型
所有基于基线成像的肿瘤评估均在开始治疗前的14天内进行。为达到该研究的目的，对于IA期和IB期，所有患者的肿瘤评估应当在开始治疗后9周起以及此后的每6周(例如第9周、第15周、第21周等)进行再评价。所有具有反应性肿瘤(irCR或irPR)的患者必须在第一次反应记录后不少于6周确认反应。所有具有肿瘤进展的患者必须在第一次进展记录后不少于6周确认进展。
相同的评估方法和相同的技术应当用于表征在基线和在随访期间的每个确定且报告的病变。当两种方法均已用于评估治疗的抗肿瘤效果时，对于通过临床检查进行的评价，基于成像的评价是优选的。所有测量值均应以公制(metric)符号进行记录。
CT和CT/PET是用于肿瘤评估的方法。常规的CT应当采用在切片厚度上连续地切割10mm或更少来进行。螺旋CT应当使用5mm连续重建算法进行。这适用于胸部、腹部以及骨盆。
胸部CT将用于肺部病变的评估。
临床病变仅当其是表面的(例如皮肤结节、明显的淋巴结)时，才被认为是可测量的。在皮肤病变的情况下，推荐通过包含用于估计病变大小的标尺的彩色照相术进行记录。
[18F]FHBG PET-CT扫描将在IA期中患者接受Reximmune-C2的前三次剂量(第1个周期)之后以及在IB期Reximmune-C2的筛选剂量之后获得。在IA期，另外的[18F]FHBG PET-CT扫描可以根据研究者的判断并经医学监护仪的指示而在随后的周期中获得。
超声不应当用于测量临床上不容易获得客观反应评价的肿瘤病变，例如内脏病变。它是对于表面可触知结节、SC病变以及甲状腺结节的临床测量的可能的替代测量。超声也可用于确认通常通过临床检查评估的表面病变的完全消失。
内窥镜检查、腹腔镜检查以及放射性核素扫描不应当用于反应评估。
所有患者的档案和放射学图像对于来源验证必须是可获得的，并且可以提交外部评审以用于抗肿瘤活性的最终评估。
肿瘤病变的可测量性
在基线处，肿瘤病变将由研究者根据如下描述的标准分类为可测量的或不可测量的：
·可测量的：可以在至少一个维度(待记录的最大直径)上采用常规技术准确地测量为≥20mm或采用螺旋CT扫描准确地测量为≥10mm的病变。临床病变仅在当其是表面的(例如，皮肤结节、明显的淋巴结)时才被认为是可测量的。
·不可测量的：所有其他的病变，包括小病变(采用常规技术最大直径<20mm或采用螺旋CT扫描最大直径<10mm)和骨病变、软脑膜疾病、腹水、胸腔积液或心包积液、皮肤或肺的淋巴管炎、通过成像技术不能确认和跟进的腹部肿块、囊性病变、先前的照射病变以及仅由间接证据(例如通过如碱性磷酸酶进行的实验室检验)所记录的疾病。
注：细胞学和组织学：如果可测量的疾病局限于孤立性病变，则其肿瘤性质应通过细胞学/组织学来确认。
也可通过独立的中心放射学盲态审查来评估对治疗的反应。
记录肿瘤测量结果
代表所有累及的器官的多达最多10个病变的所有可测量病变，应当被确定为靶病变，且在基线处以及在治疗期间以规定的时间间隔进行测量和记录。靶病变应当基于它们的大小(具有最长直径的病变)以及它们用于准确的重复测量的适宜性(通过成像技术或者临床上)进行选择。
对于每个靶病变都将记录最长直径。所有靶病变的最长直径的总和将被计算并记录为基线。最长直径的总和将用作在治疗期间进一步表征疾病的可测量维度的客观肿瘤反应的参考。所有的测量值均应当以厘米计的公制符号进行记录。
所有其他病变(或疾病部位)均应当被确定为非靶病变，并且也应当在基线处进行记录。测量不是必需的，且这些病变应当记为“存在”或“不存在”。
肿瘤反应的定义
将遵循免疫相关应答标准来评估肿瘤反应。
通过免疫相关应答标准来确定总反应。
实体瘤的靶病变
·完全反应(irCR)被定义为通过从第一次记录的日期起不少于6周的重复连续评估确认所有病变均消失(不论是可测量的还是不可测量的，并且没有新的病变)；。
·部分反应(irPR)被定义为通过在第一次记录后至少6周的连续评估确认肿瘤负荷相对于基线下降>50％。
·疾病进展(irPD)被定义为通过自从治疗开始或一个或多个新的病变出现记录的病变第一次被记录的日期起不少于6周的重复连续评估确认肿瘤负荷相对于最低点(记录的最小肿瘤负荷)增加>25％。
·病情稳定(irSD)被定义为在不存在irPD的情况下不满足irCR或irPR的标准。
实体瘤的非靶病变
当可测量的肿瘤已经满足反应或irSD的标准时，在治疗期间出现或恶化的任何渗出物的肿瘤起源的细胞学确认，对于区分反应或irSD与irPD是必要的。
肿瘤反应的确认
为指定为irPR或irCR状态，患有反应性肿瘤的患者的肿瘤测量值的改变必须通过重复研究来确认，该重复研究应当在第一次满足反应标准后≥6周进行。在irSD的情况下，随访的测量值在研究开始后在6周的最小间隔下必须至少一次满足irSD标准。当靶病变和非靶病变均存在时，将分别记录单独的评估。反应的总体评估将包含如表III中描述的所有参数。
最佳的总反应是从治疗开始直到疾病进展/复发期间记录的最佳反应(作为相对于从治疗开始记录的最小测量值的肿瘤进展的参考)。患者的最佳反应指定将依赖于测量值和确认标准两者的达成。
如果没有后续的随机肿瘤学评估，患者将被定义为是反应不可评价的(NE)。这些患者在肿瘤反应数据的分析中将被看作是失败的。
临床疗效评价：体力状态。
如表IV所述根据Karnofsky体力状态量表将患者分级。
表IV.Karnofsky体力状态标准
肿瘤标志物反应
评估方法
尽管在许多恶性肿瘤中没有充分验证的疗效测量，但是肿瘤标志物的系列测定可以允许对作为潜在附加手段的容易进行的、便宜的、定量的临床工具的评价以用于追踪治疗期间的疾病过程。
肿瘤标志物减少或增加不会被评定为客观的结果测量。特别地，升高的肿瘤标志物值将不在肿瘤进展的定义中考虑，但是应当提示重复的放射影像学评价以证明是否已经发生了放射影像学肿瘤进展。
计算终点定义
存活期被定义为从首次研究药物治疗的日期到死亡日期之间的时间。在没有确认死亡的情况下，存活时间将在随访的最后日期进行排出。
肿瘤反应率被定义为具有任何客观irCR或irPR证据的患者的比例。
TTP定义为从治疗到肿瘤进展的第一次确认记录或到由于任何原因导致的死亡的时间。对于没有肿瘤进展的客观证据以及从研究治疗中排除或给予除研究治疗之外的抗肿瘤治疗的患者，将排除TTP。满足肿瘤标志物进展的标准的肿瘤标志物增加并不构成肿瘤进展的充分客观证据。然而，这样的肿瘤标志物增加应当提示重复的放射影像学评价以记录是否已经发生了客观的肿瘤进展。
TTF被定义为从治疗到肿瘤进展的第一次确认记录，或到停止治疗的日期，或到由于任何原因导致的死亡(以先到的时间为准)的时间。在分析时仍然在治疗的患者，以及在客观反应期间被他们的医师排除治疗的患者，以及在停止治疗的日期没有客观肿瘤进展的证据的患者，将不会被认为是治疗失败，除非由于医疗事件的发生而撤出。对于这些患者，TTF将在停止研究的日期加以排除。还将在客观肿瘤进展、停止研究的日期或死亡三者最先发生的之前，对给予除研究治疗之外的抗肿瘤治疗的那些患者进行TTF排除。满足肿瘤标志物进展的标准的肿瘤标志物增加并不构成治疗失败的充分客观证据。然而，这样的肿瘤标志物增加应当提示重复的放射影像学评价以记录客观的肿瘤进展(以及由此造成的治疗失败)是否已经发生。
第一确定性能(performance)状态恶化的时间为在没有确定的确认性能状态恶化的先前记录的情况下，从治疗到性能状态不比基线差的最后时间或到由于任何原因导致的死亡之间的时间。对于没有确定的性能状态恶化的患者以及从研究中排除或给予除了研究治疗之外的抗肿瘤治疗的患者，将排除确定的性能状态恶化。
第一确定体重减轻的时间定义为在没有确定的体重减轻的先前记录的情况下，从治疗到重量百分比从基线减少<5％的最后时间或者到由于任何原因导致的死亡之间的时间。对于没有确定的体重减轻的患者以及从研究中排除或给予除研究治疗之外的抗肿瘤治疗的患者，将排除确定的体重减轻。
附加的数据评价可以包括最佳客观反应、确认和未确认的客观反应率、研究治疗的持续时间、新病变首次发生的时间、肿瘤反应时间、24周病情稳定以及24周无进展存活率。如果需要，可以通过RECIST 1.1标准来评价数据。
治疗施用评估
对于IA期和IB期两个阶段：剂量强度被定义为总剂量/周期乘以从治疗开始到最后治疗加13天之间的周数。
相对剂量强度百分比被定义为实际剂量强度除以相同时间段的计划剂量强度的比例。
缩写
ALT 丙氨酸转氨酶
ANC 嗜中性粒细胞绝对计数
AST 天冬氨酸转氨酶
AUC 血浆浓度-时间曲线下面积
BSA 体表面积(mg/m2)
CL 全身血浆清除率
Cmax 血浆峰值浓度
CR 完全反应
CRF 病例报告表
CT 计算机断层扫描
CTC 常见毒性标准
DLT 剂量限制性毒性
EOI 输注结束
FDA 美国食品与药品管理局
G-CSF 粒细胞集落刺激因子(非格司亭(filgrastim)，)
GCP 优良临床规范
GM-CSF 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(沙格司亭(sargramostim)，)
HIV 人类免疫缺陷病毒
HR 风险比
IEC 独立伦理委员会
i.p. 腹膜内
IRB 机构审查委员会
IV 静脉内，通过静脉内
LD10或 使10％或50％的动物致死的剂量
LD50
LDH 乳酸脱氢酶
MAD 最大施用剂量
MRI 磁共振成像
MTD 最大耐受剂量
NCI 国立癌症研究所
NE 肿瘤反应不可评价
NOAEL 未观察到不良作用水平
Non-CR 非完全反应
Non-PD 非疾病进展
PBMC 外周血单核细胞
PCE 丙二醇：EL：乙醇
PD 疾病进展
PR 部分反应
SAER-S 严重不良事件报告-研究
SC 皮下的，通过皮下
SD 病情稳定
STD10 对10％的动物为严重毒性的剂量
TTP 进展时间
TTF 失败时间
T1/2 半衰期
Tmax 最大血浆浓度时的时间
Vss 稳态分布体积
尽管本文已经示出并描述了优选的实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离所公开的实施方案的情况下，本领域技术人员现将会想到很多变化、改变和替代。应理解，本文中所述的实施方案的各种替代方案可用于实施该实施方案。旨在以下述权利要求限定实施方案的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
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序列
SEQ ID NO:1:野生型HSV1-TK核苷酸序列
atggcttcgtaccccggccatcaacacgcgtctgcgttcgaccaggctgcgcgttctcgcggccatagcaaccgacgtacggcgttgcgccctcgccggcagcaagaagccacggaagtccgcccggagcagaaaatgcccacgctactgcgggtttatatagacggtccccacgggatggggaaaaccaccaccacgcaactgctggtggccctgggttcgcgcgacgatatcgtctacgtacccgagccgatgacttactggcgggtgctgggggcttccgagacaatcgcgaacatctacaccacacaacaccgcctcgaccagggtgagatatcggccggggacgcggcggtggtaatgacaagcgcccagataacaatgggcatgccttatgccgtgaccgacgccgttctggctcctcatatcgggggggaggctgggagctcacatgccccgcccccggccctcaccctcatcttcgaccgccatcccatcgccgccctcctgtgctacccggccgcgcggtaccttatgggcagcatgaccccccaggccgtgctggcgttcgtggccctcatcccgccgaccttgcccggcaccaacatcgtgcttggggcccttccggaggacagacacatcgaccgcctggccaaacgccagcgccccggcgagcggctggacctggctatgctggctgcgattcgccgcgtttacgggctacttgccaatacggtgcggtatctgcagtgcggcgggtcgtggcgggaggactggggacagctttcggggacggccgtgccgccccagggtgccgagccccagagcaacgcgggcccacgaccccatatcggggacacgttatttaccctgtttcgggcccccgagttgctggcccccaacggcgacctgtataacgtgtttgcctgggccttggacgtcttggccaaacgcctccgttccatgcacgtctttatcctggattacgaccaatcgcccgccggctgccgggacgccctgctgcaacttacctccgggatggtccagacccacgtcaccacccccggctccataccgacgatatgcgacctggcgcgcacgtttgcccgggagatgggggaggctaactga
SEQ ID NO:2:野生型HSV1-TK氨基酸序列
MASYPGHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRPEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVY
VPEPMTYWRVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHIGGEAGSSHAPPPALTLI
FDRHPIAALLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYG
LLANTVRYLQCGGSWREDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLR
SMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMVQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEAN
SEQ ID NO:3:Reximmune-C HSV-TK中的HSV-TK；NLS的SR 39突变体和R25G-R26S突变
atggcctcgtaccccggccatcaacacgcgtctgcgttcgaccaggctgcgcgttctcgcggccatagcaacggatccacggcgttgcgccctcgccggcagcaagaagccacggaagtccgcccggagcagaaaatgcccacgctactgcgggtttatatagacggtccccacgggatggggaaaaccaccaccacgcaactgctggtggccctgggttcgcgcgacgatatcgtctacgtacccgagccgatgacttactggcgggtgctgggggcttccgagacaatcgcgaacatctacaccacacaacaccgcctcgaccagggtgagatatcggccggggacgcggcggtggtaatgacaagcgcccagataacaatgggcatgccttatgccgtgaccgacgccgttctggctcctcatatcgggggggaggctgggagctcacatgccccgcccccggccctcaccatcttcctcgaccgccatcccatcgccttcatgctgtgctacccggccgcgcggtaccttatgggcagcatgaccccccaggccgtgctggcgttcgtggccctcatcccgccgaccttgcccggcaccaacatcgtgcttggggcccttccggaggacagacacatcgaccgcctggccaaacgccagcgccccggcgagcggctggacctggctatgctggctgcgattcgccgcgtttacgggctacttgccaatacggtgcggtatctgcagtgcggcgggtcgtggcgggaggactggggacagctttcggggacggccgtgccgccccagggtgccgagccccagagcaacgcgggcccacgaccccatatcggggacacgttatttaccctgtttcgggcccccgagttgctggcccccaacggcgacctgtataacgtgtttgcctgggccttggacgtcttggccaaacgcctccgttccatgcacgtctttatcctggattacgaccaatcgcccgccggctgccgggacgccctgctgcaacttacctccgggatggtccagacccacgtcaccacccccggctccataccgacgatatgcgacctggcgcgcacgtttgcccgggagatgggggaggctaactga
SEQ ID NO:4(由SEQ ID NO:3编码的氨基酸序列)
MASYPGHQHASAFDQAARSRGHSNGSTALRPRRQQEATEVRPEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVYVPEPMTYWRVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHIGGEAGSSHAPPPALTIFLDRHPIAFMLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQCGGSWREDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRSMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMVQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEAN
SEQ ID NO:5:待突变的HSV-TK位点以粗体下划线显示(HSV-TK核定位序列，RR，和底物结合域，LIF和AAL)
SEQ ID NOS:6和7:Sac I-Kpn I(SR39)突变区
GAGCTCACATGCCCCGCCCCCGGCCCTCACCATCTTCCTCGACCGCCATCCCATCGCC-
CTCGAGTGTACGGGGCGGGGGCCGGGAGTGGTAGAAGGAGCTGGCGGTAGGGTAGCGG-
Sac I
-TTCATGCTGTGCTACCCGGCCGCGCGGTACC(SEQ ID NO:6)
-AAGTACGACACGATGGGCCGGCGCGCCATGG(SEQ ID NO:7)
Kpn I
SEQ ID NOS:8和9:Sac I-Kpn I(SR39)突变区(切割)
CACATGCCCCGCCCCCGGCCCTCACCATCTTCCTCGACCGCCATCCCATCGCCTTCATG
TCGAGTGTACGGGGCGGGGGCCGGGAGTGGTAGAAGGAGCTGGCGGTAGGGTAGCGGAA
Sac I(切割)
CTGTGCTACCCGGCCGCGCGGTAC(SEQ ID NO:8)
GTACGACACGATGGGCCGGC(SEQ ID NO:9)
Kpn I(切割)
SEQ ID NOS:10和11：引物
SR39sackpn F1
5’CACATGCCCCGCCCCCGGCCCTCACCATCTTCCTCGACCGCCATCCCATCGCCTTCATGCTGTGCTACCCGGCCGCGCGGTAC 3’(SEQ ID NO:10)
SR39sackpn R1
5’CGCGCGGCCGGGTAGCACAGCATGAAGGCGATGGGATGGCGGTCGAGGAAGATGGTGAGGGCCGGGGGCGGGGCATGTGAGCT 3’(SEQ ID NO:11)
SEQ ID NO:12基因#3mHSV-TK CO A168H(LIF...AHL):长度:1185
GTCAGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCACTGCGGCCACGGCGCCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGACCACACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAAGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATTACAATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCACCACACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCACCACCACCAGCACTGACCCTGATCTTCGACCGGCACCCAATCGCACACCTGCTGTGCTACCCGGCAGCACGCTACCTGATGGGCTCCATGACACCACAAGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCACCAACACTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCACCACAGGGCGCCGAGCCACAGAGCAACGCCGGACCACGACCACACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGGGCACCAGAGCTGCTGGCACCAAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCTCCATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGTCACCGGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACAACACCCGGCAGCATCCCAACAATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCCAACTAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTGTCA
SEQ ID NO:13基因#4mHSV-TK CO TK A167F(LIF...FAL):长度:1185
GTCAGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCACTGCGGCCACGGCGCCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGACCACACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAAGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATTACAATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCACCACACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCACCACCACCAGCACTGACCCTGATCTTCGACCGGCACCCAATCTTCGCACTGCTGTGCTACCCGGCAGCACGCTACCTGATGGGCTCCATGACACCACAAGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCACCAACACTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCACCACAGGGCGCCGAGCCACAGAGCAACGCCGGACCACGACCACACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGGGCACCAGAGCTGCTGGCACCAAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCTCCATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGTCACCGGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACAACACCCGGCAGCATCCCAACAATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCCAACTAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTGTCA
SEQ ID NO:14基因#5mHSV-TK CO双突变A167F-A168H(LIF...FHL):长度:1185
GTCAGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCACTGCGGCCACGGCGCCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGACCACACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAAGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATTACAATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCACCACACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCACCACCACCAGCACTGACCCTGATCTTCGACCGGCACCCAATCTTCCACCTGCTGTGCTACCCGGCAGCACGCTACCTGATGGGCTCCATGACACCACAAGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCACCAACACTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCACCACAGGGCGCCGAGCCACAGAGCAACGCCGGACCACGACCACACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGGGCACCAGAGCTGCTGGCACCAAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCTCCATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGTCACCGGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACAACACCCGGCAGCATCCCAACAATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCCAACTAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTGTCA
SEQ ID NO:15基因#6mHSV-TK CO MB-IFL A168H(IFL...AHL):长度:1185
GTCAGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCACTGCGGCCACGGCGCCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGACCACACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAAGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATTACAATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCACCACACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCACCACCACCAGCACTGACCATCTTCCTGGACCGGCACCCAATCGCACACCTGCTGTGCTACCCGGCAGCACGCTACCTGATGGGCTCCATGACACCACAAGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCACCAACACTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCACCACAGGGCGCCGAGCCACAGAGCAACGCCGGACCACGACCACACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGGGCACCAGAGCTGCTGGCACCAAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCTCCATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGTCACCGGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACAACACCCGGCAGCATCCCAACAATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCCAACTAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTGTCA
SEQ ID NO:16基因#1HSV-TK A168H dmNLS CO SC:长度:1185
GTCAGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCACTGCGGCCAGGATCTCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGACCACACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAAGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATTACAATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCACCACACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCACCACCACCAGCACTGACCCTGATCTTCGACCGGCACCCAATCGCACACCTGCTGTGCTACCCGGCAGCACGCTACCTGATGGGCTCCATGACACCACAAGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCACCAACACTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCACCACAGGGCGCCGAGCCACAGAGCAACGCCGGACCACGACCACACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGGGCACCAGAGCTGCTGGCACCAAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCTCCATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGTCACCGGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACAACACCCGGCAGCATCCCAACAATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCCAACTAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTGTCA
SEQ ID NO:17基因#2HSV-TK A167F dmNLS CO SC:长度:1185
GTCAGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCACTGCGGCCAGGATCTCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGACCACACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAAGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATTACAATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCACCACACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCACCACCACCAGCACTGACCCTGATCTTCGACCGGCACCCAATCTTCGCACTGCTGTGCTACCCGGCAGCACGCTACCTGATGGGCTCCATGACACCACAAGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCACCAACACTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCACCACAGGGCGCCGAGCCACAGAGCAACGCCGGACCACGACCACACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGGGCACCAGAGCTGCTGGCACCAAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCTCCATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGTCACCGGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACAACACCCGGCAGCATCCCAACAATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCCAACTAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTGTCA
SEQ ID NO:18基因#3HSV-TK A168H NESdmNLS CO SC:长度:1221
GTCAGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCCTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGCTGGAACTGGATGGCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCACTGCGGCCAGGATCTCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGACCACACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAAGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATTACAATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCACCACACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCACCACCACCAGCACTGACCCTGATCTTCGACCGGCACCCAATCGCACACCTGCTGTGCTACCCGGCAGCACGCTACCTGATGGGCTCCATGACACCACAAGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCACCAACACTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCACCACAGGGCGCCGAGCCACAGAGCAACGCCGGACCACGACCACACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGGGCACCAGAGCTGCTGGCACCAAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCTCCATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGTCACCGGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACAACACCCGGCAGCATCCCAACAATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCCAACTAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTGTCA
SEQ ID NO:19基因#4HSV-TK A167F NESdmNLS CO SC:长度:1221
GTCAGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCCTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGCTGGAACTGGATGGCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCACTGCGGCCAGGATCTCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGACCACACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAAGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATTACAATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCACCACACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCACCACCACCAGCACTGACCCTGATCTTCGACCGGCACCCAATCTTCGCACTGCTGTGCTACCCGGCAGCACGCTACCTGATGGGCTCCATGACACCACAAGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCACCAACACTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCACCACAGGGCGCCGAGCCACAGAGCAACGCCGGACCACGACCACACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGGGCACCAGAGCTGCTGGCACCAAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCTCCATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGTCACCGGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACAACACCCGGCAGCATCCCAACAATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCCAACTAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTGTCA
SEQ ID NO:20基因#5HSV-TK A168H NESdmNLS JCO SC:长度:1221
GTCAGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCTCTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGCTGGAACTGGATGGCTCTTATCCTGGACATCAGCATGCTTCTGCTTTTGATCAGGCTGCCAGATCTAGAGGACATTCTAATGGCAGCACAGCACTGCGGCCAGGATCTCAGCAGGAAGCTACAGAAGTGAGACCTGAACAGAAAATGCCTACACTGCTGAGAGTGTATATTGATGGACCACATGGAATGGGAAAAACAACCACAACCCAGCTGCTGGTGGCTCTCGGATCTAGAGATGATATTGTGTATGTGCCTGAACCTATGACATATTGGAGAGTGCTGGGAGCTTCTGAAACAATTGCTAATATCTATACAACACAGCATAGACTGGATCAAGGAGAAATTTCTGCCGGAGATGCTGCCGTGGTGATGACATCTGCTCAGATTACAATGGGAATGCCTTATGCTGTGACAGATGCTGTGCTGGCACCACATATTGGAGGCGAAGCTGGAAGCTCTCATGCACCACCACCAGCACTGACACTGATTTTTGATCGGCATCCAATTGCACATCTGCTGTGTTATCCGGCAGCAAGATATCTGATGGGAAGCATGACACCACAAGCCGTGCTGGCTTTTGTGGCTCTGATTCCACCAACACTGCCTGGAACAAACATCGTGCTGGGAGCTCTGCCTGAAGATAGACATATCGATCGGCTGGCCAAACGGCAGAGACCTGGAGAACGGCTGGATCTGGCCATGCTGGCTGCCATTCGGAGAGTGTATGGCCTGCTGGCTAACACAGTGAGATATCTGCAGTGTGGAGGCTCTTGGAGAGAGGATTGGGGACAGCTGTCTGGCACAGCTGTGCCACCACAGGGAGCCGAACCACAGAGCAATGCTGGACCACGACCACATATCGGAGACACACTGTTTACACTGTTTCGGGCACCAGAACTGCTGGCACCAAATGGAGACCTGTACAACGTGTTTGCCTGGGCTCTGGATGTGCTGGCTAAACGGCTGAGATCTATGCATGTGTTTATCCTGGACTATGATCAGTCACCGGCCGGATGTCGCGATGCCCTGCTGCAGCTGACATCTGGGATGGTGCAGACACATGTGACAACACCTGGATCTATCCCAACAATCTGTGATCTGGCTAGAACATTCGCTAGGGAGATGGGAGAGGCCAACTAATGAGGATCCCTCGAGAAGCTTGTCA
SEQ ID NO:21基因#6HSV-TK A167F NESdmNLS JCO SC:长度:1221
GTCAGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCTCTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGCTGGAACTGGATGGCTCTTATCCTGGACATCAGCATGCTTCTGCTTTTGATCAGGCTGCCAGATCTAGAGGACATTCTAATGGCAGCACAGCACTGCGGCCAGGATCTCAGCAGGAAGCTACAGAAGTGAGACCTGAACAGAAAATGCCTACACTGCTGAGAGTGTATATTGATGGACCACATGGAATGGGAAAAACAACCACAACCCAGCTGCTGGTGGCTCTCGGATCTAGAGATGATATTGTGTATGTGCCTGAACCTATGACATATTGGAGAGTGCTGGGAGCTTCTGAAACAATTGCTAATATCTATACAACACAGCATAGACTGGATCAAGGAGAAATTTCTGCCGGAGATGCTGCCGTGGTGATGACATCTGCTCAGATTACAATGGGAATGCCTTATGCTGTGACAGATGCTGTGCTGGCACCACATATTGGAGGCGAAGCTGGAAGCTCTCATGCACCACCACCAGCACTGACACTGATTTTTGATCGGCATCCAATTTTCGCACTGCTGTGTTATCCGGCAGCAAGATATCTGATGGGAAGCATGACACCACAAGCCGTGCTGGCTTTTGTGGCTCTGATTCCACCAACACTGCCTGGAACAAACATCGTGCTGGGAGCTCTGCCTGAAGATAGACATATCGATCGGCTGGCCAAACGGCAGAGACCTGGAGAACGGCTGGATCTGGCCATGCTGGCTGCCATTCGGAGAGTGTATGGCCTGCTGGCTAACACAGTGAGATATCTGCAGTGTGGAGGCTCTTGGAGAGAGGATTGGGGACAGCTGTCTGGCACAGCTGTGCCACCACAGGGAGCCGAACCACAGAGCAATGCTGGACCACGACCACATATCGGAGACACACTGTTTACACTGTTTCGGGCACCAGAACTGCTGGCACCAAATGGAGACCTGTACAACGTGTTTGCCTGGGCTCTGGATGTGCTGGCTAAACGGCTGAGATCTATGCATGTGTTTATCCTGGACTATGATCAGTCACCGGCCGGATGTCGCGATGCCCTGCTGCAGCTGACATCTGGGATGGTGCAGACACATGTGACAACACCTGGATCTATCCCAACAATCTGTGATCTGGCTAGAACATTCGCTAGGGAGATGGGAGAGGCCAACTAATGAGGATCCCTCGAGAAGCTTGTCA
SEQ ID NO:22
HSV-TK dmNLS A168H,CO&SC
dmNLS＝双突变的核定位序列
CO＝密码子优化的
SC＝在327和555处剪接校正
Kozak序列,下划线
gtcaGCGGCCGCACCGGTACGCGTCCACCATGGCCAGCTACCCCGGCCACCAGCACGCCAGCGCCTTCGACCAGGCCGCCCGCAGCCGCGGCCACAGCAACGGCAGCACCGCaCTGCGgCCaGGATCTCAGCAGGAGGCCACCGAGGTGCGCCCCGAGCAGAAGATGCCCACCCTGCTGCGCGTGTACATCGACGGaCCaCACGGCATGGGCAAGACCACCACCACCCAGCTGCTGGTGGCCCTGGGCAGCCGCGACGACATCGTGTACGTGCCCGAGCCCATGACCTACTGGCGCGTGCTGGGCGCCAGCGAGACCATCGCCAACATCTACACCACCCAGCACCGCCTGGACCAaGGCGAGATCAGCGCCGGCGACGCCGCCGTGGTGATGACCAGCGCCCAGATtACaATGGGCATGCCCTACGCCGTGACCGACGCCGTGCTGGCaCCaCACATCGGCGGCGAGGCCGGCAGCAGCCACGCaCCaCCaCCaGCaCTGACCCTGATCTTCGACCGgCACCCaATCGCaCACCTGCTGTGCTACCCgGCaGCaCGCTACCTGATGGGCtccATGACaCCaCAaGCCGTGCTGGCCTTCGTGGCCCTGATCCCaCCaACaCTGCCCGGCACCAACATCGTGCTGGGCGCCCTGCCCGAGGACCGCCACATCGACCGCCTGGCCAAGCGCCAGCGCCCCGGCGAGCGCCTGGACCTGGCCATGCTGGCCGCCATCCGCCGCGTGTACGGCCTGCTGGCCAACACCGTGCGCTACCTGCAGTGCGGCGGCAGCTGGCGCGAGGACTGGGGCCAGCTGAGCGGCACCGCCGTGCCaCCaCAGGGCGCCGAGCCaCAGAGCAACGCCGGaCCaCGaCCaCACATCGGCGACACCCTGTTCACCCTGTTCCGgGCaCCaGAGCTGCTGGCaCCaAACGGCGACCTGTACAACGTGTTCGCCTGGGCCCTGGACGTGCTGGCCAAGCGCCTGCGCtccATGCACGTGTTCATCCTGGACTACGACCAGtcaCCgGCCGGCTGCCGCGACGCCCTGCTGCAGCTGACCAGCGGCATGGTGCAGACCCACGTGACaACaCCCGGCAGCATCCCaACaATCTGCGACCTGGCCCGCACCTTCGCCCGCGAGATGGGCGAGGCCAACTAATAGGGATCCCTCGAGAAGCTTgtca
SEQ ID NO:23–MAP激酶激酶核输出多核苷酸序列
CTGCAGAAAAAGCTGGAAGAGCTGGAACTGGATGGC
SEQ ID NO:24-MAP激酶激酶核输出多肽序列
LQKKLEELELDG
SEQ ID NO:25–靶向部分
WREPSFMALS

Claims (41)

1.包含含有核输出序列的HSV-TK多核苷酸的基因治疗逆转录病毒颗粒在制备用于鉴定患有能够从基因疗法中受益的病变的患者的试剂盒中的用途，其中所述鉴定包括：
a)将所述包含含有核输出序列的HSV-TK多核苷酸的基因治疗逆转录病毒颗粒施用于所述患者，其中所述HSV-TK多核苷酸编码包含在氨基酸残基32和33，以及25、26、或168至少之一处突变的HSV-TK的突变形式，其中所述氨基酸残基对应于SEQ ID NO:2的位置32、33、25、26、和168，其中氨基酸残基32和33各自独立地突变为选自甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸的氨基酸，并且其中所述HSV-TK的突变形式相对于野生型胸苷激酶增加细胞杀伤活性；
b)将与放射性示踪剂连接的标记的核苷酸类似物HSV-TK底物施用于所述患者；
c)测量存在于所述患者中的放射性信号的相对量和位置；以及
d)确定所述患者的病变的位置，其中将具有以下特征的患者鉴定为能够从基因疗法治疗中受益：所述患者具有(i)与步骤(d)中测定的病变相关的放射性信号的位置；以及(ii)在某一阈值之上的放射性信号。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述HSV-TK底物选自：FHBG(9-[4-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)，FHPG(9-([3-氟-1-羟基-2-丙氧基]甲基)鸟嘌呤)，FGCV(氟更昔洛韦)，FPCV(氟喷昔洛韦)，FIAU(1-(2'-脱氧-2'-氟-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶)，FEAU(氟-5-乙基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FMAU(氟-5-甲基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FHOMP(6-((1-氟-3-羟基丙-2-基氧基)甲基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮)，更昔洛韦，缬更昔洛韦，阿昔洛韦，伐昔洛韦，喷昔洛韦，在N-1处具有4-羟基-3-(羟基甲基)丁基侧链的放射性标记的嘧啶(HHG-5-FEP)或带有2,3-二羟基丙基、阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦样侧链的5-(2-)羟基乙基)-和5-(3-羟基丙基)-取代的嘧啶衍生物。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述HSV-TK底物是FHBG(9-[4-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述放射性示踪剂是18F、64Cu、99mTe、11C、14C、124I、123I、131I、15O、13N和/或82RbCl。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述放射性示踪剂是18F。
6.如权利要求1所述的用途，其中所述HSV-TK底物是[18F]FHBG(9-[4-18F-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)。
7.如权利要求1所述的用途，其中使用正电子发射断层成像(PET)扫描来测量放射性示踪剂信号。
8.如权利要求7所述的用途，其中当使用正电子发射断层成像扫描来测量所述放射性信号时，所述阈值水平是至少2.0SUV(标准摄取值)以上或比背景高至少20％。
9.如权利要求7所述的用途，其中当使用正电子发射断层成像扫描来测量所述放射性信号时，所述阈值水平是1.0SUV至3.0SUV，或比背景高20％至40％。
10.如权利要求1所述的用途，其中所述用途进一步包括采用所述基因治疗逆转录病毒颗粒制备用于治疗患有所述病变的患者的药物。
11.如权利要求1所述的用途，其中所述突变是A168H。
12.如权利要求1所述的用途，其中所述核输出序列(NES)位于所表达的HSV-TK的突变形式的氨基末端处或附近。
13.如权利要求1所述的用途，其中所述HSV-TK多核苷酸是SEQID NO:18。
14.如权利要求13所述的用途，其中所述逆转录病毒颗粒进一步包括编码在病毒包膜上表达的靶向蛋白的多核苷酸。
15.如权利要求14所述的用途，其中所述靶向蛋白与胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖或RGD结合。
16.如权利要求14所述的用途，其中所述靶向蛋白与胶原蛋白结合。
17.如权利要求16所述的用途，其中所述靶向蛋白是SEQ ID NO:25。
18.如权利要求1所述的用途，其中所述HSV-TK多核苷酸编码包含在氨基酸残基32和33，以及25或26至少之一处突变的HSV-TK的突变形式，其中所述氨基酸残基对应于SEQ IDNO:2的位置32、33、25、和26。
19.如权利要求1所述的用途，其中所述HSV-TK多核苷酸编码包含在氨基酸残基32、33、和168处突变的HSV-TK的突变形式，其中所述氨基酸残基对应于SEQ ID NO:2的位置32、33、和168。
20.如权利要求1所述的用途，其中氨基酸残基25和26突变为选自甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸的氨基酸。
21.如权利要求1所述的用途，其中氨基酸残基168突变为选自组氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、丝氨酸和苯丙氨酸的氨基酸。
22.包含含有核输出序列的HSV-TK多核苷酸的基因治疗逆转录病毒颗粒在制备用于鉴定需要治疗病变、能够从基因疗法中受益的患者的试剂盒中的用途，其中所述鉴定包括：
a)向患者施用所述包含含有核输出序列的HSV-TK多核苷酸的基因治疗逆转录病毒颗粒并用编码HSV-TK的多核苷酸转导来自所述患者的细胞，其中所述HSV-TK多核苷酸编码包含在氨基酸残基32和33，以及25、26、或168至少之一处突变的HSV-TK的突变形式，其中所述氨基酸残基对应于SEQ ID NO:2的位置32、33、25、26、和168，其中氨基酸残基32和33各自独立地突变为选自甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸的氨基酸，并且其中所述HSV-TK的突变形式相对于野生型胸苷激酶增加细胞杀伤活性；
b)使用与放射性示踪剂连接的标记的核苷酸类似物HSV-TK底物处理所述细胞；
c)测量存在于靶组织中的放射性信号的相对量和位置；
d)鉴定所述放射性信号是否在阈值之上；
e)确定所述患者的病变的位置；以及
f)如果(i)所述患者中测量的放射性信号在所述阈值之上并且(ii)所测量的放射性信号的位置与(e)中测定的病变位置相关时，将(a)中的包含所述HSV-TK多核苷酸的基因治疗逆转录病毒颗粒重新施用于所述患者。
23.如权利要求22所述的用途，其中所述HSV-TK底物选自：FHBG(9-[4-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)，FHPG(9-([3-氟-1-羟基-2-丙氧基]甲基)鸟嘌呤)，FGCV(氟更昔洛韦)，FPCV(氟喷昔洛韦)，FIAU(1-(2'-脱氧-2'-氟-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶)，FEAU(氟-5-乙基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FMAU(氟-5-甲基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基尿嘧啶)，FHOMP(6-((1-氟-3-羟基丙-2-基氧基)甲基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮)，更昔洛韦，缬更昔洛韦，阿昔洛韦，伐昔洛韦，喷昔洛韦，在N-1处具有4-羟基-3-(羟基甲基)丁基侧链的放射性标记的嘧啶(HHG-5-FEP)或带有2,3-二羟基丙基、阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦样侧链的5-(2-)羟基乙基)-和5-(3-羟基丙基)-取代的嘧啶衍生物。
24.如权利要求22所述的用途，其中所述HSV-TK底物是FHBG(9-[4-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)。
25.如权利要求22所述的用途，其中所述放射性示踪剂是18F、64Cu、99mTe、11C、14C、124I、123I、131I、15O、13N和/或82RbCl。
26.如权利要求22所述的用途，其中所述放射性示踪剂是18F。
27.如权利要求22所述的用途，其中所述HSV-TK底物是[18F]FHBG(9-[4-18F-氟-3-(羟基甲基)丁基]鸟嘌呤)。
28.如权利要求22所述的用途，其中使用正电子发射断层成像(PET)扫描来测量放射性示踪剂信号。
29.如权利要求28所述的用途，其中当使用正电子发射断层成像扫描来测量所述放射性信号时，所述阈值水平是至少2.0SUV(标准摄取值)以上，或比背景高至少20％。
30.如权利要求28所述的用途，其中当使用正电子发射断层成像扫描来测量所述放射性信号时，所述阈值水平为1.0SUV至3.0SUV。
31.如权利要求22所述的用途，其中基因治疗逆转录载体颗粒包含第二治疗多核苷酸。
32.如权利要求22所述的用途，其中所述突变是A168H。
33.如权利要求22所述的用途，其中所述HSV-TK多核苷酸是SEQ ID NO:18。
34.如权利要求33所述的用途，其中所述逆转录病毒颗粒进一步包括编码在病毒包膜上表达的靶向蛋白的多核苷酸。
35.如权利要求34所述的用途，其中所述靶向蛋白与胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖或RGD结合。
36.如权利要求34所述的用途，其中所述靶向蛋白与胶原蛋白结合。
37.如权利要求36所述的用途，其中所述靶向蛋白是SEQ ID NO:25。
38.如权利要求22所述的用途，其中所述HSV-TK多核苷酸编码包含在氨基酸残基32和33，以及25或26至少之一处突变的HSV-TK的突变形式，其中所述氨基酸残基对应于SEQ IDNO:2的位置32、33、25、和26。
39.如权利要求22所述的用途，其中所述HSV-TK多核苷酸编码包含在氨基酸残基32、33、和168处突变的HSV-TK的突变形式，其中所述氨基酸残基对应于SEQ ID NO:2的位置32、33、和168。
40.如权利要求22所述的用途，其中氨基酸残基25和26突变为选自甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸的氨基酸。
41.如权利要求22所述的用途，其中氨基酸残基168突变为选自组氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、丝氨酸和苯丙氨酸的氨基酸。
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