JP2021118683A - 組換えワクシニアウイルス - Google Patents

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Abstract

【課題】複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ＲＶＶ）、ＲＶＶを含む組成物、および腫瘍を有する個体において、腫瘍溶解を誘導するためのＲＶＶまたは組成物の使用方法を提供する。【解決手段】対応する野生型ウイルスに比較して、ウイルスゲノム中に修飾を含む複製可能組換えＲＶＶであって、修飾が、ウイルスゲノム中に：（１）免疫刺激サイトカインポリペプチドをコードする、挿入されたヌクレオチド配列；および（２）異種チミジンキナーゼ（ＴＫ）ポリペプチドをコードする、挿入されたヌクレオチド配列を含む、複製可能組換えＲＶＶである。【選択図】なし

Description

関連出願に
対するクロスリファレンス
本出願は、２０２０年１月９日に出願された米国仮出願第６２／９５９，０８３号の恩典を請求し、該出願の開示は、その全体が本明細書に援用される。
テキストファイルとして提供される配列表の参照による援用
配列表は、２０２０年１２月３日に作成され、そして６９ＫＢのサイズを有するテキストファイル、「ＰＣ７２５７６Ａ＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」として本明細書とともに提供される。テキストファイルの内容は、その全体が本明細書に援用される。
背景
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、癌細胞を選択的にまたは優先的に感染させ、そして殺すウイルスである。生存複製ＯＶは、多様なヒト癌における臨床試験において試験されてきている。ＯＶは、抗腫瘍免疫反応、ならびに腫瘍細胞の直接溶解（すなわち腫瘍溶解）を誘導しうる。ＯＶは、天然に存在してもよいし、または他のウイルスを修飾することによって構築されてもよい。一般的なＯＶには、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、アデノウイルス（Ａｄ）、麻疹ウイルス（ＭＶ）、コクサッキーウイルス（ＣＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、およびワクシニアウイルス（ＶＶ）の弱毒化株に基づいて構築されているものが含まれる。
ＶＶは、ポックスウイルス科オルソポックスウイルス属のメンバーである。該ウイルスは、長さおよそ１９０ｋｂの直鎖二本鎖ＤＮＡゲノムを有し、約２００遺伝子をコードする。ＶＶは宿主細胞の細胞質中で複製する。ＶＶの大きなゲノムは、ウイルスＤＮＡ複製に用いられる多様な酵素およびタンパク質をコードする。複製中、ＶＶは、外膜が異なるいくつかの感染型：細胞内成熟ビリオン（ＩＭＶ）、細胞内エンベロープビリオン（ＩＥＶ）、細胞会合エンベロープビリオン（ＣＥＶ）および細胞外エンベロープビリオン（ＥＥＶ）を産生する。ＩＭＶは最も豊富な感染型であり、そして宿主間の伝播に関与すると考えられ；ＣＥＶは細胞間伝播に役割を果たすと考えられ；そしてＥＥＶは、宿主生物内の長期間播種に重要であると考えられる。ＥＥＶ特異的タンパク質は、遺伝子Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、およびＦ１３Ｌによってコードされる。Ａ３４Ｒ遺伝子によってコードされ、ＩＩ型膜貫通糖タンパク質であるＡ３４は、アクチンテールの誘導、感染細胞表面からのエンベロープウイルスの放出、およびウイルス進入前のリガンド結合後のウイルスエンベロープの破壊に関与する。
ＶＶは、天然痘のルーチンワクチンとして長く用いられている歴史があるため、腫瘍溶解性ウイルス操作のための一般的に用いられる骨格の１つである。臨床データによって、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ＯＶＶ）治療の有効性は、用量依存性である傾向があることが示唆されている。したがって、臨床セッティングにおいて、ＯＶＶの抗腫瘍効果を最大にするために、高治療投薬量（実質的にワクチン接種用量より高い）が適用される可能性がより高い。しかし、研究用細胞および遺伝子治療製品の前臨床評価（Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（２０１３年１１月）の指針において米国ＦＤＡによって言及されるように、ＯＶＶを含む複製可能腫瘍溶解性ウイルスを扱う際には、高レベルの持続性ウイルス複製は、大きな安全上の懸念を引き起こしうる。
したがって、複製調節可能ＯＶＶ、およびＯＶＶを投与された患者におけるＯＶＶ複製の調節法に関する必要性がある。
本開示は、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（本明細書において、以後、「組換えワクシニアウイルス」、「組換えＶＶ」、または「ＲＶＶ」とも称される）であって：（ｉ）免疫刺激性サイトカインポリペプチド、例えばインターロイキン−２（ＩＬ−２）ポリペプチドまたはその変異体（ＩＬ−２ｖ）をコードするヌクレオチド配列；および（ｉｉ）異種チミジンキナーゼ（ＴＫ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、前記ワクシニアウイルスを提供する。いくつかの態様において、本開示は、抗ウイルス剤、例えば２’−デオキシグアノシン類似体（例えばガンシクロビルまたはＧＣＶなど）を通じたウイルス複製調節を可能にする、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）ポリペプチドを含む複製調節可能ＲＶＶを提供する。本開示はさらに、ＲＶＶを含む組成物、腫瘍を有する個体において腫瘍溶解を誘導する方法であって、本開示のＲＶＶまたは組成物の有効量を個体に投与する工程を含む、前記方法、および癌の治療または腫瘍溶解を誘導するための薬剤製造における、本開示のＲＶＶまたは組成物の使用を提供する。本開示はまた、ＲＶＶを投与された被験体において、ＲＶＶの複製を調節するか、またはＲＶＶによって引き起こされる副作用を減少させる方法であって、被験体に、有効量の２’−デオキシグアノシン類似体、例えばガンシクロビルを投与する工程を含む、前記方法も提供する。
図１は、代表的な組換えワクシニアウイルスＶＶ９１、ＶＶ９３、およびＶＶ９６の全ゲノムの模式図を提供する。略語：ＬＩＴＲ＝左側末端逆位配列；ＲＩＴＲ＝右側末端逆位配列；Ａ〜Ｏ＝ＨｉｎｄＩＩＩ消化断片によって歴史的に定義されたウイルス遺伝子領域；ＰＳＥＬ＝合成初期後期プロモーター；ｍＩＬ２ｖ＝マウスインターロイキン−２変異体；＊＝Ａ３４タンパク質の１５１位でリジンからグルタミン酸への置換をコードする突然変異；ＰＦ１７＝Ｆ１７Ｒ遺伝子由来のプロモーター；ＨＳＶ ＴＫ．００７＝１６８位でアラニンからヒスチジンへの置換をコードする突然変異を含む単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子。 図２は、代表的な組換えワクシニアウイルスＶＶ９４およびＩＧＶ１２１の全ゲノムの模式図を提供する。略語：ＬＩＴＲ＝左側末端逆位配列；ＲＩＴＲ＝右側末端逆位配列；Ａ〜Ｏ＝ＨｉｎｄＩＩＩ消化断片によって歴史的に定義されたウイルス遺伝子領域；ＰＳＥＬ＝合成初期後期プロモーター；ｍＩＬ２ｖ＝マウスインターロイキン−２変異体；＊＝Ａ３４タンパク質の１５１位でリジンからグルタミン酸への置換をコードする突然変異；ＰＦ１７＝Ｆ１７Ｒ遺伝子由来のプロモーター；ＨＳＶ ＴＫ．００７＝１６８位でアラニンからヒスチジンへの置換をコードする突然変異を含む単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子。 図３は、組換えワクシニアウイルスＶＶ１０１、ＶＶ１０２、およびＶＶ１０３の全ゲノムの模式図を提供する。略語：ＬＩＴＲ＝左側末端逆位配列；ＲＩＴＲ＝右側末端逆位配列；Ａ〜Ｏ＝ＨｉｎｄＩＩＩ消化断片によって歴史的に定義されたウイルス遺伝子領域；ＰＳＥＬ＝合成初期後期プロモーター；ｈＩＬ２ｖ＝ヒトインターロイキン−２変異体；＊＝Ａ３４タンパク質の１５１位でリジンからグルタミン酸への置換をコードする突然変異；ＰＦ１７＝Ｆ１７Ｒ遺伝子由来のプロモーター；ＨＳＶ ＴＫ．００７＝１６８位でアラニンからヒスチジンへの置換をコードする突然変異を含む単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子。 図４は、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスでの細胞感染後のマウスＩＬ−２変異体（ｍＩＬ−２ｖ）発現分析の結果を提供する。 図５は、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスでの細胞感染後のヒトＩＬ−２変異体（ｈＩＬ−２ｖ）発現分析の結果を提供する。 図６は、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスでの細胞感染後のＨＳＶ ＴＫ．００７ ｍＲＮＡ発現分析の結果を提供する。 図７Ａ〜Ｇは、ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣ移植したＣ５７ＢＬ／６メスマウスに対するウイルス療法誘導性腫瘍増殖阻害の評価の結果を提供する。ビヒクルのみ（Ａ）、あるいはルシフェラーゼ−２Ａ−ＧＦＰレポーター（Ｃｏｐ．Ｌｕｃ−ＧＦＰ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ１６）（Ｂ）、ｍＩＬ−２ｖのみ（Ｃｏｐ．ｍＧＭ−ＣＳＦ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ２７）（Ｃ）、ｍＩＬ−２ｖおよびＢ１６Ｒ遺伝子座中、順方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ９１）（Ｄ）、ｍＩＬ−２ｖおよびＪ２Ｒ遺伝子座中、逆方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９３）（Ｅ）、またはｍＩＬ−２ｖおよびＢ１６Ｒ遺伝子座中、逆方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９６）のいずれかを装備された、Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ突然変異を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルスで処置した群における個々のマウスに関して、腫瘍増殖軌道を示す。各グラフ上の垂直の点線は、マウスが、ビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を示す。各グラフ上の水平の点線は、研究から動物を除去する基準として用いた、腫瘍体積閾値を示す。 図７Ａ〜Ｇは、ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣ移植したＣ５７ＢＬ／６メスマウスに対するウイルス療法誘導性腫瘍増殖阻害の評価の結果を提供する。ビヒクルのみ（Ａ）、あるいはルシフェラーゼ−２Ａ−ＧＦＰレポーター（Ｃｏｐ．Ｌｕｃ−ＧＦＰ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ１６）（Ｂ）、ｍＩＬ−２ｖのみ（Ｃｏｐ．ｍＧＭ−ＣＳＦ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ２７）（Ｃ）、ｍＩＬ−２ｖおよびＢ１６Ｒ遺伝子座中、順方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ９１）（Ｄ）、ｍＩＬ−２ｖおよびＪ２Ｒ遺伝子座中、逆方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９３）（Ｅ）、またはｍＩＬ−２ｖおよびＢ１６Ｒ遺伝子座中、逆方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９６）のいずれかを装備された、Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ突然変異を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルスで処置した群における個々のマウスに関して、腫瘍増殖軌道を示す。各グラフ上の垂直の点線は、マウスが、ビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を示す。各グラフ上の水平の点線は、研究から動物を除去する基準として用いた、腫瘍体積閾値を示す。 図７Ａ〜Ｇは、ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣ移植したＣ５７ＢＬ／６メスマウスに対するウイルス療法誘導性腫瘍増殖阻害の評価の結果を提供する。ビヒクルのみ（Ａ）、あるいはルシフェラーゼ−２Ａ−ＧＦＰレポーター（Ｃｏｐ．Ｌｕｃ−ＧＦＰ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ１６）（Ｂ）、ｍＩＬ−２ｖのみ（Ｃｏｐ．ｍＧＭ−ＣＳＦ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ２７）（Ｃ）、ｍＩＬ−２ｖおよびＢ１６Ｒ遺伝子座中、順方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ９１）（Ｄ）、ｍＩＬ−２ｖおよびＪ２Ｒ遺伝子座中、逆方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９３）（Ｅ）、またはｍＩＬ−２ｖおよびＢ１６Ｒ遺伝子座中、逆方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９６）のいずれかを装備された、Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ突然変異を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルスで処置した群における個々のマウスに関して、腫瘍増殖軌道を示す。各グラフ上の垂直の点線は、マウスが、ビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を示す。各グラフ上の水平の点線は、研究から動物を除去する基準として用いた、腫瘍体積閾値を示す。腫瘍移植２８日後までの各処置群に関する平均腫瘍体積（ｍｍ３）±９５％信頼区間を示し（Ｇ）、これは、各群中のすべての動物がまだ生存している最後の腫瘍測定時点であった。 図８は、ＡＮＣＯＶＡを用いたウイルス療法誘導性腫瘍増殖阻害の統計的比較の結果を提供する。ビヒクル／ウイルス処置後の各群における個々のマウスに関する腫瘍体積（腫瘍移植１４日後〜２７日後）をＡＮＣＯＶＡによって分析して、多様な処置群に渡る腫瘍増殖に対する統計的に有意な阻害効果を決定した。列は、特定の処置群対間の比較の統計的結果（ｐ値）を示す。太字フォントの値は、ｐ≦０．０５の比較ＡＮＣＯＶＡ結果を示す。 図９は、移植１２日後、ビヒクルまたはウイルスでの処置後のＭＣ３８腫瘍移植Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスの生存に対する代表的な研究の結果を提供する。マウスは、日々、腫瘍体積≧１４００ｍｍ３に到達したら死亡と称された。各群の曲線および水平の点線間の交点は、群に関する生存閾値中央値（５０％）を示す。 図１０は、ビヒクルまたは組換えＣｏｐワクシニアウイルスを腫瘍内注射した２４時間後および４８時間後のＭＣ３８腫瘍所持Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスから収集した血清において検出したＩＬ−２レベルの結果を提供する。各記号は、個々のマウスに関して計算されたＩＬ−２血清レベルを示し、バーは群の幾何平均を示す（Ｎ＝９／群）。エラーバーは９５％信頼区間を示す。 図１１Ａ〜１１Ｆは、ＬＬＣ腫瘍細胞をＳＣ移植したＣ５７ＢＬ／６メスマウスに対するウイルス療法誘導性腫瘍増殖阻害の評価の結果を提供する。ビヒクルのみ（Ａ）、あるいはＡ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ突然変異を含有し、そしてルシフェラーゼ−２Ａ−ＧＦＰレポーター（Ｃｏｐ．Ｌｕｃ−ＧＦＰ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ１６）（Ｂ）、ｍＩＬ−２ｖのみ（Ｃｏｐ．ＩＬ２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ２７）（Ｃ）、ｍＩＬ−２ｖおよびＢ１６Ｒ遺伝子座中、順方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ９１）（Ｄ）、ｍＩＬ−２ｖおよびＪ２Ｒ遺伝子座中、逆方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９３）（Ｅ）、ｍＩＬ−２ｖおよびＢ１６Ｒ遺伝子座中、逆方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９６）（Ｆ）のいずれかを装備された、コペンハーゲンワクシニアウイルスで処置した群における個々のマウスに関して、腫瘍増殖軌道を示す。各グラフ上の垂直の点線は、マウスが、ビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を示す。各グラフ上の水平の点線は、研究から動物を除去する基準として用いた、腫瘍体積閾値を示す。 図１１Ａ〜１１Ｆは、ＬＬＣ腫瘍細胞をＳＣ移植したＣ５７ＢＬ／６メスマウスに対するウイルス療法誘導性腫瘍増殖阻害の評価の結果を提供する。ビヒクルのみ（Ａ）、あるいはＡ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ突然変異を含有し、そしてルシフェラーゼ−２Ａ−ＧＦＰレポーター（Ｃｏｐ．Ｌｕｃ−ＧＦＰ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ１６）（Ｂ）、ｍＩＬ−２ｖのみ（Ｃｏｐ．ＩＬ２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ２７）（Ｃ）、ｍＩＬ−２ｖおよびＢ１６Ｒ遺伝子座中、順方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ９１）（Ｄ）、ｍＩＬ−２ｖおよびＪ２Ｒ遺伝子座中、逆方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９３）（Ｅ）、ｍＩＬ−２ｖおよびＢ１６Ｒ遺伝子座中、逆方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９６）（Ｆ）のいずれかを装備された、コペンハーゲンワクシニアウイルスで処置した群における個々のマウスに関して、腫瘍増殖軌道を示す。各グラフ上の垂直の点線は、マウスが、ビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を示す。各グラフ上の水平の点線は、研究から動物を除去する基準として用いた、腫瘍体積閾値を示す。 図１２は、ビヒクルまたは組換えＣｏｐワクシニアウイルスを腫瘍内注射した２４時間後、４８時間後、および７２時間後のＬＬＣ腫瘍所持Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスから収集した血清において検出したＩＬ−２レベルの結果を提供する。各記号は、個々のマウスに関して計算されたＩＬ−２血清レベルを示し、バーは群の幾何平均を示す（Ｎ＝５／群）。エラーバーは９５％信頼区間を示す。 図１３Ａ〜１３Ｆは、ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣ移植したＣ５７ＢＬ／６メスマウスに対する、単回（第１１日）ＩＶウイルス送達を用いたウイルス療法誘導性腫瘍増殖阻害の評価の結果を提供する。屠殺時までの腫瘍移植３２日後までの群平均±９５％信頼区間として、各処置に関して（Ａ）、あるいは屠殺時または研究終了時までの各群中の個々のマウスに関して（Ｂ〜Ｆ）、腫瘍増殖軌道を示す。試験ウイルスには、Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ突然変異を含有し、そしてルシフェラーゼ−２Ａ−ＧＦＰレポーター（ＷＲ．Ｌｕｃ−ＧＦＰ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ１７）（Ｃ）、ｍＩＬ−２ｖのみ（ＷＲ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ７９）（Ｄ）、ｍＩＬ−２ｖとＪ２Ｒ遺伝子座中、逆方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（ＷＲ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９４）（Ｅ）、ならびにｍＩＬ−２ｖおよびＢ１５Ｒ／Ｂ１７Ｒ遺伝子座中、順方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（ＷＲ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＩＧＶ−１２１）（Ｆ）のいずれかを装備された、ＷＲワクシニアウイルスが含まれた。各グラフ上の垂直の点線は、マウスが、ウイルスのＩＶ注射を受けた時点を示す。各グラフ上の水平の点線は、研究から動物を除去する基準として用いた、腫瘍体積閾値を示す。 図１３Ａ〜１３Ｆは、ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣ移植したＣ５７ＢＬ／６メスマウスに対する、単回（第１１日）ＩＶウイルス送達を用いたウイルス療法誘導性腫瘍増殖阻害の評価の結果を提供する。屠殺時までの腫瘍移植３２日後までの群平均±９５％信頼区間として、各処置に関して（Ａ）、あるいは屠殺時または研究終了時までの各群中の個々のマウスに関して（Ｂ〜Ｆ）、腫瘍増殖軌道を示す。試験ウイルスには、Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ突然変異を含有し、そしてルシフェラーゼ−２Ａ−ＧＦＰレポーター（ＷＲ．Ｌｕｃ−ＧＦＰ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ１７）（Ｃ）、ｍＩＬ−２ｖのみ（ＷＲ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ７９）（Ｄ）、ｍＩＬ−２ｖとＪ２Ｒ遺伝子座中、逆方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（ＷＲ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９４）（Ｅ）、ならびにｍＩＬ−２ｖおよびＢ１５Ｒ／Ｂ１７Ｒ遺伝子座中、順方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（ＷＲ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＩＧＶ−１２１）（Ｆ）のいずれかを装備された、ＷＲワクシニアウイルスが含まれた。各グラフ上の垂直の点線は、マウスが、ウイルスのＩＶ注射を受けた時点を示す。各グラフ上の水平の点線は、研究から動物を除去する基準として用いた、腫瘍体積閾値を示す。 図１４は、皮下ＭＣ３８腫瘍モデル研究のためのＡＮＣＯＶＡを用いたウイルス療法誘導性腫瘍増殖阻害の統計的比較の結果を提供する。処置後の複数の日の各群における個々のマウスに関する腫瘍体積をＡＮＣＯＶＡによって分析して、多様な処置群に渡る腫瘍増殖に対する統計的に有意な阻害効果を決定した。列は、特定の処置群対間の比較の統計的結果（ｐ値）を示す。太字フォントの値は、ｐ値≦０．０５が観察された比較ＡＮＣＯＶＡ結果を示す。 図１５は、ＳＣ腫瘍移植１１日後に組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスでＩＶ処置した後のＭＣ３８腫瘍所持Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスの生存の結果を提供する。マウスは、日々、腫瘍体積≧１４００ｍｍ３に到達したら死亡と称された。各群の曲線および水平の点線間の交点は、群に関する生存閾値中央値（５０％）を示す。Ｐ値は、選択ウイルス群間のログランク検定（マンテル−コックス）比較の統計的結果を示す。 図１６は、５ｅ７ ｐｆｕの組換えＷＲワクシニアウイルスをＩＶ注射した７２時間後（第１４日）のＭＣ３８腫瘍所持Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスから収集した血清において検出したＩＬ−２レベルの結果を提供する。各記号は、個々のマウスにおいて検出されたＩＬ−２血清レベルを示し、バーは群の幾何平均を示す（Ｎ＝１０／群）。エラーバーは９５％信頼区間を示す。 図１７Ａ〜１７Ｄは、ＬＬＣ腫瘍細胞をＳＣ移植したＣ５７ＢＬ／６メスマウスに対する、単回（第１４日）ＩＶウイルス送達を用いたウイルス療法誘導性腫瘍増殖阻害の評価の結果を提供する。屠殺時までの腫瘍移植２７日後までの群平均±９５％信頼区間として、各群に関して（Ａ）、あるいは屠殺時または研究終了時までの各群中の個々のマウスに関して（Ｂ〜Ｄ）、腫瘍増殖軌道を示す。試験ウイルスには、ルシフェラーゼ−２Ａ−ＧＦＰレポーター（ＷＲ．Ｌｕｃ−ＧＦＰ；ＶＶ３）（Ｃ）、またはＡ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ突然変異とともに、ｍＩＬ−２ｖおよびＢ１５Ｒ／Ｂ１７Ｒ遺伝子座中、順方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（ＷＲ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＩＧＶ−１２１）（Ｄ）のいずれかを装備された、ＷＲワクシニアウイルスが含まれた。各グラフ上の垂直の点線は、マウスが、ウイルスのＩＶ注射を受けた時点を示す。各グラフ上の水平の点線は、研究から動物を除去する基準として用いた、腫瘍体積閾値を示す。 図１７Ａ〜１７Ｄは、ＬＬＣ腫瘍細胞をＳＣ移植したＣ５７ＢＬ／６メスマウスに対する、単回（第１４日）ＩＶウイルス送達を用いたウイルス療法誘導性腫瘍増殖阻害の評価の結果を提供する。屠殺時までの腫瘍移植２７日後までの群平均±９５％信頼区間として、各群に関して（Ａ）、あるいは屠殺時または研究終了時までの各群中の個々のマウスに関して（Ｂ〜Ｄ）、腫瘍増殖軌道を示す。試験ウイルスには、ルシフェラーゼ−２Ａ−ＧＦＰレポーター（ＷＲ．Ｌｕｃ−ＧＦＰ；ＶＶ３）（Ｃ）、またはＡ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ突然変異とともに、ｍＩＬ−２ｖおよびＢ１５Ｒ／Ｂ１７Ｒ遺伝子座中、順方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（ＷＲ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＩＧＶ−１２１）（Ｄ）のいずれかを装備された、ＷＲワクシニアウイルスが含まれた。各グラフ上の垂直の点線は、マウスが、ウイルスのＩＶ注射を受けた時点を示す。各グラフ上の水平の点線は、研究から動物を除去する基準として用いた、腫瘍体積閾値を示す。 図１８は、皮下ＬＬＣ腫瘍モデル研究に関する、ＡＮＣＯＶＡを用いたウイルス療法誘導性腫瘍増殖阻害の統計的比較の結果を提供する。処置後、複数の日の各群における個々のマウスに関する腫瘍体積をＡＮＣＯＶＡによって分析して、多様な処置群に渡る腫瘍増殖に対する統計的に有意な阻害効果を決定した。列は、特定の処置群対間の比較の統計的結果（ｐ値）を示す。太字フォントの値は、ｐ≦０．０５が観察された比較ＡＮＣＯＶＡ結果を示す。 図１９は、ＳＣ腫瘍移植１１日後、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスでのＩＶ処置後のＬＬＣ腫瘍所持Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスの生存の結果を提供する。マウスは、日々、腫瘍体積≧２０００ｍｍ３に到達したら死亡と称された。各群の曲線および水平の点線間の交点は、群に関する生存閾値中央値（５０％）を示す。Ｐ値は、選択ウイルス群間のログランク検定（マンテル−コックス）比較の統計的結果を示す。 図２０Ａ〜２０Ｉは、ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣ移植したＣ５７ＢＬ／６メスマウスに対するウイルス療法誘導性腫瘍増殖阻害の評価の結果を提供する。ビヒクルのみ（Ａ）、５ｅ７ ｐｆｕでのｍＩＬ−２ｖおよびＢ１６Ｒ遺伝子座中、順方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ９１）（Ｂ）、５ｅ７ ｐｆｕでのｈＩＬ−２ｖおよびＢ１６Ｒ遺伝子座中、順方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｈＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ１０２）（Ｃ）、５ｅ７ ｐｆｕでのｍＧＭ−ＣＳＦおよびＬａｃＺレポーター導入遺伝子（Ｃｏｐ．ｍＧＭ−ＣＳＦ／ＬａｃＺ；（ＶＶ１０））（Ｄ）、２ｅ８ ｐｆｕでのルシフェラーゼ−２Ａ−ＧＦＰレポーター（Ｃｏｐ．Ｌｕｃ−ＧＦＰ；ＶＶ７）（Ｅ）、２ｅ８ ｐｆｕでのｍＩＬ−２ｖおよびＢ１６Ｒ遺伝子座中、順方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ９１）（Ｆ）、２ｅ８ ｐｆｕでのｈＩＬ−２ｖおよびＢ１６Ｒ遺伝子座中、順方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｈＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ１０２）（Ｇ）、ならびに２ｅ８ ｐｆｕでのｍＧＭ−ＣＳＦおよびＬａｃＺレポーター導入遺伝子（Ｃｏｐ．ｍＧＭ−ＣＳＦ／ＬａｃＺ；（ＶＶ１０））（Ｈ）のいずれかを装備された、コペンハーゲンワクシニアウイルスで処置した群における個々のマウスに関して、腫瘍増殖軌道を示す。各グラフ上の垂直の点線は、マウスが、ビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を示す。各グラフ上の水平の点線は、研究から動物を除去する基準として用いた、腫瘍体積閾値を示す。 図２０Ａ〜２０Ｉは、ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣ移植したＣ５７ＢＬ／６メスマウスに対するウイルス療法誘導性腫瘍増殖阻害の評価の結果を提供する。ビヒクルのみ（Ａ）、５ｅ７ ｐｆｕでのｍＩＬ−２ｖおよびＢ１６Ｒ遺伝子座中、順方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ９１）（Ｂ）、５ｅ７ ｐｆｕでのＢ１６Ｒ遺伝子座中、順方向配向でのｈＩＬ−２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｈＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ１０２）（Ｃ）、５ｅ７ ｐｆｕでのｍＧＭ−ＣＳＦおよびＬａｃＺレポーター導入遺伝子（Ｃｏｐ．ｍＧＭ−ＣＳＦ／ＬａｃＺ；（ＶＶ１０））（Ｄ）、２ｅ８ ｐｆｕでのルシフェラーゼ−２Ａ−ＧＦＰレポーター（Ｃｏｐ．Ｌｕｃ−ＧＦＰ；ＶＶ７）（Ｅ）、２ｅ８ ｐｆｕでのｍＩＬ−２ｖおよびＢ１６Ｒ遺伝子座中、順方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ９１）（Ｆ）、２ｅ８ ｐｆｕでのｈＩＬ−２ｖおよびＢ１６Ｒ遺伝子座中、順方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｈＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ１０２）（Ｇ）、ならびに２ｅ８ ｐｆｕでのｍＧＭ−ＣＳＦおよびＬａｃＺレポーター導入遺伝子（Ｃｏｐ．ｍＧＭ−ＣＳＦ／ＬａｃＺ；（ＶＶ１０））（Ｈ）のいずれかを装備された、コペンハーゲンワクシニアウイルスで処置した群における個々のマウスに関して、腫瘍増殖軌道を示す。各グラフ上の垂直の点線は、マウスが、ビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を示す。各グラフ上の水平の点線は、研究から動物を除去する基準として用いた、腫瘍体積閾値を示す。 図２０Ａ〜２０Ｉは、ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣ移植したＣ５７ＢＬ／６メスマウスに対するウイルス療法誘導性腫瘍増殖阻害の評価の結果を提供する。ビヒクルのみ（Ａ）、５ｅ７ ｐｆｕでのｍＩＬ−２ｖおよびＢ１６Ｒ遺伝子座中、順方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ９１）（Ｂ）、５ｅ７ ｐｆｕでのｈＩＬ−２ｖおよびＢ１６Ｒ遺伝子座中、順方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｈＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ１０２）（Ｃ）、５ｅ７ ｐｆｕでのｍＧＭ−ＣＳＦおよびＬａｃＺレポーター導入遺伝子（Ｃｏｐ．ｍＧＭ−ＣＳＦ／ＬａｃＺ；（ＶＶ１０））（Ｄ）、２ｅ８ ｐｆｕでのルシフェラーゼ−２Ａ−ＧＦＰレポーター（Ｃｏｐ．Ｌｕｃ−ＧＦＰ；ＶＶ７）（Ｅ）、２ｅ８ ｐｆｕでのｍＩＬ−２ｖおよびＢ１６Ｒ遺伝子座中、順方向配向でのＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ９１）（Ｆ）、２ｅ８ ｐｆｕでのＢ１６Ｒ遺伝子座中、順方向配向でのｈＩＬ−２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｈＩＬ−２ｖ．Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ１０２）（Ｇ）、ならびに２ｅ８ ｐｆｕでのｍＧＭ−ＣＳＦおよびＬａｃＺレポーター導入遺伝子（Ｃｏｐ．ｍＧＭ−ＣＳＦ／ＬａｃＺ；（ＶＶ１０））（Ｈ）のいずれかを装備された、コペンハーゲンワクシニアウイルスで処置した群における個々のマウスに関して、腫瘍増殖軌道を示す。各グラフ上の垂直の点線は、マウスが、ビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を示す。各グラフ上の水平の点線は、研究から動物を除去する基準として用いた、腫瘍体積閾値を示す。腫瘍移植２８日後までの各処置群に関する平均腫瘍体積（ｍｍ３）を示す（Ｉ）。 図２１は、ＡＮＣＯＶＡを用いたウイルス療法誘導性腫瘍増殖阻害の統計的比較の結果を提供する。ビヒクル／ウイルス処置後の各群における個々のマウスに関する腫瘍体積（腫瘍移植１４日後〜２８日後）をＡＮＣＯＶＡによって分析して、多様な処置群に渡る腫瘍増殖に対する統計的に有意な阻害効果を決定した。列は、特定の処置群対間の比較の統計的結果（ｐ値）を示す。太字フォントの値は、ｐ≦０．０５の比較ＡＮＣＯＶＡ結果を示す。 図２２Ａ〜２２Ｂは、移植１１日後、ビヒクルまたは組換えワクシニアウイルスでの処置後のＭＣ３８腫瘍移植Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスの生存の結果を提供する。マウスは、日々、腫瘍体積≧１４００ｍｍ３に到達したら死亡と称された。各群の曲線および水平の点線間の交点は、群に関する生存閾値中央値（５０％）を示す。（Ａ）は、５ｅ７ ｐｆｕのウイルスを投与された群を示す。 図２２Ａ〜２２Ｂは、移植１１日後、ビヒクルまたは組換えワクシニアウイルスでの処置後のＭＣ３８腫瘍移植Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスの生存の結果を提供する。マウスは、日々、腫瘍体積≧１４００ｍｍ３に到達したら死亡と称された。各群の曲線および水平の点線間の交点は、群に関する生存閾値中央値（５０％）を示す。（Ｂ）は、２ｅ８ ｐｆｕのウイルスを投与された群を示す。 図２３は、ビヒクルまたは組換えＣｏｐワクシニアウイルスを腫瘍内注射した２４時間後のＭＣ３８腫瘍所持Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスから収集した血清において検出したマウスＩＬ−２レベルの結果を提供する。各記号は、個々のマウスに関して計算されたＩＬ−２血清レベルを示し、バーは群の幾何平均を示す（Ｎ＝１０／群）。エラーバーは９５％信頼区間を示す。 図２４は、ビヒクルまたは組換えＣｏｐワクシニアウイルスを腫瘍内注射した２４時間後のＭＣ３８腫瘍所持Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスから収集した血清において検出したヒトＩＬ−２レベルの結果を提供する。各記号は、個々のマウスに関して計算されたＩＬ−２血清レベルを示し、バーは群の幾何平均を示す（Ｎ＝９／群）。エラーバーは９５％信頼区間を示す。 図２５は、ビヒクルまたは組換えＣｏｐワクシニアウイルスを腫瘍内注射した後の、ＨＣＴ−１１６腫瘍細胞をＳＣ移植した無胸腺メスヌードマウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍増殖阻害の評価の結果を提供する。各処置群に関する平均腫瘍体積（ｍｍ３）を、腫瘍移植４０日後まで示す。各グラフ上の垂直の点線は、マウスが、ビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を示す。各グラフ上の水平の点線は、研究から動物を除去する基準として用いた、腫瘍体積閾値を示す。
Ａ． 定義
用語「異種」は、天然存在生物には見られない分子（例えば核酸、ポリペプチド、タンパク質、または遺伝子）を指す。例えば、本開示の組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの背景において、「異種」チミジンキナーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、天然存在ワクシニアウイルスには見られないチミジンキナーゼポリペプチド、例えば単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のチミジンキナーゼポリペプチドを指す。
用語「腫瘍溶解性ウイルス」は、正常（非癌性）細胞に比較して、癌細胞を優先的に感染させそして殺す（腫瘍溶解性）ウイルスを指す。
用語「複製可能（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）」は、特定の宿主細胞を感染させてそして該細胞内で複製することが可能なウイルスを指す。
用語「組換え」ウイルスは、組換え核酸技術を用い、ウイルスゲノムに変化または修飾を導入し、そして／あるいはウイルスタンパク質に変化または修飾を導入することによって、野生型または存在するウイルス（すなわち親ウイルス）に基づいて構築されたウイルスを指す。例えば、組換えウイルスは、修飾された内因性核酸配列、外因性核酸配列、または両方を含有してもよい。組換えウイルスにはまた、修飾されたタンパク質構成要素も含まれてもよい。「組換えワクシニアウイルス」は、野生型または存在するワクシニアウイルスに基づいて修飾されたかまたは構築された組換えウイルスを指す。
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において交換可能に用いられ、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドの多量体型を指す。したがって、この用語には、限定されるわけではないが、一本鎖、二本鎖、または多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリンおよびピリミジン塩基または他の天然、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然、または誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。
用語「個体」、「被験体」、「宿主」、および「患者」は、本明細書において交換可能に用いられ、限定されるわけではないが、ネズミ（例えばラット、マウス）、ウサギ目（ｌａｇｏｍｏｒｐｈ）（例えばウサギ（ｒａｂｂｉｔ））、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）、ネコ（ｆｅｌｉｎｅ）、有蹄動物（ｕｎｇｕｌａｔｅ）（例えばウマ（ｅｑｕｉｎｅ）、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、ヤギ（ｃａｐｒｉｎｅ））を含む哺乳動物を指す。
用語「置換」は、ポリペプチド中の１つのアミノ酸の異なるアミノ酸での置き換えを指す。本開示の背景において、ポリペプチドにおける置換は：元来のアミノ酸−位−置換アミノ酸として示される。したがって、表記「Ｋ１５１Ｅ」は、変異体が、親ポリペプチド中の１５１位のアミノ酸に対応する変異体アミノ酸位で、リジン（Ｋ）のグルタミン酸（Ｅ）での置換を含むことを意味する。
「療法的有効量」または「有効量」は、疾患を治療するために被験体に投与された際に、意図する効果である疾患の治療を引き起こすために十分である、剤（例えば、本開示の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス）の量、または２つの剤（例えば、本開示の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび第二の療法剤）の組み合わせた量を指す。「療法的有効量」は、剤（単数または複数）、疾患およびその重症度、ならびに治療しようとする被験体の年齢、体重等に応じて多様であろう。
用語「治療」、「治療する」等は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に防止する観点で、予防的であってもよいし、そして／または疾患および／または疾患に寄与しうる副作用の部分的または完全な治癒の観点で、療法的であってもよい。「治療」は、本明細書において、哺乳動物、例えばヒトにおいて疾患のいかなる治療も含み、そしてこれには：（ａ）疾患に対する素因がありうるが、該疾患を有するとはまだ診断されていない被験体において、疾患が生じることを防止すること；（ｂ）疾患を阻害する、すなわち該疾患の発展を抑止すること；および（ｃ）疾患を軽減させる、すなわち疾患の後退を引き起こすことが含まれる。
用語「変異体」ポリペプチドは、参照ポリペプチドのアミノ酸配列に対して１つまたはそれより多いアミノ酸突然変異を含有し、そして参照ポリペプチドの特定の特性を保持するポリペプチドを指す。変異体は、１つまたはそれより多いアミノ酸の挿入、置換、または欠失のような修飾による、参照ポリペプチドのアミノ酸配列の修飾によってもたらされうる。したがって、用語「変異体」ポリペプチドは、所望の生物学的特性を与える十分な数の隣接アミノ酸残基を含む、参照ポリペプチドの断片を含む。
ある範囲の値を提供する場合、文脈が明らかに別に示さない限り、下限単位の１／１０までの介在する値各々は、その範囲の上限および下限の間で、そしてその言及する範囲内のいかなる他の言及するまたは介在する値もいずれも、本発明内に含まれることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立により小さい範囲内に含まれてもよく、そしてまた、言及する範囲において、任意の特に排除される限界次第で、本発明に含まれる。言及する範囲に、限界の一方または両方が含まれる場合、こうした含まれる限界のいずれかまたは両方が排除された範囲もまた、本発明に含まれる。
別に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の一般の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似のまたは同等のいかなる方法および材料もまた、本発明の実施または試験において用いられてもよいが、好ましい方法および材料をここで記載する。本明細書で言及するすべての刊行物は、刊行物が引用されるものと関連した方法および／または材料を開示し、そして記載するため、本明細書に援用される。
本明細書において、そして付随する請求項において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、背景が別に明らかに示さない限り、複数の参照物が含まれることに注目しなければならない。したがって、例えば、「（単数の）ワクシニアウイルス」に対する言及には、複数のこうしたワクシニアウイルスが含まれ、そして「（単数の）変異体ＩＬ−２ポリペプチド」への言及には、１つまたはそれより多い変異体ＩＬ−２ポリペプチドおよび当業者に知られるその同等物への言及が含まれるなどである。請求項は、いかなる場合による要素も排除するよう起草される可能性もあることがさらに注目される。こうしたものとして、この言及は、「もっぱら」、「のみ」等の排除性の用語の、請求項要素の列挙と組み合わせての使用、または「負の」限定の使用のための先行詞として働くと意図される。
明確にするために、別個の態様の背景で記載される本発明の特定の特徴はまた、単一の態様において組み合わせて提供されてもよいことが認識される。逆に、簡潔にするために、単一の態様の背景で記載される本発明の多様な特徴はまた、別個に、または任意の適切なサブコンビネーションで提供されてもよい。本発明に関する態様のすべての組み合わせは、本発明に特に含まれ、そして各々のそしてすべての組み合わせが、個々にそして明確に開示されるのと同じように、本明細書に開示される。さらに、多様な態様およびその要素のすべてのサブコンビネーションもまた、本発明に特に含まれ、そして各々のそしてすべてのこうしたサブコンビネーションが、本明細書に個々にそして明確に開示されるのと同じように、本明細書に開示される。
本明細書で論じる刊行物は、単に本出願の出願日の前の開示に関して提供される。本明細書のなにものも、本発明が以前の発明のためにこうした刊行物に先行する資格がないことの承認と見なされてはならない。さらに、提供する刊行物の日付は、実際の公開日とは異なる可能性もあり、これは独立に確認する必要がありうる。
Ｂ． 組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス
第一の側面において、本開示は、対応する野生型または存在するウイルス（すなわち親ウイルス）に比較して、ウイルスゲノムまたはウイルスタンパク質において修飾を有する複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、修飾が：（ｉ）免疫刺激サイトカインポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列；および（ｉｉ）異種チミジンキナーゼポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含む、前記ワクシニアウイルスを提供する。便宜上、本開示によって提供する複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを、「組換えワクシニアウイルス」または「ＲＶＶ」と称してもよい。いくつかの態様において、ＲＶＶは、ウイルスの１つまたはそれより多い望ましい抗腫瘍特性、例えば腫瘍選択性増加、腫瘍溶解特性増加、細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）産生増進、または毒性減少を増加させるかまたは増進させる、ウイルスの天然ゲノム、タンパク質、または他の構成要素に対する１つまたはそれより多い修飾または突然変異をさらに含む。本開示が提供するＲＶＶに見られる挿入および他の修飾の例を、以下に詳細に記載する。
Ｂ−１． 免疫刺激サイトカインポリペプチド
上述のように、本開示が提供するＲＶＶは、免疫刺激サイトカインポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含む。用語「免疫刺激サイトカイン」は、ＩＬ−２受容体の存在下で細胞傷害性Ｔ細胞の拡大を刺激するか、腫瘍に対する自然または獲得免疫を増進させるか、あるいはそうでなければ腫瘍溶解性ウイルスの抗癌活性を増進させることが可能なサイトカインを指す。免疫刺激サイトカインの例には、インターロイキン（ＩＬ）−２（ＩＬ−２：Ｔ細胞増殖因子としてもまた知られる）、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８（ＩＦＮ−γ誘導因子としてもまた知られる）、ＩＬ２４、およびＧＭ−ＣＳＦが含まれる。
いくつかの態様において、ＲＶＶは、野生型ＩＬ−２ポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列を含む。野生型ＩＬ−２ポリペプチドの変異体もまた、本明細書において、「ＩＬ−２ｖポリペプチド」と称されてもよい。１つの態様において、ＲＶＶは、組換えＶＶを投与された被験体において発現された際、毒性が減少しているか、受容体ＣＤ２５（高アフィニティＩＬ−２受容体α（アルファ）サブユニット）に対する結合が減少しているか、免疫抑制性Ｔ制御細胞（Ｔ−ｒｅｇ細胞）の刺激が減少しているか、またはそうでなければ免疫抑制活性が減少している、ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。特定の態様において、ＩＬ−２ｖポリペプチドは、野生型ＩＬ−２に比較して、ＣＤ２５への結合減少を提供するアミノ酸置換を含む。ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＲＶＶゲノム中に存在し、そして「導入遺伝子」と称されうる。ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、野生型ワクシニアウイルス中には通常存在せず、そしてしたがって、野生型ワクシニアウイルスに対して異種である。したがって、ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、「ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列」または「挿入されたヌクレオチド配列」と称されうる。導入遺伝子を含むウイルスは、導入遺伝子を「装備された」と言われる。したがって、ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む本開示のＲＶＶは、ＩＬ−２ｖをコードするヌクレオチド配列を「装備された（ａｒｍｅｄ）」と言われてもよい。
いくつかの態様において、ＩＬ−２ポリペプチドはヒトＩＬ−２ポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの他の態様において、ＩＬ−２ポリペプチドはマウスＩＬ−２ポリペプチドまたはその変異体である。野生型ヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）ポリペプチドの成熟型のアミノ酸配列を配列番号１に示す。野生型ｈＩＬ−２ポリペプチドの前駆体型のアミノ酸配列を配列番号２１に示す。野生型ｈＩＬ−２ポリペプチドの前駆体型には、シグナルペプチド（例えばＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２２））が含まれる。野生型マウスＩＬ−２（ｍＩＬ−２）ポリペプチドの成熟型のアミノ酸配列を配列番号２３に示す。マウス野生型ＩＬ−２ポリペプチドの前駆体型のアミノ酸配列を配列番号２４に示す。
いくつかの場合、本開示のＲＶＶにコードされるＩＬ−２ｖポリペプチドは、野生型ＩＬ−２に比較した際、望ましくない生物学的活性の減少を提供する。いくつかの場合、野生型ＩＬ−２に比較した際、ＣＤ２５＋ ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ細胞においてｐＳＴＡＴ５レベル増加を誘導する強度を測定することによって、前記の望ましくない生物学的活性の減少を決定する。いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドは、ＣＤ２５＋ ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ細胞において、ｐＳＴＡＴ５レベル増加を誘導する際、野生型ＩＬ−２に比較して、減少した濃度強度を提供する。いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドは、ＣＤ２５＋ ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ細胞において、ｐＳＴＡＴ５レベル増加を誘導する際、野生型ＩＬ−２に比較して、少なくとも１、少なくとも２、または少なくとも３対数、減少した濃度強度を提供する。いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドは、ＣＤ２５＋ ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ細胞において、ｐＳＴＡＴ５レベル増加を誘導する際、野生型ＩＬ−２に比較して、約１、約２、または約３対数、減少した濃度強度を提供する。いくつかの場合、実施例９に開示するように、野生型ＩＬ−２に比較した際の、ＲＶＶによってコードされるＩＬ−２ｖポリペプチドでの処置後の炎症促進性サイトカインレベルを測定することによって、前記の望ましくない生物学的活性の減少を決定する。いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドは、（例えば実施例９に開示する試験を用いて）野生型ＩＬ−２に比較した際、減少した炎症促進性サイトカインレベルを提供する。いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドは、野生型ＩＬ−２に比較した際、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％減少した炎症促進性サイトカインレベルを提供する。
いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドは、配列番号１に示すＩＬ−２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、Ｆ４２、Ｙ４５、およびＬ７２の１つまたはそれより多くの置換を含む。いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドは、配列番号１に示すＩＬ−２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、Ｆ４２およびＹ４５の１つまたはそれより多くの置換を含む。いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドは、配列番号１に示すＩＬ−２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、Ｆ４２およびＬ７２の１つまたはそれより多くの置換を含む。いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドは、配列番号１に示すＩＬ−２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、Ｙ４５およびＬ７２の１つまたはそれより多くの置換を含む。いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドは、配列番号１に示すＩＬ−２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、Ｆ４２Ｌ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、またはＦ４２Ｋの置換を含む。いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドは、配列番号１に示すＩＬ−２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、またはＹ４５Ｋの置換を含む。いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドは、配列番号１に示すＩＬ−２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｒ、またはＬ７２Ｋの置換を含む。
いくつかの場合、本開示のＲＶＶは、シグナルペプチド（例えばＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２２））を含むＩＬ−２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。したがって、例えばいくつかの場合、本開示の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、配列番号２１に示すＩＬ−２アミノ酸配列に少なくとも９５％（例えば少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有し、そして配列番号２１に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、ＩＬ−２のＦ６２、Ｙ６５、およびＬ９２の１つまたはそれより多くの置換を含む、ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。認識されるであろうように、配列番号２１に示すＩＬ−２アミノ酸配列のＦ６２、Ｙ６５、およびＬ９２は、配列番号１に示すアミノ酸配列のＦ４２、Ｙ４５、およびＬ７２に対応する。
いくつかの場合、本開示のＲＶＶによってコードされるＩＬ−２ｖポリペプチドは：配列番号１に示すＩＬ−２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、ａ）Ｆ４２Ｌ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、またはＦ４２Ｋの置換；ｂ）Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、またはＹ４５Ｋの置換；およびｃ）Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｒ、またはＬ７２Ｋの置換の１つまたはそれより多くを含む。いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドは：配列番号１に示すＩＬ−２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、ａ）Ｆ４２Ｌ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、またはＦ４２Ｋの置換；およびｂ）Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、またはＹ４５Ｋの置換を含む。いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドは：配列番号１に示すＩＬ−２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、ａ）Ｆ４２Ｌ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、またはＦ４２Ｋの置換；およびｂ）Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｒ、またはＬ７２Ｋの置換を含む。いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドは：配列番号１に示すＩＬ−２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、ａ）Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、またはＹ４５Ｋの置換；およびｂ）Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｒ、またはＬ７２Ｋの置換を含む。いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドは：配列番号１に示すＩＬ−２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、ａ）Ｆ４２Ｌ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、またはＦ４２Ｋの置換；ｂ）Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、またはＹ４５Ｋの置換；およびｃ）Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｒ、またはＬ７２Ｋの置換を含む。
いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドのアミノ酸配列は：（１）Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＬ７２Ｇの１つまたはそれより多くの置換；（２）Ｆ４２ＡおよびＹ４５Ａの１つまたは両方の置換；（３）Ｆ４２ＡおよびＬ７２Ｇの置換；（４）Ｙ４５Ａ、およびＬ７２Ｇの置換；あるいは（５）Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＬ７２Ｇの置換を含み、ここで、ＩＬ−２ｖポリペプチドのアミノ酸番号付けは、配列番号１のアミノ酸配列に基づく。
いくつかの場合、本開示のＲＶＶによってコードされるＩＬ−２ｖポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列に少なくとも９５％（例えば少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして：
（１）Ｆ４２Ａ置換；
（２）Ｙ４５Ａ置換；
（３）Ｌ７２Ｇ置換；
（４）Ｆ４２Ａ置換およびＬ７２Ｇ置換；
（５）Ｆ４２Ａ置換およびＹ４５Ａ置換；
（６）Ｙ４５Ａ置換およびＬ７２Ｇ置換；ならびに
（７）Ｆ４２Ａ置換、Ｙ４５Ａ置換、およびＬ７２Ｇ置換
からなる群より選択されるアミノ酸置換を含み、
ここで、ＩＬ−２ｖポリペプチドのアミノ酸番号付けは、配列番号１のアミノ酸配列に基づく。
いくつかの場合、本開示の複製可能ＲＶＶによってコードされるＩＬ−２ｖポリペプチドには、Ｔ３および／またはＣ１２５の置換は含まれない。言い換えると、いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドは、配列番号１に示すＩＬ−２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、アミノ酸３位のＴｈｒ、およびアミノ酸１２５位のＣｙｓを含む。
ＩＬ−２ｖポリペプチドの適切なアミノ酸配列には、例えば、以下のアミノ酸配列：
Figure 2021118683
に少なくとも９５％（例えば少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そしてＦ７６Ａ、Ｙ７９Ａ、およびＬ１０６Ｇの置換を含む（すなわちＡｌａ−７６、Ａｌａ−７９、およびＧｌｙ−１０６を含む）、マウスＩＬ−２ｖポリペプチドが含まれる。
ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードする適切なヌクレオチド配列には、例えば、マウスＩＬ−２ｖポリペプチドをコードし、そして以下のヌクレオチド配列：
Figure 2021118683
に少なくとも９５％（例えば少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のヌクレオチド配列同一性を有する、ここでコードされるＩＬ−２ｖポリペプチドが、Ｆ７６Ａ、Ｙ７９Ａ、およびＬ１０６Ｇの置換を含む（すなわち、Ａｌａ−７６、Ａｌａ−７９、およびＧｌｙ−１０６を含む）、ヌクレオチド配列が含まれる。この配列は、マウスにおける発現のためにコドン最適化されている。
いくつかの場合、マウスＩＬ−２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ワクシニアウイルスに関してコドン最適化されている。以下は、ワクシニアウイルスに関してコドン最適化されているマウスＩＬ−２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の限定されない例である：
Figure 2021118683
ＩＬ−２ｖポリペプチドの適切なアミノ酸配列には、例えば、以下のアミノ酸配列：
Figure 2021118683
に少なくとも９５％（例えば少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そしてＦ６２Ａ、Ｙ６５Ａ、およびＬ９２Ｇの置換を含む（すなわち、Ａｌａ−６２、Ａｌａ−６５、およびＧｌｙ−９２を含む）、ヒトＩＬ−２ｖポリペプチドが含まれる。
ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードする適切なヌクレオチド配列には、例えば、ヒトＩＬ−２ｖポリペプチドをコードし、そして以下のヌクレオチド配列：
Figure 2021118683
に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列が含まれ、ここで、コードされるＩＬ−２ｖポリペプチドは、Ｆ６２Ａ、Ｙ６５Ａ、およびＬ９２Ｇの置換を含む（すなわち、Ａｌａ−６２、Ａｌａ−６５、およびＧｌｙ−９２を含む）。いくつかの場合、ヌクレオチド配列は、ヒトコドン最適化されている。配列番号１２は、ヒトコドン最適化ＩＬ−２ｖコードヌクレオチド配列の例である。
ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードする適切なヌクレオチド配列には、例えば、ヒトＩＬ−２ｖポリペプチドをコードし、そして以下のヌクレオチド配列：
Figure 2021118683
に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列が含まれ、ここで、コードされるＩＬ−２ｖポリペプチドは、Ｆ６２Ａ、Ｙ６５Ａ、およびＬ９２Ｇの置換を含む（すなわち、Ａｌａ−６２、Ａｌａ−６５、およびＧｌｙ−９２を含む）。いくつかの場合、ヌクレオチド配列は、ワクシニアウイルスに関してコドン最適化されている。配列番号１３は、ワクシニアウイルスコドン最適化ＩＬ−２ｖコードヌクレオチド配列の例である。
ＩＬ−２ｖポリペプチドの適切なアミノ酸配列には、例えば、以下のアミノ酸配列：
Figure 2021118683
に少なくとも９５％（例えば少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そしてＦ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＬ７２Ｇの置換を含む（すなわちＡｌａ−４２、Ａｌａ−４５、およびＧｌｙ−７２を含む）、ヒトＩＬ−２ｖポリペプチドが含まれる。
ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードする適切なヌクレオチド配列には、例えば、ヒトＩＬ−２ｖポリペプチドをコードし、そして以下のヌクレオチド配列：
Figure 2021118683
に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列が含まれ、ここで、コードされるＩＬ−２ｖポリペプチドは、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＬ７２Ｇの置換を含む（すなわち、Ａｌａ−４２、Ａｌａ−４５、およびＧｌｙ−７２を含む）。
いくつかの場合、ヌクレオチド配列は、ヒトコドン最適化されている。配列番号１０は、ヒトコドン最適化ＩＬ−２ｖコードヌクレオチド配列の例である。
ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードする適切なヌクレオチド配列には、例えば、ヒトＩＬ−２ｖポリペプチドをコードし、そして以下のヌクレオチド配列：
Figure 2021118683
に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列が含まれ、ここで、コードされるＩＬ−２ｖポリペプチドは、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＬ７２Ｇの置換を含む（すなわち、Ａｌａ−４２、Ａｌａ−４５、およびＧｌｙ−７２を含む）。
いくつかの場合、ヌクレオチド配列は、ワクシニアウイルスに関してコドン最適化されている。配列番号１１は、ワクシニアウイルスコドン最適化ＩＬ−２ｖコードヌクレオチド配列の例である。
いくつかの場合、本開示の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードする相同組換えドナー断片を含み、ここで、相同組換えドナー断片は、配列番号４（ＶＶ２７／ＶＶ３８相同組換えドナー断片）、配列番号５（ＶＶ３９相同組換えドナー断片）、配列番号１５（ｈＩＬ−２ｖ（ヒトコドン最適化）を含有するＶＶ７５相同組換えドナー断片）、配列番号１６（ｈＩＬ−２ｖ（ヒトコドン最適）を含有するコペンハーゲンＪ２Ｒ相同組換えプラスミド）、配列番号１７（ｈＩＬ−２ｖ（ワクシニアウイルスコドン最適化）を含有する相同組換えドナー断片）、配列番号１８（ｈＩＬ−２ｖ（ワクシニアウイルスコドン最適化）を含有するコペンハーゲンＪ２Ｒ相同組換えプラスミド）、および配列番号２０（マウスＩＬ−２変異体（ワクシニアウイルスコドン最適化）相同組換えドナー断片）のいずれか１つに示すヌクレオチド配列に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
いくつかの場合、本開示の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、配列番号６（コペンハーゲンＪ２Ｒ相同組換えプラスミド）に示すヌクレオチド配列に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み；そしてＩＬ−２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
いくつかの場合、本開示の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、配列番号７（マウスＩＬ−２変異体（ｍＩＬ−２ｖ）ポリペプチドを含有するコペンハーゲンＪ２Ｒ相同組換えプラスミド）に示すヌクレオチド配列に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、上述のように、ｍＩＬ−２ｖポリペプチドの代わりに、ヒトＩＬ−２変異体（ｈＩＬ−２ｖ）ポリペプチドを含む。
いくつかの場合、本開示の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、配列番号８（ｍＩＬ−２ｖを含有するウェスタンリザーブＪ２Ｒ相同組換えプラスミド）に示すヌクレオチド配列に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、上述のように、ｍＩＬ−２ｖポリペプチドの代わりに、ヒトＩＬ−２変異体（ｈＩＬ−２ｖ）ポリペプチドを含む。
いくつかの場合、本開示の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＶＶ２７（Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１ＥおよびｍＩＬ−２ｖ導入遺伝子を含有するコペンハーゲンワクシニア）である。いくつかの場合、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、上述のように、ｍＩＬ−２ｖポリペプチドの代わりに、ヒトＩＬ−２変異体（ｈＩＬ−２ｖ）ポリペプチドを含む。
いくつかの場合、本開示の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＶＶ３８（ｍＩＬ−２ｖ導入遺伝子を含有するコペンハーゲンワクシニア）である。いくつかの場合、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、上述のように、ｍＩＬ−２ｖポリペプチドの代わりに、ヒトＩＬ−２変異体（ｈＩＬ−２ｖ）ポリペプチドを含む。
いくつかの場合、本開示の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＶＶ３９（ｍＩＬ−２ｖ導入遺伝子を含有するウェスタンリザーブワクシニア）である。いくつかの場合、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、上述のように、ｍＩＬ−２ｖポリペプチドの代わりに、ヒトＩＬ−２変異体（ｈＩＬ−２ｖ）ポリペプチドを含む。
Ｂ−２． 異種チミジンキナーゼポリペプチド
上述のように、本開示によって提供される複製可能ＲＶＶは、異種チミジンキナーゼ（ＴＫ）ポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、異種ＴＫポリペプチドは、ヒト野生型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＴＫポリペプチドである。ヒト野生型ＨＳＶ−ＴＫポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２５に示す。いくつかの他の態様において、異種ＴＫポリペプチドは、野生型ＨＳＶ−ＴＫポリペプチドの変異体である。野生型ＨＳＶ−ＴＫの変異体を、本明細書において、「ＨＳＶ−ＴＫｖポリペプチド」、「ＴＫｖポリペプチド」、または単に「ＴＫｖ」と称する。ＴＫｖポリペプチドは、いくつかの場合、Ｉ型ＴＫポリペプチド、すなわち、それぞれデオキシグアノシン（ｄＧ）のリン酸化を触媒して、ｄＧ一リン酸を生成可能であるＴＫポリペプチドである。
野生型ワクシニアウイルスにおいて、Ｊ２Ｒ領域は、ワクシニアウイルスＴＫをコードする。いくつかの例において、異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ワクシニアウイルスのＪ２Ｒ遺伝子の位置に挿入する。いくつかの他の態様において、異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ワクシニアウイルスＴＫコードヌクレオチド配列のすべてまたは一部を置換する。例えば、いくつかの場合、異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ワクシニアウイルスのＪ２Ｒ領域の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または１００％を置換する。いくつかの場合、本開示の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、内因性（ワクシニアウイルスがコードする）ＴＫコード遺伝子の転写が減少するかまたは除去されるような修飾を含む。例えば、いくつかの場合、内因性（ワクシニアウイルスがコードする）ＴＫコード遺伝子の転写は、修飾を伴わない内因性（ワクシニアウイルスがコードする）ＴＫコード遺伝子の転写に比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または９０％を超えて減少している。
いくつかの場合、複製可能ＲＶＶの複製は、野生型ＨＳＶ−ＴＫポリペプチドをコードする複製可能ＲＶＶの複製が阻害される濃度よりもより低い濃度で、ガンシクロビルで阻害される。例えば、野生型ＨＳＶ−ＴＫの変異体をコードする本開示の複製可能ＲＶＶの複製は、野生型ＨＳＶ−ＴＫポリペプチドをコードする複製可能ＲＶＶの複製の阻害に関するガンシクロビルＩＣ５０よりも、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％低い最大値５０％（ＩＣ５０）で阻害される。
いくつかの態様において、本開示の複製可能ＲＶＶ中に存在するヌクレオチド配列によってコードされる異種ＴＫポリペプチドは、野生型ＨＳＶ−ＴＫの変異体であり、ここで、ＴＫｖポリペプチドは、野生型ＨＳＶ−ＴＫ（配列番号２５）に比較して、１つまたはそれより多いアミノ酸置換を含む。したがって、例えば、本開示の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス中に存在するヌクレオチド配列によってコードされるＴＫｖポリペプチドは、野生型ＨＳＶ−ＴＫに比較して、１〜４０のアミノ酸置換を含む。例えば、本開示の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス中に存在するヌクレオチド配列によってコードされるＴＫｖポリペプチドは、野生型ＨＳＶ−ＴＫ（配列番号２５）に比較して、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、または３５〜４０のアミノ酸置換を含む。
いくつかの態様において、本開示のＲＶＶ中に存在する異種ＴＫポリペプチドは、以下の野生型アミノ酸配列：
Figure 2021118683
に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ＴＫｖポリペプチドは、配列番号２５に対して１つまたはそれより多い置換を含む。
いくつかの場合、異種ＴＫポリペプチドは、野生型ＨＳＶ−ＴＫアミノ酸配列（上記；配列番号２５）に比較して１つまたはそれより多いアミノ酸置換を含む。例えば、いくつかの場合、異種ＴＫポリペプチドは、Ｌ１５９、Ｉ１６０、Ｆ１６１、Ａ１６８、およびＬ１６９の１つまたはそれより多くの置換を含む。
いくつかの場合、異種ＴＫポリペプチドは、上記の野生型ＨＳＶ−ＴＫアミノ酸配列；配列番号２５に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むが、Ｌ１５９に置換を有し、すなわちアミノ酸１５９はＬｅｕ以外である。例えば、アミノ酸１５９は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、またはＧｌｕである。いくつかの場合、置換はＬ１５９Ｉ置換である。いくつかの場合、置換はＬ１５９Ａ置換である。いくつかの場合、置換はＬ１５９Ｖ置換である。
いくつかの場合、異種ＴＫポリペプチドは、上記の野生型ＨＳＶ−ＴＫアミノ酸配列（配列番号２５）に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むが、Ｉ１６０で置換を有し、すなわちアミノ酸１６０はＩｌｅ以外である。例えば、アミノ酸１６０は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、またはＧｌｕである。いくつかの場合、置換はＩ１６０Ｌ置換である。いくつかの場合、置換はＩ１６０Ｖ置換である。いくつかの場合、置換はＩ１６０Ａ置換である。いくつかの場合、置換はＩ１６０Ｆ置換である。いくつかの場合、置換はＩ１６０Ｙ置換である。いくつかの場合、置換はＩ１６０Ｗ置換である。
いくつかの場合、異種ＴＫポリペプチドは、上記の野生型ＨＳＶ−ＴＫアミノ酸配列（配列番号２５）に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むが、Ｆ１６１で置換を有し、すなわちアミノ酸１６１はＰｈｅ以外である。例えば、アミノ酸１６１は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、またはＧｌｕである。いくつかの場合、置換はＦ１６１Ａ置換である。いくつかの場合、置換はＦ１６１Ｌ置換である。いくつかの場合、置換はＦ１６１Ｖ置換である。いくつかの場合、置換はＦ１６１Ｉ置換である。
いくつかの場合、異種ＴＫポリペプチドは、上記の野生型ＨＳＶ−ＴＫアミノ酸配列（配列番号２５）に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むが、Ａ１６８で置換を有し、すなわちアミノ酸１６８はＡｌａ以外である。例えば、アミノ酸１６８は、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、またはＧｌｕである。いくつかの場合、置換はＡ１６８Ｈ置換である。いくつかの場合、置換はＡ１６８Ｒ置換である。いくつかの場合、置換はＡ１６８Ｋ置換である。いくつかの場合、置換はＡ１６８Ｙ置換である。いくつかの場合、置換はＡ１６８Ｆである。いくつかの場合、置換はＡ１６８Ｗである。いくつかの場合、ＴＫｖポリペプチドは、Ａ１６８の置換以外のいかなる他の置換も含まない。
いくつかの場合、異種ＴＫポリペプチドは、上記の野生型ＨＳＶ−ＴＫアミノ酸配列（配列番号２５）に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むが、Ｌ１６９で置換を有し、すなわちアミノ酸１６９はＬｅｕ以外である。例えば、アミノ酸１６９は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、またはＧｌｕである。いくつかの場合、置換はＬ１６９Ｆ置換である。いくつかの場合、置換はＬ１６９Ｍ置換である。いくつかの場合、置換はＬ１６９Ｙ置換である。いくつかの場合、置換はＬ１６９Ｗ置換である。
いくつかの場合、異種ＴＫポリペプチドは、上記の野生型ＨＳＶ−ＴＫアミノ酸配列（配列番号２５）に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ｉ）アミノ酸１５９はＬｅｕ以外であり；ｉｉ）アミノ酸１６０はＩｌｅ以外であり；ｉｉｉ）アミノ酸１６１はＰｈｅ以外であり；ｉｖ）アミノ酸１６８はＡｌａ以外であり；そしてｖ）アミノ酸１６９はＬｅｕ以外である。いくつかの場合、異種ＴＫポリペプチドは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2021118683
に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、アミノ酸１５９はＩｌｅであり、アミノ酸１６０はＬｅｕであり、アミノ酸１６１はＡｌａであり、アミノ酸１６８はＴｙｒであり、そしてアミノ酸１６９はＰｈｅである。
いくつかの場合、異種ＴＫポリペプチドは、上記の野生型ＨＳＶ−ＴＫアミノ酸配列（配列番号２５）に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、ｉ）アミノ酸１５９はＬｅｕ以外であり；ｉｉ）アミノ酸１６０はＩｌｅ以外であり；ｉｉｉ）アミノ酸１６１はＰｈｅ以外であり；ｉｖ）アミノ酸１６８はＡｌａ以外であり；そしてｖ）アミノ酸１６９はＬｅｕ以外である。いくつかの場合、異種ＴＫポリペプチドは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2021118683
に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、アミノ酸１５９はＩｌｅであり、アミノ酸１６０はＰｈｅであり、アミノ酸１６１はＬｅｕであり、アミノ酸１６８はＰｈｅであり、そしてアミノ酸１６９はＭｅｔである。
いくつかの場合、異種ＴＫポリペプチドは、上記の野生型ＨＳＶ−ＴＫアミノ酸配列（配列番号２５）に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、アミノ酸１６８はＡｌａ以外であり、例えばここで、アミノ酸１６８は、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、またはＧｌｕである。いくつかの場合、アミノ酸１６８はＨｉｓである。いくつかの場合、アミノ酸１６８はＡｒｇである。いくつかの場合、アミノ酸１６８はＬｙｓである。いくつかの場合、異種ＴＫポリペプチドは、以下の野生型アミノ酸配列：
Figure 2021118683
に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、アミノ酸１６８はＨｉｓである。
アミノ酸１６８がＨｉｓである配列番号２８の異種ＴＫポリペプチドはまた、本開示において、「ＴＫ．００７」または「ＨＳＶ−ＴＫ．００７」とも称される。
Ｂ−３． 他の修飾
免疫刺激性サイトカインをコードする挿入ヌクレオチド配列および異種ＴＫをコードする挿入ヌクレオチド配列に加えて、本開示によって提供するＲＶＶは、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの特性をさらに改善するため、ウイルスゲノムまたはウイルスタンパク質中に親ウイルスに対するさらなる修飾、例えば腫瘍溶解性ウイルスとして望ましい特性を増加するかまたは増進する修飾、例えば特定のタンパク質の機能を欠損させるか、特定の遺伝子またはタンパク質の発現を抑制するかまたは増進させるか、あるいは外因性タンパク質を発現する修飾を含んでもよい。
いくつかの態様において、本開示によって提供するＲＶＶは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの腫瘍選択性を増加させる１つまたはそれより多い修飾をさらに含む。本明細書において、「腫瘍選択性」は、正常細胞（例えば非腫瘍細胞）より高い腫瘍細胞に対する毒性（例えば腫瘍溶解性）を意味する。こうした修飾の例には：（１）ウイルスのワクシニア増殖因子（ＶＧＦ）の機能を欠損させる修飾（ＭｃＣａｒｔら（２００１） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６１：８７５１）；（２）ワクシニアウイルスＴＫ遺伝子をウイルスＴＫ欠損にする修飾、あるいは赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子、またはＦ３遺伝子もしくは中断されたＦ３遺伝子座に対する修飾（ＷＯ ２００５／０４７４５８）；（３）ワクシニアウイルスのＶＧＦおよびＯ１Ｌの機能を欠損させる修飾（ＷＯ ２０１５／０７６４２２）；（４）癌細胞において発現が減少しているマイクロＲＮＡの、Ｂ５Ｒ遺伝子の３’非コード領域内への挿入（ＷＯ ２０１１／１２５４６９）；（５）ワクシニアウイルスの、Ｂ１８Ｒ（Ｋｉｒｎら（２００７） ＰＬｏＳ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：ｅ３５３）、リボヌクレオチドレダクターゼ（Ｇａｍｍｏｎら（２０１０） ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ６：ｅ１０００９８４）、セリンプロテアーゼ阻害剤（例えばＳＰＩ−１、ＳＰＩ−２）（Ｇｕｏら（２００５） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６５：９９９１）、ＳＰＩ−１およびＳＰＩ−２（Ｙａｎｇら（２００７） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １４：６３８）、リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子Ｆ４ＬまたはＩ４Ｌ（Ｃｈｉｌｄら（１９９０） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７４：６２５； Ｐｏｔｔｓら（２０１７） ＥＭＢＯ Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ９：６３８）、Ｂ１８Ｒ（コペンハーゲン株においてはＢ１９Ｒ）（Ｓｙｍｏｎｓら（１９９５） Ｃｅｌｌ ８１：５５１）、Ａ４８Ｒ（Ｈｕｇｈｅｓら（１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２０１０３）；Ｂ８Ｒ（Ｖｅｒａｒｄｉら（２００１） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７５：１１）、Ｂ１５Ｒ（コペンハーゲン株においてはＢ１６Ｒ）（Ｓｐｒｉｇｇｓら（１９９２） Ｃｅｌｌ ７１：１４５）、Ａ４１Ｒ（Ｎｇら（２００１） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８２：２０９５）、Ａ５２Ｒ（Ｂｏｗｉｅら（２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：１０１６２）、Ｆ１Ｌ（Ｇｅｒｌｉｃら（２０１３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １１０：７８０８）、Ｅ３Ｌ（Ｃｈａｎｇら（１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：４８２５）、Ａ４４Ｒ−Ａ４６Ｒ（Ｂｏｗｉｅら（２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：１０１６２）、Ｋ１Ｌ（Ｂｒａｖｏ Ｃｒｕｚら（２０１７） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９１：ｅ００５２４）、Ａ４８Ｒ、Ｂ１８Ｒ、Ｃ１１Ｒ、およびＴＫ（Ｍｅｊｉａｓ−Ｐｅｒｅｚら（２０１７） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ ８：２７）、Ｅ３ＬおよびＫ３Ｌ領域（ＷＯ ２００５／００７８２４）、あるいはＯ１Ｌ（Ｓｃｈｗｅｎｅｋｅｒら（２０１２） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８６：２３２３）の機能を欠損させる修飾が含まれる。さらに、ＲＶＶは、ワクシニアウイルスのＢ５Ｒの細胞外領域を欠損させる修飾（Ｂｅｌｌら（２００４） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３２５：４２５）、Ａ３４Ｒ領域を欠損させる修飾（Ｔｈｉｒｕｎａｖｕｋａｒａｓｕら（２０１３） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１：１０２４）、または、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）受容体を欠損させる修飾（ＷＯ ２００５／０３０９７１）を含んでもよい。さらに、２つまたはそれより多いこうした遺伝子修飾の組み合わせを有するワクシニアウイルスを、本開示の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスにおいて用いてもよい。ワクシニアウイルスゲノムに対する外来遺伝子のこうした挿入あるいは遺伝子の欠失または突然変異を、例えば既知の相同組換えまたは部位特異的突然変異誘発によって作製してもよい。
本明細書において、用語「欠損している」または「欠損」は、本用語によって特定される遺伝子領域またはタンパク質が減少した機能を有するかまたはまったく機能を持たないことを意味する。当該技術分野に知られる方法、例えば：ｉ）本用語によって特定される遺伝子領域の突然変異（例えば置換、反転等）および／または一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）および／または欠失；ｉｉ）遺伝子領域の発現を調節するプロモーター領域の突然変異および／または一部切除および／または欠失；ならびにｉｉｉ）遺伝子領域によってコードされるポリペプチドの翻訳が減少するかまたは排除されるようなポリアデニル化配列の突然変異および／または一部切除および／または欠失によって、遺伝子またはタンパク質を欠損させてもよい。ウイルスが、所定のワクシニアウイルス遺伝子中で「欠損」させられるような修飾を含む、本開示の複製可能ＲＶＶは、遺伝子の遺伝子産物（例えばｍＲＮＡ遺伝子産物；ポリペプチド遺伝子産物）の産生および／または活性の減少を示し；例えば、遺伝子産物の量および／または活性は、野生型ワクシニアウイルスによって、または遺伝子改変を含まない対照ワクシニアウイルスによって産生される同じ遺伝子産物の量および／または活性の、７５％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満である。例えば「欠損している」は、明記する遺伝子領域からなる領域における欠失、または明記する遺伝子領域を含む隣接遺伝子領域における欠失の結果であってもよい。例えば、遺伝子領域の転写を減少させるプロモーター領域の突然変異および／または一部切除および／または欠失が欠損を生じてもよい。また、遺伝子領域によってコードされるポリペプチドの翻訳が減少するかまたは除去されるように、転写終結要素の取り込みを通じて、遺伝子領域を欠損させてもよい。また、遺伝子領域の転写を減少させるかまたは除去するため、遺伝子編集酵素または遺伝子編集複合体（例えばガイドＲＮＡと複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド）の使用を通じて遺伝子領域を欠損させてもよい。また、遺伝子領域の転写を減少させるかまたは除去するため、競合逆プロモーター／ポリメラーゼ占有の使用を通じて、遺伝子領域を欠損させてもよい。また、遺伝子領域内に核酸を挿入し、それによって遺伝子領域をノックアウトすることによって、遺伝子領域を欠損させてもよい。
いくつかの特定の態様において、本開示のＲＶＶは、ワクシニアウイルスの内因性チミジンキナーゼ（ＴＫ）活性を欠く。本明細書において、用語「内因性」は、生物、例えばウイルス、またはその細胞内に天然に存在するかまたはこれらで天然に発現される、任意の物質、例えばポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質を指す。ワクシニアウイルスＴＫは、ワクシニアウイルスゲノム上のＴＫ遺伝子およびオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）Ｊ２Ｒによってコードされる。内因性ＴＫ活性を欠くウイルスを、「チミジンキナーゼ陰性」、「ＴＫ陰性」、「チミジンキナーゼ欠損」、または「ＴＫ欠損」と称してもよい。いくつかの場合、本開示のＲＶＶは、ワクシニアウイルスがＴＫ欠損であるように、ワクシニアウイルスＴＫコード領域のすべてまたは一部の欠失を含む。例えば、いくつかの場合、本開示の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｊ２Ｒ欠失を含む。例えば、Ｍｅｊｉａ−Ｐｅｒｅｚら（２０１８） Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ ８：２７を参照されたい。いくつかの場合、本開示の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｊ２Ｒ領域内への挿入を含み、それによって、減少したワクシニアウイルスＴＫ活性を生じるかまたは該活性をまったく生じない。
いくつかの態様において、本開示は、ウイルスのＡ３４Ｒ遺伝子がＫ１５１Ｅ置換を含む（すなわちコードされるポリペプチド中にＫ１５１Ｅ置換を提供する修飾を含む）ＲＶＶを提供する。例えば、Ｂｌａｓｃｏら（１９９３） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７（６）：３３１９−３３２５；およびＴｈｉｒｕｎａｖｕｋａｒａｓｕら（２０１３） Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２１：１０２４を参照されたい。Ａ３４Ｒ遺伝子は、ワクシニアウイルスｇｐ２２−２４（タンパク質Ａ３４としても知られる）をコードする。ワクシニアウイルスコペンハーゲン株のＡ３４タンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔで入手可能であり（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ２１０５７（Ｑ３４＿ＶＡＣＣＣ））、１６８アミノ酸からなる。
いくつかの態様において、本開示によって提供するＲＶＶは：（１）ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードする挿入ヌクレオチド配列；（２）異種ＴＫポリペプチドをコードする挿入ヌクレオチド配列；および（３）Ａ３４Ｒ遺伝子中のＫ１５１Ｅ置換を含み、ここでＲＶＶはＴＫ欠損である。いくつかの特定の態様において、ＲＶＶによってコードされるＩＬ−２ｖポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含み、そしてＦ４２Ａ置換、Ｙ４５Ａ置換、およびＬ７２Ｇ置換のアミノ酸置換を含み、ここで、アミノ酸番号付けは配列番号１のアミノ酸配列に基づく。いくつかのさらなる特定の態様において、異種ＴＫポリペプチドは、アミノ酸１６８がＨｉｓである配列番号２８のアミノ酸配列に少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
Ｂ−４． 組換えワクシニアウイルスの構築
本開示の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを、現在知られているかまたは将来発見されるかいずれかの、多様なワクシニアウイルス株のいずれから構築してもよい。使用に適したワクシニアウイルス株には、限定されるわけではないが、リスター、ニューヨーク市衛生局（ＮＹＢＨ）、ワイエス、コペンハーゲン、ウェスタンリザーブ（ＷＲ）、修飾ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、ＥＭ６３、池田、ダリアン、ＬＩＶＰ、天壇、ＩＨＤ−Ｊ、タシケント、ベルン、パリ、大連株および誘導体などが含まれる。いくつかの場合、本開示の複製可能ＲＶＶはコペンハーゲン株ワクシニアウイルスである。いくつかの場合、本開示の複製可能ＲＶＶはＷＲ株ワクシニアウイルスである。
多様な株のワクシニアウイルスのゲノムのヌクレオチド配列は、当該技術分野に知られる。例えばＧｏｅｂｅｌら（１９９０） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７９：２４７； Ｇｏｅｂｅｌら（１９９０） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７９：５１７を参照されたい。コペンハーゲン株ワクシニアウイルスのヌクレオチド配列が知られており；例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第Ｍ３５０２７号を参照されたい。ＷＲ株ワクシニアウイルスのヌクレオチド配列が知られており；例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第ＡＹ２４３３１２号；およびＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第ＮＣ＿００６９９８号を参照されたい。ワクシニアウイルスのＷＲ株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）；ＡＴＣＣ ＶＲ−１３５４より入手可能である。特定の態様において、本開示によって提供するＲＶＶは：（１）ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードする挿入ヌクレオチド配列；（２）異種ＴＫポリペプチドをコードする挿入ヌクレオチド配列；および（３）Ａ３４Ｒ遺伝子中のＫ１５１Ｅ置換を含み、ここで、ＲＶＶはコペンハーゲン株であり、そしてＴＫ欠損であり、ＩＬ−２ｖポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、そしてアミノ酸置換、Ｆ４２Ａ置換、Ｙ４５Ａ置換、およびＬ７２Ｇ置換を含み、そして異種ＴＫポリペプチドは、アミノ酸１６８がＨｉｓである配列番号２８のアミノ酸配列を含む。
本開示の複製可能ＲＶＶは腫瘍溶解活性を示す。当該技術分野に知られる任意の適切な方法によって、ウイルスの腫瘍溶解活性を評価してもよい。所定のウイルスが腫瘍溶解活性を示すかどうかを評価するための方法の例には、ウイルスの添加による癌細胞の生存率の減少を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法が含まれる。用いるべき癌細胞または細胞株の例には、悪性黒色腫細胞ＲＰＭＩ−７９５１（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−６６）、肺腺癌ＨＣＣ４００６（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２８７１）、肺癌Ａ５４９（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）、肺癌ＨＯＰ−６２（例えば、ＤＣＴＤ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）、肺癌ＥＫＶＸ（例えば、ＤＣＴＤ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）、小細胞肺癌細胞ＤＭＳ ５３（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０６２）、肺扁平上皮癌ＮＣＩ−Ｈ２２６（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−５８２６）、腎癌細胞Ｃａｋｉ−１（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−４６）、膀胱癌細胞６４７−Ｖ（例えば、ＤＳＭＺ ＡＣＣ ４１４）、頭頸部癌細胞デトロイト５６２（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１３８）、乳癌細胞ＪＩＭＴ−１（例えば、ＤＳＭＺ ＡＣＣ ５８９）、乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２６）、乳癌細胞ＭＣＦ７（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）、乳癌ＨＳ−５７８Ｔ（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１２６）、乳管癌Ｔ−４７Ｄ（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１３３）、食道癌細胞ＯＥ３３（例えば、ＥＣＡＣＣ ９６０７０８０８）、神経膠芽腫Ｕ−８７ＭＧ（例えば、ＥＣＡＣＣ ８９０８１４０２）、神経芽細胞腫ＧＯＴＯ（例えば、ＪＣＲＢ ＪＣＲＢ０６１２）、骨髄腫ＲＰＭＩ ８２２６（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１５５）、卵巣癌細胞ＳＫ−ＯＶ−３（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−７７）、卵巣癌細胞ＯＶＭＡＮＡ（例えば、ＪＣＲＢ ＪＣＲＢ１０４５）、子宮頸癌ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）、結腸癌細胞ＲＫＯ（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２５７７）、結腸癌細胞ＨＴ−２９（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）、結腸癌Ｃｏｌｏ ２０５（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２２）、結腸癌ＳＷ６２０（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２７）、結腸直腸癌ＨＣＴ １１６（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４７）、膵臓癌細胞ＢｘＰＣ−３（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６８７）、骨肉腫Ｕ−２ ＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−９６）、前立腺癌細胞ＬＮＣａＰクローンＦＧＣ（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７４０）、肝細胞癌ＪＨＨ−４（例えば、ＪＣＲＢ ＪＣＲＢ０４３５）、中皮腫ＮＣＩ−Ｈ２８（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−５８２０）、子宮頸癌細胞ＳｉＨａ（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３５）、および胃癌細胞Ｋａｔｏ ＩＩＩ（例えば、ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ ＲＣＢ２０８８）が含まれる。
ＩＬ−２ｖポリペプチドまたは異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を、確立された技術を用いて、ワクシニアウイルス内に導入してもよい。適切な技術の例は、ヘルパーウイルスでの再活性化である。適切な技術の別の例は、相同組換えである。例えば、ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を挿入したプラスミド（トランスファーベクタープラスミドＤＮＡとも称される）を生成して、組換えトランスファーベクターを生成してもよく；該組換えトランスファーベクターを、ワクシニアウイルスに感染させた細胞内に導入してもよい。次いで、相同組換えを通じて、ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を、組換えトランスファーベクターからワクシニアウイルス内に導入する。ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入する領域は、ワクシニアウイルスの生活環に必須でない遺伝子領域であってもよい。例えば、ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入する領域は、ＶＧＦ機能を欠損させるワクシニアウイルス中のＶＧＦ遺伝子内の領域、Ｏ１Ｌ機能を欠損させるワクシニアウイルス中のＯ１Ｌ遺伝子内の領域、あるいはＶＧＦおよびＯ１Ｌ機能の両方を欠損させる、ワクシニアウイルス中のＶＧＦおよびＯ１Ｌ遺伝子のいずれかまたは両方内の単数または複数の領域であってもよい。上記において、ＶＧＦおよびＯ１Ｌ遺伝子のものと同じかまたは反対の方向に転写されるように、外来遺伝子（単数または複数）を導入してもよい。別の例として、ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入する領域は、Ｂ１８（Ｂ１９）機能を欠損させるＢ１８遺伝子（コペンハーゲンではＢ１９）内の領域であってもよい。
同様に、異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を挿入したプラスミド（トランスファーベクタープラスミドＤＮＡとも称される）を生成して、組換えトランスファーベクターを生成してもよく；該組換えトランスファーベクターを、ワクシニアウイルス由来の消化ゲノムＤＮＡでトランスフェクションした細胞内に導入し、そしてヘルパーウイルスに感染させてもよい。次いで、相同組換えによって、ＴＫｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、組換えトランスファーベクターからワクシニアウイルス内に導入する。ＴＫｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を導入する領域は、内因性ワクシニアウイルスＴＫコード遺伝子、例えばＪ２Ｒであってもよい。ＴＫｖポリペプチドをコードする核酸は、ワクシニアウイルスＪ２Ｒのすべてまたは一部を置換してもよい。
いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドまたは異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、機能可能であるように転写調節要素、例えばプロモーターに連結する。いくつかの場合、プロモーターは、腫瘍細胞において、ポリペプチドの発現を提供する。適切なプロモーターには、限定されるわけではないが、ｐＳＥＬプロモーター、ＰＳＦＪ１−１０プロモーター、ＰＳＦＪ２−１６プロモーター、ｐＨｙｂプロモーター、後期初期最適化プロモーター、ｐ７．５Ｋプロモーター、ｐ１１Ｋプロモーター、Ｔ７．１０プロモーター、ＣＰＸプロモーター、修飾Ｈ５プロモーター、Ｈ４プロモーター、ＨＦプロモーター、Ｈ６プロモーター、およびＴ７ハイブリッドプロモーターが含まれる。
いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドまたは異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、制御可能プロモーターに機能可能であるように連結する。いくつかの場合、制御可能プロモーターは可逆性プロモーターである。いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドまたは異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、テトラサイクリン制御プロモーター（例えばＴｅｔＡｃｔｉｖａｔｏｒ、ＴｅｔＯＮ、ＴｅｔＯＦＦ、Ｔｅｔ−Ｏｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ、Ｔｅｔ−Ｏｎ ３Ｇ等のプロモーター系）に機能可能であるように連結する。いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドまたは異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、抑制性プロモーターに機能可能であるように連結する。いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドまたは異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、テトラサイクリン抑制性プロモーターに機能可能であるように連結し、例えばプロモーターは、テトラサイクリンあるいはテトラサイクリン類似体または誘導体の存在下で抑制される。いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドまたは異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ＴｅｔＯＦＦプロモーター系に機能可能であるように連結する。ＢｕｊａｒｄおよびＧｏｓｓｅｎ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５５４７。例えば、ＴｅｔＯＦＦプロモーター系は、テトラサイクリン（あるいは適切な類似体または誘導体、例えばドキシサイクリン）の存在下で抑制され（不活性であり）；ひとたびテトラサイクリンを除去すると、プロモーターは活性となり、そしてポリペプチドの発現を駆動する。いくつかの場合、ＩＬ−２ｖポリペプチドまたは異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、テトラサイクリン活性化可能であるプロモーターに機能可能であるように連結し、例えば該プロモーターは、テトラサイクリンあるいはテトラサイクリン類似体または誘導体の存在下で活性化される。
Ｃ． 組成物
別の側面において、本開示は、本開示によって提供するＲＶＶを含む組成物を提供する。いくつかの場合、組成物は薬学的組成物である。いくつかの場合、薬学的組成物は、その必要があるヒトに投与するために適している。
本開示によって提供する薬学的組成物には、さらに薬学的に許容されうるキャリアー（単数または複数）が含まれてもよい。本明細書において、用語「薬理学的に許容されうるキャリアー」は、投与した際、長期のまたは永続的な有害な効果を実質的に持たない任意の物質を指し、そして例えば、薬理学的に許容されうる「ビヒクル」、「安定化剤」、「希釈剤」、「補助剤」または「賦形剤」などの用語を含む。こうしたキャリアーは一般的に、本開示のＲＶＶと混合され、そして固形、半固形、または液体の剤であってもよい。本開示のＲＶＶは、可溶性であってもよいし、あるいは所望のキャリアーまたは希釈剤中で懸濁物として送達されてもよいことが理解される。多様な薬学的に許容されうるキャリアーのいずれを用いてもよく、これらには、限定なしに、緩衝剤、保存剤、浸透圧調節剤、塩、酸化防止剤、膨張剤、乳化剤、湿潤剤等が含まれる。生じる調製物が薬学的に許容されうる限り、ｐＨを調節するための多様な緩衝剤および手段を用いて、本明細書に開示する薬学的組成物を調製してもよい。こうした緩衝剤には、限定なしに、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水およびホウ酸緩衝剤が含まれる。酸または塩基を用いて、必要に応じて組成物のｐＨを調整してもよいことが理解される。薬学的に許容されうる酸化防止剤には、限定なしに、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アセチルシステイン、ブチル化ヒドロキシアニソールおよびブチル化ヒドロキシトルエンが含まれる。有用な保存剤には、限定なしに、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀および安定化オキシクロロ組成物、例えばＰＵＲＩＴＥＴＭが含まれる。本薬学的組成物に含まれるために適した等張性調節剤には、限定なしに、塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、マンニトールまたはグリセリンおよび他の薬学的に許容されうる等張性調節剤が含まれる。これらのおよび薬理学業に既知の他の物質が、本薬学的組成物中に含まれてもよいことが理解される。
本開示の薬学的組成物は、１ｍｌあたり約１０２プラーク形成単位（ｐｆｕ）（ｐｆｕ／ｍｌ）〜約１０４ｐｆｕ／ｍｌ、約１０４ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０５ｐｆｕ／ｍｌ、約１０５ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０６ｐｆｕ／ｍｌ、約１０６ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０７ｐｆｕ／ｍｌ、約１０７ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０８ｐｆｕ／ｍｌ、約１０８ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０９ｐｆｕ／ｍｌ、約１０９ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０１０ｐｆｕ／ｍｌ、約１０１０ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０１１ｐｆｕ／ｍｌ、または約１０１１ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０１２ｐｆｕ／ｍｌの量で本開示のＲＶＶを含んでもよい。
Ｄ． 腫瘍溶解を誘導する使用および方法、ならびに癌の治療
Ｄ−１． 方法、使用、および投与
別の側面において、本開示は、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含む組成物の使用ならびにこれらを用いる方法を提供する。使用または方法には、腫瘍を有する個体において、腫瘍溶解を誘導するかまたは癌を治療するためのものであって、本開示の複製可能ＲＶＶまたは本開示の組成物の有効量を、その必要がある個体に投与する工程を含む方法が含まれる。本開示の複製可能ＲＶＶまたは本開示の組成物の有効量の投与はまた、本明細書において、「ウイルス療法」とも称される。
いくつかの場合、本開示の複製可能ＲＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、個体における癌細胞の数または腫瘍重量が減少する量である。例えば、いくつかの場合、複製可能ＲＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、個体における癌細胞の数を、ＲＶＶの投与前、またはＲＶＶ投与の非存在下での個体における癌細胞の数に比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％減少させる量である。いくつかの場合、ＲＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、個体における癌細胞の数を検出不能なレベルに減少させる量である。いくつかの場合、本開示のＲＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、個体における腫瘍重量を減少させる量である。例えば、いくつかの場合、本開示のＲＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、個体における腫瘍重量を、ＲＶＶの投与前、または複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス投与の非存在下での個体における腫瘍重量に比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％減少させる量である。
いくつかの場合、本開示のＲＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、個体の生存時間を増加させる量である。例えば、いくつかの場合、本開示のＲＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、個体の生存時間を、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス投与の非存在下での個体の予期される生存時間に比較して、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、３ヶ月〜６ヶ月、６ヶ月〜１年、１年〜２年、２年〜５年、５年〜１０年、または１０年より長く増加させる量である。
いくつかの場合、本開示のＲＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞の数の増加を提供する量である。例えば、いくつかの場合、本開示のＲＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与前の、または複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス投与の非存在下での個体におけるＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞の数に比較して、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍の個体におけるＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞の数の増加を提供する量である。
いくつかの場合、本開示のＲＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、個体におけるＩＬ−２またはＩＬ−２ｖの循環レベルの増加を提供する量である。例えば、いくつかの場合、本開示のＲＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与前の、または複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス投与の非存在下での個体におけるＩＬ−２またはＩＬ−２ｖの循環レベルに比較して、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍の個体におけるＩＬ−２またはＩＬ−２ｖの循環レベルの増加を提供する量である。
いくつかの場合、本開示のＲＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、個体におけるＩＬ−２ｖポリペプチドの循環レベルの増加を提供する量である。例えば、いくつかの場合、本開示のＲＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与前の、または複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス投与の非存在下での個体におけるＩＬ−２ｖポリペプチドの循環レベルに比較して、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍の個体におけるＩＬ−２ｖポリペプチドの循環レベルの増加を提供する量である。
いくつかの場合、本開示のＲＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、ＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の数の増加を提供する量である。例えば、いくつかの場合、本開示のＲＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与前の、または複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス投与の非存在下での個体におけるＣＤ８＋ ＴＩＬの数に比較して、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍のＣＤ８＋ ＴＩＬの数の増加を提供する量である。
いくつかの場合、本開示のＲＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、耐久性のある抗腫瘍免疫反応、例えば少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも６ヶ月、または少なくとも１年、腫瘍細胞数および／または腫瘍重量および／または腫瘍増殖の減少を提供する、抗腫瘍免疫反応を誘導する量である。
多様な臨床要因に基づいて、主治医または他の認定された医療従事者によって、適切な投薬量が決定可能である。医学業において周知であるように、任意の１人の患者に関する投薬量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、腫瘍負荷、および他の関連要因を含む多くの要因に応じる。
本開示のＲＶＶを、用量あたり約１０２プラーク形成単位（ｐｆｕ）〜約１０４ｐｆｕ、約１０４ｐｆｕ〜約１０５ｐｆｕ、約１０５ｐｆｕ〜約１０６ｐｆｕ、約１０６ｐｆｕ〜約１０７ｐｆｕ、約１０７ｐｆｕ〜約１０８ｐｆｕ、約１０８ｐｆｕ〜約１０９ｐｆｕ、約１０９ｐｆｕ〜約１０１０ｐｆｕ、または約１０１０ｐｆｕ〜約１０１１ｐｆｕの量で投与してもよい。
いくつかの場合、本開示のＲＶＶを、約１ｘ１０９ｐｆｕ〜５ｘ１０１１ｐｆｕの総量で投与する。いくつかの場合、本開示のＲＶＶを、約１ｘ１０９ｐｆｕ〜約５ｘ１０９ｐｆｕ、約５ｘ１０９ｐｆｕ〜約１０１０ｐｆｕ、約１０１０ｐｆｕ〜約５ｘ１０１０ｐｆｕ、約５ｘ１０１０ｐｆｕ〜約１０１１ｐｆｕ、または約１０１１ｐｆｕ〜約５ｘ１０１１ｐｆｕの総量で投与する。いくつかの場合、本開示のＲＶＶを、約２ｘ１０１０ｐｆｕの総量で投与する。
いくつかの場合、本開示のＲＶＶを、約１ｘ１０８ｐｆｕ／患者体重ｋｇ〜約５ｘ１０９ｐｆｕ／患者体重ｋｇで投与する。いくつかの場合、本開示のＲＶＶを、約１ｘ１０８ｐｆｕ／患者体重ｋｇ〜約５ｘ１０８ｐｆｕ／患者体重ｋｇ、約５ｘ１０８ｐｆｕ／患者体重ｋｇ〜約１０９ｐｆｕ／患者体重ｋｇ、または約１０９ｐｆｕ／患者体重ｋｇ〜約５ｘ１０９ｐｆｕ／患者体重ｋｇの量で投与する。いくつかの場合、本開示のＲＶＶを、１ｘ１０８ｐｆｕ／患者体重ｋｇの量で投与する。いくつかの場合、本開示のＲＶＶを、２ｘ１０８ｐｆｕ／患者体重ｋｇの量で投与する。いくつかの場合、本開示のＲＶＶを、３ｘ１０８ｐｆｕ／患者体重ｋｇの量で投与する。いくつかの場合、本開示のＲＶＶを、４ｘ１０８ｐｆｕ／患者体重ｋｇの量で投与する。いくつかの場合、本開示のＲＶＶを、５ｘ１０８ｐｆｕ／患者体重ｋｇの量で投与する。
いくつかの場合、本開示のＲＶＶの多数回用量を投与する。本開示のＲＶＶの投与頻度は、多様な要因のいずれか、例えば症状の重症度等に応じて多様であってもよい。例えば、いくつかの態様において、本開示のＲＶＶを月１回、月２回、月３回、１週おき（ｑоｗ）、週１回（ｑｗ）、週２回（ｂｉｗ）、週３回（ｔｉｗ）、週４回、週５回、週６回、１日おき（ｑоｄ）、毎日（ｑｄ）、１日２回（ｑｉｄ）、または１日３回（ｔｉｄ）投与する。
本開示のＲＶＶの投与期間、例えば本開示の多量体ポリペプチド、本開示のＲＶＶを投与する期間は、多様な要因、例えば患者の反応等のいずれかに応じて多様でありうる。例えば、本開示のＲＶＶを、約１日〜約１週、約２週〜約４週、約１ヶ月〜約２ヶ月、約２ヶ月〜約４ヶ月、約４ヶ月〜約６ヶ月、約６ヶ月〜約８ヶ月、約８ヶ月〜約１年、約１年〜約２年、または約２年〜約４年、またはそれより長期間、投与してもよい。
ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ法、ならびに全身および局所投与経路を含めて、薬剤送達に適した任意の利用可能な方法および経路を用いて、本開示のＲＶＶを個体に投与する。
投与の慣用的および薬学的に許容されうる経路には、腫瘍内、腫瘍周辺、筋内、気管内、クモ膜下腔内、頭蓋内、皮下、皮内、局所適用、静脈内、動脈内、腹腔内、膀胱内、直腸、鼻、経口、ならびに他の経腸および非経口投与経路が含まれる。望ましい場合、ＲＶＶおよび／または望ましい効果に応じて、投与経路を組み合わせてもよいし、または調節してもよい。本開示のＲＶＶを単回用量または多数回用量で投与してもよい。
いくつかの場合、本開示のＲＶＶを静脈内投与する。いくつかの場合、本開示のＲＶＶを筋内投与する。いくつかの場合、本開示のＲＶＶを局所投与する。いくつかの場合、本開示のＲＶＶを腫瘍内投与する。いくつかの場合、本開示のＲＶＶを腫瘍周辺投与する。いくつかの場合、本開示のＲＶＶを頭蓋内投与する。いくつかの場合、本開示のＲＶＶを皮下投与する。いくつかの場合、本開示のＲＶＶを動脈内投与する。いくつかの場合、本開示のＲＶＶを腹腔内投与する。いくつかの場合、本開示のＲＶＶを、膀胱内投与経路を通じて投与する。いくつかの場合、本開示のＲＶＶをクモ膜下腔内投与する。
Ｄ−２． 組み合わせ
いくつかの場合、本開示のＲＶＶを、別の療法または剤と組み合わせて投与する。例えば、ＲＶＶを、標準的な癌療法の補助療法として投与するか、別の癌療法と組み合わせて投与するか、またはＲＶＶの抗腫瘍効果を増進させる剤と組み合わせて投与してもよい。標準的な癌療法には、手術（例えば癌性組織の外科的除去）、放射線療法、骨髄移植、化学療法治療、抗体治療、生物学的反応修飾因子治療、免疫療法治療、および前述の特定の組み合わせが含まれる。いくつかの場合、本開示の方法または使用は：ａ）その必要がある個体に、本開示のＲＶＶまたは該ＲＶＶを含む組成物を投与し；そしてｂ）該個体に第二の癌療法を投与する工程を含む。いくつかの場合、第二の癌療法は、化学療法、生物学的療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、抗血管療法、凍結療法、毒素療法、腫瘍溶解性ウイルス療法（例えば本開示のＲＶＶ以外の腫瘍溶解性ウイルス）、細胞療法、および手術より選択される。
放射線療法には、限定されるわけではないが、ビームなどの外部から適用される供給源から、または小型放射性供給源の移植によってのいずれかで送達される、Ｘ線またはガンマ線が含まれる。
癌治療において使用するために適した抗体には、限定されるわけではないが、例えばアベルマブ（商標バベンチオ）、トラスツズマブ（商標ハーセプチン）、ベバシズマブ（商標アバスチン）、セツキシマブ（商標エルビタックス）、パニツムマブ（商標ベクティビックス）、イピリムマブ（商標ヤーボイ）、リツキシマブ（商標リツキサン）、アレムツズマブ（商標レムトラダ）、オファツムマブ（商標アーゼラ）、オレゴボマブ（商標オバレックス）、ラムブロリズマブ（ＭＫ−３４７５）、ペルツズマブ（商標ペルジェタ）、ラニビズマブ（商標ルセンティス）等、およびコンジュゲート化抗体、例えばゲムツズマブ・オゾガマイシン（商標ミロターグ）、ブレンツキシマブ・ベドチン（商標アドセトリス）、９０Ｙ標識イブリツモマブ・チウキセタン（商標ゼバリン）、１３１Ｉ標識トシツモマブ（商標ベキサール）等が含まれる。癌治療に使用するために適した抗体には、限定されるわけではないが、例えば、ＣＴＬＡ−４をターゲティングするイピリムマブ（黒色腫、前立腺癌、ＲＣＣの治療に用いられるようなもの）；ＣＴＬＡ−４をターゲティングするトレメリムマブ（ＣＲＣ、胃癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣの治療に用いられるようなもの）；ＰＤ−１をターゲティングするニボルマブ（黒色腫、ＮＳＣＬＣ、ＲＣＣの治療に用いられるようなもの）；ＰＤ−１をターゲティングするＭＫ−３４７５（黒色腫の治療に用いられるようなもの）；ＰＤ−１をターゲティングするピディリズマブ（血液学的悪性腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ＰＤ−Ｌ１をターゲティングするＢＭＳ−９３６５５９（黒色腫、ＮＳＣＬＣ、卵巣癌、ＲＣＣの治療に用いられるようなもの）；ＰＤ−Ｌ１をターゲティングするＭＥＤＩ４７３６；ＰＤ−Ｌ１をターゲティングするＭＰＤＬ３３２８０Ａ（黒色腫の治療に用いられるようなもの）；ＣＤ２０をターゲティングするリツキシマブ（非ホジキンリンパ腫の治療に用いられるようなもの）；イブリツモマブ・チウキセタンおよびトシツモマブ（リンパ腫の治療に用いられるようなもの）；ＣＤ３０をターゲティングするブレンツキシマブ・ベドチン（ホジキンリンパ腫の治療に用いられるようなもの）；ＣＤ３３をターゲティングするゲムツズマブ・オゾガマイシン（急性骨髄性白血病の治療に用いられるようなもの）；ＣＤ５２をターゲティングするアレムツズマブ（慢性リンパ球性白血病の治療に用いられるようなもの）；ＥｐＣＡＭをターゲティングするＩＧＮ１０１およびアデカツムマブ（上皮腫瘍（乳房腫瘍、結腸腫瘍および肺腫瘍）の治療に用いられるようなもの）；ＣＥＡをターゲティングするラベツズマブ（乳房腫瘍、結腸腫瘍および肺腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ｇｐＡ３３をターゲティングするｈｕＡ３３（結腸直腸癌の治療に用いられるようなもの）；ムチンをターゲティングするペムツモマブおよびオレゴボマブ（乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍および卵巣腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ＴＡＧ−７２をターゲティングするＣＣ４９（ミンレツモマブ）（乳房腫瘍、結腸腫瘍および肺腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ＣＡＩＸをターゲティングするｃＧ２５０（腎細胞癌の治療に用いられるようなもの）；ＰＳＭＡをターゲティングするＪ５９１（前立腺癌の治療に用いられるようなもの）；葉酸結合タンパク質をターゲティングするＭＯｖ１８およびＭＯＲＡｂ−００３（ファーレツズマブ）（卵巣腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ガングリオシド（例えばＧＤ２、ＧＤ３およびＧＭ２）をターゲティングする３Ｆ８、ｃｈ１４．１８およびＫＷ−２８７１（神経外胚葉性腫瘍およびいくつかの上皮腫瘍の治療に用いられるようなもの）；Ｌｅ ｙをターゲティングするｈｕ３Ｓ１９３およびＩｇＮ３１１（乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍および前立腺腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ＶＥＧＦをターゲティングするベバシズマブ（腫瘍血管系の治療に用いられるようなもの）；ＶＥＧＦＲをターゲティングするＩＭ−２Ｃ６およびＣＤＰ７９１（上皮由来固形腫瘍の治療に用いられるようなもの）；インテグリンＶ＿３をターゲティングするエトラシズマブ（腫瘍血管系の治療に用いられるようなもの）；インテグリン５＿１をターゲティングするボロシキシマブ（腫瘍血管系の治療に用いられるようなもの）；ＥＧＦＲをターゲティングするセツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブおよび８０６（神経膠腫、肺腫瘍、乳房腫瘍、結腸腫瘍および頭頸部腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ＥＲＢＢ２をターゲティングするトラスツズマブおよびペルツズマブ（乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍および前立腺腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ＥＲＢＢ３をターゲティングするＭＭ−１２１（乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍および前立腺腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ＭＥＴをターゲティングするＡＭＧ１０２、ＭＥＴＭＡＢおよびＳＣＨ９００１０５（乳房腫瘍、卵巣腫瘍および肺腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ＩＧＦ１ＲをターゲティングするＡＶＥ１６４２、ＩＭＣ−Ａ１２、ＭＫ−０６４６、Ｒ１５０７およびＣＰ７５１８７１（神経膠腫、肺癌、乳癌、頭頸部癌、前立腺癌および甲状腺癌の治療に用いられるようなもの）；ＥＰＨＡ３をターゲティングするＫＢ００４およびＩＩＩＡ４（肺腫瘍、腎臓および結腸腫瘍、黒色腫、神経膠腫および血液学的悪性腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ＴＲＡＩＬＲ１をターゲティングするマパツムマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲ１）（結腸腫瘍、肺腫瘍および膵臓腫瘍および血液学的悪性腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ＴＲＡＩＬＲ２をターゲティングするＨＧＳ−ＥＴＲ２およびＣＳ−１００８；ＲＡＮＫＬをターゲティングするデノスマブ（前立腺癌および骨転移の治療に用いられるようなもの）；ＦＡＰをターゲティングするシブロツズマブおよびＦ１９（結腸腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、膵臓腫瘍、および頭頸部腫瘍の治療に用いられるようなもの）；テネイシンをターゲティングする８１Ｃ６（神経膠腫、乳房腫瘍および前立腺腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ＣＤ３をターゲティングするブリナツモマブ（商標ビーリンサイト）（ＡＬＬの治療に用いられるようなもの）；癌免疫療法で用いられるようなＰＤ−１をターゲティングするペムブロリズマブ；ｃ−Ｍｙｃをターゲティングする９Ｅ１０抗体等が含まれる。
いくつかの場合、本開示の方法または使用は：ａ）有効量の本開示のＲＶＶ；およびｂ）抗ＰＤ−１抗体を投与する工程を含む。いくつかの場合、本開示の方法または使用は：ａ）有効量の本開示のＲＶＶ；およびｂ）抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与する工程を含む。適切な抗ＰＤ−１抗体の例には、限定されるわけではないが、ペムブロリズマブ（キートルーダ（登録商標）；ＭＫ−３４７５）、ニボルマブ、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１）、ＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ−５１４（ＭＥＤＩ−０６８０）、ＰＤＲ００１、およびＰＦ−０６８０１５９１が含まれる。適切な抗ＰＤ−Ｌ１抗体には、限定されるわけではないが、ＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ１１０５）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６；イミフィンジ）、およびアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３３２８０Ａ；テセントリク））が含まれる。例えば、ＳｕｎｓｈｉｎｅおよびＴａｕｂｅ（２０１５） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２３：３２；ならびにＨｅｅｒｙら（２０１７） Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １８：５８７； Ｉｗａｉら（２０１７） Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｓｃｉ． ２４：２６； Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎら（２０１７） Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２８： ｉｓｓｕｅ Ｓｕｐｐｌ． ５、ｍｄｘ３７６．０４８；および米国特許公報第２０１６／０１５９９０５号を参照されたい。
いくつかの場合、適切な抗体は、二重特異性抗体、例えば二重特異性モノクローナル抗体である。カツマキソマブ、ブリナツモマブ、ソリトマブ、パソツキシズマブ、およびフロテツズマブは、癌療法で使用するために適した二重特異性抗体の限定されない例である。例えば、ＣｈａｍｅｓおよびＢａｔｙ（２００９） ＭＡｂｓ １：５３９；ならびにＳｅｄｙｋｈら（２０１８） Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． Ｄｅｖｅｌ． Ｔｈｅｒ． １２：１９５を参照されたい。
本開示の方法と関連した使用に適した生物学的反応修飾因子には、限定されるわけではないが、（１）チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）活性の阻害剤；（２）セリン／スレオニンキナーゼ活性の阻害剤；（３）腫瘍関連抗原アンタゴニスト、例えば腫瘍抗原に特異的に結合する抗体；（４）アポトーシス受容体アゴニスト；（５）インターロイキン−２；（６）インターフェロン−α；（７）インターフェロン−γ；（８）コロニー刺激因子；（９）血管新生の阻害剤；および（１０）腫瘍壊死因子のアンタゴニストが含まれる。
化学療法剤は、癌細胞の増殖を減少させる非ペプチド性（すなわち非タンパク質性）化合物であり、そして細胞傷害性剤および細胞分裂停止剤を含む。化学療法剤の限定されない例には、アルキル化剤、ニトロソ尿素、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、植物（ビンカ）アルカロイド、およびステロイドホルモンが含まれる。
細胞増殖を減少させるように働く剤が当該技術分野に知られ、そして広く用いられている。こうした剤には、アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、およびトリアゼンが含まれ、限定されるわけではないが、メクロレタミン、シクロホスファミド（サイトキサンＴＭ）、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン、クロロゾトシン、ウラシルマスタード、クロルメチン、イフォスファミド、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、ダカルバジン、およびテモゾロミドが含まれる。
代謝拮抗剤には、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤が含まれ、限定されるわけではないが、シタラビン（ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ）、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（ＦｕｄＲ）、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、ペントスタチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキセート、１０−プロパルギル―５，８−ジデアザフォレート（ＰＤＤＦ、ＣＢ３７１７）、５，８−ジデアザテトラヒドロ葉酸（ＤＤＡＴＨＦ）、ロイコボリン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、およびゲムシタビンが含まれる。
適切な天然産物およびその誘導体（例えばビンカアルカロイド、抗腫瘍抗生物質、酵素、リンホカイン、およびエピポドフィロトキシン）には、限定されるわけではないが、Ａｒａ−Ｃ、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、ドセタキセル（タキソテール（登録商標））、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン−Ｃ、Ｌ−アスパラギナーゼ、アザチオプリン；ブレキナル；アルカロイド、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン等；ポドフィロトキシン、例えばエトポシド、テニポシド等；抗生物質、例えばアントラサイクリン、ダウノルビシン塩酸（ダウノマイシン、ルビドマイシン、セルビジン）、イダルビシン、ドキソルビシン、エピルビシンおよびモルホリノ誘導体等；フェノキシゾンビスシクロペプチド、例えばダクチノマイシン；塩基性糖ペプチド、例えばブレオマイシン；アントラキノングリコシド、例えばプリカマイシン（ミトラマイシン）；アントラセンジオン、例えばミトキサントロン；アジリノピロロインドールジオン、例えばマイトマイシン；大環状免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、ＦＫ−５０６（タクロリムス、プログラフ）、ラパマイシン等などが含まれる。
他の抗増殖性細胞傷害性剤は、ナベルベン、ＣＰＴ−１１、アナストラゾール、レトラゾール、カペシタビン、レロキサフィン（ｒｅｌｏｘａｆｉｎｅ）、シクロホスファミド、イフォサミド（ｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、およびドロロキサフィンである。
抗増殖活性を有する、微小管に影響を及ぼす剤もまた、使用に適しており、そしてこれには、限定されるわけではないが、アロコルヒチン（ＮＳＣ ４０６０４２）、ハリコンドリンＢ（ＮＳＣ ６０９３９５）、コルヒチン（ＮＳＣ ７５７）、コルヒチン誘導体（例えばＮＳＣ ３３４１０）、ドルスタチン（ｄｏｌｓｔａｔｉｎ）１０（ＮＳＣ ３７６１２８）、メイタンシン（ＮＳＣ １５３８５８）、リゾキシン（ＮＳＣ ３３２５９８）、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、タキソール（登録商標）誘導体、ドセタキセル（タキソテール（登録商標））、チオコルヒチン（ＮＳＣ ３６１７９２）、トリチルシステリン（ｔｒｉｔｙｌ ｃｙｓｔｅｒｉｎ）、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、天然および合成エポチロンが含まれ、限定されるわけではないが、エポチロン（ｅｏｐｔｈｉｌｏｎｅ）Ａ、エポチロンＢ、ディスコデルモリド；エストラムスチン、ノコダゾール等が含まれる。
使用に適したホルモン調節剤およびステロイド（合成類似体を含む）には、限定されるわけではないが、アドレノコルチコステロイド、例えばプレドニゾン、デキサメタゾン等；エストロゲンおよびプレゲスチン（ｐｒｅｇｅｓｔｉｎ）、例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、エストラジオール、クロミフェン、タモキシフェン等；および副腎皮質抑制剤、例えばアミノグルテチミド；１７α−エチニルエストラジオール；ジエチルスチルベストロール、テストステロン、フロキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、メチルプレドニゾロン、メチル−テストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、リュープロリド、フルタミド（ドロゲニル）、トレミフェン（ファレストン）、およびゾラデックス（登録商標）が含まれる。エストロゲンは、増殖および分化を刺激し、したがって、エストロゲン受容体に結合する化合物を用いて、この活性をブロックする。コルチコステロイドは、Ｔ細胞増殖を阻害しうる。
他の化学療法剤には、金属錯体、例えばシスプラチン（シス−ＤＤＰ）、カルボプラチン等；尿素、例えばヒドロキシ尿素；およびヒドラジン、例えばＮ−メチルヒドラジン；エピドフィロトキシン（ｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）；トポイソメラーゼ阻害剤；プロカルバジン；ミトキサントロン；ロイコボリン；テガファー等が含まれる。関心対象の他の抗増殖剤には、免疫抑制剤、例えばミコフェノール酸、サリドマイド、デスオキシスパガリン（ｄｅｓｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、アザスポリン、レフルノミド、ミゾリビン、アザスピラン（ＳＫＦ １０５６８５）；４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−メトキシ−６−（３−（４−モルホリニル）プロポキシ）キナゾリン（商標イレッサ）；等が含まれる。
「タキサン類」には、パクリタキセル、ならびに任意の活性タキサン誘導体またはプロドラッグが含まれる。「パクリタキセル」は、本明細書において、パクリタキセルの一般的な化学的に入手可能な型だけでなく、類似体、配合物、および誘導体、例えばドセタキセル、タキソール（登録商標）、タキソテール（登録商標）（ドセタキセルの配合物）、パクリタキセルの１０−デスアセチル類似体およびパクリタキセルの３’Ｎ−デスベンゾイル−３’Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル類似体、ならびにパクリタキセルコンジュゲート（例えばパクリタキセル−ＰＥＧ、パクリタキセル−デキストラン、またはパクリタキセル−キシロース）も指す。
細胞療法には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法（ＣＡＲ−Ｔ療法）；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞療法；樹状細胞（ＤＣ）療法（例えばＤＣに基づくワクチン）；Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）操作Ｔ細胞に基づく療法等が含まれる。
Ｄ−３． 癌
本開示の方法、使用および組成物によって治療されうる癌細胞には、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯茎、頭部、腎臓、肝臓、肺、上咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、脊髄、精巣、舌、または子宮由来の、またはこれらにおける癌細胞が含まれる。さらに、癌は、これらに限定されるわけではないが、特に、以下の組織学的タイプのものであってもよい：新生物、悪性；癌腫；癌腫、未分化；巨細胞および紡錘細胞癌腫；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；石灰化上皮癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；ガストリン産生腫瘍、悪性；胆管細胞癌；肝細胞癌；肝細胞癌および胆管細胞癌の組み合わせ；索状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープ中の腺癌；腺癌、家族性大腸線維症；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞腺癌；乳頭状腺癌；嫌色素性癌；好酸性（ａｃｉｄｏｐｈｉｌ）癌腫；好酸性（ｏｘｙｐｈｉｌｉｃ）腺癌；好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞腺癌；乳頭状および濾胞腺癌；非被包性硬化性癌；副腎皮質癌；類内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳道腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤性乳管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を伴う腺癌；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫瘍、悪性；アンドロブラストーマ、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞（ｌｉｐｉｄ ｃｅｌｌ）腫瘍、悪性；パラガングリオーマ、悪性；乳房外パラガングリオーマ、悪性；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性黒色腫；無色素性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑中の悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胚性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質性肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚性癌腫；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫瘍；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；神経膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起膠芽細胞腫；原始神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン腫瘍；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、巨細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉症；他の明記される非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；マスト細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；膵臓癌；直腸癌；および毛様細胞白血病。
本開示の方法または使用を用いて治療してもよい腫瘍には、例えば脳癌腫瘍、頭頸部癌腫瘍、食道癌腫瘍、皮膚癌腫瘍、肺癌腫瘍、胸腺癌腫瘍、胃癌腫瘍、結腸癌腫瘍、肝臓癌腫瘍、卵巣癌腫瘍、子宮癌腫瘍、膀胱癌腫瘍、精巣癌腫瘍、直腸癌腫瘍、乳癌腫瘍、または膵臓癌腫瘍が含まれる。
いくつかの場合、腫瘍は結腸直腸腺癌である。いくつかの場合、腫瘍は非小細胞肺癌である。いくつかの場合、腫瘍はトリプルネガティブ乳癌である。いくつかの場合、腫瘍は固形腫瘍である。いくつかの場合、腫瘍は液性腫瘍である。いくつかの場合、腫瘍は再発性である。いくつかの場合、腫瘍は原発性腫瘍である。いくつかの場合、腫瘍は転移性である。
Ｄ−４． 治療に適した被験体
癌を治療する本方法での治療には、多様な被験体が適している。適切な被験体には、癌を有するか、癌と診断されているか、癌を発展させるリスクがあるか、癌を有していたことがあり、そして癌の再発のリスクがあるか、癌のために本開示の腫瘍溶解性ワクシニアウイルス以外の剤で治療されたことがあり、そしてこうした治療にうまく反応しなかったか、または癌のために本開示の腫瘍溶解性ワクシニアウイルス以外の剤で治療されたことがあるが、こうした治療に最初に反応した後、再発した、任意の個体、例えばヒトまたは非ヒト動物が含まれる。いくつかの態様において、治療される被験体はヒトである。
Ｄ−５． ワクシニアウイルス免疫原性組成物
別の側面において、本開示によって提供するＲＶＶは、そのゲノム中に、癌抗原（本明細書において、「癌関連抗原」とも称される）をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。したがって、本開示は、そのゲノム中に：ｉ）ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ＩＬ−２ｖポリペプチドが、野生型ＩＬ−２に比較して、ＣＤ２５への減少した結合を有するか、またはそうでなければ減少した望ましくない特性を有する、前記ヌクレオチド配列；ｉｉ）異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；およびｉｉｉ）癌抗原をコードするヌクレオチド配列を含む、ＲＶＶを提供する。こうしたＲＶＶは、その必要がある個体（例えば癌を有する個体）に投与した際、コードされる癌抗原に対する免疫反応を個体において誘導するかまたは増進させることも可能である。免疫反応は、個体における癌細胞の数を減少させることも可能である。いくつかの場合、ＲＶＶは複製可能である。いくつかの場合、ＲＶＶは複製不能である。いくつかの場合、ＲＶＶは腫瘍溶解性ではない。適切なＩＬ−２ｖポリペプチドは上記の通りである。
癌関連抗原の例には：α−葉酸受容体；炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ３３；ＣＤ４４ｖ７／８；癌胎児抗原（ＣＥＡ）；上皮糖タンパク質−２（ＥＧＰ−２）；上皮糖タンパク質−４０（ＥＧＰ−４０）；葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）；胎児アセチルコリン受容体；ガングリオシド抗原ＧＤ２；Ｈｅｒ２／ｎｅｕ；ＩＬ−１３Ｒ−ａ２；カッパ軽鎖；ＬｅＹ；Ｌ１細胞接着分子；黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）；ＭＡＧＥ−Ａ１；メソテリン；ＭＵＣ１；ＮＫＧ２Ｄリガンド；癌胎児抗原（ｈ５Ｔ４）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；腫瘍関連糖タンパク質−７２（ＴＡＧ−７２）；血管内皮増殖因子受容体−２（ＶＥＧＦ−Ｒ２）（例えば、Ｖｉｇｎｅｒｏｎら（２０１３） Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：１５；およびＶｉｇｎｅｒｏｎ（２０１５） ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓ． Ｉｎｔ’ｌ Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ９４８５０１を参照されたい）；および上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ） ｖＩＩＩポリペプチド（例えば、Ｗｏｎｇら（１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：２９６５；およびＭｉａｏら（２０１４） ＰＬｏＳＯｎｅ ９：ｅ９４２８１を参照されたい）；ＭＵＣ１ポリペプチド；ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６ポリペプチド；ＬＭＰ２ポリペプチド；ＨＰＶ Ｅ７ポリペプチド；上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ｖＩＩＩポリペプチド；ＨＥＲ−２／ｎｅｕポリペプチド；黒色腫抗原ファミリーＡ、３（ＭＡＧＥ Ａ３）ポリペプチド；ｐ５３ポリペプチド；突然変異体ｐ５３ポリペプチド；ＮＹ−ＥＳＯ−１ポリペプチド；葉酸加水分解酵素（前立腺特異的膜抗原；ＰＳＭＡ）ポリペプチド；癌胎児抗原（ＣＥＡ）ポリペプチド；Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原（ｍｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１）ポリペプチド；Ｒａｓポリペプチド；ｇｐ１００ポリペプチド；プロテイナーゼ３（ＰＲ１）ポリペプチド；ｂｃｒ−ａｂｌポリペプチド；チロシナーゼポリペプチド；サバイビンポリペプチド；前立腺特異抗原（ＰＳＡ）ポリペプチド；ｈＴＥＲＴポリペプチド；肉腫転位置ブレイクポイントポリペプチド；滑膜肉腫Ｘ（ＳＳＸ）ブレイクポイントポリペプチド；ＥｐｈＡ２ポリペプチド；前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）ポリペプチド；アポトーシスの黒色腫阻害剤（ＭＬ−ＩＡＰ）ポリペプチド；アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）ポリペプチド；上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）ポリペプチド；ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合）ポリペプチド；ＮＡ１７ポリペプチド、ペアード−ボックス−３（ＰＡＸ３）ポリペプチド；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）ポリペプチド；アンドロゲン受容体ポリペプチド；サイクリンＢ１ポリペプチド；Ｎ−ｍｙｃ癌原遺伝子（ＭＹＣＮ）ポリペプチド；Ｒａｓ相同体遺伝子ファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）ポリペプチド；チロシナーゼ関連タンパク質−２（ＴＲＰ−２）ポリペプチド；メソテリンポリペプチド；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）ポリペプチド；黒色腫関連抗原−１（ＭＡＧＥ Ａ１）ポリペプチド；チトクロームＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）ポリペプチド；胎盤特異的タンパク質１（ＰＬＡＣ１）ポリペプチド；ＢＯＲＩＳポリペプチド（ＣＣＣＴＣ結合因子またはＣＴＣＦとしてもまた知られる）；ＥＴＶ６−ＡＭＬポリペプチド；乳癌抗原ＮＹ−ＢＲ−１ポリペプチド（アンキリンリピートドメイン含有タンパク質３０Ａとも称される）；Ｇタンパク質シグナル伝達制御因子（ＲＧＳ５）ポリペプチド；Ｔ細胞によって認識される扁平細胞癌抗原（ＳＡＲＴ３）ポリペプチド；炭酸脱水酵素ＩＸポリペプチド；ペアードボックス−５（ＰＡＸ５）ポリペプチド；ＯＹ−ＴＥＳ１（精巣抗原；アクロシン結合タンパク質としてもまた知られる）ポリペプチド；精子タンパク質１７ポリペプチド；リンパ球細胞特異的プロテイン−チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）ポリペプチド；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）；Ａ−キナーゼアンカリングタンパク質−４（ＡＫＡＰ−４）；滑膜肉腫Ｘブレイクポイント２（ＳＳＸ２）ポリペプチド；Ｘ抗原ファミリーメンバー１（ＸＡＧＥ１）ポリペプチド；Ｂ７相同体３（Ｂ７Ｈ３；ＣＤ２７６としてもまた知られる）ポリペプチド；レグマインポリペプチド（ＬＧＭＮ１；アスパラギニルエンドペプチダーゼとしてもまた知られる）；ＩｇおよびＥＧＦ相同性ドメイン含有チロシンキナーゼ−２（Ｔｉｅ−２；アンギオポエチン−１受容体としてもまた知られる）ポリペプチド；Ｐ抗原ファミリーメンバー４（ＰＡＧＥ４）ポリペプチド；血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦ２）ポリペプチド；ＭＡＤ−ＣＴ−１ポリペプチド；線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）ポリペプチド；血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦβ）ポリペプチド；ＭＡＤ−ＣＴ−２ポリペプチド；Ｆｏｓ関連抗原−１（ＦＯＳＬ）ポリペプチド；およびウィルムス腫瘍−１（ＷＴ−１）ポリペプチドが含まれる。
癌関連抗原のアミノ酸配列が当該技術分野に知られる；例えば、ＭＵＣ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ５６７３４）；ＬＭＰ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ４７０２４）；ＨＰＶ Ｅ６（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＤ３３２５２）；ＨＰＶ Ｅ７（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＨＧ９９４８０）；ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１３３３８７０）；ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＩ６７１４７）；ＭＡＧＥ−Ａ３（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＨ１１７４４）；ｐ５３（ＧｅｎＢａｎｋ ＢＡＣ１６７９９）；ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ０５９０８）；ＰＳＭＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＨ２５６７２）；ＣＥＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＡ５１９６７）；メラン／ＭＡＲＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００５５０２）；Ｒａｓ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１１２３９１４）；ｇｐ１００（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ６０６３４）；ｂｃｒ−ａｂｌ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＢ６０３８８）；チロシナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＢ６０３１９）；サバイビン（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ５１６６０）；ＰＳＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＤ５４６１７）；ｈＴＥＲＴ（ＧｅｎＢａｎｋ ＢＡＣ１１０１０）；ＳＳＸ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１２６５６２０）；Ｅｐｈ２Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００４４２２）；ＰＡＰ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＨ１６３４４）；ＭＬ−ＩＡＰ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＨ１４４７５）；ＡＦＰ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１１２５）；ＥｐＣＡＭ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００２３４５）；ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合物）（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣＡ８１３８５）；ＰＡＸ３（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＩ０１３０１）；ＡＬＫ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００４２９５）；アンドロゲン受容体（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００００３５）；サイクリンＢ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＯ９９２７３）；ＭＹＣＮ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１２８０１５７）；ＲｈｏＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＨ５２８０８）；ＴＲＰ−２（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ６０６２７）；メソテリン（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＨ０９２７２）；ＰＳＣＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＨ６５１８３）；ＭＡＧＥ Ａ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００４９７９）；ＣＹＰ１Ｂ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＭ５０５１２）；ＰＬＡＣ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＧ２２５９６）；ＢＯＲＩＳ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１２５５９６９）；ＥＴＶ６（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１９７８）；ＮＹ−ＢＲ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿４４３７２３）；ＳＡＲＴ３（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿０５５５２１）；炭酸脱水酵素ＩＸ（ＧｅｎＢａｎｋ ＥＡＷ５８３５９）；ＰＡＸ５（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿０５７９５３）；ＯＹ−ＴＥＳ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿１１５８７８）；精子タンパク質１７（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＫ２０８７８）；ＬＣＫ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１０３６２３６）；ＨＭＷ−ＭＡＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１８８８）；ＡＫＡＰ−４（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００３８７７）；ＳＳＸ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ６０１１１）；ＸＡＧＥ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１０９１０７３；ＸＰ＿００１１２５８３４；ＸＰ＿００１１２５８５６；およびＸＰ＿００１１２５８７２）；Ｂ７Ｈ３（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１０１９９０７；ＸＰ＿９４７３６８；ＸＰ＿９５０９５８；ＸＰ＿９５０９６０；ＸＰ＿９５０９６２；ＸＰ＿９５０９６３；ＸＰ＿９５０９６５；およびＸＰ＿９５０９６７）；ＬＧＭＮ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１００８５３０）；ＴＩＥ−２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿０００４５０）；ＰＡＧＥ４（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１３０５８０６）；ＶＥＧＦＲ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００２２４４）；ＭＡＤ−ＣＴ−１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００５８９３ ＮＰ＿０５６２１５）；ＦＡＰ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００４４５１）；ＰＤＧＦβ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００２６００）；ＭＡＤ−ＣＴ−２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１１３８５７４）；ＦＯＳＬ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００５４２９）；およびＷＴ−１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿０００３６９）を参照されたい。これらのポリペプチドはまた、例えばＣｈｅｅｖｅｒら（２００９）Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １５：５３２３、および該文献に引用される参考文献；Ｗａｇｎｅｒら（２００３）Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｓｃｉ． １１６：１６５３；Ｍａｔｓｕｉら（１９９０）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５：２４９；ならびにＺｈａｎｇら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８３：１６８においても論じられる。
上述のように、いくつかの場合、本開示のＲＶＶは複製不能である。いくつかの場合、ＲＶＶは、ワクシニアウイルスを複製不能にする、ワクシニアウイルス遺伝子の修飾を含む。ワクシニアウイルスが複製不能であるように、複製に必要な遺伝子産物をコードする、１つまたはそれより多いワクシニアウイルス遺伝子を修飾してもよい。例えば、中間転写因子（例えばＡ８Ｒおよび／またはＡ２３Ｒ）（例えば、Ｗｙａｔｔら（２０１７）ｍＢｉｏ ８：ｅ００７９０；およびＷａｒｒｅｎら（２０１２）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８６：９５１４）および／または後期転写因子（例えば、Ｇ８Ｒ、Ａ１Ｌ、およびＡ２Ｌの１つまたはそれより多く）（例えば、Ｙａｎｇら（２０１３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４７：２１３を参照されたい）のレベルおよび／または活性を減少させるように、ＲＶＶを修飾してもよい。中間転写因子および／または後期転写因子のレベルおよび／または活性の減少は、初期ウイルスプロモーターに機能可能であるように連結されたヌクレオチド配列（単数または複数）によってコードされるポリペプチド（単数または複数）を発現可能である修飾ワクシニアウイルスを生じうる；が、該ウイルスは複製不能であろう。修飾には、例えば遺伝子のすべてまたは一部の欠失；遺伝子内への挿入等が含まれる。例えば、Ａ８Ｒ遺伝子のすべてまたは一部を欠失させてもよい。別の例として、Ａ２３Ｒ遺伝子のすべてまたは一部を欠失させてもよい。別の例として、Ｇ８Ｒ遺伝子のすべてまたは一部を欠失させてもよい。別の例として、Ａ１Ｌ遺伝子のすべてまたは一部を欠失させてもよい。別の例として、Ａ２Ｌ遺伝子のすべてまたは一部を欠失させてもよい。
Ｄ−５． ２’−デオキシグアノシンの類似体の投与
別の側面において、本開示は、２’−デオキシグアノシンの合成類似体と組み合わせた、本明細書記載のＲＶＶの投与を提供する。
腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスを投与されている被験体において、不都合な副作用を引き起こしうる。副作用の例には、皮膚病変、例えば水疱性病変または「水疱性発疹」が含まれる。いくつかの態様において、本開示は、個体において癌を治療する方法であって、個体に：ｂ）本開示の複製可能ＲＶＶの有効量；およびｂ）２’−デオキシグアノシンの合成類似体の有効量を投与する工程を含む、前記方法を提供する。いくつかの他の態様において、本開示は、本開示の腫瘍溶解性ＲＶＶの副作用を治療するか、減少させるか、または管理する方法であって、腫瘍溶解性ＲＶＶの投与を受ける被験体に、２’−デオキシグアノシンの合成類似体の有効量を投与する工程を含む、前記方法を提供する。
２’−デオキシグアノシンの合成類似体の「有効量」は、本開示の複製可能ＲＶＶの投与の副作用を減少させるために有効である量である。例えば、副作用が皮膚病変である場合、２’−デオキシグアノシンの合成類似体の有効量は、個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、個体におけるワクシニアウイルス誘導性皮膚病変の数および／または重症度および／または期間を減少させるために有効である量である。例えば、２’−デオキシグアノシンの合成類似体の有効量は、個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、個体におけるワクシニアウイルス誘導性皮膚病変の数および／または重症度および／または期間を、２’−デオキシグアノシンの合成類似体の投与前、または２’−デオキシグアノシンの合成類似体の投与の非存在下での、個体におけるワクシニアウイルス誘導性皮膚病変の数および／または重症度および／または期間と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、または７５％より多く減少させるために有効である量であってもよい。いくつかの場合、２’−デオキシグアノシンの合成類似体の有効量は、個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、ワクシニアウイルス誘導性皮膚病変からのウイルスの脱落を減少させるために有効である量である。例えば、いくつかの場合、２’−デオキシグアノシンの合成類似体の有効量は、個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、個体におけるワクシニアウイルス誘導性皮膚病変からのウイルス脱落を、２’−デオキシグアノシンの合成類似体の投与前、または２’−デオキシグアノシンの合成類似体の投与の非存在下での、個体におけるワクシニアウイルス誘導性皮膚病変からのウイルス脱落のレベルまたは度合いと比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、または７５％より多く減少させるために有効である量である。副作用が皮膚病変である場合、いくつかの場合、２’−デオキシグアノシンの合成類似体を、任意の好適な投与経路（例えば局所、経口、静脈内等）によって、投与してもよい。例えば、不都合な副作用が皮膚病変である場合、いくつかの場合、２’−デオキシグアノシンの合成類似体を局所投与してもよい。皮膚病変を減少させるため、２’−デオキシグアノシンの合成類似体を、典型的には、例えば皮膚の病変領域への２’−デオキシグアノシン類似体の適用によって、局所投与する。
２’−デオキシグアノシンの合成類似体の投与は、本開示の複製可能ＲＶＶの複製を減少させる。本開示の複製可能ＲＶＶの複製のこうした減少は、例えば個体における複製可能ＲＶＶのレベルを調節するため、複製可能ＲＶＶの効果を調節するため等に望ましい可能性もある。したがって、いくつかの態様において、本開示は、ＲＶＶを投与されている個体において、本開示によって提供する複製可能ＲＶＶの複製を調節する方法であって、有効量の抗ウイルス薬剤、例えば２’−デオキシグアノシン類似体を個体に投与する工程を含む、前記方法を提供する。いくつかの特定の態様において、投与する２’−デオキシグアノシン類似体は、２’−デオキシグアノシン類似体の投与前の、または２’−デオキシグアノシン類似体の投与の非存在下での、個体における複製可能ＲＶＶの複製レベルに比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、または７５％より多く、個体における本開示の複製可能ＲＶＶの複製を減少させるために有効である。
いくつかの他の態様において、本開示は、個体において癌を治療する方法であって：ａ）本開示の複製可能ＲＶＶの有効量を投与し；そしてｂ）２’−デオキシグアノシンの合成類似体の有効量を投与する工程を含む、前記方法を提供する。いくつかの場合、２’−デオキシグアノシンの合成類似体の有効量は、個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、個体における本開示の複製可能ＲＶＶの複製を、２’−デオキシグアノシンの合成類似体の投与前、または２’−デオキシグアノシンの合成類似体の投与の非存在下での、個体における複製可能ＲＶＶの複製レベルと比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、または７５％より多く減少させるために有効である量である。
２’−デオキシグアノシンの合成類似体を、本開示の複製可能ＲＶＶの投与後に投与してもよい。例えば、２’−デオキシグアノシンの合成類似体を、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の１日〜７日後、７日〜２週間後、２週間〜１ヶ月後、１ヶ月〜３ヶ月後、または３ヶ月より後に投与してもよい。
いくつかの場合、本開示の複製可能ＲＶＶが投与されている個体への２’−デオキシグアノシンの合成類似体の投与は、個体において、迅速で全身性の腫瘍溶解（癌細胞の溶解）を誘導する。例えば、ひとたび腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが腫瘍増殖の遅延を開始したら、そして／またはひとたびウイルス複製がピークとなるかまたはこうしたピークの直後となったら、そして／またはひとたびワクシニアウイルスタンパク質に対する循環抗体がピークとなるかまたはこうしたピークの直後となったら、２’−デオキシグアノシンの合成類似体を個体に投与してもよい。本開示の複製可能ＲＶＶの投与後に腫瘍増殖の遅延が起こるかどうかは、腫瘍増殖および／または癌細胞数を測定する任意の多様な確立された方法を用いて決定されてもよい。個体における本開示の複製可能ＲＶＶの複製がピークにあるかまたはそのピークの直後であるかどうかは、本明細書に記載するように、個体におけるＴＫｖポリペプチドのレベルを検出し、そして／または測定することによって決定されてもよく、ここで適切な方法の限定されない例はＰＥＴである。本開示の複製可能ＲＶＶに対する循環抗体がピークにあるかまたはそのピークの直後であるかどうかは、抗体レベルを測定するための標準法を用いて測定されてもよく、こうした方法には、例えば酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等が含まれる。
例えば、本開示の使用法は：ａ）本開示の複製可能ＲＶＶの有効量を、その必要がある個体に投与し；ｂ）ｉ）個体における腫瘍サイズおよび／または癌細胞数；ならびに／あるいはｉｉ）個体におけるＴＫｖポリペプチドのレベル；ならびに／あるいはｉｉｉ）個体における複製可能ＲＶＶに対する抗体のレベルを測定し；そしてｃ）測定工程が：ｉ）複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与前の腫瘍増殖および／または癌細胞数に比較して、腫瘍増殖が遅延しており、そして／または癌細胞数が減少しており；そして／またはｉｉ）個体におけるＴＫｖポリペプチドのレベルがピークにあるかまたはそのピーク直後であり；そして／またはｉｉｉ）個体における複製可能ＲＶＶに対する循環抗体のレベルがピークにあるかまたはそのピーク直後であることを示す場合、２’−デオキシグアノシンの合成類似体を投与する工程を含んでもよい。例えば、本開示の方法または使用は：ａ）本開示の複製可能ＲＶＶの有効量を、その必要がある個体に投与し；そしてｂ）２’−デオキシグアノシンの合成類似体の有効量を個体に投与する工程を含んでもよく、ここで、投与工程（ｂ）を工程（ａ）の５日〜２０日後（例えば５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後、１４日後、１５日後、１６日後、１７日後、１８日後、１９日後、または２０日後）に行う。
２’−デオキシグアノシンの適切な合成類似体には、例えば、アシクロビル（アシクログアノシン）、５’−ヨードデオキシウリジン（「イドクスウリジン」とも称される）、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、２’−フルオロ−２’−デオキシ−５−ヨード−１−ベータ−ｄ−アラビノフラノシルウラシル（ＦＩＡＵ）等が含まれる。２’−デオキシグアノシンの適切な合成類似体の構造を以下に示す。
Figure 2021118683
いくつかの場合、２’−デオキシグアノシンの合成類似体を、１日あたり４０００ｍｇ未満の用量で、経口投与する。いくつかの場合、２’−デオキシグアノシンの合成類似体の適切な経口用量は、１日あたり約５０ｍｇ〜１日あたり約２５００ｍｇ、例えば１日あたり約５０ｍｇ〜１日あたり約１００ｍｇ、１日あたり約１００ｍｇ〜１日あたり約２００ｍｇ、１日あたり約２００ｍｇ〜１日あたり約３００ｍｇ、１日あたり約３００ｍｇ〜１日あたり約４００ｍｇ、１日あたり約４００ｍｇ〜１日あたり約５００ｍｇ、１日あたり約５００ｍｇ〜１日あたり約６００ｍｇ、１日あたり約６００ｍｇ〜１日あたり約７００ｍｇ、１日あたり約７００ｍｇ〜１日あたり約８００ｍｇ、１日あたり約８００ｍｇ〜１日あたり約９００ｍｇ、１日あたり約９００ｍｇ〜１日あたり約１０００ｍｇ、１日あたり約１０００ｍｇ〜１日あたり約１２５０ｍｇ、１日あたり約１２５０ｍｇ〜１日あたり約１５００ｍｇ、１日あたり約１５００ｍｇ〜１日あたり約１７５０ｍｇ、１日あたり約１７５０ｍｇ〜１日あたり約２０００ｍｇ、１日あたり約２０００ｍｇ〜１日あたり約２２５０ｍｇ、または１日あたり約２２５０ｍｇ〜１日あたり約２５００ｍｇの範囲である。いくつかの場合、２’−デオキシグアノシンの合成類似体の適切な経口用量は、１日あたり約２５００ｍｇ〜１日あたり約３０００ｍｇ、１日あたり約３０００ｍｇ〜１日あたり約３５００ｍｇ、または１日あたり約３５００ｍｇ〜１日あたり約４０００ｍｇの範囲である。
１つの限定されない例として、ガンシクロビルを、１０００ｍｇの用量を１日３回、３０００ｍｇの総１日用量で投与する。ガンシクロビルを３０００ｍｇ未満の総１日用量（例えば１日あたり約５０ｍｇ〜１日あたり約２５００ｍｇ、例えば１日あたり約５０ｍｇ〜１日あたり約１００ｍｇ、１日あたり約１００ｍｇ〜１日あたり約２００ｍｇ、１日あたり約２００ｍｇ〜１日あたり約３００ｍｇ、１日あたり約３００ｍｇ〜１日あたり約４００ｍｇ、１日あたり約４００ｍｇ〜１日あたり約５００ｍｇ、１日あたり約５００ｍｇ〜１日あたり約６００ｍｇ、１日あたり約６００ｍｇ〜１日あたり約７００ｍｇ、１日あたり約７００ｍｇ〜１日あたり約８００ｍｇ、１日あたり約８００ｍｇ〜１日あたり約９００ｍｇ、１日あたり約９００ｍｇ〜１日あたり約１０００ｍｇ、１日あたり約１０００ｍｇ〜１日あたり約１２５０ｍｇ、１日あたり約１２５０ｍｇ〜１日あたり約１５００ｍｇ、１日あたり約１５００ｍｇ〜１日あたり約１７５０ｍｇ、１日あたり約１７５０ｍｇ〜１日あたり約２０００ｍｇ、１日あたり約２０００ｍｇ〜１日あたり約２２５０ｍｇ、または１日あたり約２２５０ｍｇ〜１日あたり約２５００ｍｇ）で投与してもよい。いくつかの場合、経口投与を通じてガンシクロビルを投与する。
別の限定されない例として、アシクロビルを１０００ｍｇ〜４０００ｍｇの総１日用量で投与してもよい。アシクロビルを４０００ｍｇ未満（例えば１日あたり約５０ｍｇ〜１日あたり約２５００ｍｇ、例えば１日あたり約５０ｍｇ〜１日あたり約１００ｍｇ、１日あたり約１００ｍｇ〜１日あたり約２００ｍｇ、１日あたり約２００ｍｇ〜１日あたり約３００ｍｇ、１日あたり約３００ｍｇ〜１日あたり約４００ｍｇ、１日あたり約４００ｍｇ〜１日あたり約５００ｍｇ、１日あたり約５００ｍｇ〜１日あたり約６００ｍｇ、１日あたり約６００ｍｇ〜１日あたり約７００ｍｇ、１日あたり約７００ｍｇ〜１日あたり約８００ｍｇ、１日あたり約８００ｍｇ〜１日あたり約９００ｍｇ、１日あたり約９００ｍｇ〜１日あたり約１０００ｍｇ、１日あたり約１０００ｍｇ〜１日あたり約１２５０ｍｇ、１日あたり約１２５０ｍｇ〜１日あたり約１５００ｍｇ、１日あたり約１５００ｍｇ〜１日あたり約１７５０ｍｇ、１日あたり約１７５０ｍｇ〜１日あたり約２０００ｍｇ、１日あたり約２０００ｍｇ〜１日あたり約２２５０ｍｇ、または１日あたり約２２５０ｍｇ〜１日あたり約２５００ｍｇ）の総１日用量で投与してもよい。いくつかの場合、経口投与を通じてアシクロビルを投与する。
別の例として、バルガンシクロビルを約９００ｍｇ〜約１８００ｍｇの総１日用量で投与する。バルガンシクロビルを１８００ｍｇ未満（例えば、約５００ｍｇ／日〜約６００ｍｇ／日、約６００ｍｇ／日〜約７００ｍｇ／日、約７００ｍｇ／日〜約８００ｍｇ／日、約８００ｍｇ／日〜約９００ｍｇ／日、約９００ｍｇ／日〜約１０００ｍｇ／日、約１０００ｍｇ／日〜約１２００ｍｇ／日、約１２００ｍｇ／日〜約１４００ｍｇ／日、または約１４００ｍｇ／日〜約１６００ｍｇ／日）の総１日用量で投与してもよい。いくつかの場合、経口投与を通じてバルガンシクロビルを投与する。
別の例として、ファムシクロビルを約２０００ｍｇ／日〜約４０００ｍｇ／日の総１日用量で投与する。ファムシクロビルを４０００ｍｇ未満（例えば１日あたり約５０ｍｇ〜１日あたり約２５００ｍｇ、例えば１日あたり約５０ｍｇ〜１日あたり約１００ｍｇ、１日あたり約１００ｍｇ〜１日あたり約２００ｍｇ、１日あたり約２００ｍｇ〜１日あたり約３００ｍｇ、１日あたり約３００ｍｇ〜１日あたり約４００ｍｇ、１日あたり約４００ｍｇ〜１日あたり約５００ｍｇ、１日あたり約５００ｍｇ〜１日あたり約６００ｍｇ、１日あたり約６００ｍｇ〜１日あたり約７００ｍｇ、１日あたり約７００ｍｇ〜１日あたり約８００ｍｇ、１日あたり約８００ｍｇ〜１日あたり約９００ｍｇ、１日あたり約９００ｍｇ〜１日あたり約１０００ｍｇ、１日あたり約１０００ｍｇ〜１日あたり約１２５０ｍｇ、１日あたり約１２５０ｍｇ〜１日あたり約１５００ｍｇ、１日あたり約１５００ｍｇ〜１日あたり約１７５０ｍｇ、１日あたり約１７５０ｍｇ〜１日あたり約２０００ｍｇ、１日あたり約２０００ｍｇ〜１日あたり約２２５０ｍｇ、または１日あたり約２２５０ｍｇ〜１日あたり約２５００ｍｇ）の総１日用量で投与してもよい。いくつかの場合、経口投与を通じてファムシクロビルを投与する。
別の例として、バラシクロビルを約２０００ｍｇ〜約４０００ｍｇの総１日用量で投与する。バラシクロビルを４０００ｍｇ未満（例えば１日あたり約５０ｍｇ〜１日あたり約２５００ｍｇ、例えば１日あたり約５０ｍｇ〜１日あたり約１００ｍｇ、１日あたり約１００ｍｇ〜１日あたり約２００ｍｇ、１日あたり約２００ｍｇ〜１日あたり約３００ｍｇ、１日あたり約３００ｍｇ〜１日あたり約４００ｍｇ、１日あたり約４００ｍｇ〜１日あたり約５００ｍｇ、１日あたり約５００ｍｇ〜１日あたり約６００ｍｇ、１日あたり約６００ｍｇ〜１日あたり約７００ｍｇ、１日あたり約７００ｍｇ〜１日あたり約８００ｍｇ、１日あたり約８００ｍｇ〜１日あたり約９００ｍｇ、１日あたり約９００ｍｇ〜１日あたり約１０００ｍｇ、１日あたり約１０００ｍｇ〜１日あたり約１２５０ｍｇ、１日あたり約１２５０ｍｇ〜１日あたり約１５００ｍｇ、１日あたり約１５００ｍｇ〜１日あたり約１７５０ｍｇ、１日あたり約１７５０ｍｇ〜１日あたり約２０００ｍｇ、１日あたり約２０００ｍｇ〜１日あたり約２２５０ｍｇ、または１日あたり約２２５０ｍｇ〜１日あたり約２５００ｍｇ）の総１日用量で投与してもよい。いくつかの場合、経口投与を通じてバラシクロビルを投与する。
別の例として、ガンシクロビルを約１０ｍｇ／ｋｇの総１日用量で投与する。ガンシクロビルを１０ｍｇ／ｋｇ未満（例えば約１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ〜約７ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ／ｋｇ、または約８ｍｇ／ｋｇ〜約９ｍｇ／ｋｇ）の総１日用量で投与してもよい。いくつかの場合、注射（例えば筋肉内注射、静脈内注射、または皮下注射）を通じてガンシクロビルを投与する。
別の例として、アシクロビルを、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、または約３０ｍｇ／ｋｇ〜約４５ｍｇ／ｋｇの総１日用量で投与する。アシクロビルを４５ｍｇ／ｋｇ未満（例えば約５ｍｇ／ｋｇ〜約７．５ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１２．５ｍｇ／ｋｇ、約１２．５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、または約３０ｍｇ／ｋｇ〜約３５ｍｇ／ｋｇ）の総１日用量で投与してもよい。いくつかの場合、注射（例えば筋肉内注射、静脈内注射、または皮下注射）を通じてアシクロビルを投与する。
別の例として、バルガンシクロビルを約１０ｍｇ／ｋｇの総１日用量で投与する。バルガンシクロビルを１０ｍｇ／ｋｇ未満（例えば約１ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ〜約７ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ／ｋｇ、または約８ｍｇ／ｋｇ〜約９ｍｇ／ｋｇ）の総１日用量で投与してもよい。いくつかの場合、注射（例えば筋肉内注射、静脈内注射、または皮下注射）を通じてバルガンシクロビルを投与する。
いくつかの場合、２’−デオキシグアノシンの合成類似体を局所投与する。局所投与に適した配合物には、例えば皮膚配合物（例えば液体、クリーム、ジェル等）および眼配合物（例えばクリーム、液体、ジェル等）が含まれる。ガンシクロビルの局所用量は、例えば、眼適用のため、例えば０．１５％配合物１滴を１日５回であってもよい。アシクロビルの局所用量は、例えば、皮膚病変を覆うために十分な量の５％配合物を１日６回の適用であってもよい。イドクスウリジンの局所用量は、例えば０．５％軟膏または０．１％クリームを４時間ごとに１滴の適用であってもよい。
いくつかの場合、２’−デオキシグアノシンの合成類似体を、１０ｍｇ／ｋｇ体重未満の用量で静脈内投与する。いくつかの場合、２’−デオキシグアノシンの合成類似体の適切な静脈内用量は、約１ｍｇ／ｋｇ体重〜約２．５ｍｇ／ｋｇ体重、約２．５ｍｇ／ｋｇ体重〜約５ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重〜約７．５ｍｇ／ｋｇ体重、または約７．５ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
Ｅ． 開示の限定されない側面の例
上述の本主題の態様を含む側面は、単独で、あるいは１つまたはそれより多い他の側面または態様と組み合わせて有益でありうる。前述の説明を限定することなく、本開示の特定の限定されない側面を、以下に提供する。本開示を読めば当業者には明らかであるように、個々の番号付けされた側面は、各々用いられてもよいし、あるいは先行するまたは続く個々の番号付けされた側面と組み合わされてもよい。これは、側面のすべてのこうした組み合わせに対する支持を提供するよう意図され、そして以下に明確に提供する側面の組み合わせに限定されない：
側面１． ゲノム中に：（１）変異体インターロイキン−２（ＩＬ−２ｖ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ＩＬ−２ｖポリペプチドが野生型ＩＬ−２に比較して減少した望ましくない特性を有する、前記ヌクレオチド；および（２）異種チミジンキナーゼ（ＴＫ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ＲＶＶ。
側面２． ワクシニアウイルスがワクシニアチミジンキナーゼ欠損にする修飾をさらに含む、側面１のＲＶＶ。
側面３． 修飾が、Ｊ２Ｒ発現および／または機能の欠如を生じる、側面２のワクシニアウイルス。
側面４． コペンハーゲン株ワクシニアウイルスである、側面１〜３のいずれか１つのワクシニアウイルス。
側面５． ＷＲ株ワクシニアウイルスである、側面１〜３のいずれか１つのワクシニアウイルス。
側面６． Ｋ１５１Ｅ置換を含むＡ３４Ｒ遺伝子を含む、側面１〜５のいずれか１つのワクシニアウイルス。
側面７． ＩＬ−２ｖポリペプチドが、配列番号１に示すＩＬ−２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、Ｆ４２、Ｙ４５、およびＬ７２の１つまたはそれより多くの置換を含む、側面１〜６のいずれか１つのワクシニアウイルス。
側面８． ＩＬ−２ｖポリペプチドが、配列番号１に示すＩＬ−２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、Ｆ４２Ｌ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、またはＦ４２Ｋの置換を含む、側面１〜７のいずれか１つのワクシニアウイルス。
側面９． ＩＬ−２ｖポリペプチドが、配列番号１に示すＩＬ−２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、またはＹ４５Ｋの置換を含む、側面１〜８のいずれか１つのワクシニアウイルス。
側面１０． ＩＬ−２ｖポリペプチドが、配列番号１に示すＩＬ−２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｒ、またはＬ７２Ｋの置換を含む、側面１〜９のいずれか１つのワクシニアウイルス。
側面１１． ＩＬ−２ｖポリペプチドが、配列番号１に示すＩＬ−２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＬ７２Ｇの置換を含む、側面１〜１０のいずれか１つのワクシニアウイルス。
側面１２． ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、制御可能プロモーターに機能可能であるように連結されている、側面１〜１１のいずれか１つのワクシニアウイルス。
側面１３． 制御可能プロモーターが、テトラサイクリンあるいはテトラサイクリン類似体または誘導体によって制御される、側面１２のワクシニアウイルス。
側面１４． ａ）側面１〜１３のいずれか１つのワクシニアウイルス；およびｂ）薬学的に許容されうるキャリアーを含む、組成物。
側面１５． 腫瘍を有する個体において腫瘍溶解を誘導する方法であって、側面１〜１３のいずれか１つのワクシニアウイルスまたは側面１４の組成物の有効量を、個体に投与する工程を含む、前記方法。
側面１６． 前記投与が、ウイルスまたは組成物の単回用量を投与する工程を含む、側面１５の方法。
側面１７． 単回用量が、少なくとも１０６プラーク形成単位（ｐｆｕ）のワクシニアウイルスを含む、側面１６の方法。
側面１８． 単回用量が、１０９〜１０１２ｐｆｕのワクシニアウイルスを含む、側面１６の方法。
側面１９． 前記投与が、ワクシニアウイルスまたは組成物の多数回用量を投与する工程を含む、側面１５の方法。
側面２０． ワクシニアウイルスまたは組成物を１日おきに投与する、側面１９の方法。
側面２１． ワクシニアウイルスまたは組成物を週１回投与する、側面１５〜２０のいずれか１つの方法。
側面２２． ワクシニアウイルスまたは組成物を１週おきに投与する、側面１５〜２０のいずれか１つの方法。
側面２３． 腫瘍が、脳癌腫瘍、頭頸部癌腫瘍、食道癌腫瘍、皮膚癌腫瘍、肺癌腫瘍、胸腺癌腫瘍、胃癌腫瘍、結腸癌腫瘍、肝臓癌腫瘍、卵巣癌腫瘍、子宮癌腫瘍、膀胱癌腫瘍、精巣癌腫瘍、直腸癌腫瘍、乳癌腫瘍、または膵臓癌腫瘍である、側面１５〜２１のいずれか１つの方法。
側面２４． 腫瘍が結腸直腸腺癌である、側面１５〜２２のいずれか１つの方法。
側面２５． 腫瘍が非小細胞肺癌である、側面１５〜２２のいずれか１つの方法。
側面２６． 腫瘍がトリプルネガティブ乳癌である、側面１５〜２２のいずれか１つの方法。
側面２７． 腫瘍が固形腫瘍である、側面１５〜２２のいずれか１つの方法。
側面２８． 腫瘍が液性腫瘍である、側面１５〜２２のいずれか１つの方法。
側面２９． 腫瘍が再発性である、側面１５〜２８のいずれか１つの方法。
側面３０． 腫瘍が原発性腫瘍である、側面１５〜２８のいずれか１つの方法。
側面３１． 腫瘍が転移性である、側面１５〜２８のいずれか１つの方法。
側面３２． 個体に第二の癌療法を投与する工程をさらに含む、側面１５〜３１のいずれか１つの方法。
側面３３． 第二の癌療法が、化学療法、生物学的療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、抗血管療法、凍結療法、毒素療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、細胞療法、および手術より選択される、側面３２の方法。
側面３４． 第二の癌療法が抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む、側面３２の方法。
側面３５． 個体が免疫無防備状態である、側面１５〜３４のいずれか１つの方法。
側面３６． ワクシニアウイルスまたは組成物の前記投与が腫瘍内投与である、側面１５〜３５のいずれか１つの方法。
側面３７． ワクシニアウイルスまたは組成物の前記投与が腫瘍周辺投与である、側面１５〜３５のいずれか１つの方法。
側面３８． ワクシニアウイルスまたは組成物の前記投与が静脈内投与である、側面１５〜３５のいずれか１つの方法。
側面３９． ワクシニアウイルスまたは組成物の前記投与が、動脈内投与である、側面１５〜３５のいずれか１つの方法。
側面４０． ワクシニアウイルスまたは組成物の前記投与が、膀胱内投与である、側面１５〜３５のいずれか１つの方法。
側面４１． ワクシニアウイルスまたは組成物の前記投与が、クモ膜下腔内投与である、側面１５〜３５のいずれか１つの方法。
側面４２． ゲノム中に、変異体インターロイキン−２（ＩＬ−２ｖ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＲＶＶであって、ＩＬ−２ｖポリペプチドが、野生型ＩＬ−２に比較して、ＣＤ２５への結合の減少を提供する１つまたはそれより多いアミノ酸置換を含む、前記ＲＶＶ。
側面４３． ゲノム中に、配列番号９を含む変異体インターロイキン−２（ＩＬ−２ｖ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＲＶＶであって、ワクシニアウイルスがコペンハーゲン株ワクシニアウイルスであり、ワクシニアチミジンキナーゼ欠損であり、そしてＫ１５１Ｅ置換を含むＡ３４Ｒ遺伝子を含む、前記ＲＶＶ。
側面４４． シグナルペプチドをさらに含む、側面４３のワクシニアウイルス。
側面４５． シグナルペプチドが配列番号２２を含む、側面４４のワクシニアウイルス。
側面４６． ゲノム中に、配列番号１０を含む変異体インターロイキン−２（ＩＬ−２ｖ）ヌクレオチド配列を含むＲＶＶであって、ワクシニアウイルスがコペンハーゲン株ワクシニアウイルスであり、ワクシニアチミジンキナーゼ欠損であり、そしてＫ１５１Ｅ置換を含むＡ３４Ｒ遺伝子を含む、前記ＲＶＶ。
側面４７． ゲノム中に、配列番号１２を含む変異体インターロイキン−２（ＩＬ−２ｖ）ヌクレオチド配列を含むＲＶＶであって、ワクシニアウイルスがコペンハーゲン株ワクシニアウイルスであり、ワクシニアチミジンキナーゼ欠損であり、そしてＫ１５１Ｅ置換を含むＡ３４Ｒ遺伝子を含む、前記ＲＶＶ。
側面４８． （ｉ）側面４２〜４７のいずれか１つのワクシニアウイルスおよび（ｉｉ）薬学的に許容されうるキャリアーを含む、組成物。
側面４９． ゲノム中に、変異体インターロイキン−２（ＩＬ−２ｖ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＲＶＶであって、ＩＬ−２ｖポリペプチドが、野生型ＩＬ−２に比較した際、減少した望ましくない生物学的活性を提供する、前記ＲＶＶ。
側面５０． 腫瘍を有する個体において腫瘍溶解を誘導する方法において使用するための、側面１〜１３のいずれか１つのワクシニアウイルス、または側面１４の組成物。
側面５１． 腫瘍を有する個体において、腫瘍溶解を誘導するための薬剤製造における、側面１〜１３のいずれか１つのワクシニアウイルス、または側面１４の組成物の使用。
Ｆ． 配列インデックス
Figure 2021118683
Figure 2021118683
Ｇ． 実施例
以下の実施例は、本発明の特定の側面を例示する目的のために提供され、そして該実施例は、本発明者らが本発明と見なす範囲を限定することを意図されず、あるいは以下の実験が行うすべてのまたは唯一の実験であることを示すとは意図されない。用いる数値（例えば量、温度等）に関する正確さを確実にするように努力は行っているが、ある程度の実験誤差および逸脱は考慮されるべきである。別に示さない限り、部分は重量部分であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセルシウス度であり、そして圧は大気圧かまたは大気圧近くである。標準的な略語を用いることもあり、例えばｐｌ、ピコリットル（単数または複数）；ｓまたはｓｅｃ、秒（単数または複数）；ｍｉｎ、分（単数または複数）；ｈまたはｈｒ、時間（単数または複数）；ａａ、アミノ酸（単数または複数）；ｋｂ、キロ塩基（単数または複数）；ｂｐ、塩基対（単数または複数）；ｎｔ、ヌクレオチド（単数または複数）；ｉ．ｍ．、筋内（に）；ｉ．ｐ．、腹腔内（に）；ｓ．ｃ．、皮下（に）；ｉ．ｖ．、静脈内（に）等である。
実施例１： 組換えワクシニアウイルス構築物の生成
以下に提供する実施例と関連して生成される特定のＲＶＶ構築物の選択される特徴を、以下の表１に要約する。表１中の各ウイルスは、ＶＶ１０およびＶＶ１８を除いて、Ｊ２Ｒ遺伝子の欠失を有し、ＶＶ１０およびＶＶ１８はＪ２Ｒ遺伝子の挿入不活性化を有する。ＶＶ２７、ＶＶ７９、ＶＶ９１〜ＶＶ９６およびＩＧＶ−１２１は、マウス細胞における発現のためにコドン最適化されたマウスＩＬ−２変異体（Ｆ７６Ａ、Ｙ７９Ａ、Ｌ１０６Ｇ置換を含む）をコードする遺伝子を有する。ＶＶ７５およびＶＶ１０１〜ＶＶ１０３は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されたヒトＩＬ−２変異体（Ｆ６２Ａ、Ｙ６５Ａ、およびＬ９２Ｇ置換を含む）をコードする遺伝子を有する。
表１． 組換えワクシニアウイルス（ＲＶＶ）構築物の特徴
Figure 2021118683
ＶＶ２７構築
該ウイルスはワクシニアのコペンハーゲン株に基づき、そして合成初期後期プロモーターおよびオペレーターの調節下でマウスＩＬ−２変異体をコードする遺伝子を所持する。該ウイルスは、Ａ３４Ｒ遺伝子中のＫ１５１Ｅ置換の取り込みによる、増進された細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）産生のために操作された。ＶＶ２７は、ヘルパーウイルスに仲介され、制限酵素にガイドされる相同組換え修復およびレスキュー技術を用いて構築された。まず、マウスＩＬ−２ｖ（Ｆ７６Ａ、Ｙ７９Ａ、Ｌ１０６Ｇ）をコードする遺伝子を、マウス細胞における発現のためにコドン最適化し、そしてＧｅｎｅＷｉｚ（ニュージャージー州サウスプレインフィールド）によって合成した。ＤＮＡをＢｇｌＩＩ／ＡｓｉＳＩで消化し、そしてやはりＢｇｌＩＩ／ＡｓｉＳＩで消化したコペンハーゲンＪ２Ｒ相同組換えプラスミド内に挿入した。マウスＩＬ−２ｖ遺伝子ならびに隣接する左側および右側ワクシニア相同領域をＰＣＲによって増幅して、相同組換えドナー断片を生成した。ＢＳＣ−４０細胞をヘルパーウイルスであるショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）に１時間感染させ、そして続いて、ドナーアンプリコン、およびＪ２Ｒ領域内であらかじめ制限消化した精製ワクシニアゲノムＤＮＡの混合物をトランスフェクションした。親ゲノムＤＮＡは、天然Ｊ２Ｒ遺伝子の代わりにホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼおよびＧＦＰを、そしてＥＥＶ産生増進のため、Ａ３４Ｒ遺伝子内にＫ１５１Ｅ突然変異（置換）を所持するコペンハーゲン株ワクシニアウイルスに由来した。十分な細胞傷害効果が観察されるまで、トランスフェクション細胞をインキュベーションし、そして３周期の凍結／融解および超音波処理によって、総細胞溶解物を採取した。溶解物を連続希釈し、ＢＳＣ−４０単層上にプレーティングし、そして寒天重層によって覆った。全部で３周期のプラーク精製に渡って、蛍光顕微鏡下でＧＦＰ陰性プラークを単離した。Ｔ２２５フラスコ中、ＢＳＣ−４０細胞における中間増幅のため、１つのプラーク（ＫＲ１４４）を選択した後、２０層セルファクトリー中、ＨｅＬａ細胞において大規模増幅した。スクロース勾配超遠心によってウイルスを精製し、そして全ゲノム次世代配列決定を含む品質管理アッセイにおいて、完全に特徴づけた。
ＶＶ３８構築
該ウイルスはワクシニアのコペンハーゲン株に基づき、そして合成初期後期プロモーターおよびオペレーターの調節下でマウスＩＬ−２変異体をコードする遺伝子を所持する。該ウイルスは、野生型Ａ３４Ｒ遺伝子を所持し、そして増進されたＥＥＶ産生のために操作されていないことを除いて、ＶＶ２７と同一である。ＶＶ３８は、ヘルパーウイルスに仲介され、制限酵素にガイドされる相同組換え修復およびレスキュー技術を用いて構築された。ＢＳＣ−４０細胞をＳＦＶヘルパーウイルスに１〜２時間感染させ、そして続いて、ドナーアンプリコン、およびＪ２Ｒ領域中であらかじめＡｓｉＳＩで消化した精製ワクシニアゲノムＤＮＡの混合物をトランスフェクションした。親ゲノムＤＮＡは、天然Ｊ２Ｒ遺伝子の代わりにホタル・ルシフェラーゼおよびＧＦＰを所持するコペンハーゲン株ワクシニアウイルスに由来した。十分な細胞傷害効果が観察されるまで、トランスフェクション細胞をインキュベーションし、そして３周期の凍結／融解および超音波処理によって、総細胞溶解物を採取した。溶解物を連続希釈し、ＢＳＣ−４０単層上にプレーティングし、そして寒天重層によって覆った。全部で３周期のプラーク精製に渡って、蛍光顕微鏡下でＧＦＰ陰性プラークを単離した。Ｔ２２５フラスコ中、ＢＳＣ−４０細胞における中間増幅のため、１つのプラーク（ＬＷ２２６）を選択した後、２０層セルファクトリー中、ＨｅＬａ細胞において大規模増幅した。スクロース勾配超遠心によってウイルスを精製し、そして全ゲノム次世代配列決定を含む品質管理アッセイにおいて、完全に特徴づけた。
ＶＶ３９構築
該ウイルスはワクシニアのウェスタンリザーブ（ＷＲ）株に基づき、そして合成初期後期プロモーターおよびオペレーターの調節下でマウスＩＬ−２変異体をコードする遺伝子を所持する。ＶＶ３９は、ヘルパーウイルスに仲介され、制限酵素にガイドされる相同組換え修復およびレスキュー技術を用いて構築された。ＢＳＣ−４０細胞をＳＦＶヘルパーウイルスに１〜２時間感染させ、そして続いて、ドナーアンプリコン、およびＪ２Ｒ領域中であらかじめＡｓｉＳＩで消化した精製ワクシニアゲノムＤＮＡの混合物をトランスフェクションした。親ゲノムＤＮＡは、天然Ｊ２Ｒ遺伝子の代わりにルシフェラーゼ−２Ａ−ＧＦＰレポーター遺伝子カセットを、そして増進されたＥＥＶ産生のために操作されていない野生型Ａ３４Ｒを所持するＷＲ株ワクシニアウイルスに由来した。十分な細胞傷害効果が観察されるまで、トランスフェクション細胞をインキュベーションし、そして３周期の凍結／融解および超音波処理によって、総細胞溶解物を採取した。溶解物を連続希釈し、ＢＳＣ−４０単層上にプレーティングし、そして寒天重層によって覆った。全部で３周期のプラーク精製に渡って、蛍光顕微鏡下でＧＦＰ陰性プラークを単離した。Ｔ２２５フラスコ中、ＢＳＣ−４０細胞における中間増幅のため、１つのプラーク（ＬＷ２２８）を選択した後、２０層セルファクトリー中、ＨｅＬａ細胞において大規模増幅した。スクロース勾配超遠心によってウイルス（ロット番号１８０３３０）を精製し、そして全ゲノム次世代配列決定を含む品質管理アッセイにおいて、完全に特徴づけた。
ＶＶ７９構築
コペンハーゲンＶＶ２７のＷＲ株同等物であるＶＶ７９は、Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ置換の付加を除いて、ＶＶ３９と同一である。該ウイルスは、ヘルパーウイルスに仲介される相同組換え修復およびレスキュー技術を用いて構築され、ＶＶ３９親ウイルス骨格内にＫ１５１Ｅ突然変異が挿入された。
ＶＶ１０１構築
ＶＶ１０１は、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン（Ｃｏｐ）株に基づく、装備された腫瘍溶解性ウイルスである。ＶＶ１０１は、１）天然ワクシニアＪ２Ｒ（チミジンキナーゼ）遺伝子の欠失、２）Ｊ２Ｒ遺伝子座内の合成初期後期プロモーターによって調節されるヒトＩＬ−２変異体（ｈＩＬ−２ｖ）発現カセットの挿入、３）ｈＩＬ−２ｖカセットとは反対の配向での、Ｊ２Ｒ遺伝子座内のＦ１７プロモーターによって調節される単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ変異体（ＴＫ．００７）発現カセットの挿入、および４）Ａ３４タンパク質の１５１位のリジンからグルタミン酸への置換（Ｋ１５１Ｅ）を導入するウイルスＡ３４Ｒ遺伝子内の突然変異を含む、４つの遺伝子修飾により、親コペンハーゲン天然痘ワクチン株と異なる。ＶＶ１０１は、ヘルパーウイルスに仲介される相同組換え修復およびレスキュー技術を用いて構築された。まず、ＨＳＶ ＴＫ．００７をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルスによる発現のためにコドン最適化し、そしてＧｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成した。該遺伝子を、ワクシニアコペンハーゲンのＪ２Ｒ領域をターゲティングする相同組換えベクター中のＦ１７プロモーター（ＰＦ１７）の下流にクローニングした。第二に、精製ＶＶ２７からワクシニア核酸を抽出し、そしてＨＳＶ ＴＫ．００７／Ｊ２Ｒ相同組換えプラスミドとともに、ショープ線維腫ウイルスに感染したＢＳＣ−４０細胞内にトランスフェクションした。３日間インキュベーションした後、反復凍結および融解によって、溶解物を採取した。ウイルスに４周期のプラーク精製を行い、そしてＰＣＲによってＨＳＶ−ＴＫ．００７の存在に関してスクリーニングした。ＶＶ９３と標識したウイルスを、ＨｅＬａ細胞中で拡大し、スクロース勾配遠心分離によって精製し、そして全ゲノム次世代配列決定を含む品質管理アッセイにおいて特徴づけた。最後に、上述のように、ヘルパーウイルスが仲介する相同組換え修復およびレスキュー技術を用いて、マウスＩＬ−２変異体（ｍＩＬ−２ｖ）をコードする遺伝子を、ヒトにおける発現のために最適化したｈＩＬ−２ｖをコードする遺伝子で置き換えることによって、ＶＶ１０１をＶＶ９３から構築した。組換え、プラーク精製およびスクリーニング後、ＶＶ１０１をＨｅＬａ細胞において拡大し、スクロース勾配遠心分離によって精製し、そして全ゲノム次世代配列決定を含む品質管理アッセイにおいて特徴づけた。
ＶＶ１０２構築
ＶＶ１０２は、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株に基づく、装備された腫瘍溶解性ウイルスである。ＶＶ１０２は、１）天然ワクシニアＪ２Ｒ遺伝子の欠失、２）Ｊ２Ｒ遺伝子座内の合成初期後期プロモーターによって調節されるｈＩＬ−２ｖ発現カセットの挿入、３）天然Ｂ１６Ｒ遺伝子の１５９塩基を置換する、Ｂ１６Ｒ遺伝子座内のＦ１７プロモーターによって調節されるＨＳＶチミジンキナーゼ変異体（ＴＫ．００７）発現カセットの挿入、および４）Ａ３４タンパク質の１５１位のリジンからグルタミン酸への置換（Ｋ１５１Ｅ）を導入するウイルスＡ３４Ｒ遺伝子内の突然変異を含む、４つの遺伝子修飾により、親コペンハーゲン天然痘ワクチン株と異なる。ＶＶ１０２は、ヘルパーウイルスに仲介される相同組換え修復およびレスキュー技術を用いて構築された。まず、ＨＳＶ ＴＫ．００７をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルスによる発現のためにコドン最適化し、そしてＧｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成した。該遺伝子を、ワクシニアコペンハーゲンのＢ１６Ｒ領域をターゲティングする相同組換えベクター中のＦ１７プロモーター（ＰＦ１７）の下流にクローニングした。第二に、精製ＶＶ２７（ＩＧＮＴ−００１に記載される）からワクシニア核酸を抽出し、そしてＨＳＶ ＴＫ．００７／Ｂ１６相同組換えプラスミドとともに、ショープ線維腫ウイルスに感染したＢＳＣ−４０細胞内にトランスフェクションした。３日間インキュベーションした後、反復凍結および融解によって、溶解物を採取した。ウイルスに４周期のプラーク精製を遂行し、そしてＰＣＲによってＨＳＶ−ＴＫ．００７の存在に関してスクリーニングした。ＶＶ９１と標識したウイルスを、ＨｅＬａ細胞中で拡大し、スクロース勾配遠心分離によって精製し、そして全ゲノム次世代配列決定を含む品質管理アッセイにおいて特徴づけた。最後に、上述のように、ヘルパーウイルスが仲介する相同組換え修復およびレスキュー技術を用いて、ｍＩＬ−２ｖをコードする遺伝子を、ヒトにおける発現のために最適化したｈＩＬ−２ｖをコードする遺伝子で置き換えることによって、ＶＶ１０２をＶＶ９１から構築した。組換え、プラーク精製およびスクリーニング後、ＶＶ１０２をＨｅＬａ細胞において拡大し、スクロース勾配遠心分離によって精製し、そして全ゲノム次世代配列決定を含む品質管理アッセイにおいて特徴づけた。
ＶＶ１０３構築
ＶＶ１０３は、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株に基づく、装備された腫瘍溶解性ウイルスである。ＶＶ１０３は、１）天然ワクシニアＪ２Ｒ遺伝子の欠失、２）Ｊ２Ｒ遺伝子座内の合成初期後期プロモーターによって調節されるｈＩＬ−２ｖ発現カセットの挿入、３）天然Ｂ１６Ｒ遺伝子全体を置換する、Ｂ１６Ｒ遺伝子座内のＦ１７プロモーターによって調節されるＨＳＶチミジンキナーゼ変異体（ＴＫ．００７）発現カセットの挿入、および４）Ａ３４タンパク質の１５１位のリジンからグルタミン酸への置換（Ｋ１５１Ｅ）を導入するウイルスＡ３４Ｒ遺伝子内の突然変異を含む、４つの遺伝子修飾により、親コペンハーゲン天然痘ワクチン株と異なる。ＶＶ１０３は、ヘルパーウイルスに仲介される相同組換え修復およびレスキュー技術を用いて構築された。まず、ＨＳＶ ＴＫ．００７をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルスによる発現のためにコドン最適化し、そしてＧｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成した。該遺伝子を、ワクシニアコペンハーゲンのＢ１６Ｒ領域をターゲティングする相同組換えベクター中のＦ１７プロモーター（ＰＦ１７）の下流にクローニングした。第二に、精製ＶＶ２７（ＩＧＮＴ−００１に記載される）からワクシニア核酸を抽出し、そしてＨＳＶ ＴＫ．００７／Ｂ１６相同組換えプラスミドとともに、ショープ線維腫ウイルスに感染したＢＳＣ−４０細胞内にトランスフェクションした。３日間インキュベーションした後、反復凍結および融解によって、溶解物を採取した。ウイルスに４周期のプラーク精製を行い、そしてＰＣＲによってＨＳＶ−ＴＫ．００７の存在に関してスクリーニングした。ＶＶ９６と標識したウイルスを、ＨｅＬａ細胞中で拡大し、スクロース勾配遠心分離によって精製し、そして全ゲノム次世代配列決定を含む品質管理アッセイにおいて特徴づけた。最後に、上述のように、ヘルパーウイルスが仲介する相同組換え修復およびレスキュー技術を用いて、ｍＩＬ−２ｖをコードする遺伝子を、ヒトにおける発現のために最適化したｈＩＬ−２ｖをコードする遺伝子で置き換えることによって、ＶＶ１０３をＶＶ９６から構築した。組換え、プラーク精製およびスクリーニング後、ＶＶ１０３をＨｅＬａ細胞において拡大し、スクロース勾配遠心分離によって精製し、そして全ゲノム次世代配列決定を含む品質管理アッセイにおいて特徴づけた。
ＶＶ９４構築
ＶＶ９４は、ワクシニアウイルスのマウス適応ウェスタンリザーブ（ＷＲ）株に基づく、装備された腫瘍溶解性ウイルスである。ＶＶ９４は、１）天然ワクシニアＪ２Ｒ遺伝子の欠失、２）順方向配向での、Ｊ２Ｒ遺伝子座内の合成初期後期プロモーターによって調節されるｍＩＬ−２ｖ発現カセットの挿入、３）逆方向配向での、Ｊ２Ｒ遺伝子座内のＦ１７プロモーターによって調節されるＨＳＶチミジンキナーゼ変異体（ＴＫ．００７）発現カセットの挿入、および４）Ａ３４タンパク質の１５１位のリジンからグルタミン酸への置換（Ｋ１５１Ｅ）を導入するウイルスＡ３４Ｒ遺伝子内の突然変異を含む、４つの遺伝子修飾により、親ＷＲ株と異なる。ＶＶ９４は、ヘルパーウイルスに仲介される相同組換え修復およびレスキュー技術を用いて構築された。まず、ＨＳＶ ＴＫ．００７をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルスによる発現のためにコドン最適化し、そしてＧｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成した。該遺伝子を、ＷＲのＪ２Ｒ領域をターゲティングする相同組換えベクター中のＦ１７プロモーター（ＰＦ１７）の下流にクローニングした。第二に、精製ＶＶ７９からワクシニア核酸を抽出し、そしてＨＳＶ ＴＫ．００７／Ｊ２Ｒ相同組換えアンプリコンとともに、ショープ線維腫ウイルスに感染したＢＳＣ−４０細胞内にトランスフェクションした。３日間インキュベーションした後、反復凍結および融解によって、溶解物を採取した。ウイルスに４周期のプラーク精製を行い、そしてＰＣＲによってＨＳＶ−ＴＫ．００７の存在に関してスクリーニングした。ＶＶ９４と標識したウイルスを、まずＢＳＣ−４０細胞中で、次いでＨｅＬａ細胞中で拡大し、スクロース勾配遠心分離によって精製し、そして全ゲノム次世代配列決定を含む品質管理アッセイにおいて特徴づけた。
ＩＧＶ−１２１構築
ＩＧＶ−１２１は、ワクシニアウイルスのマウス適応ＷＲ株に基づく、装備された腫瘍溶解性ウイルスである。ＩＧＶ−１２１は、１）天然ワクシニアＪ２Ｒ遺伝子の欠失、２）Ｊ２Ｒ遺伝子座内の合成初期後期プロモーターによって調節されるｍＩＬ−２ｖ変異体発現カセットの挿入、３）Ｂ１５Ｒ（ＷＲ１９７としてもまた知られる）およびＢ１７Ｌ（ＷＲ１９８）の間の遺伝子間領域中のＦ１７プロモーターによって調節されるＨＳＶチミジンキナーゼ変異体（ＴＫ．００７）発現カセットの挿入、および４）Ａ３４タンパク質の１５１位のリジンからグルタミン酸への置換（Ｋ１５１Ｅ）を導入するウイルスＡ３４Ｒ遺伝子内の突然変異を含む、４つの遺伝子修飾により、親ＷＲ株と異なる。ＩＧＶ−１２１は、ヘルパーウイルスに仲介される相同組換え修復およびレスキュー技術を用いて構築された。まず、ＨＳＶ ＴＫ．００７をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルスによる発現のためにコドン最適化し、そしてＧｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成した。該遺伝子を、ワクシニアＷＲ株のＢ１５ＲおよびＢ１７Ｌの間の遺伝子間領域をターゲティングする相同組換えベクター中のＦ１７プロモーター（ＰＦ１７）の下流にクローニングした。第二に、精製ＶＶ７９（マウスＩＬ−２ｖによって置換されたＪ２ＲおよびＡ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ置換を含むＷＲ株）からワクシニア核酸を抽出し、そしてＨＳＶ ＴＫ．００７／Ｂ１５Ｒ−Ｂ１７Ｌ相同組換えプラスミドとともに、ショープ線維腫ウイルスに感染したＶｅｒｏ−Ｂ４細胞内にトランスフェクションした。２日間インキュベーションした後、反復凍結、融解、および超音波処理によって、溶解物を採取した。ＢＳＣ−４０細胞上で、ウイルスに３周期のプラーク精製を行った。ＩＧＶ−１２１と標識したウイルスを、ＨｅＬａ Ｓ３細胞中で拡大し、スクロース勾配遠心分離によって精製し、そして全ゲノム次世代配列決定を含む品質管理アッセイにおいて特徴づけた。図１は、ＶＶ９１、ＶＶ９３、およびＶＶ９６の全ゲノムの模式図を提供し、図２は、ＶＶ９４およびＩＧＶ−１２１の全ゲノムの模式図を提供し、そして図３は、ＶＶ１０１〜ＶＶ１０３の全ゲノムの模式図を提供する。
実施例２： ウェスタンブロットによる、ウイルス感染細胞における組換えワクシニアウイルスからのＩＬ−２ｖ発現の立証
ＨｅＬａ細胞を、６ウェルプレート中、２ｍＬの培地中で６ｅ５細胞／ウェルでプレーティングし、そして培養およそ２４時間後、ＭＯＩ＝３でウイルスに２４時間感染させた。各ウェル由来の細胞を続いて採取し、そして２００μＬのレムリー緩衝液中で溶解し、次いでミリＱ水で１：１に希釈した。１２μＬの試料を、還元剤および１ｘＮｕＰａｇｅ ＬＤＳ試料緩衝液を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中、最終体積２０μＬに調製した後、９５℃で５分間インキュベーションし、そしてＮｕＰａｇｅ ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上に装填した。１ｘＭＥＳ泳動緩衝液を用いて、ゲル電気泳動を２００Ｖで３０分間行った。ｉＢｌｏｔデバイスを用いて、タンパク質をＰＶＤＦ膜にトランスファーし、そしてｉＢｌｏｔデバイスを用いて、ウェスタンブロットを行った。ｍＩＬ−２ｖの検出のため、以下の抗体を用いた−１：２０００希釈の抗ＩＬ−２一次抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１５１０）、１：１０００希釈のヤギ抗ラットＩｇＧ−ＨＲＰ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃６２９５２６）。ｈＩＬ−２ｖの検出のため、以下の抗体を用いた−１：５００希釈の抗ＩＬ−２一次抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＮＢＰ２−１６９４８）、１：２０００希釈のマウス抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、＃３１４６０）。続いて、ＴＭＢ基質を膜に添加して、バンドを視覚化した。膜を水でリンスし、乾燥させ、そしてスキャンした。組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスで細胞を感染させた後のｍＩＬ−２ｖ発現分析の結果を図４に提供する。組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスで細胞を感染させた後のｈＩＬ−２ｖ発現分析の結果を図５に提供する。
実施例３： ＲＴ−ｑＰＣＲによる、ウイルス感染細胞における組換えワクシニアウイルスからのＨＳＶ ＴＫ．００７発現の立証
ＨｅＬａ細胞を、６ウェルプレート中、２ｍＬの培地中で７ｅ４細胞／ウェルでプレーティングし、そして培養およそ７２時間後、ＭＯＩ＝３でウイルスに１８時間感染させた。各ウェル由来の細胞を続いて採取し、そしてＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ普遍的ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、＃７３４０４）を用いて、ＲＮＡ抽出のためにプロセシングした。大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃４３６８８１４）を用いて、５００ｎｇの総ＲＮＡを逆転写した。ｃＤＮＡを１：１０に希釈した後、ｑＰＣＲで用い、組換えウイルス中にコードされるＨＳＶ ＴＫ．００７導入遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブ、ならびにＰｒｉｍｅＴｉｍｅ遺伝子発現マスターミックス（ＩＤＴ、＃１０５５７７２）を用いて、ＨＳＶ ＴＫ．００７ ｍＲＮＡ発現レベルを分析した。ＶｉｉＡ７装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でＰＣＲを行った。ＨＳＶ ＴＫ．００７ ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドＤＮＡを標準として用いて、そして標準曲線から各試験試料中のコピー数／μＬを決定した。組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスでの細胞の感染後のＨＳＶ ＴＫ．００７発現分析の結果を図６に提供する。
実施例４： ＭＣ３８腫瘍所持Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性（ｍＩＬ−２ｖを発現するＣｏｐウイルス）
メスＣ５７ＢＬ／６マウス（８〜１０週齢）の右上方後部脇腹に５ｅ５ ＭＣ３８腫瘍細胞を皮下（ＳＣ）移植した。ＭＣ３８は、ネズミ結腸腺癌細胞株である。例えば、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （１９７５） ｖｏｌ． ３５， ｐｐ． ２４３４−２４３９を参照されたい。腫瘍細胞を移植した１１日後、腫瘍体積に基づいて、マウスを別個の処置群にランダム化した（群あたりの平均腫瘍体積、〜５０ｍｍ３；Ｎ＝１８／群）。移植１２日後、腫瘍に、６０μＬビヒクル（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％スクロース、ｐＨ８．０）または組換えコペンハーゲン（Ｃｏｐ）ワクシニアウイルス変異体の５ｅ７プラーク形成単位（ｐｆｕ）を含有する６０μＬビヒクルを、直接注射した。腫瘍所持マウスを毎日観察し、そしてｉ）腫瘍体積が１４００ｍｍ３を超えるか、ｉｉ）体重が≧２０％喪失するか、またはｉｉｉ）健康状態がひどく低下するかいずれかのため、マウスを人道的に屠殺するまで、腫瘍体積および体重の両方を週２回測定した。マウス群を以下のように処置した：
群ｉ）ビヒクルのみ；
群ｉｉ）ＶＶ１６：Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ突然変異（アミノ酸置換）を所持し、そしてルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質（Ｌｕｃ−２Ａ−ＧＦＰ）二重レポーターカセットを装備されたＣｏｐワクシニアウイルス；
群ｉｉｉ）ＶＶ２７：Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ置換を所持し、そしてｍＩＬ−２ｖ導入遺伝子を装備されたＣｏｐワクシニアウイルス；
群ｉｖ）ＶＶ９１：Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ置換を所持し、ｍＩＬ−２ｖ導入遺伝子を装備され、そしてＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ挿入、順方向配向）をコードする、Ｃｏｐワクシニアウイルス；
群ｖ）ＶＶ９３：Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ置換を所持し、ネズミｍＩＬ−２ｖ導入遺伝子を装備され、そしてＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ挿入、逆方向配向）をコードする、Ｃｏｐワクシニアウイルス；または
群ｖｉ）ＶＶ９６：Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ置換を所持し、ｍＩＬ−２ｖ導入遺伝子を装備され、そしてＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ挿入、逆方向配向）をコードする、Ｃｏｐワクシニアウイルス。
群（ｉ）〜（ｖｉ）の腫瘍増殖プロファイル間の比較（図７Ａ〜７Ｇ）は、すべての試験ウイルスが、連続する複数の日に渡って、腫瘍増殖に対して統計的に有意な阻害効果を生じ、ｍＩＬ−２ｖ装備Ｃｏｐワクシニアウイルスのすべて（ＶＶ２７、ＶＶ９１、ＶＶ９３、およびＶＶ９６）が、対照ウイルス（ＶＶ１６）に比較して、連続する複数の日に渡って、腫瘍増殖に対する統計的に有意な阻害効果を生じ（図８、ＡＮＣＯＶＡ結果）、そしてＶＶ２７（ｍＩＬ−２ｖのみ）をＶＶ９１、ＶＶ９３、またはＶＶ９６（各々、ｍＩＬ−２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７を含む）のいずれかに比較した際、統計的に有意な相違がないことを明らかにした。
各処置群（Ｎ＝１８／群）における動物の生存もまた、腫瘍移植の４１日後まで評価した（図９）。装備しないワクシニア対照（ＶＶ１６）は、ビヒクル対照よりも生存を有意に改善しなかった（ログランク／マンテル−コックス検定、ｐ＝０．１３３）。しかし、装備したワクシニアウイルス変異体ＶＶ２７、ＶＶ９１、ＶＶ９３、およびＶＶ９６で処置したマウスは、レポーター導入遺伝子を装備したワクシニア対照（ＶＶ１６）処置群よりも統計的に有意な平均生存利点を示した（ログランク／マンテル−コックス検定、それぞれ、ｐ＝０．００９、０．００６、＜０．０００１、および０．０１３）。
腫瘍増殖阻害および生存の監視に加えて、ビヒクルまたは組換えＣｏｐワクシニアウイルスを注射した２４時間後および４８時間後に、腫瘍所持マウスから血清を収集して、循環ＩＬ−２レベルを評価した。腫瘍内注射を受けた２４時間後および４８時間後の各処置群から収集した血清中の循環ＩＬ−２レベルをＥＬＩＳＡによって定量化した（図１０）。ｍＩＬ−２ｖ装備Ｃｏｐワクシニアウイルス変異体（ＶＶ２７、ＶＶ９１、ＶＶ９３、およびＶＶ９６）で処置した大部分の動物由来の血清において、測定可能なレベルのＩＬ−２が検出された一方、ビヒクルまたは他のＣｏｐワクシニアウイルス（ＶＶ１６）群由来のいかなる動物においても、バックグラウンドレベルのＩＬ−２しか見られなかった。この後者の結果は、ｍＩＬ−２ｖ導入遺伝子を欠くＣｏｐワクシニアウイルスの腫瘍内注射が、少なくとも試験した用量レベルでは、処置した動物の血清において、循環ＩＬ−２レベルの増加を誘導するには不十分であることを示す。したがって、ｍＩＬ−２ｖ装備Ｃｏｐワクシニアウイルスで処置したマウスの血清において見られたレベル上昇は、腫瘍内注射後の導入遺伝子仲介性発現の指標であるはずである。
実施例５： ルイス肺癌（ＬＬＣ）腫瘍所持Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるｍＩＬ−２ｖ装備ワクシニアウイルス活性（ｍＩＬ−２ｖを発現するＣｏｐウイルス）
メスＣ５７ＢＬ／６マウス（８〜１０週齢）の左上方後部脇腹に１ｅ５ ＬＬＣ腫瘍細胞を皮下（ＳＣ）移植した。腫瘍細胞を移植した１２日後、腫瘍体積に基づいて、マウスを別個の処置群にランダム化した（群あたりの平均腫瘍体積、〜５０ｍｍ３；Ｎ＝２０／群）。移植１３日後、腫瘍に、６０μＬビヒクル（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％スクロース、ｐＨ８．０）または組換えコペンハーゲン（Ｃｏｐ）ワクシニアウイルス変異体の５ｅ７プラーク形成単位（ｐｆｕ）を含有する６０μＬビヒクルを、直接注射した。腫瘍所持マウスを毎日観察し、そしてｉ）腫瘍体積が１４００ｍｍ３を超えるか、ｉｉ）体重が≧２０％喪失するか、またはｉｉｉ）健康状態がひどく低下するかいずれかのため、マウスを人道的に屠殺するまで、腫瘍体積および体重の両方を週２回測定した。マウス群を以下のように処置した：
群ｉ）ビヒクルのみ；
群ｉｉ）ＶＶ１６：Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ突然変異（アミノ酸置換）を所持し、そしてルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質（Ｌｕｃ−２Ａ−ＧＦＰ）二重レポーターカセットを装備されたＣｏｐワクシニアウイルス；
群ｉｉｉ）ＶＶ２７：Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ置換を所持し、そしてｍＩＬ−２ｖ導入遺伝子を装備されたＣｏｐワクシニアウイルス；
群ｉｖ）ＶＶ９１：Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ置換を所持し、ｍＩＬ−２ｖ導入遺伝子を装備され、そしてＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ挿入、順方向配向）をコードする、Ｃｏｐワクシニアウイルス；
群ｖ）ＶＶ９３：Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ置換を所持し、ｍＩＬ−２ｖ導入遺伝子を装備され、そしてＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ挿入、逆方向配向）をコードする、Ｃｏｐワクシニアウイルス；または
群ｖｉ）ＶＶ９６：Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ置換を所持し、ｍＩＬ−２ｖ導入遺伝子を装備され、そしてＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ挿入、逆方向配向）をコードする、Ｃｏｐワクシニアウイルス。
群（ｉ）〜（ｖｉ）の腫瘍増殖プロファイル間の比較（図１１Ａ〜１１Ｆ）は、すべての試験ウイルスが、腫瘍増殖に対して阻害効果を生じ、ｍＩＬ−２ｖ装備Ｃｏｐワクシニアウイルスのすべて（ＶＶ２７、ＶＶ９１、ＶＶ９３、およびＶＶ９６）が、対照ウイルス（ＶＶ１６）に比較して、腫瘍増殖に対して、より顕著な阻害効果を生じることを明らかにした。研究した多くの動物は、異なるウイルス変異体に関連する腫瘍増殖阻害の統計分析を制限する腫瘍潰瘍および関連する健康状態低下のため、人道的に屠殺された。しかし、個々の動物の分析は、それぞれ、７／２０、２／２０、および１／２０の腫瘍は、それぞれ、ＶＶ９１、ＶＶ９３、またはＶＶ９６での処置後、移植後３０日までに＜５０ｍｍ３となるかまたは完全に消失し、他の処置群では小さな腫瘍もまた完全な消失も観察されないことを示した。
腫瘍増殖阻害および生存の監視に加えて、ビヒクルまたは組換えＣｏｐワクシニアウイルスを注射した２４時間後、４８時間後および７２時間後に、腫瘍所持マウスから血清を収集して、循環ＩＬ−２レベルを評価した。腫瘍内注射を受けた後のこれらの時点で、各処置群から収集した血清中の循環ＩＬ−２レベルをＥＬＩＳＡによって定量化した（図１２）。ｍＩＬ−２ｖ装備Ｃｏｐワクシニアウイルス変異体（ＶＶ２７、ＶＶ９１、ＶＶ９３、およびＶＶ９６）で処置した大部分の動物由来の血清において、測定可能なレベルのＩＬ−２が検出された一方、ビヒクルまたは他のＣｏｐワクシニアウイルス（ＶＶ１６）群由来のいかなる動物においても、バックグラウンドレベルのＩＬ−２しか見られなかった。この後者の結果は、ｍＩＬ−２ｖ導入遺伝子を欠くＣｏｐワクシニアウイルスの腫瘍内注射が、少なくとも試験した用量レベルでは、処置した動物の血清において、循環ＩＬ−２レベルの増加を誘導するには不十分であったことを示す。したがって、ｍＩＬ−２ｖ装備Ｃｏｐワクシニアウイルスで処置したマウスの血清において見られたレベル上昇は、腫瘍内注射後の導入遺伝子仲介性発現の指標であるはずである。
実施例６： ＭＣ３８腫瘍所持Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ｍＩＬ−２ｖを発現するＷＲウイルス）を用いた単回ＩＶウイルス療法
Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスの左脇腹に５ｅ５ ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣ移植した。腫瘍細胞を移植した１０日後、腫瘍体積に基づいて、マウスを別個の処置群にランダム化した（群あたりの平均腫瘍体積、〜５０ｍｍ３；Ｎ＝１５／群）。腫瘍細胞移植１１日後、マウスに、１００μＬのビヒクル（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％スクロース、ｐＨ８．０）または５ｅ７ ｐｆｕの組換えＷＲワクシニアウイルスを含有する１００μＬのビヒクルをＩＶ注射した。腫瘍所持マウスを毎日観察し、そしてｉ）腫瘍体積が１４００ｍｍ３を超えるか、ｉｉ）体重が≧２０％喪失するか、ｉｉｉ）健康状態がひどく低下するか、またはｉｖ）研究終了のいずれかのため、マウスを人道的に屠殺するまで、腫瘍体積および体重の両方を週２回測定した。
各試験ウイルスに関する群平均として（図１３Ａ）または各試験群内の個々のマウスとして（図１３Ｂ〜１３Ｆ）示した腫瘍増殖プロファイルの分析は、重要な知見を明らかにした。ｍＩＬ−２ｖ導入遺伝子を装備したＷＲウイルス（ｍＩＬ−２ｖを単独でまたはＨＳＶ ＴＫ．００７とともにコードする）のＩＶ投与は、ビヒクルおよびレポーター導入遺伝子を装備したＷＲウイルス（ＶＶ１７）処置に比較して、ＭＣ３８腫瘍増殖の統計的に有意な阻害を導いた。ＶＶ７９およびＩＧＶ−１２１によって誘導される腫瘍増殖阻害の間には統計的に有意な相違はなかったが、ＶＶ７９およびＶＶ９４の間で検出される統計的に有意な相違があった（図１４、ＡＮＣＯＶＡ結果）。
同じ試験ウイルスに関する生存結果は、腫瘍増殖阻害に関して上に報告するものと非常に類似の結果を示した。これには、対応するＬｕｃ−ＧＦＰレポーターを装備したＷＲウイルスに比較して、ＨＳＶ ＴＫ．００７の存在下または非存在下で、ｍＩＬ−２ｖ導入遺伝子を装備したＷＲウイルスと関連する統計的に優れた群生存が含まれた（図１５）。総合すると、ｍＩＬ−２ｖ導入遺伝子を装備したＷＲウイルス変異体のＩＶ送達は、ＭＣ３８ ＳＣ腫瘍モデルにおいて有効な抗腫瘍療法であることが証明され、そしてウイルスの単回療法投与の強度を立証した。
循環ＩＬ−２レベルの評価のため、ＩＶウイルス用量の７２時間後（第１４日）、各試験群において、ＭＣ３８腫瘍所持マウスから血清もまた収集した。ｍＩＬ−２ｖ導入遺伝子を装備したウイルスを試験した他の研究と一致して、ＩＬ−２の上昇し、そして統計的に有意な血清レベルは、ｍＩＬ−２ｖ導入遺伝子を装備したＷＲウイルスを投与したすべての試験群で検出された（図１６）。
実施例７： ＬＬＣ腫瘍所持Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ｍＩＬ−２ｖを発現するＷＲウイルス）を用いた単回ＩＶウイルス療法
このセットの実験において、Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスの右脇腹に１ｅ５のＬＬＣ腫瘍細胞をＳＣ移植した。腫瘍細胞を移植した１２日後、腫瘍体積に基づいて、マウスを別個の処置群にランダム化した（群あたりの平均腫瘍体積、〜５０ｍｍ３；Ｎ＝２０／群）。第１４日、マウスに、１００μＬのビヒクル（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％スクロース、ｐＨ８．０）または５ｅ７ ｐｆｕの組換えＷＲワクシニアウイルス変異体を含有する１００μＬのビヒクルをＩＶ注射した。腫瘍所持マウスを毎日観察し、そしてｉ）腫瘍体積が２０００ｍｍ３を超えるか、ｉｉ）体重が≧２０％喪失するか、ｉｉｉ）健康状態がひどく低下するか、またはｉｖ）研究終了のいずれかのため、マウスを人道的に屠殺するまで、腫瘍体積および体重の両方を週２回測定した。
各試験ウイルスに関する群平均として（図１７Ａ）または各試験群内の個々のマウスとして（図１７Ｂ〜１７Ｄ）示した腫瘍増殖プロファイルの分析は、ＨＳＶ ＴＫ．００７およびＡ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ突然変異をコードするｍＩＬ−２ｖ導入遺伝子を装備したＷＲウイルス（ＩＧＶ−１２１）のＩＶ投与が、レポーター導入遺伝子を装備したＷＲウイルス処置に比較して、ＬＬＣ腫瘍増殖の統計的に有意な阻害を導くことを立証した（図１８、ＡＮＣＯＶＡ結果）。
同じ試験ウイルスに関する生存結果は、腫瘍増殖阻害に関して上に報告するものと非常に類似の結果を示した。これには、対応するＬｕｃ−ＧＦＰレポーターを装備したＷＲウイルスに比較して、ｍＩＬ−２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７導入遺伝子を装備したＷＲウイルスと関連する統計的に優れた群生存が含まれた（図１９）。総合すると、ｍＩＬ−２ｖ導入遺伝子を装備したＷＲウイルス変異体のＩＶ送達は、ＬＬＣ ＳＣ腫瘍モデルにおいて有効な抗腫瘍療法であることが証明され、そしてウイルスの単回療法投与の強度を立証した。
実施例８： ＭＣ３８腫瘍所持Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性（ｍＩＬ−２ｖまたはｈＩＬ−２ｖを発現するＣｏｐウイルス）
メスＣ５７ＢＬ／６マウス（８〜１０週齢）の右上方後部脇腹に５ｅ５のＭＣ３８腫瘍細胞を皮下（ＳＣ）移植した。腫瘍細胞を移植した１０日後、腫瘍体積に基づいて、マウスを別個の処置群にランダム化した（群あたりの平均腫瘍体積、〜５０ｍｍ３；Ｎ＝２０／群）。移植１１日後、腫瘍に、６０μＬビヒクル（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％スクロース、ｐＨ８．０）または組換えコペンハーゲン（Ｃｏｐ）ワクシニアウイルス変異体の５ｅ７または２ｅ８プラーク形成単位（ｐｆｕ）のいずれかを含有する６０μＬビヒクルを、直接注射した。腫瘍所持マウスを毎日観察し、そしてｉ）腫瘍体積が１４００ｍｍ３を超えるか、ｉｉ）体重が≧２０％喪失するか、またはｉｉｉ）健康状態がひどく低下するかいずれかのため、マウスを人道的に屠殺するまで、腫瘍体積および体重の両方を週２回測定した。マウス群を以下のように処置した：
群ｉ）ビヒクルのみ；
群ｉｉ）２ｅ８ ｐｆｕの用量レベルのＶＶ７：ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質（Ｌｕｃ−２Ａ−ＧＦＰ）二重レポーターカセットを装備された、Ｃｏｐワクシニアウイルス；
群ｉｉｉ）５ｅ７ ｐｆｕの用量レベルのＶＶ９１：Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ置換を所持し、ネズミインターロイキン２変異体（ｍＩＬ−２ｖ）導入遺伝子を装備され、そしてＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ挿入、順方向配向）をコードする、Ｃｏｐワクシニアウイルス；
群ｉｖ）２ｅ８ ｐｆｕの用量レベルのＶＶ９１：Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ置換を所持し、ネズミインターロイキン２変異体（ｍＩＬ−２ｖ）導入遺伝子を装備され、そしてＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ挿入、順方向配向）をコードする、Ｃｏｐワクシニアウイルス；
群ｖ）ＶＶ１０２：５ｅ７ ｐｆｕの用量レベル：Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ置換を所持し、ヒトインターロイキン２変異体（ｈＩＬ−２ｖ）導入遺伝子を装備され、そしてＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ挿入、順方向配向）をコードする、Ｃｏｐワクシニアウイルス；
群ｖｉ）２ｅ８ ｐｆｕの用量レベルのＶＶ１０２：Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ置換を所持し、ヒトインターロイキン２変異体（ｈＩＬ−２ｖ）導入遺伝子を装備され、そしてＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ挿入、順方向配向）をコードする、Ｃｏｐワクシニアウイルス；
群ｖｉｉ）５ｅ７ ｐｆｕの用量レベルのＶＶ１０：マウスＧＭ−ＣＳＦおよびＬａｃＺレポーター導入遺伝子を装備されたＣｏｐワクシニアウイルス；または
群ｖｉｉｉ）２ｅ８ ｐｆｕの用量レベルのＶＶ１０：マウスＧＭ−ＣＳＦおよびＬａｃＺレポーター導入遺伝子を装備されたＣｏｐワクシニアウイルス
群（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の腫瘍増殖プロファイル間の比較（図２０Ａ〜２０Ｉ）は、すべての試験ウイルスが、連続する複数の日に渡って、腫瘍増殖に対して統計的に有意な阻害効果を生じ、そしてマウスおよびヒトＩＬ−２ｖ装備Ｃｏｐワクシニアウイルス（それぞれ、ＶＶ９１およびＶＶ１０２）が、マウスＧＭ−ＣＳＦ装備Ｃｏｐワクシニアウイルス（ＶＶ１０）に比較して、連続する複数の日に渡って、腫瘍増殖に対する統計的に有意な阻害効果を生じることを明らかにした（図２１、ＡＮＣＯＶＡ結果）。ＶＶ１０２（ｈＩＬ−２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７）に対して、ＶＶ９１（ｍＩＬ−２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７）によって誘導される腫瘍増殖阻害効果を比較した際には、統計的に有意な相違は観察されなかった。
各処置群における動物の生存（Ｎ＝２０／群）もまた、腫瘍移植の４２日後まで評価した（図２２）。この場合、ＶＶ９１およびＶＶ１０２で処置されたマウスはどちらも、ビヒクル、ＶＶ７、およびＶＶ１０処置群よりも、統計的に有意な平均生存利点を示した（ログランク／マンテル−コックス検定からのＰ値に関しては、図２２中の表を参照されたい）。
腫瘍増殖阻害および生存の監視に加えて、ビヒクルまたは組換えＣｏｐワクシニアウイルスを注射した２４時間後に、腫瘍所持マウスから血清を収集して、循環ＩＬ−２レベルを評価した。腫瘍内注射を受けた２４時間後の各処置群から収集した血清中の循環マウスＩＬ−２およびヒトＩＬ−２レベルをＥＬＩＳＡによって定量化した（それぞれ、図２３および図２４）。ＩＬ−２ｖ装備Ｃｏｐワクシニアウイルス変異体（ＶＶ９１、およびＶＶ１０２）で処置した大部分の動物由来の血清において、測定可能なレベルのＩＬ−２が検出された一方、ビヒクルまたは他のＣｏｐワクシニアウイルス（ＶＶ７、およびＶＶ１０）群由来のいかなる動物においても、バックグラウンドレベルのＩＬ−２しか見られなかった。特に、マウスＩＬ−２の有意なレベル上昇は、ｍＩＬ−２ｖ発現ウイルス（ＶＶ９１）を投与されたマウスの血清でのみ検出され、そしてヒトＩＬ−２の有意なレベル上昇は、ｈＩＬ−２ｖ発現ウイルス（ＶＶ１０２）を投与されたマウスの血清でのみ検出された。したがって、ＩＬ−２ｖ装備Ｃｏｐワクシニアウイルスで処置されたマウスの血清で見られるレベル上昇は、腫瘍内注射後の導入遺伝子仲介性発現の指標であるはずである。
実施例９： ＨＣＴ−１１６腫瘍所持ヌードマウスにおける組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性（ｈＩＬ−２ｖを発現するＣｏｐウイルス）
メスヌードマウスの右脇腹に５ｅ６のＨＣＴ−１１６腫瘍細胞をＳＣ移植した。腫瘍細胞を移植した８日後、腫瘍体積に基づいて、マウスを別個の処置群にランダム化した（群あたりの平均腫瘍体積、〜５０ｍｍ３；Ｎ＝２０／群）。移植９日後、マウスに、１００μＬのビヒクルのみまたは組換え腫瘍溶解性Ｃｏｐワクシニアウイルスの最適以下の用量（３ｅ５ ｐｆｕ）を含有するビヒクルを、ＩＶ注射した。腫瘍所持マウスを毎日観察し、そしてｉ）腫瘍体積が１４００ｍｍ３を超えるか、ｉｉ）体重が≧２０％喪失するか、ｉｉｉ）健康状態がひどく低下するか、またはｉｖ）研究終了のいずれかのため、マウスを人道的に屠殺するまで、腫瘍体積および体重の両方を週２回測定した。マウス群を以下のように処置した：
群ｉ）ビヒクルのみ；
群ｉｉ）ＶＶ９０：Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ突然変異（アミノ酸置換）を所持し、欠失されたＪ２Ｒ遺伝子領域内に導入遺伝子が挿入されていない、Ｃｏｐワクシニアウイルス；
群ｉｉｉ）ＶＶ２７：Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ置換を所持し、そしてネズミインターロイキン２変異体（ｍＩＬ−２ｖ）導入遺伝子（ＶＶ２７）を装備されたＣｏｐワクシニアウイルス；
群ｉｖ）ＶＶ９１：Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ置換を所持し、ネズミインターロイキン２変異体（ｍＩＬ−２ｖ）導入遺伝子を装備され、そしてＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ挿入、順方向配向）をコードする、Ｃｏｐワクシニアウイルス；
群ｖ）ＶＶ９３：Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ置換を所持し、ネズミインターロイキン２変異体（ｍＩＬ−２ｖ）導入遺伝子を装備され、そしてＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ挿入、逆方向配向）をコードする、Ｃｏｐワクシニアウイルス；または
群ｖｉ）ＶＶ９６：Ａ３４Ｒ−Ｋ１５１Ｅ置換を所持し、ネズミインターロイキン２変異体（ｍＩＬ−２ｖ）導入遺伝子を装備され、そしてＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ挿入、逆方向配向）をコードする、Ｃｏｐワクシニアウイルス。
群（ｉ）〜（ｖｉ）の腫瘍増殖プロファイル間の比較（図２５）は、すべての試験ウイルスが、連続する複数の日に渡って、ヒト異種移植腫瘍において、腫瘍増殖に対して統計的に有意な阻害効果を生じることを明らかにした。
本明細書に記載するような治療法を指す態様において、こうした態様はまた、その治療における使用に関する、あるいはその治療において使用するための薬剤の製造に関するさらなる態様である。
本発明は、その特定の態様に言及して記載されてきているが、当業者には、多様な変化が作製可能であり、そして同等物は、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく置換可能であることが理解されなければならない。さらに、特定の状況、物質、組成物、プロセス、単数または複数のプロセス工程が、本発明の目的、精神および範囲に適応するように、多くの修飾を作製してもよい。こうしたすべての修飾は、本明細書に付随する請求項の範囲内であると意図される。

Claims (46)

  1. 対応する野生型ウイルスに比較して、ウイルスゲノム中に修飾を含む複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ＲＶＶ）であって、修飾が、ウイルスゲノム中に：（１）免疫刺激サイトカインポリペプチドをコードする、挿入されたヌクレオチド配列；および（２）異種チミジンキナーゼ（ＴＫ）ポリペプチドをコードする、挿入されたヌクレオチド配列を含む、前記ＲＶＶ。
  2. ワクシニアＴＫ欠損にするさらなる修飾を含む、請求項１のＲＶＶ。
  3. さらなる修飾が、Ｊ２Ｒ発現および／または機能の欠如を生じる、請求項２のＲＶＶ。
  4. コペンハーゲン株ワクシニアウイルスである、請求項２のＲＶＶ。
  5. ＷＲ株ワクシニアウイルスである、請求項２のＲＶＶ。
  6. 免疫刺激サイトカインポリペプチドがインターロイキン−２（ＩＬ−２）ポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項のＲＶＶ。
  7. 免疫刺激サイトカインポリペプチドが野生型ＩＬ−２ポリペプチドである、請求項１〜６のいずれか一項のＲＶＶ。
  8. 免疫刺激サイトカインポリペプチドが、対応する野生型ＩＬ−２ポリペプチドに比較した際、減少した望ましくない生物学的活性を有する変異体ＩＬ−２（ＩＬ−２ｖ）ポリペプチドである、請求項１〜６のいずれか一項のＲＶＶ。
  9. 異種ＴＫポリペプチドがＨＳＶ−ＴＫポリペプチドである、請求項１〜８のいずれか一項のＲＶＶ。
  10. Ｋ１５１Ｅ置換を含むＡ３４Ｒ遺伝子を含む、請求項１〜９のいずれか一項のＲＶＶ。
  11. ＩＬ−２ｖポリペプチドが、配列番号１のＩＬ−２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、Ｆ４２、Ｙ４５、およびＬ７２の１つまたはそれより多くの置換を含む、請求項８〜１０のいずれか一項のＲＶＶ。
  12. ＩＬ−２ｖポリペプチドが、配列番号１のＩＬ−２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、Ｆ４２Ｌ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、またはＦ４２Ｋの置換を含む、請求項８〜１１のいずれか一項のＲＶＶ。
  13. ＩＬ−２ｖポリペプチドが、配列番号１のＩＬ−２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、またはＹ４５Ｋの置換を含む、請求項８〜１２のいずれか一項のＲＶＶ。
  14. ＩＬ−２ｖポリペプチドが、配列番号１のＩＬ−２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｒ、またはＬ７２Ｋの置換を含む、請求項８〜１３のいずれか一項のＲＶＶ。
  15. ＩＬ−２ｖポリペプチドが、配列番号１のＩＬ−２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＬ７２Ｇの置換を含む、請求項８〜１４のいずれか一項のＲＶＶ。
  16. ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、制御可能プロモーターに機能可能であるように連結されている、請求項８〜１４のいずれか一項のＲＶＶ。
  17. 制御可能プロモーターが、テトラサイクリンあるいはテトラサイクリン類似体または誘導体によって制御される、請求項１６のＲＶＶ。
  18. 異種ＴＫポリペプチドがデオキシグアノシンのリン酸化を触媒可能である、請求項１〜１７のいずれか一項のＲＶＶ。
  19. 異種ＴＫポリペプチドが変異体単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＴＫポリペプチドである、請求項１〜１８のいずれか一項のＲＶＶ。
  20. 変異体ＨＳＶ ＴＫポリペプチドが、野生型ＨＳＶ ＴＫに少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして配列番号２５の野生型ＨＳＶ ＴＫアミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づいて、Ｌ１５９、Ｉ１６０、Ｆ１６１、Ａ１６８、およびＬ１６９の１つまたはそれより多くの置換を含む、請求項１９のＲＶＶ。
  21. 変異体ＨＳＶ ＴＫポリペプチドがＡ１６８Ｈ置換を含む、請求項２０のＲＶＶ。
  22. 変異体ＨＳＶ ＴＫポリペプチドが、Ｌ１５９Ｉ置換、Ｉ１６０Ｌ置換、Ｆ１６１Ａ置換、Ａ１６８Ｙ置換、およびＬ１６９Ｆ置換を含む、請求項２０のＲＶＶ。
  23. 変異体ＨＳＶ ＴＫポリペプチドが、Ｌ１５９Ｉ置換、Ｉ１６０Ｆ置換、Ｆ１６１Ｌ置換、Ａ１６８Ｆ置換、およびＬ１６９Ｍ置換を含む、請求項２０のＲＶＶ。
  24. 変異体ＨＳＶ ＴＫポリペプチドが、配列番号２６、２７、または２８のアミノ酸配列を含む、請求項２０のＲＶＶ。
  25. ａ）請求項１〜２４のいずれか一項のＲＶＶ；および
    ｂ）薬学的に許容されうるキャリアー
    を含む、組成物。
  26. 腫瘍を有する個体において腫瘍溶解を誘導する方法であって、請求項１〜２４のいずれか一項のＲＶＶまたは請求項２５の組成物の有効量を、個体に投与する工程を含む、前記方法。
  27. 腫瘍が、脳癌腫瘍、頭頸部癌腫瘍、食道癌腫瘍、皮膚癌腫瘍、肺癌腫瘍、胸腺癌腫瘍、胃癌腫瘍、結腸癌腫瘍、肝臓癌腫瘍、卵巣癌腫瘍、子宮癌腫瘍、膀胱癌腫瘍、精巣癌腫瘍、直腸癌腫瘍、乳癌腫瘍、または膵臓癌腫瘍である、請求項２６の方法。
  28. 腫瘍が結腸直腸腺癌、非小細胞肺癌、またはトリプルネガティブ乳癌である、請求項２６の方法。
  29. 腫瘍が再発性である、請求項２６〜２８のいずれか一項の方法。
  30. 腫瘍が原発性腫瘍である、請求項２６〜２８のいずれか一項の方法。
  31. 腫瘍が転移性である、請求項２６〜２８のいずれか一項の方法。
  32. 個体に第二の癌療法を投与する工程をさらに含む、請求項２６〜３１のいずれか一項の方法。
  33. 第二の癌療法が、化学療法、生物学的療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、抗血管療法、凍結療法、毒素療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、細胞療法、および手術より選択される、請求項３２の方法。
  34. 第二の癌療法が抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む、請求項３２の方法。
  35. 個体が免疫無防備状態である、請求項２６〜３４のいずれか一項の方法。
  36. ＲＶＶまたは組成物の前記投与が腫瘍内投与である、請求項２６〜３５のいずれか一項の方法。
  37. ＲＶＶまたは組成物の前記投与が腫瘍周辺投与である、請求項２６〜３５のいずれか一項の方法。
  38. ＲＶＶまたは組成物の前記投与が静脈内投与である、請求項２６〜３５のいずれか一項の方法。
  39. ＲＶＶまたは組成物の前記投与が、動脈内、膀胱内、またはクモ膜下腔内投与である、請求項２６〜３５のいずれか一項の方法。
  40. ワクシニアウイルスの不都合な副作用を減少させるために有効な量のガンシクロビルを、個体に投与する工程をさらに含む、請求項２６〜３９のいずれか一項の方法。
  41. ゲノム中に：（１）配列番号９を含む変異体インターロイキン−２（ＩＬ−２ｖ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（２）配列番号２８を含む異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および（３）Ａ３４Ｒ遺伝子中のＫ１５１Ｅ置換を含む、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ＲＶＶ）であって、コペンハーゲン株ワクシニアウイルスであり、そしてワクシニアチミジンキナーゼ欠損である、前記ＲＶＶ。
  42. ＩＬ−２ｖポリペプチドがシグナルペプチドをさらに含む、請求項４１のＲＶＶ。
  43. シグナルペプチドが配列番号２２を含む、請求項４２のＲＶＶ。
  44. 変異体ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が配列番号１０を含む、請求項８〜２４のいずれか一項のＲＶＶ。
  45. 変異体ＩＬ−２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が配列番号１２を含む、請求項８〜２４のいずれか一項のＲＶＶ。
  46. （ｉ）請求項４１〜４５のいずれか一項のＲＶＶおよび（ｉｉ）薬学的に許容されうるキャリアーを含む、組成物。
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