JP2016519570A - 改善されたチミジンキナーゼ遺伝子 - Google Patents

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Abstract

改善された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼをコードする核酸配列が提供され、診断適用および治療適用におけるその使用を含む。チミジンキナーゼは、保存的突然変異、非保存的突然変異または両方を使用して突然変異し得る。また、ウイルスおよびレトロウイルス粒子を含む遺伝子治療系も提供される。

Description

相互参照
本願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年３月１４日に出願された米国特許仮出願番号第６１／７８４，９０１号の利益を主張する。
本願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、本明細書と同日に出願された、以下の同時係属特許出願番号［まだ割り当てられていない］、代理人整理番号第３０８６３−７２２．２０２号に関連する。
癌などの増殖性疾患は、社会に対して容易でない課題を提示する。悪性癌性成長を含めた癌性成長は、例えば、悪性組織の調節されない成長をもたらす制御不能な細胞増殖、局所、さらには遠隔組織にまで浸潤する能力、分化の欠如、検出可能な症状の欠如および最も著しくは、有効な治療および予防の欠如などの独特の特徴を有する。
癌は、任意の年齢で任意の臓器の任意の組織において発達し得る。癌の病因論は、明確に規定されていないが、遺伝的感受性、染色体切断障害、ウイルス、環境因子および免疫学的障害などの機序はすべて、悪性細胞成長および形質転換と関係していた。癌は、世界中で何百万人もの個人に影響を及ぼす医学的状態の大きなカテゴリーを包含する。癌細胞は、身体のほとんどいかなる臓器および／または組織においても生じ得る。世界中で、毎年１０００万人超が、癌と診断され、この数字は、２０２０年までに毎年１５００万の新規症例まで増大すると推測されている。癌は、毎年６００万人の死亡、すなわち、世界中の死亡の１２％を引き起こす。
ヒト単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）の突然変異形態をコードするポリヌクレオチド配列が、本明細書において提供され、ここで、コードされるＨＳＶ−ＴＫは、アミノ酸残基２５、２６、３２、３３、１６７、１６８またはそれらの組合せで突然変異しており、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１または３のポリヌクレオチド配列と比較して突然変異している。
ヒト単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）の突然変異した形態をコードするポリヌクレオチド配列であって、コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基２５、２６、３２、３３、１６７、１６８またはそれらの組合せで突然変異しており、ポリヌクレオチド配列が、配列番号３のポリヌクレオチド配列と比較して突然変異している、ポリヌクレオチド配列。一実施形態では、コードされるＨＳＶ−ＴＫは、アミノ酸残基１６７、１６８またはそれらの組合せで、極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に突然変異している。別の実施形態では、コードされるＨＳＶ−ＴＫは、アミノ酸残基１６７で、極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に突然変異している。なお別の実施形態では、コードされるＨＳＶ−ＴＫは、アミノ酸残基１６８で、極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に突然変異している。さらに別の実施形態では、コードされるＨＳＶ−ＴＫは、アミノ酸残基１６７および１６８の両方で、極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に突然変異している。
一実施形態では、コードされるＨＳＶ−ＴＫのアミノ酸残基１６７は、セリンまたはフェニルアラニンに突然変異している。別の実施形態では、コードされるＨＳＶ−ＴＫのアミノ酸残基１６８は、ヒスチジン、リシン、システイン、セリンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸に突然変異している。さらに別の実施形態では、コードされるＨＳＶ−ＴＫは、アミノ酸２５および２６で突然変異している。なお別の実施形態では、アミノ酸残基２５および２６は、グリシン、セリンおよびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸に突然変異している。別の実施形態では、コードされるＨＳＶ−ＴＫは、アミノ酸残基３２および３３で突然変異している。一実施形態では、アミノ酸残基３２および３３は、グリシン、セリンおよびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸に突然変異している。一実施形態では、コードされるＨＳＶ−ＴＫは、アミノ酸残基２５、２６、３２および３３で突然変異している。別の実施形態では、アミノ酸残基２５、２６、３２および３３は、グリシン、セリンおよびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸に突然変異している。さらに別の実施形態では、コードされるＨＳＶ−ＴＫは、アミノ酸残基２５、２６、３２および３３からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異およびアミノ酸残基１６７および１６８からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む。
さらに他の実施形態では、コードされるＨＳＶ−ＴＫ配列は、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）をさらに含む。別の実施形態では、核外輸送シグナル配列は、ＨＳＶ−ＴＫ配列の５’末端にまたはその付近に挿入される。別の実施形態では、核外輸送シグナル配列は、ＬＱＫＫＬＥＥＬＥＬＤＧ（配列番号２４）である。一実施形態では、コードされる突然変異体ＨＳＶ−ＴＫは、核領域に排他的に局在しない。
一実施形態では、コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫは、野生型ＨＳＶ−ＴＫと比較して、低下した量のチミジンキナーゼ活性を示す。別の実施形態では、コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫの活性は、約１．５倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍または約５０倍低下する。さらに別の実施形態では、コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫの活性は、約１．５％、約２％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約１００％低下する。
一実施形態では、コードされるＨＳＶ−ＴＫは、アミノ酸残基２５、２６、３２、３３および１６８での突然変異を含む。別の実施形態では、コードされるＨＳＶ−ＴＫは、突然変異Ｒ２５Ｇ、Ｒ２６Ｓ、Ｒ３２Ｇ、Ｒ３３ＳおよびＡ１６８Ｈを含む。
一実施形態では、修飾されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１２〜２２のいずれか１種として示される核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、修飾されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１６〜２２のいずれか１種として示される核酸配列を含む。一実施形態では、配列は、ＴＫ１６８ｄｍＮＥＳ（配列番号１８）を含む。さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、修飾されたＨＳＶ−ＴＫポリペプチドをコードする。
さらに他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、前記の第２のポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。さらに他の実施形態では、第２の治療用ポリペプチドは、第２の自殺遺伝子または成長因子である。いくつかの実施形態では、成長因子は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−βおよび線維芽細胞成長因子からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼ、ＶＳＶ−ｔｋ、ＩＬ−２、ニトロレダクターゼ（ＮＲ）、カルボキシルエステラーゼ、β−グルクロニダーゼ、シトクロムｐ４５０、β−ガラクトシダーゼ、ジフテリア毒素Ａ−鎖（ＤＴ−Ａ）、カルボキシペプチドＧ２（ＣＰＧ２）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）およびデオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＰｉＴ−２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。さらに他の実施形態では、本明細書において開示されるポリヌクレオチドは、ターゲッティングポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。一実施形態では、ターゲッティングポリペプチドは、細胞外タンパク質と結合する。別の実施形態では、細胞外タンパク質は、コラーゲンである。
本明細書において記載されるように、治療有効量のレトロウイルス粒子を投与することを含み、レトロウイルスベクターがＨＳＶ−ＴＫ修飾されたペプチドをコードする、それを必要とする対象において新生物細胞を死滅させる方法も、本明細書において提供される。
いくつかの実施形態では、レトロウイルス粒子は、静脈内に、筋肉内に、皮下に（subcutaneoustly）、動脈内に、肝動脈内に、髄腔内に、腹膜内におよび／または腫瘍内に投与される。他の実施形態では、レトロウイルス粒子は、腫瘍内にまたは静脈内に投与される。さらに他の実施形態では、レトロウイルスベクター粒子は、動脈内に投与される。
他の実施形態では、少なくとも１×１０１２ＴＶＰのレトロウイルスベクターが、それを必要とする対象に累積的に投与される。さらに他の実施形態では、少なくとも１×１０９ＴＶＰのレトロウイルスベクターが、それを必要とする対象に一度に投与される。
さらに他の実施形態では、プロドラッグは、レトロウイルスベクター粒子の投与後、約１〜２日の間投与される。いくつかの実施形態では、プロドラッグは、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、アシクロビル、バラシクロビル、ペンシクロビルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プロドラッグは、ガンシクロビルである。
また、それを必要とする患者に、本明細書において記載されるような、ＨＳＶ−ＴＫ修飾されたペプチドをコードする治療有効量のレトロウイルスベクター粒子を送達し、その後、ヌクレオシドプロドラッグを投与することを含む、それを必要とする患者において癌を治療する方法が本明細書において提供される。
また、ギャップ結合依存性細胞内情報伝達（ＧＪＩＣ）を増大する処理とともに、対象に治療有効量の、ＨＳＶ−ＴＫを含むレトロウイルスベクター粒子を送達することを含む、対象における新生物細胞のＨＳＶ−ＴＫガンシクロビル、バルガンシクロビル、アシクロビル、バラシクロビル、ペンシクロビル媒介性死滅を増大する方法も本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、ＧＪＩＣを増大する処理は、少なくとも１種のギャップ結合サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を送達することを含む。他の実施形態では、ギャップ結合サブユニットは、コネキシン４３、コネキシン３０またはコネキシン２６である。さらに他の実施形態では、ギャップ結合サブユニットは、翻訳後修飾を防ぐよう修飾されたギャップ結合サブユニットである。さらに他の実施形態では、ＧＪＩＣを増大する処理は、Ｅ−カドヘリンをコードするポリヌクレオチド配列を送達することを含む。さらに他の実施形態では、ＧＪＩＣを増大する処理は、対象に、ゲムシタビン、ｃＡＭＰ、レチノイン酸、カロテノイド、グルココルチコイド、フラバノイド、アピゲニンまたはロバスタチンからなる群からの化合物を送達することを含む。さらに他の実施形態では、ＧＪＩＣを増大する処理は、プロテアソーム阻害を含む。一実施形態では、プロテアソーム阻害は、Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯ（ＡＬＬＮ）および／またはクロロキンの投与を含む。他の実施形態では、ＧＪＩＣを増大する処理は、放射線または電気的処理を含む。
また、ａ）細胞に、請求項１から２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を導入することと、ｂ）細胞が、発現されるチミジンキナーゼまたはその変異体を発現するのを可能にするまたは開始させることと、ｃ）細胞を、チミジンキナーゼによって細胞傷害性薬剤に変換される薬剤と接触させることとを含む、細胞を死滅させる方法も本明細書において提供される。
一実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の修飾を含む、ヒト単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）の突然変異形態をコードする。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の修飾を含む、ヒト単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）の突然変異形態をコードする。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の修飾を含む、ヒト単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）突然変異形態をコードする。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の修飾を含む、ヒト単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）の突然変異形態をコードする。別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の修飾を含む、ヒト単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）の突然変異形態をコードする。
一実施形態では、コードされるＨＳＶ−ＴＫは、アミノ酸残基１６７、１６８またはそれらの組合せで、極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に突然変異し得る。例えば、コードされるＨＳＶ−ＴＫは、アミノ酸残基１６７で、極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に突然変異し得る。別の例では、コードされるＨＳＶ−ＴＫは、アミノ酸残基１６８で、極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に突然変異し得る。別の例では、コードされるＨＳＶ−ＴＫは、アミノ酸残基１６７および１６８の両方で、極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に突然変異し得る。
別の実施形態では、コードされるＨＳＶ−ＴＫのアミノ酸残基１６７は、セリンまたはフェニルアラニンに突然変異し得る。
別の実施形態では、コードされるＨＳＶ−ＴＫのアミノ酸残基１６８は、ヒスチジン、リシン、システイン、セリンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸に突然変異し得る。
別の実施形態では、コードされるＨＳＶ−ＴＫは、アミノ酸２５および２６で突然変異し得る。例えば、アミノ酸残基２５および２６は、グリシン、セリンおよびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸に突然変異し得る。
別の実施形態では、コードされるＨＳＶ−ＴＫは、アミノ酸残基３２および３３で突然変異し得る。例えば、アミノ酸残基３２および３３は、グリシン、セリンおよびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸に突然変異し得る。
別の実施形態では、コードされるＨＳＶ−ＴＫは、アミノ酸残基２５、２６、３２および３３で突然変異し得る。例えば、アミノ酸残基２５、２６、３２および３３は、グリシン、セリンおよびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸に突然変異し得る。
別の実施形態では、コードされる突然変異体ＨＳＶ−ＴＫは、核領域に排他的に局在しない。
別の実施形態では、コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫは、野生型ＨＳＶ−ＴＫと比較して低下した量のチミジンキナーゼ活性を示す。
別の実施形態では、コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫのチミジンキナーゼ活性は、約１．５倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍または約５０倍低下され得る。
別の実施形態では、コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫのチミジンキナーゼ活性は、約１．５％、約２％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約１００％低下され得る。
別の実施形態では、コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫのチミジンキナーゼ活性は、約１．５倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍または約５０倍増大され得る。
別の実施形態では、コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫのチミジンキナーゼ活性は、約１．５％、約２％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約１００％増大され得る。
コードされるＨＳＶ−ＴＫが、突然変異Ａ１６７Ｆ、Ａ１６８Ｈまたは両方を含む、上記のポリヌクレオチド配列が本明細書において提供される。
本明細書において記載されるポリヌクレオチド配列は、治療用ポリペプチドである第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み得る。治療用ポリペプチドは、いくつかの場合には、自殺遺伝子であり得る。自殺遺伝子として、それだけには限らないが、シトシンデアミナーゼ、ＶＳＶ−ｔｋ、ＩＬ−２、ニトロレダクターゼ（ＮＲ）、カルボキシルエステラーゼ、β−グルクロニダーゼ、シトクロムｐ４５０、β−ガラクトシダーゼ、ジフテリア毒素Ａ鎖（ＤＴ−Ａ）、カルボキシペプチドＧ２（ＣＰＧ２）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、グアニレートキナーゼおよびデオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）が挙げられる。
一実施形態では、本明細書に記載された修飾されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１２〜２４のいずれか１種として示される核酸配列を含み得る。
別の実施形態では、本明細書に記載された修飾されたポリヌクレオチド配列は、配列番号２２〜２４のいずれか１種として示される核酸配列を含み得る。
一実施形態では、本明細書に記載されたポリヌクレオチド配列は、核外輸送シグナルを含む。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ＨＳＶ−ＴＫＡ１６８ＨｄｍＮＥＳ（配列番号１８）を含み得る。
別の実施形態では、本明細書に記載された方法において使用するためのレトロウイルスベクターは、１つまたは複数のスプライシング部位修飾を含む。
別の実施形態では、本明細書に記載された方法において使用するためのレトロウイルスベクターは、ＨＳＶ−ＴＫ Ａ１６７Ｆｓｍを含み、ここで、「ｓｍ」とは、単一の突然変異対Ｒ２５Ｇ−Ｒ２６Ｓ（配列番号１３）を指す。
別の実施形態では、本明細書に記載された方法において使用するためのレトロウイルスベクターは、ＨＳＶ−ＴＫ Ａ１６８Ｈｓｍ（配列番号１２）を含む。
別の実施形態では、本明細書に記載された方法において使用するためのレトロウイルスベクターは、ＨＳＶ−ＴＫ Ａ１６７Ｆｄｍを含み、ここで、「ｄｍ」とは、二重の突然変異対Ｒ２５Ｇ−Ｒ２６Ｓ、Ｒ３２Ｇ−Ｒ３３Ｓ（配列番号１７）を指す。
別の実施形態では、本明細書に記載された方法において使用するためのレトロウイルスベクターは、ＨＳＶ−ＴＫ Ａ１６８Ｈｄｍ（配列番号１６）を含む。
別の実施形態では、本明細書に記載された方法において使用するためのレトロウイルスベクターは、ＨＳＶ−ＴＫ Ａ１６７Ｆｄｍおよびマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ由来の核外輸送配列を含み、その一例として、配列番号１９がある。
別の実施形態では、本明細書に記載された方法において使用するためのレトロウイルスベクターは、ＨＳＶ−ＴＫ Ａ１６８ＨｄｍおよびＮＥＳ（配列番号１８）を含む。このような一実施形態では、配列は、ＨＳＶ−ＴＫ Ａ１６８Ｈを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載された方法において使用するためのレトロウイルスベクターは、ＨＳＶ−ＴＫを含み、ここで、このようなベクターは、改良された基質結合ドメインおよびｍＮＬＳ／ＮＥＳセットを含む。この例示的実施形態の例として、配列番号１８および１９が挙げられる。
別の実施形態では、本明細書に記載された方法において使用するためのレトロウイルスベクターは、ＨＳＶ−ＴＫを含み、ここで、ベクターは、選択マーカー、蛍光を発する遺伝子および／または１種もしくは複数の死滅遺伝子を含む。
別の実施形態では、本明細書に記載された方法において使用するためのレトロウイルスベクターは、２つの修飾を含む。
別の実施形態では、レトロウイルス粒子は、ＰｉＴ−２ポリヌクレオチド配列を含み、レトロウイルス粒子は、標的細胞の表面上のＰｉＴ−２受容体と特異的に結合し、それによって、レトロウイルス粒子の細胞への取り込みを可能にする。
別の実施形態では、本明細書に記載された方法において使用するためのレトロウイルスベクターは、ＨＳＶ−ＴＫを含み、ここで、ポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は、ＴＫ１６８ｄｍＮＥＳを含む。
ギャップ結合依存性細胞内情報伝達（ＧＪＩＣ）を増大する処理とともに、対象にＨＳＶ−ＴＫをコードする治療有効量のベクター粒子を送達することを含む、ＦＨＢＧ（９−［４−フルオロ−３−（ヒドロキシメチル）ブチル］グアニン）、ＦＨＰＧ（９−（［３−フルオロ−１−ヒドロキシ−２−プロポキシ］メチル）グアニン）、ＦＧＣＶ（フルオロガンシクロビル）、ＦＰＣＶ（フルオロペンシクロビル）、ＦＩＡＵ（１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル）、ＦＥＡＵ（フルオロ−５−エチル−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル）、ＦＭＡＵ（フルオロ−５−メチル−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル）、ＦＨＯＭＰ（６−（（１−フルオロ−３−ヒドロキシプロパン−２−イルオキシ）メチル）−５−メチルピリミジン（methylpryrimidine）−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン）、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、アシクロビル、バラシクロビル（valacivlovir）、ペンシクロビル、放射標識された、Ｎ−１に４−ヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）ブチル側鎖を有するピリミジン（ＨＨＧ−５−ＦＥＰ）または２，３−ジヒドロキシプロピルを有する、５−（２−）ヒドロキシエチル）−および５−（３−ヒドロキシプロピル）置換ピリミジン誘導体、アシクロビル−、ガンシクロビル−およびペンシクロビル−様側鎖によって媒介される、対象における新生物細胞の死滅を増大する方法が、本明細書において提供される。
一実施形態では、このような方法において使用されるＨＳＶ−ＴＫは、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列のいずれかによってコードされ得る。
ＧＪＩＣを増大する処理は、例えば、少なくとも１種のギャップ結合サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を送達することを含み得る。ギャップ結合サブユニットは、例えば、コネキシン４３、コネキシン３０またはコネキシン２６であり得る。ギャップ結合サブユニットは、翻訳後修飾を防ぐよう修飾されたギャップ結合サブユニットであり得る。
一実施形態では、ＧＪＩＣを増大する処理は、Ｅ−カドヘリンをコードするポリヌクレオチド配列を送達することを含む。
別の実施形態では、ＧＪＩＣを増大する処理は、対象に、ゲムシタビン、ｃＡＭＰ、レチノイン酸、カロテノイド、グルココルチコイド、フラバノイド、アピゲニンまたはロバスタチンからなる群からの化合物を送達することを含む。
別の実施形態では、ＧＪＩＣを増大する処理は、プロテアソーム阻害を含む。プロテアソーム阻害は、Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯ（ＡＬＬＮ）および／またはクロロキンの投与を含み得る。
別の実施形態では、ＧＪＩＣを増大する処理は、酸化剤およびＭＡＰキナーゼを活性化する薬剤との同時投与を含めた、放射線または光力学処理を含む。
別の実施形態では、ＧＪＩＣを増大する処理は、電気的処理を含む。
（ａ）細胞に、本明細書において記載されるポリヌクレオチド配列を導入することと、（ｂ）細胞が、発現されるチミジンキナーゼまたはその変異体を発現するのを可能にするまたは開始させることと、（ｃ）細胞を、チミジンキナーゼによって細胞傷害性薬剤に変換される薬剤と接触させることとを含む、細胞を死滅させる方法が、本明細書において提供される。
ギャップ結合サブユニットをコードする配列を、ＨＳＶ−ＴＫをコードするレトロウイルスベクター粒子とともに送達することを含む、チミジンキナーゼバイスタンダー効果を増大する方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、レトロウイルス粒子は、対象の細胞または系にターゲッティングされ得る。いくつかの実施形態では、レトロウイルスターゲッティング法は、対象の細胞または系を認識またはそれと結合する因子の組込みを含み得る。いくつかの実施形態では、レトロウイルスターゲッティング法は、抗体、受容体結合タンパク質またはそれだけには限らないが、コラーゲンを含めた細胞成分と結合するタンパク質を含めた、対象の系の細胞の表面上のタンパク質または受容体との結合を含めた、ターゲッティングタンパク質の組込みを含み得る。いくつかの実施形態では、ターゲッティングタンパク質は、それだけには限らないが、コラーゲン結合ドメインを含む、ペプチド、タンパク質および／またはタンパク質ドメインを含めた、コラーゲンと結合するタンパク質を含み得る。
本発明の新規特徴を、添付の特許請求の範囲における詳細とともに示す。本発明の原理が使用される例示的実施形態を示す以下の詳細な説明および添付の図面を参照して、本発明の特徴および利点の良好な理解が得られる。
図１は、ＨＳＶ−ＴＫスプライシング部位の除去が、ＨＳＶ−ＴＫの不活性化形態を避ける方法を例示する。スプライシング部位が除去されたか（ＨｕＴ ＳＦ／Ｔｋ／ｍｕｔ）またはされていない（ＨｕＴ Ｇ１Ｔｋ１ＳｖＮａ）ＨＳＶ−ＴＫベクターを用いて形質導入された、Ｔ細胞株および一次Ｔ細胞のＰＣＲ解析。 図２は、本明細書に記載される組成物を用いる第ＩＡ相臨床試験の例示的概略図を提供する。 図３は、本明細書に記載される組成物を用いる第ＩＢ相臨床試験の例示的概略図を提供する。 図４は、コホート１〜３の第ＩＡ相臨床試験の事象の例示的スケジュールを提供する。 図５は、コホート４以上の第ＩＡ相臨床試験の事象の例示的スケジュールを提供する。 図６は、本明細書に記載される組成物を用いる第ＩＢ相臨床試験の例示的概略図を提供する。 図７は、本明細書に記載される組成物を用いる治療の臨床試験のスケジュールＡの例示的概略図を提供する。 図８は、本明細書に記載される組成物を用いる治療の臨床試験のスケジュールＢの例示的概略図を提供する。 図９は、ＰｉＴ−２膜貫通分子の例示を提供する。四角は、抗ＰｉＴ−２ウエスタン抗体結合部位のおよその位置を表す。 図１０は、ＰｉＴ−２膜貫通分子の例示を提供する。四角は、抗ＰｉＴ−２ ＩＨＣ抗体結合部位のおよその位置を表す。 図１１は、種々のＨＳＶ−ＴＫ修飾を有する例示的Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅコンストラクトを提供する。図１１Ａ：ＧＭ−ＣＳＦ Ｍｉｎｕｓ、ＨＳＶ−ＴＫ １６７ｓｍ。図１１Ｂ：ＧＭ−ＣＳＦ Ｍｉｎｕｓ、ＨＳＶ−ＴＫ １６８ｓｍ。図１１Ｃ：ＧＭ−ＣＳＦ Ｍｉｎｕｓ、ＨＳＶ−ＴＫ １６７ｄｍ。図１１Ｄ：ＧＭ−ＣＳＦ Ｍｉｎｕｓ、ＨＳＶ−ＴＫ １６８ｄｍ。図１１Ｅ：ＧＭ−ＣＳＦ Ｍｉｎｕｓ、ＨＳＶ−ＴＫ １６７ｄｍ ＋ ＮＥＳ。図１１Ｆ：ＧＭ−ＣＳＦ Ｍｉｎｕｓ、ＨＳＶ−ＴＫ １６８ｄｍ ＋ ＮＥＳ。 図１２は、図１１に示されるレトロウイルスベクターのウエスタン解析によるｍＨＳＶ−ＴＫ、タンパク質検出である。ウイルスＤＮＡを、２９３Ｔベクター産生細胞にトランスフェクトし、細胞を溶解し、抗ＨＳＶ−ＴＫ抗体を用いてＨＳＶ−ＴＫタンパク質を検出した。ＨＳＶ−ＴＫウイルスベクターのすべてが、高レベルのＨＳＶ−ＴＫタンパク質を発現するとわかった。 図１３は、例示的レトロウイルスベクターを提供する。図１３Ａ：ＲｅｘＲｅｄ−ＴＫ Ａ１６８Ｈ。図３Ｂ：ＲｅｘＲｅｄ−ＴＫ １６７−ｄｍ。図１３Ｃ：ＲｅｘＲｅｄ−ＴＫ １６８ ｄｍ。 図１４は、特定の形態のコドン最適化が使用されるさらなる例示的レトロウイルスベクターを提供する。図１４Ａ：ＲｅｘＲｅｄ−ＴＫ １６７−ｄｍ＋ＮＥＳ。図１４Ｂ：ＲｅｘＲｅｄ−ＴＫ １６８−ｄｍ＋ＮＥＳ。図１４Ｃ：ＲｅｘＲｅｄ−ＴＫ １６７−ｄｍ＋ＮＥＳ ＪＣＯ。図１４Ｄ：ＲｅｘＲｅｄ−ＴＫ １６８−ｄｍ＋ＮＥＳ ＪＣＯ。ＪＣＯ＝正しいとされるコドン最適化。 図１５は、さらなる例示的レトロウイルスベクターを提供する。図１５Ａ：ＲｅｘＲｅｄ−ＴＫ Ａ１６８Ｆ。図１５Ｂ：ＲｅｘＲｅｄ−ＴＫ Ａ１６８Ｆ（ＧＣＶ特異的）。図１５Ｃ：ハイグロマイシン耐性遺伝子を含有するＲｅｘ−Ｈｙｇｒｏ−Ｒ−ＴＫ Ａ１６８Ｆ。 図１６は、さらなる例示的レトロウイルスベクターを提供する。図１６Ａ：Ｒｅｘ−Ｈｙｇｒｏ−Ｒ−ＴＫ Ａ１６７Ｆ。図１６Ｂ：Ｑ−ＰｉＴ−２は、標的細胞の表面上のＰｉＴ−２受容体と結合するウイルス受容体遺伝子を含有するベクターである。 図１７は、さらなる例示的レトロウイルスベクターを提供する。図１７Ａ：元のＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ。図１７Ｂ：ネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）および選択マーカーが挿入された、ｍＴＫ３９（ＨＳＶ−ＴＫＳＲ３９）死滅遺伝子を用いる改良を含有するＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ。 図１８は、Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ＋突然変異した細菌シチジンデアミナーゼ（ｍＢＣＤ）死滅遺伝子の例示を提供する。 図１９は、Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ＋突然変異した酵母シチジンデアミナーゼ（ｍＹＣＤ）死滅遺伝子の例示を提供する。 図２０は、蛍光を発する遺伝子（ＲＦＰ）および記された位置に同定された配列を含有する死滅遺伝子を含むＲｅｘＲｅｄ Ｓｕｐｅｒ ＴＫの一例を例示する。 図２１は、Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ１または２、ＳＲ−３９および野生型ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子間の配列の相違を強調し、ＬＴＲおよびＳＶ４０プロモーターの間にＲＦＰ遺伝子の代わりに第２の治療用遺伝子が導入された、改良された基質結合ドメインおよび＋／−ｍＮＬＳおよび／または＋／−ＮＥＳセットを有するレトロウイルスベクターの例示を提供する。 図２２は、蛍光を発する遺伝子（ＲＦＰ）および１５９〜１６１位および１６７〜１６９位に記された配列を含有する死滅遺伝子を含むＲｅｘＲｅｄ Ｓｕｐｅｒ ＴＫ Ａ１６７Ｆを例示する。 図２３は、ＬＮＣＥ Ａ３７５形質導入細胞のＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃマルチカラークローンである例示的レトロウイルスベクターを提供する。図２３Ａ：蛍光を発する遺伝子として高感度緑色蛍光タンパク質を含有するＬＮＣ−ＥＧＦＰ。図２３Ｂ：蛍光を発する遺伝子として赤色蛍光タンパク質を含有するＲｅｘＲｅｄ。 図２４は、蛍光を発する遺伝子のみまたはハイグロマイシン耐性遺伝子選択マーカーのみである例示的ベクターを提供する。 図２５：親およびＰｉＴ−２−ＣＨＯ−Ｋ１株におけるＴｋ−ＧＣＶ死滅結果。グラフは、単一ＲｘＣ２−形質導入プロトコールのデータを例示する。すべての実験にＲｘＣ２の同一バッチが使用された（ミリリットルあたり、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）と合わせて逆転写酵素によって決定される、力価およそ５Ｅ＋１０総ウイルス粒子（ＴＶＰ））。図２５Ａ：ＧＣＶ中４日（４用量）後のＲｘＣ２が形質導入されたＣＨＯ−Ｋ１親株のＧＣＶ死滅。図２５Ｂ：ＧＣＶ中４日（４用量）後のＲｘＣ２が形質導入されたＰｉＴ−２−ＣＨＯ−Ｋ１のＧＣＶ死滅。 図２６：親および三重ＲｘＣ２−形質導入プロトコール後のＰｉＴ−２−ＣＨＯ−Ｋ１におけるＴｋ−ＧＣＶ死滅。図２６Ａ：９日目（１０％プレート、５用量ＧＣＶ）のＲｘＣ２三重形質導入ＣＨＯ−Ｋ１親のＧＣＶ死滅。図２６Ｂ：９日目（１０％プレート、５用量ＧＣＶ）のＲｘＣ２三重形質導入ＰｉＴ−２−ＣＨＯ−Ｋ１のＧＣＶ死滅。 図２７は、ＭＩＡ−ＰａＣａ−２ヒト膵臓癌腫細胞株におけるＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２（ＨＳＶ−ＴＫＡ１６８ＨｄｍＮＥＳ）（配列番号１８）を用いた三重形質導入後のＴＫ−ＧＣＶ死滅を例示する。種々の濃度のＧＣＶを用いた、８日目の、最初の細胞の２５％が再播種されたＲｘＣ２三重形質導入ＭＩＡ−ＰａＣａ２のＧＣＶ死滅。 Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２を用いるＰｉＴ−２−ＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞の三重形質導入後のＴＫ−ＧＣＶ死滅を例示する。種々の濃度のＧＣＶを用いた、８日目の、ＲｘＣ２三重形質導入ＰｉＴ−２−ＭＩＡ−ＰａＣａ２、最初の細胞の２５％のＧＣＶ死滅。 ヒト黒色腫Ａ３７５ Ｈｙｇｒｏ ＴＫクローンが、２０ｍＭ ＧＣＶを用いて処理されたバイスタンダーインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）アッセイから得たグラフ。 Ｃ６−Ｈｙｇｒｏ−ＴＫクローンが、２０ｍＭ ＧＣＶを用いて処理されたバイスタンダーインビトロアッセイから得たグラフ。 図３１は、種々の癌細胞株のＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２三重形質導入後のＧＣＶ死滅のパーセンテージを表すグラフである。 図３２は、ＧＣＶにおいて４日後のＲｘＣ２形質導入ＣＨＯ−Ｋ１細胞株のグラフを示す。 図３３は、ＧＣＶにおいて４日後のＲｘＣ２形質導入ＰｉＴ−２−ＨＡ−ＣＨＯ−Ｋ１細胞株のグラフを示す。 図３４は、ＲｅｘＣ１ ＨＳＶ−ＴＫ（左パネル）およびＲｅｘＣ２ ＨＳＶ−ＴＫ（右パネル）を用いた、２９３Ｔ細胞一時的トランスフェクション、２４時間一次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）におけるＨＳＶ−ＴＫ細胞内局在性の免疫組織化学（ＩＨＣ）を示す。
ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子治療用製品は入手可能であるが、癌遺伝子療法を含めたインビトロおよびインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）の両方で最大遺伝子発現および腫瘍死滅活性に関しては最適ではない。
ウイルスまたはシュードウイルス（psuedoviral）遺伝子送達系との関連で、プロドラッグ活性化性能が増強された改善された自殺遺伝子を製造するためのＨＳＶ−ＴＫ遺伝子内のコドンの最適化が、本明細書において初めて開示される。最適化された遺伝子送達系は、最適ＨＳＶ−ＴＫプロドラッグ酵素活性および高力価のウイルス粒子の製造の両方を保証する。
したがって、生物情報科学ソフトウェアならびに遺伝子およびウイルスベクター系の機能および制限の知識を利用した本発明者らによるカスタム分析の両方を使用して調製された候補最適化ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の最適化が、本明細書において開示される。
以下の最適化工程は、本明細書に記載される実施形態に達するために本発明者らによって利用された例示的方法を表す。ソフトウェアを利用したコドン最適化が、使用頻度の稀なおよび低いコドンを除去して、ＨＳＶ−ＴＫタンパク質発現を改善するために利用され得る。新たにコドン最適化された遺伝子内のＧＣ含量は、遺伝子合成および他の問題を避けるよう調整され得る。
ＨＳＶ−ＴＫ内の既知スプライス受容およびスプライス供与配列は除去され得る。
スプライシングに関与し得る、ポリ−ピリミジンのトラクト、特に、コドン最適化によって導入されたものは除去され得る。
１つの単一の強力なＫｏｚａｋ翻訳開始配列が、開始コドン（ＡＴＧ）の前に含まれ得る一方で、ＨＳＶ−ＴＫオープンリーディングフレーム内の可能性あるＫｏｚａｋ配列は除去され得る。これらの配列のうち一部は、コドン最適化によって導入された可能性もあり、改善された殺腫瘍活性のために遺伝子を最適化するために、修飾が複数回反復して行われることが必要である場合もあるということは理解されよう。
ＨＳＶ−ＴＫ内の核局在性配列（ＮＬＳ）は、発現されたＨＳＶ−ＴＫを排出するよう除去され得、これでは、発現されたＨＳＶ−ＴＫタンパク質は、核に排他的に局在せず、代わりに、細胞質に蓄積する。
遺伝子を、開示されたレトロウイルスベクター中の多数の位置にクローニングすることを可能にするＨＳＶ−ＴＫ遺伝子のそれぞれの両端に位置する制限部位が付加され得、一方で、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子自体内のこれら同一の制限部位は排除される。
ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の末端の二重の停止コドンは、ＨＳＶ−ＴＫ翻訳の完全な終結を保証するために含まれ得る。
ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子内のアミノ酸位置１５９〜１６１の基質結合ドメイン付近の突然変異が、評価され得る。
ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子内のアミノ酸位置１６７での基質結合ドメイン中の突然変異体は、ガンシクロビル（gangciclovir）および同様のプロドラッグなどのプロドラッグヌクレオシド類似体に対する酵素活性の増大ならびに癌細胞を死滅させる能力の選択性について評価され得る。
ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子内のアミノ酸位置１６８での基質結合ドメイン中の突然変異体は、プロドラッグＧＣＶ酵素活性の増大および癌細胞を死滅させるその能力の選択性について評価され得る。
ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子内のアミノ酸位置１６７＋１６８での基質結合ドメイン中の突然変異体は、プロドラッグＧＣＶ酵素活性の増大および癌細胞を死滅させるその能力の選択性について評価され得る。
ＨＳＶ−ＴＫの、他の遺伝子およびタンパク質とのタグ、融合タンパク質およびリンカーの使用が、評価され得る。
最適化のさらなる方法はまた、本明細書に記載される方法における使用について考慮され得る。遺伝子がこの方法で最適化されると、その遺伝子配列は、カスタム遺伝子合成のために遺伝子合成会社に送られ得る。
定義
別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。すべての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、ＧｅｎＢａｎｋ配列、ウェブサイトおよび本明細書における全開示を通じて参照される他の公開された材料は、別に記載されない限り、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書において用語について複数の定義がある事象では、この節におけるものが優先する。ＵＲＬまたは他のこのような識別子もしくはアドレスが参照される場合には、このような識別子は、変わり得ることおよびインターネットでの特定の情報は移り変わる場合があるが、同等の情報は、インターネットを検索することによって見出され得ることは理解される。それに対する参照によって、このような情報の利用の可能性および一般への普及が証明される。
本明細書において、「核酸」とは、少なくとも２つの共有結合によって連結されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体サブユニットを含有するポリヌクレオチドを指す。核酸は、一般に、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）またはＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体である。ヌクレオチド類似体は、市販されており、このようなヌクレオチド類似体を含有するポリヌクレオチドを調製する方法は、公知である（Lin et al. (1994) Nucl. Acids Res. 22:5220-5234; Jellinek et al. (1995) Biochemistry 34:11363-11372; Pagratis et al. (1997) Nature Biotechnol. 15:68-73）。核酸は、一般に、一本鎖、二本鎖またはそれらの混合物である。本明細書における目的上、別に明記されない限り、核酸は、二本鎖であるか、または文脈から明らかである。
本明細書において、「ＤＮＡ」とは、ｃＤＮＡ、プラスミドならびに修飾されたヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含むＤＮＡを含めた、すべての種類および大きさのＤＮＡ分子を含むものとする。
本明細書において、「ヌクレオチド」は、ヌクレオシド一、二および三リン酸を含む。ヌクレオチドはまた、それだけには限らないが、ホスホロチオエートヌクレオチドおよびデアザプリンヌクレオチドおよび他のヌクレオチド類似体などの修飾されたヌクレオチドも含む。
本明細書において用語「ポリヌクレオチド」とは、任意の長さのヌクレオチドの多量体形態を意味し、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを含む。このような用語はまた、一本鎖および二本鎖ＤＮＡならびに一本鎖および二本鎖ＲＮＡを含む。この用語はまた、メチル化またはキャップドポリヌクレオチドなどの修飾されたポリヌクレオチドも含む。
本明細書において、用語「対象」とは、大きなＤＮＡ分子が導入される、動物、植物、昆虫および鳥類を指す。ヒト、霊長類、げっ歯類、ウシ、ブタ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモット、ネコ、イヌ、ウマ、ニワトリなどを含めた哺乳動物および鳥類などの高等生物が含まれる。
本明細書において、「対象に投与すること」は、１種または複数の送達物質および／または大きな核酸分子が、一緒にかまたは別個に、対象中に導入されるかまたは対象に適用され、その結果、対象中に存在する標的細胞が、物質および／または大きな核酸分子と均一に接触される手順である。
本明細書において、「送達ベクター」または「送達媒体」または「治療用ベクター」または「治療系」とは、外因性核酸分子を有し、標的細胞または組織に輸送する、ウイルスおよび非ウイルス粒子の両方を指す。ウイルス媒体として、それだけには限らないが、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが挙げられる。非ウイルス媒体として、それだけには限らないが、マイクロ粒子、ナノ粒子、リロソームおよびリポソームが挙げられる。「ターゲッティングされた」とは、本明細書において、送達媒体と関連しており媒体を細胞または組織にターゲッティングするリガンドの使用を指す。リガンドとして、それだけには限らないが、抗体、受容体およびコラーゲン結合ドメインが挙げられる。
本明細書において、「形質導入」と同義的に使用される「送達」とは、外因性核酸分子が細胞中に移動され、その結果、それらが細胞内に局在するプロセスを指す。核酸の送達は、核酸の発現とは別個のプロセスである。
本明細書において、「多重クローニング部位（ＭＣＳ）」とは、複数の制限酵素部位を含有し、そのうちいずれかが、ベクターを消化するために標準組換え技術とともに使用され得るプラスミド中の核酸領域である。「制限酵素消化」とは、核酸分子中の特定の位置でのみ機能する酵素での核酸分子の触媒切断を指す。これらの制限酵素のうち多数が市販されている。このような酵素の使用は、当業者によって広く理解されている。ＭＣＳ内で切断し、外因性配列がベクターと連結されることを可能にする制限酵素を使用して、ベクターが線形化されるか断片化されることが頻繁にある。
本明細書において、「複製起点」（「ｏｒｉ」と呼ばれることが多い）は、複製が開始される特定の核酸配列である。あるいは、宿主細胞が酵母である場合には、自立複製配列（ＡＲＳ）が使用され得る。
本明細書において、「選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカー」は、細胞に同定可能な変化を付与し、発現ベクターを含有する細胞の容易な同定を可能にする。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。陽性選択マーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするものであり、陰性選択マーカーは、その存在がその選択を阻止するものである。陽性選択マーカーの一例として、薬物耐性マーカーがある。
普通、薬物選択マーカーを含むことは、形質転換体のクローニングおよび同定に役立ち、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子が、有用な選択マーカーである。条件の実施に基づく形質転換体の区別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、その基礎が比色分析であるＧＦＰなどのスクリーニング可能なマーカーを含めた他の種類のマーカーも考慮される。いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのスクリーニング可能な酵素が利用される。当業者ならばまた、恐らくはＦＡＣＳ解析とともに免疫学的マーカーを使用する方法を承知するであろう。使用されるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることができさえすれば、重要であると考えられない。選択可能な、スクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者にとって周知である。
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指すよう使用される。外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されている場合に、細胞は「トランスフェクトされている」。いくつかのトランスフェクション技術は、一般に、当技術分野で公知である。例えば、Graham et al., Virology 52:456 (1973); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986); Chu et al., Gene 13:197 (1981)を参照のこと。このような技術は、ヌクレオチド組込みベクターおよび他の核酸分子などの１種または複数の外因性ＤＮＡ部分を適した宿主細胞中に導入するために使用され得る。この用語は、化学的、電気的およびウイルス媒介性トランスフェクション手順を獲得する。
本明細書において、「発現」とは、核酸がペプチドに翻訳されるか、またはＲＮＡに転写され、これが例えば、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳され得るプロセスを指す。核酸がゲノムＤＮＡに由来する場合には、発現は、適当な真核細胞宿主細胞または生物が選択される場合には、ｍＲＮＡのスプライシングを含む。異種核酸が宿主細胞において発現されるには、最初に細胞に送達され、次いで、細胞中にあれば、最終的に核中に存在しなくてはならない。
本明細書において、「治療経過」とは、規定された期間内の、本明細書に開示されるベクターの周期的投与または時限投与を指す。このような期間は、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも５日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月または少なくとも６ヶ月である。投与はまた、慢性的に、すなわち、規定されない期間、起こり得る。周期的投与または時限投与は、１日１回、１日２日、１日３回または他のセットの時限投与を含む。
本明細書において、用語「同時投与」、「と組み合わせて投与された」およびその文法上の等価物などは、単一患者への選択された治療剤の投与を包含するものとし、薬剤が同一もしくは異なる投与経路によって、または同時にもしくは異なる時間に投与される治療計画を含むものとする。いくつかの実施形態では、本願に開示されるような治療剤は、他の薬剤と同時投与される。これらの用語は、両薬剤および／またはその代謝産物が同時に動物中に存在するような動物への２種以上の薬剤の投与を包含する。それらは、別個の組成物での同時投与、別個の組成物での異なる時点での投与および／または両薬剤が存在する組成物での投与を含む。したがって、いくつかの実施形態では、治療剤および他の薬剤（複数可）は、単一組成物で投与される。いくつかの実施形態では、治療剤および他の薬剤（複数可）は、組成物中に混合される。さらなる実施形態では、治療剤および他の薬剤（複数可）は、別個の用量で別個の時間で投与される。
用語「宿主細胞」は、例えば、送達ベクターを製造するための複数のコンストラクトのレシピエントとして使用され得るかまたは使用されている、微生物、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞を示す。この用語は、トランスフェクトされている元の細胞の後代を含む。したがって、本明細書において「宿主細胞」とは、一般に、外因性ＤＮＡ配列を用いてトランスフェクトされている細胞を指す。単一親細胞の後代は、天然の、偶発的または計画的突然変異のために元の親と、形態においてまたはゲノムもしくは総ＤＮＡ相補体において必ずしも完全に同一でないということは理解される。
本明細書において、「遺伝子治療」は、治療または診断が探し求められる障害または状態を有する哺乳類、特に、ヒトの特定の細胞、標的細胞への異種ＤＮＡの移動を含む。異種ＤＮＡが発現され、それによってコードされる治療用生成物が製造されるような方法で、ＤＮＡが選択された標的細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、異種ＤＮＡは、治療用生成物をコードするＤＮＡの発現を直接的または間接的に媒介する。いくつかの実施形態では、異種ＤＮＡは、治療用生成物の発現を直接的または間接的に媒介するペプチドまたはＲＮＡなどの生成物をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子治療は、欠陥のある遺伝子と置き換わるよう、または導入される哺乳類または細胞によって製造される遺伝子産物を補完するよう、遺伝子産物をコードする核酸を送達ために使用される。いくつかの実施形態では、導入された核酸は、したがって、哺乳類宿主では一般に産生されないかまたは治療有効量でもしくは治療上有用な時間で産生されない受容体などの、成長因子もしくはその阻害剤または腫瘍壊死因子もしくはその阻害剤など治療用化合物をコードする。いくつかの実施形態では、治療用生成物をコードする異種ＤＮＡは、生成物またはその発現を増強するかまたはそうでなければ変更するよう、苦しんでいる宿主の細胞中への導入に先立って修飾される。
本明細書において、「異種核酸配列」は、一般に、発現される細胞によってインビボで普通製造されないＲＮＡおよびタンパク質をコードするか、または転写、翻訳もしくは他の調節可能な生化学的プロセスに影響を及ぼすことによって内因性ＤＮＡの発現を変更するメディエーターを媒介もしくはコードするＤＮＡである。当業者が、発現される細胞にとって異種もしくは外来と認識するかまたは考える任意のＤＮＡが、本明細書において異種ＤＮＡによって包含される。異種ＤＮＡの例として、それだけには限らないが、薬物耐性を付与するタンパク質などの追跡可能なマーカータンパク質をコードするＤＮＡ、抗癌剤、酵素およびホルモンなどの治療上有効な物質をコードするＤＮＡならびに抗体などの他の種類のタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。いくつかの実施形態では、異種ＤＮＡによってコードされる抗体は、異種ＤＮＡが導入されている細胞の表面上に分泌または発現される。
本明細書において、用語「チミジンキナーゼ突然変異体」とは、本明細書に記載される特定のタンパク質（ならびにこれらのタンパク質をコードする核酸配列）だけでなく、生物活性を保持する一次タンパク質の種々の構造形態を含み得るそれらの誘導体も指す。
本明細書において、「突然変異していないチミジンキナーゼ」とは、天然または野生型チミジンキナーゼポリペプチド配列を指す。
本明細書において、「自殺遺伝子」とは、それ自体によって、または他の化合物の存在下で細胞死を引き起こす生成物をコードする核酸を指す。
本明細書において、用語「突然変異した」または「別のヌクレオチドによって置き換えられた」とは、特定の位置のヌクレオチドが、突然変異していないかまたはこれまでに突然変異した配列中に存在するもの以外のヌクレオチドによってその位置で置き換えられていることを意味する。すなわち、いくつかの場合には、種々のヌクレオチドにおいて、特定の修飾が行われ得る。いくつかの実施形態では、置換は、関連スプライス供与および／または受容部位が、遺伝子中にもはや存在しないように行われる。例えば、図１を参照のこと。
本明細書において、「極性アミノ酸」とは、アミノ酸残基Ａｓｐ（Ｎ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）またはＴｙｒ（Ｙ）を指す。
本明細書において、「非極性アミノ酸」とは、アミノ酸残基Ａｌａ（Ａ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｔｒｐ（Ｗ）またはＶａｌ（Ｖ）を指す。
本明細書において、「塩基性アミノ酸」とは、アミノ酸残基Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）またはＬｙｓ（Ｋ）を指す。
本明細書において、「酸性アミノ酸」とは、アミノ酸残基Ａｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）を指す。
改善されたＨＳＶ−ＴＫ
チミジンキナーゼは、天然のヌクレオシド基質ならびにヌクレオシド類似体をリン酸化するサルベージ経路酵素である。一般に、ウイルスチミジンキナーゼは、ウイルスチミジンキナーゼを発現する細胞へのガンシクロビルまたはアシクロビルなどのヌクレオシド類似体の投与によって治療上利用され、ここで、ウイルスチミジンキナーゼは、ヌクレオシド類似体をリン酸化して、細胞を死滅させることができる毒性生成物を作製する。
本発明のウイルスチミジンキナーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、さまざまなウイルスチミジンキナーゼから調製され得る。いくつかの実施形態では、ウイルスチミジンキナーゼ突然変異体は、例えば、霊長類ヘルペスウイルスおよび鳥類ヘルペスウイルスなどの非霊長類ヘルペスウイルスの両方を含めたヘルペスウイルス科（Herpesviridae）チミジンキナーゼに由来する。適したヘルペスウイルスの代表例として、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型、単純ヘルペスウイルス２型、水痘帯状疱疹ウイルス、マーモセットヘルペスウイルス、ネコヘルペスウイルス１型、仮性狂犬病ウイルス、ウマヘルペスウイルス１型、ウシヘルペスウイルス１型、シチメンチョウヘルペスウイルス、マレック病ウイルス、ヘルペスウイルスサイミリおよびエプスタイン−バーウイルスが挙げられる。
ヘルペスウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）などの商業的供給源から容易に入手できる。ヘルペスウイルスはまた、天然に存在する供給源（例えば、感染動物）から単離され得る。
ＴＫ遺伝子の改善
いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫをコードするポリヌクレオチド配列が本明細書において開示される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、野生型ＨＳＶ−ＴＫアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、突然変異したＨＳＶ−ＴＫアミノ酸配列をコードする。
本明細書において提供される最適化されたポリヌクレオチド配列の調製において使用され得る例示的手順として、それだけには限らないが、コドン最適化、スプライシング部位の修正、ポリ−ピリミジンのトラクトおよび過剰のＧＣ含量の除去、単一のＫｏｚａｋ配列の付加、不要なＫｏｚａｋ配列の除去、レトロウイルスまたは他のベクターへのサブクローニングのための制限部位を含めること、核局在性配列の除去または核外輸送配列の付加、突然変異配列の付加、二重停止コドン配列の付加、タグ、リンカーおよび融合配列の付加、遺伝子合成会社への寄託のための配列ファイルの準備、レトロウイルスベクターへの合成された遺伝子のサブクローニング、レトロウイルスベクターに蛍光タンパク質遺伝子を含めること、レトロウイルスベクターに選択マーカー遺伝子を含めること、ＭａｘｉｐｒｅｐプラスミドＤＮＡの調製、レトロウイルス産生株または他の細胞のトランスフェクション、レトロウイルスの実験室、パイロットまたはＧＭＰ規模の製造、レトロウイルスを用いた標的細胞の形質導入、ＧＣＶまたは類似体プロドラッグ媒介性細胞死滅アッセイ、ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）選択アッセイ、レトロウイルスによって形質導入された細胞株を製造するための選択マーカー薬物選択手順、レトロウイルスによって形質導入された標的細胞を検出し、記録するための蛍光顕微鏡観察および写真撮影、レトロウイルスによって形質導入された標的細胞の定量的蛍光検出、ウエスタンタンパク質発現アッセイ、ＨＳＶ−ＴＫ解析に必要な他の手順およびアッセイまたはそれらの組合せが挙げられる。このような方法のプロトコールは、本明細書に記載されるか、市販されているかまたは公開文献およびデータベースに記載されている。
いくつかの実施形態では、改善されたＨＳＶ−ＴＫ配列を得る方法が、本明細書において記載される。いくつかの実施形態では、方法は、ａ）スプライシング部位の修正および／もしくは除去、ならびに／またはｂ）単一Ｋｏｚａｋ配列への調整を含む。任意選択で、いくつかの実施形態では、方法は、ＨＳＶ−ＴＫ配列のサブクローニングのための制限部位を含めることをさらに含む。任意選択で、またはさらに、いくつかの実施形態では、方法は、核局在性配列の除去をさらに含む。
コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基２５、２６、３２、３３、１６７、１６８またはそれらの組合せで突然変異しており、ポリヌクレオチド配列が、配列番号１または３のポリヌクレオチド配列と比較して突然変異している、ヒト単純ウイルス（ＨＳＶ−ＴＫ）由来のチミジンキナーゼの突然変異形態をコードするポリヌクレオチド配列が本明細書において提供される。このような配列では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４の突然変異が行われ得る。
コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基２５、２６、３２、３３、１６７、１６８またはそれらの組合せで突然変異しており、ポリヌクレオチド配列が、配列番号１のポリヌクレオチド配列と比較して突然変異している、ヒト単純ウイルス（ＨＳＶ−ＴＫ）由来のチミジンキナーゼの突然変異形態をコードするポリヌクレオチド配列が本明細書において提供される。このような配列では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４の突然変異が行われ得る。
コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基２５、２６、３２、３３、１６７、１６８またはそれらの組合せで突然変異しており、ポリヌクレオチド配列が、配列番号３のポリヌクレオチド配列と比較して突然変異している、ヒト単純ウイルス（ＨＳＶ−ＴＫ）由来のチミジンキナーゼの突然変異形態をコードするポリヌクレオチド配列が本明細書において提供される。このような配列では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４の突然変異が行われ得る。
修飾は、保存的または非保存的突然変異であり得る。突然変異は、コードされるアミノ酸が極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に修飾されるよう行われ得る。
コードされるＨＳＶ−ＴＫが、核外輸送配列を含む、ヒト単純ウイルス（ＨＳＶ−ＴＫ）由来のウイルスチミジンキナーゼの突然変異した形態をコードするポリヌクレオチド配列が本明細書において提供される。コードされるＨＳＶ−ＴＫが、野生型ＨＳＶ−ＴＫと比較して機能において改善され、Ａ１６８Ｈ ｄｍＮＥＳ （ＬＴＲプロモーター領域と適宜融合しているＣＬシステム−ＣＭＶエンハンサー）を含み、ＮＥＳが、核外輸送配列を指す、ヒト単純ウイルス（ＨＳＶ−ＴＫ）由来のチミジンキナーゼの突然変異した形態をコードするポリヌクレオチド配列が本明細書において提供される。一実施形態では、突然変異体ＨＳＶ−ＴＫＡ１６８ＨｄｍＮＥＳは、Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２中に含むための突然変異体ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子である。一実施形態では、ＮＥＳは、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）に由来する。なお別の実施形態では、ＮＥＳのポリヌクレオチド配列は、ＣＴＧＣＡＧＡＡＡＡＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＧＣ（配列番号２３）である。他の実施形態では、ＮＥＳポリペプチド配列は、ＬＱＫＫＬＥＥＬＥＬＤＧ（配列番号２４）である。
いくつかの実施形態では、突然変異が野生型ＨＳＶ−ＴＫのポリペプチド配列に行われていないヒト単純ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）をコードするポリヌクレオチド配列に対する突然変異が本明細書において開示される。
ヌクレオチド位置は、配列番号１（野生型（ｗｔ）ＨＳＶ１−ＴＫヌクレオチド配列）または配列番号３（Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ ＨＳＶ−ＴＫにおけるＨＳＶ−ＴＫ；ＳＲ３９突然変異体およびＨＳＶ−ＴＫ核局在性シグナル（ＮＬＳ）のＲ２５Ｇ−Ｒ２６Ｓ突然変異）における位置を参照して呼ばれる。
一実施形態では、突然変異体ＨＳＶ−ＴＫ ＳＲ３９突然変異体領域のクローニング可能な二本鎖オリゴヌクレオチドの境界となるＳａｃ Ｉ−Ｋｐｎ Ｉ制限部位が提供される。例えば、Ｓａｃ ＩおよびＫｐｎ Ｉ部位が、それぞれ左側および右側に示されている示される配列番号６および７を参照のこと。太字、下線は、突然変異が行われ得る部位を示す。配列番号８および９は、Ｓａｃ ＩおよびＫｐｎ Ｉで切断した後の例示的配列を示す。突然変異を行うために使用され得る例示的フォワードおよびリバースプライマーは、配列番号１０および１１として示されている。
例示的最適化ＨＳＶ−ＴＫポリヌクレオチド配列は、例えば、配列番号１２〜２４として提供される。
しかし、このような参照がなされる場合には、本発明は、配列番号１または３に示されるようなまさにその配列に制限されるものではなく、その変異体および誘導体を含む。したがって、他のチミジンキナーゼ配列中のヌクレオチド位置の同定（すなわち、当業者が、配列番号１または３において列挙された位置に対応すると考える位置のヌクレオチドの同定）が考慮される。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、コドンが、同一のアミノ酸残基をコードする異なるコドンに変更されるような遺伝暗号に気付くことによって置き換えられる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、ＨＳＶ−ＴＫをコードする核酸配列のコーディング領域内で置き換えられるが、核酸配列は野生型ＨＳＶ−ＴＫタンパク質発現を維持する。
いくつかの実施形態では、コドンは、コードされるＨＳＶ−ＴＫが活性の増大を示すよう突然変異しる。いくつかの実施形態では、コドンＧＣＴは、アラニンを表すよう使用される。いくつかの実施形態では、コドンＡＧＡは、アルギニンを表すよう使用される。いくつかの実施形態では、コドンＡＡＴは、アスパラギンを表すよう使用される。いくつかの実施形態では、コドンＧＡＴは、アスパラギン酸を表すよう使用される。いくつかの実施形態では、コドンＴＧＴは、システインを表すよう使用される。いくつかの実施形態では、コドンＣＡＧは、グルタミンを表すよう使用される。いくつかの実施形態では、コドンＧＡＡは、グルタミン酸を表すよう使用される。いくつかの実施形態では、コドンＧＧＡは、グリシンを表すよう使用される。いくつかの実施形態では、コドンＣＡＴは、ヒスチジンを表すよう使用される。いくつかの実施形態では、コドンＡＴＴは、イソロイシンを表すよう使用される。いくつかの実施形態では、コドンＣＴＧは、ロイシンを表すよう使用される。いくつかの実施形態では、コドンＡＡＡは、リシンを表すよう使用される。いくつかの実施形態では、コドンＡＴＧは、メチオニンを表すよう使用される。いくつかの実施形態では、コドンＴＴＴは、フェニルアラニンを表すよう使用される。いくつかの実施形態では、コドンＣＣＴは、プロリンを表すよう使用される。いくつかの実施形態では、コドンＴＣＴは、セリンを表すよう使用される。いくつかの実施形態では、コドンＡＣＡは、トレオニンを表すよう使用される。いくつかの実施形態では、コドンＴＧＧは、トリプトファンを表すよう使用される。いくつかの実施形態では、コドンＴＡＴは、チロシンを表すよう使用される。いくつかの実施形態では、コドンＧＴＧは、バリンを表すよう使用される。いくつかの実施形態では、コドンＴＧＡは、停止コドンとして使用される。突然変異のための例示的コドン位置は、以下の表に提供されている。
Figure 2016519570
このような実施形態では、５／２１種のコドンが、３番目の位置に「ＣまたはＧ」を含有し（２４％）、０／２１種のコドンが、３番目の位置に「Ｃ」を含有し（０％）、５／２１種のコドンが、３番目の位置に「Ｇ」を含有し（２４％）、１６／２１種のコドンが、３番目の位置に「ＡまたはＴ」を含有する（７６％）。
さらに他の実施形態では、２１種のコドンのうち約３〜７種のコドンが、３番目の位置に「ＣまたはＧ」を含有し、２１種のコドンのうち０〜３種を超えるコドンが、３番目の位置に「Ｃ」を含有し、２１種のコドンのうち約３〜７種のコドンが、３番目の位置に「Ｇ」を含有し、２１種のコドンのうち約１４〜１８種のコドンが、３番目の位置に「ＡまたはＴ」を含有する。
いくつかの実施形態では、コドンＧＣＡは、アラニンを表すために使用される。いくつかの実施形態では、コドンＡＧＧは、アルギニンを表すために使用される。いくつかの実施形態では、コドンＡＡＣは、アスパラギンを表すために使用される。いくつかの実施形態では、コドンＧＡＣは、アスパラギン酸を表すために使用される。いくつかの実施形態では、コドンＴＧＣは、システインを表すために使用される。いくつかの実施形態では、コドンＣＡＡは、グルタミンを表すために使用される。いくつかの実施形態では、コドンＧＡＧは、グルタミン酸を表すために使用される。いくつかの実施形態では、コドンＧＧＣは、グリシンを表すために使用される。いくつかの実施形態では、コドンＣＡＣは、ヒスチジンを表すために使用される。いくつかの実施形態では、コドンＡＴＣは、イソロイシンを表すために使用される。いくつかの実施形態では、コドンＣＴＣは、ロイシンを表すために使用される。いくつかの実施形態では、コドンＡＡＧは、リシンを表すために使用される。いくつかの実施形態では、コドンＡＴＧは、メチオニンを表すために使用される。いくつかの実施形態では、コドンＴＴＣは、フェニルアラニンを表すために使用される。いくつかの実施形態では、コドンＣＣＡは、プロリンを表すために使用される。いくつかの実施形態では、コドンＡＧＣは、セリンを表すために使用される。いくつかの実施形態では、コドンＡＣＴは、トレオニンを表すために使用される。いくつかの実施形態では、コドンＴＧＧは、トリプトファンを表すために使用される。いくつかの実施形態では、コドンＴＡＣは、チロシンを表すために使用される。いくつかの実施形態では、コドンＧＴＣは、バリンを表すために使用される。いくつかの実施形態では、ＴＡＡは、停止コドンとして使用される。
Figure 2016519570
このような実施形態では、１６／２１種のコドンが、３番目の位置に「ＣまたはＧ」を含有し（７６％）、１１／２１種のコドンが、３番目の位置に「Ｃ」を含有し（５２％）、５／２１種のコドンが、３番目の位置に「Ｇ」を含有し（２４％）、５／２１種のコドンが、３番目の位置に「ＡまたはＴ」を含有する（２４％）。
さらに他の実施形態では、２１種のコドンのうち約１４〜１８種のコドンが、３番目の位置に「ＣまたはＧ」を含有し、２１種のコドンのうち約９〜１３種のコドンが、３番目の位置に「Ｃ」を含有し、２１種のコドンのうち約３〜７種のコドンが、３番目の位置に「Ｇ」を含有し、２１種のコドンのうち約３〜７種のコドンが、３番目の位置に「ＡまたはＴ」を含有する。
いくつかの実施形態では、以下の稀なコドンは、稀なコドン配列を変更することが、突然変異体ＨＳＶ−ＴＫまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドのコーディング領域内で、新規スプライス受容および／または代替Ｋｏｚａｋ部位を作り出さない限り、または不要な制限部位もしくは他の問題のある配列を付加しない限り、可能であれば避けられる。アラニンについてはＧＣＧ、アルギニンについてはＣＧＡまたはＣＧＴ、ロイシンについてはＴＴＡまたはＣＴＡ、プロリンについてはＣＣＧ、セリンについてはＴＣＧ、トレオニンについてはＡＣＧおよびバリンについてはＧＴＡ。可能であれば避けられるべき稀なコドンは、０．１２以下のコドン／アミノ酸／アミノ酸あたりのコドンあたりの割合を有するものである。
Figure 2016519570
いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるようなコドンを変更することは、活性の約２％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上のパーセンテージの増大をもたらす。
高いパーセンテージコドン最適化は、タンパク質発現を改善するが、ＧＣ遺伝子含量を増大するとわかった。コドン最適化は、評価され、以下の特徴を有すると決定された。
Figure 2016519570
Figure 2016519570
Figure 2016519570
Figure 2016519570
十分に自動化されたコドン最適化ソフトウェアプログラムを用いて得られる不満足な結果のために、カスタマイズされたコドン最適化を実施して、得られるタンパク質発現および力価の両方を増大した。最初の工程は、各コドンを正しいリーディングフレームについてヒトを含む対象種において最も好ましいものに設定するための、第１のスクリーンとしてのコドン最適化プログラムの使用を含み、「生」コドン最適化をもたらす。一般に、任意の所望のクローニング制限部位は、プロセスのこの段階の間、使用から排除される。
結果は、ＤＮＡ編集プログラムにおいてＤＮＡ配列を編集することおよびピリミジンなどの縮重コドンを探すことによって（例えば、「Ｙ」コドンを探すことによって）さらに精緻化される。次いで、以下の操作がこの順序で実施される：
「Ｙ」のラン、一般に、少なくとも５以上の「Ｙ」連続ランについて配列を手作業で探すこと。これらの配列は、所与の配列中で強調されており、コドンへの変更が、翻訳されるタンパク質に影響を及ぼさないことを確実にするよう、ペプチド配列への登録一覧表に列挙されるＤＮＡ配列を含む翻訳を決定するために、ＤＮＡ編集プログラムが使用される。
５以上のＹのランにおける各コドンが評価される。利用可能である場合には、各コドンのゆらぎ塩基が、アミノ酸にとって最も好ましいＡ−Ｇ塩基（普通、アデニン）に変換され、結果が調べられる。変更の結果が、３’ＡＧにまたはその付近にプリンリッチなラン末端を作製する場合には、変更は、手作業で取り消される。ゆらぎ塩基に利用可能な最も好ましいＡ−Ｔ塩基がない場合には、またはそれが別の配列矛盾を引き起こす場合には、ゆらぎ塩基に最も好ましいＣ−Ｇ塩基が使用される。
結果が稀なコドン（＜１０％使用）である場合には、そのコドンは、フレーム中の次に利用可能なコドンに移される。
別のコドン変更が推定受容部位を切断し得る場合には、変更は元の配列に戻るよう行われる。このような代替変更が利用可能ではない場合には、元の変化が実行される。
このプロセスが完了すると、配列が代替リーディングフレームについて５’から３’に調べられる。各リーディングフレームで、ＡＴＧコドンの５塩基３’が、Ｋｏｚａｋ配列としてのその適合性について調べられる。ＡＴＧが所望の遺伝子のリーディングフレームでメチオニンを与える場合には、まず、ＡＴＧの「−１」ゆらぎ塩基の、次いで、「−４」ゆらぎ塩基のゆらぎ塩基を「Ｔ」に変換すること（可能な場合には）によって、選択肢はＫｏｚａｋ配列の切断に制限される。
稀な場合には、リーディングフレーム中の第２のコドンを、元は「ＡＧＮ」塩基（Ｓｅｒ／Ａｒｇ）である場合に、Ｔ（セリンのため）またはＣ（アルギニンのため）で始まるコドンに変換することが望ましいものである場合がある。しかし、「ＡＧＮ」コドンは、「ＡＧ」配列対のために避けられるので、この状況は、上記のアルゴリズムを厳密に適用する場合には一般には遭遇されない。
代替リーディングフレームが、メッセージのものと異なり、その周囲のＫｏｚａｋ配列が「ＣＣＡＣＣａｔｇＧ」と適合する場合には、インフレームコドンのゆらぎ塩基は、開始コドンを除去するよう変更される。これは、コドン最適化および／またはスプライス受容切断プロセスの結果として一般に起こる（しかし、常にではない）。
ペプチド配列が変更されないことを確実にするために、インプロセスチェックが一般に実施される。最終チェック段階で、多すぎる「稀な」コドンが使用されている（一般に２個以上）場合には、使用されるものに優先順位をつけることが望ましい場合があり、「生」コドン最適化配列からのより長いピリミジンランに与えられる変更が好ましい。最後に、任意の必要な制限部位が付加され、ポリペプチドが、最適化プロセスが始められる前の元の配列から変更されないことおよび任意の所望の制限部位が、クローニング目的で付加されるものに対して独特なままであることを確実にするために最後のチェックが実施される。
スプライス部位修飾
エキソンを接続するために、一般に、イントロンはＲＮＡからスプライスされる。スプライス供与部位は、スプライシングプロセスの際に除去されるＲＮＡの５’側のＲＮＡ中の部位であり、切断され、スプライス受容部位内のヌクレオチド残基と再接続される部位を含有する。したがって、スプライス供与部位は、エキソンの最後とイントロンの開始点の間の接合点ある。一般に、ＲＮＡ中のスプライス供与部位は、ジヌクレオチドＧＵ（または対応するＤＮＡ配列中のＧＴジヌクレオチド）である。
スプライス受容部位は、スプライシングプロセスの際に除去されるＲＮＡの３’側のＲＮＡ中の部位であり、切断され、スプライス供与部位内のヌクレオチド残基と再接続される部位を含有する。したがって、スプライス受容部位は、イントロンの最後（通常、ジヌクレオチドＡＧで終結する）と下流のエキソンの開始点の間の接合点である。
いくつかの実施形態では、スプライス供与部位に対応する少なくとも１つのヌクレオチドが、別のヌクレオチドによって置き換えられる、チミジンキナーゼをコードする核酸配列が本明細書において開示される。例えば、図１（Chalmers et al., Mol. Ther. 4:146-8 (2001)）を参照のこと。さらなる実施形態では、スプライス受容部位のヌクレオチドは、変更されない。いくつかの実施形態では、スプライス受容部位に対応する少なくとも１つのヌクレオチドが、別のヌクレオチドによって置き換えられる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号１または３）の３２９位および３３０位のスプライス供与部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つが、別のヌクレオチドによって置き換えられるチミジンキナーゼをコードする核酸配列が、本明細書において開示される。いくつかの実施形態では、３２７位および５５５位のヌクレオチドの両方が、他のヌクレオチドによって置き換えられる。例えば、３２７位は、Ｇ〜Ａから選択されるアミノ酸残基に突然変異し得る。あるいは、またはさらに、５５５位は、Ｇ〜Ａから選択されるアミノ酸残基に突然変異し得る。一実施形態では、修飾されたＨＳＶ−ＴＫは、ＨＳＶ−ＴＫが以下の方法で改善された配列番号１８のポリヌクレオチド配列を有する：
ＨＳＶ−ＴＫ ＮＥＳｄｍＮＬＳ Ａ１６８Ｈ、ＣＯ ＆ ＳＣ
ＮＥＳ＝ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）由来の核外輸送シグナル配列
ｄｍＮＬＳ＝二重突然変異ＨＳＶ−ＴＫ核局在性配列
ＣＯ＝最適化されたコドン
ＳＣ＝３２７および５５５の修正されたスプライス供与／受容部位
下線を引いた配列
Figure 2016519570
いくつかの実施形態では、野生型配列の５５４位および５５５位のスプライス受容部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つまたは６６２位および６６３位のスプライス受容部位ヌクレオチドに対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つまたは５４１位および５４２位のスプライス受容部位に対応するヌクレオチドのうち少なくとも１つが、別のヌクレオチドによって置き換えられるチミジンキナーゼをコードする核酸配列が本明細書において開示される。例えば、５４１位は、Ｇ〜Ａから選択されるアミノ酸残基に突然変異し得る。５４２位は、Ｇ〜Ａから選択されるアミノ酸残基に突然変異し得る。５５４位は、Ｇ〜Ａから選択されるアミノ酸残基に突然変異し得る。５５５位は、Ｇ〜Ａから選択されるアミノ酸残基に突然変異し得る。６６２位は、Ｇ〜Ａから選択されるアミノ酸残基に突然変異し得る。６６３位は、Ｇ〜Ａから選択されるアミノ酸残基に突然変異し得る。
いくつかの実施形態では、野生型ＨＳＶ−ＴＫコード配列のヌクレオチドのうち少なくとも１つが、以下の表１に記載されるように置き換えられる。
Figure 2016519570
Ｋｏｚａｋ配列は、ｍＲＮＡ内のＡＵＧ開始コドンの両側に隣接し、真核細胞のリボソームによる開始コドンの認識に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫをコードするポリヌクレオチド配列は、わずか１つのＫｏｚａｋ配列しか含まない。いくつかの実施形態では、Ｋｏｚａｋ配列は、ＤＮＡ配列のコーディング部分の上流である。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫをコードするポリヌクレオチドのＫｏｚａｋ配列は、哺乳類細胞においてより高い効率の翻訳開始を伴うＫｏｚａｋ配列を製造するよう修飾される。いくつかの実施形態では、Ｋｏｚａｋ配列の修飾は、コードされるＨＳＶ−ＴＫポリペプチド産物におけるアミノ酸置換を引き起こさない。いくつかの実施形態では、Ｋｏｚａｋ配列の修飾は、コードされるＨＳＶ−ＴＫポリペプチド産物において少なくとも１種のアミノ酸置換をもたらす。一実施形態では、修飾されたＨＳＶ−ＴＫは、配列番号１８のポリヌクレオチド配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫをコードするポリヌクレオチド配列は、１種または複数の制限部位を挿入する修飾を含む。１種または複数の制限部位の挿入のための最適部位は、経験的におよび／または配列を分析するためのコンピュータプログラムを使用して決定され得る。１つの限定されない実施形態では、第１の制限部位は、ＫｏｚａｋおよびＡＴＧ開始部位の上流に挿入され、第２の制限部位は、配列の３’末端に挿入される。例えば、配列番号１８、以下の下線が引かれた部分を参照のこと。
ＨＳＶＴＫ ＮＥＳｄｍＮＬＳ Ａ１６８Ｈ、ＣＯ ＆ ＳＣ
ＮＥＳ＝ＭＡＰＫＫ由来の核外輸送シグナル配列
ｄｍＮＬＳ＝二重突然変異核局在性配列
ＣＯ＝最適化されたコドン
ＳＣ＝先に記載された、３２７および５５５の修正されたスプライス
先に記載されたｋｏｚａｋ配列
下線を引いた、以下として特定される制限部位：
Figure 2016519570
Figure 2016519570
他のスプライシング部位修飾は、以下の例において開示され、特許請求される方法において使用され得る修飾されたＴＫ配列として含めるために考慮される。
いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫをコードするポリヌクレオチド配列は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のコドン置換を含む。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫをコードするポリヌクレオチド配列は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のコドン置換を含み、ここで、コドン置換は、その位置で野生型コドンよりも哺乳類細胞においてより高頻度の使用を有するコドンの置換を含む。しかし、いくつかの実施形態では、特定の状況に応じて、個々のアミノ酸のために、より好ましくないコドンが選択され得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のコドン置換を含むＨＳＶ−ＴＫをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１または３に対して、約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％未満の配列同一性を有し、ここで、配列同一性は、グローバルアラインメント法を使用してコード配列の全長にわたって決定される。いくつかの実施形態では、対応するコードされるポリペプチド配列は、ＨＳＶ−ＴＫアミノ酸配列、例えば、配列番号２または４に対して、少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫをコードするポリヌクレオチド配列は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のコドン置換を含み、ここで、コドン置換は、その位置の野生型コドンの、哺乳類細胞において最高頻度の使用を有するコドンとの置換を含む。いくつかの実施形態では、対応するコードされるポリペプチド配列は、ＨＳＶ−ＴＫアミノ酸配列、例えば、配列番号２または４に対して、少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫをコードするポリヌクレオチド配列は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のコドン置換を含み、ここで、置換コドンは、約０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５以上またはそれより高い使用の頻度を有する。いくつかの実施形態では、対応するコードされるポリペプチド配列は、ＨＳＶ−ＴＫアミノ酸配列、例えば、配列番号２または４に対して、少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫをコードするポリヌクレオチド配列は、約４５、４０、３５、３０、２５、２０未満またはそれより少ないコドンを含み、ここで、コドンは、約０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４または０．２５未満の使用の頻度を有する。いくつかの実施形態では、対応するコードされるポリペプチド配列は、ＨＳＶ−ＴＫアミノ酸配列、例えば、配列番号２または４に対して、少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫをコードするポリヌクレオチド配列は、少なくとも７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％またはそれ以上の、約０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５以上またはそれより高い使用の頻度を有するコドンを含む。いくつかの実施形態では、対応するコードされるポリペプチド配列は、ＨＳＶ−ＴＫアミノ酸配列、例えば、配列番号２または４に対して、少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫをコードするポリヌクレオチド配列は、少なくとも３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％またはそれ以上の、哺乳類細胞において使用の最高頻度を有するコドンを含む。いくつかの実施形態では、対応するコードされるポリペプチド配列は、ＨＳＶ−ＴＫアミノ酸配列、例えば、配列番号２または４に対して、少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫをコードするポリヌクレオチド配列は、約２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％未満またはそれより少ない、約０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４または０．２５未満の使用の頻度を有するコドンを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、約２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％未満またはそれより少ない、哺乳類細胞において約０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４または０．２５未満の使用の頻度を有するコドンを含む。いくつかの実施形態では、対応するコードされるポリペプチド配列は、ＨＳＶ−ＴＫアミノ酸配列、例えば、配列番号２または４に対して、少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫをコードするポリヌクレオチド配列は、コドン置換を含み、ここで、少なくとも３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上のコドンが、野生型配列と比較して変更されている。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫをコードするポリヌクレオチド配列は、コドン置換を含み、ここで、少なくとも３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上のコドンが、野生型配列と比較して、哺乳類細胞において使用のより高い頻度を有するコドンに変更されている。いくつかの実施形態では、対応するコードされるポリペプチド配列は、ＨＳＶ−ＴＫアミノ酸配列、例えば、配列番号２または４に対して、少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫをコードするポリヌクレオチド配列は、コドン置換を含み、ここで、少なくとも１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上のコドンが、野生型配列と比較して、哺乳類細胞において使用のより高い頻度を有するコドンに変更されている。いくつかの実施形態では、対応するコードされるポリペプチド配列は、ＨＳＶ−ＴＫアミノ酸配列、例えば、配列番号２または４に対して、少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
保存されない突然変異
選択されたヘルペスウイルス由来のウイルスチミジンキナーゼ遺伝子は、突然変異していない野生型チミジンキナーゼと比較して、チミジンキナーゼの生物活性を増大する１つまたは複数の突然変異を含むチミジンキナーゼ酵素をコードする核酸分子を構築するために、以下に記載されるように、容易に単離され、突然変異し得る。チミジンキナーゼの生物活性は、例えば、ヌクレオシド類似体取り込みの割合の決定またはヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体リン酸化の割合の決定を含めた、当技術分野で公知のアッセイのいずれかを利用して容易に決定され得る。さらに、熱安定性およびタンパク質安定性などの他の生物学的特性を特徴とするチミジンキナーゼ突然変異体は、容易に選択され得る。
いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫをコードするポリヌクレオチド配列は、予測されるシグナル配列を除去または修飾するよう修飾される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、核局在性配列（ＮＬＳ）を除去または修飾するよう修飾される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、核局在性配列を除去するよう修飾される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＨＳＶ−ＴＫを核に排他的に局在するよう、もはや機能しないようにＮＬＳを修飾するよう修飾される。
いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫポリペプチド配列は、アミノ酸残基１６７、１６８または両方で突然変異しる。１つの例では、配列は、アミノ酸残基１６７で突然変異しる。別の例では、配列は、アミノ酸残基１６８で突然変異しる。別の例では、配列は、アミノ酸残基１６７および１６８で突然変異しる。アミノ酸残基１６７は、セリンまたはフェニルアラニンに突然変異し得る。アミノ酸残基１６８は、ヒスチジン、リシン、システイン、セリンまたはフェニルアラニンに突然変異し得る。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫポリペプチド配列は、アミノ酸残基２５および／または２６で突然変異しる。アミノ酸残基２５および／または２６は、グリシン、セリンおよびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸に突然変異し得る。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫポリペプチド配列は、アミノ酸残基３２および／または３３で突然変異しる。アミノ酸残基３２および／または３３は、グリシン、セリンおよびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸に突然変異し得る。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫポリペプチドは、アミノ酸残基２５、２６、３２および／または３３で突然変異しる。アミノ酸残基２５、２６、３２および／または３３は、グリシン、セリンおよびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸に突然変異し得る。アミノ酸残基修飾は、配列番号２または４のポリペプチド配列と比較して行われ得る。
本発明に従って、上記の核酸分子によってコードされる突然変異体チミジンキナーゼ酵素ならびにこのような分子を発現できるベクターが提供される。いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子と作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターが提供される。いくつかの実施形態では、ベクターは、核酸分子の発現を指示できるウイルスベクターである。このようなウイルスベクターの代表例として、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス随伴ウイルスベクター、ポックスベクター、パルボウイルスベクター、バキュロウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターが挙げられる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異を含み、突然変異のうち少なくとも１つが、突然変異していない（すなわち、野生型）チミジンキナーゼと比較して、チミジンキナーゼの生物活性を増大する、チミジンキナーゼ酵素をコードする核酸分子の発現を指示できるウイルスベクターが提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される核酸分子は、ヌクレオシド類似体を、野生型チミジンキナーゼ酵素によるヌクレオシド類似体のリン酸化のレベルよりも、少なくとも１０％高いレベルでリン酸化できるチミジンキナーゼ酵素をコードする。いくつかの実施形態では、チミジンキナーゼ酵素は、ヌクレオシド類似体を、野生型チミジンキナーゼ酵素によるヌクレオシド類似体のリン酸化のレベルよりも、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％または少なくとも５００％高いレベルでリン酸化できる。適したヌクレオシド類似体の代表例として、ガンシクロビル、アシクロビル、ファムシクロビル、ブシクロビル（buciclovir）、ペンシクロビル、バルシクロビル（valciclovir）、トリフルオロチミジン、１−［２−デオキシ、２−フルオロ、β−Ｄ−アラビノフラノシル］−５−ヨードウラシル、ａｒａ−Ａ、ａｒａＴ１−β−Ｄ−アラビノフラノキシルチミン、５−エチル−２’−デオキシウリジン、５−ヨード−５’−アミノ−２、５’−ジデオキシウリジン、イドクスウリジン、ＡＺＴ、ＡＩＵ、ジデオキシシチジンおよびＡｒａＣが挙げられる。いくつかの実施形態では、改善されたＴＫ突然変異体は、チミジンキナーゼ活性を欠く。
いくつかの実施形態では、開示されるＨＳＶ−ＴＫ突然変異体のチミジンキナーゼ活性のＫｍ値は、少なくとも２．５μｍである。いくつかの実施形態では、開示されるＨＳＶ−ＴＫ突然変異体のチミジンキナーゼ活性のＫｍ値は、少なくとも５μｍ、少なくとも１０μｍ、少なくとも１５μｍ、少なくとも２０μｍ、少なくとも２５μｍ、少なくとも３０μｍ、少なくとも４０μｍ、少なくとも５０μｍ、少なくとも６０μｍ、少なくとも７０μｍ、少なくとも８０μｍ、少なくとも９０μｍ、少なくとも１００μｍ、少なくとも１５０μｍ、少なくとも２００μｍ、少なくとも２５０μｍ、少なくとも３００μｍ、少なくとも４００μｍ、少なくとも５００μｍ、少なくとも６００μｍ、少なくとも７００μｍ、少なくとも８００μｍ、少なくとも９００μｍまたは少なくとも１０００μｍである。いくつかの実施形態では、野生型ＨＳＶ−ＴＫと比較した、開示されるＨＳＶ−ＴＫ突然変異体のパーセントＫｍは、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％または少なくとも５００％である。
本発明の一実施形態内で、ＨＳＶ−ＴＫ突然変異体の切断型誘導体が提供される。例えば、部位特異的突然変異誘発は、チミジンキナーゼ突然変異体のＮ末端の４５個のアミノ酸を欠失し、その生物活性を保持する突然変異体の切断型を構築するよう容易に実施され得る。
チミジンキナーゼ突然変異体の誘導体の発現のために構築されたヌクレオチド配列中の突然変異は、コード配列のリーディングフレーム相を保たなくてはならない。さらに、突然変異は、好ましくは、ハイブリダイズして、受容体ｍＲＮＡの翻訳に悪影響を及ぼすであろうループまたはヘアピンなどの二次的ｍＲＮＡ構造を製造できる相補的領域を作製しない。このような誘導体は、上記で議論されたものを含めたさまざまな技術を使用して容易に構築され得る。
修飾されたチミジンキナーゼ突然変異体
本発明者らは、本明細書において記載された方法を使用して、最適化されたＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の候補の大部分が、レトロウイルス発現系と匹敵し、生物学的に有用なレトロウイルス力価をもたらすようであると決定した。
さらに、これらの最適化のほとんどを組み込んだ最適化されたＨＳＶ−ＴＫ遺伝子（配列番号１８）は、レトロウイルス形質導入送達後に、プロドラッグＧＣＶ酵素活性および癌細胞を死滅させるその能力の選択性を示した。コドン最適化され、スプライス修正された突然変異体ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子Ａ１６８Ｈは、最高のＧＣＶ媒介性癌死滅活性を有すると思われた（配列番号１２、１６、１８または２２）。このＨＳＶ−ＴＫ遺伝子Ａ１６８Ｈの同じ型で、アミノ酸１５９〜１６１でＬＩＦからＩＦＬに突然変異したものは、ＧＣＶ媒介性癌細胞死滅活性を示した。
コドン最適化され、スプライス修正された突然変異体ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子Ａ１６７Ｆ（配列番号１３、１７または１９）は、レトロウイルス形質導入送達後に極めて高いＧＣＶ媒介性癌死滅活性を有していたが、より驚くべきことに、ＨＡＴ培地を用いて選択された３Ｔ３ ＴＫ（−）細胞におけるレトロウイルス形質導入送達後のこの遺伝子の発現によって決定されるように、チミジンキナーゼ活性は有していなかった。本発明者らの知る限りでは、これは、これまでに生物学的に評価されたチミジン活性を有さない（ＨＡＴアッセイ）ＧＣＶ活性化のための最もＧＣＶ選択的なＨＳＶ−ＴＫ合成遺伝子産物である。
二重突然変異体ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子Ａ１６７Ｆ＋Ａ１６８Ｈ（配列番号１４）は、予期しないことに、極めてわずかなＧＣＶ媒介性癌死滅活性および極めてわずかなチミジン活性（ＨＡＴアッセイ）を示すことによって、ＧＣＶおよびチミジン酵素活性の両方を除去した。
本発明者らは、細菌シトシンデアミナーゼ、酵母シトシンデアミナーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの遺伝子の機能的ＨＳＶ−ＴＫ融合物を製造し、リンカー配列を含み、ＨＳＶ−ＴＫ ＧＣＶ媒介性癌細胞死滅活性を保持することが可能であると明らかにした。
一実施形態では、１種または複数の他の治療用遺伝子と融合されていない１種または複数の核局在性配列を保持する、ＧＣＶ媒介性癌死滅活性を有するコドン最適化されたＨＳＶ−ＴＫ遺伝子が作製され得る。
本明細書に記載される最適化されたＨＳＶ−ＴＫ遺伝子へのさらなる修飾および／またはその評価は、以下：ＨＳＶ−ＴＫ内の公知の核局在性配列の除去、プロドラッグＧＣＶ酵素活性および癌細胞を死滅させるその能力の選択性の増大のうち１つまたは複数を含み得、ＨＳＶ−ＴＫの、他の遺伝子およびタンパク質との、より多くのタグ、融合タンパク質およびリンカーの使用、癌細胞におけるＨＳＶ−ＴＫ最適化遺伝子の、他の最適化自殺および癌死滅遺伝子との同時発現を評価し得、Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ型レトロウイルスベクター系中の最適化ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子、Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ型ＧＭＰ生成物またはそれらの任意の組合せの製造および試験を含み得る。
例示的ポリヌクレオチド配列
一実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列は、核外輸送シグナルを含む。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ＴＫ１６８ｄｍＮＥＳを含み得る。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するためのレトロウイルスベクターは、１種または複数のスプライシング部位修飾を含む。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するためのレトロウイルスベクターは、ＨＳＶ−ＴＫ Ａ１６７Ｆｓｍ（配列番号１３）を含む。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するためのレトロウイルスベクターは、ＨＳＶ−ＴＫ Ａ１６８Ｈｓｍ（配列番号１２）を含む。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するためのレトロウイルスベクターは、ＨＳＶ−ＴＫ Ａ１６７Ｆｄｍ（配列番号１７）を含む。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するためのレトロウイルスベクターは、ＨＳＶ−ＴＫ Ａ１６８ｄｍ（配列番号１６）を含む。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するためのレトロウイルスベクターは、ＨＳＶ−ＴＫ Ａ１６７ＦｄｍおよびＮＥＳ（配列番号１９）を含む。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するためのレトロウイルスベクターは、ＨＳＶ−ＴＫ Ａ１６８ＨｄｍおよびＮＥＳ（配列番号１８）を含む。このような一実施形態では、配列は、ＨＳＶ−ＴＫ Ａ１６８Ｈを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するためのレトロウイルスベクターは、ＨＳＶ−ＴＫを含み、このようなベクターは、改良された基質結合ドメインおよびｍＮＬＳ／ＮＥＳセットを含む。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するためのレトロウイルスベクターは、ＨＳＶ−ＴＫを含み、ベクターは、選択マーカー、蛍光を発する、蛍光または生物発光遺伝子および／または１種もしくは複数の死滅遺伝子を含む。
別の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するためのレトロウイルスベクターは、少なくとも２つの修飾を含む。
チミジンキナーゼ突然変異体の構築
本発明のチミジンキナーゼ突然変異体は、さまざまな技術を使用して構築され得る。例えば、突然変異は、突然変異体配列を含有し、天然配列の断片との連結を可能にする制限部位によって両側に隣接されるオリゴヌクレオチドを合成することによって特定の遺伝子座に導入され得る。連結後、得られた再構築された配列は、所望のアミノ酸挿入、置換または欠失を有する誘導体をコードする。
あるいは、オリゴヌクレオチドによって指示される部位特異的（またはセグメント特異的）突然変異誘発手順は、必要な置換、欠失または挿入に従って変更された、特定のコドンを有する変更された遺伝子を提供するよう使用され得る。チミジンキナーゼ突然変異体の欠失または切断誘導体はまた、所望の欠失に隣接する好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位を利用することによって構築され得る。制限後に、オーバーハングが埋められ、ＤＮＡが再連結され得る。上記で示される変更を行う例示的方法は、Sambrook et al. (Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)によって開示されている。
本明細書において開示されるチミジンキナーゼ突然変異体の他の誘導体は、他のタンパク質またはポリペプチドととものチミジンキナーゼ突然変異体のコンジュゲートを含む。これは、例えば、チミジンキナーゼ突然変異体の精製または同定を促進するよう付加され得るＮ末端またはＣ末端融合タンパク質の合成によって達成され得る（米国特許第４，８５１，３４１号を参照のこと、Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988も参照のこと)。
ＨＳＶ媒介性死滅の改善
いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫをコードするポリヌクレオチド配列は、二次的治療薬またはポリペプチドをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、二次的治療薬またはポリペプチドは、診断薬または治療薬またはポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、二次的治療薬またはポリペプチドは、それ自体によって、または他の化合物の存在下で細胞死を引き起こすさらなる「自殺タンパク質」である。いくつかの実施形態では、第２の自殺遺伝子は、ペニシリン−Ｖ−アミダーゼ、ペニシリン−Ｇ−アミダーゼ、β−ラクタマーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、リナマラーゼ（β−グルコシダーゼとも呼ばれる）、大腸菌（E. coli）ｇｐｔ遺伝子および大腸菌Ｄｅｏ遺伝子、シトシンデアミナーゼ、ＶＳＶ−ｔｋ、ＩＬ−２、ニトロレダクターゼ（ＮＲ）、カルボキシルエステラーゼ、β−グルクロニダーゼ、シトクロムｐ４５０、β−ガラクトシダーゼ、ジフテリア毒素Ａ鎖（ＤＴ−Ａ）、カルボキシペプチドＧ２（ＣＰＧ２）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）およびデオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）を含む群から選択される。
いくつかの実施形態では、第２の自殺タンパク質は、プロドラッグを毒性化合物に変換する。本明細書において、「プロドラッグ」とは、毒性の、すなわち、腫瘍細胞に対して毒性の生成物に変換され得る、本明細書において開示される方法において有用な任意の化合物を意味する。プロドラッグは、自殺タンパク質によって毒性生成物に変換される。このようなプロドラッグの代表例として、ＦＨＢＧ（９−［４−フルオロ−３−（ヒドロキシメチル）ブチル］グアニン）、ＦＨＰＧ（９−（［３−フルオロ−１−ヒドロキシ−２−プロポキシ］メチル）グアニン）、ＦＧＣＶ（フルオロガンシクロビル）、ＦＰＣＶ（フルオロペンシクロビル）、ＦＩＡＵ（１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル）、ＦＥＡＵ（フルオロ−５−エチル−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル）、ＦＭＡＵ（フルオロ−５−メチル−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル）、ＦＨＯＭＰ（６−（（１−フルオロ−３−ヒドロキシプロパン−２−イルオキシ）メチル）−５−メチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン）、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、アシクロビル、バラシクロビル（valacivlovir）、ペンシクロビル、放射標識された、Ｎ−１に４−ヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）ブチル側鎖を有するピリミジン（ＨＨＧ−５−ＦＥＰ）または２，３−ジヒドロキシプロピルを有する、５−（２−）ヒドロキシエチル）−および５−（３−ヒドロキシプロピル）置換ピリミジン誘導体、チミジンキナーゼのためのアシクロビル−、ガンシクロビル−およびペンシクロビル−様側鎖、オキシドレダクターゼのためのイホスファミド、ＶＺＶ−ＴＫのための６−メトキシプリンアラビノシド、シトシンデアミナーゼのための５−フルオロシトシン、β−グルクロニダーゼのためのドキソルビシン、ニトロレダクターゼのためのＣＢ１９５４およびニトロフラゾンおよびＮ−（シアノアセチル）−Ｌ−フェニルアラニンまたはカルボキシペプチダーゼＡのためのＮ−（３−クロロプロピオニル）−Ｌ−フェニルアラニンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、二次的治療薬またはポリペプチドは、それだけには限らないが、細胞周期制御物質、サイクリンＡおよび／またはＤ遺伝子に対するアンチセンスポリヌクレオチドなどのサイクリンタンパク質を阻害する物質、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−βおよび線維芽細胞成長因子などの成長因子、それだけには限らないが、インターロイキン１から１３および腫瘍壊死因子を含めたサイトカイン、抗凝固薬、抗血小板薬、抗炎症薬、抗血管新生因子、腫瘍抑制タンパク質、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子を含めた凝固因子、タンパク質Ｓ、タンパク質Ｃ、抗トロンビンＩＩＩ、フォンウィルブランド因子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）および陰性選択マーカーを含めた群から選択される。
いくつかの実施形態では、二次的治療剤またはポリペプチドは、癌抑制、例えば、ｐ５３もしくはＲｂまたはこのようなタンパク質もしくはポリペプチドをコードする核酸である。
二次的治療剤またはポリペプチドの他の例として、アポトーシス促進性治療用タンパク質およびポリペプチド、例えば、ｐ１５、ｐ１６またはｐ２１／ＷＡＦ−１が挙げられる。
いくつかの実施形態では、二次的治療剤またはポリペプチドは、サイトカインである。サイトカインの例として、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）、それだけには限らないが、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γを含めたインターフェロンおよびそれだけには限らないが、インターロイキン−１（ＩＬ１）、インターロイキン−β（ＩＬ−β）、インターロイキン−２（ＩＬ２）、インターロイキン−４（ＩＬ４）、インターロイキン−５（ＩＬ５）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、インターロイキン−８（ＩＬ８）、インターロイキン−１０（ＩＬ１０）、インターロイキン−１２（ＩＬ１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ１３）、インターロイキン−１４（ＩＬ１４）、インターロイキン−１５（ＩＬ１５）、インターロイキン−１６（ＩＬ１６）、インターロイキン−１８（ＩＬ１８）、インターロイキン−２３（ＩＬ２３）、インターロイキン−２４（ＩＬ２４）を含めたインターロイキンが挙げられるが、他の実施形態は、当技術分野で公知である。
いくつかの実施形態では、二次的治療剤またはポリペプチドは、アポトーシス促進性である。アポトーシス促進性タンパク質またはポリペプチドの例として、それだけには限らないが、Ｂａｘ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｂａｋ、Ｂｉｍ、チトクロームＣ、アポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）、Ｐｕｍａ、ＣＴ１０調節性キナーゼ（ＣＲＫ）、Ｂｏｋ、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、前立腺アポトーシス応答タンパク質−４（Ｐａｒ−４）、Ｓｍａｃ、キナーゼＣδ、Ｆａｓ、阻害性ＰＡＳドメインタンパク質（ＩＰＡＳ）およびＨｒｋが挙げられる。
いくつかの実施形態では、二次的治療剤またはポリペプチドは、細胞間情報伝達に関与している。いくつかの実施形態では、二次的治療剤またはポリペプチドは、ギャップ細胞結合に関与している。いくつかの実施形態では、二次的治療剤またはポリペプチドは、コネキシンである。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質またはポリペプチドは、群コネキシン４３、コネキシン３２およびコネキシン２６から選択されるコネキシンである。
いくつかの実施形態では、二次的治療剤またはポリペプチドは、ヒト受容体遺伝子ＰｉＴ−２（ＳＬＣ２０Ａ２）によってコードされる。Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ１および２レトロウイルスベクターに含まれる両種指向性のエンベロープ遺伝子産物は、標的細胞感染に先立ってＰｉＴ−２受容体と結合する。いくつかの実施形態では、二次的治療剤またはポリペプチドは、ヒト受容体遺伝子ＰｉＴ−１（ＳＬＣ２０Ａ１）によってコードされる。テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）エンベロープ遺伝子産物は、標的細胞感染に先立ってＰｉＴ−１受容体と結合する。
いくつかの実施形態では、二次的治療剤またはポリペプチドは、レトロウイルスタンパク質のＮ末端切断であり、Ｎ末端切断は、エンベロープタンパク質の機能的受容体結合ドメインを含む。
治療を改善するための細胞内情報伝達の増大
バイスタンダー効果の増大
いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫプロドラッグ基質バイスタンダー効果を増大する方法が、本明細書において開示される。本明細書において、「バイスタンダー効果」とは、ＨＳＶ−ＴＫ陽性細胞におけるＨＳＶ−ＴＫ発現の発現の誘導後に、ＨＳＶ−ＴＫ陽性が、隣接するＨＳＶ−ＴＫ陰性細胞に対して死滅効果を発揮する現象を指す。
いくつかの実施形態では、例えば、ギャップ結合依存性細胞内情報伝達の増大とともにＧＣＶを用いる処理後に、ＨＳＶ−ＴＫプロドラッグ媒介性バイスタンダー効果を増大する方法である。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫプロドラッグ媒介性バイスタンダー効果は、死滅率を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％またはそれ以上、増大する。
ギャップ結合は、ある細胞の細胞質を別の細胞の細胞質と直接接続するギャップ結合チャネルのクラスターを有する細胞膜の領域である。ギャップ結合チャネルは、２種の隣接する細胞の各々によって提供される２つのヘミチャネル（コネクソン）から構成される。コネクソンは、４つの膜貫通ドメイン、２つの細胞外ループおよび細胞質ループを含む基本構造を有するタンパク質の大きなファミリーである６種のコネキシンタンパク質を含むことが最も多い。
ギャップ結合は、成長制御およびホメオスタシス（すなわち、細胞間のイオン、栄養分および流体の迅速平衡）などの種々の生理学的役割に役立つ。さらに、ギャップ結合は、心筋細胞、平滑筋細胞およびニューロンなどの電気的シグナルを伝播できる細胞において電気シナプスとして働く。
リン酸化されると、ＧＣＶは、ＧＪを通って、結合を共有する隣接する細胞中に移動し得る。ＧＣＶ−Ｐは、それらの細胞においてさらにリン酸化され、ＨＳＫ−ＴＫ発現細胞におけるように細胞死を引き起こす。バイスタンダー効果の程度は、ギャップ結合の存在に応じて変わり、したがって、細胞型の間で異なる。しかし、Dahle et al. 「Gap junctional intercellular communication is not a major mediator in the bystander effect in photodynamic treatment of MDCKII cells.」Radiation Res. 154: 331-341 (Sept. 2000)を参照のこと。
ウイルスＴＫ酵素は、ＤＮＡ塩基グアニンと似ているプロドラッグガンシクロビル（ＧＣＶ）に対して感受性である。
ＧＣＶが細胞培地に添加される際に、ウイルスＴＫ（宿主非ウイルスＴＫは、そうではない）は、ＧＣＶをリン酸化し、それを薬物に変換するが、これは、リン酸化されると、グアニンとの類似性のためにＤＮＡへの組込みについてｄＧＴＰと競合するからである。
組込みは、ＤＮＡ鎖合成の終結を引き起こす。ＧＣＶ−モノＰの非癌細胞への移動は、それらが活発に分裂する限り、それらにとって毒性ではない。危険にある正常細胞は、高レベルのＧＣＶ薬物で処理される際にウイルスＴＫ発現細胞と密接に接触しているものだけである。
いくつかの実施形態では、ギャップ結合依存性細胞内情報伝達（ＧＪＩＣ）を増大する処理とともに、ＨＳＶ−ＴＫをコードするベクター粒子を送達することを含む、対象において標的細胞のウイルスチミジンキナーゼ媒介性死滅を増大する方法が、本明細書において開示される。いくつかの実施形態では、標的細胞は、新生物細胞である。いくつかの実施形態では、ＧＪＩＣを増大する処理は、細胞に少なくとも１種のギャップ結合サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を送達することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１種のギャップ結合サブユニットは、野生型または突然変異体コネキシンである。いくつかの実施形態では、ギャップ結合サブユニットは、野生型または突然変異体コネキシン４３、コネキシン３０およびコネキシン２６からなる群から選択される。他の実施形態では、ギャップ結合サブユニットは、コネキシン３０．３、コネキシン３１、コネキシン３１．１、コネキシン３２、コネキシン３３、コネキシン３７、コネキシン４０、コネキシン４５、コネキシン４６およびコネキシン５０である。いくつかの実施形態では、ギャップ結合サブユニットは、翻訳後修飾を防ぐよう修飾される。いくつかの実施形態では、ＧＪＩＣを増大する処理は、細胞にＥ−カドヘリンをコードするポリヌクレオチド配列を送達することを含む。
いくつかの実施形態では、ＧＪＩＣを増大する処理は、対象への化合物の送達を含む。いくつかの実施形態では、ＧＪＩＣを増大する処理は、対象に、ゲムシタビン、ｃＡＭＰ、レチノイン酸、カロテノイド、グルココルチコイド、フラバノイド、アピゲニンおよび／またはロバスタチンを含む群からの化合物を送達することを含む。
いくつかの実施形態では、ＧＪＩＣを増大する処理は、プロテアソーム阻害を含む。いくつかの実施形態では、ＧＪＩＣを増大する処理は、Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯ（ＡＬＬＮ）および／またはクロロキンの投与によるプロテアソーム阻害を含む。
いくつかの実施形態では、ＧＪＩＣを増大する処理は、放射線処理を含む。
いくつかの実施形態では、ＧＪＩＣを増大する処理は、電気的処理を含む。
検出の方法
いくつかの実施形態では、ａ）細胞を、ＨＳＶ−ＴＫおよび第１の蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を用いてトランスフェクトすることと、ｂ）細胞を、第１の蛍光タンパク質と光学的に識別可能である第２の蛍光タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド配列を用いてトランスフェクトすることと、ｃ）細胞を、滴定された用量のガンシクロビルを用いて処理することと、ｄ）第１の蛍光タンパク質および第２の蛍光タンパク質の発現の相対量を測定することとを含む、ＨＳＶ−ＴＫ媒介性バイスタンダー効果を測定する方法が、本明細書において開示される。
一実施形態では、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）が、第１の蛍光タンパク質蛍光タンパク質および第２の両方を用いて形質導入された標的腫瘍細胞の数を定量するために使用され、すべてがＨｙｇｒｏ（登録商標）およびＨＳＶ−ＴＫの両方を発現する腫瘍細胞の集団を選択するために、Ｈｙｇｒｏ（登録商標）が使用され得る。ＲＦＰは市販されており、本明細書における使用のために考慮される（例えば、以下の参考文献１〜１４に記載されるＲＦＰを参照のこと。
別の実施形態では、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が、形質導入された標的腫瘍細胞の数を定量するために使用される。ＧＦＰは、市販されており、本明細書における使用のために考慮され、それだけには限らないが、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を含む。
ＨＳＶ−ＴＫのプラスミドおよび製造
いくつかの実施形態では、適した転写または翻訳調節エレメントと作動可能に連結している、ＨＳＶ−ＴＫまたはその突然変異体および／または誘導体をコードする核酸分子が、本明細書において開示される。いくつかの実施形態では、適した調節エレメントは、細菌、真菌、ウイルス、哺乳類、昆虫または植物遺伝子に由来している。適当な調節エレメントの選択は、選択される宿主細胞に応じて変わり、いくつかの実施形態では、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列および翻訳開始シグナルを含むリボソーム結合配列を含む。
上記のような、ＨＳＶ−ＴＫまたはその突然変異体および／または変異体をコードする核酸配列を含むプラスミドが、本明細書において記載される。いくつかの実施形態では、第２のペプチド成分と融合しているＨＳＶ−ＴＫをコードするプラスミドが本明細書において開示される。いくつかの実施形態では、第２のペプチド成分は、治療剤またはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第２のペプチド成分は、診断用ポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示されるＨＳＶ−ＴＫをコードする核酸分子の発現を指示するのに適した種々のウイルスおよび非ウイルス両方のベクターが、本明細書において開示される。
いくつかの実施形態では、治療および診断手順において使用するための送達ベクターまたは治療用ベクターをトランスフェクトおよび製造するためのプラスミドが、本明細書において開示される。一般に、このようなプラスミドは、本明細書において開示されるターゲッティングされるベクターのウイルスまたは非ウイルス成分をコードする核酸配列を提供する。このようなプラスミドは、例えば、ＭｏＭＬＶエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭｏＭＬＶエンベロープタンパク質は、コラーゲン結合ドメインを含有するよう修飾される。さらなるプラスミドは、プロモーターと作動可能に連結している核酸配列を含み得る。配列は、一般に、ウイルスｇａｇ−ｐｏｌポリペプチドをコードする。プラスミドは、プロモーターと作動可能に連結している核酸配列をさらに含み、配列は、産生株細胞に薬物耐性を付与するポリペプチドをコードする。複製起点もまた含まれる。いくつかの実施形態では、さらなるプラスミドは、本明細書において開示されるような、改善されたＨＳＶ−ＴＫコード配列、５’および３’長い末端反復配列、Ψレトロウイルスパッケージング配列、５’ＬＴＲプロモーター上流のＣＭＶエンハンサー、プロモーターと作動可能に連結している核酸配列およびＳＶ４０複製起点を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫをコードするポリヌクレオチドは、適したプロモーターの制御下にある。適したプロモーターとして、それだけには限らないが、レトロウイルスＬＴＲ、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒストンプロモーター、ｐｏｌＩＩＩプロモーター、β−アクチンプロモーター、ＭＭＴＶプロモーター、メタロチオネインプロモーターなどの誘導プロモーター、熱ショックプロモーター、アデノウイルスプロモーター、アルブミンプロモーター、ＡｐｏＡＩプロモーター、Ｂ１９パルボウイルスプロモーター、ヒトグロビンプロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターなどのウイルスチミジンキナーゼプロモーター、レトロウイルスＬＴＲ、ヒト成長ホルモンプロモーターおよびＭｘＩＦＮ誘導プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターは、チロシナーゼ関連プロモーター（ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２）、ＤＦ３エンハンサー（乳房細胞の）、ＳＬＰＩプロモーター（分泌型ロイコプロテアーゼ阻害剤−多数の種類の癌腫において発現される）、ＴＲＳ（組織特異的調節配列）、α−フェトタンパク質プロモーター（それぞれ、正常肝細胞および形質転換された肝細胞に特異的な）、癌胎児性抗原プロモーター（胃腸管、肺、乳房および他の組織の形質転換された細胞において使用するための）、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター（メラノサイトの）、コリンアセチルトランスフェラーゼまたは神経芽細胞腫において使用するためのニューロン特異的エノラーゼプロモーター、グリアの線維芽腫（glial fibroblastomas）の調節配列、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター、ｃ−ｅｒｂ Ｂ−２プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＰＥＰＣＫプロモーター、ホエイ酸性プロモーター（乳房組織）およびカゼインプロモーター（乳房組織）および脂肪細胞Ｐ２プロモーターを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ウイルス特異的プロモーター（例えば、レトロウイルスプロモーターならびにＨＩＶプロモーターなどの他のもの）、肝炎、ヘルペス（例えば、ＥＢＶ）である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、天然ＨＳＶ−ＴＫプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、細菌、真菌または寄生虫（例えば、マラリア）特異的プロモーターであり、ウイルス、細菌、真菌または寄生虫に感染している特定の細胞または組織をターゲッティングするために利用される。
いくつかの実施形態では、送達ベクターまたは治療用ベクターは、送達ベクターまたは治療用ベクターを所望の細胞または系にターゲッティングするターゲッティング部分を含み得る。いくつかの実施形態では、ターゲッティング部分は、送達媒体と関連しており、媒体を細胞または組織にターゲッティングする、送達ベクターまたは治療用ベクターによって発現されるリガンドを指す。いくつかの実施形態では、リガンドは、それだけには限らないが、ターゲッティングされる細胞または系中で露出されるかまたはその上にある細胞成分と結合する、抗体、受容体およびタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、露出される細胞成分は、コラーゲンを含み得る。いくつかの実施形態では、露出される細胞成分とのリガンド結合は、コラーゲン結合ドメインを含むタンパク質を含む。
本明細書において開示されるプラスミドは、当業者に公知の遺伝子工学技術によって製造され得る。さらに、プラスミドは、細菌、哺乳類、酵母または他の真菌、ウイルス、昆虫または植物細胞を含めたさまざまな原核生物および真核細胞宿主細胞によって容易に発現され得る。外来ＤＮＡを発現するよう、このような細胞を形質転換またはトランスフェクトする方法は、当技術分野に周知である（例えば、Itakura et al.,米国特許第４，７０４，３６２号;Hinnen et al., PNAS USA 75:1929-1933, 1978;Murray et al., 米国特許第４，８０１，５４２号；Upshall et al.,米国特許第４，９３５，３４９号；Hagen et al., 米国特許第４，７８４，９５０号；Axel et al., 米国特許第４，３９９，２１６号；Goeddel et al., 米国特許第４，７６６，０７５号およびSambrook et al. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照のこと；植物細胞については、Czako and Marton, Plant Physiol. 104:1067-1071, 1994;およびPaszkowski et al., Biotech. 24:387-392, 1992を参照のこと）。
哺乳類細胞のトランスフェクションのためのプロトコールは、当業者に周知である。代表的な方法として、リン酸カルシウムおよび／またはマグネシウム媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびプロトプラスト融合媒介性が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＨＳＶ−ＴＫまたはその突然変異体は、組換えチミジンキナーゼ突然変異体を発現するために、上記の宿主／ベクター系を培養することによって調製される。組換えによって製造されたチミジンキナーゼ突然変異体は、当技術分野で周知の方法に従ってさらに精製され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される核酸分子は、さまざまな宿主細胞中に導入される。このような宿主細胞の代表例として、植物細胞、真核細胞および原核細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ヒト、マカクザル、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ラット、ハムスター、マウスまたは魚の細胞またはそれらの任意のハイブリッドなどの、脊椎動物または温血動物から得た細胞中に導入される。
いくつかの実施形態では、本明細書において記載される核酸分子は、哺乳類細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、ＣＯＳ、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、２９３およびＮＳ−１細胞を含む群から選択される。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞において発現を指示するのに適した発現ベクターは、プロモーターならびに他の転写および翻訳制御配列を含む。一般的なプロモーターとして、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、メタロチオネイン−１、アデノウイルスＥ１ａ、サイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびサイトメガロウイルス前後期（Immediate Late）プロモーターが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核酸分子は、酵母または真菌細胞に導入される。本発明を実施するのに適した酵母および真菌宿主細胞として、中でも、サッカロミセス・ポンべ（Saccharomyces pombe）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア（Pichia）またはクルイベロマイセス（Kluyveromyces）属およびアスペルギルス（Aspergillus）属の種々の種が挙げられる。酵母および真菌に適した発現ベクターとして、中でも、酵母のためのＹＣｐ５０およびａｍｄＳクローニングベクターｐＶ３が挙げられる。いくつかの実施形態では、酵母の形質転換は、ＤＮＡとともの酵母のスフェロプラストの調製によってか、またはＬｉＣｌなどのアルカリ塩を用いる処理のいずれかによって達成される。いくつかの実施形態では、真菌の形質転換は、ポリエチレングリコールを使用して実施される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核酸分子は、細菌細胞中に導入される。本発明を実施するのに適した細菌宿主細胞として、大腸菌、枯草菌（B.subtilis）、サルモネラ・チフィリウム（Salmonella typhimurium）ならびにシュードモナス（Pseudomonas）、ストレプトマイセス（Streptomyces）およびスタフィロコッカス（Staphylococcus）属内の種々の種ならびに当業者に周知の多数の他の細菌が挙げられる。細菌宿主細胞の代表例として、ＤＨ５αが挙げられる（Stratagene、La Jolla、Calif.）。
いくつかの実施形態では、細菌発現ベクターは、宿主細胞において機能するプロモーター、１種または複数の選択可能な表現型マーカーおよび細菌複製起点を含む。代表的なプロモーターとして、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、λプロモーター、ｔｒｐプロモーターおよびｔａｃプロモーターが挙げられる。代表的な選択マーカーとして、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子などの種々の抗生物質耐性マーカーが挙げられる。いくつかの実施形態では、宿主細菌細胞を形質転換するのに適したプラスミドとして、中でも、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣプラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａおよびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｍ１３ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核酸分子は、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、イヌおよびブタなどの非ヒトトランスジェニック動物において発現される。いくつかの実施形態では、適宜配置された発現制御配列と一緒に発現されるべき核酸分子を含めた発現単位が、例えば、マイクロインジェクションによって受精卵の前核中に導入される。いくつかの実施形態では、注入されたＤＮＡの組込みは、組織サンプルから得たＤＮＡのブロット分析によって検出される。いくつかの実施形態では、導入されたＤＮＡは、動物の後代に伝えられるよう、動物の生殖系列中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、組織特異的発現は、組織特異的プロモーターの使用によって、または導入遺伝子の調節された発現を可能にするメタロチオネイン遺伝子プロモーターなどの誘導プロモーターの使用によって達成される
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核酸分子は、例えば、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、リポフェクション、遺伝子銃、エレクトロポレーション、レトロウイルス、アデノウイルス、プロトプラスト融合媒介性トランスフェクションまたはＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクションを含めたさまざまな機序によって宿主細胞中に導入される
ベクターおよびその製造方法
所望の細胞において発現される、上記のような、改善されたＨＳＶ−ＴＫコード配列を含むベクター粒子が、本明細書において開示される。いくつかの実施形態では、ベクター粒子は、ウイルスベクター粒子である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクター粒子は、レトロウイルスベクター粒子である。
いくつかの実施形態では、改善されたＨＳＶ−ＴＫコード配列を含むベクター粒子は、改善されたＨＳＶ−ＴＫコード配列に加えてさまざまなさらなる核酸分子を含有するかまたは発現する。いくつかの実施形態では、ベクターは、リンホカイン、アンチセンス配列、毒素または「補充」タンパク質（例えば、アデノシンデアミナーゼ）をさらに発現する。リンホカインの代表例として、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γインターフェロンおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられる。アンチセンス配列の代表例として、それだけには限らないが、アンチセンスｍｙｃ、アンチセンスｐ５３、アンチセンスｒａｓならびにＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶなどのウイルスの発現または製造を阻止するアンチセンス配列が挙げられる。毒素の代表例として、それだけには限らないが、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、ボツリヌス、ブタクサ抗ウイルス薬タンパク質、トリチン（tritin）、赤痢菌属（Shigella）毒素およびシュードモナス（Pseudomonas）外毒素Ａが挙げられる。自殺遺伝子の代表例として、それだけには限らないが、シトシンデアミナーゼ、ＶＳＶ−ｔｋ、ＩＬ−２、ニトロレダクターゼ（ＮＲ）、カルボキシルエステラーゼ、β−グルクロニダーゼ、シトクロムｐ４５０、β−ガラクトシダーゼ、ジフテリア毒素Ａ鎖（ＤＴ−Ａ）、カルボキシペプチドＧ２（ＣＰＧ２）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）およびデオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）が挙げられる。いくつかの場合には、ベクターは、酵母および／または細菌シトシンデアミナーゼをさらに発現する。
さらなる治療用配列として、それだけには限らないが、酵母または細菌シトシンデアミナーゼ、他の自殺遺伝子、ｐ５３および他のアポトーシス遺伝子、グアニレートキナーゼ、ＩＬ−１２および他の免疫刺激性またはサイトカイン遺伝子、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ｉＲＦＰ、ＬＵＣ２、ＧＬＵＣならびに他の蛍光および生物発光遺伝子、サイクリンＡ、Ｄおよび他の細胞周期調節遺伝子、ウイルス遺伝子、細菌遺伝子、ヒト遺伝子、合成遺伝子、ＳＩＲＮＡ、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、遺伝子のアンチセンス、阻害性または刺激性配列、ライブラリー戦略から獲得された遺伝子、反復配列、複製配列、プロモーターまたはエンハンサー配列、ＤＮＡ結合配列、任意の治療用配列などが挙げられる。
いくつかの実施形態では、γレトロウイルスの受容体をコードするポリヌクレオチド配列が含まれる。両種指向性のウイルスベクターエンベロープ遺伝子産物の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）が、標的細胞の細胞膜上のＰｉＴ−２受容体と結合し、ウイルスベクター形質導入の増強を可能にすることを実証する実験が、本願において本明細書において開示される。ＣＨＯ−Ｋ１およびＢＨＫ細胞でのＰｉＴ−２およびマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭｕＬＶ）受容体結合実験の形態的モデルを使用して、Feldman et al. (Eiden MV. J Virol. (2004) 78: 595−602)は、ヒトＰｉＴ−２受容体の細胞外ドメイン１（ＥＣＤ１）を、両種指向性ウイルス結合および感染にとって重要であると同定した。BottgerおよびPetersen(2004)による研究は、ウイルスを結合するのに必要な部分は、１８２アミノ酸のＮ末端領域および１７０アミノ酸のＣ末端領域に狭められ得ると示した。
したがって、選択実施形態において、コードされるＨＳＶ−ＴＫが、ＰｉＴ−２、ＰｉＴ−１、ＭＣＡＴおよびγレトロウイルスによって使用される他の受容体をコードするようポリヌクレオチド配列を含む、ヒト単純ウイルス由来のチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）の突然変異した形態をコードするポリヌクレオチド配列が本明細書において提供される。
ギャップ結合依存性細胞内情報伝達
いくつかの実施形態では、ベクター粒子は、本明細書に記載されるようなギャップ結合依存性細胞内情報伝達（ＧＪＩＣ）を増大する処理をさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクター粒子は、チミジンキナーゼの生物活性を促進または増大するタンパク質をコードする１種または複数の遺伝子をさらに発現する。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ヘルペスＤＮＡポリメラーゼ）および／またはグアニレートキナーゼをコードする配列をさらに含む。
遺伝子療法を達成するために最も頻繁に使用される送達系の１つは、ウイルスベクター、最も一般的には、アデノウイルスおよびレトロウイルスベクターを含む。例示的なウイルスベースの媒体として、それだけには限らないが、組換えレトロウイルス（例えば、各々が組換えレトロウイルスに関する開示に関して、参照により組み込まれる、ＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９４／０３６２２、ＷＯ９３／２５６９８、ＷＯ９３／２５２３４、米国特許第５，２１９，７４０号、ＷＯ９３／１１２３０、ＷＯ９３／１０２１８、米国特許第４，７７７，１２７号、英国特許第２，２００，６５１号；ＥＰ０３４５２４２およびＷＯ９１／０２８０５を参照のこと）、アルファウイルスベースのベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０、ＡＴＣＣ ＶＲ １２４９、ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２））およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５）が挙げられる。Curiel (Hum. Gene Ther. (1992) 3:147)によって記載されるような死滅したアデノウイルスと連結されたＤＮＡの投与も使用され得る。
レトロウイルスは、一般に、３種の共通オープンリーディングフレーム、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを有し、これらは、それぞれ、マトリックス、ｇａｇおよびヌクレオカプシド構造タンパク質をコードし、逆転写酵素、インテグラーゼおよびプロテアーゼを含めた酵素をコードし、エンベロープタンパク質および膜貫通膜融合性タンパク質をコードする。一般に、レトロウイルスベクター粒子は、必要なｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子産物をトランスに提供するパッケージング細胞株によって製造される。このアプローチは、哺乳類細胞を形質導入するが、細胞のゲノム中に組み込まれた後にさらに複製することはできないレトロウイルスベクター粒子の製造をもたらす。
遺伝子送達目的で、ウイルス粒子は、標的細胞にとって天然であるウイルスからか、または標的細胞にとって非天然であるウイルスから開発され得る。一般に、天然ウイルスベクターよりも非天然ウイルスベクターを使用することが望ましい。天然ウイルスベクターは、標的細胞に対して自然な親和性を有し得るものの、このようなウイルスは、それらが、標的細胞における増殖についてより大きな可能性を有するので、より大きな危険をもたらす。この関連で、ヒト細胞における増殖のために天然には設計されていない動物ウイルスベクターは、ヒト細胞への遺伝子送達のために有用であり得る。しかし、遺伝子送達において使用するためのこのような動物ウイルスベクターの十分な収量を得るために、天然動物パッケージング細胞における製造を実施することが必要である。しかし、このようにして製造されたウイルスベクターは、普通、エンベロープの一部としてか、またはヒト細胞に対する指向性を提供し得るキャプシッドの部分のいずれかとしての任意の成分を欠く。例えば、ＭＭＬＶのようなエコトロピックマウス（ネズミ）レトロウイルスなどの非ヒトウイルスベクターの製造のための現在の実行は、マウスパッケージング細胞株において製造される。ヒト細胞指向性に必要な別の成分が提供されなければならない。
一般に、ウイルスベクター（ヘルパーウイルスを伴わない）の増殖は、パッケージング成分の核酸配列が細胞ゲノム中に安定に組み込まれるパッケージング細胞において進行し、ウイルス核酸の核酸コーディングが、このような細胞株に導入される。
いくつかの実施形態では、レトロウイルスプラスミドベクターは、改善されたＨＳＶ−ＴＫコード配列を含むポリヌクレオチドを含み、改善されたＨＳＶ−ＴＫコード配列を含むポリヌクレオチドを含む発現媒体が、ｇａｇ、ｐｏｌおよび野生型（すなわち、修飾されていない）ｅｎｖレトロウイルスタンパク質をコードする核酸配列を含むパッケージング細胞株中に形質導入される。このようなパッケージング細胞株の例として、それだけには限らないが、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９０７８）、’−２、−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＴＣＲＥ、ＴＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍｌ２および参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMiller, Human Gene Therap， Vol. 1, pgs. 5-14 (1990)に記載されるようなＤＡＮ細胞株または２９３Ｔ細胞株（米国特許第５，９５２，２２５号）が挙げられる。ベクター（単数または複数）は、当技術分野で公知の任意の手段によってパッケージング細胞中にトランスフェクトされ得る。このような手段として、それだけには限らないが、エレクトロポレーションおよび本明細書において上記で記載されるものなどのリポソームの使用およびＣａＰＯ４沈殿が挙げられる。このような産生株細胞は、一般に、第１のまたは修飾されていない野生型レトロウイルスエンベロープタンパク質、キメラレトロウイルスエンベロープタンパク質および治療薬または診断薬をコードするポリヌクレオチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を作製する。
いくつかの実施形態では、ｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするポリヌクレオチド、非レトロウイルスペプチド（いくつかの実施形態では、野生型レトロウイルスエンベロープタンパク質である）を含まない第１のレトロウイルスエンベロープタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびキメラレトロウイルスエンベロープタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むパッケージング細胞が提供される。いくつかの実施形態では、第１のおよびキメラエンベロープタンパク質を含むレトロウイルスベクター粒子を作製するための産生株細胞は、このようなパッケージング細胞中に、各場合において、治療剤または診断剤をコードするポリヌクレオチドを含む、レトロウイルスベクター粒子またはレトロウイルスプラスミドベクターのいずれかを導入することによって製造される。いくつかの実施形態では、産生株細胞株は、改善されたＨＳＶ−ＴＫコード配列を含むポリヌクレオチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子をこのように作製する。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの製造のためのキット、ａ）核酸配列がプロモーターと作動可能に連結されたレトロウイルスエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む第１のプラスミドを含有する容器と、ｂ）ウイルスｇａｇ−ｐｏｌポリペプチドをコードする、プロモーターと作動可能に連結している核酸配列と、産生株細胞に薬物耐性を付与するポリペプチド、ＳＶ４０複製起点をコードする、プロモーターと作動可能に連結された核酸配列とを含む第２のプラスミドを含有する容器と、ｃ）プロモーターと作動可能に連結された改善されたＨＳＶ−ＴＫコード配列と、５’および３’長い末端反復配列（ＬＴＲ）と、Ψレトロウイルスパッケージング配列と、５’ＬＴＲの上流のＣＭＶプロモーターと、産生株細胞に薬物耐性を付与するポリペプチド、ＳＶ４０複製起点をコードする、プロモーターと作動可能に連結している核酸配列とを含む第３のプラスミドを含有する容器と、ｄ）ＳＶ４０ラージＴ抗原を発現する産生株細胞を含有する容器と、ｅ）ａ）、ｂ）およびｃ）のプラスミドを用いてｄ）の産生株細胞を一時的にトランスフェクトし、ウイルス粒子が製造されるのを可能にする条件下でトランスフェクトされた産生株細胞を培養するための使用説明書とを含むキットが、本明細書において開示される。
本明細書において開示される送達ベクターまたは治療用ベクターは、ウイルスおよび非ウイルス粒子を含むと認識される。例えば、カチオン性リポソームポリカチオンを含めたマイクロ粒子またはナノ粒子などの非ウイルス送達系は、送達系の代替方法を提供し、本開示によって包含される。非ウイルス粒子は、脂質二重層中に、完全にまたは部分的に組み立てられたウイルス粒子を含む、カプセル封入された核タンパク質を含む。ウイルスを脂質二重層中にカプセル封入するための方法は、当技術分野で公知である。それらは、脂質二重層によって包み込まれる小胞（リポソーム）中への受動的封入およびビリオンのリポソームととものインキュベーション（米国特許第５，９６２，４２９号；Fasbender, et al., J. Biol. Chem. 272:6479-6489; Hodgson and Solaiman， Nature Biotechnology 14:339-342 (1996))を含む。理論に捉われようとは思わないが、本発明者らは、ビリオンの表面上に曝露された酸性タンパク質が、送達ベクターまたは治療用ベクターのカチオン性脂質／カチオン性ポリマー成分との複合体形成のための界面を提供し、中性脂質成分による二重膜形成のための「スキャフォールド」として働くと考えた。
非ウイルス送達系の例として、例えば、Wheeler et al.,米国特許第５，９７６，５６７号および同５，９８１，５０１号が挙げられる。これらの特許は、プラスミドの水溶液を、カチオン性および非カチオン性脂質を含有する有機溶液と接触させることによる血清安定プラスミド脂質粒子の調製を開示する。Thierry et al., 米国特許第６，０９６，３３５号は、全体的にアニオン性の生物活性物質、カチオン性成分およびアニオン性成分を含む複合体の調製を開示している。AllenおよびStuart、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１２９３７（ＷＯ９８／５８６３０）は、カチオン性脂質の可溶化に適した脂質溶媒中でポリヌクレオチドカチオン性脂質粒子を形成すること、粒子を含有する溶媒へ中性小胞形成性脂質を添加することおよび脂質溶媒を蒸発させて、ポリヌクレオチドが中に封入されたリポソームを形成することを開示している。AllenおよびStuart、米国特許第６，１２０，７９８号は、第１の、例えば、水性溶媒にポリヌクレオチドを溶解すること、前記の第１の溶媒とは不混和性の、第２の、例えば、有機溶媒中に脂質を溶解すること、第３の溶媒を添加して、単一相の形成を達成することおよび一定量の第１および第２の溶媒をさらに添加して、２つの液相の形成を達成することによってポリヌクレオチド−脂質マイクロ粒子を形成することを開示している。Bally et al.米国特許第５，７０５，３８５号およびZhang et al.米国特許第６，１１０，７４５号は、核酸を、非カチオン性脂質およびカチオン性脂質を含有する溶液と接触させて、脂質−核酸混合物を形成することによって脂質−核酸粒子を調製する方法を開示している。Maurer et al.,ＰＣＴ／ＣＡ００／００８４３（ＷＯ０１／０６５７４）は、小胞を不安定化するが、破壊しない不安定化溶媒中で、予め形成された脂質小胞、荷電治療薬および不安定化剤を組み合わせて、その混合物を形成すること、続いて、不安定化剤を除去することを含む、十分に脂質によってカプセル封入された、荷電治療剤の治療剤粒子を調製する方法を開示している。
粒子形成性成分（「ＰＦＣ」）は、通常、カチオン性脂質などの脂質を、カチオン性脂質以外のＰＦＣと組み合わせて含んでいてもよい。カチオン性脂質は、その分子が、約３〜約１０のｐＨの範囲で、好ましくは、約４〜約９の生理学的ｐＨ範囲で電離して、正味の陽性イオン電荷をもたらすことができる脂質である。このようなカチオン性脂質は、例えば、単一炭化水素鎖を有するカチオン性両親媒性物質などのカチオン性界面活性剤を包含する。特許および科学文献は、核酸トランスフェクション増強特性を有する多数のカチオン性脂質を記載する。これらのトランスフェクション増強性カチオン性脂質として、例えば、１，２−ジオレイルオキシ−３−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニオ）プロパンクロリド−、ＤＯＴＭＡ（米国特許第４，８９７，３５５号）、ＤＯＳＰＡ（Hawley-Nelson, et al., Focus 15(3):73 (1993)を参照のこと）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アンモニウム ブロミドまたはＤＤＡＢ（米国特許第５，２７９，８３３号）、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニオ）プロパンクロリド−ＤＯＴＡＰ（Stamatatos, et al., Biochemistry 27: 3917-3925 (1988)）、グリセロールベースの脂質（Leventis, et al., Biochem. Biophys. Acta 1023:124 (1990)を参照のこと、アルギニル−ＰＥ（米国特許第５，９８０，９３５号）、リシニル−ＰＥ(Puyal, et al. J. Biochem. 228:697 (1995)）、リポポリアミン（米国特許第５，１７１，６７８号）およびコレステロールベースの脂質（ＷＯ９３／０５１６２、米国特許第５，２８３，１８５号）、ＣＨＩＭ（１−（３−コレステリル）−オキシカルボニル−アミノメチルイミダゾール）などが挙げられる。トランスフェクションのためのカチオン性脂質は、例えば、Behr, Bioconjugate Chemistry, 5:382-389 (1994)に概説されている。好ましいカチオン性脂質は、ＤＤＡＢ、ＣＨＩＭまたはそれらの組合せである。カチオン性界面活性剤であるカチオン性脂質の例として、（Ｃ１２−Ｃ１８）−アルキル−および（Ｃ１２−Ｃ１８）−アルケニル−トリメチルアンモニウム塩、Ｎ−（Ｃ１２−Ｃ１８）−アルキル−およびＮ−（Ｃ１２−Ｃ１８）−アルケニル−ピリジニウム塩などが挙げられる。
いくつかの実施形態では、送達ベクターまたは治療用ベクターの大きさは、約４０〜約１５００ｎｍの範囲内である。いくつかの実施形態では、送達ベクターまたは治療用ベクターは、約５０〜５００ｎｍの範囲の大きさである。いくつかの実施形態では、送達ベクターまたは治療用ベクターは、約２０〜１５０ｎｍの範囲の大きさである。この大きさの選択は、送達ベクターが、身体に投与されると、血管から悪性腫瘍などの罹患組織へ浸透し、治療用核酸をその中に移動させるのを有利に補助する。例えば、動的光散乱法によって測定されるようなその大きさが、インビトロ細胞培養培地または血漿などの細胞外生物学的流体の存在下で実質的に増大しないことは、送達ベクターの特徴的で、有利な特性である。
あるいは、いくつかの実施形態では、レトロウイルスを製造する細胞は、腫瘍中に注入される。いくつかの実施形態では、そのように導入されるレトロウイルスを製造する細胞は、ウイルスベクター粒子などの送達ベクターを活発に製造するよう操作され、その結果、ベクターの継続製造が生体内原位置で腫瘍量内で起こる。いくつかの実施形態では、増殖中の腫瘍細胞は、レトロウイルスベクターを製造する細胞に近接することによってインビボで形質導入される。
使用方法
いくつかの実施形態では、標的細胞に、本明細書において開示されるようなＨＳＶ−ＴＫをコードするポリヌクレオチドを提供する方法が、本明細書において開示され、方法は、次いで、毒性物質に変換される適当な基質に対して細胞を曝露して、突然変異体ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子を発現する細胞、突然変異体ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子を発現する細胞の近くのもの、すなわち、バイスタンダー細胞を死滅させることを含む。突然変異体ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子は、ターゲッティングされる細胞または所望の細胞に直接的に、または特定のウイルスベクターまたは送達製剤の選択によってなど、ターゲッティング手段と組み合わせて全身的に投与され得る。細胞は、治療される患者内でインビボで治療され得るか、またはインビトロで治療され、次いで、患者に注入され得る。突然変異体ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子の患者中の細胞への導入後、プロドラッグが、突然変異体ＨＳＶ−１チミジンキナーゼによって、ターゲッティングされる細胞を死滅させるのに十分な量の毒性物質に変換される有効量で全身にまたは局所に投与される。標的細胞を死滅させる毒性物質を生成するＨＳＶ−１ ＴＫの基質であるヌクレオシド類似体は、本明細書において、「プロドラッグ」と呼ばれる。
いくつかの実施形態では、ｉ）細胞に、本明細書において開示されるようなポリヌクレオチドまたはベクターを導入すること、ｉｉ）細胞がチミジンキナーゼを発現するのを可能にするか、または指示することと、ｉｉｉ）細胞を、チミジンキナーゼによって細胞傷害性薬剤に変換される薬剤と接触させることとを含む、細胞を死滅させる方法が、本明細書において開示される。
本発明のいくつかの実施形態では、（ｉ）宿主に、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含むよう遺伝子操作されたＴ細胞を投与することと、（ｉｉ）前記宿主に、移植片対宿主病が発生する前に、チミジンキナーゼによって細胞傷害性薬剤に変換され得る薬剤を、ＧｖＨＤを生じさせることができる遺伝子操作されたＴ細胞を死滅させるのに有効な量で投与することとを含む、患者において移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を防ぐ方法が本明細書において提供される。同種異系骨髄移植の際に、移植片対宿主病を防ぐために移植片からアロ反応性Ｔリンパ球が除去され得る。ＧｖＨＤは、移植された幹細胞移植片中のＴ細胞が、移植レシピエントの身体を攻撃する場合に起こる。しかし、Ｔ細胞の除去は、疾患再発の罹患率、移植片拒絶およびウイルス感染の再活性化を増大し得る。ＧｖＨＤの可能性に対抗するために、同種異系骨髄移植患者は、同種異系の骨髄移植後、遅れてドナーＴリンパ球を導入することによって治療され得る。しかし、同種異系骨髄移植後のドナーＴリンパ球の遅れた導入は、ＧｖＨＤ、治療の頻繁な、致死的となり得る合併症によって制限される。移植レシピエントに、「自殺遺伝子」をコードするポリヌクレオチドを含むよう遺伝子操作されたＴ細胞を投与することによって、Ｔ細胞は、移植レシピエントの身体を攻撃し始めた場合、死滅され得る。
いくつかの実施形態では、宿主において治療剤を発現させるために、キメラレトロウイルスエンベロープタンパク質および治療剤をコードするポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクター粒子が、宿主に投与される。いくつかの実施形態では、治療剤をコードするポリヌクレオチドは、本明細書において開示されるような、ＨＳＶ−ＴＫまたはその突然変異体および／または変異体をコードするポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、細胞は、患者から得られ、治療剤またはポリペプチドを細胞中に導入するために、レトロウイルスベクター粒子が使用され、このような修飾された細胞が患者に投与される。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクター粒子が、患者にインビボで投与され、それによって、レトロウイルスベクター粒子が、患者の細胞をインビボで形質導入する。
いくつかの実施形態では、ｉ）キメラレトロウイルスエンベロープタンパク質と、ｉｉ）治療用ポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドとを含むレトロウイルス粒子を、組織傷害部位に直接的または静脈内で送達することを含む、対象における組織傷害部位に治療剤またはポリペプチドを送達する方法が、本明細書において開示され、ここで、ウイルス粒子は、組織傷害部位で露出するコラーゲンと結合し、組織傷害部位で治療用ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、組織傷害は、腫瘍浸潤、血管病変、潰瘍性病変、炎症性組織傷害、眼のレーザー傷害、手術、関節炎の関節、瘢痕およびケロイドによる組織傷害からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、組織傷害は、宿主における腫瘍の成長による組織の病変である。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示されるような治療用ベクターは、悪性および非悪性腫瘍を含めた癌の治療において使用される。いくつかの実施形態では、治療用ベクターは、細胞外マトリックス結合ペプチドまたはペプチドドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックス結合ペプチドまたはペプチドドメインは、コラーゲン結合ドメインまたはペプチドである。いくつかの実施形態では、腫瘍として、それだけには限らないが、すべての固形腫瘍が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示されるような治療用ベクターは、乳癌、皮膚癌、骨癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、脳癌、喉頭、胆嚢、膵臓、直腸、上皮小体、甲状腺、副腎、神経組織、頭頸部、結腸、胃、気管支、腎臓の癌、基底細胞癌、潰瘍型および乳頭型両方の扁平上皮癌、転移性皮膚癌腫、黒色腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網肉腫（veticulum cell sarcoma）、骨髄腫、巨細胞腫、小細胞肺腫瘍、胆石、島細胞腫瘍、原発性脳腫瘍、急性および慢性リンパ性および顆粒球性腫瘍、ヘアリー細胞腫瘍、腺腫、肥厚化、髄様癌、褐色細胞腫、粘膜ニューロン、腸管神経節神経腫、過形成性角膜神経腫瘍、マルファノイド体質性腫瘍、ウィルムス腫瘍、セミノーマ、卵巣腫瘍、平滑筋腫瘍（leiomyomater tumor）、子宮頸部異形成および上皮内癌腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、軟組織肉腫、悪性カルチノイド、局所皮膚病変、菌状息肉症、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、骨肉腫および他の肉腫、悪性高カルシウム血症、腎細胞腫瘍、真性多血症、腺癌、多形神経膠芽腫、白血病、リンパ腫、悪性メラノーマおよび類表皮癌からなる群から選択される癌の治療において使用される。他の実施形態では、治療されている癌は、膵臓癌、肝臓癌、乳癌、骨肉腫、肺癌、軟組織肉腫、喉頭の癌、黒色腫、卵巣癌、脳癌、ユーイング肉腫または結腸癌である。
他の実施形態では、治療されるべき癌は、原発性肝細胞癌腫、肝臓への転移性乳房癌腫、肝臓への転移性膵臓癌、肝臓への転移性胃癌、肝臓への転移性食道癌、肝臓への転移性肺癌、肝臓への転移性黒色腫、肝臓への転移性卵巣癌腫および肝臓への転移性腎臓癌からなる群から選択される。
治療用ベクターは、単独でまたは他の治療的処置または活性薬剤とともに投与され得る。使用され得る他の活性薬剤の例として、それだけには限らないが、化学療法剤、抗炎症剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤などのプロテアーゼ阻害剤、ＡＺＴなどのヌクレオシド類似体が挙げられる。いくつかの実施形態では、治療方法は、対象に、治療用ウイルス粒子の投与に先立って、それと同時に、またはその後に、化学療法剤、生物学的薬剤または放射線療法を投与することをさらに含む。当業者ならば、本明細書において記載されるレトロウイルス粒子は、１種または複数の薬剤（例えば、レトロウイルスベクターおよび薬剤は両方とも静脈内に投与される）と同一経路によってか、または異なる経路によって（例えば、レトロウイルスベクターは、静脈内に投与され、１種または複数の薬剤は経口的に投与される）のいずれかで投与され得ることは理解するであろう。
治療用ウイルス粒子の投与量は、好ましくは、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあり、毒性はほとんどないかまたは全くない。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変わり得る。治療上有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推定され得る。用量は、細胞培養において決定されるようなＩＣ５０（すなわち、最大半量感染または最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するよう、動物モデルにおいて処方され得る。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、ＲＴ−ｑＰＣＲまたはｄｄＰＣＲ法によって測定され得る。
治療を必要とする対象に投与されるべき本明細書において開示されるレトロウイルス粒子の有効量または治療上有効なものは、種々の方法で決定され得る。例として、量は、動物モデルにおけるウイルス力価または有効性に基づいたものであり得る。あるいは、臨床試験において使用される投与計画は、一般的ガイドラインとして使用され得る。
いくつかの実施形態では、１日用量は、単回用量でまたは１日の種々の時間に小分けして投与され得る。いくつかの実施形態では、最適開始反応が得られる場合には、高投与量が必要とされ得、経時的に低減され得る。いくつかの実施形態では、治療は、数日間、数週間または数年間連続し得、または間隔を置いてであり、介在する休止期間を有し得る。いくつかの実施形態では、投与量は、個体が受けている可能性がある他の治療に従って修飾される。しかし、治療方法は、特定の濃度または範囲のレトロウイルス粒子に決して制限されず、治療されている各個体のためにおよび使用される各誘導体のために変わり得る。
所与の個体に対して最大効果を達成するために、投与量の個別化が必要とされ得る。いくつかの実施形態では、治療されている個体に投与される投与量は、個体の年齢、疾患の重症度またはステージおよび治療の経過に対する応答に応じて変わる。いくつかの実施形態では、投与量を決定するための臨床パラメータとして、それだけには限らないが、腫瘍の大きさ、特定の悪性度について臨床試験において使用される腫瘍マーカーのレベルの変更が挙げられる。いくつかの実施形態では、治療医師が、所与の個体のために使用されるべき治療有効量を決定する。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される療法は、必要なだけ、治療医師によって必要と判断される期間投与される。
それだけには限らないが、対象の細胞または系に対して特異的である治療用レトロウイルス粒子を含めた治療用ベクターは、治療を必要とする対象に、全身にかまたは領域的に（局所的に）送達される。例えば、治療用ベクターは、静脈内に全身に投与され得る。あるいは、治療用ベクターはまた、動脈内に投与され得る。治療用ベクターはまた、局所的に、静脈内に、動脈内に、腫瘍内に、結腸内に、気管内に、腹膜内に、鼻腔内に、血管内に、くも膜下腔内に、頭蓋内に、骨髄内に、胸膜内に、皮内に、皮下に、筋肉内に、眼内に、骨内におよび／または滑膜内にまたは定位的に（sterotactically）投与され得る。送達様式の組合せも使用され得、例えば、患者は、治療用ベクターの治療を用いて腫瘍反応を改善するために治療用ベクターを全身におよび領域的に（局所的に）受け取り得る。
いくつかの実施形態では、治療と必要とする対象に、複数の治療経過（例えば、第１および第２の治療経過）が投与される。いくつかの実施形態では、第１および／または第２の治療経過が、静脈内に投与される。他の実施形態では、第１および／または第２の治療経過は、それだけには限らないが、肝動脈、大動脈、冠動脈、肺動脈、腸骨動脈、腸腔動脈、胃動脈、脾動脈、腎動脈、生殖腺動脈、鎖骨下動脈、椎骨動脈、腋窩動脈、上腕動脈、橈骨動脈、尺骨動脈、頸動脈、大腿動脈、下腸間膜動脈および／または上腸間膜動脈による注入を含めた動脈内注入によって投与される。動脈内注入は、血管内手順、経皮的手順または開腹外科的アプローチを使用して達成され得る。いくつかの実施形態では、第１および第２の治療経過は、逐次投与され得る。さらに他の実施形態では、第１および第２の治療経過は、同時に投与され得る。さらに他の実施形態では、任意選択の第３の治療経過が、第１および第２の治療経過と逐次または同時に投与され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される治療用ベクターは
累積方式で高用量で、逐次または同時投与された治療経過（単数または複数）とともに投与され得る。例えば、いくつかの実施形態では、それを必要とする患者は、全身に投与され得る、例えば、累積方式で少なくとも１×１０９ＴＶＰ、少なくとも１×１０１０ＴＶＰ、少なくとも１×１０１１ＴＶＰ、少なくとも１×１０１２ＴＶＰ、少なくとも１×１０１３ＴＶＰ、少なくとも１×１０１４ＴＶＰ、少なくとも１×１０１５ＴＶＰ、少なくとも１×１０１６ＴＶＰ、少なくとも１×１０１７ＴＶＰ、少なくとも１×１０１８ＴＶＰ、少なくとも１×１０１９ＴＶＰ、少なくとも１×１０２０ＴＶＰ、少なくとも１×１０２１ＴＶＰまたは少なくとも１×１０２２ＴＶＰの送達ベクターの第１の治療経過を用いて静脈内に投与され得る。第１の治療経過は全身に投与され得る。あるいは、第１の治療経過は、局所法で、例えば、動脈内に投与され得る、例えば、それを必要とする患者は、累積方式で、少なくとも１×１０９ＴＶＰ、少なくとも１×１０１０ＴＶＰ、少なくとも１×１０１１ＴＶＰ、少なくとも１×１０１２ＴＶＰ、少なくとも１×１０１３ＴＶＰ、少なくとも１×１０１４ＴＶＰ、少なくとも１×１０１５ＴＶＰ、少なくとも１×１０１６ＴＶＰ、少なくとも１×１０１７ＴＶＰ、少なくとも１×１０１８ＴＶＰ、少なくとも１×１０１９ＴＶＰ、少なくとも１×１０２０ＴＶＰ、少なくとも１×１０２１ＴＶＰまたは少なくとも１×１０２２ＴＶＰの送達ベクターを用いて動脈内注入によって投与され得る。
さらに他の実施形態では、それを必要とする対象は、高用量の送達ベクターの全身および動脈内注入投与の組合せを、逐次または同時のいずれかで受け取り得る。例えば、それを必要とする患者は、まず、累積方式で少なくとも１×１０９ＴＶＰ、少なくとも１×１０１０ＴＶＰ、少なくとも１×１０１１ＴＶＰ、少なくとも１×１０１２ＴＶＰ、少なくとも１×１０１３ＴＶＰ、少なくとも１×１０１４ＴＶＰ、少なくとも１×１０１５、少なくとも１×１０１６ＴＶＰ、少なくとも１×１０１７ＴＶＰ、少なくとも１×１０１８ＴＶＰ、少なくとも１×１０１９ＴＶＰ、少なくとも１×１０２０ＴＶＰ、少なくとも１×１０２１ＴＶＰまたは少なくとも１×１０２２ＴＶＰの送達ベクターを用いて全身に、続いて、動脈内注入、例えば、肝動脈注入のさらなる治療経過、累積方式で、少なくとも１×１０９ＴＶＰ、少なくとも１×１０１０ＴＶＰ、少なくとも１×１０１１ＴＶＰ、少なくとも１×１０１２ＴＶＰ、少なくとも１×１０１３ＴＶＰ、少なくとも１×１０１４ＴＶＰ、少なくとも１×１０１５ＴＶＰ、少なくとも１×１０１６ＴＶＰ、少なくとも１×１０１７ＴＶＰ、少なくとも１×１０１８ＴＶＰ、少なくとも１×１０１９ＴＶＰ、少なくとも１×１０２０ＴＶＰ、少なくとも１×１０２１ＴＶＰまたは少なくとも１×１０２２ＴＶＰの投与される送達ベクターを用いて投与され得る。さらに別の実施形態では、それを必要とする患者は、動脈内注入および高用量の送達ベクターの全身投与の組合せを受け取り得る。例えば、それを必要とする患者は、まず、累積方式で、少なくとも１×１０９ＴＶＰ、少なくとも１×１０１０ＴＶＰ、少なくとも１×１０１１ＴＶＰ、少なくとも１×１０１２ＴＶＰ、少なくとも１×１０１３ＴＶＰ、少なくとも１×１０１４ＴＶＰ、少なくとも１×１０１５ＴＶＰ、少なくとも１×１０１６ＴＶＰ、少なくとも１×１０１７ＴＶＰ、少なくとも１×１０１８ＴＶＰ、少なくとも１×１０１９ＴＶＰ、少なくとも１×１０２０ＴＶＰ、少なくとも１×１０２１ＴＶＰまたは少なくとも１×１０２２ＴＶＰの送達ベクターを用いる動脈内注入によって、続いて、累積方式で、少なくとも１×１０９ＴＶＰ、少なくとも１×１０１０ＴＶＰ、少なくとも１×１０１１ＴＶＰ、少なくとも１×１０１２ＴＶＰ、少なくとも１×１０１３ＴＶＰ、少なくとも１×１０１４ＴＶＰ、少なくとも１×１０１５ＴＶＰ、少なくとも１×１０１６ＴＶＰ、少なくとも１×１０１７ＴＶＰ、少なくとも１×１０１８ＴＶＰ、少なくとも１×１０１９ＴＶＰ、少なくとも１×１０２０ＴＶＰ、少なくとも１×１０２１ＴＶＰまたは少なくとも１×１０２２ＴＶＰの全身投与される送達ベクターのさらなる治療経過によって投与され得る。治療経過はまた、同時に投与され得る、すなわち、例えば、動脈内注入、例えば、肝動脈注入の治療経過、累積方式で、少なくとも１×１０９ＴＶＰ、少なくとも１×１０１０ＴＶＰ、少なくとも１×１０１１ＴＶＰ、少なくとも１×１０１２ＴＶＰ、少なくとも１×１０１３ＴＶＰ、少なくとも１×１０１４ＴＶＰ、少なくとも１×１０１５ＴＶＰ、少なくとも１×１０１６ＴＶＰ、少なくとも１×１０１７ＴＶＰ、少なくとも１×１０１８ＴＶＰ、少なくとも１×１０１９ＴＶＰ、少なくとも１×１０２０ＴＶＰ、少なくとも１×１０２１ＴＶＰまたは少なくとも１×１０２２ＴＶＰの投与される送達ベクターと一緒の、累積方式で、少なくとも１×１０９ＴＶＰ、少なくとも１×１０１０ＴＶＰ、少なくとも１×１０１１ＴＶＰ、少なくとも１×１０１２ＴＶＰ、少なくとも１×１０１３ＴＶＰ、少なくとも１×１０１４ＴＶＰ、少なくとも１×１０１５ＴＶＰ、少なくとも１×１０１６ＴＶＰ、少なくとも１×１０１７ＴＶＰ、少なくとも１×１０１８ＴＶＰ、少なくとも１×１０１９ＴＶＰ、少なくとも１×１０２０ＴＶＰ、少なくとも１×１０２１ＴＶＰまたは少なくとも１×１０２２ＴＶＰの送達ベクターの高用量の送達ベクターの治療経過。
さらに他の実施形態では、それを必要とする対象はさらに、第１および第２の治療経過と逐次または同時のいずれかで、送達ベクター、例えば、累積方式で、少なくとも１×１０９ＴＶＰ、少なくとも１×１０１０ＴＶＰ、少なくとも１×１０１１ＴＶＰ、少なくとも１×１０１２ＴＶＰ、少なくとも１×１０１３ＴＶＰ、少なくとも１×１０１４ＴＶＰ、少なくとも１×１０１５ＴＶＰ、少なくとも１×１０１６ＴＶＰ、少なくとも１×１０１７ＴＶＰ、少なくとも１×１０１８ＴＶＰ、少なくとも１×１０１９ＴＶＰ、少なくとも１×１０２０ＴＶＰ、少なくとも１×１０２１ＴＶＰまたは少なくとも１×１０２２ＴＶＰの送達ベクターの累積用量のさらなる治療経過（例えば、第３の治療経過、第４の治療経過、第５の治療経過）を受け取り得る。
いくつかの実施形態では、治療を必要とする対象は、少なくとも１×１０１１ＴＶＰの用量を全身に（例えば、静脈内に）投与され、続いて、少なくとも１×１０１１ＴＶＰの用量の動脈内注入（例えば、肝動脈注入）によって投与される。他の実施形態では、治療を必要とする患者は、少なくとも１×１０１２ＴＶＰの累積用量を全身に（例えば、静脈内に）投与され、続いて、少なくとも１×１０１２ＴＶＰの用量の動脈内注入（例えば、肝動脈注入）によって投与され得る。一実施形態では、治療を必要とする患者は、少なくとも１×１０１３ＴＶＰの用量を全身に（例えば、静脈内に）投与され、続いて、少なくとも１×１０１３ＴＶＰの用量の動脈内注入（例えば、肝動脈注入）によって投与され得る。さらに他の実施形態では、治療を必要とする患者は、少なくとも１×１０１４ＴＶＰの用量を全身に（例えば、静脈内に）投与され、同時に、少なくとも１×１０１４ＴＶＰの用量の動脈内注入（例えば、肝動脈注入）によって投与され得る。さらに他の実施形態では、治療を必要とする患者は、少なくとも１×１０１５ＴＶＰの用量を全身に（例えば、静脈内に）投与され、一緒に、少なくとも１×１０１５ＴＶＰの用量の動脈内注入（例えば、肝動脈注入）によって投与され得る。さらに他の実施形態では、治療を必要とする患者は、少なくとも１×１０１６ＴＶＰの用量を全身に（例えば、静脈内に）投与され、同時に、少なくとも１×１０１６ＴＶＰの用量の動脈内注入（例えば、肝動脈注入）によって投与され得る。さらに他の実施形態では、治療を必要とする患者は、少なくとも１×１０１３ＴＶＰの用量を全身に（例えば、静脈内に）投与され、一緒に、少なくとも１×１０１７ＴＶＰの用量の動脈内注入（例えば、肝動脈注入）によって投与され得る。
治療を必要とする対象はまた、全身にかまたは局所に（例えば、肝動脈注入などの動脈内注入）のいずれかで、送達ベクターの治療経過を既定の期間投与され得る。いくつかの実施形態では、期間は、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１０ヶ月、少なくとも１１ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年または少なくとも５年であり得る。投与は、慢性的な方法で、すなわち、規定されないかまたは不確定の期間起こり得る。
治療用ベクターの投与はまた、周期的な方法で、例えば、少なくとも１日１回、少なくとも１日２回、少なくとも１日３回、少なくとも１日４回、少なくとも１日５回起こり得る。送達ベクターの周期的投与は、送達ベクターの時間ならびに投与様式に応じて変わり得る。例えば、非経口投与は、長期間にわたって１日に１回のみ起こり得るが、送達ベクターの経口投与は、１日に２回以上起こり得、これでは、送達ベクターの投与は、短期間にわたって起こる。
一実施形態では、対象は、第１の治療経過と第２の治療経過との間に１〜２日休止することが許される。いくつかの実施形態では、対象は、第１の治療経過と第２の治療経過との間に２〜４日休止することが許される。他の実施形態では、対象は、第１と第２の治療経過との間に少なくとも２日間休止することが許される。さらに他の実施形態では、対象は、第１と第２の治療経過との間に少なくとも４日間休止することが許される。さらに他の実施形態では、対象は、第１と第２の治療経過との間に少なくとも６日間休止することが許される。いくつかの実施形態では、対象は、第１と第２の治療経過との間に少なくとも１週間休止することが許される。さらに他の実施形態では、対象は、第１と第２の治療経過との間に少なくとも２週間休止することが許される。一実施形態では、対象は、第１と第２の治療経過との間に少なくとも１ヶ月休止することが許される。いくつかの実施形態では、対象は、第２の治療経過と任意選択の第３の治療経過との間に少なくとも１〜７日休止することが許される。さらに他の実施形態では、対象は、第２の治療経過と任意選択の第３の治療経過との間に少なくとも１〜２週間休止することが許される。
いくつかの実施形態では、治療用ベクターは、ペプチドまたはベクターの局所濃度を増大するよう投与される。いくつかの実施形態では、治療用ベクターは、特定の臓器系の治療用ベクターの局所濃度を増大する動脈内注入によって投与される。さらに他の実施形態では、治療用ベクターは、腫瘍内に投与される。いくつかの実施形態では、標的病変の位置に応じて、肝病変を局所的にターゲッティングするために、肝動脈のカテーテル留置に、それぞれ、脾十二指腸、右肝および中肝動脈中への注入が続けられる。いくつかの実施形態では、ペプチドまたは送達ベクターの、肺、胃腸管、脳、生殖系、脾臓または他の既定の臓器系を含めた他の臓器系への局在化された分布は、カテーテル留置または他の局在化される送達系によって達成される。いくつかの実施形態では、動脈内注入は、それだけには限らないが、肝動脈、大動脈、冠動脈、肺動脈、腸骨動脈、腸腔動脈、胃動脈、脾臓動脈、腎動脈、生殖腺動脈、鎖骨下動脈、椎骨動脈、腋窩動脈、上腕動脈、橈骨動脈、尺骨動脈、頸動脈、大腿動脈、下腸間膜動脈および／または上腸間膜動脈による注入を含め、任意の他の利用可能な動脈性供給源によって達成される。いくつかの実施形態では、動脈内注入は、血管内手順、経皮的手順または開腹手術アプローチを使用して達成される。
製剤
治療用ベクターを含む医薬組成物は、選択された量の治療用ベクターを、１種または複数の生理学的に許容される担体または賦形剤と混合することによって任意の従来法で製剤化され得る。例えば、治療用ベクターは、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）などの担体中に懸濁され得る。活性化合物は、例えば、経口的に、非経口的に、静脈内に、皮内に、皮下にまたは局所に、液体、半液体または固体形態で任意の適当な経路によって投与され得、各投与経路に適した方法で．製剤化される。
いくつかの実施形態では、治療用ベクターおよび生理学的に許容される塩および溶媒和物は、吸入または吹送による投与（口または鼻のいずれかによる）のために、または経口、頬側、非経口もしくは直腸投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、吸入による投与のために、治療用ベクターは、適した噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラ−フルオロエタン、二酸化炭素または他の適したガスの使用を伴う、加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレー提示の形態で送達される。いくつかの実施形態では、加圧されたエアゾール投与量単位または定量を送達するためのバルブ。いくつかの実施形態では、吸入具または吸入器において使用するための、治療用化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適した粉末基剤の粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチンの）が製剤化される。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、増量剤（例えば、ラクトース、微晶質セルロースまたはリン酸水素カルシウム）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの医薬上許容される賦形剤とともに、従来手段によって調製された錠剤またはカプセル剤として経口投与するために製剤化される。いくつかの実施形態では、錠剤は、当技術分野で周知の方法によってコーティングされる。いくつかの実施形態では、経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップもしくは懸濁液の形態であり、またはそれらは使用前に水もしくは他の適した媒体を用いて構成するための無水生成物として製剤化される。いくつかの実施形態では、このような液体調製物は、沈殿防止剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油）および保存料（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの医薬上許容される添加物を用いて従来手段によって調製される。いくつかの実施形態では、調製物はまた、必要に応じて、バッファー塩、芳香料、着色料および甘味料を含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、活性化合物の制御された放出を与える製剤化された経口投与である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、従来法で製剤化された錠剤またはロゼンジ剤の形態で頬側用に製剤化される。
いくつかの実施形態では、治療用ベクターは、注射による、例えば、ボーラス注射による、または連続注入による非経口投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、注射用製剤は、単位剤形で、例えば、添加された防腐剤とともに、アンプル中または複数回用量容器中にある。いくつかの実施形態では、組成物は油性または水性媒体中の、懸濁液、溶液またはエマルジョンとして製剤化される。いくつかの実施形態では、製剤は、沈殿防止剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含む。あるいは、いくつかの実施形態では、有効成分は、使用前に、適した媒体、例えば、滅菌パイロジェンフリー水を用いて構成するための粉末凍結乾燥形態である。
いくつかの実施形態では、治療用ベクターは、デポー調製物として製剤化される。いくつかの実施形態では、このような長時間作用型製剤は、移植（例えば、皮下にまたは筋肉内に）によってかまたは筋肉内注射によって投与される。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、治療用化合物は、適したポリマー材料または疎水性材料（例えば、許容されるオイル中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂を用いて、または難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として製剤化される。
いくつかの実施形態では、活性剤は、ゲル、クリームおよびローションの形態で、皮膚および粘膜への局所（topical）適用用など、眼中などの、局所（local）または局所（topical）適用用に、眼への適用用に、または大槽内もしくは脊髄内適用用に製剤化される。いくつかの実施形態では、このような溶液、特に、眼の使用用に意図されるものは、適当な塩を用いて０．０１％〜１０％の等張性溶液、ｐＨ約５〜９として製剤化される。いくつかの実施形態では、化合物は、吸入によるなどの局所適用用エアゾールとして製剤化される。
薬物組成物中の活性化合物の濃度は、活性化合物の吸収、不活性化および排泄速度、投与量スケジュールおよび投与される量ならびに当業者に公知の他の因子に応じて変わる。
いくつかの実施形態では、組成物は、有効成分を含有する１種または複数の単位剤形を含むパックまたはディスペンサー装置中で提示される。いくつかの実施形態では、ブリスターパックなどのパックは、金属またはプラスチックホイルを含み得る。いくつかの実施形態では、パックまたはディスペンサー装置は、投与のための使用説明書を伴う。
いくつかの実施形態では、活性薬剤は、パッケージング材料、本明細書において提供される薬剤および薬剤が提供される障害を示す表示を含有する製造品としてパッケージングされる。
動物モデル
いくつかの実施形態では、本明細書において上記で記載されるレトロウイルスベクター粒子は、遺伝子療法治療の有効性の研究のための動物モデルの一部として、動物にインビボで投与される。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクター粒子は、同一種の異なる動物に変動する用量で投与される。次いで、動物は、所望の治療剤または診断剤のインビボ発現について評価される。いくつかの実施形態では、このような評価から得られたデータから、当業者は、ヒト患者に投与されるべきレトロウイルスベクター粒子の量を決定する。
キット
また、本明細書に記載される方法において使用するための組成物を含むキットまたは薬物送達系も提供される。本明細書に記載されるレトロウイルス粒子の投与に必要なすべての必須材料および試薬は、キットに集められ得る（例えば、パッケージング細胞コンストラクトまたは細胞株、サイトカイン発現ベクター）。キットの成分は、上記のような種々の製剤で提供され得る。１種または複数の治療用レトロウイルス粒子は、１種または複数の薬剤（例えば、化学療法剤）とともに単一の医薬上許容される組成物または別個の医薬上許容される組成物に製剤化され得る。
これらのキットまたは薬物送達系の成分は、乾燥形態または凍結乾燥形態で提供され得る。試薬または成分が、乾燥形態として提供される場合には、再構成は、一般に、別の容器手段中で提供され得る適した溶媒の添加によってである。
キットの容器手段は、一般に、少なくとも１種の物質が入れられ得る、少なくとも１種のバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジおよび／または他の容器手段を含み得る。
本明細書において開示されるキットはまた、レトロウイルス粒子の投与量および／または投与情報に関する使用説明書を含み得る。使用説明書は、治療方法を含めた本明細書に記載される方法のいずれかを実施するための使用説明書を含み得る。使用説明書は、満足のいく臨床エンドポイントの適応症または生じ得る任意の不都合な症状またはヒト対象で使用するために食品医薬品局などの監督官庁によって必要とされるさらなる情報をさらに含み得る。
使用説明書は、キット内のまたはキットに貼られた、「印刷物」で、例えば、紙またはボール紙で、またはキットもしくはパッケージング材料に貼られた、もしくはキットの成分を含有するバイアルもしくは試験管に取り付けられた表示であり得る。使用説明書は、ディスク（フロッピーディスケットまたはハードディスク）、ＣＤ−またはＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭなどの光学ＣＤ、磁気テープ、ＲＡＭおよびＲＯＭなどの電気的ストラージ媒体、ＩＣチップおよび磁気／光学ストラージ媒体などのこれらのハイブリッドなどのコンピュータで読み取り可能な媒体にさらに含まれ得る。
いくつかの実施形態では、キットまたは薬物送達系は、例えば、中に所望のバイアルが保持される注射または中空成形プラスチック容器などの商業的販売のための厳重な管理下にあるバイアルを含有するための手段を含む。容器の数または種類に関わらず、キットはまた、対象の身体内に最終的な複合組成物を注射／投与または配置するのを補助する機器を含み得るかまたはそれを用いてパッケージングされ得る。このような機器は、アプリケーター、吸入具、シリンジ、ピペット、鉗子、計量スプーン、点滴器または任意のこのような医学的に承認された送達媒体であり得る。
パッケージおよびキットは、例えば、製品説明、投与様式および／または治療の適応症を明記する表示をさらに含み得る。本明細書において提供されるパッケージは、本明細書において記載される組成物のいずれかを含み得る。パッケージはさらに、１種または複数の疾患および／または状態を治療するための表示を含み得る。
用語「パッケージング材料」とは、キットの成分を収納する物理的構造を指す。パッケージング材料は、成分を無菌的に維持し得、このような目的のために一般的に使用される材料（例えば、紙、波型のファイバー、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプルなど）からなり得る。表示または添付文書は、適当な書面による使用説明書を含み得る。したがって、キットはさらに、本明細書に記載される任意の方法においてキット成分を使用するための表示または使用説明書を含み得る。キットは、パックまたはディスペンサー中の化合物を、本明細書に記載される方法において化合物を投与するための使用説明書と一緒に含み得る。
当業者が、本明細書に記載される組成物および方法をより良好に実施できるために、例示目的で以下の実施例を提供する。
実施例１：細胞株作製
第１に、３または４種のプラスミド系をリン酸カルシウム試薬を用いて２９３Ｔ細胞にトランスフェクションすることによってレトロウイルス上清を作製する。上清を０．４５μｍのフィルターをとおして濾過する。濾過された上清は、新鮮なままで、４８時間までは４℃で、または−８０℃で貯蔵されて使用され得る。
細胞株を、６ウェル組織培養ディッシュに１×１０４個の細胞／ウェルを播種することによって作製する。翌日、８μｇ／ｍＬポリブレンを用いてレトロウイルス上清を１６〜２４時間添加し、適当な用量の選択薬（Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはピューロマイシン）を用いて選択する。選択薬の用量は、細胞に対する過剰な毒性を避けるために、非ＨＳＶ−ＴＫ細胞で薬物の添加後少なくとも４日で１００％死滅を引き起こすための最小量とする。
実施例２：ＧＣＶ感受性アッセイ
ＨＳＶ−ＴＫまたはその突然変異体および／または変異体を発現する細胞を、６ウェルディッシュに１×１０５個で播種する。翌日、ＧＣＶの５種の段階１０倍希釈を、１ｍＭ〜０．１μｍの範囲の最終濃度を用いて添加する。ＧＣＶ処理の３（３）日後、メチレンブルーを添加して、生細胞を染色する。
実施例３：バイスタンダーアッセイ
細胞を、０〜１００％の範囲のＴＫ細胞の混合物とともに、９６ウェルプレートに１〜４×１０４個の細胞／ウェルで３連で播種する。翌日、ＧＣＶを１０μｍ〜１ｍＭの範囲の用量で添加する。ＧＣＶ添加の２０〜２４時間後、コンフルエンシーの細胞プレートを１：３０で分割して、３プレートする。５日後、細胞を、Ｐｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅによって生細胞代謝について分析し、マイクロプレートリーダーで読み取る。Ｐｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅによって、ＧＣＶ処理の３日後にサブコンフルエンシーの細胞プレートを分析する。
１アッセイでは、本発明らが使用したＨＳＶ−ＴＫクローン細胞株は、ネオマイシン−ＨＳＶ−ＴＫ、ハイグロマイシン−ＨＳＶ−ＴＫ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）−ＨＳＶ−ＴＫ細胞株および使用して作製し、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子のいくつかの突然変異体を比較した。
ＲｅｘＣ２は、改善された型の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）を保持する。ＲｘＣ２を用いて効率的に感染した（形質導入した）細胞宿主は、そのゲノム中にウイルスＴＫを組み込み、この酵素を発現する。ＨＳＶ−ＴＫは、分裂細胞における新規に合成されたＤＮＡへのその組込みのためにＤＮＡ塩基チミジンをリン酸化する。
細胞播種およびＧＣＶ処理の通常の９６ウェルプレートプランは、以下の表に示されている（ＨＫ＝ＨＳＶ−ＴＫ）：
Figure 2016519570
バイスタンダーアッセイ実験の図式結果が図１９および２０に示されている。
種々の突然変異体ＨＳＶ−ＴＫおよびクローン集団を使用して、４０種を超えるバイスタンダーアッセイを実施した。
データは、ＧＣＶ感受性および酵素動態学測定値および潜在力を有する突然変異体の製造物のウイルス力価を用いてまとめた。
すべてのこれらのパラメータの注意深い調査によって、Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ Ｃ−２中のＴＫ遺伝子である突然変異体ＨＳＶ−ＴＫ１６８ｄｍＮＥＳの選択が可能となった。
実施例４：リアルタイムＰＣＲによるＴＫ ＲＮＡのスプライシングされた形態の定量化
ＨＳＶ−ＴＫのスプライシングされていない切断型形態を、ｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にサブクローニングする。ＴａｑＭａｎ（登録商標）／ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システムを使用して、ＨＳＶ−ＴＫのスプライシングされていない形態およびスプライシングされた形態を選択的に増幅および検出できるプライマーおよびプローブの２種の異なるセットを用いて、２種の定量的リアルタイムＰＣＲを設定する。ＨＳＶ−ＴＫスプライシングされていない形態については、プライマーおよびプローブを、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子のスプライシングされる領域中に設計する。
スプライシングされていない形態のリアルタイムＰＣＲを、１００〜５００ｎｇのゲノムＤＮＡまたは１０μｌのｃＤＮＡ、１×ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、３００ｎＭの２種のプライマーＴＫｗｔｆｏｒ（５’−ＣＧＧ ＣＧＧ ＴＧＧ ＴＡＡ ＴＧＡ ＣＡＡ Ｇ−３’）およびＴｋｗｔｒｅｖ（５’−ＧＣＧ ＴＣＧ ＧＴＣ ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＡ−３’）の各々および２００ｎＭのＴＫｗｔ ＭＧＢプローブ（５’−ＦＡＭ ＣＣＡ ＧＡＴ ＡＡＣ ＡＡＴ ＧＧＧ Ｃ−３’）を含有する２５μｌの反応混合物中で実施する。
スプライスジャンクションを包含するＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを、ＨＳＶ−ＴＫのスプライシングされた形態を選択的に検出するよう設計する。ＴＫのスプライシングされた（切断型）形態に特異的な定量的リアルタイムＰＣＲを、１００〜５００ｎｇのゲノムＤＮＡまたは１０μｌのｃＤＮＡ、１×Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３００ｎＭの２種のプライマーの各々を含有する２５μｌの反応混合物中で実施した。熱サイクル条件は、以下のとおりである：５０℃で２分間のＵＮＧの最初の活性化、続く、９５℃で１５分間のＴａｑ Ｇｏｌｄの活性化およびＵＮＧの不活性化。その後、９５℃で１５秒および６０℃で１分間で４０サイクルの増幅を実施する。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）光学９６ウェル反応プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、両ＰＣＲを並行して実施する。ＰＣＲサイクル３〜１５から平均ベースライン蛍光を算出し、Ｃｔをリポーター色素の正規化された蛍光強度が０．０５に等しいＰＣＲサイクルと規定した。Ｃｔ値をＤＮＡの初期投入量の対数に対してプロットすることによって、各ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイにおいて既知コピー数（１０＜６＞〜４コピー／反応）を用いて２種の標準曲線を作成する。標準希釈物およびｃＤＮＡサンプルを、それぞれ、２連、３連で分析する。
実施例５：臨床試験
原発性肝細胞癌腫または肝臓に転移性の腫瘍を有する難治性対象において用量漸増試験を実施して、Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２（チミジンキナーゼおよびＧＭ−ＣＳＦ遺伝子）の安全性、薬物動態および薬物動力学を評価した。
背景および論理的根拠
Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２は、対象の治療用タンパク質をコードする内部ペイロードを含有する遺伝子送達プラットフォームを含む。遺伝子送達プラットフォームは、世界中で２８０人を超える対象に投与されており、およそ２７０人の対象が、ペイロードとしてｄｎＧ１を含有するベクターを用いて（Ｒｅｘｉｎ−Ｇ）、１６人の対象がペイロードとしてチミジンキナーゼ（ｖＴＫ）および免疫促進剤顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を用いて（Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ）治療された。遺伝子送達プラットフォームは、高度に遺伝子操作された非組換えマウスモロニーウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）である。これまでに、難治性原発性または転移性固形腫瘍を有する対象においてＲｅｘｉｎ−ＧおよびＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃの組合せを調べる第Ｉ相用量漸増試験が実施された（Ｇｅｎｅｖｉｅｖｅ試験）。この提案された第Ｉ相臨床試験（Ｇｅｎｅｖｉｅｖｅ２試験と題された）は、チミジンキナーゼおよびＧＭ−ＣＳＦの組合せ中で改善された形態のチミジンキナーゼを使用して、Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２単独−Ｒｅｘｉｎ−Ｇを伴わない−を調べて行われた試験の延長である。
元のＧｅｎｅｖｉｅｖｅ試験では、１６人の対象が、８．０×１０１０ｃｆｕｓ（ｐｔｓ数＝７）である最高用量群および最長期間６サイクル（３〜６サイクルの範囲）において、平均曝露で３用量レベルにわたって補充された。研究のパートＡについては、治療は、これまでに決定された安全な、有効な（最適）用量のＲｅｘｉｎ−Ｇおよび漸増用量のＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃからなっていた。具体的には、１サイクルとして、１、３、５、８、１０および１２日目にＲｅｘｉｎ−Ｇ、２×１０１１ｃｆｕ、３日目にＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ、１．０、２．０または３．０×１０１０ｃｆｕ（それぞれ、用量レベルＩ、ＩＩ、ＩＩＩ）および６〜１９日目に１ｇｍ ｐ．ｏ．１日３回でバラシクロビル。研究のパートＢパートについては、毒性がなかったか、毒性がグレード１以下に消滅した対象が、合計６治療サイクルまで療法のさらなるサイクルを受け取ることができた。
いずれの用量レベルでも用量を制限する毒性はなかった。研究中の１６人の対象について無関係の有害事象が報告されたが、事象の数は少なく（ほとんどの場合に、望ましい期間あたり１または２の出現）、ほとんどは、グレード１または２であった。２人の対象において関連非重篤有害事象が起こり、両方ともグレード２であった。４人の対象は、重篤有害事象を経験し、それらのすべては、研究薬物と関連していないと考えられた。
この第Ｉ相試験の継続の論理的根拠は、（１）チミジンキナーゼ自体が、特に、その腫瘍がバイスタンダー効果を実証する対象において有効な抗癌剤であると証明し得ること（２）対象の国際グループへの今までの遺伝子送達プラットフォームの投与が、極めて高度の安全性を実証したことおよび（３）動物における体内分布が、肝臓への高度の体内分布を示唆することである。さらに、ＧＭ−ＣＳＦの添加は、適当な免疫細胞の補充による免疫学的効果および腫瘍関連抗原による腫瘍細胞死滅の増強に寄与し得る。
ウイルス粒子の体内分布は、肝臓へが最高であり、脾臓、次いで、肺が続く。これが、肝細胞腫瘍に最初に焦点を合わせることの論理的根拠であり、ここで、用量強度が最高でなくてはならない。また、これらの癌の有効な抗癌剤に対して、高い臨床的に満たされていない要求がある。
本明細書において開示される実施形態は、特定の方法および成分および記載されるその他のプロセスに制限されないが、これはこれらが変わり得るからであるということは理解される。本明細書において使用される技術用語は、単に特定の実施形態を説明する目的で使用されるのであって、本発明の範囲を制限するよう意図されないということも理解されるべきである。本明細書においておよび、添付の特許請求の範囲において、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、別に明確に指示しない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「タンパク質」への言及は、１種または複数のタンパク質への言及であり、当業者に公知のその等価物などを含むということも留意しなくてはならない。
別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。具体的な方法、装置および材料が記載されているが、本明細書に記載されるものと同様の任意の方法および材料または等価物は、本発明の実施または試験において使用され得る。
学術論文、書籍、マニュアル、公開特許出願および交付済み特許を含めた、本明細書において引用されたすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語および語句の意味が提供される。定義は、本来、制限であるものではなく、本発明の特定の態様のより明確な理解を提供するよう働く。
実施例６：遺伝子療法適用のための臨床試験
この臨床試験は、２相に分割される：５日のうち３日で、Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２を単回静脈内用量として投与する第ＩＡ相。バルガンシクロビル（ガンシクロビルの経口形態）投薬を、ＰＥＴスキャン結果に関わらず８日目に５日間開始する。およそ１週間の休薬期間が続く。各サイクルは３週間の期間とする。
用量制限毒性（ＤＬＴ）を経験するまで、またはＮＣＩ−ＣＴＣグレード２毒性の２症例が研究薬によって起こるまで（悪心／嘔吐、疲労、拒食症、脱毛症または貧血を除く）、第１およびその後のコホートにおいて３人の患者とする。ＤＬＴがない場合には、対象は次の用量レベルに移動する。ＤＬＴがない場合には、コホートは、６人の患者に拡大され、２人以上の患者がＤＬＴを示す場合には、用量レベルは進行しない。
最大投与用量（ＭＡＤ）に到達すると、ＤＬＴがなかったコホート用量で出発し、ある用量レベルで２人の患者において用量制限毒性が観察されるまで継続する、修飾されたフィボナッチスケジュールが続く。推奨される第２相用量（ＲＰ２Ｄ）が規定されると、６〜１２人の患者が補充される。
第ＩＢ相は、第ＩＡ相データに基づいて既定の腫瘍種およびステージの、１用量（ＲＰ２Ｄ）のＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２後、３〜６日目に［１８Ｆ］ＦＨＢＧスキャン陽性である患者において、Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２の活性を調査するために設計される。スキャンが陽性である場合には、患者は、プロトコールの第ＩＢ相治療相に承認され、ＲＰ２Ｄが、５日内に３用量として投与され、その相の８日目に開始する５日のバルガンシクロビルが続き、１週間の休薬期間が続く。各サイクルは、３週間の期間である。単回用量のＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２後に［１８Ｆ］ＦＨＢＧ ＰＥＴスキャンを有する陰性患者は、５日のバルガンシクロビルが投与され、研究は継続しない。
患者ＤＬＴは、Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２に起因し、薬物投与の最初のサイクル（３週間）の間に生じる以下の事象のうちいずれかの出現として規定される。
グレード４の７連続日以上の好中球減少症（すなわち、絶対好中球数（ＡＮＣ）＜５００個細胞／ｍｍ３）または熱性好中球減少症（すなわち、ＡＮＣ＜１０００個細胞／ｍｍ３を伴う発熱≧３８．５℃）；グレード４の血小板減少症（＜２５，０００個細胞／ｍｍ３または血小板輸血を必要とする出血エピソード）；適切な／最大医療介入および／または予防の使用にもかかわらないグレード３以上の吐き気および／または嘔吐；任意のグレード３以上の非血液学的毒性（グレード３注射部位反応、脱毛症、疲労を除く）；Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２を用いた治療と関連する毒性からの回復の遅延による３週間超の再治療遅延；および前投与の適当な使用にもかかわらないグレード３以上の過敏症反応（「じんま疹を伴うか伴わない、非経口薬物適用（単数または複数）を必要とする症候性気管支痙攣；アレルギー関連浮腫血管性浮腫」として規定される共通毒性基準によって）。
Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２は、注入ポンプによって１５〜６０分かけて（用量に応じて）静脈内に注入される。Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２は、−８０℃±１０℃で保存された３０ｍｌのバイアル中で提供される。
この第Ｉ相試験では、漸増用量のＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２の安全性、薬物動態および薬物動力学が調べられる。Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ Ｃ２の最大耐用量が同定され、推奨される第２相用量が規定される。Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２治療の任意の抗腫瘍活性および臨床反応が記載される。
この試験での出発用量は、関連ベクタープラットフォーム薬物製品Ｒｅｘｉｎ−ＧおよびＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃを用いるヒト臨床安全性実験およびＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２の２１日ラットＧＬＰ毒性学研究の結果に基づいている。
目的
研究の主目的は、肝臓への進行した原発性または転移性腫瘍を有すると診断されたこの研究に登録された患者における、１週目における５日内で静脈内に投与される一連の３用量と、それに続く、２週目におけるバルガンシクロビルの５日用量からなる３週間のサイクルにわたって投与されるＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２の、最大耐用量（ＭＴＤ）、用量制限毒性（ＤＬＴ）、安全性および推奨される第２相用量（ＲＰ２Ｄ）を決定することである。
第２の目的として、（ｉ）Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２の血漿薬物動態の評価、（ｉｉ）一連の［１８Ｆ］ＦＨＢＧ ＰＥＴおよび／またはＳＰＥＣＴイメージングによるＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２からのＨＳＶ−ＴＫ−ｍ２タンパク質発現の代用物の評価、（ｉｉｉ）Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２の抗腫瘍活性の任意の予備的証拠の説明および評価および（ｉｖ）レトロベクターｇｐ７０ ｅｎｖ、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）において複製可能なレトロウイルスに対する抗体、ＰＢＬのゲノムＤＮＡへのベクター組込みおよび循環ｈＧＭ−ＣＳＦタンパク質について試験する臨床研究を提供するためが挙げられる。
方法
研究デザイン：並行群、オープンラベル用量漸増、３センター臨床試験
階層化：なし。
療法：Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２が、静脈内注入として別個の患者に投与される。第ＩＡ相では−Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２を調べる−用量は、ＤＬＴが観察されるまで、患者のコホート間で漸増される。ＲＰ２Ｄでは、さらなる患者が補充される。第ＩＢ相では、患者は、ＨＳＶ−ＴＫ−ｍ２の発現について［１８Ｆ］ＦＨＢＧ ＰＥＴによってプレスクリーニングされる。ＨＳＶ−ＴＫ−ｍ２を発現するものは、さらなる用量のＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２を受け取る。患者は、過敏症反応が生じるまで前投薬されない。
統計的手法：統計分析には、記述統計学が使用される。
サンプルサイズ決定：正確なサンプルサイズは、観察された毒性に応じて変わるので規定され得ない。各スケジュールについて、３〜６人の対象のコホートが、ＭＴＤが規定されるまで各用量レベルで治療される。ＭＴＤが同定されると、この用量レベルが、最大１２人の患者に拡大され、用量およびスケジュールの耐容性および薬物動態をより良好に規定するために治療される。４５〜７０人の対象が登録され、ＩＡ部分では３３〜４６人を有すると予測される。
登録基準
対象は、研究における無作為化に適格であるために、以下の組み入れ基準のすべてを満たさなければならない。
１．標準療法に対して難治性であるか、またはそれに対する根治的標準療法が存在しない、組織学的に確認された、進行したステージの、原発性または転移性の肝臓の成人固形腫瘍の診断。
２．Ｘ線写真上で測定可能または評価可能な疾患の証拠。
３．米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＮＣＩ）共通毒性基準（ＣＴＣ）（バージョン４．０）グレード＜１に、任意の先行する放射線療法、化学療法または外科的手順のすべての急性毒性効果が消滅していなくてはならない。
４．年齢は、＞１８歳でなくてはならない。
５．ホルモン療法を除く抗新生物療法の最終用量が、＞２１日でなくてはならない。外部照射療法は、＜２５％骨髄含有骨格でなくてはならない。
６．患者は、Ｂ型およびＣ型肝炎陽性であってもよい（患者は、その抗ウイルス薬物適用を継続し得る）。
７．患者は、脳照射されており、６週間安定であれば、任意の数の頭蓋内転移を有してもよい。患者は、抗発作医薬を服用していてもよいが、ステロイドを使用していてはならない。
８．カルノフスキーパフォーマンスステータスが、≧７０でなくてはならない。
９．少なくとも３ヶ月の平均余命
１０．患者は、ＰＥＴスキャンのためにセントルークスメディカルセンター（Ｓｔ． Ｌｕｋｅ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）を訪問できなくてはならない。
１１．必要なベースライン実験室データとして以下が挙げられる：
Figure 2016519570
１２．その疾患の新生物的性質を承知しており、続く手順、療法の実験性、代替案、可能性ある利益、副作用、危険および不快症状を知らされていることを示す、署名したインフォームドコンセント。
１３．予定された訪問、治療プランおよび実験室検査に従う意思および能力。
以下のいずれかの存在が、研究登録から対象を排除する。
１．任意のその他の治験剤を含めた任意の抗癌療法との併用療法。
２．スクリーニングの６週間以内の既知頭蓋内浮腫またはＣＶＡ。
３．妊娠中または母乳栄養中の女性。女性対象は、有効な避妊を使用することに同意しなくてはならないか、外科的に生殖不能でなくてはならないか、または閉経後でなくてはならない。男性対象は、有効な避妊を使用することに同意しなくてはならないか、または外科的に生殖不能でなくてはならない。有効な避妊の定義は、治験責任医師または指定された同僚の判断に基づく。すべての危険な状態にある女性対象は、研究治療の開始前７日内に陰性妊娠検査を有さなくてはならない。
４．臨床的に有意な候補疾患（ニューヨーク心臓協会、クラスＩＩＩまたはＩＶ）。
５．インフォームドコンセントを妨げる認知症または精神状態の変化。
６．主席治験責任医師の判断において、研究参加または研究薬物投与と関連する危険を増大し得るか、または研究結果の解釈を干渉し得る、その他の重度の、急性もしくは慢性の医学的もしくは精神医学的状態または検査所見の異常は、対象をこの研究に不適切とする。
７．ガンシクロビルクラスの抗ウイルス薬に対する既知副作用。
８．ＨＩＶ陽性であるとわかっている患者。
９．患者は、スクリーニングの時点でステロイドを服用していてはならない。
出発用量およびスケジュールの論理的根拠
Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃは、１．０、２．０または３．０×１０１０ｃｆｕ（サイクルの３日目に、それぞれ、用量レベルＩ、ＩＩ、ＩＩＩ）の範囲にわたって１６人の患者に投薬された。いずれの用量レベルでも用量制限毒性はなかった。研究中の１６人の患者について無関係の有害事象は報告されたが、事象の数は少なく（ほとんどの場合に、望ましい期間あたり１または２の出現）、ほとんどは、グレード１または２であった。２人の患者において関連非重篤有害事象が起こり、両方ともグレード２であった。４人の患者は、重篤有害事象を経験し、それらのすべては、研究薬物と関連していないと考えられた。Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃの最適用量およびスケジュールを決定する前に治験を終えた。この治験、新規Ｇｅｎｅｖｉｅｖｅ−２試験では、最初の投薬は、２１日目毒性学およびＨＳＶ−ＴＫ−ｍ１研究に基づく。将来の投薬は、ｍＬあたりのｃｆｕよりもより正確な力価の尺度である総ウイルス粒子（ＴＶＰ）／ｍｌを使用して進行する。
スケジュールは、Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２曝露は、腫瘍細胞のすべてを形質導入しないという論理的根拠に基づいている。したがって、患者は、５日の期間にわたってサイクル中で３回投薬される。
ＧＤＳに対する曝露とＨＳＶ−ＴＫ−ｍ２（およびｈＧＭ−ＣＳＦ）の発現の間の時間は、４８〜７２時間であると推定される。したがって、Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２の３回目の用量の７２時間後、バルガンシクロビルを開始する。用量（腎機能のために調整される）は、従来の抗ウイルス薬用量レベルで与える。バルガンシクロビルの可能性ある毒性およびガンシクロビルの５日間は、ＨＳＶ−ＴＫ−ｍ２を含有生する細胞の大部分を死滅させるのに十分であるはずであるという公開された知見のために、５日の療法を選択した。Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２およびバルガンシクロビルの両方の可能性がある毒性のために、これに、およそ９日の休薬期間を続ける。ｈＧＭ−ＣＳＦは、バルガンシクロビル添加の時点で、腫瘍細胞アポトーシスの際に現れ得る任意の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の提示に影響を及ぼすのに十分な濃度であり得る。
薬物動態のために、血漿サンプルを、サイクル１中の第１および第３の用量の後におよびサイクル２中の第１の用量後に採取する。
分布は、主として肝臓であるので、そこでおよび関連のために骨髄で毒性を注意深くモニタリングする。
この臨床プロトコールは、原発性肝細胞または肝臓へ転移性の腫瘍のいずれかの進行した悪性腫瘍を有する患者への静脈内注入によるＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２の投与を求める。２つのパートとなる：第ＩＡ相（用量漸増３用量／週、どの３週間も）および第ＩＢ相（Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２の１用量後のプレスクリーニングおよび［１８Ｆ］ＦＨＢＧスキャン）。ＰＥＴスキャンが陽性である場合には、患者は研究を継続する。ＰＥＴスキャンが陰性である場合には、患者は、５日のバルガンシクロビルを受け取り、治験を継続しない。第ＩＡ相のために、用量漸増は、加速された力価測定設計をたどり、研究薬物に起因するＤＬＴの１症例またはＮＣＩ−ＣＴＣグレード２毒性の２症例のいずれか（悪心／嘔吐、疲労、拒食症、脱毛症または貧血を除く）が観察されるまで、用量レベルあたり３人の患者を組み込む。その後、臨床プロトコールにおける投薬は、用量制限毒性が達成されるまで、修飾されたフィボナッチスケジュールをたどる。
治験設計
これは第１相、オープンラベル、４センター用量漸増試験である。ＤＬＴが観察され、ＭＴＤが規定されるまで、用量を増大する。
Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２は、１５〜６０分かけてＩＶ注入として投与される。３３〜７０人の患者が研究の経過の間に治療されると予想される。
第ＩＡ相のために、Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２の用量は、６．０×１０１１ＴＶＰから漸増される。加速された用量漸増相では、各用量レベルで３人の患者のコホートが登録される。用量漸増増分は、ＤＬＴまたは２人のＣＴＣグレード２以上毒性が観察されるまでに１００％となる。加速された用量漸増が終了すると、標準用量漸増における新規患者の用量漸増は、修飾されたフィボナッチスキームをたどる（すなわち、６７％、５０％、４０％、３３％および２５％の用量増分）。用量レベルあたり最小で３人の患者が登録される。第ＩＢ相のために、Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２の用量は、ＲＰ２Ｄとなる。ＤＬＴが評価される。ある用量レベルで６人の患者のうち≧２人でＤＬＴが観察される場合には、さらなる用量漸増はなく、この用量レベルが、最大投与用量（ＭＡＤ）を規定する。
ＭＡＤを少し下回る用量は、ＭＴＤと考えられる。ＭＴＤが規定されると、第２相臨床研究のための推奨される用量として、薬物動態および薬物動力学パラメータおよび適合性をさらに特性決定するために、この用量レベルは、最大１２人の患者に拡大され得る。
患者の治療
それ自体に対するおよび環境に対する過度の曝露を最小化する手順に精通する有資格者のみが、適当な環境における生物学的薬剤の調製、取り扱いおよび安全な廃棄に取り組まなければならない。
Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ Ｃ２は、ＨＳＶ−ＴＫ−ｍ２およびｈＧＭ−ＣＳＦをコードする遺伝子を含有するモロニーマウス複製不能なレトロベクター粒子である。薬物製品は、ＤＭＥＭ（低グルコース）、ＲＤ−レトロベクター粒子、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ヒト血清アルブミン、ｎ−酪酸、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標）、マグネシウムおよびその他の賦形剤を含有する。
薬物製品は、１バイアルサイズ：２０ｍｍフィニッシュを有する３０ｍＬタイプ１透明ガラスバイアル（２５ｍＬの≧１．０×１０１０ＴＶＰを含有する）で入手可能である。バイアルは、２０ｍｍテフロンコートされた血清ストッパーおよび２０ｍｍフリップオフラッカー塗フリップトップで閉じられる。
Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２は、注入ポンプによって１５分かけて最大１００ｍＬ、３０分かけて＞１００ｍＬ〜２００ｍＬ、４５分かけて＞２００ｍＬ〜３００ｍＬ、６０分かけて＞３００ｍＬ〜４００ｍＬの容量が静脈内に投与される。４００ｍＬを超える容量が、治験責任医師およびＧｌｅｎｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｏｎｉｔｏｒによって決定される速度で投与される。スケジュールのためにＭＴＤが同定されると、必要であれば（また治験責任医師およびＧｌｅｎｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｏｎｉｔｏｒ間で一致するように）、投与の時間が変更され得る。
バルガンシクロビルは経口的に投与され、食物とともに摂取されなければならない。血清クレアチニンまたはクレアチニンクリアランスレベルは、注意深くモニタリングされなければならない。投与量調整は、以下の表に示されるようなクレアチニンクリアランスに基づいて必要とされる。バルガンシクロビル投薬は、サイクルの７〜９日目に始まり得るが、５連続日間与えられなければならない。
クレアチニンクリアランスは、血清クレアチニンから以下の式によって算出され得る：
男性について＝｛（１４０−年齢［年］）×（体重［ｋｇ］）｝／｛（７２）×（０．０１１×血清クレアチニン［ｍｉｃｒｏｍｏｌ／Ｌ］）｝
女性について＝０．８５×男性値。
Figure 2016519570
第１相研究の目的は、治験剤のＭＴＤ、ＤＬＴ、安全性およびＲＰ２Ｄを確立することである。したがって、毒性効果は主な研究エンドポイントであり、継続的に評価される。容易に測定され、再評価され得る患者が疾患を有する場合には、反応情報が得られる。これらの評価は、どのサイクルでも行われる。さらに、反応は、療法に対する確認された反応として実証されるために、少なくとも６週間離れた２つの実験の間に留意されなければならない。
− 毒性について評価可能−すべての患者が、任意の研究薬物を受け取る場合には、毒性について評価可能となる。
− 反応について評価可能−少なくとも単一サイクルの治療を受け、腫瘍再評価を有していたすべての患者が、反応について評価可能と考えられる。さらに、早期の進行性の疾患を発症する患者はまた、反応について評価可能と考えられる。少なくとも２サイクルの治療の間、療法を受けている患者は、その反応が評価される。
抗腫瘍有効性の決定は、評価の免疫関連反応基準（ｉｒＲＣ）システムに従ってなされた目的腫瘍評価に基づき、治験責任医師による治療決定は、これらの評価に基づく。
Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２におけるＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子の存在および腫瘍効果に寄与する免疫応答の可能性を考え、免疫応答基準が、臨床反応のために利用される。免疫応答基準対ＲＥＣＩＳＴ１．１を使用する理由は以下のとおりである：（１）測定可能な抗腫瘍活性の出現は、細胞傷害性療法についてよりも免疫療法についてより長くかかり得る；（２）免疫療法に対する反応は、従来のＰＤ後に起こる；（３）免疫療法の中断は、いくつかの場合には、ＰＤが確認されるまで（普通、反応に対して行われるように）適当ではないことがある；（４）「臨床的に不充分な」ＰＤ（例えば、その他の反応性病変の存在下での少ない新規病変）の許容が推奨される；および（５）耐久性のあるＳＤが、抗腫瘍活性を表し得る。
ＲＥＣＩＳＴ １．１と免疫関連反応基準間との比較が、以下に列挙される：
Figure 2016519570
評価のタイミングおよび種類
すべてのベースラインイメージングベースの腫瘍評価は、治療の開始に先立って１４日内に実施されるべきである。この研究の目的上、第ＩＡ相および第ＩＢ相の両方について、すべての患者の腫瘍評価は、治療の開始の９週間後に開始し、その後６週間ごとに再評価されなければならない（例えば、９週間、１５週間、２１週間など）。反応性腫瘍（ｉｒＣＲまたはｉｒＰＲ）を有するすべての患者は、反応の最初の実証の６週間以上後に確認される反応を有さなくてはならない。腫瘍進行を有するすべての患者は、進行の最初の実証の６週間以上後に確認される進行を有さなくてはならない。
ベースラインおよびフォローアップの間に各々同定され、報告された病変を特性決定するために、評価の同一方法および同一技術が、使用されなくてはならない。治療の抗腫瘍効果を評価するために両方法が使用された場合には、イメージングベースの評価が、臨床実験による評価にとって好ましい。すべての測定値は、メートル表記法で記録されなければならない。
ＣＴおよびＣＴ／ＰＥＴは、腫瘍評価のための方法である。従来のＣＴは、連続してスライス厚が１０ｍｍ以下の切断で実施されなければならない。スパイラルＣＴは、５ｍｍの連続再構成アルゴリズムを使用して実施されなければならない。これは、胸部、腹部および骨盤に適用される。
胸部ＣＴは、肺病変の評価のために使用される。
臨床病変は、それらが表在性である（例えば、皮膚結節、触知できるリンパ節）場合にのみ測定可能と考えられる。皮膚病変の場合には、病変の大きさを推定するための定規を含むカラー写真による実証が推奨される。
［１８Ｆ］ＦＨＢＧ ＰＥＴ−ＣＴスキャンは、患者が第ＩＡ相において第１のＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２の３用量（サイクル１）を受け取った後に、また第ＩＢ相におけるＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２のスクリーニング用量後に得る。第ＩＡ相では、治験責任医師の裁量で、メディカルモニターの承認をもって、その後のサイクルにおいてさらなる［１８Ｆ］ＦＨＢＧ ＰＥＴ−ＣＴスキャンを得てもよい。
目的の反応評価のために臨床的に容易に近づけない腫瘍病変、例えば、内臓病変を測定するために、超音波が使用されてはならない。表在性の触知できる節、ＳＣ病変および甲状腺結節の臨床測定の可能性ある代替案である。超音波はまた、普通は、臨床検査によって評価される表在性病変の完全消失を確認するのに有用である可能性がある。
内視鏡、腹腔鏡検査および放射性核種スキャンは、反応評価に使用されてはならない。
供給源確認のために、すべての患者のファイルおよび放射線学的イメージが入手可能でなくてはならず、抗腫瘍活性の最終評価のための院外再検討のために提出され得る。
腫瘍病変の測定可能性
ベースラインでは、腫瘍病変は、治験責任医師によって、以下に記載されるような基準によって測定可能または測定不能と分類される。
− 測定可能：少なくとも１次元（記録されるべき最長直径）で、従来技術を用いて≧２０ｍｍと、またはスパイラルＣＴスキャンを用いて≧１０ｍｍと正確に測定され得る病変。臨床病変は、それらが表在性である（例えば、皮膚結節、触知できるリンパ節）場合にのみ測定可能と考えられる。
− 測定不能：小さい病変（従来技術を用いて最長直径＜２０ｍｍまたはスパイラルＣＴスキャンを用いて＜１０ｍｍ）および、骨病変、軟膜疾患、腹水症、胸腔または心膜液貯留、皮膚または肺のリンパ管炎、確認されずイメージング技術によってたどられる腹部腫瘤、嚢胞性病変、これまでに放射線照射された病変および間接的な証拠のみによって実証された疾患（例えば、アルカリホスファターゼなどの臨床検査によって）を含めたすべてのその他の病変。
注記：細胞学および組織学：測定可能な疾患が、孤立性病変に制限される場合には、その新生物的性質は、細胞学／組織学によって確認されなければならない。
療法に対する反応はまた、独立した、中心的、放射線学的盲検再検討によって評価され得る。
腫瘍測定値の記録
臓器に含まれるすべてを代表する、最大１０病変までのすべての測定可能な病変が、ベースラインで、および治療の間の規定された間隔で、標的病変として同定され、測定され、記録されなければならない。標的病変は、その大きさ（最長直径を有する病変）および正確な反復性測定（イメージング技術かまたは臨床的にのいずれか）に対するその適合性に基づいて選択されなければならない。
各標的病変の最長直径を記録する。すべての標的病変の最長直径の合計を算出し、ベースラインとして記録する。最長直径の合計は、治療の間の疾患の測定可能な寸法の目的腫瘍反応をさらに特性決定するための参照として使用される。すべての測定値は、センチメートルでメートル表記法で記録されなければならない。
すべてのその他の病変（または疾患の部位）は、非標的病変として同定されなければならず、同様にベースラインとして記録されなければならない。測定値は必要ではなく、これらの病変は、「存在」または「不在」としてたどられる。
腫瘍反応の定義
腫瘍反応の評価のために、免疫関連反応基準基準に従う。
免疫関連反応基準による全体的な反応の決定
固形腫瘍の標的病変
− 完全寛解（ｉｒＣＲ）は、すべての病変の消失（測定可能であろうとなかろうと、および新規病変なし）；最初に実証された日付から６週間以上の反復した連続評価による確認として定義される。
− 部分反応（ｉｒＰＲ）は、最初の実証から少なくとも６週間後の連続評価によって確認された、ベースラインに対する腫瘍量の＞５０％減少として定義される。
− 進行性疾患（ｉｒＰＤ）は、治療が開始してから記録された最初に実証された病変の日付から６週間以上の反復した連続評価によって確認される、最下点（最小の記録された腫瘍量）に対する腫瘍量の＞２５％増大または１つもしくは複数の新規病変の出現として定義される。
− 安定疾患（ｉｒＳＤ）は、ｉｒＰＤの不在下でｉｒＣＲまたはｉｒＰＲの基準を満たさないこととして定義される。
固形腫瘍の非標的病変
測定可能な腫瘍が、反応またはｉｒＳＤの基準を満たした場合には、反応またはｉｒＳＤとｉｒＰＤ間を区別するために、治療の間に現れるかまたは悪化させる任意の滲出液の新生物の起源の細胞学的確認が必須である。
腫瘍反応の確認
ｉｒＰＲまたはｉｒＣＲの状態が割り当てられるには、反応性腫瘍を有する患者における腫瘍測定値の変化は、反応の基準が最初に満たされた後≧６週間実施されなければならない反復研究によって確認されなければならない。ｉｒＳＤの場合には、フォローアップ測定は、６週間の最小間隔で研究エントリー後少なくとも１回ｉｒＳＤ基準を満たしていなければならない。標的および非標的病変の両方存在する場合には、個々の評価を別個に記録する。反応の全体的な評価は、表ＩＩＩに表されるようなすべてのパラメータを含む。
最良の全体的な反応は、治療の開始から疾患進行／再発までの記録される最良の反応である（腫瘍進行の参照として、治療が開始してから記録された最小の測定値をとり）。患者の最良の反応の割り当ては、測定および基準の確認の両方の達成に応じて変わる。
患者は、無作為化後腫瘍評価がない場合に、反応について評価可能ではない（ＮＥ）と定義される。これらの患者は、腫瘍反応データの分析において失敗とカウントする。
臨床有効性評価：パフォーマンスステータス
患者を、カルノフスキーパフォーマンスステータススケールに従って段階分けする。
腫瘍マーカー反応
評価の方法
多数の悪性腫瘍において有効性の十分に検証された尺度ではないが、腫瘍マーカーの連続決定が、療法の間の病気の経過をたどるための可能性のあるさらなる手段としての、容易に実施される、高価でない、定量的な臨床ツールの評価を可能にし得る。
腫瘍マーカー減少または増加は、結果の目的手段として評価されない。特に、腫瘍マーカー値が上がることは、腫瘍進行の定義において考慮されないが、Ｘ線写真腫瘍進行が起こったか否かを実証するための反復性のＸ線写真評価を促さなくてはならない。
算出されたエンドポイント定義
生存は、最初の研究薬物治療の日付から死亡の日付までの時間として定義される。死亡の確認がない場合には、生存時間は、フォローアップの最終日で打ち切られる。
腫瘍反応速度は、目的のｉｒＣＲまたはｉｒＰＲの何らかの証拠を有する患者の割合として規定される。
ＴＴＰは、治療から腫瘍進行の最初に確認される実証まで、または任意の原因による死亡までの時間と定義される。腫瘍進行の目的証拠を有さない患者および研究治療から除去されるかまたは研究治療以外の抗腫瘍治療が与えられる患者については、ＴＴＰは打ち切られる。腫瘍マーカー進行の基準を満たす腫瘍マーカー増大は、腫瘍進行の適切な目的証拠を構成しない。しかし、このような腫瘍マーカー増大は、目的腫瘍進行が起こったか否かを実証するための反復性のＸ線写真評価を促さなくてはならない。
ＴＴＦは、治療から腫瘍進行の最初に確認される実証まで、または治療から離れる日付まで、またはどれでも最初に来る任意の原因による死亡までの時間と定義される。分析の時点で依然として治療中である患者および目的反応の間に医師によって療法から除去される患者および治療から離れる日付で、目的腫瘍進行の証拠がない患者は、離脱が医学事象の出現によらない限り、治療失敗を経験したと考えられない。これらの患者については、ＴＴＦは、研究から離れた日付で打ち切られる。ＴＴＦの打ち切りはまた、最初の目的腫瘍進行、研究から離れる日付または死亡の前に、研究治療以外の抗腫瘍治療が与えられる患者において実施される。腫瘍マーカー進行の基準を満たす腫瘍マーカー増大は、治療失敗の適切な目的証拠を構成しない。しかし、このような腫瘍マーカー増大は、目的腫瘍進行（ひいては、治療失敗）が起こったか否かを実証するための反復性のＸ線写真評価を促さなくてはならない。
最初の決定的なパフォーマンスステータス悪化までの時間は、治療から、パフォーマンスステータスがベースラインでよりも悪くなかった最後の時間まで、または決定的な確認されたパフォーマンスステータス悪化の事前の実証がない中での任意の原因による死亡までの時間である。決定的なパフォーマンスステータス悪化がない患者および研究から除去されるかまたは研究治療以外の抗腫瘍治療を与えられた患者については、決定的なパフォーマンスステータス悪化は打ち切られる。
最初の決定的な体重減少までの時間は、治療からベースラインからの体重減少パーセントが＜５％であった最後の時間まで、または決定的な体重減少の事前の実証のない中での任意の原因による死亡までの時間と定義される。決定的な体重減少がない患者および研究から除去されるかまたは研究治療以外の抗腫瘍治療を与えられた患者については、決定的な体重減少は打ち切られる。
データのさらなる評価は、最良の目的反応、確認されたおよび確認されていない目的反応割合、研究治療の期間、新規病変の最初の出現までの時間、腫瘍反応までの時間、２４週での安定な疾患および２４週での進行のない生存の割合を含み得る。データは、必要に応じて、ＲＥＣＩＳＴ １．１基準によって評価され得る。
治療投与評価
第ＩＡ相および第ＩＢ相の両方について、用量強度は、総用量／サイクル×治療の開始から最後の治療の間の週数＋１３日として規定される。
相対用量強度パーセントは、同一期間に対して計画された用量強度によって除された実際の用量強度の割合として規定される。
実施例７：ＲｘＣ２−ＧＣＶ死滅アッセイ
死滅アッセイを以下のとおりに実施した。ＲｘＣ２を用いる処理後のＧＣＶによる細胞死滅のパーセンテージは、試験された癌細胞の感染力（形質導入度）に応じて変わる。各細胞株の細胞を、６ウェルディッシュにプレーティングした。翌日、１：５希釈したＥＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質遺伝子）を含有するレトロベクターを用いて細胞を形質導入した。４８時間後、細胞を回収した。自動蛍光細胞カウンターを使用して蛍光および非蛍光細胞をカウントして、形質導入されたパーセントを決定した。緑色蛍光タンパク質の遺伝子を保持するウイルスを使用して形質導入の効率を調べ、ここで、形質導入効率が降順で示されている。
Figure 2016519570
本明細書において示されるすべての細胞株に同一ウイルス調製物を使用した（力価２．７２Ｅ＋１０ ＴＶＰ）。
実施例８：ＰｉＴ−２を発現する細胞株のＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２媒介性ＧＣＶ死滅の分析
ＰｉＴ−２およびネオマイシン耐性遺伝子を含有するＥ−Ｒｅｘ発現レトロウイルスベクターを用いる標的細胞形質導入によって、ＰｉＴ−２を発現する細胞株を確立した。次いで、安定な細胞株を薬物選択して（Ｇ４１８）、ＰｉＴ−２発現細胞の純粋な集団を確立した。ＰｉＴ２発現細胞へのＬＵＣ−２遺伝子の両種指向性のレトロウイルスベクター形質導入と、それに続く、生物発光分析によって、細胞株を検証した。Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２細胞死滅分析のために、次いで、ＰｉＴ２発現細胞株を４８ウェルプレートにプレーティングした。翌日、Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２レトロベクターを用いて細胞を形質導入した。形質導入後、２０〜４０μＭ ＧＣＶの１日用量に細胞を曝露した。ＧＣＶ処理の４日後、細胞を、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ試薬を使用して細胞生存力について分析した。この試薬は、生細胞における還元性環境の存在下では、試薬を、吸光度測定を使用して定量化される蛍光に変換する、レザズリンベースの溶液である。
Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２形質導入およびＧＣＶ曝露後に、ヒト結腸癌株ＨＣＴ−１５は、不十分なＨＳＶ−ＴＫ−ＧＣＶ死滅を実証し、ＲＫＯ細胞株は、細胞死滅を実証しなかった。ＰｉＴ−２発現ＨＣＴ−１５およびＰＫＯ株を作製し、その形質導入効率を調べ、結果が以下の表に提供されている。
Figure 2016519570
すべてのＰｉＴ−２発現細胞株において、ＬＮＣＥ−ＲＶＥ形質導入効率の相当な増加が観察され、標的細胞がＰｉＴ２を発現する場合には、死滅活性が増大することを実証した。
ＰｉＴ−２を発現する細胞株を使用することで、データは、ＬＮＣＥ−ＲＶＥ形質導入にＰｉＴ−２受容体の存在が必要であることは、蛍光顕微鏡によって分析される細胞におけるＥＧＦＰ発現のレベルによって反映される（示されていないデータ）と示す。Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２感染性にＰｉＴ−２の存在が必要であることも、ＧＣＶ細胞死滅アッセイによって示された。したがって、ＰｉＴ−２は、Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２の良好なバイオマーカーに相当する。
Ｐｉｔ２発現が、Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２媒介性ＧＣＶ細胞死滅と相関することが決定された。ＣＨＯ−Ｋ１親株対ＰＩＴ２発現ＣＨＯ−Ｋ１株のＨＳＶ−ＴＫ−ＧＣＶ死滅。
図２５および２６は、グラフ結果ＰｉＴ−２の不在下（各図のパネルＡ）またはＰｉＴ−２の存在下（各図のパネルＢ）での一重または三重形質導入後の、種々の細胞株における一重または三重形質導入後のＨＳＶ−ＴＫ−ＧＣＶ死滅を提供する。
図２７は、ＭＩＡ−ＰａＣａ−２ヒト膵臓癌腫細胞株におけるＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２を用いる三重形質導入後のＴＫ−ＧＣＶ死滅の結果を提供する。ＧＣＶ死滅は、高濃度のＴＶＰで有効であった。
図２８は、ＰｉＴ−２−ＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞のＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２を用いる三重形質導入後のＨＳＶ−ＴＫ−ＧＣＶ死滅の結果を提供する。ＲｘＣ２三重形質導入されたＰｉＴ−２−ＭＩＡ−ＰａＣａ２ヒト膵臓癌腫細胞株のＧＣＶ死滅。ＰｉＴ−２の存在は、低濃度のＴＶＰで細胞死滅量を著しく増大した。
図３２は、ＧＣＶにおいて４日後のＲｘＣ２形質導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞株のグラフを示す。
図３３は、ＧＣＶにおいて４日後のＲｘＣ２形質導入されたＰｉＴ−２−ＨＡ−ＣＨＯ−Ｋ１細胞株のグラフを示す。
最低濃度のＧＣＶでさえ、ＰｉＴ−２の存在が、有意に多い形質導入および細胞死滅を可能にすることは、極めて明らかである。
実施例９：Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ Ｃ２三重形質導入後の形質導入効率対ＧＣＶ死滅
形質導入効率およびＧＣＶ死滅を実証するために、細胞を４８ウェルプレートにプレーティングした。翌日、細胞を１：４０〜１：５１２０の範囲で希釈したＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２を用いて形質導入する。３回の形質導入の最後ののち、細胞をＧＣＶの１日用量（２０〜４０μＭ）に４日間曝露した。ＧＣＶの最後の用量の翌日、Ｐｒｅｓｔｏｂｌｕｅ試薬を使用して、細胞生存力について細胞を分析した。この試薬は、生細胞の還元環境の存在下では、試薬を、吸光度測定を使用して定量化される蛍光に変換するレザズリンベースの溶液である。結果は、非形質転換細胞生存力に基づく死滅パーセントとして報告されている。
Figure 2016519570
図３１は、種々の癌細胞株のＲｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２三重形質導入後のＧＣＶ死滅のパーセンテージを表すグラフである。グラフは、種々の細胞株の中でのＧＣＶ死滅の変動を実証する。細胞株は、細胞死滅パーセントに対して総ウイルス粒子／ｍＬに変換された各希釈物にわたって同等である。表は、グラフ中に表される細胞株の形質導入効率を示す。効率パーセントは、細胞死滅と直接の相関を有さないと思われるが、効率が高いほど高い細胞死滅につながる傾向は明らかである。
実施例１０：突然変異体ＨＳＶ−ＴＫ細胞タンパク質発現の免疫組織化学（ＩＨＣ）
Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ Ｃ１またはＣ２プラスミドのいずれかを、２９３Ｔ細胞中に一時的にトランスフェクトし、組織培養スライド器具上で標準条件下でインキュベートし、２、３日後、細胞を約２％ホルマリンを用いて固定し、ＰＢＳを用いて洗浄し、０．１％ ｔｒｉｔｏｎ×１００または同等の界面活性剤を用いて透過処理した。有効希釈の一次抗ＨＳＶ−ＴＫ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、これらの細胞とともに４℃で終夜インキュベートする。細胞を洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）とコンジュゲートした二次抗一次抗体とともに周囲温度で１〜２時間インキュベートする。細胞を再度洗浄し、ＨＲＰＯ検出染色試薬を、室温で５〜３０分間適用する。ＣＣＤデジタルカメラを取り付けた光学顕微鏡を用いてＩＨＣイメージを得、画像解析ソフトウェアを用いて像を獲得する。注記：この実施例におけるＩＨＣはまた、免疫細胞化学（ＩＣＣ）として記載され得る。
野生型ベクターは、核に局在するとわかった（野生型ＨＳＶ−ＴＫと融合した蛍光遺伝子を用いて決定されたように）、示されていないデータ。
ＲｅｘＣ１は、蛍光融合物では核および細胞質の間に分布する（示されていないデータ）が、免疫組織化学では、大部分は、核である（ＩＨＣ；図３７、左パネル参照のこと）。
ＲｅｘＣ２は、蛍光融合物ではほぼ完全に細胞質である（示されていないデータ）が、一部は、細胞質に移動するとＩＨＣにおいて見られる（図３７、右パネルを参照のこと）。
実施例１１：改善された突然変異体
種々の突然変異の効果を、Ｍａｒｇａｒｅｔ Ｂｌａｃｋによって記載されるものなどのこれまでに開示されたコンストラクトと比較した。ＨＳＶ−ＴＫ変異体ｐＥＴコンストラクトによるＢＬ２１ ＤＥ３ ｔｋ（−）細胞の救出が、以下の表に示されている。
Figure 2016519570
以下の表は、ＨＳＶ−ＴＫ変異体ｐＥＴコンストラクトによるＢＬ２１ ＤＥ３ ｔｋ（−）細胞の救出後のＧＣＶ死滅を表す。
Figure 2016519570
Ｋｅｙ：ｐＴＫ番号＝ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子または変異体をコードするｐＥＴ３０ａベースの細菌タンパク質発現ベクター；ｐＴＫ１＝野生型ＨＳＶ−ＴＫ；ｐＴＫ２＝ＨＳＶ−ＴＫ ＮＥＳｄｍＮＬＳ Ａ１６７Ｙ（ＳＲ３９）；ｐＴＫ３＝ＨＳＶ−ＴＫ（ＳＲ３９）（Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ１におけるような）；ｐＴＫ４＝ＨＳＶ−ＴＫ−ＮＥＳｄｍＮＬＳ Ａ１６７Ｆ；ｐＴＫ５＝ＨＳＶ−ＴＫ−ＮＥＳｄｍＮＬＳ Ａ１６８Ｈ（Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２におけるような）；ｐＥＴ２４ａ＝陰性対照としての空の発現ベクター；ＧＣＶ＝ガンシクロビル（示された濃度の）、ＩＰＴＧ＝イソプロピルｂ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＨＳＶ−ＴＫタンパク質発現のｌａｃオペロンインデューサーとして）；２ｘＹＴ＝寒天プレートでの２ｘ酵母／トリプトン細菌培地、これでは、そのように表示された列中の試験は、ＩＰＴＧおよびＧＣＶの両方を欠く。これらのＨＳＶ−ＴＫのすべては、原核生物における発現のためにコドン最適化されており、ＩＰＴＧ誘導性ｐＥＴ３０ａプラスミドにおいて発現される。注記；チミジン酵素活性を有さないＨＳＶ−ＴＫ突然変異体は、これらのＴＫ−細菌細胞の成長を支持しない。
実施例１２：インビトロバイスタンダーアッセイ
実験を、本発明者らの実験室で実施して、種々のＴＫ突然変異体を発現する癌細胞の発現しない細胞との混合物で、インビトロでバイスタンダー効果を実証した。Ａ１６８Ｈ突然変異ＨＳＶ−ＴＫ−ｍ２遺伝子を含有する、Ａ３７５ヒト黒色腫およびＣ６ラット神経膠腫安定純粋集団細胞株を確立した。親の非ＨＳＶ−ＴＫ−ｍ２細胞の、０〜１００％ ＨＳＶ−ＴＫ−ｍ２の範囲の対応するＨＳＶ−ＴＫ−ｍ２細胞株との混合物を用いて癌細胞をプレーティングすることによって、バイスタンダーアッセイを実施した。続いて、癌細胞の混合物を５〜２０μＭ ＧＣＶに曝露し、細胞死滅が以下の表にプロットされている。結果は、バイスタンダー効果を伴わない、理論的に考えられるものを上回る、混合集団における有意な増大を明確に示す。
種々の突然変異体ＴＫおよびクローン集団を使用して、４０超のバイスタンダーアッセイを実施した。データは、ＧＣＶ感受性および酵素動態学測定値ならびに潜在力を有する突然変異体の製造物のウイルス力価を用いてまとめた。
図２９は、種々の突然変異体の１つのバイスタンダーインビトロアッセイから得られたグラフ結果を提供する。データは、突然変異ＨＳＶ−ＴＫ Ａ１６８Ｈ遺伝子が、ＨＳＶ−ＴＫ １６７またはＭａｒｇａｒｅｔ Ｂｌａｃｋ突然変異体よりも高い細死滅およびバイスタンダー効果を有することを支持する。
図３０は、Ｃ６−Ｈｙｇｒｏ−ＴＫクローンを、２０ｍＭ ＧＣＶを用いて処理したバイスタンダーインビトロアッセイから得られたグラフを提供する。データは、ＨＳＶ−ＴＫ Ｍａｒｇａｒｅｔ Ｂｌａｃｋ突然変異体は、試験されたその他の突然変異体の最低細胞死滅を有していたということをさらに支持する。
突然変異体のすべての分析が、突然変異体ＴＫ１６８ｄｍＮＥＳが、Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ Ｃ−２におけるＴＫ遺伝子のリード候補であると同定した。
実施例１３：修飾されたＴＫ分子の配列
ＨＳＶ−ＴＫスプライシング部位除去；コドン最適化されたＴＫ１（スプライス部位が修正された）
Figure 2016519570
コドン最適化された、すべて推定スプライス受容部位が切除された、ＲＥ’ｓ，＋Ｋｏｚａｋを有するＴＫ１、２ｘＴＫ Ａ１６８Ｈ（ＬＩＦ・・・ＡＨＬ）
Figure 2016519570
ＨＳＶ−ＴＫスプライシング部位除去がコドン最適化を改善する
Figure 2016519570
ＮＥＳにおけるＨＳＶ−ＴＫ ＮＬＳ除去および置換
Figure 2016519570
ＨＳＶ−ＴＫ ＮＬＳ除去
Figure 2016519570
ＨＳＶ−ＴＫカスタムコドン最適化
Figure 2016519570
ＨＳＶ−ＴＫ ＮＬＳ除去ＮＥＳおよび付加
Figure 2016519570
ＨＳＶ−ＴＫカスタムコドン最適化
Figure 2016519570
実施例１４：ＨＡＴアッセイ
ＲｅｘＲｅｄ Ｓｕｐｅｒ ＴＫ Ａ１６８ＨおよびＲｅｘＲｅｄ ＴＫ １６７Ｆのレトロウイルスベクターを２９３Ｔ細胞において製造し、３Ｔ３（ＴＫ−）細胞を形質導入するために使用した。これらの形質導入された細胞を、７〜１４日間ＨＡＴ選択した。形質転換されていない３Ｔ３（ＴＫ−）細胞は、ＨＡＴ選択後に死滅する。ＲｅｘＲｅｄ Ｓｕｐｅｒ ＴＫ Ａ１６８Ｈを用いて形質導入されたこれらの同一細胞は、ＨＡＴ選択を生き延びなかったが、ＲｅｘＲｅｄ ＴＫ １６７Ｆを用いて形質導入した３Ｔ３（ＴＫ−）細胞は、ＨＡＴ選択を生き延びた。これは＋／−細胞生存アッセイであり、生存細胞を固定し、メタノール中、１％メチレンブルーを用いて染色する。
これまでに形質導入をベースとするＨＡＴ細胞死滅アッセイは、ＲＦＰマーカーを含有するレトロウイルスベクター中のＡ１６７Ｆ ＨＳＶ−ＴＫ突然変異体に対してチミジンを上回るＧＣＶ特異性を示す。その特異性は、１×ＨＡＴ用量での７２時間および７日アッセイでＮＩＨ ３Ｔ３細胞において見られる。
現在の形質導入をベースとするＨＡＴ細胞死滅アッセイは、ＲＦＰマーカーを含有するレトロウイルスベクター中のＡ１６７Ｆ ＨＳＶ−ＴＫ突然変異体に対してチミジンを上回るＧＣＶ特異性を示す。その特異性は、２×ＨＡＴ用量での７日アッセイでＮＩＨ ３Ｔ３細胞において見られる。
形質導入をベースとするＨＡＴ細胞死滅アッセイは、ＲＦＰマーカーを含有するレトロウイルスベクター中のＡ１６７Ｆ ＨＳＶ−ＴＫ突然変異体に対してチミジンを上回るＧＣＶ特異性を示す。その特異性は、１×ＨＡＴ用量での７２時間アッセイおよび７日アッセイでＮＩＨ ３Ｔ３細胞において見られる。
形質導入をベースとするＨＡＴ細胞死滅アッセイは、ＨｙｇｒｏＲマーカーを含有するレトロウイルスベクター中のＡ１６７Ｆ ＨＳＶ−ＴＫ突然変異体に対してチミジンを上回るＧＣＶ特異性を示す。その特異性は、１×ＨＡＴ用量での７２時間アッセイおよび７日アッセイでＮＩＨ ３Ｔ３細胞において見られる。
実施例１５：ＧＣＶ死滅アッセイ
細胞を２４ウェルディッシュに播種した。翌日、レトロウイルスベクターの６種の希釈物（１：４〜４０９６）を用いて細胞を形質導入した。翌日、細胞に０〜２００μＭのＧＣＶを添加した。ＧＣＶ処理の７日後、細胞を固定し、メタノール中の１％メチレンブルーを用いて生細胞を染色した。ウイルス突然変異体の効力が高いほど、より多い細胞死滅につながる。
これまでの形質導入をベースとするＨＳＶ−ＴＫ／ＧＣＶ細胞死滅アッセイは、ＲＦＰマーカーを含有するレトロウイルスベクター中で、Ａ１６８Ｆ、Ａ１６７ＦおよびＡ１６８Ｈ ＨＳＶ−ＴＫ突然変異体の効力順序を示す。その順序は、高ＧＣＶ用量（１ｍＭ〜１２５ｍＭ）での７２時間および７日アッセイでＲｇＡ３７５細胞において試験された場合には、Ａ１６８Ｈ＞Ａ１６８Ｆ＝Ａ１６７Ｆである。
現在の形質導入をベースとするＨＳＶ−ＴＫ／ＧＣＶ細胞死滅アッセイは、ＲＦＰマーカーを含有するレトロウイルスベクター中で、Ａ１６７ＦおよびＡ１６８Ｈ ＨＳＶ−ＴＫ突然変異体の効力順序を示す。その順序は、高ＧＣＶ用量（０．２ｍＭ〜０．０５ｍＭ）での７日アッセイでＲｇＡ３７５細胞において試験された場合には、Ａ１６８Ｈ＞Ａ１６８Ｆである。ｄｍ ＮＬＳまたはＮＥＳ用量の添加は、この順序を変更しないと思われる。ＪＣＯの使用は、力価および凝集体ＨＳＶ−ＴＫ細胞死滅活性を低下させると思われる。
形質導入をベースとするＨＳＶ−ＴＫ／ＧＣＶ細胞死滅アッセイは、ＲＦＰマーカーを含有するレトロウイルスベクター中で、Ａ１６８Ｆ、Ａ１６７ＦおよびＡ１６８Ｈ ＨＳＶ−ＴＫ突然変異体の効力順序を示す。その順序は、高ＧＣＶ用量（１ｍＭ〜１２５ｍＭ）での７２時間アッセイでＡ３７５およびＲｇＡ３７５細胞において試験された場合には、Ａ１６８Ｈ＞Ａ１６８Ｆ＝Ａ１６７Ｆである。
形質導入をベースとするＨＳＶ−ＴＫ／ＧＣＶ細胞死滅アッセイは、ＲＦＰマーカーを含有するレトロウイルスベクター中で、Ａ１６８Ｆ、Ａ１６７ＦおよびＡ１６８Ｈ ＨＳＶ−ＴＫ突然変異体の効力順序を示す。その順序は、高ＧＣＶ用量（１ｍＭ〜５００ｍＭ）での７２時間アッセイでＮＩＨ３Ｔ３細胞において試験された場合には、Ａ１６８Ｈ＞Ａ１６８Ｆ＝Ａ１６７Ｆである。
形質導入をベースとするＨＳＶ−ＴＫ／ＧＣＶ細胞死滅アッセイは、ＲＦＰマーカーを含有するレトロウイルスベクター中で、Ａ１６８Ｆ、Ａ１６７ＦおよびＡ１６８Ｈ ＨＳＶ−ＴＫ突然変異体の効力順序を示す。その順序は、高ＧＣＶ用量（１ｍＭ〜１２５ｍＭ）での７２時間および７日アッセイでＲｇＡ３７５細胞において試験された場合には、Ａ１６８Ｈ＞Ａ１６８Ｆ＝Ａ１６７Ｆである。
形質導入をベースとするＨＳＶ−ＴＫ／ＧＣＶ細胞死滅アッセイは、ＲＦＰまたはＨｙｇｒｏＲマーカーを含有するレトロウイルスベクター中で、Ａ１６８Ｆ、Ａ１６７ＦおよびＡ１６８Ｈ ＨＳＶ−ＴＫ突然変異体の効力順序を示す。その順序は、高ＧＣＶ用量（１ｍＭ〜１２５ｍＭ）での７２時間アッセイでＡ３７５、ＲｇＡ３７５またはＮＩＨ３Ｔ３細胞において試験された場合には、Ａ１６８Ｈ＞Ａ１６８Ｆ＝Ａ１６７Ｆである。
形質導入をベースとするＨＳＶ−ＴＫ／ＧＣＶ細胞死滅アッセイは、ＨｙｇｒｏＲマーカーを含有するレトロウイルスベクター中で、Ａ１６８Ｆ、Ａ１６７ＦおよびＡ１６８Ｈ ＨＳＶ−ＴＫ突然変異体の効力順序を示す。その順序は、高ＧＣＶ用量（１ｍＭ〜１２５ｍＭ）での７２時間アッセイでＡ３７５およびＲｇＡ３７５細胞において試験された場合には、Ａ１６８Ｈ＞Ａ１６８Ｆ＝Ａ１６７Ｆである。
形質導入をベースとするＨＳＶ−ＴＫ／ＧＣＶ細胞死滅アッセイは、ＨｙｇｒｏＲマーカーを含有するレトロウイルスベクター中で、Ａ１６８Ｆ、Ａ１６７ＦおよびＡ１６８Ｈ ＨＳＶ−ＴＫ突然変異体の効力順序を示す。その順序は、高ＧＣＶ用量（１ｍＭ〜５００ｍＭ）での７２時間アッセイでＮＩＨ３Ｔ３細胞において試験された場合には、Ａ１６８Ｈ＞Ａ１６８Ｆ＝Ａ１６７Ｆである。
実施例１６：Ｈｙｇｒｏ耐性
レトロベクターＨｙｇｒｏ−ＨＳＶ−ＴＫ突然変異体を用いて形質導入された細胞株を、ハイグロマイシンの存在下で選択して、Ｈｙｇｒｏ−ＨＳＶ−ＴＫ突然変異体を含有し、ハイグロマイシン耐性遺伝子を発現する細胞の純粋な集団を製造する。
Ａ３７５ Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２様細胞株：Ａ３７５ Ｈｙｇｒｏ選択されたＨＳＶ−ＴＫ ｄｍＮＥＳＡ１６８Ｈ 細胞株は、Ｌｕｃ（＋）に変換されていた。上記の細胞株は、親株と同一のＧＣＶ死滅を有する。Ａ３７５ Ｌｕｃ（＋）のみの細胞株は、上記の細胞株と同一のＬｕｃ活性を有する。
Ｃ６ Ｒｅｘｉｍｍｕｎｅ−Ｃ２様細胞株：Ｃ６ Ｈｙｇｒｏ選択されたＨＳＶ−ＴＫ ｄｍＮＥＳＡ１６８Ｈ細胞株は、Ｌｕｃ（＋）に変換されていた。上記の細胞株は、親株と同一のＧＣＶ死滅を有する。Ｃ６ Ｌｕｃ（＋）のみの細胞株は、上記の細胞株と同一のＬｕｃ活性を有する。
本明細書において、好ましい実施形態が示され、記載されているが、このような実施形態は単に例として提供されるということは当業者には明らかであろう。多数の変法、変更および置換が、開示される実施形態から逸脱することなく当業者には自明であろう。実施形態の実施において、本明細書に記載される実施形態の種々の代替物が使用され得ることは理解されなくてはならない。以下の特許請求の範囲が、実施形態の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにその等価物がそれによって対象とされると意図される。
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配列
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配列番号２２
ＨＳＶ−ＴＫ ｄｍＮＬＳ Ａ１６８Ｈ、ＣＯ ＆ ＳＣ
ｄｍＮＬＳ＝二重突然変異した核局在性配列
ＣＯ＝コドン最適化
ＳＣ＝３２７および５５５でスプライス修正された
Ｋｏｚａｋ 配列、下線が引かれている
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Claims (67)

  1. ヒト単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）の突然変異した形態をコードするポリヌクレオチド配列であって、コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基２５、２６、３２、３３、１６７、１６８またはそれらの組合せで突然変異しており、ポリヌクレオチド配列が、配列番号３のポリヌクレオチド配列と比較して突然変異している、ポリヌクレオチド配列。
  2. コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基１６７、１６８またはそれらの組合せで、極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に突然変異している、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基１６７で、極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に突然変異している、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
  4. コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基１６８で、極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に突然変異している、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
  5. コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基１６７および１６８の両方で、極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に突然変異している、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
  6. コードされるＨＳＶ−ＴＫのアミノ酸残基１６７が、セリンまたはフェニルアラニンに突然変異している、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド配列。
  7. コードされるＨＳＶ−ＴＫのアミノ酸残基１６８が、ヒスチジン、リシン、システイン、セリンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸に突然変異している、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド配列。
  8. コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸２５および２６で突然変異している、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  9. アミノ酸残基２５および２６が、グリシン、セリンおよびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸に突然変異している、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
  10. コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基３２および３３で突然変異している、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  11. アミノ酸残基３２および３３が、グリシン、セリンおよびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸に突然変異している、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
  12. コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基２５、２６、３２および３３で突然変異している、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  13. アミノ酸残基２５、２６、３２および３３が、グリシン、セリンおよびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸に突然変異している、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
  14. コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基２５、２６、３２および３３からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異ならびにアミノ酸残基１６７および１６８からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  15. コードされるＨＳＶ−ＴＫ配列が、核外輸送シグナルをさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  16. 核外輸送シグナル配列が、ＨＳＶ−ＴＫ配列の５’末端にまたはその付近に挿入される、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
  17. 核外輸送シグナル配列が、ＬＱＫＫＬＥＥＬＥＬＤＧ（配列番号２４）である、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
  18. コードされる突然変異体ＨＳＶ−ＴＫが、核領域に排他的に局在しない、請求項１から１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  19. コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫが、野生型ＨＳＶ−ＴＫと比較して、低下した量のチミジンキナーゼ活性を示す、請求項１から１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列。
  20. コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫの活性が、約１．５倍、約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍または約５０倍低下する、請求項１９に記載のポリヌクレオチド配列。
  21. コードされる修飾されたＨＳＶ−ＴＫの活性が、約１．５％、約２％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約１００％低下する、請求項１９に記載のポリヌクレオチド配列。
  22. コードされるＨＳＶ−ＴＫが、アミノ酸残基２５、２６、３２、３３および１６８での突然変異を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド配列。
  23. コードされるＨＳＶ−ＴＫが、突然変異Ｒ２５Ｇ、Ｒ２６Ｓ、Ｒ３２Ｇ、Ｒ３３ＳおよびＡ１６８Ｈを含む、請求項２２に記載のポリヌクレオチド配列。
  24. 配列番号１２〜２２のいずれか１種として示される核酸配列を含む、請求項１から２３のいずれかに記載の修飾されたポリヌクレオチド配列。
  25. 配列番号１６〜２２のいずれか１種として示される核酸配列を含む、請求項１から２４のいずれかに記載の修飾されたポリヌクレオチド配列。
  26. ＨＳＶ−ＴＫ１６８ｄｍＮＥＳ（配列番号１８）を含む、請求項１から２５に記載のポリヌクレオチド配列。
  27. 修飾されたＨＳＶ−ＴＫポリペプチドをコードする請求項１から２６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクター。
  28. 第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、前記第２のポリペプチドが、治療用ポリペプチドである、請求項２７に記載のレトロウイルスベクター。
  29. 第２の治療用ポリペプチドが、第２の自殺遺伝子または成長因子である、請求項２８に記載のレトロウイルスベクター。
  30. 成長因子が、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−βおよび線維芽細胞成長因子からなる群から選択される、請求項２９に記載のレトロウイルスベクター。
  31. 第２の自殺遺伝子が、シトシンデアミナーゼ、ＶＳＶ−ｔｋ、ＩＬ−２、ニトロレダクターゼ（ＮＲ）、カルボキシルエステラーゼ、β−グルクロニダーゼ、シトクロムｐ４５０、β−ガラクトシダーゼ、ジフテリア毒素Ａ−鎖（ＤＴ−Ａ）、カルボキシペプチドＧ２（ＣＰＧ２）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）およびデオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）からなる群から選択される、請求項２９に記載のレトロウイルスベクター。
  32. ＰｉＴ−２またはＰｉＴ−１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２７に記載のレトロウイルスベクター。
  33. ターゲッティングポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２７に記載のレトロウイルスベクター。
  34. ターゲッティングポリペプチドが、細胞外タンパク質と結合する、請求項３３に記載のレトロウイルスベクター。
  35. 細胞外タンパク質が、コラーゲンである、請求項３４に記載のレトロウイルスベクター。
  36. それを必要とする対象に、請求項２７から３５に記載のレトロウイルスベクターを含む治療有効量のレトロウイルス粒子を投与し、その後、ヌクレオシドプロドラッグを投与することを含む、それを必要とする対象において新生物細胞を死滅させる方法。
  37. レトロウイルス粒子が、静脈内に、筋肉内に、皮下に、動脈内に、肝動脈内に、髄腔内に、腹膜内におよび／または腫瘍内に投与される、請求項３６に記載の方法。
  38. レトロウイルス粒子が、腫瘍内にまたは静脈内に投与される、請求項３６に記載の方法。
  39. レトロウイルスベクター粒子が、動脈内に投与される、請求項３６に記載の方法。
  40. 少なくとも１×１０１５ＴＶＰのレトロウイルスベクターが、それを必要とする対象に累積的に投与される、請求項３６に記載の方法。
  41. 少なくとも１×１０９ＴＶＰのレトロウイルスベクターが、それを必要とする対象に一度に投与される、請求項３６に記載の方法。
  42. プロドラッグが、レトロウイルスベクター粒子の投与後、約１〜２日の間投与される、請求項３６に記載の方法。
  43. プロドラッグが、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、アシクロビル、バラシクロビル、ペンシクロビルからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
  44. プロドラッグが、ガンシクロビルである、請求項３６に記載の方法。
  45. それを必要とする患者に、治療有効量の請求項２７から３５に記載のレトロウイルスベクター粒子を送達し、その後、ヌクレオシドプロドラッグを投与することを含む、それを必要とする患者において癌を治療する方法。
  46. レトロウイルス粒子が、静脈内に、筋肉内に、皮下に、動脈内に、肝動脈内に、髄腔内に、腹膜内におよび／または腫瘍内に投与される、請求項４０に記載の方法。
  47. レトロウイルス粒子が、腫瘍内にまたは静脈内に投与される、請求項４０に記載の方法。
  48. レトロウイルスベクター粒子が、動脈内に投与される、請求項４０に記載の方法。
  49. 少なくとも１×１０１５ＴＶＰのレトロウイルスベクターが、それを必要とする対象に累積的に投与される、請求項４０に記載の方法。
  50. 少なくとも１×１０９ＴＶＰのレトロウイルスベクターが、それを必要とする対象に一度に投与される、請求項４０に記載の方法。
  51. プロドラッグが、レトロウイルスベクター粒子の投与後、約１〜２日の間投与される、請求項４０に記載の方法。
  52. プロドラッグが、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、アシクロビル、バラシクロビル、ペンシクロビルからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
  53. プロドラッグが、ガンシクロビルである、請求項４０に記載の方法。
  54. ギャップ結合依存性細胞内情報伝達（ＧＪＩＣ）を増大する処理とともに、対象に治療有効量の、ＨＳＶ−ＴＫを含むレトロウイルスベクター粒子を送達することを含む、対象における新生物細胞のＨＳＶ−ＴＫガンシクロビル、バルガンシクロビル、アシクロビル、バラシクロビル、ペンシクロビル媒介性死滅を増大する方法。
  55. レトロウイルスベクター粒子が、請求項２７から３５に記載のレトロウイルスベクターを含む、請求項５４に記載の方法。
  56. ＧＪＩＣを増大する処理が、少なくとも１種のギャップ結合サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を送達することを含む、請求項５４に記載の方法。
  57. ギャップ結合サブユニットが、コネキシン４３、コネキシン３０またはコネキシン２６である、請求項５６に記載の方法。
  58. ギャップ結合サブユニットが、翻訳後修飾を防ぐよう修飾されたギャップ結合サブユニットである、請求項５６に記載の方法。
  59. ＧＪＩＣを増大する処理が、Ｅ−カドヘリンをコードするポリヌクレオチド配列を送達することを含む、請求項５４に記載の方法。
  60. ＧＪＩＣを増大する処理が、対象に、ゲムシタビン、ｃＡＭＰ、レチノイン酸、カロテノイド、グルココルチコイド、フラバノイド、アピゲニンまたはロバスタチンからなる群からの化合物を送達することを含む、請求項５４に記載の方法。
  61. ＧＪＩＣを増大する処理が、プロテアソーム阻害を含む、請求項５４に記載の方法。
  62. プロテアソーム阻害が、Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯ（ＡＬＬＮ）および／またはクロロキンの投与を含む、請求項６１に記載の方法。
  63. ＧＪＩＣを増大する処理が、放射線処理を含む、請求項５４に記載の方法。
  64. ＧＪＩＣを増大する処理が、電気的処理を含む、請求項５４に記載の方法。
  65. レトロウイルス粒子が、ＴＫ１６８ｄｍＮＥＳ（配列番号１８）を含む、請求項５４に記載の方法。
  66. ａ）細胞に、請求項１から２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を導入することと、
    ｂ）細胞が、発現されるチミジンキナーゼまたはその変異体を発現するのを可能にするまたは開始させることと、
    ｃ）細胞を、チミジンキナーゼによって細胞傷害性薬剤に変換される薬剤と接触させることと
    を含む、細胞を死滅させる方法。
  67. ＨＳＶ−ＴＫが、請求項１から２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項６６に記載の方法。
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