KR102077648B1 - 안전성 및 항암효과가 개선된 종양 용해 바이러스 - Google Patents

안전성 및 항암효과가 개선된 종양 용해 바이러스 Download PDF

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Abstract

본 발명은 안전성 및 항암효과가 개선된 종양 용해 바이러스 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 안전성 및 항암효과가 개선된 종양 용해 바이러스는 HSV-TK 단편을 코딩하는 유전자를 TK 유전자 부분에 삽입시켜 백시니아 바이러스의 TK를 결실시킨 것이다. 또한, 본 발명의 종양 용해 바이러스는 HSV-TK 단편을 발현함으로써 GCV를 인산화시켜 종양 용해 바이러스에 감염된 암세포 및 주변 암세포까지 사멸시킬 수 있다. 아울러, GCV가 바이러스 증식 억제에도 관여하여 고용량 바이러스 투여 시에도 바이러스로 인한 부작용을 통제할 수 있도록 하였다. 뿐만 아니라, GCV로 인한 바이러스 증식 억제로 인해 바이러스 입자의 수가 감소함에도 불구하고 함암효과가 증가되었다. 따라서, 본 발명의 안전성 및 항암효과가 개선된 종양 용해 바이러스는 암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

안전성 및 항암효과가 개선된 종양 용해 바이러스{ONCOLYTIC VIRUS WITH IMPROVED SAFETY AND ANTICANCER EFFECT}
본 발명은 안전성 및 항암효과가 개선된 종양 용해 바이러스 및 이의 용도에 관한 것이다.
유전자 재조합 기술이 본격적으로 사용되면서 종양 선택성과 항암 효능이 증가된 종양 용해 바이러스를 이용한 임상연구가 시작되었다. 문헌적으로 보고된 최초의 유전자 재조합 종양 용해 바이러스는 허피스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus)이다. 그 이후 다른 바이러스를 이용한 종양 용해에 대한 연구가 활발히 진행되었다(Martuza et al., 1991, Hwang et al., 2011; Kaufaman et al., 2015; Khuri et al., 2000; Park et al,. 2008).
종양 용해 바이러스의 유용성은 최근 미국과 유럽에서 허피스 바이러스 기반의 T-Vec(Talimogene laherparepvec)이 진행성 흑색종에서 상업화에 성공하면서 본격적으로 각광받게 되었다. 하지만, 티미딘 키나아제(Thymidine kinase, TK) 유전자가 결실된 백시니아 바이러스는 임상적 유용성은 크나, 협소한 치료 범위(narrow therapeutic window)로 임상적인 효과를 극대화시키기에 한계가 있었다. TK 결손 백시니아 바이러스의 치료범위가 좁다는 것은 고용량의 바이러스가 임상적 효능이 크나, 바이러스의 독성으로 인해 임상적 위험이 따른다는 것을 의미한다.
실제로 30명의 1차 간암 환자를 대상으로 진행된 신라젠사의 펙사벡(JX-594)의 2상 임상시험에서 고용량 투여군(109 pfu)이 저용량 투여군(108 pfu)보다 생존율이 증가되는 임상적 결과를 보여주었다(Heo et al., 2013). 하지만, 종양내 투여로 진행된 임상 1상에서 3x109 pfu에서 용량제한독성(Dose Limiting Toxicity, DLT)이 관찰되어 1x109 pfu에서 최대허용용량(Maximum Tolerable Dose, MTD)이 제한되었다. 약물과의 관련성은 없는 것으로 보고되었다. 하지만, 종양 용해 바이러스 치료 후 조기 사망이 자주 보고된바 있었으며, 이는 바람직하지 못한 바이러스의 증식으로 인해 예측하지 못한 결과를 초래할 수 있음을 나타낸다. 이러한 용량 의존적 유효성 증가와 용량제한독성은 보다 안전하고 효과적인 백시니아 바이러스의 개발이 필요함을 의미한다.
한편, 간시클로비르(Ganciclovir, GCV)는 허피스 심플렉스 바이러스, 싸이토메갈로 바이러스(Cytomegalovirus) 및 수두 대상포진 바이러스(varicella zoster virus)에 효과가 있는 항바이러스제이다. GCV는 허피스 심플렉스 바이러스의 TK와 결합하면 5'-말단이 인산화되어 트리포스페이트-GCV(triphosphate-ganciclovir, GCV-TP)로 전환되고, GCV-TP는 DNA 중합효소의 활성을 저해하고 DNA 3'-말단에 붙어 DNA 신장을 정지시킨다. GCV-TP는 고독성 물질로, 세포에서도 DNA 합성을 차단함으로써 세포독성을 나타낼 수 있다.
최근에는 HSV1-TK를 종양 용해 바이러스에 삽입하여 GCV와 함께 병용투여함으로써 종양세포를 사멸하도록 유도하는 항암치료 연구가 진행되고 있다. 일차적으로 종양 용해 바이러스가 종양세포를 감염시켜 직접적인 항암효과를 유도하고, HSV1-TK(suicide gene)가 GCV를 인산화시켜 종양세포 증식이 억제됨으로 인해 항암효과가 부가적으로 나타나는 것이다(Oliver W et al., Human Gene Therapy, Vol.10, No.16, 1999). HSV1-TK/GCV 시스템은 주로 아데노바이러스를 벡터로 하는 종양 용해 바이러스 치료에 사용되었다. 그러나, GCV를 병용투여 함으로써 기대하는 추가적인 세포독성 효과에 대해서는 아직 논란의 여지가 있다.
구체적으로, 복제가능 아데노바이러스(replication-competent adenovirus)에 HSV-TK 유전자를 삽입한 종양 용해 바이러스와 GCV를 함께 투여했을 때, 신경교종 세포에서의 세포독성효과가 유의미하게 증가하는 것이 관찰되었다. 반면, 복제가능 아데노바이러스에 HSV-TK를 삽입한 다른 많은 연구에서는 GCV 투여로 인해 부가되는 항암효과가 일관되게 나타나지 않고 있다(Lambright ES et al., Gene Ther, 8: 946-53). 이는 HSV-TK/GCV 시스템이 종양세포 증식 억제뿐만 아니라 바이러스 증식 억제에도 관여하기 때문에 그 효과가 서로 상반되어 상쇄되기 때문인 것으로 보고되고 있다(Widner O, Morris JC, 2000).
따라서, HSV-TK/GCV 시스템을 종양 용해 바이러스에 적용함에 있어 안전성을 확보함과 동시에 항암효과를 증대시킬 수 있는 구체적인 방법에 대해 연구가 필요한 실정이다.
Oliver W et al., Human Gene Therapy, Vol.10, No.16, 1999 Lambright ES et al., Gene Ther, 8: 946-53
이에 본 발명자들은 안전성 및 항암효과가 개선된 종양 용해 바이러스를 개발하기 위해 연구한 결과, HSV1-TK의 C-말단 일부가 절단된 HSV1-TK 단편 또는 이의 변이체를 코딩하는 유전자(HSV1-TKmut)를 포함한 재조합 백시니아 바이러스를 개발하였고, 이를 GCV와 병용 투여하는 경우 우수한 안전성과 항암효과를 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면은, HSV-TK(Herpes simplex virus thymidine kinase) 단편 또는 이의 변이체를 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, HSV-TK 단편 또는 이의 변이체를 코딩하는 염기서열을 포함하는 종양 용해 바이러스를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 종양 용해 바이러스를 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 종양 용해 바이러스 및 GCV(Ganciclovir) 또는 ACV(Acyclovir) 중 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 종양 용해 바이러스 및 GCV 또는 ACV 중 어느 하나를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, i) HSV-TK 단편 또는 이의 변이체를 코딩하는 염기서열을 포함하는 셔틀 플라스미드를 숙주세포로 형질주입시키고, 야생형 백시니아 바이러스를 숙주세포에 처리하는 단계; ii) 숙주세포를 배양하는 단계; 및 iii) 배양물로부터 바이러스를 수득하는 단계를 포함하는 HSV-TK 단편 또는 이의 변이체를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 안전성 및 항암효과가 개선된 종양 용해 바이러스는 HSV-TK 단편 또는 이의 변이체를 코딩하는 유전자를 TK 유전자 부분에 삽입시켜 백시니아 바이러스의 TK를 결실시킨 것이다. 또한, 본 발명의 종양 용해 바이러스는 HSV-TK 단편 또는 이의 변이체를 발현함으로써 GCV를 인산화시켜 종양 용해 바이러스에 감염된 암세포 및 주변 암세포까지 사멸시킬 수 있다. 아울러, GCV가 바이러스 증식 억제에도 관여하여 고용량 바이러스 투여 시에도 바이러스로 인한 부작용을 통제할 수 있도록 하였다. 뿐만 아니라, GCV로 인한 바이러스 증식 억제로 인해 바이러스 입자의 수가 감소함에도 불구하고 함암효과가 증가되었다. 따라서, 본 발명의 안전성 및 항암효과가 개선된 종양 용해 바이러스는 암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 재조합 백시니아 바이러스를 제조하기 위해 사용된 HSV1-TK 유전자가 적재된 셔틀 플라스미드 벡터를 도식화한 도면이다.
도 2는 재조합 백시니아 바이러스의 일 실시예로서, 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412)의 TK 유전자 부위에 HSV1-TKmut 유전자 및 파이어플라이 루시퍼라제(firefly luciferase) 유전자가 삽입된 것을 도식화한 도면이다.
도 3은 HSV1-TK 단편을 발현하는 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412)를 제조하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 4는 OTS-412에서 HSV1-TK 단편이 발현되는 것을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 도면이다.
도 5는 제한효소 절단(restriction enzyme mapping) 방법을 통해 OTS-412 DNA 내 HSV1-TKmut 유전자가 삽입된 것을 확인한 도면이다.
도 6은 HCT-116 암세포주에 OTS-412를 처리하고 24시간 및 48시간이 경과한 후, OTS-412의 감염 및 증식량을 확인한 도면이다.
도 7은 NCI-H460 및 NCI-H23 암세포주에서의 GCV 처리에 따른 OTS-412의 증식량 변화를 확인한 도면이다.
도 8은 HCT-116 암세포주에서의 GCV 처리에 따른 OTS-412의 세포독성 변화를 확인한 도면이다.
도 9는 A549, NCI-H460, HT-29 및 HCT-116 암세포주에 각각 OTS-412 또는 OTS-412와 GCV를 병용 처리한 후, 암세포주의 세포생존율을 나타낸 도면이다.
도 10은 A549 및 NCI-H460 암세포주에 각각 GCV, OTS-412 또는 OTS-412와 GCV를 병용 처리한 후, A549 및 NCI-H460 암세포주의 세포자멸(apoptosis)과 괴사(necrosis) 패턴을 분석한 도면이다.
도 11은 A549 및 NCI-H460 암세포주에 각각 GCV, OTS-412 또는 OTS-412와 GCV를 병용 처리한 후, 암세포주의 세포생존율을 나타낸 도면이다.
도 12는 HCT-116 암세포주를 식립(transplant)한 마우스에 식염수(Saline), OTS-412 또는 OTS-412와 GCV를 병용 투여한 후, 12일 동안의 종양 크기 변화를 나타낸 도면이다.
도 13은 HCT-116 암세포주를 식립한 마우스에 PBS, OTS-412 또는 OTS-412와 GCV를 병용 투여한 후, 마우스 내 OTS-412의 분포를 생체발광영상(Bioluminescence image)으로 촬영한 사진이다.
도 14는 HCT-116 암세포주를 식립한 마우스에 OTS-412 또는 OTS-412와 GCV를 병용 투여한 후, 종양조직에서 검출된 총 바이러스 입자 수를 나타낸 도면이다.
도 15는 HCT-116 암세포주를 식립한 마우스에 식염수, OTS-412 또는 OTS-412와 GCV를 병용 투여한 후, 12일 동안의 체중 변화를 나타낸 도면이다.
도 16은 Renca 암세포주를 식립한 마우스에 식염수, OTS-412 또는 OTS-412와 GCV를 병용 투여한 후, 24일 동안의 종양 크기 변화를 나타낸 도면이다.
도 17은 Renca 암세포주를 식립한 마우스에 식염수, OTS-412 또는 OTS-412와 GCV를 병용 투여한 후, 종양조직에서 검출된 총 바이러스 입자 수를 나타낸 도면이다.
도 18은 Renca 암세포주를 식립한 마우스에 식염수, OTS-412 또는 OTS-412와 GCV를 병용 처리한 후, 종양조직을 TUNEL 염색하여 촬영한 사진이다.
도 19는 Renca 암세포주를 식립한 마우스에 식염수, OTS-412 또는 OTS-412와 GCV를 병용 처리한 후, 종양조직을 TUNEL 염색하여 괴사된 부분을 수치화하여 나타낸 도면이다.
도 20은 HCT-116 암세포주를 식립한 마우스에 식염수, OTS-412 또는 OTS-412와 GCV를 병용 투여한 후, 21일 동안의 종양 크기 변화를 나타낸 도면이다.
도 21은 HCT-116 암세포주를 식립한 마우스에 식염수, OTS-412 또는 OTS-412와 GCV를 병용 투여한 후, 종양조직을 면역조직화학(IHC) 염색하여 촬영한 사진이다.
도 22는 HCT-116 암세포주를 식립한 마우스에 식염수, OTS-412 또는 OTS-412와 GCV를 병용 투여한 후, 종양조직을 면역조직화학(IHC) 염색하여 염색된 부분을 수치화하여 나타낸 도면이다.
도 23은 HCT-116 암세포주를 식립한 마우스에 식염수, OTS-412 또는 OTS-412와 GCV를 병용 투여한 후, 종양조직을 H&E 염색하여 괴사된 부분을 수치화하여 나타낸 도면이다.
도 24는 HCT-116 암세포주를 식립한 마우스에 식염수, OTS-412 또는 OTS-412와 GCV를 병용 투여한 후, 종양조직을 H&E 염색하여 남아있는 종양조직의 면적을 수치화하여 나타낸 도면이다.
도 25는 HCT-116 암세포주를 식립한 마우스에 식염수, OTS-412 또는 OTS-412 와 GCV를 병용 투여한 후, 21일 동안의 체중 변화를 나타낸 도면이다.
도 26은 13종의 암세포주에 OTS-412를 처리한 후 암세포주의 세포생존율을 나타낸 도면이다.
도 27은 HCT-116, SK-MEL-28 및 DU145 암세포주에 각각 OTS-412를 처리한 후, IC50 값을 확인한 도면이다.
도 28은 HCT-116 암세포주를 식립한 마우스에 OTS-412를 복강 내 투여한 후, 3일째 및 7일째에 마우스 내 OTS-412의 분포를 생체발광영상으로 촬영한 사진이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 HSV-TK(Herpes simplex virus thymidine kinase) 단편 또는 이의 변이체를 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어 “TK(thymidine kinase)”란, 티미딘 키나아제로 뉴클레오티드의 생합성에 관여하는 효소를 의미한다. 상기 TK는 세포 및 바이러스의 뉴클레오티드의 생합성에 모두 쓰이는 효소이다. 상기 TK의 유래는 허피스 심플렉스 바이러스 유래일 수 있다. 이때, 허피스 심플렉스 바이러스는 허피스 심플렉스 바이러스 1형(Herpes Simplex Virus type1, HSV1) 또는 허피스 심플렉스 바이러스 2형(Herpes Simplex Virus type2, HSV2)일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 “HSV-TK(Herpes simplex virus thymidine kinase)”란, 허피스 심플렉스 바이러스의 티미딘 키나아제 효소를 의미한다. 구체적으로, 상기 HSV-TK는 HSV1-TK(Herpes simplex virus type 1 thymidine kinase)일 수 있다. 상기 HSV1-TK는 허피스 심플렉스 바이러스 내 DNA 합성 과정 중 초기 인산화 반응에 관여하는 효소이다. 또한, HSV-TK는 항바이러스 물질인 GCV(ganciclovir) 또는 ACV(acyclovir)의 인산화에도 관여한다. 특히, HSV1-TK는 다른 바이러스 내에 존재하는 TK보다 약 10배 정도 GCV 또는 ACV에 민감하게 반응한다.
본 발명에서 사용하는 용어 “HSV-TK 단편”은 HSV-TK 아미노산 일부가 결실된 것을 의미한다. 구체적으로, 상기 HSV-TK 단편은 HSV-TK의 N-말단 또는 C-말단의 일부가 결실된 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 HSV-TK 단편은 C-말단의 일부가 결실된 것일 수 있다. 일 구체예로서, HSV-TK 단편은 C-말단으로부터 연속적으로 1개 내지 195개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다. 상기 HSV-TK 단편은 C-말단으로부터 연속적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190 또는 195개가 결실된 것일 수 있다.
본 발명의 HSV1-TK 단편 또는 이의 변이체는 적응진화를 유도하여 변이된 바이러스로부터 유래된 것일 수 있다. 본 발명자들은 최적화된 HSV1-TK 단편 또는 이의 변이체를 발현하는 백시니아 바이러스를 개발하기 위해, HSV1-TK 유전자를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스를 제조한 후, TK 미존재하에 적응진화를 유도하였다. 재조합 백시니아 바이러스의 루시퍼라제(luciferase) 활성, 유전체 분석 및 GCV에 대한 민감도 실험을 통해 HSV1-TK 단편 또는 이의 변이체를 발현하는 백시니아 바이러스(OTS-412)를 선별하였다. HSV1-TK 단편 또는 이의 변이체는 3'-말단의 상당한 절단에도 불구하고 GCV에 대한 민감도를 유지하였다. 또한, HSV1-TK 단편 또는 이의 변이체를 발현하는 백시니아 바이러스와 GCV를 병용 투여할 경우, 항암효과가 증가하는 것을 확인하였다.
상기 HSV-TK 단편은 HSV1-TK 단편일 수 있다. 상기 HSV1-TK 단편의 일 구체예로는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 C-말단으로부터 연속적으로 1 내지 195, 24 내지 149, 30 내지 46개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 HSV1-TK 단편은 C-말단으로부터 연속적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190 또는 195개가 결실된 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 HSV1-TK 단편은 C-말단으로부터 연속적으로 24, 30, 70, 99, 149 또는 195개의 아미노산이 결실된 것일 수 있다. 상기 HSV1-TK 단편은 C-말단의 아미노산 일부를 결실함에 따라 GCV에 대한 민감도가 감소될 수 있다.
상기 HSV1-TK 단편의 일 실시예로는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 C-말단으로부터 연속적으로 195개, 149개, 99개, 70개, 46개, 30개, 24개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 HSV1-TK 단편은 서열번호 2 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 HSV1-TK 단편을 코딩하는 염기서열은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 C-말단으로부터 연속적으로 1 내지 195, 24 내지 149, 30 내지 46개의 아미노산 잔기가 결실된 것을 코딩하는 염기서열일 수 있다. 구체적으로, 상기 HSV1-TK 단편을 코딩하는 염기서열은 서열번호 2 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 코딩하는 염기서열일 수 있다. 바람직하게는, 상기 HSV1-TK 단편을 코딩하는 염기서열은 서열번호 9의 염기서열일 수 있다.
상기 HSV-TK 단편의 변이체는 HSV1-TK 단편의 변이체일 수 있다. 구체적으로, 상기 HSV1-TK 단편의 변이체는 HSV1-TK 단편을 구성하고 있는 아미노산 잔기 중 1개 이상이 치환된 것일 수 있다. 특히, HSV1-TK 단편의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 1번째 내지 145번째까지의 아미노산 잔기를 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예로서, 상기 HSV1-TK 단편의 변이체는 서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 HSV1-TK 단편의 변이체를 코딩하는 염기서열은 서열번호 10 또는 11의 염기서열일 수 있다.
상기 바이러스 벡터는 유전자를 세포에 도입하거나 바이러스를 생산하기 위한 벡터이다. 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스(Adenovirus), 허피스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus), 렌티바이러스(Lentivirus), 레트로바이러스(Retrovirus), 아데노부속바이러스(Adeno-associated virus), 백시니아 바이러스(Vaccinia virus) 또는 폭스바이러스(Poxvirus)로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, HSV-TK 단편 또는 이의 변이체를 코딩하는 염기서열을 포함하는 종양 용해 바이러스를 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어 “종양 용해 바이러스”란, 암세포에 특이적으로 복제하도록 바이러스의 유전자를 조작하여 암세포를 파괴하는 재조합 바이러스를 의미한다. 상기 종양 용해 바이러스는 아데노바이러스(Adenovirus), 허피스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus), 홍역 바이러스(Measles virus), 렌티바이러스(Lentivirus), 레트로바이러스(Retrovirus), 싸이토메갈로 바이러스(Cytomegalovirus), 배큘로바이러스(baculovirus), 리오바이러스(Reovirus), 아데노부속바이러스(Adeno-associated virus), 점액종 바이러스(Myxoma virus), 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus), 폴리오바이러스(Poliovirus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 파보바이러스(Parvovirus), 코사키 바이러스(Coxsackie virus), 세네카바이러스 (Senecavirus), 백시니아 바이러스(Vaccinia virus) 또는 폭스바이러스(Poxvirus)로부터 유래된 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 종양 용해 바이러스는 백시니아 바이러스로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD-J(International Health Division-J) 또는 IHD-W(International Health Division-White) 백시니아 바이러스 주(strain)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 HSV-TK 단편은 HSV1-TK 단편일 수 있다. 상기 HSV1-TK 단편의 일 구체예로는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 C-말단으로부터 연속적으로 1 내지 195, 24 내지 149, 30 내지 46개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 HSV1-TK 단편은 C-말단으로부터 연속적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190 또는 195개가 결실된 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 HSV1-TK 단편은 C-말단으로부터 연속적으로 24, 30, 70, 99, 149 또는 195개의 아미노산이 결실된 것일 수 있다. 상기 HSV1-TK 단편은 C-말단의 아미노산 일부를 결실함에 따라 GCV에 대한 민감도가 감소될 수 있다.
상기 HSV1-TK 단편의 일 실시예로는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 C-말단으로부터 연속적으로 195개, 149개, 99개, 70개, 46개, 30개, 24개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 HSV1-TK 단편은 서열번호 2 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 HSV1-TK 단편을 코딩하는 염기서열은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 C-말단으로부터 연속적으로 1 내지 195, 24 내지 149, 30 내지 46개의 아미노산 잔기가 결실된 것을 코딩하는 염기서열일 수 있다. 구체적으로, 상기 HSV1-TK 단편을 코딩하는 염기서열은 서열번호 2 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 코딩하는 염기서열일 수 있다. 바람직하게는, 상기 HSV1-TK 단편을 코딩하는 염기서열은 서열번호 9의 염기서열일 수 있다.
상기 HSV-TK 단편의 변이체는 HSV1-TK 단편의 변이체일 수 있다. 구체적으로, 상기 HSV1-TK 단편의 변이체는 HSV1-TK 단편을 구성하고 있는 아미노산 잔기 중 1개 이상이 치환된 것일 수 있다. 특히, HSV1-TK 단편의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 1번째 내지 145번째까지의 아미노산 잔기를 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예로서, 상기 HSV1-TK 단편의 변이체는 서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 HSV1-TK 단편의 변이체를 코딩하는 염기서열은 서열번호 10 또는 11의 염기서열일 수 있다.
상기 종양 용해 바이러스는 바이러스 내에 존재하는 TK 유전자가 결손된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 종양 용해 바이러스는 바이러스에 존재하는 TK 유전자 부분에 상기 HSV1-TK 단편을 코딩하는 염기서열을 삽입 또는 치환시켜 기존 바이러스의 TK 유전자를 결손시킨 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 백시니아 바이러스의 TK 유전자 부분에 HSV1-TK 단편을 코딩하는 염기서열을 삽입시켜 백시니아 바이러스의 TK 유전자를 결손시켰다.
본 발명에서 사용하는 용어 “유전자 결손”이란, 유전자 일부 결실, 전부 결실, 또는 유전자 내부에 외래 유전자가 삽입시켜 유전자가 발현되지 않는 것을 의미한다. 상기 유전자 일부 결실 시 N-말단 또는 C-말단 일부가 결실된 것일 수 있다. 즉, 종양 용해 바이러스 자체가 가지고 있는 TK 유전자는 전부 또는 일부 유전자가 결실된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예로는 HSV-TK 단편을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412)를 HCT-116 암세포주에 감염시킨 후 감염 및 증식량을 확인하였다(도 6). 또한, OTS-412의 항암효과를 확인하기 위해, OTS-412를 13종의 암세포주에 감염시켜 72시간 동안 배양한 후, 암세포주의 세포 생존율을 측정하여 OTS-412가 암세포를 사멸시키는 것을 확인하였다(도 26). 따라서, 본 발명의 HSV-TK 단편을 코딩하는 염기서열을 포함하는 종양 용해 바이러스는 암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, HSV-TK 단편 또는 이의 변이체를 코딩하는 염기서열을 포함하는 종양 용해 바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
약학 조성물에 유효성분으로 포함되는 종양 용해 바이러스는 상술한 바와 같다.
상기 종양 용해 바이러스의 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 환자에게 1x103 내지 1x1018의 바이러스 입자(virus particle), 감염능을 가지는 바이러스 단위(TCID50) 또는 플라크 형성 단위(pfu)를 투여하는 것일 수 있다. 구체적으로는, 1x103, 2x103, 5x103, 1x104, 2x104, 5x104, 1x105, 2x105, 5x105, 1x106, 2x106, 5x106, 1x107, 2x107, 5x107, 1x108, 2x108, 5x108, 1x109, 2x109, 5x109, 1x1010, 5x1010, 1x1011, 5x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017, 1x1018 또는 그 이상의 바이러스 입자, 감염능을 가지는 바이러스 단위 또는 플라크 형성 단위를 투여하는 것으로써, 상기 사이에 다양한 수 및 범위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 종양 용해 바이러스는 1x103 내지 1x1010 pfu 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 종양 용해 바이러스를 1x106, 1x107, 1x108 pfu로 투여하였다.
상기 암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선압, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 비소세포성암 폐암, 결장암, 골암, 안구내 흑색종, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호치킨 병, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 만성 백혈병, 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 생리적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 비경구 투여를 위한 제제로서 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
상기 약학 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있는데, 종양 내(intratumoral), 복강내(intraperitoneal), 피하(sub-cutaneous), 피내(intra-dermal), 림프절내(intra-nodal) 및 정맥 내(intra-venous) 등에 적당한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 종양 내 투여, 복강 투여 또는 정맥 투여 일 수 있다. 한편, 상기 약학 조성물의 투여량은 투여 스케줄, 투여량 및 환자의 건강 상태 등에 따라 결정될 수 있다.
본 발명자들은 A549, NCI-H460, HT-29 및 HCT-116 암세포주에 OTS-412 및 GCV 병용 투여한 후 암세포주의 세포 생존율을 측정하여 병용 투여함에 따라 항암효과가 증가하는 것을 확인하였다(도 9). 또한, 상기 OTS-412 및 GCV를 암세포주에 병용 투여하여도 일정 수준의 증식능력을 유지하는 것을 확인하였다(도 14). 따라서, HSV-TK 단편 또는 이의 변이체를 코딩하는 염기서열을 포함하는 종양 용해 바이러스 및 GCV는 암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, HSV-TK 단편 또는 이의 변이체를 코딩하는 염기서열을 포함하는 종양 용해 바이러스 및 GCV(Ganciclovir) 또는 ACV(Acyclovir)를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물은 종양 용해 바이러스 및 GCV 또는 ACV를 동시, 순차적, 또는 역순으로 병용 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은 종양 용해 바이러스 및 GCV 또는 ACV를 동시에 투여할 수 있다. 또한. 상기 약학 조성물은 종양 용해 바이러스를 먼저 투여한 후 GCV 또는 ACV를 투여할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 종양 용해 바이러스를 먼저 투여한 후 GCV 또는 ACV를 투여하고 다시 종양 용해 바이러스를 투여할 수 있다.
약학 조성물에 유효성분으로 포함되는 종양 용해 바이러스는 상술한 바와 같다.
상기 종양 용해 바이러스의 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 환자에게 1x103 내지 1x1018 의 바이러스 입자(virus particle), 감염능을 가지는 바이러스 단위(TCID50) 또는 플라크 형성 단위(pfu)를 투여하는 것일 수 있다. 구체적으로는, 1x103, 2x103, 5x103, 1x104, 2x104, 5x104, 1x105, 2x105, 5x105, 1x106, 2x106, 5x106, 1x107, 2x107, 5x107, 1x108, 2x108, 5x108, 1x109, 2x109, 5x109, 1x1010, 5x1010, 1x1011, 5x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017, 1x1018 또는 그 이상의 바이러스 입자, 감염능을 가지는 바이러스 단위 또는 플라크 형성 단위를 투여하는 것으로써, 상기 사이에 다양한 수 및 범위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 종양 용해 바이러스는 1x103 내지 1x1010 pfu 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 종양 용해 바이러스를 1x106, 1x107, 1x108 pfu로 투여하였다.
본 발명에서 사용하는 용어 “GCV”란, 간시클로비르(Ganciclovir)로 불리며 허피스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus), 싸이토메갈로 바이러스(Cytomegalovirus) 및 수두 대상포진 바이러스(varicella zoster virus)에 효과가 있는 항바이러스제를 의미한다. 상기 GCV는 바이러스의 TK에 의해 5'-말단이 인산화되어 트리포스페이트 간시클로비르(triphosphate-ganciclovir, GCV-TP)로 전환되고, GCV-TP는 바이러스 DNA 중합효소의 활성을 저해하고 바이러스의 DNA 3'-말단에 붙어 DNA 신장을 정지시킬 수 있다. 또한, 인산화된 GCV는 세포 DNA 복제를 중단시켜 세포 성장을 억제시킬 수 있다. 상기 GCV는 하기 화학식 1과 같다.
[화학식 1]
Figure 112018131683331-pat00001
본 발명에서 사용하는 용어 “ACV”란, 아시클로비르(Aciclocir)로 불리며, 허피스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus), 수두 대상포진 바이러스(varicella zoster virus) 및 EB 바이러스(Epstein-Barr virus)에 효과가 있는 항바이러스제를 의미한다. 상기 ACV는 바이러스의 TK에 의해 인산화되어 트리포스페이트 아시클로비르(triphosphate-aciclovir, ACV-TP)로 전환되고, ACV-TP는 바이러스 DNA 중합효소의 활성을 저해하고 바이러스의 DNA 3'-말단에 붙어 DNA 신장을 정지시킬 수 있다. 상기 ACV는 하기 화학식 2과 같다.
[화학식 2]
Figure 112018131683331-pat00002
또한, 상기 GCV 또는 ACV는 0.1 ㎍/㎏ 내지 50 ㎎/㎏ 용량으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 GCV 또는 ACV의 투여량은 0.1 ㎍/㎏ 내지 50 ㎎/㎏, 1 ㎍/㎏ 내지 40 ㎎/㎏, 5 ㎍/㎏ 내지 30 ㎎/㎏, 10 ㎍/㎏ 내지 20 ㎎/㎏로 투여할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 GCV의 투여량은 50 ㎎/㎏로 투여하였다.
상기 암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선압, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 비소세포성암 폐암, 결장암, 골암, 안구내 흑색종, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호치킨 병, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 만성 백혈병, 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 생리적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 비경구 투여를 위한 제제로서 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
상기 약학 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있는데, 종양 내, 복강내, 피하, 피내, 림프절내 및 정맥 내 등에 적당한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 종양 내 투여, 복강 투여 또는 정맥 투여 일 수 있다. 한편, 상기 약학 조성물의 투여량은 투여 스케줄, 투여량 및 환자의 건강 상태 등에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, HSV-TK 단편 또는 이의 변이체를 코딩하는 염기서열을 포함하는 종양 용해 바이러스 및 GCV 또는 ACV를 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 종양 용해 바이러스, GCV 및 ACV는 상술한 바와 같다.
상기 종양 용해 바이러스의 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 환자에게 1x103 내지 1x1018 의 바이러스 입자(virus particle), 감염능을 가지는 바이러스 단위(TCID50) 또는 플라크 형성 단위(pfu)를 투여하는 것일 수 있다. 구체적으로는, 1x103, 2x103, 5x103, 1x104, 2x104, 5x104, 1x105, 2x105, 5x105, 1x106, 2x106, 5x106, 1x107, 2x107, 5x107, 1x108, 2x108, 5x108, 1x109, 2x109, 5x109, 1x1010, 5x1010, 1x1011, 5x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017, 1x1018 또는 그 이상의 바이러스 입자, 감염능을 가지는 바이러스 단위 또는 플라크 형성 단위를 투여하는 것으로써, 상기 사이에 다양한 수 및 범위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 종양 용해 바이러스는 1x103 내지 1x1010 pfu 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 종양 용해 바이러스를 1x106, 1x107, 1x108 pfu로 투여하였다.
또한, 상기 GCV 또는 ACV는 0.1 ㎍/㎏ 내지 50 ㎎/㎏ 용량으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 GCV 또는 ACV의 투여량은 0.1 ㎍/㎏ 내지 50 ㎎/㎏, 1 ㎍/㎏ 내지 40 ㎎/㎏, 5 ㎍/㎏ 내지 30 ㎎/㎏, 10 ㎍/㎏ 내지 20 ㎎/㎏로 투여할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 GCV의 투여량은 50 ㎎/㎏로 투여하였다.
상기 GCV 또는 ACV는 종양 용해 바이러스 투여 중 또는 후에 적어도 1회 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 GCV 또는 ACV는 종양 용해 바이러스 투여 후 24시간 후부터 약 2주간 투여될 수 있다. 상기 GCV 또는 ACV는 종양 용해 바이러스 투여 후 주 2회, 5 내지 18일 동안 투여될 수 있다.
상기 암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선압, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 비소세포성암 폐암, 결장암, 골암, 안구내 흑색종, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호치킨 병, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 만성 백혈병, 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 생리적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 비경구 투여를 위한 제제로서 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
상기 약학 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있는데, 종양 내, 복강내, 피하, 피내, 림프절내 및 정맥 내 등에 적당한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 종양 내 투여, 복강 투여 또는 정맥 투여 일 수 있다. 한편, 상기 약학 조성물의 투여량은 투여 스케줄, 투여량 및 환자의 건강 상태 등에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "개체"란, 본 발명의 암세포 표적화 조성물을 투여하여 질환이 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태이거나 질환을 앓고 있는 사람을 의미한다.
또한, 상기 종양 용해 바이러스 및 GCV는 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, i) HSV-TK 단편 또는 이의 변이체를 코딩하는 염기서열을 포함하는 셔틀 플라스미드를 숙주세포로 형질주입시키고, 야생형 백시니아 바이러스를 숙주세포에 처리하는 단계; ii) 숙주세포를 배양하는 단계; 및 iii) 배양물로부터 바이러스를 수득하는 단계를 포함하는 HSV-TK 단편 또는 이의 변이체를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 HSV-TK 단편은 HSV1-TK 단편일 수 있다. 상기 HSV1-TK 단편의 일 구체예로는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 C-말단으로부터 연속적으로 1 내지 195, 24 내지 149, 30 내지 46개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 HSV1-TK 단편은 C-말단으로부터 연속적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190 또는 195개가 결실된 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 HSV1-TK 단편은 C-말단으로부터 연속적으로 24, 30, 70, 99, 149 또는 195개의 아미노산이 결실된 것일 수 있다. 상기 HSV1-TK 단편은 C-말단의 아미노산 일부를 결실함에 따라 GCV에 대한 민감도가 감소될 수 있다.
상기 HSV1-TK 단편의 일 실시예로는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 C-말단으로부터 연속적으로 195개, 149개, 99개, 70개, 46개, 30개, 24개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 HSV1-TK 단편은 서열번호 2 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 HSV1-TK 단편을 코딩하는 염기서열은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 C-말단으로부터 연속적으로 1 내지 195, 24 내지 149, 30 내지 46개의 아미노산 잔기가 결실된 것을 코딩하는 염기서열일 수 있다. 구체적으로, 상기 HSV1-TK 단편을 코딩하는 염기서열은 서열번호 2 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 코딩하는 염기서열일 수 있다. 바람직하게는, 상기 HSV1-TK 단편을 코딩하는 염기서열은 서열번호 9의 염기서열일 수 있다.
상기 HSV-TK 단편의 변이체는 HSV1-TK 단편의 변이체일 수 있다. 구체적으로, 상기 HSV1-TK 단편의 변이체는 HSV1-TK 단편을 구성하고 있는 아미노산 잔기 중 1개 이상이 치환된 것일 수 있다. 특히, HSV1-TK 단편의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 1번째 내지 145번째까지의 아미노산 잔기를 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예로서, 상기 HSV1-TK 단편의 변이체는 서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 HSV1-TK 단편의 변이체를 코딩하는 염기서열은 서열번호 10 또는 11의 염기서열일 수 있다.
상기 형질주입은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 형질주입 방법은 CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질주입법, PEG를 이용한 형질주입법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질주입 방법 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 숙주세포는 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO 세포, Hela 세포, COS 세포, NSO 세포, 293 세포, 보우 멜라노마세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포일 수 있다. 일 구체예로는, 상기 숙주세포는 Hela 세포일 수 있다.
상기 야생형 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD-J(International Health Division-J) 또는 IHD-W(International Health Division-White) 백시니아 바이러스 주(strain)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 셔틀 플라스미드와 야생형 백시니아 바이러스는 동일한 백시니아 바이러스 유전자의 상동 영역을 포함할 수 있다. 셔틀 플라스미드 및 야생형 백시니아 바이러스는 바람직하게는, 각 요소가 선별될 수 있도록 하기 위해 상이한 복제기원 및/또는 마커를 포함할 수 있다.
상기 숙주세포를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 본 발명의 HSV1-TK 단편을 발현하는 재조합 백시니아 바이러스를 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 배양은 유가 배양(fed batch) 또는 반복 유가 배양 공정(repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족시킬 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용할 수 있다. 이외에 탄소원으로는 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함될 수 있다. 또한, 상기 탄소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 일 구체예로서, 배양에 사용된 배지는 우태아 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 EMEM 배지일 수 있다.
또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.
또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 상기 배양 시간은 2시간 내지 80시간일 수 있다. 바람직하게는, 상기 배양 시간은 4시간 내지 76시간 일 수 있다.
상기 배양물로부터 바이러스를 수득하는 방법은 숙주세포를 회수한 다음 동결 및 해동을 반복하여 세포를 용해시키고, 이를 동결 및 해동을 반복하여 크루드 바이러스를 수득한 후, 상기 크루드 바이러스를 이용하여 통상적인 방법으로 플라크 분리(plaque isolation)를 반복하여 순수한 재조합 백시니아 바이러스를 수득할 수 있다. 하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412) 제조
실시예 1.1. 셔틀 플라스미드 벡터 제작
ATCC(American Type Culture Collection)에서 야생형 백시니아 바이러스(NYC Department of Health strain, VR-1536)를 구입하였다. 재조합을 위해 HSV1-TK 유전자(pSE/L promoter)와 firefly luciferase reporter(p7.5 promoter) 유전자를 가진 pUC57amp+ (genewiz, USA)를 셔틀 플라스미드 벡터로 사용하였다(도 1).
실시예 1.2. 변이된 백시니아 바이러스 제조
재조합 바이러스를 확보하기 위하여, Hela 세포(ATCC)를 6-웰 플레이트에 4x105 세포/웰 조건 및 10% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지 상태로 준비하였다. 야생형 백시니아 바이러스 0.05 MOI를 처리하고, 2시간 후, 2% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지로 교체하고 상기 실시예 1.1에서 제작된 선형화시킨 셔틀 플라스미드 벡터 4 ㎍을 XfectTM polymer(Clonetech 631317, USA)로 세포 내에 전달하였다. 4시간 배양 후, 세포를 2% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지로 교체한 후 72시간 추가 배양하였다. HeLa 세포에서 루시퍼라제(luciferase) 활성을 확인하여 HSV1-TK 유전자를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스를 확보하였다.
그 후, TK- 골육종(osteosarcoma 143 TK-)세포주에서 BrdU(Thymidine analogue, 15 ㎍/㎖) 존재 하, TK 기능이 없는 세포를 선택할 수 있는 생화학적 환경(TK- selection pressure)이 가해진 상태에서 10회의 연속 계대 배양을 통해 HSV1-TK의 돌연변이를 유도하였다. 변이된 백시니아 바이러스의 아미노산 서열 분석(amino acid sequencing)을 마크로젠에 의뢰하였다. 그 결과, 변이된 백시나아 바이러스의 HSV1-TK의 C-말단의 46번째 아미노산인 글루타민(Gln)을 코딩하는 코돈(caa)이 스탑 코돈(stop codon)으로 점 돌연변이(point mutation)된 것을 확인하였다. 또한, 변이된 백시나아 바이러스의 HSV1-TK의 46번째 이후의 C-말단의 아미노산 잔기들이 결실된 것을 확인하였다. 최종적으로, 유전적 안정성이 확보된 HSV1-TK 단편을 발현하는 변이된 백시니아 바이러스(OTS-412)를 획득하였다(도 2 및 도 3).
또한, 다른 돌연변이체의 HSV1-TK 유전자를 분석한 결과, HSV1-TK의 C-말단에서부터 24, 30, 70, 99, 149 또는 195개의 아미노산이 결실된 것을 확인하였다. 나아가, 다른 돌연변이체의 HSV1-TK 유전자를 분석한 결과, HSV1-TK의 N-말단에서부터 1번째부터 145번째까지의 아미노산 잔기를 포함하는 181개 또는 227의 아미노산으로 이루어진 HSV1-TK 단편의 변이체를 확인하였다.
실시예 2. OTS-412 내 HSV1-TK 단편 발현 확인 및 HSV1-TK mut 유전자 확인
상기 실시예 1.2에서 제조한 OTS-412 내 HSV1-TK 단편을 발현하는지 확인하기 위해, OTS-412를 HeLa 셀에 처리하여 감염시키고 24시간 후에 세포를 수집한 후, 세포를 용해시켜 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 변성(denature)과정을 거친 후, 각 시료당 40 ㎍을 SDS-PAGE gel에 로딩하여 전기영동하였다. 전기영동 후 PVDF 막으로 이동시켜 1차 항체인 항-HSV1-TK 항체와 반응시켰다. 그 후, PBST로 세척한 후, 2차 항체인 HRP이 표지된 항-염소 항체와 반응시켰다. 다시 PBST로 세척한 후, 발광시약(Chemiluminescent reagent)를 처리하고 Chemiluminescent Image system(Davinch K)를 이용하여 확인하였다. 그 결과, HSV1-TK 단편 단백질이 바이러스에서 발현되는 것을 확인하였다(도 4).
실시예 3. OTS-412 내 HSV1-TK mut 유전자 도입 확인
OTS-412 내에 HSV1-TKmut 유전자가 삽입된 것을 확인하기 위해, 야생형 백시니아 바이러스와 OTS-412를 제한효소 절단 방법(restriction enzyme mapping) 방법으로 확인하였다. 야생형 백시니아 바이러스 또는 OTS-412 인간 골육종 세포에 감염 시킨 후, 바이러스를 분리하여 바이러스 게놈 DNA를 대량 추출하여 음성대조군(Wild type-VV)과 양성대조군(OTS-412)을 확보하였다.
확보된 바이러스 DNA를 HindIII 제한효소(10 units/2.5 ㎍)로 절단한 후, DNA 전기영동 장치를 이용하여 크기별로 분리하였다(도 5). 그 결과, 음성대조군과 양성대조군을 비교하였을 때, 4kb와 8kb 사이에 일치하는 4개 밴드(화살표)와 불일치하는 1개의 밴드(점선 화살표)를 확인하였다. 불일치 하는 밴드는 백시니아 바이러스 TK 부위에 HSV1-TKmut 유전자와 파이어플라이 루시퍼라제(firefly luciferase) 유전자가 삽입되어 유전자 규모가 크게 나타난 것으로, 야생형 백시니아 바이러스와는 다른 OTS-412의 고유한 밴드 패턴임을 확인하였다. 수 차례 계대 배양 후의 야생형 백시니아 바이러스와 OTS-412를 대조군과 비교하였을 때도 각각의 대조군과 같은 밴드 패턴이 관찰됨으로써 OTS-412 내 HSV1-TKmut 유전자가 유전적 안정성을 가지는 것을 확인하였다.
실시예 4. OTS-412의 GCV 투여에 의한 증식 능력 감소 확인 ( in vitro )
상기 실시예 1.2에서 제조한 OTS-412의 암세포 감염 및 증식능력을 확인하였다. HCT-116 암세포주에 1 MOI(1 pfu/cells)의 OTS-412를 처리하고 24시간 및 48시간이 경과한 후, 바이러스 플라크 분석(plaque assay)을 통해 역가(titration)를 측정하였다.
그 결과, 24시간 경과하였을 때, 암세포주가 OTS-412에 감염된 것을 확인하였다. 48시간이 경과하였을 때 24시간이 경과하였을 때보다 OTS-412가 약 2.5배 정도 증식한 것을 확인하였다(도 6).
이러한 증식능력을 갖고 있는 OTS-412에 GCV를 처리한 후 증식량의 변화를 확인하기 위해, 백시니아 바이러스만이 특정하게 발현하는 E9L을 기반으로 정량적 중합 효소 연쇄 반응 분석(qPCR)을 수행하였다.
구체적으로, E9L 유전자를 인식하면서 상보적인 DNA의 두가닥중에 한쪽에만 결합하는 프로브를 제작하였다. 제작한 프로브는 바이러스가 한번 증식 할 때 한 번의 발광이 측정되도록 하였다. NCI-460 및 NCI-H23 암세포주에 각각 1 MOI(1 pfu/cells)의 OTS-412 또는 OTS-412와 GCV를 병용 처리하여 2시간 동안 감염시킨 후, 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 각 바이러스 추출용 kit를 사용해서 DNA 추출하고 1 ng/ 5 ㎕ 농도로 희석하여 qPCR를 진행하였다.
그 결과, NCI-460 및 NCI-H23 암세포주 모두에서 OTS-412와 GCV를 병용 처리한 경우, OTS-412를 단독으로 투여했을 때와 비교했을 때, 약 45% 정도의 OTS-412의 증식능력이 감소한 것을 확인하였다(도 7). 이를 통해, OTS-412 내 HSV1-TK 단편이 GCV에 대한 민감도가 있음을 확인하였다.
실시예 5. OTS-412의 세포독성 확인 ( in vitro )
GCV에 의해 OTS-412 바이러스 증식이 억제됨에도 불구하고, OTS-412의 세포독성이 유지되는지를 확인하기 위해, 야생형 HSV1-TK를 발현하는 백시니아 바이러스를 처리한 그룹, GCV를 처리한 그룹 및 OTS-412와 GCV를 처리한 그룹간의 세포독성을 비교하였다. 구체적으로, HCT-116 암세포주에서 0.05 MOI(0.05 pfu/cells)의 OTS-412와 GCV(50 ㎍)를 각각 처리한 후 72시간 동안 배양한 뒤 CCK8(Cell Counting Kit 8)을 이용하여 세포독성을 분석하였다.
그 결과, OTS-412은 GCV와 병용 처리하여도 세포독성이 95% 이상으로 유지되는 반면, 야생형 HSV1-TK를 발현하는 백시니아 바이러스의 경우 세포독성이 거의 나타나지 않았다(도 8). 야생형 HSV1-TK를 발현하는 백시니아 바이러스의 경우 GCV에 의한 민감도가 높아 바이러스 증식이 완전히 억제되어 종양세포를 살상하는 효과가 거의 나타나지 않는 것을 확인하였다.
실시예 6. OTS-412 및 GCV 병용 투여에 따른 항암효과 확인 ( in vitro )
OTS-412와 GCV의 병용 투여에 따른 항암효과를 확인하기 위해 2종의 인간 폐암세포주인 A549 및 NCI-H460 암세포주와 2종의 인간 대장암세포주인 HT-29 및 HCT-116 암세포주에서 OTS-412 및 GCV 투여에 따른 세포 독성을 평가하였다. 구체적으로, A549, NCI-H460, HT-29 및 HCT-116 암세포주에 각각 OTS-412를 각각 0.01, 0.1 또는 1 MOI로 감염시켰다. 감염시킨 4종의(A549, NCI-H460, HT-29, NCI-H460) 암세포에는 GCV를 100 μM, HCT-116 암세포에는 50 μM을 처리하여 72시간 동안 배양한 후, CCK8(Cell Counting Kit8)을 이용하여 세포독성을 분석하였다.
그 결과, NCI-H460 및 HCT-116 암세포주에서 OTS-412와 GCV를 병용 처리한 암세포주의 세포생존율이 OTS-412만을 단독 투여한 암세포주의 세포생존율보다 유의미하게 낮았다. 반면, A549 및 HT-29 암세포주에서는 OTS-412와 GCV를 병용 처리한 암세포주의 세포생존율과 OTS-412만을 단독 투여한 암세포주의 세포생존율이 유의미한 차이를 보이지 않았다. 이를 통해, OTS-412에 의한 직접적인 종양세포의 사멸에 이어, GCV에 의한 추가적인 세포독성 효과를 확인하였다(도 9).
또한, 유동세포분석법(FACS)을 통해 OTS-412와 GCV의 병용 투여에 따른 세포 사멸과 괴사를 확인하였다. 구체적으로, A549 및 NCI-H460에 GCV 단독처리, OTS-412, 또는 OTS-412와 GCV를 병용 처리한 후, Annexin V/PI 염색하여 유동세포분석을 수행하였다. 이때, 살아 있는 세포는 Anneixn V 와 PI가 모두 음성으로 나타나고, 세포사멸 초기에는 세포막의 투과성이 변화되어 Annexin V가 양성으로 나타난다. 또한, 세포사멸 말기에는 세포막의 파괴로 핵이 노출되어 Annexin V와 PI 모두 양성으로 나타나 이를 이용하여 세포의 생존 여부를 감별하였다.
그 결과, GCV 단독처리에 의한 세포사멸은 확인되지 않았으나, A549 세포에 OTS-412 처리 시 19.64%의 세포사멸이 확인되었고, OTS-412와 GCV를 병용 처리한 경우 35.06% 세포사멸을 확인하였다. 또한, NCI-H460 세포에 OTS-412 처리 시 6.58%의 세포사멸이 확인되었고, OTS-412와 GCV를 병용 처리한 경우 12.78%의 세포사멸을 확인하였다(도 10). 또한, FACS 결과를 수치화하여 비교한 결과, OTS-412 단독 처리한 군에 비교하였을 때 GCV에 의한 추가적인 독성효과를 확인하였다(도 11).
실시예 7. OTS-412 및 GCV 병용 투여에 따른 항암효과 확인 ( in vivo )
실시예 7.1. HCT-116 암세포주가 식립된 마우스 모델을 이용한 OTS-412 및 GCV 병용 투여에 따른 항암효과 확인 (종양 내 투여)
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에, 5x106 세포수의 인간 대장암 세포주인 HCT-116 암세포주(한국세포주은행)로 이종이식(xenograft)을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎣ 내지 150 ㎣에 도달할 때까지 관찰한 뒤 OTS-412 또는 OTS-412와 GCV를 종양 내 병용 투여하였다.
제작한 인간 대장암세포 이식 마우스를 3개 그룹으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며, 종양 용해 바이러스(OTS-412, 1x106 pfu)를 투여받는 그룹을 양성 대조군으로 설정하였다. 또한, 종양 용해 바이러스(OTS-412, 1x106 pfu)와 GCV(25 ㎎/㎏)를 병용 투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 이때, 각각의 약물은 1일째에 한 번 투여하였다.
투여 후 12일째, 각 군의 마우스의 종양 크기를 측정한 결과, 음성 대조군 마우스의 종양 크기는 600 ㎣으로 측정되었으며, 양성 대조군 마우스의 종양 크기는 음성 대조군보다 약 66% 정도 작은 200 ㎣으로 측정되었다. 반면, 실험군 마우스의 종양 크기는 음성 대조군과 비교하였을 때, 약 75% 정도 작은 150 ㎣으로 측정되었다(도 12). 이를 통해 인간 대장암세포주에서 OTS-412와 GCV를 병용 투여할 경우 항암 효과가 증가하는 것을 확인하였다.
바이러스 분포를 확인하기 위하여, 7일째 각 그룹에 대한 생체발광영상(Bioluminescence image) 분석을 하였다. 생체발광영상은 OPTIX MX3 장비에 마우스를 고정시킨 후 마취상태에서 D-루시페린(D-luciferin)을 주입하여 이미지를 촬영하였다. OTS-412를 단독 투여한 그룹과 GCV 병용 투여한 그룹의 형광세기를 비교한 결과, GCV 병용 투여 시 바이러스 증식이 억제되는 것을 확인하였다(도 13).
바이러스 증식 억제를 확인하기 위하여 12일 째 희생시킨 마우스로부터 종양을 분리하여 조직에서 유전체(genomic) DNA를 추출하였고, 백시니아 바이러스만 특정하게 발현되는 E9L을 기반으로 정량적 중합효소연쇄반응 분석(qPCR)을 수행하였다.
그 결과, OTS-412와 GCV를 병용 처리한 경우 OTS-412 바이러스 입자가 OTS-412를 단독으로 투여한 그룹보다 약 50% 정도 낮게 검출되었으며, 통계적으로도 유의미한 차이가 나는 것을 확인하였다. 따라서, GCV에 의해 바이러스 증식이 억제되는 것을 확인하였다(도 14).
또한, OTS-412의 단독투여 및 OTS-412와 GCV를 병용투여에 대한 안전성을 확인하기 위해, 대조군과 실험군에 각각의 약물을 투여한 후, 투여한 당일, 3일, 6일, 9일 및 12일차에 마우스의 체중을 측정하였다. 마우스의 체중은 12일차의 체중에서 종양의 무게를 차감하여 계산하였다.
그 결과, 세 그룹 모두 마우스의 체중이 증가된 양상을 보였으며, 그룹 간의 차이는 거의 나타나지 않았다(도 15). 이로 OTS-412와 GCV 병용 투여에 대한 안전성이 확인되었다.
이를 통해, HCT-116 식립 마우스 실험을 통해 OTS-412와 GCV의 병용 투여로 바이러스 증식을 효과적으로 통제할 수 있으면서 항암효과가 유지되는 것을 확인하였다.
실시예 7.2. Renca 암세포주가 식립된 마우스 모델을 이용한 OTS-412 및 GCV 병용 투여에 따른 항암효과 확인
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 7주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5x107 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식(allograft)을 수행하였다. 종양의 크기가 300 ㎣ 내지 500 ㎣에 도달할 때까지 관찰한 뒤 종양 용해 바이러스 투여를 시작하였다. 한편, Renca 세포는 in vitro에서 종양 용해 바이러스에 완전한 내성을 가지는 세포주이므로 바이러스 증식의 한계를 가지나, 동종이식 모델에서의 효과를 분석하기 위해 수행하였다.
제작한 마우스 신장암세포 이식 마우스를 3개 그룹으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며, 종양 용해 바이러스(OTS-412, 1x107 pfu)를 주당 1회 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 종양 용해 바이러스(OTS-412, 5x106 pfu)를 주당 2회 투여받으면서 GCV(25 ㎎/㎏)를 투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 상기 마우스 신장암세포 이식 마우스에 종양 용해 바이러스는 종양 내 투여하였고, GCV는 복강 내로 투여하였다. 이때, 음성대조군과 실험군에 각각 PBS와 GCV를 종양 용해 바이러스를 투여하지 않는 날마다 투여하였다.
24일 째, 각 군의 마우스의 종양 크기를 측정한 결과, 음성 대조군 마우스의 종양 크기는 1,350 ㎣으로 측정되었으며, 양성 대조군 마우스의 종양 크기는 음성 대조군보다 약 10% 정도 작은 1,200 ㎣으로 측정되었다. 반면, 실험군 마우스의 종양 크기는 음성 대조군과 비교하였을 때, 약 45% 정도 작은 700 ㎣으로 측정되었다. 이를 통해 종양 용해 바이러스에 내성을 가지는 암세포주에서도 OTS-412와 GCV를 병용 투여할 경우 바이러스 단독 투여에 비해 유의미하게 항암 효과가 증가하는 것을 확인하였다(도 16).
또한, OTS-412 투여 23일 째 희생시킨 마우스로부터 종양을 분리하여 조직에서 유전체 DNA를 추출하였고, 백시니아 바이러스만 특정하게 발현되는 E9L을 기반으로 정량적 중합효소 연쇄반응분석 수행하였다.
그 결과, OTS-412와 GCV를 병용 처리한 경우 OTS-412 바이러스 입자가 OTS-412를 단독으로 투여한 그룹보다 약 50% 정도 낮게 검출되었으며, 통계적으로도 유의미한 차이가 나는 것을 확인하였다. 따라서, GCV에 의해 바이러스 증식이 효과적으로 통제되는 것을 확인하였다(도 17).
또한, OTS-412 투여 24일 째 마우스를 희생시키고 종양조직을 분리하여 TUNEL 분석을 수행하였다. 파라포름알데하이드(Paraformaldehyde)로 고정한 조직을 절단하였다. 그 후, 절단한 조직을 프로테이나제 K(Proteinase K)로 15분간 항원 복원과정(antigen retrieval)을 거친 후, apoptosis detection kit을 사용하여 dUTP가 표지된 FITC를 처리하여 종양조직의 세포사멸을 관찰하였다.
그 결과, OTS-412와 GCV를 병용 처리한 그룹에서 세포사멸이 증가된 것을 확인하였다(도 18). 이때, 세포가 사멸한 것은 적색형광(TRITC)으로 나타나며, 세포의 핵은 파란색 형광(DAPI)으로 염색하였다. 또한, TUNEL 분석 결과 이미지의 통계 처리가 필요하다고 판단되어 해당 면적을 수치화한 결과, OTS-412와 GCV를 병용처리한 그룹이 OTS-412 단독처리한 그룹에 비해 2배 정도 낮게 나타난 것을 확인하였다(도 19).
실시예 7.3. HCT-116 암세포주가 식립된 마우스 모델을 이용한 OTS-412 및 GCV 병용 투여에 따른 항암효과 확인 (복강 내 투여)
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 2.5x106 세포수의 인간 대장암 세포주인 HCT-116 암세포주(한국세포주은행)로 이종이식(xenograft)을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎣ 내지 150 ㎣에 도달할 때까지 관찰한 뒤 OTS-412 또는 OTS-412와 GCV를 복강 내 투여하였다.
상기 제작한 인간 대장암세포 이식 마우스를 3개 그룹으로 분류하였다. 식염수를 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며, 종양 용해 바이러스(OTS-412, 1x108 pfu)를 투여받는 그룹을 양성 대조군으로 설정하였다. 또한, 종양 용해 바이러스(OTS-412, 1x108 pfu)와 GCV(50 ㎎/㎏)를 투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 이때, HCT-116 이식 마우스에 모든 약물은 복강 내 투여하였고, 종양 용해 바이러스 는 주당 2회 투여하였으며, 바이러스를 투여하지 않는 날마다 음성대조군과 실험군에 각각 PBS와 GCV를 투여하였다.
그 결과, 21일 째 마우스를 희생하여 종양의 크기를 측정하였을 때, 대조군에서는 종양의 크기가 약 8배 증가하였으나, OTS-412와 GCV를 투여받은 그룹은 대조군에 비해 약 40% 정도로 크기가 작게 유지되는 것을 확인하였다(도 20).
또한, 종양조직에서 바이러스 감염정도를 확인하기 위해 면역조직화학 분석(immunohistochemistry, IHC)을 수행하였다. 종양조직을 분리하여 파라핀 블럭을 만들어 분할한 뒤, 크실렌(xylene)과 에틸알코올(ethyl alcohol)을 이용하여 파라핀을 제거하였다. 항원 복원기(decloaking chamber)를 이용해 항원을 회수한 후 1차 항체(vaccinia virus antibody, ab35219)를 붙이고 FITC가 접합된 2차 항체를 붙인 뒤 형광현미경을 이용해 관찰하였다.
그 결과, PBS를 처리한 대조군에서는 종양 용해 바이러스가 확인되지 않았고, OTS-412를 처리한 그룹의 종양조직에서는 종양 용해 바이러스가 확인되었다. GCV를 병용 투여한 그룹에서도 종양 용해 바이러스가 확인되었으나, 그 정도는 OTS-412 단독 투여한 그룹에 비해 적게 검출되었다(도 21 및 도 22).
또한, 마우스 종양조직을 분리하여 H&E 염색을 수행하였다. 구체적으로, 21일차에 각 군의 마우스를 희생하여 종양 조직을 분리하여 종양 조직으로 파라핀 블록을 만든 뒤, 분할하여 파라핀을 제거하고 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)에 각각 담근 후 건조시켜 봉입한 뒤 슬라이드 스캐너를 이용해 관찰하였다. H&E 염색을 통해 종양조직이 괴사된 비율을 측정 하고 전체 종양의 크기에서 괴사된 부분을 제외한 생존한 종양의 크기(viable tumor size)를 측정하였다. 그 결과, 대조군과 비교하였을 때, 실험군의 종양조직의 괴사의 정도가 대조군에 비해 유의미하게 높은 것을 확인하였다(도 23)
또한, 각 그룹의 모든 마우스의 종양조직을 H&E 염색한 후 괴사한 부분을 제외한 면적의 크기를 측정하여 대조군과 비교하였을 때, OTS-412와 GCV를 병용 투여한 실험군 마우스의 종양조직의 면적이 대조군 마우스의 종양조직의 면적에 비해 약 40% 정도 적은 것을 확인하였다(도 24).
마우스의 체중을 3일째, 7일째, 10일째, 14일째, 17일째, 21일 째 측정하여 약물의 독성을 평가하였다. 바이러스를 주입하고 3일 째 두 그룹에서 몸무게의 감소가 나타났지만, 7일 째 몸무게가 약 95% 정도로 회복되었다. 그 후, OTS-412와 GCV를 투여 받은 그룹의 경우 21일째까지 몸무게가 유지되는 양상을 보여 약물 투여의 안전성을 확인하였다(도 25).
실시예 8. 다양한 암세포주에서의 OTS-412 의 세포독성 ( in vitro )
다양한 암세포주에서 OTS-412의 항암효과를 확인하기 위해 HeLa, PC-3, DU-145, HT-29, HCT-116, A549, NCI-H23, NCI-H460, MCF-7, MDA-MB-231, 4T1, Renca 및 B16F10 암세포주에서 독성을 평가하였다. HeLa, A549, 4T1, B16F10 세포는 ATCC(미국)로부터 입수하였고, 나머지 9종의 암세포주는 한국세포주은행(KCLB)으로부터 입수하였다.
구체적으로, 상기 암세포주들에 각각 0.5 MOI(1 pfu/cells)의 OTS-412를 처리하여 암세포주를 감염시킨 후 48시간, 72시간 동안 배양하였다. 그 후, CCK8(Cell Counting Kit8)을 이용하여 세포독성을 분석하였다.
자궁경부암 세포주(HeLa), 폐암 세포주(A549, NCI-H23, HCI-H460), 전립선암 세포주(PC-3, DU145), 직장암 세포주(HT-29, HCT-116), 유방암(MCF-7, MDA-MB-231, 4T1), 흑생종(B16F10) 및 쥐의 신장암 세포주(Renca) 등 총 13개의 암세포주를 분석한 결과, 4T1, Renca, B16F10 세포주에서 80% 이상의 생존률을 보이며 상대적으로 높은 저항성을 나타내었지만, 나머지 암세포주에서는 72시간후 대부분은 40% 이하의 생존률을 보이며 높은 세포독성을 나타내는 것을 확인하였다(도 26).
또한, in vitro상에서의 세포독성를 측정하기 위해, 암세포의 활성도가 50% 저해되는 농도인 IC50를 측정하였다. 이때, HCT-116, SK-MEL-29, DU145 세포에 OTS-412를 각각 0.1, 0.3, 0.6, 1 MOI(pfu/cell)를 투여하였다. 세포독성은 CCK-8 (Cell Counting Kit 8)을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 측정하였다. 그 결과, 각각의 HCT-116, SK-MEL-29, DU145 세포에서 OTS-412의 IC50는 0.24 pfu, 0.37 pfu, 0.08 pfu로 확인되었다(도 27).
실시예 9. OTS-412의 복강 내 투여 후 바이러스 분포 확인( in vivo )
HCT-116 암세포를 이식한 마우스에 고용량의 OTS-412 바이러스(1×107 pfu/mouse)를 복강 내 투여하고 전신투여(systemic injection) 경로로 바이러스가 종양을 표적화하여 전달되는지를 확인하였다.
생체발광영상(Bioluminescence image)으로 분석한 결과, 바이러스가 종양을 표적화하는 것을 확인하였고, 3일째 보다 7일째 바이러스가 증식하여 시그널이 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 28).
<110> Bionoxx Inc. <120> ONCOLYTIC VIRUS WITH IMPROVED SAFETY AND ANTICANCER EFFECT <130> FPD201812-0070 <150> US 62/611,174 <151> 2017-12-28 <150> KR 10-2018-0106841 <151> 2018-09-07 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 376 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-376 aa fregment of HSV1-TK (OTS-410) <400> 1 Met Ala Ser Tyr Pro Cys His Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala 1 5 10 15 Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg 20 25 30 Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Leu Glu Gln Lys Met Pro Thr 35 40 45 Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr Thr 50 55 60 Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr 65 70 75 80 Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Gln Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr 85 90 95 Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile 100 105 110 Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met 115 120 125 Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Val Gly 130 135 140 Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile 145 150 155 160 Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg 165 170 175 Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala 180 185 190 Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu 195 200 205 Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly 210 215 220 Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly 225 230 235 240 Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ser Trp Trp 245 250 255 Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala 260 265 270 Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu 275 280 285 Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu 290 295 300 Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg 305 310 315 320 Pro Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys 325 330 335 Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met Val Gln Thr His Val 340 345 350 Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe 355 360 365 Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn 370 375 <210> 2 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-330 aa fregment of HSV1-TK (OTS-412) <400> 2 Met Ala Ser Tyr Pro Cys His Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala 1 5 10 15 Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg 20 25 30 Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Leu Glu Gln Lys Met Pro Thr 35 40 45 Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr Thr 50 55 60 Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr 65 70 75 80 Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Gln Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr 85 90 95 Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile 100 105 110 Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met 115 120 125 Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Val Gly 130 135 140 Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile 145 150 155 160 Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg 165 170 175 Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala 180 185 190 Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu 195 200 205 Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly 210 215 220 Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly 225 230 235 240 Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ser Trp Trp 245 250 255 Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala 260 265 270 Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu 275 280 285 Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu 290 295 300 Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg 305 310 315 320 Pro Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp 325 330 <210> 3 <211> 277 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-277 aa fregment of HSV1-TK(OTS-411) <400> 3 Met Ala Ser Tyr Pro Cys His Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala 1 5 10 15 Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg 20 25 30 Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Leu Glu Gln Lys Met Pro Thr 35 40 45 Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr Thr 50 55 60 Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr 65 70 75 80 Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Gln Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr 85 90 95 Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile 100 105 110 Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met 115 120 125 Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Val Gly 130 135 140 Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile 145 150 155 160 Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg 165 170 175 Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala 180 185 190 Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu 195 200 205 Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly 210 215 220 Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly 225 230 235 240 Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ser Trp Trp 245 250 255 Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala 260 265 270 Glu Pro Gln Ser Asn 275 <210> 4 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-306 aa fregment of HSV1-TK(OTS-411a) <400> 4 Met Ala Ser Tyr Pro Cys His Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala 1 5 10 15 Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg 20 25 30 Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Leu Glu Gln Lys Met Pro Thr 35 40 45 Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr Thr 50 55 60 Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr 65 70 75 80 Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Gln Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr 85 90 95 Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile 100 105 110 Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met 115 120 125 Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Val Gly 130 135 140 Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile 145 150 155 160 Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg 165 170 175 Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala 180 185 190 Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu 195 200 205 Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly 210 215 220 Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly 225 230 235 240 Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ser Trp Trp 245 250 255 Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala 260 265 270 Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu 275 280 285 Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu 290 295 300 Tyr Asn 305 <210> 5 <211> 346 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-346 aa fregment of HSV1-TK(OTS-411b) <400> 5 Met Ala Ser Tyr Pro Cys His Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala 1 5 10 15 Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg 20 25 30 Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Leu Glu Gln Lys Met Pro Thr 35 40 45 Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr Thr 50 55 60 Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr 65 70 75 80 Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Gln Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr 85 90 95 Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile 100 105 110 Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met 115 120 125 Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Val Gly 130 135 140 Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile 145 150 155 160 Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg 165 170 175 Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala 180 185 190 Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu 195 200 205 Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly 210 215 220 Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly 225 230 235 240 Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ser Trp Trp 245 250 255 Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala 260 265 270 Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu 275 280 285 Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu 290 295 300 Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg 305 310 315 320 Pro Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys 325 330 335 Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly 340 345 <210> 6 <211> 352 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-352 aa fregment of HSV1-TK(OTS-411c) <400> 6 Met Ala Ser Tyr Pro Cys His Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala 1 5 10 15 Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg 20 25 30 Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Leu Glu Gln Lys Met Pro Thr 35 40 45 Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr Thr 50 55 60 Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr 65 70 75 80 Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Gln Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr 85 90 95 Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile 100 105 110 Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met 115 120 125 Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Val Gly 130 135 140 Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile 145 150 155 160 Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg 165 170 175 Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala 180 185 190 Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu 195 200 205 Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly 210 215 220 Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly 225 230 235 240 Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ser Trp Trp 245 250 255 Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala 260 265 270 Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu 275 280 285 Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu 290 295 300 Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg 305 310 315 320 Pro Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys 325 330 335 Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met Val Gln Thr His Val 340 345 350 <210> 7 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 227 aa fregment of HSV1-TK <400> 7 Met Ala Ser Tyr Pro Cys His Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala 1 5 10 15 Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg 20 25 30 Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Leu Glu Gln Lys Met Pro Thr 35 40 45 Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr Thr 50 55 60 Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr 65 70 75 80 Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Gln Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr 85 90 95 Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile 100 105 110 Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met 115 120 125 Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Val Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Trp Glu Phe Thr Cys Pro Ala Pro Gly Pro His Pro His 145 150 155 160 Leu Arg Pro Pro Ser His Arg Arg Pro Pro Val Leu Pro Gly Arg Ala 165 170 175 Ile Pro Tyr Gly Gln His Asp Pro Pro Gly Arg Ala Gly Val Arg Gly 180 185 190 Pro His Pro Ala Asp Leu Ala Arg His Lys His Arg Val Gly Gly Pro 195 200 205 Ser Gly Gly Gln Thr His Arg Pro Pro Gly Gln Thr Pro Ala Pro Arg 210 215 220 Arg Ala Ala 225 <210> 8 <211> 181 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 181 aa fregment of HSV1-TK <400> 8 Met Ala Ser Tyr Pro Cys His Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala 1 5 10 15 Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg 20 25 30 Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Leu Glu Gln Lys Met Pro Thr 35 40 45 Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr Thr 50 55 60 Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr 65 70 75 80 Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Gln Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr 85 90 95 Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile 100 105 110 Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met 115 120 125 Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Val Gly 130 135 140 Gly Arg Leu Gly Val His Met Pro Arg Pro Arg Pro Ser Pro Ser Ser 145 150 155 160 Ser Thr Ala Ile Pro Ser Pro Pro Ser Cys Ala Thr Arg Pro Arg Asp 165 170 175 Thr Leu Trp Ala Ala 180 <210> 9 <211> 993 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for 330 aa fregment of HSV1-TK (OTS-412) <400> 9 ttagtcgtaa tccaggataa agacgtgcat gggacggagg cgtttggcca agacgtccaa 60 ggcccaggca aacacgttat acaggtcgcc gttgggggcc agcaactcgg gggcccgaaa 120 cagggtaaat aacgtgtccc cgatatgggg tcgtgggccc gcgttgctct ggggctcggc 180 accctggggc ggcacggccg tccccgaaag ctgtccccaa tcctcccacc acgacccgcc 240 gccctgcaga taccgcaccg tattggcaag cagcccgtaa acgcggcgaa tcgcggccag 300 catagccagg tcaagccgct cgccggggcg ctggcgtttg gccaggcggt cgatgtgtct 360 gtcctccgga agggccccca acacgatgtt tgtgccgggc aaggtcggcg ggatgagggc 420 cacgaacgcc agcacggcct ggggggtcat gctgcccata aggtatcgcg cggccgggta 480 gcacaggagg gcggcgatgg gatggcggtc gaagatgagg gtgagggccg ggggcggggc 540 atgtgaactc ccagcctccc ccccgacatg aggagccaga acggcgtcgg tcacggcata 600 aggcatgccc attgttatct gggcgcttgt cattaccacc gccgcgtccc cggccgatat 660 ctcaccctgg tcgaggcggt gttgtgtggt gtagatgttc gcgattgtct cggaagcccc 720 cagcacctgc cagtaagtca tcggctcggg tacgtagacg atatcgtcgc gcgaacccag 780 ggccaccagc agttgcgtgg tggtggtttt ccccatcccg tgaggaccgt ctatataaac 840 ccgcagtagc gtgggcattt tctgctccag gcggacttcc gtggcttctt gctgccggcg 900 agggcgcaac gccgtacgtc ggttgctatg gccgcgagaa cgcgcagcct ggtcgaacgc 960 agacgcgtgt tgatggcagg ggtacgaagc cat 993 <210> 10 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for 227 aa fregment of HSV1-TK <400> 10 atggcttcgt acccctgcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60 ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120 cgcctggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata tagacggtcc tcacgggatg 180 gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac 240 gtacccgagc cgatgactta ctggcaggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc 300 tacaccacac aacaccgcct cgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta 360 atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 420 cctcatgtcg gggggggagg ctgggagttc acatgccccg cccccggccc tcaccctcat 480 cttcgaccgc catcccatcg ccgccctcct gtgctacccg gccgcgcgat accttatggg 540 cagcatgacc ccccaggccg tgctggcgtt cgtggccctc atcccgccga ccttgcccgg 600 cacaaacatc gtgttggggg cccttccgga ggacagacac atcgaccgcc tggccaaacg 660 ccagcgcccc ggcgagcggc ttga 684 <210> 11 <211> 546 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for 181 aa fregment of HSV1-TK <400> 11 atggcttcgt acccctgcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60 ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120 cgcctggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata tagacggtcc tcacgggatg 180 gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac 240 gtacccgagc cgatgactta ctggcaggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc 300 tacaccacac aacaccgcct cgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta 360 atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 420 cctcatgtcg gggggaggct gggagttcac atgccccgcc cccggccctc accctcatct 480 tcgaccgcca tcccatcgcc gccctcctgt gctacccggc cgcgcgatac cttatgggca 540 gcatga 546

Claims (41)

  1. HSV-TK(Herpes simplex virus thymidine kinase) 단편을 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 백시니아 바이러스 벡터로서,
    상기 HSV-TK 단편은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 재조합 백시니아 바이러스 벡터.
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  11. HSV-TK 단편을 코딩하는 염기서열을 포함하는 종양 용해 백시니아 바이러스로서,
    상기 HSV-TK 단편은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 종양 용해 백시니아 바이러스.
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  22. 제11항의 종양 용해 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 종양 용해 백시니아 바이러스가 1x103 pfu 내지 1x1010 pfu 용량으로 투여되는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  24. 제 22항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선압, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 비소세포성암 폐암, 결장암, 골암, 안구내 흑색종, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호치킨 병, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 만성 백혈병, 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  25. 제11항의 종양 용해 백시니아 바이러스; 및 GCV(Ganciclovir) 또는 ACV(Aciclovir)를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  26. 제 25항에 있어서,
    상기 조성물은 종양 용해 백시니아 바이러스; 및 GCV 또는 ACV가 동시 또는, 순차적으로 병용 투여되는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  27. 삭제
  28. 제 25항에 있어서,
    상기 GCV 또는 ACV가 0.1 ㎍/㎏/day 내지 50 ㎎/㎏/day 용량으로 투여되는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  29. 제 25항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선압, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 비소세포성암 폐암, 결장암, 골암, 안구내 흑색종, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호치킨 병, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 만성 백혈병, 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  30. 삭제
  31. 제 25항에 있어서,
    상기 종양 용해 백시니아 바이러스가 1x103 pfu 내지 1x1010 pfu 용량으로 투여되는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  32. 삭제
  33. 제 26항에 있어서,
    상기 GCV 또는 ACV가 종양 용해 백시니아 바이러스 투여 중 또는 후에 적어도 1회 투여되는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  34. 제 26항에 있어서,
    상기 GCV 또는 ACV가 종양 용해 백시니아 바이러스 투여 후 24시간 후부터 2주간 투여되는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  35. 제 26항에 있어서,
    상기 GCV 또는 ACV가 주 2회, 5 내지 18일 동안 연속으로 투여되는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  36. 삭제
  37. 제 26항에 있어서,
    상기 종양 용해 백시니아 바이러스가 종양 내(intratumoral), 복강 내(intraperitoneal) 또는 정맥 내(intra-venous)로 투여되는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  38. i) HSV-TK 단편을 코딩하는 염기서열을 포함하는 셔틀 플라스미드를 숙주세포로 형질주입시키고, 야생형 백시니아 바이러스를 숙주세포에 도입하는 단계;
    ii) 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    iii) 배양물로부터 바이러스를 수득하는 단계를 포함하는 HSV-TK 단편을 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 제조방법으로서,
    상기 HSV-TK 단편은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 재조합 백시니아 바이러스 제조방법.
  39. 삭제
  40. 제 38항에 있어서,
    상기 HSV-TK 단편을 코딩하는 염기서열은 서열번호 9의 염기서열인 것인, 재조합 백시니아 바이러스 제조방법.
  41. 삭제
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