JP2021106576A - 変異体腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびその使用法 - Google Patents

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Maruri Avidal Liliana
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Abstract

【課題】増進された抗腫瘍特性を持つ組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを提供する。【解決手段】ａ）変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ｂ）変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびｃ）変異体Ｂ５ポリペプチドの１つまたはそれより多くをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ＯＶＶ）であって、変異体Ａ３３、変異体Ａ３４、および変異体Ｂ５ポリペプチドが、対応する野生型Ａ３３、Ａ３４およびＢ５ポリペプチドをコードするウイルスに比較して、増進されたウイルス伝播または増進されたＥＥＶ産生を提供する、１つまたはそれより多いアミノ酸置換を含む、前記ＯＶＶを提供する。本開示はまた、腫瘍を有する個体において腫瘍溶解を誘導するための、ＯＶＶを含む組成物およびＯＶＶまたは組成物の使用も提供する。【選択図】なし

Description

関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、２０１９年１２月１２日出願の米国仮出願第６２／９４７，２００号、２０１９年１２月１２日出願の米国仮出願第６２／９４７，２０２号、および２０１９年１２月１２日出願の米国仮出願第６２／９４７，２０４号の恩典を請求する。各仮出願の開示は、その全体が本明細書に援用される。
テキストファイルとして提供される配列表の参照による援用
配列表は、２０２０年１１月３日に作成され、そして１５２ＫＢのサイズを有するテキストファイル、「ＰＣ０４０３１８Ａ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」として本明細書とともに提供される。テキストファイルの内容は、その全体が本明細書に援用される。
本開示は、一般に、腫瘍溶解性ウイルスに、そして特に、増進された抗腫瘍特性を持つ組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに関する。
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、非癌細胞においてよりも、癌細胞において、選択的にまたはより効率的に複製するウイルスである。このウイルス群には、天然に見出されたウイルス（例えば野生型または天然ウイルス）、ならびにその抗腫瘍特性、例えば腫瘍選択性または腫瘍細胞における優先的複製、宿主指向性、表面付着、溶解、ならびに伝播が改善されるように、遺伝子破壊または遺伝子付加によって、天然ウイルスから操作されているウイルスが含まれる。生存複製ＯＶが、多様なヒト癌における臨床試験で試験されてきている。ＯＶは、抗腫瘍免疫反応、ならびに腫瘍細胞の直接溶解（すなわち腫瘍溶解）を誘導しうる。一般的なＯＶには、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、アデノウイルス（Ａｄ）、麻疹ウイルス（ＭＶ）、コクサッキーウイルス（ＣＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、およびワクシニアウイルス（ＶＶ）の弱毒化株が含まれる。
ワクシニアウイルスは、オルソポックスウイルス属のプロトタイプメンバーであり、宿主細胞の細胞質において複製する。複製中、３つの形態学的および抗原的に別個の型のウイルス：細胞内成熟ビリオン（ＩＭＶ）、細胞内エンベロープビリオン（ＩＥＶ）、および細胞外ビリオンが産生される。最初に産生される感染性子孫であるＩＭＶのサブセットは、トランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）に輸送され、ここで２つのさらなる膜でエンベロープ形成されて、ＩＥＶが産生される。ＩＥＶは細胞質を通じて細胞外縁に輸送され、ここで最も外側の膜が形質膜と融合して、ＥＶと称される二重膜型を放出する。細胞表面で保持されるＥＶは、細胞会合エンベロープビリオン（ＣＥＶ）と称される一方、もはや細胞表面に付着していないＥＶは、細胞外エンベロープビリオン（ＥＥＶ）と称される。ＩＭＶは最も豊富な感染型であり、そして宿主間の伝播に関与すると考えられ；ＣＥＶは細胞間伝播に役割を果たすと考えられ；そしてＥＥＶは、宿主生物内での長期播種に重要であると考えられる。
ＶＶは、およそ２００ｋｂｐの二本鎖ＤＮＡゲノムを含有し、該ゲノムは２００を超えるオープンリーディングフレームをコードすると予測される。ウイルスによってコードされる７つのタンパク質、すなわち、Ａ３３、Ａ３４、Ａ３６、Ａ５６、Ｂ５、Ｆ１２、およびＦ１３は、ウイルスのエンベロープ型（ＩＥＶ／ＥＥＶ／ＣＥＶ）にユニークである。ワクシニアウイルスオープンリーディングフレームは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ断片を示す大文字で示され、数字はＨｉｎｄＩＩＩ断片における位を示し、そして文字（ＬまたはＲ）は、転写方向を示し、例えばＡ３４Ｒとなる。対応するタンパク質は、大文字および数字、例えばＡ３４によって示される。細胞外ビリオン膜に特異的な糖タンパク質Ａ３３、Ａ３４、およびＢ５は、ＥＶ表面上に曝露され、そして細胞外ビリオン形成および続く感染中に役割を有する。
本開示は、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（本明細書において、以後、「腫瘍溶解性ワクシニアウイルス」または「ＯＶＶ」と称する）であって、変異体ウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該変異体ウイルスポリペプチドが増進されたウイルス伝播または増進されたＥＥＶ産生を提供する、前記ワクシニアウイルスを提供する。用語「増進された」は、本明細書において、本開示における「増加した」と同じものを意味し、そして交換可能に用いられる。いくつかの側面において、ＯＶＶは、変異体Ａ３３ポリペプチド、変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または上記ヌクレオチド配列の任意の組み合わせより選択される変異体ウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで変異体Ａ３３、変異体Ａ３４、および変異体Ｂ５ポリペプチドは、それぞれの突然変異を含まない対応するポリペプチドに比較して、増進されたウイルス伝播または増進されたＥＥＶ産生を提供する、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれより多いアミノ酸突然変異（例えば置換、欠失、または挿入）を含む。いくつかの態様において、ＯＶＶは、コペンハーゲン株に基づいて構築される。他の態様において、ＯＶＶは、ウェスタンリザーブ株に基づいて構築される。
本開示は、ＯＶＶを含む組成物をさらに提供する。本開示はまた、腫瘍を有する個体において腫瘍溶解を誘導する方法であって、該個体に、本開示のＯＶＶまたは本開示の組成物の有効量を投与する工程を含む、前記方法も提供する。本開示はまた、腫瘍を有する個体において腫瘍溶解を誘導する方法において使用するための本開示のＯＶＶまたは組成物、ならびにこうした方法において使用するための薬剤の製造における本開示のＯＶＶまたは組成物の使用も提供する。
図１Ａ〜１Ｃは、ワクシニアウイルスの一般的な株のＡ３３ＲヌクレオチドおよびＡ３３アミノ酸配列の整列を提供する。ＡおよびＢ）遺伝子間および遺伝子に渡るヌクレオチドの位置を示す、コペンハーゲン（配列番号１）、アンカラ（配列番号２）、ＩＨＤ−Ｊ（配列番号３）、リスター（配列番号４）、天壇（配列番号５）、ウェスタンリザーブ（配列番号６）、およびワイエス（配列番号７）のＡ３３Ｒヌクレオチド配列。 図１Ａ〜１Ｃは、ワクシニアウイルスの一般的な株のＡ３３ＲヌクレオチドおよびＡ３３アミノ酸配列の整列を提供する。ＡおよびＢ）遺伝子間および遺伝子に渡るヌクレオチドの位置を示す、コペンハーゲン（配列番号１）、アンカラ（配列番号２）、ＩＨＤ−Ｊ（配列番号３）、リスター（配列番号４）、天壇（配列番号５）、ウェスタンリザーブ（配列番号６）、およびワイエス（配列番号７）のＡ３３Ｒヌクレオチド配列。 図１Ａ〜１Ｃは、ワクシニアウイルスの一般的な株のＡ３３ＲヌクレオチドおよびＡ３３アミノ酸配列の整列を提供する。ＡおよびＢ）遺伝子間および遺伝子に渡るヌクレオチドの位置を示す、コペンハーゲン（配列番号１）、アンカラ（配列番号２）、ＩＨＤ−Ｊ（配列番号３）、リスター（配列番号４）、天壇（配列番号５）、ウェスタンリザーブ（配列番号６）、およびワイエス（配列番号７）のＡ３３Ｒヌクレオチド配列。Ｃ）タンパク質間およびタンパク質に渡るアミノ酸の位置を示す、コペンハーゲン（配列番号８）、アンカラ（配列番号９）、ＩＨＤ−Ｊ（配列番号１０）、リスター（配列番号１１）、天壇（配列番号１２）、ウェスタンリザーブ（配列番号１３）、およびワイエス（配列番号１４）のＡ３３アミノ酸配列。 図２Ａ〜２Ｃは、ワクシニアウイルスの一般的な株のＡ３４ＲヌクレオチドおよびＡ３４アミノ酸配列の整列を提供する。ＡおよびＢ）遺伝子間および遺伝子に渡るヌクレオチドの位置を示す、コペンハーゲン（配列番号１５）、アンカラ（配列番号１６）、ＩＨＤ−Ｊ（配列番号１７）、リスター（配列番号１８）、天壇（配列番号１９）、ウェスタンリザーブ（配列番号２０）、およびワイエス（配列番号２１）のＡ３４Ｒヌクレオチド配列。 図２Ａ〜２Ｃは、ワクシニアウイルスの一般的な株のＡ３４ＲヌクレオチドおよびＡ３４アミノ酸配列の整列を提供する。ＡおよびＢ）遺伝子間および遺伝子に渡るヌクレオチドの位置を示す、コペンハーゲン（配列番号１５）、アンカラ（配列番号１６）、ＩＨＤ−Ｊ（配列番号１７）、リスター（配列番号１８）、天壇（配列番号１９）、ウェスタンリザーブ（配列番号２０）、およびワイエス（配列番号２１）のＡ３４Ｒヌクレオチド配列。 図２Ａ〜２Ｃは、ワクシニアウイルスの一般的な株のＡ３４ＲヌクレオチドおよびＡ３４アミノ酸配列の整列を提供する。ＡおよびＢ）遺伝子間および遺伝子に渡るヌクレオチドの位置を示す、コペンハーゲン（配列番号１５）、アンカラ（配列番号１６）、ＩＨＤ−Ｊ（配列番号１７）、リスター（配列番号１８）、天壇（配列番号１９）、ウェスタンリザーブ（配列番号２０）、およびワイエス（配列番号２１）のＡ３４Ｒヌクレオチド配列。Ｃ）タンパク質間およびタンパク質に渡るアミノ酸の位置を示す、コペンハーゲン（配列番号２２）、アンカラ（配列番号２３）、ＩＨＤ−Ｊ（配列番号２４）、リスター（配列番号２５）、天壇（配列番号２６）、ウェスタンリザーブ（配列番号２７）、およびワイエス（配列番号２８）のＡ３４アミノ酸配列。 図３Ａ〜３Ｄは、ワクシニアウイルスの一般的な株のＡ５６ＲヌクレオチドおよびＡ５６アミノ酸配列の整列を提供する。Ａ〜Ｃ）遺伝子間および遺伝子に渡るヌクレオチドの位置を示す、コペンハーゲン（配列番号２９）、アンカラ（配列番号３０）、ＩＨＤ−Ｊ（配列番号３１）、リスター（配列番号３２）、天壇（配列番号３３）、ウェスタンリザーブ（配列番号３４）、およびワイエス（配列番号３５）のＡ５６Ｒヌクレオチド配列。 図３Ａ〜３Ｄは、ワクシニアウイルスの一般的な株のＡ５６ＲヌクレオチドおよびＡ５６アミノ酸配列の整列を提供する。Ａ〜Ｃ）遺伝子間および遺伝子に渡るヌクレオチドの位置を示す、コペンハーゲン（配列番号２９）、アンカラ（配列番号３０）、ＩＨＤ−Ｊ（配列番号３１）、リスター（配列番号３２）、天壇（配列番号３３）、ウェスタンリザーブ（配列番号３４）、およびワイエス（配列番号３５）のＡ５６Ｒヌクレオチド配列。 図３Ａ〜３Ｄは、ワクシニアウイルスの一般的な株のＡ５６ＲヌクレオチドおよびＡ５６アミノ酸配列の整列を提供する。Ａ〜Ｃ）遺伝子間および遺伝子に渡るヌクレオチドの位置を示す、コペンハーゲン（配列番号２９）、アンカラ（配列番号３０）、ＩＨＤ−Ｊ（配列番号３１）、リスター（配列番号３２）、天壇（配列番号３３）、ウェスタンリザーブ（配列番号３４）、およびワイエス（配列番号３５）のＡ５６Ｒヌクレオチド配列。 図３Ａ〜３Ｄは、ワクシニアウイルスの一般的な株のＡ５６ＲヌクレオチドおよびＡ５６アミノ酸配列の整列を提供する。Ａ〜Ｃ）遺伝子間および遺伝子に渡るヌクレオチドの位置を示す、コペンハーゲン（配列番号２９）、アンカラ（配列番号３０）、ＩＨＤ−Ｊ（配列番号３１）、リスター（配列番号３２）、天壇（配列番号３３）、ウェスタンリザーブ（配列番号３４）、およびワイエス（配列番号３５）のＡ５６Ｒヌクレオチド配列。 図３Ａ〜３Ｄは、ワクシニアウイルスの一般的な株のＡ５６ＲヌクレオチドおよびＡ５６アミノ酸配列の整列を提供する。Ｄ）タンパク質間およびタンパク質に渡るアミノ酸の位置を示す、コペンハーゲン（配列番号３６）、アンカラ（配列番号３７）、ＩＨＤ−Ｊ（配列番号３８）、リスター（配列番号３９）、天壇（配列番号４０）、ウェスタンリザーブ（配列番号４１）、およびワイエス（配列番号４２）のＡ５６アミノ酸配列。 図３Ａ〜３Ｄは、ワクシニアウイルスの一般的な株のＡ５６ＲヌクレオチドおよびＡ５６アミノ酸配列の整列を提供する。Ｄ）タンパク質間およびタンパク質に渡るアミノ酸の位置を示す、コペンハーゲン（配列番号３６）、アンカラ（配列番号３７）、ＩＨＤ−Ｊ（配列番号３８）、リスター（配列番号３９）、天壇（配列番号４０）、ウェスタンリザーブ（配列番号４１）、およびワイエス（配列番号４２）のＡ５６アミノ酸配列。 図４Ａ〜４Ｄは、ワクシニアウイルスの一般的な株のＢ５ＲヌクレオチドおよびＢ５アミノ酸配列の整列を提供する。Ａ〜Ｃ）遺伝子間および遺伝子に渡るヌクレオチドの位置を示す、コペンハーゲン（配列番号４３）、アンカラ（配列番号４４）、ＩＨＤ−Ｊ（配列番号４５）、リスター（配列番号４６）、天壇（配列番号４７）、ウェスタンリザーブ（配列番号４８）、およびワイエス（配列番号４９）のＢ５Ｒヌクレオチド配列。 図４Ａ〜４Ｄは、ワクシニアウイルスの一般的な株のＢ５ＲヌクレオチドおよびＢ５アミノ酸配列の整列を提供する。Ａ〜Ｃ）遺伝子間および遺伝子に渡るヌクレオチドの位置を示す、コペンハーゲン（配列番号４３）、アンカラ（配列番号４４）、ＩＨＤ−Ｊ（配列番号４５）、リスター（配列番号４６）、天壇（配列番号４７）、ウェスタンリザーブ（配列番号４８）、およびワイエス（配列番号４９）のＢ５Ｒヌクレオチド配列。 図４Ａ〜４Ｄは、ワクシニアウイルスの一般的な株のＢ５ＲヌクレオチドおよびＢ５アミノ酸配列の整列を提供する。Ａ〜Ｃ）遺伝子間および遺伝子に渡るヌクレオチドの位置を示す、コペンハーゲン（配列番号４３）、アンカラ（配列番号４４）、ＩＨＤ−Ｊ（配列番号４５）、リスター（配列番号４６）、天壇（配列番号４７）、ウェスタンリザーブ（配列番号４８）、およびワイエス（配列番号４９）のＢ５Ｒヌクレオチド配列。 図４Ａ〜４Ｄは、ワクシニアウイルスの一般的な株のＢ５ＲヌクレオチドおよびＢ５アミノ酸配列の整列を提供する。Ａ〜Ｃ）遺伝子間および遺伝子に渡るヌクレオチドの位置を示す、コペンハーゲン（配列番号４３）、アンカラ（配列番号４４）、ＩＨＤ−Ｊ（配列番号４５）、リスター（配列番号４６）、天壇（配列番号４７）、ウェスタンリザーブ（配列番号４８）、およびワイエス（配列番号４９）のＢ５Ｒヌクレオチド配列。 図４Ａ〜４Ｄは、ワクシニアウイルスの一般的な株のＢ５ＲヌクレオチドおよびＢ５アミノ酸配列の整列を提供する。Ｄ）タンパク質間およびタンパク質に渡るアミノ酸の位置を示す、コペンハーゲン（配列番号５０）、アンカラ（配列番号５１）、ＩＨＤ−Ｊ（配列番号５２）、リスター（配列番号５３）、天壇（配列番号５４）、ウェスタンリザーブ（配列番号５５）、およびワイエス（配列番号５６）のＢ５アミノ酸配列。 図４Ａ〜４Ｄは、ワクシニアウイルスの一般的な株のＢ５ＲヌクレオチドおよびＢ５アミノ酸配列の整列を提供する。Ｄ）タンパク質間およびタンパク質に渡るアミノ酸の位置を示す、コペンハーゲン（配列番号５０）、アンカラ（配列番号５１）、ＩＨＤ−Ｊ（配列番号５２）、リスター（配列番号５３）、天壇（配列番号５４）、ウェスタンリザーブ（配列番号５５）、およびワイエス（配列番号５６）のＢ５アミノ酸配列。 図５は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＥＥＶ変異体を同定するために用いられる定向進化プロセスの単一段階の模式的例を提供する。 図６は、異なるヒト初代癌細胞およびＶＥＧＦ刺激内皮細胞の感染後、増進された伝播およびＥＥＶ産生が可能な変異体を同定するための定向進化プロセスの多様なラウンドにおける、特定のワクシニアウイルス変異体の頻度に関するデータを示す。 図７Ａ〜７Ｂは、Ａ３３およびＡ３４置換を含有するワクシニアウイルス変異体のウイルス伝播およびＥＥＶ産生に関するデータを提供する。 図８Ａ〜８Ｄは、代表的ヒト癌細胞株における、感染サイクル初期に上清に放出される感染性ウイルス（潜在的にＥＥＶ）のワクシニアウイルス産生に関するデータを提供する。 図９Ａ〜９Ｂは、代表的ヒト癌細胞株における、ワクシニアウイルス伝播に関するデータを提供する。 図１０Ａ〜１０Ｂは、ＥＥＶ産生およびウイルス伝播に対する、Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換の非存在下での異なる変異体ワクシニアウイルス置換および置換の組み合わせに関するデータを提供する。 図１１Ａ〜１１Ｂは、ＥＥＶ産生およびウイルス伝播に対する、Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換に加えて、異なる変異体ワクシニアウイルス置換および置換の組み合わせに関するデータを提供する。 図１２Ａ〜１２Ｂは、ＨｅＬａ Ｓ３（子宮頸腺癌）細胞株における、物理的ＥＥＶ産生および特異的感染性における異なるワクシニアウイルス変異体に関するデータを提供する。 図１３Ａ〜１３Ｂは、ＥＥＶ産生およびウイルス伝播に対する、ウェスタンリザーブ株上のＡ３４におけるＫ１５１Ｅ置換と組み合わせた異なる変異体ワクシニアウイルス置換に関するデータを提供する。 図１４は、ＨＣＴ−１１６ヒト結腸直腸癌細胞に対する感染および選択後の、増進されたウイルス伝播およびＥＥＶ産生が可能な変異体を同定するための定向進化プロセスの最終ラウンドにおける、特定のワクシニアウイルス変異体の頻度に関するデータを提供する。 図１５Ａ〜１５Ｆは、Ａ３４およびＡ５６置換を含有するさらなるワクシニアウイルス変異体のウイルス伝播およびＥＥＶ産生に関するデータを提供する。 図１５Ａ〜１５Ｆは、Ａ３４およびＡ５６置換を含有するさらなるワクシニアウイルス変異体のウイルス伝播およびＥＥＶ産生に関するデータを提供する。 図１６Ａ〜１６Ｂは、ワクシニアウイルス変異体のＡ３３およびＡ３４アミノ酸配列の整列を提供する。Ａ）タンパク質間およびタンパク質に渡るアミノ酸の位置を示す、コペンハーゲン（配列番号８）、Ｍ６３Ｒ置換（配列番号５７）、Ａ８８Ｄ置換（配列番号５８）、Ｅ１２９Ｍ置換（配列番号５９）、ならびにＡ８８ＤおよびＥ１２９Ｍ置換（配列番号６０）のＡ３３アミノ酸配列。Ｂ）タンパク質間およびタンパク質に渡るアミノ酸の位置を示す、コペンハーゲン（配列番号２２）、Ｍ６６Ｔ置換（配列番号６１）、Ｆ９４Ｈ置換（配列番号６２）、Ｋ１５１Ｅ置換（配列番号６３）、Ｆ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（配列番号６４）、Ｒ８４Ｇ置換（配列番号６５）、Ｒ９１Ａ置換（配列番号８１）、Ｒ９１Ｓ置換（配列番号６６）、ならびにＴ１２７Ｅ置換（配列番号６７）のＡ３４アミノ酸配列。 ワクシニアウイルスライブラリーでのＣｏｌｏ ２０５ヒト結腸直腸癌細胞の感染後の増進されたウイルス伝播およびＥＥＶ産生が可能な変異体を同定するための、定向進化プロセスの最終ラウンドにおける特定のワクシニアウイルスの頻度に関するデータを提供する。 図１８Ａ〜１８Ｂは、ワクシニアウイルスをワクチン接種されたドナー由来の血清の非存在下または存在下での、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞の感染後の、増進されたウイルス伝播およびＥＥＶ産生が可能な変異体を同定するための、定向進化プロセスの最終ラウンドにおける特定のワクシニアウイルス変異体の頻度に関するデータを提供する。 図１９Ａ〜１９Ｂは、Ｂ５置換を含有するワクシニアウイルス変異体のウイルス伝播およびＥＥＶ産生に関するデータを提供する。 図２０Ａ〜２０Ｄは、代表的ヒト癌細胞株における上清中のワクシニアウイルス感染性ビリオン（潜在的にＥＥＶ）に関するデータを提供する。 図２１Ａ〜２１Ｂは、ｉｎ ｖｉｖｏで増進された伝播が可能である変異体を同定するための、定向進化プロセスにおける特定のワクシニアウイルス変異体の頻度に関するデータを提供する。 図２２Ａ〜Ｄは、Ａ３３／Ａ３４またはＢ５置換を含有するさらなるワクシニアウイルス変異体のウイルス伝播およびＥＥＶ産生に対するデータを提供する。 図２２Ａ〜Ｄは、Ａ３３／Ａ３４またはＢ５置換を含有するさらなるワクシニアウイルス変異体のウイルス伝播およびＥＥＶ産生に対するデータを提供する。 図２３は、ワクシニアウイルス変異体のＢ５アミノ酸配列の整列を提供する。タンパク質間およびタンパク質に渡るアミノ酸の位置を示す、コペンハーゲン（配列番号５０）、Ｎ９４Ｔ置換（配列番号６８）、Ｓ１９７Ｆ置換（配列番号８２）、Ｓ１９７Ｖ置換（配列番号８３）、Ｓ１９９Ｍ置換（配列番号６９）、Ｓ２７３Ｉ置換（配列番号７０）、Ｎ３９ＧおよびＳ２７３Ｉ置換（配列番号７１）、Ｌ９０ＲおよびＳ２７３Ｖ置換（配列番号７２）、Ｋ２２９ＣおよびＳ２７３Ｌ置換（配列番号７３）、Ｖ２３３Ｄ、Ｉ２３６Ｌ、Ｖ２３８Ｗ、Ｔ２４０Ｙ、およびＥ２４３Ｒ置換（配列番号７４）、Ｉ２３６Ｐ、Ｖ２３８Ｒ、Ｔ２４０Ｒ、およびＥ２４３Ｇ置換（配列番号７５）、Ｎ２４１Ｔ、Ｅ２４３Ｖ、Ｖ２４７Ｓ、Ｇ２５０Ｒ、およびＡ２７６Ｆ置換（配列番号７６）、Ｎ２４１Ｇ、Ｅ２４３Ｓ、Ｖ２４７Ｗ、Ｄ２４８Ｙ、Ｇ２５０Ａ、およびＡ２７６Ｆ置換（配列番号７７）、Ｄ２６３Ａ、Ｅ２７０Ｓ、Ｅ２７２Ｇ、およびＥ２７５Ｆ置換（配列番号７８）、ならびにＤ２６３Ｖ、Ｅ２６８Ｔ、Ｅ２７０Ｇ、Ｅ２７２Ｐ、およびＥ２７５Ｓ置換（配列番号７９）のＢ５タンパク質配列。 図２３は、ワクシニアウイルス変異体のＢ５アミノ酸配列の整列を提供する。タンパク質間およびタンパク質に渡るアミノ酸の位置を示す、コペンハーゲン（配列番号５０）、Ｎ９４Ｔ置換（配列番号６８）、Ｓ１９７Ｇ置換（配列番号８２）、Ｓ１９７Ｖ置換（配列番号８３）、Ｓ１９９Ｍ置換（配列番号６９）、Ｓ２７３Ｉ置換（配列番号７０）、Ｎ３９ＧおよびＳ２７３Ｉ置換（配列番号７１）、Ｌ９０ＲおよびＳ２７３Ｖ置換（配列番号７２）、Ｋ２２９ＣおよびＳ２７３Ｌ置換（配列番号７３）、Ｖ２３３Ｄ、Ｉ２３６Ｌ、Ｖ２３８Ｗ、Ｔ２４０Ｙ、およびＥ２４３Ｒ置換（配列番号７４）、Ｉ２３６Ｐ、Ｖ２３８Ｒ、Ｔ２４０Ｒ、およびＥ２４３Ｇ置換（配列番号７５）、Ｎ２４１Ｔ、Ｅ２４３Ｖ、Ｖ２４７Ｓ、Ｇ２５０Ｒ、およびＡ２７６Ｆ置換（配列番号７６）、Ｎ２４１Ｇ、Ｅ２４３Ｓ、Ｖ２４７Ｗ、Ｄ２４８Ｙ、Ｇ２５０Ａ、およびＡ２７６Ｆ置換（配列番号７７）、Ｄ２６３Ａ、Ｅ２７０Ｓ、Ｅ２７２Ｇ、およびＥ２７５Ｆ置換（配列番号７８）、ならびにＤ２６３Ｖ、Ｅ２６８Ｔ、Ｅ２７０Ｇ、Ｅ２７２Ｐ、およびＥ２７５Ｓ置換（配列番号７９）のＢ５タンパク質配列。 図２４は、ワクシニアウイルス変異体のＡ５６アミノ酸配列の整列を提供する。タンパク質間およびタンパク質に渡るアミノ酸の位置を示す、コペンハーゲン（配列番号３６）およびＩ２６９Ｆ置換（配列番号８０）のＡ５６アミノ酸配列。
定義
本発明を記載する前に、本開示の背景で用いるいくつかの用語を定義する。これらの用語に加えて、必要に応じて他のものを、本明細書の別の箇所に定義する。本明細書に明らかに定義しない限り、本明細書で用いる技術分野の用語は、技術分野に認識される意味を有するであろう。
用語「腫瘍溶解性」ワクシニアウイルスは、正常（非癌性）細胞に比較して、癌細胞に優先的に感染し、そして癌細胞を優先的に殺す、ワクシニアウイルスを指す。
用語「異種」は、それぞれ、天然核酸またはタンパク質に見られない、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指す。例えば、本開示の組換えワクシニアウイルスの背景において、「異種」免疫調節ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、ワクシニアウイルスに天然には見られない、すなわち、コードされる免疫調節ポリペプチドが、天然存在ワクシニアウイルスによってはコードされない、核酸である。
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において交換可能に用いられ、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれであっても、任意の長さのヌクレオチドのポリマー型を指す。したがって、この用語には、限定されるわけではないが、一本鎖、二本鎖または多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリンおよびピリミジン塩基または他の天然の、化学的もしくは生化学的修飾された、非天然、もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。
本明細書において、用語「治療」、「治療する」等は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に防止する観点で、予防的であってもよいし、そして／または疾患および／または疾患に寄与しうる副作用の部分的または完全な治癒の観点で、療法的であってもよい。「治療」は、本明細書において、哺乳動物、例えばヒトにおいて疾患のいかなる治療も含み、そしてこれには：（ａ）疾患に対する素因がありうるが、該疾患を有するとはまだ診断されていない被験体において、疾患が生じることを防止すること；（ｂ）疾患を阻害する、すなわち該疾患の発展を抑止すること；および（ｃ）疾患を軽減させる、すなわち疾患の後退を引き起こすことが含まれる。
用語「個体」、「被験体」、「宿主」、および「患者」は、本明細書において交換可能に用いられ、限定されるわけではないが、ネズミ（例えばラット、マウス）、ウサギ目（ｌａｇｏｍｏｒｐｈ）（例えばウサギ（ｒａｂｂｉｔ））、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）、ネコ（ｆｅｌｉｎｅ）、有蹄動物（ｕｎｇｕｌａｔｅ）（例えばウマ（ｅｑｕｉｎｅ）、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、ヤギ（ｃａｐｒｉｎｅ））等を含む哺乳動物を指す。
「療法的有効量」または「有効量」は、疾患を治療するために哺乳動物または他の被験体に投与された際に、疾患のこうした治療を達成するために十分である、剤（例えば、本開示の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス）の量、または２つの剤（例えば、本開示の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび第二の療法剤）の組み合わせた量を指す。「療法的有効量」は、剤（単数または複数）、疾患およびその重症度、ならびに治療しようとする被験体の年齢、体重等に応じて多様であろう。
用語「変異体」ポリペプチドは；前記変異体が本明細書に定義するような生物学的活性を有するならば、そのアミノ酸配列が、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも９０％であるが、１００％未満の同一性を示すポリペプチドを指す。変異体は、１つまたはそれより多いアミノ酸の挿入、置換、または欠失のような修飾による、参照ポリペプチドのアミノ酸配列の修飾によってもたらされうる。したがって、用語「変異体」ポリペプチドは、所望の生物学的特性を与える十分な数の隣接アミノ酸残基を含む、参照ポリペプチドの断片を含む。
用語「置換」は、ポリペプチド中の１つのアミノ酸の異なるアミノ酸での置き換えを指す。本開示の背景において、変異体における置換は：元来のアミノ酸−位−置換アミノ酸として示される。したがって、表記「Ｋ１５１Ｅ」は、変異体が、親ポリペプチドの１５１位のアミノ酸に対応する変異体アミノ酸位で、リジン（Ｋ）のグルタミン酸（Ｅ）での置換を含むことを意味する。
本発明をさらに記載する前に、本発明は、記載するいかなる特定の態様にも限定されず、こうしたものとしてもちろん、多様でありうることが理解されるものとする。本発明の範囲は付随する請求項によってのみ限定されるであろうため、本明細書に用いる用語が、特定の態様を記載する目的のみのためであり、そして限定することは意図されないこともまた理解されるものとする。
ある範囲の値を提供する場合、文脈が明らかに別に示さない限り、下限単位の１／１０までの介在する値各々は、範囲の上限および下限の間で、そしてその言及する範囲内のいかなる他の言及するまたは介在する値もいずれも、本発明内に含まれることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立により小さい範囲内に含まれてもよく、そしてまた、言及する範囲において、任意の特に排除される限界次第で、本発明に含まれる。言及する範囲に、限界の一方または両方が含まれる場合、こうした含まれる限界のいずれかまたは両方が排除された範囲もまた、本発明に含まれる。
別に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術的および化学的用語は、本発明が属する技術分野の一般の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似のまたは同等のいかなる方法および材料もまた、本発明の実施または試験において用いられてもよいが、好ましい方法および材料をここで記載する。本明細書で言及するすべての刊行物は、刊行物が引用されるものと関連した方法および／または材料を開示し、そして記載するため、本明細書に援用される。
本明細書において、そして付随する請求項において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、背景が別に明らかに示さない限り、複数の参照物が含まれることに注目しなければならない。したがって、例えば、「（単数の）ワクシニアウイルス」に対する言及には、複数のこうしたワクシニアウイルスが含まれ、そして「（単数の）Ａ３３ポリペプチド」への言及には、１つまたはそれより多いＡ３３ポリペプチドおよび当業者に知られるその同等物への言及が含まれるなどである。請求項は、いかなる場合による要素も排除するよう起草される可能性もあることがさらに注目される。こうしたものとして、この言及は、「もっぱら」、「のみ」等の排除性の用語の、請求項要素の列挙と組み合わせての使用、または「負の」限定の使用のための先行詞として働くと意図される。
明確にするために、別個の態様の背景で記載される本発明の特定の特徴はまた、単一の態様において組み合わせて提供されてもよいことが認識される。逆に、簡潔にするために、単一の態様の背景で記載される本発明の多様な特徴はまた、別個に、または任意の適切なサブコンビネーションで提供されてもよい。本発明に関する態様のすべての組み合わせは、本発明に特に含まれ、そして各々のそしてすべての組み合わせが、個々にそして明確に開示されるのと同じように、本明細書に開示される。さらに、多様な態様およびその要素のすべてのサブコンビネーションもまた、本発明に特に含まれ、そして各々のそしてすべてのこうしたサブコンビネーションが、本明細書に個々にそして明確に開示されるのと同じように、本明細書に開示される。
本明細書で論じる刊行物は、単に本出願の出願日の前の開示に関して提供される。本明細書のなにものも、本発明が以前の発明のためにこうした刊行物に先行する資格がないことの承認と見なされてはならない。さらに、提供する刊行物の日付は、実際の公開日とは異なる可能性もあり、これは独立に確認する必要がありうる。
腫瘍溶解性ワクシニアウイルス
本開示は、所望の腫瘍溶解特性を示す、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（「腫瘍溶解性ワクシニアウイルス」または「ＯＶＶ」とも称される）を提供する。該ウイルスは、任意のワクシニアウイルス株、好ましくはエルスツリー、ワイエス、コペンハーゲンおよびウェスタンリザーブ株に由来してもよい。別に示さない限り、本明細書で用いる遺伝子命名は、コペンハーゲンワクシニアウイルス株のものである。ＯＶＶは、遺伝子産物の産生、活性、機能、または任意の他の特性を変化させる、１つまたはそれより多いウイルス遺伝子の改変（例えば、ウイルス遺伝子またはその制御要素内の１つまたはそれより多いヌクレオチドの欠失、挿入、置換）ならびに／あるいは外因性ポリペプチド（すなわちウイルスによって天然には発現されないポリペプチド）をコードする１つまたはそれより多い導入遺伝子の挿入によって、親ワクシニアウイルスに由来してもよい。
いくつかの側面において、本開示は、変異体ウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＯＶＶであって、変異体ウイルスポリペプチドがウイルスの１つまたはそれより多い増進された腫瘍溶解特性、例えば増進されたウイルス伝播または増進されたＥＥＶ産生を提供する、前記ＯＶＶを提供する。ウイルス伝播またはＥＥＶ産生に対する変異体ウイルスポリペプチドの影響は、本明細書に提供される実施例に記載される方法、ならびに当該技術分野に知られる任意の他の適切な方法を用いて決定されうる。
いくつかの態様において、ＯＶＶは、変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して（例えば野生型Ａ３３ポリペプチド、例えば図１Ｃに示すアミノ酸配列を有するＡ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する、変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの他の態様において、本開示は、変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して（例えば野生型Ａ３４ポリペプチド、例えば図２Ｃに示すアミノ酸配列を有するＡ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する、変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＯＶＶを提供する。いくつかのさらなる態様において、本開示は、変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して（例えば野生型Ｂ５ポリペプチド、例えば図４Ｄに示すアミノ酸配列を有するＢ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）、増進されたウイルス伝播および／またはＥＥＶ産生を提供する１つまたはそれより多いアミノ酸置換を含む、変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＯＶＶを提供する。いくつかのさらにさらなる態様において、本開示は、変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を任意の組み合わせで含む、ＯＶＶを提供する。適切な対照の例には、実施例に記載するようなＩＧＶ−００７およびＩＧＶ−００６が含まれる。増進されたウイルス伝播および／またはＥＥＶ産生を提供する変異体Ａ３３ポリペプチド、変異体Ａ３４ポリぺプチド、および変異体Ｂ５ポリペプチドの例を以下に詳細に記載する。
いくつかの場合、本開示のＯＶＶは、ａ）変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ｂ）増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供するいかなるアミノ酸置換も含まない、Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびにｃ）増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供するいかなるアミノ酸置換も含まない、Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合、本開示のＯＶＶは：ａ）変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ｂ）野生型Ａ３４ポリペプチド（例えば、天然存在アミノ酸配列を有するＡ３４ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列；ならびにｃ）野生型Ｂ５ポリペプチド（例えば、天然存在アミノ酸配列を有するＢ５ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの場合、本開示のＯＶＶは：ａ）変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ｂ）増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供するいかなるアミノ酸置換も含まない、Ａ３３ポリペプチド（例えば、野生型Ａ３３ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列；ならびにｃ）増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供するいかなるアミノ酸置換も含まない、Ｂ５ポリペプチド（例えば、野生型Ｂ５ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合、本開示のＯＶＶは：ａ）変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ｂ）野生型Ａ３３ポリペプチド（例えば、天然存在アミノ酸配列を有するＡ３３ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列；ならびにｃ）野生型Ｂ５ポリペプチド（例えば、天然存在アミノ酸配列を有するＢ５ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの場合、本開示のＯＶＶは：ａ）変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ｂ）増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供するいかなるアミノ酸置換も含まない、Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびにｃ）増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供するいかなるアミノ酸置換も含まない、Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合、本開示のＯＶＶは：ａ）変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ｂ）野生型Ａ３３ポリペプチド（例えば、天然存在アミノ酸配列を有するＡ３３ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列；ならびにｃ）野生型Ａ３４ポリペプチド（例えば、天然存在アミノ酸配列を有するＡ３４ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの場合、本開示のＯＶＶは：ａ）変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して（例えば野生型Ａ３３ポリペプチド、例えば図１Ｃに示すアミノ酸配列を有するＡ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する、変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ｂ）変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して（例えば野生型Ａ３４ポリペプチド、例えば図２Ｃに示すアミノ酸配列を有するＡ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する、変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびにｃ）野生型Ｂ５ポリペプチド（例えば、天然存在アミノ酸配列を有するＢ５ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの場合、本開示のＯＶＶは：ａ）変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して（例えば野生型Ａ３３ポリペプチド、例えば図１Ｃに示すアミノ酸配列を有するＡ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する、変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ｂ）変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して（例えば野生型Ｂ５ポリペプチド、例えば図４Ｄに示すアミノ酸配列を有するＢ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する、変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびにｃ）野生型Ａ３４ポリペプチド（例えば、天然存在アミノ酸配列を有するＡ３４ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの場合、本開示のＯＶＶは：ａ）変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して（例えば野生型Ａ３４ポリペプチド、例えば図２Ｃに示すアミノ酸配列を有するＡ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する、変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ｂ）変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して（例えば野生型Ｂ５ポリペプチド、例えば図４Ｄに示すアミノ酸配列を有するＢ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する、変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびにｃ）野生型Ａ３３ポリペプチド（例えば、天然存在アミノ酸配列を有するＡ３３ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの場合、本開示のＯＶＶは：ａ）変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して（例えば野生型Ａ３３ポリペプチド、例えば図１Ｃに示すアミノ酸配列を有するＡ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する、変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ｂ）変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して（例えば野生型Ａ３４ポリペプチド、例えば図２Ｃに示すアミノ酸配列を有するＡ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する、変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびにｃ）変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して（例えば野生型Ｂ５ポリペプチド、例えば図４Ｄに示すアミノ酸配列を有するＢ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する、変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの場合、本開示のＯＶＶは、本明細書に記載するような変異体Ａ３３ポリペプチドおよび／または変異体Ａ３４ポリペプチドおよび／または変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して、増加したウイルス伝播および／または増加したＥＥＶ産生を示す。例えば、いくつかの場合、変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および／または変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および／または変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む本開示のＯＶＶは、変異体Ａ３３ポリペプチドおよび／または変異体Ａ３４ポリペプチドおよび／または変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（単数または複数）を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％（または２倍）、少なくとも２．５倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、または２５倍より高い伝播を示す。所定の変異体Ａ３３ポリペプチド、所定の変異体Ａ３４ポリペプチド、所定のＢ５ポリペプチド、あるいは所定のＡ３３ポリペプチド、所定の変異体Ａ４５ポリペプチド、および所定の変異体Ｂ５ポリペプチドの２つまたは３つの組み合わせが、対照に比較して増加したウイルス伝播を提供するかどうかは、本明細書の実施例に記載するような方法、例えば実施例２に記載するＵ−２ ＯＳ細胞を用いた２段階感染性アッセイを含む、任意の既知の方法を用いて決定可能である。２段階感染性アッセイは、（１）ワクシニアウイルスの感染多重度（ＭＯＩ）の異なる３倍希釈でＵ−２細胞を感染させ、（２）感染２２時間後、上清を収集し、（３）Ｕ−２ ＯＳ細胞の新規プレートを上清で感染させ、そして（４）感染１５時間後にウイルスから発現されるルシフェラーゼを測定する工程を含み、ルシフェラーゼレベルの増加が、ウイルス伝播の増加の指標となる。
いくつかの場合、変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または変異体Ａ３３、Ａ３４、およびＢ５ポリペプチドの任意の組み合わせをコードするヌクレオチド配列を含む本開示のＯＶＶは、対応する野生型Ａ３３、Ａ３４、およびＢ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（単数または複数）を含む対照ワクシニアウイルスに比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％（または２倍）、少なくとも２．５倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、または２５倍より高いＥＥＶ産生を示す。所定の変異体Ａ３３ポリペプチド、所定の変異体Ａ３４ポリペプチド、所定の変異体Ｂ５ポリペプチド、あるいは所定のＡ３３ポリペプチド、所定の変異体Ａ４５ポリペプチド、および所定のＢ５ポリペプチドの２つまたは３つの組み合わせが、対照に比較して増加したＥＥＶ産生を提供するかどうかは、本明細書の実施例に記載するような方法、例えば実施例３に記載するプラークアッセイを含む、任意の既知の方法を用いて決定可能である。プラークアッセイは、（１）１つまたはそれより多い細胞株をウイルスに感染させ、（２）ウイルス吸着の１時間後に細胞を洗浄し、（３）感染２４時間後、上清（潜在的にＥＥＶ）を収集し、そして（４）プラークアッセイを通じて、上清中で産生された感染性ウイルスの数を決定する工程を含む。
いくつかの場合、本開示のＯＶＶは、本明細書に記載するような変異体Ａ３３ポリペプチドおよび／または変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して、増加したウイルス伝播および／または増加したＥＥＶ産生を示す。例えば、いくつかの場合、変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および／または変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む本開示のＯＶＶは、変異体Ａ３３ポリペプチドおよび／または変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（単数または複数）を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して（例えば、野生型Ａ３３ポリペプチド、例えば図１Ｃに示すアミノ酸配列を有するＡ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む；そして／または野生型Ａ３４ポリペプチド、例えば図２Ｃに示すアミノ酸配列を有するＡ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％（または２倍）、少なくとも２．５倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、または２５倍より高い伝播を示す。所定の変異体Ａ３３ポリペプチド、所定のＡ３４ポリペプチド、または所定のＡ３３ポリペプチドおよび所定の変異体Ａ３４ポリペプチドの組み合わせが、対照に比較して増加したウイルス伝播を提供するかどうかは、本明細書の実施例に記載するような方法を含む、任意の既知の方法を用いて決定可能である。
いくつかの場合、変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および／または変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む本開示のＯＶＶは、変異体Ａ３３ポリペプチドおよび／または変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（単数または複数）を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して（例えば、野生型Ａ３３ポリペプチド、例えば図１Ｃに示すアミノ酸配列を有するＡ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む；そして／または野生型Ａ３４ポリペプチド、例えば図２Ｃに示すアミノ酸配列を有するＡ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％（または２倍）、少なくとも２．５倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、または２５倍より高いＥＥＶ産生を示す。所定の変異体Ａ３３ポリペプチド、所定の変異体Ａ３４ポリペプチド、または所定の変異体Ａ３３ポリペプチドおよび所定の変異体Ａ３４ポリペプチドの組み合わせが、対照に比較して増加したＥＥＶ産生を提供するかどうかは、本明細書の実施例に記載するような方法を含む、任意の既知の方法を用いて決定可能である。
いくつかの場合、本開示のＯＶＶは、本明細書に記載するような変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して（例えば、野生型Ｂ５ポリペプチド、例えば図４Ｄに示すアミノ酸配列を有するＢ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）、増加したウイルス伝播および／または増加したＥＥＶ産生を示す。例えば、いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む本開示のＯＶＶは、変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して（例えば、野生型Ｂ５ポリペプチド、例えば図４Ｄに示すアミノ酸配列を有するＢ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％（または２倍）、少なくとも２．５倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、または２５倍より高い伝播を示す。所定の変異体Ｂ５ポリペプチドが、対照に比較して増加したウイルス伝播を提供するかどうかは、本明細書の実施例に記載するような方法を含む、任意の既知の方法を用いて決定可能である。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む本開示のＯＶＶは、変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して（例えば、野生型Ｂ５ポリペプチド、例えば図４Ｄに示すアミノ酸配列を有するＢ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％（または２倍）、少なくとも２．５倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、または２５倍より高いＥＥＶ産生を示す。所定の変異体Ｂ５ポリペプチドが、対照に比較して増加したＥＥＶ産生を提供するかどうかは、本明細書の実施例に記載するような方法を含む、任意の既知の方法を用いて決定可能である。
いくつかの場合、本開示のＯＶＶを用いて産生される感染性ビリオンの少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または７５％より多くは、ＥＥＶである。いくつかの場合、本開示のＯＶＶを用いて産生される総物理的ウイルス粒子の少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または７５％より多くは、ＥＥＶである。
変異体Ａ３３ポリペプチド
ワクシニアウイルスの一般的な株のＡ３３ポリペプチドの野生型アミノ酸配列の例を図１Ｃに表し、そして配列番号８〜１４に示す。変異体Ａ３３ポリペプチドは、１つ、２つ、３つ、またはそれより多いアミノ酸突然変異、例えばアミノ酸番号付けが図１Ｃに示す番号付けに基づく場合（例えばアミノ酸番号付けが、コペンハーゲンＡ３３アミノ酸配列；配列番号８のアミノ酸番号付けに基づく場合）、例えばＭ６３、Ａ８８、およびＥ１２９の１つまたはそれより多くでの置換を含んでもよい。
いくつかの場合、変異体Ａ３３ポリペプチドは、図１Ｃに示すＡ３３アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして６３位でＭｅｔ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ａ３３ポリペプチドは、図１Ｃに示すアミノ酸番号付けに基づいて、６３位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ａ３３ポリペプチドは、Ｍ６３Ｒ置換、Ｍ６３Ｈ、またはＭ６３Ｋ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ａ３３ポリペプチドは、Ｍ６３Ｒ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ａ３３ポリペプチドは、図１Ｃに示すＡ３３アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして８８位でＡｌａ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ａ３３ポリペプチドは、図１Ｃに示すアミノ酸番号付けに基づいて、８８位にＧｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ａ３３ポリペプチドは、Ａ８８Ｄ置換またはＡ８８Ｅ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ａ３３ポリペプチドは、Ａ８８Ｄ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ａ３３ポリペプチドは、図１Ｃに示すＡ３３アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして１２９位でＧｌｕ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ａ３３ポリペプチドは、図１Ｃに示すアミノ酸番号付けに基づいて、１２９位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ａ３３ポリペプチドは、Ｅ１２９Ｍ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ａ３３ポリペプチドは、図１Ｃに示すＡ３３アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；図１Ｃに示すアミノ酸番号付けに基づいて、６３位でＭｅｔ以外のアミノ酸を含み；そして図１Ｃに示すアミノ酸番号付けに基づいて、８８位でＡｌａ以外のアミノ酸を含む。いくつかの場合、変異体Ａ３３ポリペプチドは、図１Ｃに示すＡ３３アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そしてＭ６３Ｒ置換およびＡ８８Ｄ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ａ３３ポリペプチドは、図１Ｃに示すＡ３３アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；図１Ｃに示すアミノ酸番号付けに基づいて、６３位でＭｅｔ以外のアミノ酸を含み；そして図１Ｃに示すアミノ酸番号付けに基づいて、１２９位でＧｌｕ以外のアミノ酸を含む。いくつかの場合、変異体Ａ３３ポリペプチドは、図１Ｃに示すＡ３３アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そしてＭ６３Ｒ置換およびＥ１２９Ｍ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ａ３３ポリペプチドは、図１Ｃに示すＡ３３アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；図１Ｃに示すアミノ酸番号付けに基づいて、８８位でＡｌａ以外のアミノ酸を含み；そして図１Ｃに示すアミノ酸番号付けに基づいて、１２９位でＧｌｕ以外のアミノ酸を含む。いくつかの場合、変異体Ａ３３ポリペプチドは、図１Ｃに示すＡ３３アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そしてＡ８８Ｄ置換およびＥ１２９Ｍ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ａ３３ポリペプチドは、図１Ｃに示すＡ３３アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；図１Ｃに示すアミノ酸番号付けに基づいて、６３位でＭｅｔ以外のアミノ酸を含み；図１Ｃに示すアミノ酸番号付けに基づいて、８８位でＡｌａ以外のアミノ酸を含み；そして図１Ｃに示すアミノ酸番号付けに基づいて、１２９位でＧｌｕ以外のアミノ酸を含む。いくつかの場合、変異体Ａ３３ポリペプチドは、図１Ｃに示すＡ３３アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そしてＭ６３Ｒ置換、Ａ８８Ｄ置換、およびＥ１２９Ｍ置換を含む。
変異体Ａ３４ポリペプチド
ワクシニアウイルスの一般的な株のＡ３４ポリペプチドの野生型アミノ酸配列の例を図２Ｃに表し、そして配列番号２２〜２８に示す。変異体Ａ３４ポリペプチドは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれより多いアミノ酸突然変異、アミノ酸番号付けが図２Ｃに示す番号付けに基づく場合（例えばアミノ酸番号付けが、コペンハーゲンＡ３４アミノ酸配列；配列番号２２のアミノ酸番号付けに基づく場合）、例えばＭ６６、Ｆ９４、Ｒ８４、Ｒ９１、およびＴ１２７の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つでのアミノ酸置換を含んでもよい。
いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、図２Ｃに示すＡ３４アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして６６位でＭｅｔ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、図２Ｃに示すアミノ酸番号付けに基づいて、６６位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、Ｍ６６Ｔ置換またはＭ６６Ｓ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドはＭ６６Ｔ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、１５１位にＬｙｓを含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、１５１位にＧｌｕを含む。
いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、図２Ｃに示すＡ３４アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして９４位でＰｈｅ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、図２Ｃに示すアミノ酸番号付けに基づいて、９４位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、Ｆ９４Ｈ置換、Ｆ９４Ｒ置換、またはＦ９４Ｋ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、Ｆ９４Ｈ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、１５１位でＬｙｓを含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、１５１位でＧｌｕを含む。
いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、図２Ｃに示すＡ３４アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして８４位でＡｒｇ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、図２Ｃに示すアミノ酸番号付けに基づいて、８４位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、Ｒ８４Ｇ置換、Ｒ８４Ａ置換、Ｒ８４Ｉ置換、Ｒ８４Ｌ置換、またはＲ８４Ｖ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、Ｒ８４Ｇ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、１５１位でＬｙｓを含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、１５１位でＧｌｕを含む。
いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、図２Ｃに示すＡ３４アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして９１位でＡｒｇ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、図２Ｃに示すアミノ酸番号付けに基づいて、９１位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、Ｒ９１Ｓ置換、Ｒ９１Ａ置換、またはＲ９１Ｔ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、Ｒ９１Ｓ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、Ｒ９１Ａ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、１５１位でＬｙｓを含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、１５１位でＧｌｕを含む。
いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、図２Ｃに示すＡ３４アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして１２７位でＴｈｒ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、図２Ｃに示すアミノ酸番号付けに基づいて、１２７位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、Ｔ１２７Ｅ置換またはＴ１２７Ｄ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、Ｔ１２７Ｅ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、１５１位でＬｙｓを含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、１５１位でＧｌｕを含む。
いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、図２Ｃに示すＡ３４アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そしてアミノ酸番号付けが図２Ｃに示す番号付けに基づく場合、Ｍ６６、Ｆ９４、Ｒ８４、Ｒ９１、およびＴ１２７より選択される２つの位でアミノ酸置換を含む。したがって、例えばいくつかの場合、変異体Ａ３４は、Ｍ６６およびＦ９４；Ｍ６６およびＲ８４；Ｍ６６およびＲ９１；Ｍ６６およびＴ１２７；Ｆ９４およびＲ８４；ならびにＦ９４およびＦ９１；Ｆ９４およびＴ１２７；Ｒ８４およびＲ９１；Ｒ８４およびＴ１２７；またはＲ９１およびＴ１２７で置換を含む。いくつかの場合、Ｍ６６の置換はＭ６６Ｔ置換である。いくつかの場合、Ｆ９４の置換はＦ９４Ｈ置換である。いくつかの場合、Ｒ８４の置換はＲ８４Ｇ置換である。いくつかの場合、Ｒ９１の置換はＲ９１Ｓ置換である。いくつかの場合、Ｒ９１の置換はＲ９１Ａ置換である。いくつかの場合、Ｔ１２７の置換はＴ１２７Ｅ置換である。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、１５１位でＬｙｓを含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、１５１位でＧｌｕを含む。
いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、図２Ｃに示すＡ３４アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そしてアミノ酸番号付けが図２Ｃに示す番号付けに基づく場合、Ｍ６６、Ｆ９４、Ｒ８４、Ｒ９１、およびＴ１２７より選択される３つの位でアミノ酸置換を含む。したがって、例えばいくつかの場合、変異体Ａ３４は、Ｍ６６、Ｆ９４、およびＲ８４；Ｍ６６、Ｆ９４、およびＲ９１；Ｍ６６、Ｆ９４、およびＴ１２７；Ｆ９４、Ｒ８４、およびＲ９１；Ｒ９４、Ｒ８４、およびＴ１２７；Ｆ９４、Ｒ９１、およびＴ１２７；Ｒ８４、Ｒ９１、およびＴ１２７；Ｍ６６、Ｒ８４、およびＲ９１；またはＭ６６、Ｒ９１、およびＴ１２７で置換を含む。いくつかの場合、Ｍ６６の置換はＭ６６Ｔ置換である。いくつかの場合、Ｆ９４の置換はＦ９４Ｈ置換である。いくつかの場合、Ｒ８４の置換はＲ８４Ｇ置換である。いくつかの場合、Ｒ９１の置換はＲ９１Ｓ置換である。いくつかの場合、Ｒ９１の置換はＲ９１Ａ置換である。いくつかの場合、Ｔ１２７の置換はＴ１２７Ｅ置換である。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、１５１位でＬｙｓを含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、１５１位でＧｌｕを含む。
いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、図２Ｃに示すＡ３４アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そしてアミノ酸番号付けが図２Ｃに示す番号付けに基づく場合、Ｍ６６、Ｆ９４、Ｒ８４、Ｒ９１、およびＴ１２７より選択される４つの位でアミノ酸置換を含む。したがって、例えばいくつかの場合、変異体Ａ３４は、Ｍ６６、Ｆ９４、Ｒ８４、およびＲ９１；Ｍ６６、Ｆ９４、Ｒ８４、およびＴ１２７；Ｆ９４、Ｒ８４、Ｒ９１、およびＴ１２７；Ｍ６６、Ｒ８４、Ｒ９１、およびＴ１２７；またはＭ６６、Ｆ９４、Ｒ９１、およびＴ１２７で置換を含む。いくつかの場合、Ｍ６６の置換はＭ６６Ｔ置換である。いくつかの場合、Ｆ９４の置換はＦ９４Ｈ置換である。いくつかの場合、Ｒ８４の置換はＲ８４Ｇ置換である。いくつかの場合、Ｒ９１の置換はＲ９１Ｓ置換である。いくつかの場合、Ｒ９１の置換はＲ９１Ａ置換である。いくつかの場合、Ｔ１２７の置換はＴ１２７Ｅ置換である。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、１５１位でＬｙｓを含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、１５１位でＧｌｕを含む。
上記態様のいずれにおいても、変異体Ａ３４ポリペプチドは、図２Ｃに示す番号付けに基づいて、１５１位で、Ｌｙｓを有してもよい。上記態様のいずれにおいても、変異体Ａ３４ポリペプチドは、図２Ｃに示す番号付けに基づいて、１５１位に、Ｌｙｓ以外のアミノ酸を有してもよい。上記態様のいずれにおいても、変異体Ａ３４ポリペプチドは、図２Ｃに示す番号付けに基づいて、１５１位でＧｌｕを有してもよい。したがって、例えば、いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、図２Ｃに示すＡ３４アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そしてＦ９４でのアミノ酸置換およびＫ１５１でのアミノ酸置換を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、Ｆ９４Ｈ置換およびＫ１５１Ｅ置換を含む。
変異体Ａ３３ポリペプチドおよび変異体Ａ３４ポリペプチドの組み合わせ
上述のように、いくつかの場合、本開示のＯＶＶは：ａ）変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して（例えば野生型Ａ３３ポリペプチド、例えば図１Ｃに示すアミノ酸配列を有するＡ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する、変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；およびｂ）変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して（例えば野生型Ａ３４ポリペプチド、例えば図２Ｃに示すアミノ酸配列を有するＡ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する、変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
変異体Ａ３３ポリペプチドおよび変異体Ａ３４ポリペプチドの両方をコードするヌクレオチド配列を含む本開示のＯＶＶは、任意の組み合わせの上述の変異体Ａ３３ポリペプチドのいずれかおよび上述のＡ３４ポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。組み合わせの限定されない例を表２に示す。
したがって、例えばいくつかの場合、本開示のＯＶＶは：ａ）上述のように、Ｍ６３、Ａ８８、およびＥ１２９で１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換を含む変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびにｂ）上述のように、Ｍ６６、Ｆ９４、Ｒ８４、Ｒ９１、およびＴ１２７で１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのアミノ酸置換を含む変異体Ａ３４ポリペプチドを含む。
以下は、例示的な組み合わせであり、そして限定することを意味しない。
Ａ３３（Ａ８８Ｘ）およびＡ３４（Ｆ９４Ｘ）
例として、本開示のＯＶＶは、ａ）図１Ｃに示すＡ３３アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして図１Ｃに示すアミノ酸番号付けに基づいて、８８位でＡｌａ以外のアミノ酸を含む（例えば、変異体Ａ３３ポリペプチドは、８８位にＧｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む）、変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；およびｂ）図２Ｃに示すＡ３４アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして９４位でＰｈｅ以外のアミノ酸を含む（例えば、変異体Ａ３４ポリペプチドは、９４位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む）、変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、本開示のＯＶＶは、ａ）Ａ８８Ｄ置換を含む変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；およびｂ）Ｆ９４Ｈ置換を含む変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは１５１位でＬｙｓを含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは１５１位でＧｌｕを含む。例えば、いくつかの場合、本開示のＯＶＶは、ａ）Ａ８８Ｄ置換を含む変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；およびｂ）ｉ）Ｆ９４Ｈ置換；およびｉｉ）Ｋ１５１Ｅ置換を含む変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
Ａ３３（Ｅ１２９Ｘ）およびＡ３４（Ｆ９４Ｘ）
例えば、本開示のＯＶＶは、ａ）１２９位でＧｌｕ以外のアミノ酸を含む（例えば、変異体Ａ３３ポリペプチドは、１２９位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む）、変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；およびｂ）図２Ｃに示すＡ３４アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして９４位でＰｈｅ以外のアミノ酸を含む（例えば、変異体Ａ３４ポリペプチドは、９４位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む）、変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、本開示のＯＶＶは、ａ）Ｅ１２９Ｍ置換を含む変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；およびｂ）Ｆ９４Ｈ置換を含む変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは１５１位でＬｙｓを含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは１５１位でＧｌｕを含む。したがって、例えば、いくつかの場合、本開示のＯＶＶは、ａ）Ｅ１２９Ｍ置換を含む変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；およびｂ）ｉ）Ｆ９４Ｈ置換；およびｉｉ）Ｋ１５１Ｅ置換を含む変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
Ａ３３（Ａ８８Ｘ；およびＥ１２９Ｘ）およびＡ３４（Ｆ９４Ｘ）
例えば、本開示のＯＶＶは：ａ）図１Ｃに示すＡ３３アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そしてｉ）図１Ｃに示すアミノ酸番号付けに基づいて、８８位でＡｌａ以外のアミノ酸を含み（例えば、変異体Ａ３３ポリペプチドは、８８位にＧｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む）；そしてｉｉ）１２９位でＧｌｕ以外のアミノ酸を含む（例えば、変異体Ａ３３ポリペプチドは、１２９位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む）、変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；およびｂ）図２Ｃに示すＡ３４アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして９４位でＰｈｅ以外のアミノ酸を含む（例えば、変異体Ａ３４ポリペプチドは、９４位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む）、変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、本開示のＯＶＶは、ａ）ｉ）Ａ８８Ｄ置換；およびｉｉ）Ｅ１２９Ｍ置換を含む変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびにｂ）Ｆ９４Ｈ置換を含む変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは１５１位でＬｙｓを含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは１５１位でＧｌｕを含む。例えば、いくつかの場合、本発明のＯＶＶは、ａ）ｉ）Ａ８８Ｄ置換；およびｉｉ）Ｅ１２９Ｍ置換を含む変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびにｂ）ｉ）Ｆ９４Ｈ置換；およびｉｉ）Ｋ１５１Ｅ置換を含む変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
変異体Ａ５６ポリペプチド
上述の任意の態様において、いくつかの場合、本開示のＯＶＶは、図３Ｄに示すＡ５６アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；コードされる変異体Ａ５６ポリペプチドは、図３Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２６９位でＩｌｅ以外のアミノ酸を含む（例えば、変異体Ａ５６ポリペプチドは、２６９位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む）、変異体Ａ５６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、変異体Ａ５６ポリペプチドは、アミノ酸２６９でＰｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを含んでもよい。いくつかの場合、変異体Ａ５６ポリペプチドは、アミノ酸２６９でＰｈｅを含む。
例えば、本開示のＯＶＶは：ａ）図２Ｃに示すＡ３４アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして９１位でＡｒｇ以外のアミノ酸を含む（例えば、いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは、図２Ｃに示すアミノ酸番号付けに基づいて、９１位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む）、変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；およびｂ）図３Ｄに示すＡ５６アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；コードされる変異体Ａ５６ポリペプチドが、図３Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２６９位でＩｌｅ以外のアミノ酸を含む（例えば、変異体Ａ５６ポリペプチドは、２６９位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む）、変異体Ａ５６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、本開示のＯＶＶは：ａ）Ｒ９１Ｓ置換を含む変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；およびｂ）Ｉ２６９Ｆ置換を含む変異体Ａ５６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは１５１位でＬｙｓを含む。いくつかの場合、変異体Ａ３４ポリペプチドは１５１位でＧｌｕを含む。例えば、本開示のＯＶＶは、ａ）ｉ）Ｒ９１Ｓ置換およびｉｉ）Ｋ１５１Ｅ置換を含む変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびにｂ）Ｉ２６９Ｆ置換を含む変異体Ａ５６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
変異体Ｂ５ポリペプチド
いくつかの態様において、本開示によって提供されるＯＶＶは、変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。ワクシニアウイルスＢ５ポリペプチドの野生型アミノ酸配列の例を図４Ｄに表し、そして配列番号５０〜５６に示す。変異体Ｂ５ポリペプチドは、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれより多いアミノ酸突然変異を、アミノ酸番号付けが図４Ｄに示す番号付けに基づく場合、Ｎ３９、Ｌ９０、Ｎ９４、Ｓ１９７、Ｓ１９９、Ｋ２２９、Ｖ２３３、Ｉ２３６、Ｖ２３８、Ｔ２４０、Ｎ２４１、Ｅ２４３、Ｖ２４７、Ｄ２４８、Ｇ２５０、Ｄ２６３、Ｅ２６８、Ｅ２７０、Ｄ２７２、Ｓ２７３、Ｄ２７５、およびＡ２７６のアミノ酸位で含んでもよい。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、アミノ酸番号付けが図４Ｄに示す番号付けに基づく場合、Ｎ３９、Ｌ９０、Ｎ９４、Ｓ１９７、Ｓ１９９、Ｋ２２９、Ｖ２３３、Ｉ２３６、Ｖ２３８、Ｔ２４０、Ｎ２４１、Ｅ２４３、Ｖ２４７、Ｄ２４８、Ｇ２５０、Ｄ２６３、Ｅ２６８、Ｅ２７０、Ｅ２７２、Ｓ２７３、Ｅ２７５、およびＡ２７６の１つで単一アミノ酸置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、アミノ酸番号付けが図４Ｄに示す番号付けに基づく場合、Ｎ３９、Ｌ９０、Ｎ９４、Ｓ１９７、Ｓ１９９、Ｋ２２９、Ｖ２３３、Ｉ２３６、Ｖ２３８、Ｔ２４０、Ｎ２４１、Ｅ２４３、Ｖ２４７、Ｄ２４８、Ｇ２５０、Ｄ２６３、Ｅ２６８、Ｅ２７０、Ｅ２７２、Ｓ２７３、Ｅ２７５、およびＡ２７６より選択される位で２つのアミノ酸置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、アミノ酸番号付けが図４Ｄに示す番号付けに基づく場合、Ｎ３９、Ｌ９０、Ｎ９４、Ｓ１９７、Ｓ１９９、Ｋ２２９、Ｖ２３３、Ｉ２３６、Ｖ２３８、Ｔ２４０、Ｎ２４１、Ｅ２４３、Ｖ２４７、Ｄ２４８、Ｇ２５０、Ｄ２６３、Ｅ２６８、Ｅ２７０、Ｅ２７２、Ｓ２７３、Ｅ２７５、およびＡ２７６より選択される位で３つのアミノ酸置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、アミノ酸番号付けが図４Ｄに示す番号付けに基づく場合、Ｎ３９、Ｌ９０、Ｎ９４、Ｓ１９７、Ｓ１９９、Ｋ２２９、Ｖ２３３、Ｉ２３６、Ｖ２３８、Ｔ２４０、Ｎ２４１、Ｅ２４３、Ｖ２４７、Ｄ２４８、Ｇ２５０、Ｄ２６３、Ｅ２６８、Ｅ２７０、Ｅ２７２、Ｓ２７３、Ｅ２７５、およびＡ２７６より選択される位で４つのアミノ酸置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、アミノ酸番号付けが図４Ｄに示す番号付けに基づく場合、Ｎ３９、Ｌ９０、Ｎ９４、Ｓ１９７、Ｓ１９９、Ｋ２２９、Ｖ２３３、Ｉ２３６、Ｖ２３８、Ｔ２４０、Ｎ２４１、Ｅ２４３、Ｖ２４７、Ｄ２４８、Ｇ２５０、Ｄ２６３、Ｅ２６８、Ｅ２７０、Ｅ２７２、Ｓ２７３、Ｅ２７５、およびＡ２７６より選択される位で５つのアミノ酸置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、アミノ酸番号付けが図４Ｄに示す番号付けに基づく場合、Ｎ３９、Ｌ９０、Ｎ９４、Ｓ１９７、Ｓ１９９、Ｋ２２９、Ｖ２３３、Ｉ２３６、Ｖ２３８、Ｔ２４０、Ｎ２４１、Ｅ２４３、Ｖ２４７、Ｄ２４８、Ｇ２５０、Ｄ２６３、Ｅ２６８、Ｅ２７０、Ｅ２７２、Ｓ２７３、Ｅ２７５、およびＡ２７６より選択される位で６つのアミノ酸置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして３９位でＡｓｎ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、３９位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＮ３９Ｇ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして９０位でＬｅｕ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、９０位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＬ９０Ｒ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＬ９０Ｈ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＬ９０Ｋ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして９４位でＡｓｎ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、９４位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＮ９４Ｔ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＮ９４Ｓ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＮ９４Ｑ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして１９７位でＳｅｒ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、１９７位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＳ１９７Ｆ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＳ１９７Ｖ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして１９９位でＳｅｒ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、１９９位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＳ１９９Ｍ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＳ１９９Ｌ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＳ１９９Ｉ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして２２９位でＬｙｓ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、ｘｘ位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＫ２２９Ｃ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして２３３位でＶａｌ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、ｘｘ位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＶ２３３Ｄ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＶ２３３Ｅ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして２３６位でＩｌｅ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２３６位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＩ２３６Ｐ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＩ２３６Ｌ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドＩ２３６Ｃ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＩ２３６Ｖ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして２３８位でＶａｌ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２３８位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＶ２３８Ｒ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＶ２３８Ｈ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＶ２３８Ｋ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＶ２３８Ｗ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＶ２３８Ｙ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＶ２３８Ｆ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして２４０位でＴｈｒ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２４０位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＴ２４０Ｒ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＴ２４０Ｈ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＴ２４０Ｋ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＴ２４０Ｙ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＴ２４０Ｗ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＴ２４０Ｆ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして２４１位でＡｓｎ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２４１位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＮ２４１Ｔ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＮ２４１Ｓ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＮ２４１Ｑ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＮ２４１Ｇ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして２４３位でＧｌｕ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２４３位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２４３Ｇ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２４３Ｖ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２４３Ａ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２４３Ｉ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２４３Ｌ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２４３Ｓ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２４３Ｔ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２４３Ｒ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして２４７位でＶａｌ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２４７位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＶ２４７Ｓ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＶ２４７Ｔ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＶ２４７Ｎ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＶ２４７Ｑ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＶ２４７Ｗ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＶ２４７Ｙ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＶ２４７Ｆ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして２４８位でＡｓｐ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２４８位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＤ２４８Ｙ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＤ２４８Ｆ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＤ２４８Ｗ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして２５０位でＧｌｙ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２５０位にＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＧ２５０Ａ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＧ２５０Ｖ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＧ２５０Ｉ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＧ２５０Ｌ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＧ２５０Ｒ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＧ２５０Ｈ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＧ２５０Ｋ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして２６３位でＡｓｐ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２６３位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＤ２６３Ｖ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＤ２６３Ａ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＤ２６３Ｉ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＤ２６３Ｌ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして２６８位でＧｌｕ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２６８位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２６８Ｔ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２６８Ｓ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドＥ２６８Ｎ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２６８Ｑ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして２７０位でＧｌｕ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２７０位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２７０Ｓ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２７０Ｔ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドＥ２７０Ｎ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２７０Ｑ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２７０Ｇ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして２７２位でＧｌｕ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２７２位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２７２Ｇ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２７２Ｐ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして２７３位でＳｅｒ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２７３位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＳ２７３Ｉ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＳ２７３Ｌ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＳ２７３Ｖ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＳ２７３Ａ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして２７５位でＧｌｕ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２７５位にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２７５Ｆ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２７５Ｙ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２７５Ｗ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２７５Ｓ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２７５Ｔ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２７５Ｎ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＥ２７５Ｑ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして２７６位でＡｌａ以外のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２７６位にＧｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＡ２７６Ｆ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＡ２７６Ｙ置換を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドはＡ２７６Ｗ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、９０位でＬｅｕ以外のアミノ酸を含み；そして図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２７３位でＳｅｒ以外のアミノ酸を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そしてＬ９０Ｒ置換およびＳ２７３Ｖ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２２９位でＬｙｓ以外のアミノ酸を含み；そして図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２７３位でＳｅｒ以外のアミノ酸を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そしてＫ２２９Ｃ置換およびＳ２７３Ｌ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、３９位でＡｓｎ以外のアミノ酸を含み；そして図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２７３位でＳｅｒ以外のアミノ酸を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そしてＮ３９Ｇ置換およびＳ２７３Ｉ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２３６位でＩｌｅ以外のアミノ酸を含み；そして図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２３８位でＶａｌ以外のアミノ酸を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そしてＩ２３６Ｐ置換およびＶ２３８Ｒ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２３３位でＶａｌ以外のアミノ酸を含み；そして図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２３６位でＩｌｅ以外のアミノ酸を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そしてＶ２３３Ｄ置換およびＩ２３６Ｌ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２６３位でＡｓｐ以外のアミノ酸を含み；そして図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２６８位でＧｌｕ以外のアミノ酸を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そしてＤ２６３Ｖ置換およびＥ２６８Ｔ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２６３位でＡｓｐ以外のアミノ酸を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２７０位でＧｌｕ以外のアミノ酸を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２７２位でＧｌｕ以外のアミノ酸を含み；そして図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２７５位でＧｌｕ以外のアミノ酸を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そしてＤ２６３Ａ置換、Ｅ２７０Ｓ置換、Ｅ２７２Ｇ置換およびＥ２７５Ｆ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２３６位でＩｌｅ以外のアミノ酸を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２３８位でＶａｌ以外のアミノ酸を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２４０位でＴｈｒ以外のアミノ酸を含み；そして図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２４３位でＧｌｕ以外のアミノ酸を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そしてＩ２３６Ｐ置換、Ｖ２３８Ｒ置換、Ｔ２４０Ｒ置換、およびＥ２４３Ｇ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２３３位でＶａｌ以外のアミノ酸を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２３６位でＩｌｅ以外のアミノ酸を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２３８位でＶａｌ以外のアミノ酸を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２４０位でＴｈｒ以外のアミノ酸を含み；そして図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２４３位でＧｌｕ以外のアミノ酸を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そしてＶ２３３Ｄ置換、Ｉ２３６Ｌ置換、Ｖ２３８Ｗ置換、Ｔ２４０Ｙ置換、およびＥ２４３Ｒ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２４１位でＡｓｎ以外のアミノ酸を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２４３位でＧｌｕ以外のアミノ酸を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２４７位でＶａｌ以外のアミノ酸を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２５０位でＧｌｙ以外のアミノ酸を含み；そして図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２７６位でＡｌａ以外のアミノ酸を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そしてＮ２４１Ｔ置換、Ｅ２４３Ｖ置換、Ｖ２４７Ｓ置換、Ｇ２５０Ｒ置換、およびＡ２７６Ｆ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２６３位でＡｓｐ以外のアミノ酸を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２６８位でＧｌｕ以外のアミノ酸を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２７０位でＧｌｕ以外のアミノ酸を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２７２位でＧｌｕ以外のアミノ酸を含み；そして図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２７５位でＧｌｕ以外のアミノ酸を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そしてＤ２６３Ｖ置換、Ｅ２６８Ｔ置換、Ｅ２７０Ｇ置換、Ｅ２７２Ｐ置換、およびＥ２７５Ｓ置換を含む。
いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２４１位でＡｓｎ以外のアミノ酸を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２４３位でＧｌｕ以外のアミノ酸を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２４７位でＶａｌ以外のアミノ酸を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２４８位でＡｓｐ以外のアミノ酸を含み；図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２５０位でＧｌｙ以外のアミノ酸を含み；そして図４Ｄに示すアミノ酸番号付けに基づいて、２７６位でＡｌａ以外のアミノ酸を含む。いくつかの場合、変異体Ｂ５ポリペプチドは、図４Ｄに示すＢ５アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そしてＮ２４１Ｇ置換、Ｅ２４３Ｓ置換、Ｖ２４７Ｗ置換、Ｄ２４８Ｙ置換、Ｇ２５０Ａ置換、およびＡ２７６Ｆ置換を含む。
上述の態様の任意の１つにおいて、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスには、Ｋ１５１Ｅ置換を有する変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列がさらに含まれてもよい。例えば、変異体Ａ３４ポリペプチドは、図２Ｃに示すＡ３４アミノ酸配列に少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく；そしてＫ１５１Ｅ置換を含む。組み合わせの限定されない例を表２に示す。
変異体Ａ３４ポリペプチドおよび変異体Ｂ５ポリペプチド
いくつかの場合、本開示のＯＶＶは、変異体Ａ３４ポリペプチドおよび変異体Ｂ５ポリペプチドの両方をコードするヌクレオチド配列を含み；こうしたＯＶＶは、任意の組み合わせで、上記変異体Ａ３４ポリペプチドのいずれかおよび上記Ｂ５ポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。組み合わせの限定されない例を表２に示す。
１つの限定されない例として、本開示のＯＶＶは：ａ）Ｆ９４Ｈ置換を含む変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびにｂ）Ｎ３９Ｇ置換およびＳ２７３Ｉ置換を含む変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。別の限定されない例として、本開示のＯＶＶは：ａ）Ｆ９４Ｈ置換およびＫ１５１Ｅ置換を含む変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびにｂ）Ｎ３９Ｇ置換およびＳ２７３Ｉ置換を含む変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの構築
本開示のＯＶＶを、任意の多様なワクシニアウイルス株から構築してもよい。使用に適したワクシニアウイルス株の例には、限定されるわけではないが、リスター、ニューヨーク市衛生局（ＮＹＢＨ）、ワイエス、コペンハーゲン、ウェスタンリザーブ（ＷＲ）、修飾ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、ＥＭ６３、池田、ダリアン、ＬＩＶＰ、天壇、ＩＨＤ−Ｊ、タシケント、ベルン、パリ、大連株および誘導体などが含まれる。いくつかの場合、本開示のＯＶＶはコペンハーゲン株ワクシニアウイルスである。いくつかの場合、本開示のＯＶＶはＷＲ株ワクシニアウイルスである。
多様な株のワクシニアウイルスのゲノムのヌクレオチド配列は、当該技術分野に知られ、例えばＧｏｅｂｅｌら（１９９０） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７９：２４７； Ｇｏｅｂｅｌら（１９９０） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７９：５１７を参照されたい。コペンハーゲン株ワクシニアウイルスのヌクレオチド配列が知られており；例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第Ｍ３５０２７号を参照されたい。ＷＲ株ワクシニアウイルスのヌクレオチド配列が知られており；例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第ＡＹ２４３３１２号；およびＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第ＮＣ＿００６９９８号を参照されたい。ワクシニアウイルスのＷＲ株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）；ＡＴＣＣ ＶＲ−１３５４より入手可能である。
本開示のＯＶＶを構築するために用いられるワクシニアウイルスには、弱毒化および／または腫瘍選択的ワクシニアウイルスが含まれてもよい。本明細書において、「弱毒化」は、正常細胞（例えば非腫瘍細胞）に対する低い毒性（例えば低ウイルス複製、低細胞溶解活性、低細胞傷害活性）を意味する。本明細書において、「腫瘍選択的」は、正常細胞（例えば非腫瘍細胞）のものよりも高い腫瘍細胞に対する毒性（例えば腫瘍溶解性）を意味する。特定のタンパク質機能を欠損させるように、あるいは特定の遺伝子またはタンパク質の発現を抑制するように遺伝子修飾されているワクシニアウイルス（Ｇｕｓｅら（２０１１） Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：５９５）を、本開示の腫瘍溶解性ウイルスに用いてもよい。例えば、ワクシニアウイルスの腫瘍選択性を増加させるため、ワクシニア増殖因子（ＶＧＦ）の機能が欠損しているワクシニアウイルス（ＭｃＣａｒｔら（２００１） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６１：８７５１）；修飾ワクシニアウイルスＴＫ遺伝子、修飾赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子、および修飾Ｆ３遺伝子または中断されたＦ３遺伝子座を有するワクシニアウイルス（ＷＯ ２００５／０４７４５８）、ＶＧＦおよびＯ１Ｌの機能が欠損しているワクシニアウイルス（ＷＯ ２０１５／０７６４２２）；癌細胞において発現が減少しているマイクロＲＮＡのターゲット配列がＢ５Ｒ遺伝子の３’非コード領域内に挿入されているワクシニアウイルス（ＷＯ ２０１１／１２５４６９）；ＨＡおよびＦ１４．５Ｌの機能が欠損しているワクシニアウイルス（Ｚｈａｎｇら（２００７） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６７：１００３８）；リボヌクレオチドレダクターゼの機能が欠損しているワクシニアウイルス（Ｇａｍｍｏｎら（２０１０） ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ６：ｅ１０００９８４）；セリンプロテアーゼ阻害剤（例えばＳＰＩ−１、ＳＰＩ−２）の機能が欠損しているワクシニアウイルス（Ｇｕｏら（２００５） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６５：９９９１）；ＳＰＩ−１およびＳＰＩ−２の機能が欠損しているワクシニアウイルス（Ｙａｎｇら（２００７） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １４：６３８）；リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子Ｆ４ＬまたはＩ４Ｌの機能が欠損しているワクシニアウイルス（Ｃｈｉｌｄら（１９９０） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７４：６２５； Ｐｏｔｔｓら（２０１７） ＥＭＢＯ Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ９：６３８）；Ｂ１８Ｒ（コペンハーゲン株においてはＢ１９Ｒ）の機能が欠損しているワクシニアウイルス（Ｓｙｍｏｎｓら（１９９５） Ｃｅｌｌ ８１：５５１； Ｋｉｒｎら（２００７） ＰＬｏＳ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：ｅ３５３）；Ａ４８Ｒの機能が欠損しているワクシニアウイルス（Ｈｕｇｈｅｓら（１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２０１０３）；Ｂ８Ｒの機能が欠損しているワクシニアウイルス（Ｖｅｒａｒｄｉら（２００１） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７５：１１）；Ｂ１５Ｒ（コペンハーゲン株においてはＢ１６Ｒ）の機能が欠損しているワクシニアウイルス（Ｓｐｒｉｇｇｓら（１９９２） Ｃｅｌｌ ７１：１４５）；Ａ４１Ｒの機能が欠損しているワクシニアウイルス（Ｎｇら（２００１） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８２：２０９５）；Ａ５２Ｒの機能が欠損しているワクシニアウイルス（Ｂｏｗｉｅら（２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：１０１６２）；Ｆ１Ｌの機能が欠損しているワクシニアウイルス（Ｇｅｒｌｉｃら（２０１３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １１０：７８０８）；Ｅ３Ｌの機能が欠損しているワクシニアウイルス（Ｃｈａｎｇら（１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：４８２５）；Ａ４４Ｒ−Ａ４６Ｒの機能が欠損しているワクシニアウイルス（Ｂｏｗｉｅら（２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：１０１６２）；Ｋ１Ｌの機能が欠損しているワクシニアウイルス（Ｂｒａｖｏ Ｃｒｕｚら（２０１７） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９１：ｅ００５２４）；Ａ４８Ｒ、Ｂ１８Ｒ、Ｃ１１Ｒ、およびＴＫの機能が欠損しているワクシニアウイルス（Ｍｅｊｉａｓ−Ｐｅｒｅｚら（２０１７） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ ８：２７）；あるいはＥ３ＬおよびＫ３Ｌ領域に突然変異を有するワクシニアウイルス（ＷＯ ２００５／００７８２４）を用いてもよい。さらに、Ｏ１Ｌの機能が欠損しているワクシニアウイルス（Ｓｃｈｗｅｎｅｋｅｒら（２０１２） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８６：２３２３）を用いてもよい。さらに、Ｂ５Ｒの細胞外領域が欠損しているワクシニアウイルス（Ｂｅｌｌら（２００４） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３２５：４２５）またはＡ３４Ｒ領域が欠損しているワクシニアウイルス（Ｔｈｉｒｕｎａｖｕｋａｒａｓｕら（２０１３） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１：１０２４）を用いてもよい。さらに、インターロイキン−１ｂ（ＩＬ−１ｂ）受容体が欠損しているワクシニアウイルス（ＷＯ ２００５／０３０９７１）を用いてもよい。外来遺伝子のこうした挿入あるいは遺伝子の欠失または突然変異を、例えば既知の相同組換えまたは部位特異的突然変異誘発によって作製してもよい。さらに、２つまたはそれより多いこうした遺伝子修飾の組み合わせを有するワクシニアウイルスを、本開示のＯＶＶにおいて用いてもよい。
本明細書において、「欠損している」は、この用語によって特定される遺伝子領域または遺伝子産物が、減少した機能を有するかまたは機能をまったく持たず、そしてこうした領域または産物には：ｉ）突然変異（例えば置換、反転等）および／または遺伝子領域の一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）および／または欠失；ｉｉ）遺伝子領域の発現を制御するプロモーター領域の突然変異および／または一部切除および／または欠失；ならびにｉｉｉ）遺伝子領域によってコードされるポリペプチドの翻訳が減少するかまたは排除されるような、ポリアデニル化配列の突然変異および／または一部切除および／または欠失の１つまたはそれより多くから生じる欠損が含まれることを意味する。複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが所定のワクシニアウイルス遺伝子において「欠損している」ような遺伝子改変を含む、本開示のＯＶＶは、遺伝子の遺伝子産物（例えばｍＲＮＡ遺伝子産物；ポリペプチド遺伝子産物）の減少した産生および／または活性を示し；例えば遺伝子産物の量および／または活性は、野生型ワクシニアウイルスによって、または遺伝子改変を含まない対照ワクシニアウイルスによって産生される同じ遺伝子産物の量および／または活性の７５％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満である。例えば、「欠損している」は、明記する遺伝子領域からなる領域中の欠失または明記する遺伝子領域を含む近隣遺伝子領域における欠失の結果であってもよい。例えば、遺伝子領域の転写を減少させる、プロモーター領域の突然変異および／または一部切除および／または欠失は、欠損を生じうる。遺伝子領域によってコードされるポリペプチドの翻訳が減少しているかまたは排除されるように、転写終結要素の取り込みを通じて、遺伝子領域を欠損させてもよい。また、遺伝子領域の転写を減少させるかまたは排除するための遺伝子編集酵素または遺伝子編集複合体の使用を通じて、遺伝子領域を欠損させてもよい。また、遺伝子領域の転写を減少させるかまたは排除するための競合的逆プロモーター／ポリメラーゼ占有の使用を通じて、遺伝子領域を欠損させてもよい。また、遺伝子領域内に核酸を挿入し、それによって遺伝子領域をノックアウトすることによって、遺伝子領域を欠損させてもよい。
いくつかの態様において、本開示によって提供されるＯＶＶは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）が欠損したワクシニアウイルスである。いくつかの場合、本開示のＯＶＶは、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスがＴＫ欠損性であるように、ワクシニアウイルスＴＫコード領域のすべてまたは一部の欠失を含む。例えば、いくつかの場合、本開示のＯＶＶは、Ｊ２Ｒ遺伝子（すなわちウイルスチミジンキナーゼをコードする遺伝子）における欠失を含む。例えば、Ｍｅｊｉａ−Ｐｅｒｅｚら（２０１８） Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ ８：２７を参照されたい。いくつかの場合、本開示のＯＶＶは、Ｊ２Ｒ領域内への挿入を含み、それによって、減少したワクシニアウイルスＴＫ発現または活性を生じる。
本開示のＯＶＶは、いくつかの場合、Ｋ１５１Ｅ置換を有する（すなわちコードされるポリペプチド中にＫ１５１Ｅ置換を提供する修飾を含む）Ａ３４Ｒ遺伝子にコードされるＡ３４ポリペプチドを含む。例えば、Ｂｌａｓｃｏら（１９９３） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７（６）：３３１９−３３２５；およびＴｈｉｒｕｎａｖｕｋａｒａｓｕら（２０１３） Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２１：１０２４を参照されたい。Ａ３４Ｒ遺伝子はワクシニアウイルスｇｐ２２−２４をコードする。
いくつかの場合、本開示のＯＶＶは、免疫調節ポリペプチド（異種免疫調節ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。免疫調節ポリペプチドの例には、サイトカイン（例えばＩＬ−２、およびＩＬ−１２）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、および腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）が含まれる。
本開示のＯＶＶは腫瘍溶解活性を示す。所定のウイルスが腫瘍溶解活性を示すかどうかを評価するための方法の例には、ウイルスの付加による癌細胞の生存率の減少を評価するための方法が含まれる。評価に用いるべき癌細胞の例には、悪性黒色腫細胞ＲＰＭＩ−７９５１（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−６６）、肺腺癌ＨＣＣ４００６（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２８７１）、肺癌Ａ５４９（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）、肺癌ＨＯＰ−６２（例えば、ＤＣＴＤ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）、肺癌ＥＫＶＸ（例えば、ＤＣＴＤ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）、小細胞肺癌細胞ＤＭＳ ５３（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０６２）、肺扁平上皮癌ＮＣＩ−Ｈ２２６（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−５８２６）、腎癌細胞Ｃａｋｉ−１（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−４６）、膀胱癌細胞６４７−Ｖ（例えば、ＤＳＭＺ ＡＣＣ ４１４）、頭頸部癌細胞デトロイト５６２（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１３８）、乳癌細胞ＪＩＭＴ−１（例えば、ＤＳＭＺ ＡＣＣ ５８９）、乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２６）、乳癌細胞ＭＣＦ７（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）、乳癌ＨＳ−５７８Ｔ（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１２６）、乳管癌細胞Ｔ−４７Ｄ（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１３３）、食道癌細胞ＯＥ３３（例えば、ＥＣＡＣＣ ９６０７０８０８）、神経膠芽腫Ｕ−８７ＭＧ（例えば、ＥＣＡＣＣ ８９０８１４０２）、神経芽細胞腫ＧＯＴＯ（例えば、ＪＣＲＢ ＪＣＲＢ０６１２）、骨髄腫ＲＰＭＩ ８２２６（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１５５）、卵巣癌細胞ＳＫ−ＯＶ−３（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−７７）、卵巣癌細胞ＯＶＭＡＮＡ（例えば、ＪＣＲＢ ＪＣＲＢ１０４５）、子宮頸癌ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）、結腸癌細胞ＲＫＯ（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２５７７）、結腸癌細胞ＨＴ−２９（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）、結腸癌Ｃｏｌｏ ２０５（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２２）、結腸癌ＳＷ６２０（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２７）、結腸直腸癌ＨＣＴ １１６（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４７）、膵臓癌細胞ＢｘＰＣ−３（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６８７）、骨肉腫Ｕ−２ ＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−９６）、前立腺癌細胞ＬＮＣａＰクローンＦＧＣ（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７４０）、肝細胞癌ＪＨＨ−４（例えば、ＪＣＲＢ ＪＣＲＢ０４３５）、中皮腫ＮＣＩ−Ｈ２８（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−５８２０）、子宮頸癌細胞ＳｉＨａ（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３５）、および胃癌細胞Ｋａｔｏ ＩＩＩ（例えば、ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ ＲＣＢ２０８８）が含まれる。使用にやはり適切なのは、患者から得た癌細胞である。例えば、患者から得た結腸直腸癌細胞、乳癌細胞、または非小細胞肺癌細胞を用いてもよい。
上述のように、本開示のＯＶＶは、ａ）本明細書に記載するような変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば野生型Ａ３３ポリペプチド、例えば図１Ｃに示すアミノ酸配列を有するＡ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）；および／またはｂ）本明細書に記載するような変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば野生型Ａ３４ポリペプチド、例えば図２Ｃに示すアミノ酸配列を有するＡ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）および／またはｃ）本明細書に記載するような変異体Ｂ５ポリペプチド（例えば野生型Ｂ５ポリペプチド、例えば図４Ｄに示すアミノ酸配列を有するＢ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を示す。
組成物
本開示は、本開示のＯＶＶを含む組成物を提供する。いくつかの場合、組成物は薬学的組成物である。本開示のＯＶＶを含む薬学的組成物は、薬学的に許容されうるキャリアー（単数または複数）をさらに含んでもよい。本明細書において、用語「薬理学的に許容されうるキャリアー」および「薬理学的に許容されうる賦形剤」は、交換可能に用いられ、そしてヒトへの投与のためのＯＶＶ配合物において使用するために適した任意の物質を指す。こうしたキャリアーは、一般的に、本開示のＯＶＶと混合され、そして固形、半固形、または液体の剤であってもよい。組成物は、所望のキャリアーまたは希釈剤中の溶液または懸濁物であってもよい。多様な薬学的に許容されうるキャリアーのいずれを用いてもよく、これらには、限定なしに、水性媒体、例えば蒸留脱イオン水、生理食塩水；溶媒；分散媒体；コーティング；抗細菌および抗真菌剤；等張剤および吸収遅延剤；または任意の他の不活性成分が含まれる。薬理学的に許容されうるキャリアーの選択は、投与様式に応じうる。任意の薬理学的に許容されうるキャリアーが本開示のＯＶＶと不適合である場合を除き、薬学的に許容されうる組成物中の使用が意図される。こうした薬学的キャリアーの特定の使用の限定されない例は、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ”（Ｈｏｗａｒｄ Ｃ． Ａｎｓｅｌら監修， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， 第７版 １９９９）； “Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ監修， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， ２０ｔｈ ２０００）； “Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ” Ｊｏｅｌ Ｇ． Ｈａｒｄｍａｎら監修， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ， 第１０版 ２００１）；および“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ” （Ｒａｙｍｏｎｄ Ｃ． Ｒｏｗｅら， ＡＰｈＡ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， 第４版 ２００３）に見出されうる。
本薬学的組成物には、随意に、限定なしに、他の薬学的に許容されうる構成要素が含まれてもよく、これには、限定なしに、緩衝剤、保存剤、浸透圧調節剤、塩、酸化防止剤、生理学的物質、薬理学的物質、膨張剤、乳化剤、湿潤剤等が含まれる。生じる調製物が薬学的に許容されうる限り、ｐＨを調節するための多様な緩衝剤および手段を用いて、本明細書に開示する薬学的組成物を調製してもよい。こうした緩衝剤には、限定なしに、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水およびホウ酸緩衝剤が含まれる。酸または塩基を用いて、必要に応じて組成物のｐＨを調整してもよいことが理解される。薬学的に許容されうる酸化防止剤には、限定なしに、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アセチルシステイン、ブチル化ヒドロキシアニソールおよびブチル化ヒドロキシトルエンが含まれる。有用な保存剤には、限定なしに、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀および安定化オキシクロロ組成物、例えばＰＵＲＩＴＥＴＭが含まれる。本薬学的組成物に含まれるために適した等張性調節剤には、限定なしに、塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、マンニトールまたはグリセリンおよび他の薬学的に許容されうる等張性調節剤が含まれる。これらのおよび薬理学業に既知の他の物質が、本薬学的組成物中に含まれてもよいことが理解される。
薬学的に許容されうるキャリアーとして働きうる物質のいくつかの例には：（１）糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン、例えばコーンスターチおよびジャガイモデンプン；（３）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；（４）粉末化トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えばココアバターおよび座薬ワックス；（９）油、例えばピーナツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびダイズ油；（１０）グリコール、例えばプロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質不含水；（１７）等調性生理食塩水；（１８）リンゲル溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；および（２２）薬学的配合物に使用される他の非毒性適合性物質が含まれる。
本開示の薬学的組成物は、１ｍｌあたり約１０２プラーク形成単位（ｐｆｕ）（ｐｆｕ／ｍｌ）〜約１０４ｐｆｕ／ｍｌ、約１０４ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０５ｐｆｕ／ｍｌ、約１０５ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０６ｐｆｕ／ｍｌ、約１０６ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０７ｐｆｕ／ｍｌ、約１０７ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０８ｐｆｕ／ｍｌ、約１０８ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０９ｐｆｕ／ｍｌ、約１０９ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０１０ｐｆｕ／ｍｌ、約１０１０ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０１１ｐｆｕ／ｍｌ、または約１０１１ｐｆｕ／ｍｌ〜約１０１２ｐｆｕ／ｍｌの量で本開示のＯＶＶを含んでもよい。
腫瘍溶解を誘導する方法
本開示は、腫瘍を有する個体において腫瘍溶解を誘導する方法であって、該個体に本開示のＯＶＶまたは本開示の組成物の有効量を投与する工程を含む、前記方法を提供する。本開示のＯＶＶまたは本開示の組成物の有効量の投与はまた、本明細書において、「ウイルス療法」とも称される。本開示は、腫瘍を有する個体において、腫瘍溶解を誘導する方法において使用するための、本開示のＯＶＶまたは組成物をさらに提供する。本開示は、こうした方法において使用するための薬剤の製造における、本開示のＯＶＶまたは組成物の使用をさらに提供する。
いくつかの場合、本開示のＯＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回、２回、またはさらなる回数の用量を投与した際、個体における癌細胞の数が減少する量である。例えば、いくつかの場合、本開示のＯＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、個体における癌細胞の数を、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与前、または複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス投与の非存在下での個体における癌細胞の数に比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％減少させる量である。いくつかの場合、本開示のＯＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、個体における癌細胞の数を検出不能なレベルに減少させる量である。いくつかの場合、本開示のＯＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、個体における腫瘍重量を減少させる量である。例えば、いくつかの場合、本開示のＯＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、個体における腫瘍重量を、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与前、または複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス投与の非存在下での個体における腫瘍重量に比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％減少させる量である。
いくつかの場合、本開示のＯＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、個体の生存時間を増加させる量である。例えば、いくつかの場合、本開示のＯＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、個体の生存時間を、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス投与の非存在下での個体の予期される生存時間に比較して、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、３ヶ月〜６ヶ月、６ヶ月〜１年、１年〜２年、２年〜５年、５年〜１０年、または１０年より長く増加させる量である。
いくつかの場合、本開示のＯＶＶの「有効量」は、その必要がある個体に１回またはそれより多い回数の用量を投与した際、耐久性のある抗腫瘍免疫反応、例えば少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも６ヶ月、または少なくとも１年、腫瘍細胞数および／または腫瘍重量および／または腫瘍増殖の減少を提供する、抗腫瘍免疫反応を誘導する量である。
多様な臨床要因に基づいて、主治医または他の認定された医療従事者によって、適切な投薬量が決定可能である。医学業において周知であるように、任意の１人の患者に関する投薬量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、腫瘍負荷、および他の関連要因を含む多くの要因に応じる。
本開示のＯＶＶを、用量あたり約１０２プラーク形成単位（ｐｆｕ）〜約１０４ｐｆｕ、約１０４ｐｆｕ〜約１０５ｐｆｕ、約１０５ｐｆｕ〜約１０６ｐｆｕ、約１０６ｐｆｕ〜約１０７ｐｆｕ、約１０７ｐｆｕ〜約１０８ｐｆｕ、約１０８ｐｆｕ〜約１０９ｐｆｕ、約１０９ｐｆｕ〜約１０１０ｐｆｕ、約１０１０ｐｆｕ〜約１０１１ｐｆｕ、または約１０１１ｐｆｕ〜約１０１２ｐｆｕの量で投与してもよい。
いくつかの場合、本開示のＯＶＶを、約１ｘ１０９ｐｆｕ〜５ｘ１０１２ｐｆｕの総量で投与する。いくつかの場合、本開示のＯＶＶを、約１ｘ１０９ｐｆｕ〜約５ｘ１０９ｐｆｕ、約５ｘ１０９ｐｆｕ〜約１０１０ｐｆｕ、約１０１０ｐｆｕ〜約５ｘ１０１０ｐｆｕ、約５ｘ１０１０ｐｆｕ〜約１０１１ｐｆｕ、約１０１１ｐｆｕ〜約５ｘ１０１１ｐｆｕ、約５ｘ１０１１ｐｆｕ〜約１０１２ｐｆｕ、または約１０１２ｐｆｕ〜約５ｘ１０１２ｐｆｕの総量で投与する。いくつかの場合、本開示のＯＶＶを、約２ｘ１０１０ｐｆｕの総量で投与する。
いくつかの場合、本開示のＯＶＶを、約１ｘ１０８ｐｆｕ／患者体重ｋｇ〜約１ｘ１０１０ｐｆｕ／患者体重ｋｇで投与する。いくつかの場合、本開示のＯＶＶを、約１ｘ１０８ｐｆｕ/患者体重ｋｇ〜約５ｘ１０８ｐｆｕ／患者体重ｋｇ、約５ｘ１０８ｐｆｕ／患者体重ｋｇ〜約１０９ｐｆｕ／患者体重ｋｇ、約１０９ｐｆｕ／患者体重ｋｇ〜約５ｘ１０９ｐｆｕ／患者体重ｋｇ、または約５ｘ１０９ｐｆｕ／患者体重ｋｇ〜約１０１０ｐｆｕ／患者体重ｋｇの量で投与する。いくつかの場合、本開示のＯＶＶを、１ｘ１０８ｐｆｕ／患者体重ｋｇの量で投与する。いくつかの場合、本開示のＯＶＶを、２ｘ１０８ｐｆｕ／患者体重ｋｇの量で投与する。いくつかの場合、本開示のＯＶＶを、３ｘ１０８ｐｆｕ／患者体重ｋｇの量で投与する。いくつかの場合、本開示のＯＶＶを、４ｘ１０８ｐｆｕ／患者体重ｋｇの量で投与する。いくつかの場合、本開示のＯＶＶを、５ｘ１０８ｐｆｕ／患者体重ｋｇの量で投与する。いくつかの場合、本開示のＯＶＶを、１０９ｐｆｕ／患者体重ｋｇの量で投与する。いくつかの場合、本開示のＯＶＶを、５ｘ１０９ｐｆｕ／患者体重ｋｇの量で投与する。
いくつかの場合、本開示のＯＶＶの多数回用量を投与する。本開示のＯＶＶの投与頻度は、多様な要因のいずれか、例えば症状の重症度等に応じて多様であってもよい。例えば、いくつかの態様において、本開示のＯＶＶを月１回、月２回、月３回、１週おき（ｑоｗ）、週１回（ｑｗ）、週２回（ｂｉｗ）、週３回（ｔｉｗ）、週４回、週５回、週６回、１日おき（ｑоｄ）、毎日（ｑｄ）、１日２回（ｑｉｄ）、または１日３回（ｔｉｄ）投与する。
本開示のＯＶＶの投与期間、例えば本開示の多量体ポリペプチド、本開示のＯＶＶを投与する期間は、多様な要因、例えば患者の反応等のいずれかに応じて多様でありうる。例えば、本開示のＯＶＶを、約１日〜約１週、約２週〜約４週、約１ヶ月〜約２ヶ月、約２ヶ月〜約４ヶ月、約４ヶ月〜約６ヶ月、約６ヶ月〜約８ヶ月、約８ヶ月〜約１年、約１年〜約２年、または約２年〜約４年、またはそれより長期間、投与してもよい。
ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ法、ならびに全身および局所投与経路を含めて、薬剤送達に適した任意の利用可能な方法および経路を用いて、本開示のＯＶＶを個体に投与する。
投与の慣用的および薬学的に許容されうる経路には、腫瘍内、腫瘍周辺、筋内、気管内、クモ膜下腔内、頭蓋内、皮下、皮内、局所適用、静脈内、動脈内、腹腔内、膀胱内、直腸、鼻、経口、ならびに他の経腸および非経口投与経路が含まれる。望ましい場合、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび／または望ましい効果に応じて、投与経路を組み合わせてもよいし、または調節してもよい。本開示のＯＶＶを単回用量または多数回用量で投与してもよい。
いくつかの場合、本開示のＯＶＶを静脈内投与する。いくつかの場合、本開示のＯＶＶを筋内投与する。いくつかの場合、本開示のＯＶＶを局所投与する。いくつかの場合、本開示のＯＶＶを腫瘍内投与する。いくつかの場合、本開示のＯＶＶを腫瘍周辺投与する。いくつかの場合、本開示のＯＶＶを頭蓋内投与する。いくつかの場合、本開示のＯＶＶを皮下投与する。いくつかの場合、本開示のＯＶＶを動脈内投与する。いくつかの場合、本開示のＯＶＶを腹腔内投与する。いくつかの場合、本開示のＯＶＶを、膀胱内投与経路を通じて投与する。いくつかの場合、本開示のＯＶＶをクモ膜下腔内投与する。
組み合わせ
いくつかの場合、本開示のＯＶＶを、別の癌療法、例えば手術（例えば癌性組織の外科的除去）、放射線療法、骨髄移植、化学療法治療、抗体治療、生物学的反応修飾因子治療、免疫療法治療、および前述の特定の組み合わせと組み合わせて投与する。いくつかの場合、本開示の方法は：ａ）その必要がある個体に、本開示のＯＶＶまたは該ＯＶＶを含む組成物を投与し；そしてｂ）該個体に第二の癌療法を投与する工程を含む。いくつかの場合、第二の癌療法は、化学療法、生物学的療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、抗血管療法、凍結療法、毒素療法、腫瘍溶解性ウイルス療法（例えば本開示のＯＶＶ以外の腫瘍溶解性ウイルス）、細胞療法、および手術より選択される。
放射線療法には、限定されるわけではないが、ビームなどの外部から適用される供給源から、または小型放射性供給源の移植によってのいずれかで送達される、Ｘ線またはガンマ線が含まれる。
癌治療において使用するために適した抗体には、限定されるわけではないが、例えばトラスツズマブ（ハーセプチン）、ベバシズマブ（アバスチンＴＭ）、セツキシマブ（エルビタックスＴＭ）、パニツムマブ（ベクティビックスＴＭ）、イピリムマブ（ヤーボイＴＭ）、リツキシマブ（リツキサン）、アレムツズマブ（レムトラダＴＭ）、オファツムマブ（アーゼラＴＭ）、オレゴボマブ（オバレックスＴＭ）、ラムブロリズマブ（ＭＫ−３４７５）、ペルツズマブ（ペルジェタＴＭ）、ラニビズマブ（ルセンティスＴＭ）等、およびコンジュゲート化抗体、例えばゲムツズマブ・オゾガマイシン（ミロターグＴＭ）、ブレンツキジマブ・ベドチン（アドセトリスＴＭ）、９０Ｙ標識イブリツモマブ・チウキセタン（ゼヴァリンＴＭ）、１３１Ｉ標識トシツモマブ（ベキサールＴＭ）等が含まれる。癌治療に使用するために適した抗体には、限定されるわけではないが、例えば、ＣＴＬＡ−４をターゲティングするイピリムマブ（黒色腫、前立腺癌、ＲＣＣの治療に用いられるようなもの）；ＣＴＬＡ−４をターゲティングするトレメリムマブ（ＣＲＣ、胃癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣの治療に用いられるようなもの）；ＰＤ−１をターゲティングするニボルマブ（黒色腫、ＮＳＣＬＣ、ＲＣＣの治療に用いられるようなもの）；ＰＤ−１をターゲティングするＭＫ−３４７５（黒色腫の治療に用いられるようなもの）；ＰＤ−１をターゲティングするピディリズマブ（血液学的悪性腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ＰＤ−Ｌ１をターゲティングするＢＭＳ−９３６５５９（黒色腫、ＮＳＣＬＣ、卵巣癌、ＲＣＣの治療に用いられるようなもの）；ＰＤ−Ｌ１をターゲティングするＭＥＤＩ４７３６；ＰＤ−Ｌ１をターゲティングするＭＰＤＬ３３２８０Ａ（黒色腫の治療に用いられるようなもの）；ＣＤ２０をターゲティングするリツキシマブ（非ホジキンリンパ腫の治療に用いられるようなもの）；イブリツモマブ・チウキセタンおよびトシツモマブ（リンパ腫の治療に用いられるようなもの）；ＣＤ３０をターゲティングするブレンツキシマブ・ベドチン（ホジキンリンパ腫の治療に用いられるようなもの）；ＣＤ３３をターゲティングするゲムツズマブ・オゾガマイシン（急性骨髄性白血病の治療に用いられるようなもの）；ＣＤ５２をターゲティングするアレムツズマブ（慢性リンパ球性白血病の治療に用いられるようなもの）；ＥｐＣＡＭをターゲティングするＩＧＮ１０１およびアデカツムマブ（上皮腫瘍（乳房腫瘍、結腸腫瘍および肺腫瘍）の治療に用いられるようなもの）；ＣＥＡをターゲティングするラベツズマブ（乳房腫瘍、結腸腫瘍および肺腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ｇｐＡ３３をターゲティングするｈｕＡ３３（結腸直腸癌の治療に用いられるようなもの）；ムチンをターゲティングするペムツモマブおよびオレゴボマブ（乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍および卵巣腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ＴＡＧ−７２をターゲティングするＣＣ４９（ミンレツモマブ）（乳房腫瘍、結腸腫瘍および肺腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ＣＡＩＸをターゲティングするｃＧ２５０（腎細胞癌の治療に用いられるようなもの）；ＰＳＭＡをターゲティングするＪ５９１（前立腺癌の治療に用いられるようなもの）；葉酸結合タンパク質をターゲティングするＭＯｖ１８およびＭＯＲＡｂ−００３（ファーレツズマブ）（卵巣腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ガングリオシド（例えばＧＤ２、ＧＤ３およびＧＭ２）をターゲティングする３Ｆ８、ｃｈ１４．１８およびＫＷ−２８７１（神経外胚葉性腫瘍およびいくつかの上皮腫瘍の治療に用いられるようなもの）；Ｌｅ ｙをターゲティングするｈｕ３Ｓ１９３およびＩｇＮ３１１（乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍および卵巣腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ＶＥＧＦをターゲティングするベバシズマブ（腫瘍血管系の治療に用いられるようなもの）；ＶＥＧＦＲをターゲティングするＩＭ−２Ｃ６およびＣＤＰ７９１（上皮由来固形腫瘍の治療に用いられるようなもの）；インテグリンＶ＿３をターゲティングするエトラシズマブ（腫瘍血管系の治療に用いられるようなもの）；インテグリン５＿１をターゲティングするボロシキシマブ（腫瘍血管系の治療に用いられるようなもの）；ＥＧＦＲをターゲティングするセツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブおよび８０６（神経膠腫、肺腫瘍、乳房腫瘍、結腸腫瘍および頭頸部腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ＥＲＢＢ２をターゲティングするトラスツズマブおよびペルツズマブ（乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍および前立腺腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ＥＲＢＢ３をターゲティングするＭＭ−１２１（乳房腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍および前立腺腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ＭＥＴをターゲティングするＡＭＧ１０２、ＭＥＴＭＡＢおよびＳＣＨ９００１０５（乳房腫瘍、卵巣腫瘍および肺腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ＩＧＦ１ＲをターゲティングするＡＶＥ１６４２、ＩＭＣ−Ａ１２、ＭＫ−０６４６、Ｒ１５０７およびＣＰ７５１９８１（神経膠腫、肺癌、乳癌、頭頸部癌、前立腺癌および甲状腺癌の治療に用いられるようなもの）；ＥＰＨＡ３をターゲティングするＫＢ００４およびＩＩＩＡ４（肺腫瘍、腎臓および結腸腫瘍、黒色腫、神経膠腫および血液学的悪性腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ＴＲＡＩＬＲ１をターゲティングするマパツムマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲ１）（結腸腫瘍、肺腫瘍および膵臓腫瘍および血液学的悪性腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ＴＲＡＩＬＲ２をターゲティングするＨＧＳ−ＥＴＲ２およびＣＳ−１００８；ＲＡＮＫＬをターゲティングするデノスマブ（前立腺癌および骨転移の治療に用いられるようなもの）；ＦＡＰをターゲティングするシブロツズマブおよびＦ１９（結腸腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、膵臓腫瘍、および頭頸部腫瘍の治療に用いられるようなもの）；テネイシンをターゲティングする８１Ｃ６（神経膠腫、乳房腫瘍および前立腺腫瘍の治療に用いられるようなもの）；ＣＤ３をターゲティングするブリナツモマブ（ビーリンサイト；Ａｍｇｅｎ）（ＡＬＬの治療に用いられるようなもの）；癌免疫療法で用いられるようなＰＤ−１をターゲティングするペムブロリズマブ；ｃ−Ｍｙｃをターゲティングする９Ｅ１０抗体等が含まれる。
いくつかの場合、本開示の方法は：ａ）有効量の本開示のＯＶＶ；およびｂ）抗ＰＤ−１抗体を投与する工程を含む。いくつかの場合、本開示の方法は：ａ）有効量の本開示のＯＶＶ；およびｂ）抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与する工程を含む。本開示の併用療法で有用でありうる抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１抗体の例には、限定されるわけではないが、ペムブロリズマブ（キートルーダ（登録商標）；ＭＫ−３４７５）、ニボルマブ（オプディーボ（登録商標）；ＢＭＳ−９２６５５８；ＭＤＸ１１０６）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１）、ＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ−５１４（ＭＥＤＩ−０６８０）、ＰＤＲ００１、およびＰＦ−０６８０１５９１（ササンリマブまたはＲＮ８８８としてもまた知られる）、ＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ１１０５）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６；ＩＭＦＩＮＺＩ（登録商標））、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３３２８０Ａ；ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標））、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＢＣＤ−１００（ＢＩＯＣＡＤ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、チスレリズマブ（ＢＧＢ−Ａ３１７、ＢｅｉＧｅｎｅ Ｌｔｄ．／Ｃｅｌｇｅｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ゲノリムズマブ（ＣＢＴ−５０１、ＣＢＴ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＣＢＴ−５０２（ＣＢＴ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＧＬＳ−０１０（Ｈａｒｂｉｎ Ｇｌｏｒｉａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）、シンチリマブ（ＩＢＩ３０８、Ｉｎｎｏｖｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ， Ｉｎｃ．）、ＷＢＰ３１５５（ＣＳｔｏｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）、ＡＭＰ−２２４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ｐｌｃ）、ＢＩ ７５４０９１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ ＧｍｂＨ）、ＢＭＳ−９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ＣＡ−１７０（Ａｕｒｉｇｅｎｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＦＡＺ０５３（Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＡＧ）、スパルタリズマブ（ＰＤＲ００１、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＡＧ）、ＬＹ３３０００５４（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ＭＥＤＩ０６８０（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ ＰＬＣ）、ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＡＧ）、セミプリマブ（ＬＩＢＴＡＹＯ（登録商標）、ＲＥＧＮ２８１０、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．）、カムレリズマブ（ＳＨＲ−１２１０、Ｉｎｃｙｔｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＴＳＲ−０４２（Ｔｅｓａｒｏ、Ｉｎｃ．）、ＡＧＥＮ２０３４（Ａｇｅｎｕｓ Ｉｎｃ．）、ＣＸ−０７２（ＣｙｔｏｍＸ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．）、ＪＮＪ−６３７２３２８３（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＭＧＤ０１３（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ、Ｉｎｃ．）、ＡＮ−２００５（Ａｄｌａｉ Ｎｏｒｔｙｅ）、ＡＮＡ０１１（ＡｎａｐｔｙｓＢｉｏ、Ｉｎｃ．）、ＡＮＢ０１１（ＡｎａｐｔｙｓＢｉｏ、Ｉｎｃ．）、ＡＵＮＰ−１２（Ｐｉｅｒｒｅ Ｆａｂｒｅ Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ Ｓ．Ａ．）、ＢＢＩ−８０１（住友大日本製薬）、ＢＩＯＮ−００４（Ａｄｕｒｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＣＡ−３２７（Ａｕｒｉｇｅｎｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣＫ−３０１（Ｆｏｒｔｒｅｓｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．）、ＥＮＵＭ ２４４Ｃ８（Ｅｎｕｍｅｒａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ、Ｉｎｃ．）、ＦＰＴ１５５（Ｆｉｖｅ Ｐｒｉｍｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．）、ＦＳ１１８（Ｆ−ｓｔａｒ Ａｌｐｈａ Ｌｔｄ．）、ｈＡｂ２１（Ｓｔａｉｎｗｅｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．）、Ｊ４３（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｓ．Ａ．）、ＪＴＸ−４０１４（Ｊｏｕｎｃｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．）、ＫＤ０３３（Ｋａｄｍｏｎ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ、Ｉｎｃ．）、ＫＹ−１００３（Ｋｙｍａｂ Ｌｔｄ．）、ＭＣＬＡ−１３４（Ｍｅｒｕｓ Ｂ．Ｖ．）、ＭＣＬＡ−１４５（Ｍｅｒｕｓ Ｂ．Ｖ．）、ＰＲＳ−３３２（Ｐｉｅｒｉｓ ＡＧ）、ＳＨＲ−１３１６（Ａｔｒｉｄｉａ Ｐｔｙ Ｌｔｄ．）、ＳＴＩ−Ａ１０１０（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．）、ＳＴＩ−Ａ１０１４（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．）、ＳＴＩ−Ａ１１１０（Ｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ Ｓｅｒｖｉｅｒ）、およびＸｍＡｂ２０７１７（Ｘｅｎｃｏｒ、Ｉｎｃ．）が含まれる。さらなる抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、例えば、ＳｕｎｓｈｉｎｅおよびＴａｕｂｅ（２０１５） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２３：３２；ならびにＨｅｅｒｙら（２０１７） Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １８：５８７； Ｉｗａｉら（２０１７） Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｓｃｉ． ２４：２６； Ｈｕ−Ｌｉｅｓｋｏｖａｎら（２０１７） Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２８： ｉｓｓｕｅ Ｓｕｐｐｌ． ５、ｍｄｘ３７６．０４８； ＷＯ２０１６／０９２４１９および米国特許公報第２０１６／０１５９９０５号に見出されうる。
いくつかの場合、適切な抗体は、二重特異性抗体、例えば二重特異性モノクローナル抗体である。カツマキソマブ、ブリナツモマブ、ソリトマブ、パソツキシズマブ、およびフロテツズマブは、癌療法で使用するために適した二重特異性抗体の限定されない例である。例えば、ＣｈａｍｅｓおよびＢａｔｙ（２００９） ＭＡｂｓ １：５３９；ならびにＳｅｄｙｋｈら（２０１８） Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． Ｄｅｖｅｌ． Ｔｈｅｒ． １２：１９５を参照されたい。
本開示の方法と関連した使用に適した生物学的反応修飾因子には、限定されるわけではないが、（１）チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）活性の阻害剤；（２）セリン／スレオニンキナーゼ活性の阻害剤；（３）腫瘍関連抗原アンタゴニスト、例えば腫瘍抗原に特異的に結合する抗体；（４）アポトーシス受容体アゴニスト；（５）インターロイキン−２；（６）インターフェロン−α；（７）インターフェロン−γ；（８）コロニー刺激因子；（９）血管新生の阻害剤；および（１０）腫瘍壊死因子のアンタゴニストが含まれる。
化学療法剤は、癌細胞の増殖を減少させる非ペプチド性（すなわち非タンパク質性）化合物であり、そして細胞傷害性剤および細胞分裂停止剤を含む。化学療法剤の限定されない例には、アルキル化剤、ニトロソ尿素、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、植物（ビンカ）アルカロイド、およびステロイドホルモンが含まれる。
細胞増殖を減少させるように働く剤が当該技術分野に知られ、そして広く用いられている。こうした剤には、アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、およびトリアゼンが含まれ、限定されるわけではないが、メクロレタミン、シクロホスファミド（サイトキサンＴＭ）、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン、クロロゾトシン、ウラシルマスタード、クロルメチン、イフォスファミド、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、ダカルバジン、およびテモゾロミドが含まれる。
代謝拮抗剤には、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤が含まれ、限定されるわけではないが、シタラビン（ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ）、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（ＦｕｄＲ）、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、ペントスタチン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキセート、１０−プロパルギル―５，８−ジデアザフォレート（ＰＤＤＦ、ＣＢ３７１７）、５，８−ジデアザテトラヒドロ葉酸（ＤＤＡＴＨＦ）、ロイコボリン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、およびゲムシタビンが含まれる。
適切な天然産物およびその誘導体（例えばビンカアルカロイド、抗腫瘍抗生物質、酵素、リンホカイン、およびエピポドフィロトキシン）には、限定されるわけではないが、Ａｒａ−Ｃ、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、ドセタキセル（タキソテール（登録商標））、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン−Ｃ、Ｌ−アスパラギナーゼ、アザチオプリン；ブレキナル；アルカロイド、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン等；ポドフィロトキシン、例えばエトポシド、テニポシド等；抗生物質、例えばアントラサイクリン、ダウノルビシン塩酸（ダウノマイシン、ルビドマイシン、セルビジン）、イダルビシン、ドキソルビシン、エピルビシンおよびモルホリノ誘導体等；フェノキシゾンビスシクロペプチド、例えばダクチノマイシン；塩基性糖ペプチド、例えばブレオマイシン；アントラキノングリコシド、例えばプリカマイシン（ミトラマイシン）；アントラセンジオン、例えばミトキサントロン；アジリノピロロインドールジオン、例えばマイトマイシン；大環状免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、ＦＫ−５０６（タクロリムス、プログラフ）、ラパマイシン等などが含まれる。
他の抗増殖性細胞傷害性剤は、ナベルベン、ＣＰＴ−１１、アナストラゾール、レトラゾール、カペシタビン、レロキサフィン（ｒｅｌｏｘａｆｉｎｅ）、シクロホスファミド、イフォサミド（ｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、およびドロロキサフィンである。
抗増殖活性を有する、微小管に影響を及ぼす剤もまた、使用に適しており、そしてこれには、限定されるわけではないが、アロコルヒチン（ＮＳＣ ４０６０４２）、ハリコンドリンＢ（ＮＳＣ ６０９３９５）、コルヒチン（ＮＳＣ ７５７）、コルヒチン誘導体（例えばＮＳＣ ３３４１０）、ドルスタチン１０（ＮＳＣ ３７６１２８）、メイタンシン（ＮＳＣ １５３８５８）、リゾキシン（ＮＳＣ ３３２５９８）、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、タキソール（登録商標）誘導体、ドセタキセル（タキソテール（登録商標））、チオコルヒチン（ＮＳＣ ３６１７９２）、トリチルシステリン（ｔｒｉｔｙｌ ｃｙｓｔｅｒｉｎ）、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、天然および合成エポチロンが含まれ、限定されるわけではないが、エポチロン（ｅｏｐｔｈｉｌｏｎｅ）Ａ、エポチロンＢ、ディスコデルモリド；エストラムスチン、ノコダゾール等が含まれる。
使用に適したホルモン調節剤およびステロイド（合成類似体を含む）には、限定されるわけではないが、アドレノコルチコステロイド、例えばプレドニゾン、デキサメタゾン等；エストロゲンおよびプレゲスチン（ｐｒｅｇｅｓｔｉｎ）、例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、エストラジオール、クロミフェン、タモキシフェン等；および副腎皮質抑制剤、例えばアミノグルテチミド；１７α−エチニルエストラジオール；ジエチルスチルベストロール、テストステロン、フロキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、メチルプレドニゾロン、メチル−テストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、リュープロリド、フルタミド（ドロゲニル）、トレミフェン（ファレストン）、およびゾラデックス（登録商標）が含まれる。エストロゲンは、増殖および分化を刺激し、したがって、エストロゲン受容体に結合する化合物を用いて、この活性をブロックする。コルチコステロイドは、Ｔ細胞増殖を阻害しうる。
他の化学療法剤には、金属錯体、例えばシスプラチン（シス−ＤＤＰ）、カルボプラチン等；尿素、例えばヒドロキシ尿素；およびヒドラジン、例えばＮ−メチルヒドラジン；エピドフィロトキシン（ｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）；トポイソメラーゼ阻害剤；プロカルバジン；ミトキサントロン；ロイコボリン；テガファー等が含まれる。関心対象の他の抗増殖剤には、免疫抑制剤、例えばミコフェノール酸、サリドマイド、デスオキシスパガリン（ｄｅｓｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、アザスポリン、レフルノミド、ミゾリビン、アザスピラン（ＳＫＦ １０５６８５）；イレッサ（登録商標）（ＺＤ １８３９、４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−メトキシ−６−（３−（４−モルホリニル）プロポキシ）キナゾリン等）が含まれる。
「タキサン類」には、パクリタキセル、ならびに任意の活性タキサン誘導体またはプロドラッグが含まれる。「パクリタキセル」（本明細書において、類似体、配合物、および誘導体、例えばドセタキセル、タキソールＴＭ、タキソテールＴＭ（ドセタキセルの配合物）、パクリタキセルの１０−デスアセチル類似体およびパクリタキセルの３’Ｎ−デスベンゾイル―３’Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル類似体などを含むと理解されなければならない）は、当業者に知られる技術を利用して、容易に調製可能であり（ＷＯ ９４／０７８８２、ＷＯ ９４／０７８８１、ＷＯ ９４／０７８８０、ＷＯ ９４／０７８７６、ＷＯ ９３／２３５５５、ＷＯ ９３／１００７６；米国特許第５，２９４，６３７号；第５，２８３，２５３号；第５，２７９，９４９号；第５，２７４，１３７号；第５，２０２，４４８号；第５，２００，５３４号；第５，２２９，５２９号；およびＥＰ ５９０，２６７もまた参照されたい）、または例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス（セイヨウイチイ（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）由来のＴ７４０２；またはタキサス・ヤンナネンシス（Ｔａｘｕｓ ｙａｎｎａｎｅｎｓｉｓ）由来のＴ−１９１２）を含む多様な商業的供給源から得られうる。
パクリタキセルは、パクリタキセルの一般的な化学的に入手可能な型だけでなく、類似体および誘導体（例えば上述のようなタキソテールＴＭドセタキセル）、ならびにパクリタキセルコンジュゲート（例えばパクリタキセル−ＰＥＧ、パクリタキセル−デキストラン、またはパクリタキセル−キシロース）も指すと理解されなければならない。
細胞療法には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法（ＣＡＲ−Ｔ療法）；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞療法；樹状細胞（ＤＣ）療法（例えばＤＣに基づくワクチン）；Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）操作Ｔ細胞に基づく療法等が含まれる。
免疫チェックポイント阻害剤は当該技術分野に知られ、そしてこれには、免疫チェックポイントポリペプチドに特異的な抗体が含まれる。例えば、免疫チェックポイント阻害剤には、例えばＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ９６、ＣＤ７３、ＣＤ４７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＳＦ１Ｒ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋデルタ、ＰＩ３Ｋガンマ、ＴＡＭ、アルギナーゼ、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ９６、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１２２、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２より選択される免疫チェックポイントポリペプチドに特異的な抗体が含まれる。
免疫チェックポイントに特異的であり、そして免疫チェックポイント阻害剤として機能する、抗体、例えばモノクローナル抗体が、当該技術分野に知られる。例えば、Ｗｕｒｚら（２０１６） Ｔｈｅｒ． Ａｄｖ． Ｍｅｄ． Ｏｎｃｏｌ． ８：４；およびＮａｉｄｏｏら（２０１５） Ａｎｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２６：２３７５を参照されたい。
適切な抗免疫チェックポイント抗体には、限定されるわけではないが、ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ペムブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ）、ピディリズマブ（Ｃｕｒｅｔｅｃｈ）、ＡＭＰ−２２４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ／Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｏｃｈｅ）、ＭＤＸ−１１０５（Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｉｎｃ．／Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＭＥＤＩ−４７３６（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、アレルマブ（Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ）、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ、（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、トレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒ）、ピディリズマブ（ＣｕｒｅＴｅｃｈ、Ｌｔｄ．）、ＩＭＰ３２１（Ｉｍｍｕｔｅｐ Ｓ．Ａ．）、ＭＧＡ２７１（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）、ＢＭＳ−９８６０１６（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、リリルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ウレルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＰＦ−０５０８２５６６（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＩＰＨ２１０１（Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ／Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＭＥＤＩ−６４６９（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ）、ＣＰ−８７０，８９３（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、モガムリズマブ（協和キリン株式会社）、バルリルマブ（ＣｅｌＩＤｅｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ガリキシマブ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）、ＡＭＰ−５１４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ／ＡＺ）、ＡＵＮＰ １２（Ａｕｒｉｇｅｎｅ ａｎｄ Ｐｉｅｒｒｅ Ｆａｂｒｅ）、インドキシモド（ＮｅｗＬｉｎｋ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＮＬＧ−９１９（ＮｅｗＬｉｎｋ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＩＮＣＢ０２４３６０（Ｉｎｃｙｔｅ）；ＫＮ０３５；およびその組み合わせが含まれる。
癌
本開示の方法および組成物によって治療されうる癌細胞には、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯茎、頭部、腎臓、肝臓、肺、上咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、脊髄、精巣、舌、または子宮由来の細胞が含まれる。さらに、癌は、これらに限定されるわけではないが、特に、以下の組織学的タイプのものであってもよい：新生物、悪性；癌腫；癌腫、未分化；巨細胞および紡錘細胞癌腫；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；石灰化上皮癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；ガストリン産生腫瘍、悪性；胆管細胞癌；肝細胞癌；肝細胞癌および胆管細胞癌の組み合わせ；索状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープ中の腺癌；腺癌、家族性大腸線維症；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞腺癌；乳頭状腺癌；嫌色素性癌；好酸性（ａｃｉｄｏｐｈｉｌ）癌腫；好酸性（ｏｘｙｐｈｉｌｉｃ）腺癌；好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞腺癌；乳頭状および濾胞腺癌；非被包性硬化性癌；副腎皮質癌；類内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳道腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤性乳管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を伴う腺癌；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫瘍、悪性；アンドロブラストーマ、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞（ｌｉｐｉｄ ｃｅｌｌ）腫瘍、悪性；パラガングリオーマ、悪性；乳房外パラガングリオーマ、悪性；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性黒色腫；無色素性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑中の悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胚性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質性肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚性癌腫；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫瘍；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；神経膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起膠芽細胞腫；原始神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン腫瘍；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、巨細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞；菌状息肉症；他の明記される非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；マスト細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；膵臓癌；直腸癌；および毛様細胞白血病。
本開示の方法を用いて治療してもよい腫瘍には、例えば脳癌腫瘍、頭頸部癌腫瘍、食道癌腫瘍、皮膚癌腫瘍、肺癌腫瘍、胸腺癌腫瘍、胃癌腫瘍、結腸癌腫瘍、肝臓癌腫瘍、卵巣癌腫瘍、子宮癌腫瘍、膀胱癌腫瘍、精巣癌腫瘍、直腸癌腫瘍、乳癌腫瘍、または膵臓癌腫瘍が含まれる。
いくつかの場合、腫瘍は結腸直腸腺癌である。いくつかの場合、腫瘍は非小細胞肺癌である。いくつかの場合、腫瘍はトリプルネガティブ乳癌である。いくつかの場合、腫瘍は固形腫瘍である。いくつかの場合、腫瘍は液性腫瘍である。いくつかの場合、腫瘍は再発性である。いくつかの場合、腫瘍は原発性腫瘍である。いくつかの場合、腫瘍は転移性である。
癌を治療する本方法での治療には、多様な被験体が適している。適切な被験体には、癌を有するか、癌と診断されているか、癌を発展させるリスクがあるか、癌を有していたことがあり、そして癌の再発のリスクがあるか、癌のために本開示の腫瘍溶解性ワクシニアウイルス以外の剤で治療されたことがあり、そしてこうした治療にうまく反応しなかったか、または癌のために本開示の腫瘍溶解性ワクシニアウイルス以外の剤で治療されたことがあるが、こうした治療に最初に反応した後、再発した、任意の個体、例えばヒトまたは非ヒト動物が含まれる。
ワクシニアウイルス免疫原性組成物
本開示は：ａ）変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して（例えば野生型Ａ３３ポリペプチド、例えば図１Ｃに示すアミノ酸配列を有するＡ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する、変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ｂ）変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して（例えば野生型Ａ３４ポリペプチド、例えば図２Ｃに示すアミノ酸配列を有するＡ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する、変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；およびｃ）変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して（例えば野生型Ｂ５ポリペプチド、例えば図４Ｄに示すアミノ酸配列を有するＢ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む対照ワクシニアウイルスに比較して）、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する、変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の１つまたはそれより多くを含むＯＶＶを含む組成物を提供する。
癌抗原に対する個体における免疫反応を誘導するかまたは増進させるため、本開示のＯＶＶを必要な個体に投与する。治療に適した被験体には、上述のものが含まれる。いくつかの場合、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを、低用量で、例えば用量あたり約１０２プラーク形成単位（ｐｆｕ）〜約１０４ｐｆｕ、約１０４ｐｆｕ〜約１０５ｐｆｕ、または約１０５ｐｆｕ〜約１０６ｐｆｕで、必要な個体に投与する。いくつかの場合、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを、約１０６ｐｆｕ〜約１０１２ｐｆｕの用量、例えば約１０６ｐｆｕ〜約１０７ｐｆｕ、約１０７ｐｆｕ〜約１０８ｐｆｕ、約１０８ｐｆｕ〜約１０９ｐｆｕ、約１０９ｐｆｕ〜約１０１０ｐｆｕ、約１０１０ｐｆｕ〜約１０１１ｐｆｕ、または約１０１１ｐｆｕ〜約１０１２ｐｆｕの用量で、必要な個体に投与する。
本開示のＯＶＶを薬学的組成物中で必要な個体に投与してもよく、例えば薬学的組成物は：ａ）本開示のＯＶＶ；およびｂ）薬学的に許容されうる賦形剤を含んでもよい。したがって、本開示は：ａ）本開示のＯＶＶ；およびｂ）薬学的に許容されうる賦形剤を含む、薬学的組成物を提供する。適切な薬学的に許容されうる賦形剤は、上述のとおりである。いくつかの場合、薬学的組成物はアジュバントを含む。適切なアジュバントには、限定されるわけではないが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９（４．３％ｗ／ｖスクアレン、０．５％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ、０．５％ｗ／ｖ Ｓｐａｎ８５）、ＣｐＧ含有核酸（シトシンがメチル化されていない）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、３−Ｑ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａ（３ＤＭＰＬ）等が含まれる。
本開示のＯＶＶを、任意の適切な投与経路、例えば上述のような投与経路を通じて、必要な個体に投与してもよい。例えば、本開示の組換えワクシニアウイルスを、筋内、静脈内、皮下投与経路を通じて、必要な個体に投与してもよい。
本開示の限定されない側面の例
上述の本主題の態様を含む側面は、単独で、あるいは１つまたはそれより多い他の側面または態様と組み合わせて有益でありうる。前述の説明を限定することなく、１〜７２と番号付けられた本開示の特定の限定されない側面を、以下に提供する。本開示を読めば当業者には明らかであるように、個々の番号付けされた側面は、各々用いられてもよいし、あるいは先行するまたは続く個々の番号付けされた側面と組み合わされてもよい。これは、側面のすべてのこうした組み合わせに対する支持を提供するよう意図され、そして以下に明確に提供する側面の組み合わせに限定されない：
側面１． ａ）変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して、増進されたウイルス伝播および／または増進された細胞外エンベロープビリオン（ＥＥＶ）産生を提供する、変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｂ）変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する、変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
ｃ）変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する、変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
の１つまたはそれより多くを含む、ＯＶＶ。
側面２． ａ）変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する、変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
ｂ）変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する、変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含む、側面１の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面３． ａ）変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する、変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｂ）変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する、変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
ｃ）変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない対照ワクシニアウイルスに比較して、増進されたウイルス伝播および／または増進されたＥＥＶ産生を提供する、変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含む、側面１の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面４． 変異体Ａ３３ポリペプチドが、Ｍ６３、Ａ８８、およびＥ１２９の１つ、２つ、または３つの置換を含む、側面１〜３のいずれか１つの複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面５． 置換が、Ｍ６３Ｒ置換、Ａ８８Ｄ置換、およびＥ１２９Ｍ置換の１つまたはそれより多くである、側面４の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面６． 変異体Ａ３３ポリペプチドがＡ８８Ｄ置換およびＥ１２９Ｍ置換を含む、側面５の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面７． 変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、変異体Ａ３４ポリペプチドがＫ１５１Ｅ置換を含む、側面４〜６のいずれか１つの複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面８． 変異体Ａ３４ポリペプチドが、Ｍ６６、Ｆ９４、Ｒ８４、Ｒ９１、およびＴ１２７の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの置換を含む、側面１〜３のいずれか１つの複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面９． 置換が、Ｍ６６Ｔ置換、Ｆ９４Ｈ置換、Ｒ８４Ｇ置換、Ｒ９１Ａ置換、Ｒ９１Ｓ置換、およびＴ１２７Ｅ置換の１つまたはそれより多くである、側面８の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面１０． 変異体Ａ３４ポリペプチドがＫ１５１Ｅ置換を含む、側面９の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面１１． 変異体Ａ３４ポリペプチドがＦ９４Ｈ置換を含む、側面９の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面１２． 変異体Ａ３４ポリペプチドがＦ９４Ｈ置換およびＫ１５１Ｅ置換を含む、側面１０の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面１３． 変異体Ａ３３ポリペプチドが、Ｍ６３、Ａ８８、およびＥ１２９の１つまたはそれより多くの置換を含み；そして
変異体Ａ３４ポリペプチドが、Ｍ６６、Ｆ９４、Ｒ８４、Ｒ９１、およびＴ１２７の１つまたはそれより多くの置換を含む、
側面２の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面１４． 変異体Ａ３３ポリペプチドが、Ｍ６３Ｒ置換、Ａ８８Ｄ置換、およびＥ１２９Ｍ置換の１つまたはそれより多くを含み；そして変異体Ａ３４ポリペプチドが、Ｍ６６Ｔ置換、Ｆ９４Ｈ置換、Ｒ８４Ｇ置換、Ｒ９１Ｓ置換、Ｒ９１Ａ置換およびＴ１２７Ｅ置換の１つまたはそれより多くを含む、側面１３の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面１５． 変異体Ａ３４ポリペプチドがＫ１５１Ｅ置換を含む、側面１４の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面１６． 変異体Ａ３３ポリペプチドがＡ８８Ｄ置換を含み；そして変異体Ａ３４ポリペプチドがＦ９４Ｈ置換を含む、側面１４の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面１７． 変異体Ａ３３ポリペプチドがＥ１２９Ｍ置換を含み、そして変異体Ａ３４ポリペプチドがＦ９４Ｈ置換を含む、側面１４の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面１８． 変異体Ａ３３ポリペプチドがＡ８８Ｄ置換およびＥ１２９置換を含み、そして変異体Ａ３４ポリペプチドがＦ９４Ｈ置換を含む、側面１４の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面１９． 変異体Ａ３３ポリペプチドがＡ８８Ｄ置換およびＥ１２９Ｍ置換を含み、そして変異体Ａ３４ポリペプチドがＫ１５１Ｅ置換を含む、側面１５の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面２０． 変異体Ａ３３ポリペプチドがＡ８８Ｄ置換を含み、そして変異体Ａ３４ポリペプチドがＦ９４Ｈ置換およびＫ１５１Ｅ置換を含む、側面１５の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面２１． 変異体Ａ３３ポリペプチドがＥ１２９Ｍ置換を含み、そして変異体Ａ３４ポリペプチドがＦ９４Ｈ置換およびＫ１５１Ｅ置換を含む、側面１５の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面２２． 変異体Ａ３３ポリペプチドがＡ８８Ｄ置換およびＥ１２９Ｍ置換を含み、そして変異体Ａ３４ポリペプチドがＦ９４Ｈ置換およびＫ１５１Ｅ置換を含む、側面１５の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面２３． 変異体Ｂ５ポリペプチドが、Ｎ３９、Ｌ９０、Ｎ９４、Ｓ１９９、Ｋ２２９、Ｖ２３３、Ｉ２３６、Ｖ２３８、Ｔ２４０、Ｎ２４１、Ｅ２４３、Ｖ２４７、Ｄ２４８、Ｇ２５０、Ｄ２６３、Ｅ２６８、Ｅ２７０、Ｄ２７２、Ｓ２７３、Ｄ２７５、およびＡ２７６の位で、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれより多くのアミノ酸置換を含む、側面１または側面３の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面２４． 変異体Ｂ５ポリペプチドがＳ１９７ＦまたはＳ１９７Ｖ置換を含む、側面２３の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面２５． 変異体Ｂ５ポリペプチドがＳ１９９Ｍ置換を含む、側面２３の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面２６． 変異体Ｂ５ポリペプチドがＳ２７３Ｌ置換またはＳ２７３Ｉ置換を含む、側面２３の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面２７． 変異体Ｂ５ポリペプチドがＮ３９Ｇ置換を含む、側面２３の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面２８． 変異体Ｂ５ポリペプチドがＮ９４Ｔ置換を含む、側面２３の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面２９． 変異体Ｂ５ポリペプチドがＬ９０Ｒ置換およびＳ２７３Ｖ置換を含む、側面２３の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面３０． 変異体Ｂ５ポリペプチドがＮ３９Ｇ置換およびＳ２７３Ｉ置換を含む、側面２３の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面３１． 変異体Ｂ５ポリペプチドがＫ２２９Ｃ置換およびＳ２７３Ｌ置換を含む、側面２３の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面３２． 変異体Ｂ５ポリペプチドが、Ｄ２６３Ａ置換、Ｅ２７０Ｓ置換、Ｅ２７２Ｇ置換、およびＥ２７５Ｆ置換を含む、側面２３の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面３３． 変異体Ｂ５ポリペプチドが、Ｉ２３６Ｐ置換、Ｖ２３８Ｒ置換、Ｔ２４０Ｒ置換、およびＥ２４３Ｇ置換を含む、側面２３の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面３４． 変異体Ｂ５ポリペプチドが、Ｖ２３３Ｄ置換、Ｉ２３６Ｌ置換、Ｖ２３８Ｗ置換、Ｔ２４０Ｙ置換、およびＥ２４３Ｒ置換を含む、側面２３の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面３５． 変異体Ｂ５ポリペプチドが、Ｄ２６３Ｖ置換、Ｅ２６８Ｔ置換、Ｅ２７０Ｇ置換、Ｅ２７２Ｐ置換、およびＥ２７５Ｓ置換を含む、側面２３の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面３６． 変異体Ｂ５ポリペプチドが、Ｎ２４１Ｔ置換、Ｅ２４３Ｖ置換、Ｖ２４７Ｓ置換、Ｇ２５０Ｒ置換、およびＡ２７６Ｆ置換を含む、側面２３の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面３７． 変異体Ｂ５ポリペプチドが、Ｎ２４１Ｇ置換、Ｅ２４３Ｓ置換、Ｖ２４７Ｗ置換、Ｄ２４８Ｙ置換、Ｇ２５０Ａ置換、およびＡ２７６Ｆ置換を含む、側面２３の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面３８． Ｋ１５１Ｅ置換を含む変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、側面１〜３７のいずれか１つの複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面３９． 変異体Ａ５６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、側面１〜３８のいずれか１つの複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面４０． 変異体Ａ５６ポリペプチドがアミノ酸２６９の置換を含む、側面３９の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面４１． アミノ酸２６９の置換がＩ２６９Ｆ置換である、側面４０の複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面４２． 免疫調節ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、側面１〜４１のいずれか１つの複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面４３． Ｊ２Ｒ発現および／または機能の欠如を生じる修飾を含む、側面１〜４１のいずれか１つの複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面４４． ｉ）免疫調節ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸；およびｉｉ）Ｊ２Ｒ発現および／または機能の欠如を生じる修飾の両方を含む、側面１〜４１のいずれか１つの複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス。
側面４５． ａ）側面１〜４４のいずれか１つのワクシニアウイルス；および
ｂ）薬学的に許容されうる賦形剤
を含む、組成物。
側面４６． 腫瘍を有する個体において腫瘍溶解を誘導する方法であって、側面１〜４４のいずれか１つのワクシニアウイルスまたは側面４５の組成物の有効量を、個体に投与する工程を含む、前記方法。
側面４７． 前記投与が、ウイルスまたは組成物の単回用量を投与する工程を含む、側面４６の方法。
側面４８． 単回用量が、ワクシニアウイルスの少なくとも１０６プラーク形成単位（ｐｆｕ）を含む、側面４７の方法。
側面４９． 単回用量がワクシニアウイルスの１０９〜１０１２ｐｆｕを含む、請求項４７の方法。
側面５０． 前記投与が、ワクシニアウイルスまたは組成物の複数回用量を投与する工程を含む、側面４６の方法。
側面５１． ワクシニアウイルスまたは組成物を１日おきに投与する、側面５０の方法。
側面５２． ワクシニアウイルスまたは組成物を週１回投与する、側面５０の方法。
側面５３． ワクシニアウイルスまたは組成物を１週おきに投与する、側面５０の方法。
側面５４． 腫瘍が、脳癌腫瘍、頭頸部癌腫瘍、食道癌腫瘍、皮膚癌腫瘍、肺癌腫瘍、胸腺癌腫瘍、胃癌腫瘍、結腸癌腫瘍、肝臓癌腫瘍、卵巣癌腫瘍、子宮癌腫瘍、膀胱癌腫瘍、精巣癌腫瘍、結腸癌腫瘍、乳癌腫瘍、または膵臓癌腫瘍である、側面４６〜５３のいずれか１つの方法。
側面５５． 腫瘍が結腸直腸癌である、側面４６〜５３のいずれか１つの方法。
側面５６． 腫瘍が非小細胞肺癌である、側面４６〜５３のいずれか１つの方法。
側面５７． 腫瘍が乳癌である、側面４６〜５３のいずれか１つの方法。
側面５８． 腫瘍がトリプルネガティブ乳癌である、側面５５７６の方法。
側面５９． 腫瘍が固形腫瘍である、側面４６〜５８のいずれか１つの方法。
側面６０． 腫瘍が液状腫瘍である、側面４６〜５８のいずれか１つの方法。
側面６１． 腫瘍が再発性である、側面４６〜６０のいずれか１つの方法。
側面６２． 腫瘍が原発性腫瘍である、側面４６〜６０のいずれか１つの方法。
側面６３． 腫瘍が転移性である、側面４６〜６２のいずれか１つの方法。
側面６４． 個体に第二の癌療法を投与する工程をさらに含む、側面４６〜６３のいずれか１つの方法。
側面６５． 第二の癌療法が、化学療法、生物学的療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、抗血管療法、凍結療法、毒素療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、細胞療法、遺伝子療法、および手術より選択される、側面６４の方法。
側面６６． 第二の癌療法が免疫チェックポイント阻害剤である、側面６４の方法。
側面６７． 免疫チェックポイント阻害剤が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ９６、ＣＤ７３、ＣＤ４７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＳＦ１Ｒ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋデルタ、ＰＩ３Ｋガンマ、ＴＡＭ、アルギナーゼ、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ９６、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１２２、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２より選択される免疫チェックポイント阻害剤に特異的な抗体である、側面６６の方法。
側面６８． 個体が免疫無防備状態である、側面４６〜６７のいずれか１つの方法。
側面６９． ワクシニアウイルスまたは組成物の前記投与が、動脈内、腹腔内、膀胱内、またはクモ膜下腔内投与である、側面４６〜６８のいずれか１つの方法。
側面７０． ワクシニアウイルスまたは組成物の前記投与が腫瘍内投与である、側面４６〜６８のいずれか１つの方法。
側面７１． ワクシニアウイルスまたは組成物の前記投与が腫瘍周辺投与である、側面４６〜６８のいずれか１つの方法。
側面７２． ワクシニアウイルスまたは組成物の前記投与が静脈内投与である、側面４６〜６８のいずれか１つの方法。
側面７３． 腫瘍を有する個体において腫瘍溶解を誘導する方法において使用するための、側面１〜４４のいずれか１つのワクシニアウイルス、または側面４５の組成物。
側面７４． 腫瘍を有する個体において腫瘍溶解を誘導する方法において使用するための薬剤製造における、側面１〜４４のいずれか１つのワクシニアウイルス、または側面４５の組成物の使用。
一般の当業者に、本発明をどのように作製しそして使用するかの完全な開示および説明を提供するために、以下の実施例を示し、そして該実施例は、本発明者らが本発明と見なす範囲を限定することを意図されず、また以下の実験が行うすべてのまたは唯一の実験であることを示すとは意図されない。用いる数値（例えば量、温度等）に関する正確さを確実にするように努力は行っているが、ある程度の実験誤差および逸脱は考慮されるべきである。別に示さない限り、部分は重量部分であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセルシウス度であり、そして圧は大気圧かまたは大気圧近くである。標準的な略語を用いてもよく、例えばｂｐ、塩基対（単数または複数）；ｋｂ、キロ塩基（単数または複数）；ｐｌ、ピコリットル（単数または複数）；ｓまたはｓｅｃ、秒（単数または複数）；ｍｉｎ、分（単数または複数）；ｈまたはｈｒ、時間（単数または複数）；ａａ、アミノ酸（単数または複数）；ｋｂ、キロ塩基（単数または複数）；ｂｐ、塩基対（単数または複数）；ｎｔ、ヌクレオチド（単数または複数）；ｉ．ｍ．、筋内（に）；ｉ．ｐ．、腹腔内（に）；ｓ．ｃ．、皮下（に）等である。
実施例１
Ａ． ワクシニアウイルスライブラリー骨格の生成
骨格ウイルスを生成して、ワクシニアウイルスゲノム内の関心対象の遺伝子座への多数のライブラリーのクローニング、再活性化、および構築を容易にした。骨格ウイルスは、選択可能マーカー、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）およびｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質（ワクシニアウイルス発現のために最適化されたコドン）を、合成初期後期プロモーター（ｐＳＥＬ）の制御下で含有した。ホーミングエンドヌクレアーゼ部位Ｉ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＣｅｕＩが隣接したｐＳＥＬ−ＨＳＶ−ＴＫ／ｍＣｈｅｒｒｙカセット、ならびに１）Ａ３３Ｒ／Ａ３４Ｒ遺伝子座、２）Ａ５６Ｒ遺伝子座、または３）Ｂ５Ｒ遺伝子座に対する相同性の上流および下流領域におけるＡａｒＩ部位のユニークな対を含有するドナーＤＮＡを、各領域の特異的プライマー（ＩＤＴ）およびＰｈｕｓｉｏｎ−ＨＦ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いた重複ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を通じて生成した。Ｚｙｍｏ ＤＮＡ ｃｌｅａｎ−ａｎｄ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５キット（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いてＰＣＲ産物を精製し、そしてＺｅｒｏＢｌｕｎｔＴＭ ＴＯＰＯＴＭ ＰＣＲクローニングキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって供給されるＤＮＡシャトルベクター内に平滑端クローニング（ｂｌｕｎｔ−ｃｌｏｎｉｎｇ）した。Ｅｌｉｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（カリフォルニア州ヘイワード）によってＤＮＡを配列決定した。Ｊ２Ｒ欠失およびｐＳＥＬプロモーターによって駆動されるホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼ２Ａ−ｅＧＦＰの挿入を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス由来のウイルスゲノムＤＮＡを抽出し、そして関心対象の３つの遺伝子座の１つで切断した。ウイルス再活性化を用いて、関心対象の各遺伝子座：１）ワクシニアウイルスゲノムのＡ３３Ｒ／Ａ３４Ｒ遺伝子座、２）Ａ５６Ｒ遺伝子座、および３）Ｂ５Ｒ遺伝子座を、選択可能マーカーで置換した。簡潔には、ＶＥＲＯ−Ｂ４細胞（ＤＳＭＺ）をＳｈｏｐｅ線維腫ウイルス（ＳＦＶ；ＡＴＣＣ）に室温で２時間感染させ、洗浄し、そして３７℃および５％ＣＯ２で１時間回復を許した。回復中、製造者の指示にしたがって、ゲノムＤＮＡおよびドナーＤＮＡを含有するトランスフェクション混合物を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と混合した。感染細胞をトランスフェクション混合物で、３７℃および５％ＣＯ２で２日間トランスフェクションした。ＢＳＣ−４０細胞から、連続希釈およびプラーク単離によって、機能性ウイルスを回収した（Ｅａｒｌら（１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔｏｃｏｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４３：１６．１７．１．）。ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ／Ｌｕｃｉｇｅｎ）を用いてウイルスプラークをＤＮＡ抽出し、そしてＥｌｉｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって、プラーク精製前およびプラーク精製３ラウンド後にサンガー配列決定した。配列検証されたウイルスを、ＨｅＬａ Ｓ３細胞（ＤＳＭＺ）中で増幅し、そして以下に記載するように精製した。ＤＮＡを抽出し（Ｃｏｔｔｅｒら（２０１５） Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３９：１４Ａ．３．１．）、そして全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）（Ｓｅｑｍａｔｉｃ、カリフォルニア州ヘイワード）のために提出した（ｓｕｍｍｉｔｅｄ）。Ｇｅｎｅｉｏｕｓデスクトップソフトウェア（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ Ｌｔｄ．）を用いて、ＷＧＳ分析を社内で行った。
Ｂ． ワクシニアウイルスＡ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ５６Ｒ、およびＢ５Ｒ ＤＮＡライブラリーの生成
ＰＣＲを通じて単一アミノ酸置換を含有するライブラリーを生成した。最初の遺伝子のプロモーターの上流および最後の遺伝子のターミネーターの下流に挿入されたユニークなＡａｒＩおよびＳｆｉＩクローニング部位を含み、各遺伝子座に関して、Ａ３３ＲおよびＡ３４Ｒ（Ｋ１５１Ｅ置換を含有する）、Ａ５６Ｒ、またはＢ５Ｒのコペンハーゲンワクシニアウイルスを含有するテンプレートＤＮＡを合成した（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）。Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ５６Ｒ、およびＢ５Ｒコード配列に関して、遺伝子の長さに渡るＮＮＫライブラリーを設計した。各タンパク質のコード領域に渡ってタイリングされた縮重ＮＮＫ含有プライマー（ＩＤＴ）を用いて、ＰＣＲによって各遺伝子座に関するＮＮＫ変異体を生成した。順方向および逆方向プライマーの間の相同性によって、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡアセンブリー（ＮＥＢ）を用いて、各コドンに関するＮＮＫ変異体の自己アセンブリーが可能になった。アセンブリー反応を、Ｅｎｄｕｒａ化学的コンピテント大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に形質転換し、そして選択寒天培地（１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを含むルリアブロスまたはＬＢ＋Ｃａｒｂ、Ｔｅｋｎｏｖａ）上で増殖させた。コロニーを計数し、そして各遺伝子座における各コドンに関して、ＮＮＫあたり〜２０ｘコロニー形成単位（ＣＦＵ）が達成されるまで、形質転換を続けた。液体培地ＬＢ＋Ｃａｒｂ（Ｔｅｋｎｏｖａ）を注ぎ、そして掻き取ることによってプレートからコロニーを回収し、アリコットし、そして３０％グリセロール中で凍結した。各コドンに関して１つのアリコットを、ＬＢ＋５０μｇ／ｍＬ Ｃａｒｂを含有する９６ウェルプレート内に接種し、３７℃および９００ｒｐｍで一晩振盪し；次いで、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ９６プラスミドトランスフェクション等級キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いてミニプレップした。ミニプレップを滅菌水中で１：１００に希釈し；次いで、Ａ３３Ｒ／Ａ３４Ｒ、Ａ５６Ｒ、およびＢ５Ｒに関する特異的プライマー（ＩＤＴ）それぞれで、Ｐｈｕｓｉｏｎ−ＨＦ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、各コドンに関してドナーＤＮＡを増幅した。各ランダム化コドンに関するＰＣＲアンプリコンを、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５プレート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上、ＡｃｃｕＣｌｅａｒ超高感度ｄｓＤＮＡ定量化キット（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を用いて定量化し、そしてＥｌｉｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（カリフォルニア州ヘイワード）によって配列決定した。Ｇｅｎｅｉｏｕｓ（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ Ｌｔｄ．）を用いて、配列決定結果を社内分析した。検証されたＮＮＫ ＰＣＲ産物を濃度によって標準化し、プールし、そしてワクシニアウイルスに組み換えるドナーＤＮＡとして用いた。Ｂ５Ｒ遺伝子内に関心対象のランダム化領域を含有するライブラリーを、ランダム化の定義された領域での縮重合成プロセスを用いて、Ｇｅｎｅｗｉｚによって合成した。ライブラリー多様性概算およびＤＮＡライブラリー段階でのアレル頻度をすべてのライブラリーに関して概算した。
Ｃ． ワクシニアウイルスＡ３３、Ａ３４、Ａ５６、およびＢ５ウイルスライブラリーの生成
ワクシニア骨格生成またはウイルス再活性化に関して記載したものと同じ戦略を用いて、ワクシニアウイルスゲノム内にライブラリーを挿入した。簡潔には、ＶＥＲＯ−Ｂ４細胞（ＤＳＭＺ）をＳｈｏｐｅ線維腫ウイルス（ＳＦＶ、ＡＴＣＣ）に感染させ、そして消化したウイルスゲノムＤＮＡおよびドナーＤＮＡでトランスフェクションした。ワクシニアウイルスのウイルス粒子を２４時間後に回収した。上述のように、プラークを単離し、Ｑｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ／Ｌｕｃｉｇｅｎ）でＤＮＡを抽出し、そしてＰＣＲアンプリコンの配列を決定することによって、ウイルス再活性化直後の多様性を概算した。各ライブラリー由来のウイルスをＨｅＬａ Ｓ３細胞中で増幅した。各遺伝子座を増幅し、そしてアンプリコン次世代配列決定（ＮＧＳ、ＳｅｑＭａｔｉｃ）のために提出することによって、多様性に関してウイルスシードストックを分析した。各遺伝子座特異的ライブラリー中に存在する多様性の分析を、フリーのコマンドラインプログラム、ＶｉｒＶａｒＳｅｑ（ｈｔｔｐｓ：／／ｏｍｉｃｔｏｏｌｓ．ｃｏｍ／ｖｉｒｖａｒｓｅｑ−ｔｏｏｌ）によって容易にし、そしてＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを用いて後処理した。以下に記載するように、スクロース勾配および超遠心によって、増幅されたウイルスライブラリーを精製した（Ｃｏｔｔｅｒら（２０１５） Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３９：１４Ａ．３．１）。精製したウイルスライブラリーを−８０℃で保存し、そしてプラークアッセイによって２つ組で力価決定し、以下に記載するように、精製ウイルスの連続希釈をＢＳＣ−４０細胞（ＡＴＣＣ）に添加した（Ｅａｒｌら（１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔｏｃｏｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４３：１６．１７．１．）。
Ｄ． 定向進化
いくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ定向進化プログラムを行って、多様な腫瘍タイプの形質導入と組み合わせて、増加したＥＥＶ産生およびウイルス伝播が可能な変異体を同定した。プログラムを表１に要約する。一般的な定向進化プロセスを図５に要約する。
表１
Figure 2021106576
図５は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＥＶ変異体を同定するために用いられる定向進化プロセスの単一の段階の模式的例を提供する。関心対象の適切な領域、この例ではＡ３３／Ａ３４、Ｂ５およびＡ５６領域中のウイルス変異体のライブラリーを含有するワクシニアウイルスをまず、大規模ウイルス再活性化実験を通じて操作した後、特定の細胞タイプにおける多数ラウンドの選択に供した。定向進化プロセスを、癌患者由来初代細胞または不死化癌細胞株のいずれかに適応させてもよい。ウイルス変異体を、１つまたは多様な細胞タイプにおける選択ラウンドに通過させてもよい。簡潔には、プロセスは、選択した第一の細胞タイプにおいて、複製および上清中への放出が可能なウイルスで始まり、その後、２４時間のインキュベーション期間後に採取し、増幅し、そして精製する（ラウンド１）。次いで、ラウンド１から得た感染性ウイルスを用いて、別の細胞タイプまたは同じ細胞タイプのいずれかを感染させる（ラウンド２）。ラウンド１〜４の実施を定向進化プロセスの１ステージと見なす。全部で合わせて３ステージを完了した。用いた細胞タイプ（癌患者由来一次細胞または不死化癌細胞株）に応じて、多様な感染多重度（ＭＯＩ）を考慮すべきである。
定向進化プロセスの多数ラウンドに関して、アンプリコン次世代配列決定（ＮＧＳ）、個々のプラークのサンガー配列決定、および全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）の組み合わせを用いて、ライブラリーの代表的な部分の配列決定を行った。最も蔓延している変異体の、総集団の割合として表される頻度は、選択の経過に渡って有意に増加した。
Ｅ． プラスミド構築
遺伝子合成技術を用いて、変異体Ａ３３Ｒおよび／またはＡ３４Ｒ配列を含有するプラスミドを生成した。以下に記載する置換変異体各々をコードする配列を、遺伝子合成のため、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔに提出し、そしてｐＵＣ５７−ミニベクター内に挿入した。変異体Ａ３３およびＡ３４配列によってコードされるアミノ酸配列を、配列番号５７〜６０、６１〜６７、および８１として、図１６の簡単な説明中に注解した。変異体Ｂ５配列によってコードされるアミノ酸配列を、配列番号６８〜７９として、図２３の簡単な説明中に注解した。変異体Ａ５６配列によってコードされるアミノ酸配列を、配列番号８０として、図２４の簡単な説明中に注解した。
Ｆ． ウイルスおよび細胞
ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株のチミジンキナーゼウイルス遺伝子Ｊ２Ｒ内への、ｐＳＥＬプロモーターの制御下のルシフェラーゼ−２Ａ−ＧＦＰカセットの相同組換え挿入によって、ワクシニアウイルスコペンハーゲンＩＧＶ−００７を構築した。Ｂｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用い、発光によって、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を確認した。蛍光顕微鏡観察を通じて、ＧＦＰ発現を確認した。
再活性化およびＩＧＶ−００７のＡ３３Ｒ／Ａ３４Ｒ遺伝子領域内への合成遺伝子の相同組換えによって、Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−００６）、Ａ３３中のＡ８８Ｄ置換（ＩＧＶ−０６０）、Ａ３３中のＥ１２９Ｍ置換（ＩＧＶ−０６１）、Ａ３４中のＦ９４Ｈ置換（ＩＧＶ−０６２）、Ａ３３中のＡ８８ＤおよびＥ１２９Ｍ置換（ＩＧＶ−０６３）、Ａ３３中のＡ８８Ｄ置換およびＡ３４中のＦ９４Ｈ置換（ＩＧＶ−０６４）、Ａ３３中のＥ１２９Ｍ置換およびＡ３４中のＦ９４Ｈ置換（ＩＧＶ−０６６）、ならびにＡ３３中のＡ８８ＤおよびＥ１２９Ｍ置換ならびにＡ３４中のＦ９４Ｈ置換（ＩＧＶ−０６６）を含有するワクシニアウイルスコペンハーゲン株を構築した。再活性化およびＩＧＶ−００６のＡ３３Ｒ／Ａ３４Ｒ遺伝子領域内への合成遺伝子の相同組換えによって、Ａ３３中のＡ８８Ｄ置換およびＡ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０６７）、Ａ３３中のＥ１２９Ｍ置換およびＡ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０６８）、Ａ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０７３）、Ａ３３中のＡ８８ＤおよびＥ１２９Ｍ置換ならびにＡ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０６９）、Ａ３３中のＡ８８Ｄ置換ならびにＡ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０７０）、Ａ３３中のＥ１２９Ｍ置換ならびにＡ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０７１）、ならびにＡ３３中のＡ８８ＤおよびＥ１２９Ｍ置換ならびにＡ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０７２）を含有するワクシニアウイルスコペンハーゲン株を構築した。ＩＧＶ−００７またはＩＧＶ−００６内への変異体Ａ３３Ｒ遺伝子および／またはＡ３４Ｒ遺伝子の挿入成功を、個々の単離プラークのサンガー配列決定によって検証した。以下に記載するように、ウイルスを増幅し、そして精製した。
再活性化およびＩＧＶ−０１３のＡ３３Ｒ／Ａ３４Ｒ遺伝子領域内への合成遺伝子の相同組換えによって、Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−１１７）、Ａ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−１１８）、Ａ３３中のＡ８８Ｄ置換ならびにＡ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−１１９）、ならびにＡ３３中のＡ８８ＤおよびＥ１２９Ｍ置換ならびにＡ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−１２０）を含有するワクシニアウイルスウェスタンリザーブ株を構築した。ワクシニアウイルスのウェスタンリザーブ（ＷＲ；ＡＴＣＣ）株のチミジンキナーゼウイルス遺伝子Ｊ２Ｒ内への、テトラサイクリンオペレーターを伴うｐＳＥＬプロモーターの制御下のルシフェラーゼ−２Ａ−ＧＦＰカセットの相同組換え挿入によって、ワクシニアウイルスＷＲ ＩＧＶ−０１３を構築した。Ｂｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用い、発光によって、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を確認した。蛍光顕微鏡を通じて、ＧＦＰ発現を確認した。
ＨｅＬａ、Ｕ−２ ＯＳ、およびＢＳＣ−４０細胞をＡＴＣＣから得た。Ａ５４９、ＨＣＴ１１６、Ｃｏｌｏ２０５、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を腫瘍および腫瘍細胞株のＮＣＩ ＤＣＴＤレポジトリーより得た。ＨｅＬａ Ｓ３およびＶＥＲＯ−Ｂ４細胞をＤＳＭＺより得た。癌患者由来初代細胞（乳房、結腸直腸、および肺）を、Ｃｏｎｖｅｒｓａｎｔ Ｂｉｏより得た。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＬｏｎｚａより得た。ＲＫ−１３細胞をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈより得た。
Ｇ． ウイルス増幅および精製
単層細胞にウイルスを添加し、そして２．５％ＦＢＳを含む培地中で１時間インキュベーションすることによって、ＨｅＬａ Ｓ３細胞（ＤＳＭＺ）を感染させた。感染後、新鮮な培地を添加し、そして感染細胞単層を４８時間インキュベーションして、ウイルス複製および増幅を可能にした。インキュベーション後、細胞を採取し、そして遠心分離によって収集した。Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー（Ｗｈｅａｔｏｎ）での機械的破壊によって細胞を溶解した。２４％〜４０％スクロース勾配および超遠心でウイルス精製を完了した。精製したウイルスをアリコットし、−８０℃で保存して、そしてプラークアッセイによって２つ組で力価決定し、以前記載されるように（Ｅａｒｌら（１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔｏｃｏｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４３：１６．１７．１．）、精製ウイルスの連続希釈をＢＳＣ−４０細胞またはＵ−２ ＯＳ細胞（ＡＴＣＣ）に添加した。
Ｈ． プラークアッセイによるウイルス力価決定
最終希釈が濃縮精製ウイルスストックの１０−９である１０倍連続希釈によってウイルス力価を決定した。ウイルス希釈を用いて、ＢＳＣ−４０細胞またはＵ−２ ＯＳ細胞を感染させて、ｍＬあたりのプラーク形成単位数（ＰＦＵ／ｍＬ）を決定した。１ｍＬの各連続希釈を、標準６ウェルマイクロプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）中の集密細胞単層を含有するウェルに２つ組で適用した。細胞を１時間感染させ、新鮮な培地で洗浄し、そして１．５％カルボキシメチルセルロース（Ｔｅｋｎｏｖａ）を含有する新鮮な培地溶液を重層した。４８または７２時間インキュベーションした後、培地を除去し、そして細胞を固定し、そして０．１％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ）を含有する２０％エタノール溶液で染色した。次いで、各ウェル中のプラーク数をカウントし、２つ組力価の間で平均し、そして希釈因子に関して調整することによって、ストック力価を決定した。
Ｉ． ヒト腫瘍細胞の上清中の感染性ウイルス
１または３のＭＯＩで１時間、細胞単層をウイルスに感染させることによって、腫瘍細胞株Ａ５４９（ＮＣＩ）、Ｃｏｌｏ２０５（ＮＣＩ）、ＭＤＡ ＭＢ２３１（ＮＣＩ）、ＨＴ−２９（ＮＣＩ）、ＳＷ−６２０（ＮＣＩ）、およびＨｅＬａ（ＤＳＭＺ）中のウイルス複製を、３つ組で決定した。感染後、ウイルス接種を３回洗浄し、そして新鮮な培地で置き換えた。感染２４時間後、上清中で産生されたウイルスおよび細胞を別個に培地に採取した。上述のプラークアッセイプロトコルを用いて、上清中のウイルスを直ちに、２つ組で力価決定した。細胞ペレット中に含有されたウイルスを凍結し、そして−８０℃で保存した。
Ｊ． コメットアッセイ
６ウェルプレート中に植え付けられたＢＳＣ−４０細胞単層を、１ｍＬの１０倍連続希釈ウイルスに１時間感染させた。感染細胞を３回洗浄し、新鮮な培地を補充し、そして角度４０°、３７℃で４８または７２時間インキュベーションした。細胞単層を、０．１％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ）を含有する２０％エタノール溶液で２時間染色して、コメットを視覚化した。
Ｋ． 伝播アッセイ
２段階感染性アッセイのため、Ｕ−２ ＯＳ（骨肉腫）、ＲＫ−１３（ウサギ腎臓）、ＶＥＲＯ−Ｂ４（アフリカミドリザル腎臓）、Ａ５４９（肺腺癌）またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）細胞を、ある範囲のＭＯＩで１時間感染させた。感染細胞を３回洗浄し、そして２０〜２４時間インキュベーションし、この時点で上清を収集した。低速遠心分離によって、細胞破片から上清を清澄化し、そして９６ウェル白壁プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中に植え付けられた対応する細胞の新規プレートを感染させた。第二のプレート上で１５または２４時間感染させた後、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５分光光度計上でルシフェラーゼ活性を評価した。
Ｌ． ＥＥＶ定量化
ＣｓＣｌ密度勾配超遠心法を用いて、細胞内成熟ウイルス（ＩＭＶ）粒子の濃縮または細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）粒子の濃縮を含有するウイルス試料を分離し、そして精製した。ウイルスを、２５％〜３０％ＣｓＣｌ勾配上に重層し、そして１７５，０００ｒｃｆで１８時間遠心分離した。濃縮分画を含有するバンドを、密度勾配内の定義された位置で抽出し、そしてＣｓＣｌを除去した。試料をコンジュゲート化抗Ｂ５抗体とインキュベーションした後、定量化した。マイクロフローサイトメーター（Ａｐｏｇｅｅ）を用いて、ウイルスサイズ粒子（ＶＳＰ）およびＢ５抗原（ＥＥＶの指標）を含有するＶＳＰを定量化した。
実施例２
最初の選択は、異なる初代癌細胞（結腸、乳房および肺）およびＶＥＧＦ刺激内皮細胞の感染後、増進された伝播およびＥＥＶ産生が可能な変異体を同定した。配列決定集団内で増加した頻度を示す２つの変異体を同定した（図６）。１つはＡ３３配列に対するＡ８８ＤおよびＥ１２９Ｍ置換を含有し、そして１つはＡ３４配列に対するＦ９４Ｈ置換を含有する、２つの変異体が、ラウンド１１で実質的な濃縮（それぞれ、９００倍および４００倍）を示した（図６）。
図６は、異なるヒト初代癌細胞およびＶＥＧＦ刺激内皮細胞の感染後、増進された伝播およびＥＥＶ産生が可能な変異体を同定する定向進化プロセスの多様なラウンドにおいて、特定のワクシニアウイルス変異体の頻度に関するデータを提供する。ライブラリーの代表的な分画を、最初のＨｅＬａ Ｓ３増幅、ラウンド３、ラウンド４、ラウンド９、ラウンド１０、およびラウンド１１の後に、アンプリコン次世代配列決定（ＮＧＳ）、個々のプラークのサンガー配列決定（プラーク配列決定）、および全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）の組み合わせを用いて、配列決定した。総集団の割合として表される、２つの最も蔓延している変異体の頻度は、選択経過に渡って有意に増加した。Ａ８８ＤおよびＥ１２９Ｍ置換を含有するＡ３３変異体、ならびにＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換を含有するＡ３４変異体に関する濃縮によって、ワクシニアウイルスが、初代ヒト癌細胞の感染後、伝播を増加させそしてＥＥＶを産生する能力を、これらの置換が増加させることが立証される。ｎ．ｄ．、未実行。
ＢＳＣ−４０（アフリカミドリザル腎臓）およびＵ−２ ＯＳ（ヒト骨肉腫）細胞株を用い、ウイルス伝播およびＥＥＶ産生に対する置換変異体の影響をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。野生型Ａ３３およびＡ３４配列（ＩＧＶ−００７）、Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−００６；伝播およびＥＥＶ産生を増加させる既知の突然変異）、Ａ３３中のＡ８８ＤおよびＥ１２９Ｍ置換ならびにＡ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０５１）、またはＡ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０５２）を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルスを、実施例１に記載するように生成し、そして製造した。実施例１に記載するように、コメットアッセイを行った。野生型Ａ３３およびＡ３４配列を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルスに比較した、変異体ワクシニアウイルスに関するより長いコメットテールの存在（図７Ａ）は、変異体ワクシニアウイルス、特にＩＧＶ−０５１およびＩＧＶ−５２によって、ウイルス伝播が増進し、そしてしたがってより多くのＥＥＶが産生されたことを示す。実施例１に記載する伝播アッセイを用いて、変異体伝播をさらに評価した。野生型Ａ３３およびＡ３４配列（ＩＧＶ−００７）、ならびにＡ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−００６）を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルスに比較して、変異体ワクシニアウイルス（ＩＧＶ−０５１およびＩＧＶ−０５２）は、より多量の相対光単位（ＲＬＵ）を生じ、増進されたウイルス伝播を示す（図７Ｂ）。これらの研究は、Ａ３３およびＡ３４への置換の取り込み、特に、Ａ３３中のＡ８８およびＥ１２９の位置、ならびにＡ３４中のＦ９４の位置での置換を、Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換と組み合わせると、増進されたＥＥＶ産生およびしたがってウイルス伝播を導くことを例示する。
図７Ａ〜７Ｂは、Ａ３３およびＡ３４置換を含有するワクシニアウイルス変異体のウイルス伝播およびＥＥＶ産生に関するデータを提供する。Ａ）ＢＳＣ−４０細胞の感染後に形成されるコメットの代表的な画像は、野生型Ａ３３およびＡ３４配列を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（上部左）、ならびにＡ３４中にＫ１５１Ｅ置換を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（ウイルス伝播およびＥＥＶ産生を増加させる既知の突然変異；上部右）に比較して、ワクシニアウイルス変異体がより長いコメットテールを生じることを示し、これは、より優れた伝播および増進されたＥＥＶ産生の指標である。Ｂ）ウイルス伝播を測定する２段階感染性アッセイであって、ここで、Ｕ−２ ＯＳ細胞をまず、異なる３倍希釈の多重度（ＭＯＩ）のワクシニアウイルスに感染させ、次いで、２２時間後に上清を収集し、清澄化して、そしてこれを用いてＵ−２ ＯＳ細胞の新規プレートを感染させた。ウイルスから発現されるルシフェラーゼを感染１５時間後に測定し、そしてルシフェラーゼの増加したレベルは、感染およびウイルス複製のより高い速度と相関する。したがって、より高いルシフェラーゼレベルは、伝播増加の指標である。ＩＧＶ−００６（Ａ３４中にＫ１５１Ｅ置換を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス）中のルシフェラーゼ発現に比較した倍変化として、データを提供する。どちらのワクシニアウイルス変異体も、Ａ３４中に置換をまったく含まないコペンハーゲンウイルス（ＩＧＶ−００７）に比較して、ウイルス伝播のほぼ７倍の増加を示し、これはよりよい腫瘍内伝播能によって、癌における腫瘍溶解活性改善を導きうる。ＩＧＶ−００７はコペンハーゲン（対照）であり、ＩＧＶ−００６はコペンハーゲンＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−０５１はコペンハーゲンＡ３４ Ｆ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−０５２はＡ３３ Ａ８８ＤおよびＥ１２９ＭならびにＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換である。エラーバーはＳＤを示す（ｎ＝３）。アステリスクは、Ａ３４Ｒ遺伝子中にＫ１５１Ｅ置換を含むコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００６）に対する統計的有意性を示す（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１；スチューデントのｔ検定）。
実施例３
異なるヒト癌細胞株において上清中に生成される感染性ウイルス（ＥＥＶ産生）に対する置換変異体の影響を、Ａ５４９細胞（肺腺癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（乳腺癌）、Ｃｏｌｏ２０５細胞（結腸直腸腺癌）、およびＨｅＬａ細胞（子宮頸癌）を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。野生型Ａ３３およびＡ３４配列（ＩＧＶ−００７）、Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−００６；ウイルス伝播およびＥＥＶ産生を増加させる既知の突然変異）、Ａ３３中のＡ８８ＤおよびＥ１２９Ｍ置換ならびにＡ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０５１）、またはＡ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０５２）を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルスを、実施例１に記載するように生成し、そして製造した。上記のすべての細胞株を、１のＭＯＩで感染させ、そしてウイルス吸着の１時間後、徹底的に３回洗浄した。感染２４時間後、上清を収集し、そして上清中で産生された感染性ウイルス（潜在的にＥＥＶ）の数を、実施例１に記載するように、プラークアッセイによって決定した。４つの細胞株すべてにおいて、Ａ３３中のＡ８８ＤおよびＥ１２９Ｍ置換ならびにＡ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０５１）またはＡ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０５２）を含有する置換変異体は、上清中により多数の感染性ウイルス（潜在的にＥＥＶ）を生じた（図８Ａ〜８Ｄ）。この研究は、Ａ３３およびＡ３４への突然変異の取り込み、特にＡ３３中のＡ８８およびＥ１２９の位置、ならびにＡ３４中のＦ９４の位置の突然変異をＡ３４中のＫ１５１Ｅ置換と組み合わせると、異なる癌細胞株において、増進された感染性ＥＥＶ産生につながることを立証する。
図８Ａ〜８Ｄは、代表的なヒト癌細胞株において、感染周期の初期に、上清に放出された感染性ウイルス（潜在的にＥＥＶ）のワクシニアウイルス産生に関するデータを提供する。Ａ）Ａ５４９細胞（肺腺癌）、Ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（乳腺癌）、Ｃ）Ｃｏｌｏ２０５細胞（結腸直腸腺癌）、およびＤ）ＨｅＬａ細胞（子宮頸癌）を、１のＭＯＩでワクシニアウイルスに感染させた。感染２４時間後、プラークアッセイによって、上清に放出された感染性ウイルス（潜在的にＥＥＶ粒子）の数を決定した。各癌細胞株において、上清中に放出された感染性ウイルスの倍増加を、野生型Ａ３３およびＡ３４配列を含有するコペンハーゲンウイルス（ＩＧＶ−００７）に比較して、各ウイルス変異体に関して計算した。試験したすべての癌細胞株において、野生型Ａ３３およびＡ３４配列を含有するコペンハーゲン、ならびにＡ３４中のＫ１５１Ｅ置換を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（ウイルス伝播およびＥＥＶ産生を増加させる既知の突然変異）に比較して、どちらのワクシニアウイルス変異体に関しても上清中の感染性ウイルスの有意な増加がある。ＩＧＶ−００７はコペンハーゲン（対照）であり、ＩＧＶ−００６はコペンハーゲンＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−０５１はコペンハーゲンＡ３４ Ｆ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−０５２はＡ３３ Ａ８８ＤおよびＥ１２９ＭならびにＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換である。エラーバーはＳＤを示す（ｎ＝３）。アステリスクは、野生型Ａ３３およびＡ３４配列を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００７）に対する統計的有意性を示す（＊ｐ＜０．５；＊＊＊＊＜０．０００１；一方向ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）。
実施例４
異なるヒト癌細胞株におけるワクシニアウイルス伝播に対する置換変異体の影響を、Ａ５４９細胞（肺腺癌）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（乳腺癌）を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。野生型Ａ３３およびＡ３４配列（ＩＧＶ−００７）、Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−００６；ウイルス伝播およびＥＥＶ産生を増加させる既知の突然変異）、Ａ３３中のＡ８８ＤおよびＥ１２９Ｍ置換ならびにＡ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０５１）、またはＡ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０５２）を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルスを、実施例１に記載するように生成し、そして製造した。Ａ５４９細胞（肺腺癌）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（乳腺癌）を、試験したすべてのウイルスのＭＯＩの連続希釈に感染させ、そして１時間後に細胞を３回洗浄した。感染２２時間後、上清を収集し、清澄化し、そして細胞の新規プレートを感染させるために用いた。感染１５時間後、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて発光を定量化することによって、第二のプレート上の細胞におけるルシフェラーゼ活性を評価した。どちらの細胞株においても、Ａ３３中のＡ８８ＤおよびＥ１２９Ｍ置換ならびにＡ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０５１）またはＡ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０５２）を含有する置換変異体は、より高いルシフェラーゼ検出を導き（図９Ａ〜９Ｂ）、これは優れた感染および伝播の指標である。本研究はさらに、Ａ３３およびＡ３４への置換の取り込み、特にＡ３３中のＡ８８およびＥ１２９の位置ならびにＡ３４中のＦ９４の位置での置換を、Ａ３４中のＫ１５１置換と組み合わせると、異なるヒト癌細胞株において増進されたウイルス伝播が導かれることを例示する。
図９Ａ〜９Ｂは、代表的なヒト癌細胞株におけるワクシニアウイルス伝播に関するデータを提供する。Ａ）Ａ５４９細胞（肺腺癌）、およびＢ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（乳癌）を、１．２５のＭＯＩで１時間、ワクシニアウイルスに感染させた。感染２２時間後、上清を収集し、清澄化し、そして細胞の新規プレートを感染させるために用いた。二次感染１５時間後、ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵとして測定）を決定した。変異体ワクシニアウイルスにおいて、より高いルシフェラーゼ活性が観察され、これらが異なるヒト癌細胞において、より強い伝播が可能であることを立証した。ＩＧＶ−００７はコペンハーゲン（対照）であり、ＩＧＶ−００６はコペンハーゲンＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−０５１はコペンハーゲンＡ３４ Ｆ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−０５２はＡ３３ Ａ８８ＤおよびＥ１２９ＭならびにＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換である。エラーバーはＳＤを示す（ｎ＝３）。アステリスクは、野生型Ａ３３およびＡ３４配列を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００７）に対する統計的有意性を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊＜０．０００１；一方向ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）。
実施例５
実施例１に記載するように、ＩＧＶ−０５１およびＩＧＶ−０５２ウイルスにおいて同定されるＡ３３およびＡ３４突然変異を用いて、すべてのありうる組み合わせで、ウイルス骨格としてＩＧＶ−００６およびＩＧＶ−００７を用いて、新規ウイルスを操作した。Ａ８８Ｄ、Ｅ１２９Ｍ、Ｆ９４Ｈ、およびＫ１５１Ｅ突然変異のすべての単一の置換および組み合わせの評価によって、伝播上の利点を与えるさらなる組み合わせおよび置換の同定が可能になった。実施例１に記載するように、ＥＥＶ産生およびウイルス伝播に対する単一のまたは多数の置換の影響を、ＢＳＣ−４０（アフリカミドリザル腎臓）およびＵ−２ ＯＳ（ヒト骨肉腫）細胞株を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。野生型Ａ３３およびＡ３４配列（ＩＧＶ−００７）、Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−００６；ウイルス伝播およびＥＥＶ産生を増加させる既知の突然変異）、Ａ３３中のＡ８８Ｄ置換（ＩＧＶ−０６０）、Ａ３３中のＥ１２９Ｍ置換（ＩＧＶ−０６１）、Ａ３４中のＦ９４Ｈ置換（ＩＧＶ−０６２）、Ａ３３中のＡ８８ＤおよびＥ１２９Ｍ置換（ＩＧＶ−０６３）、Ａ３３中のＡ８８Ｄ置換およびＡ３４中のＦ９４Ｈ置換（ＩＧＶ−０６４）、Ａ３３中のＥ１２９Ｍ置換およびＡ３４中のＦ９４Ｈ置換（ＩＧＶ−０６５）、Ａ３３中のＡ８８ＤおよびＥ１２９Ｍ置換ならびにＡ３４中のＦ９４Ｈ置換（ＩＧＶ−０６６）、Ａ３３中のＡ８８Ｄ置換およびＡ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０６７）、Ａ３３中のＥ１２９Ｍ置換およびＡ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０６８）、Ａ３３中のＡ８８ＤおよびＥ１２９Ｍ置換ならびにＡ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０６９）、Ａ３３中のＡ８８Ｄ置換ならびにＡ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０７０）、Ａ３３中のＥ１２９Ｍ置換ならびにＡ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０７１）、Ａ３３中のＡ８８ＤおよびＥ１２９Ｍ置換ならびにＡ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０７２）、またはＡ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０７３）を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルスを、実施例１に記載するように生成し、そして製造した。実施例１に記載するようにコメットアッセイを行った。このアッセイにおいて、Ｆ９４Ｈを含む置換の組み合わせは、一貫してより長くそしてより広いコメットテールを生じた（図１０Ａ；ＩＧＶ−０６２、ＩＧＶ−０６４、ＩＧＶ−０６５、ＩＧＶ−０６６対ＩＧＶ−００７）。逆に、Ａ８８ＤまたはＥ１２９Ｍの存在は、わずかにしかし認識可能に、元来のコメットのサイズに影響を及ぼすようであった（図１０Ａ：ＩＧＶ−０６６、ＩＧＶ−０６４、ＩＧＶ−０６１対ＩＧＶ−００７）。Ａ８８ＤおよびＦ９４Ｈの組み合わせは相乗性であり；プラークサイズはわずかに減少する一方、コメットテール拡散は増進した（図１０Ａ：ＩＧＶ−６０、ＩＧＶ−６２対ＩＧＶ−６４）。Ｋ１５１Ｅの存在下で、Ｆ９４Ｈ含有ウイルスは、一貫して、増進されたコメット形成を有した（図１１Ａ：ＩＧＶ−０７３対ＩＧＶ−００６、ＩＧＶ−０７０対ＩＧＶ−０６７、ＩＧＶ−０７１対ＩＧＶ−０６８、ＩＧＶ−０７２対ＩＧＶ−０６９）。実施例１に記載する伝播アッセイを用いて、変異体伝播を評価した。ルシフェラーゼ活性を、野生型Ａ３３およびＡ３４配列を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００７）のルシフェラーゼ活性およびＡ３４中のＫ１５１Ｅ置換を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００６）のルシフェラーゼ活性に比較し、そして倍増加として報告する（図１０Ｂ、図１１Ｂ）。野生型Ａ３３およびＡ３４配列を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００７）に比較すると、Ａ３４中のＦ９４Ｈ置換（ＩＧＶ−０６２）、Ａ３３中のＡ８８Ｄ置換およびＡ３４中のＦ９４Ｈ置換（ＩＧＶ−０６４）、Ａ３３中のＥ１２９Ｍ置換およびＡ３４中のＦ９４Ｈ置換（ＩＧＶ−０６５）、ならびにＡ３３中のＡ８８ＤおよびＥ１２９Ｍ置換ならびにＡ３４中のＦ９４Ｈ置換（ＩＧＶ−０６６）は、より高いルシフェラーゼ活性を生じ、変異体ワクシニアウイルスが、より強く伝播可能であることを立証した（図１０Ｂ）。Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００６）に比較して、Ａ３３中のＡ８８ＤおよびＥ１２９Ｍ置換ならびにＡ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０６９）、Ａ３３中のＡ８８Ｄ置換ならびにＡ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０７０）、Ａ３３中のＥ１２９Ｍ置換ならびにＡ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０７１）、Ａ３３中のＡ８８ＤおよびＥ１２９Ｍ置換ならびにＡ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０７２）、ならびにＡ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０７３）は、より高いルシフェラーゼアッセイを生じ、変異体ワクシニアウイルスがより強い伝播が可能であることを示した（図１１Ｂ）。この研究は、Ａ３３およびＡ３４への突然変異の取り込み、特にＡ３３中のＡ８８およびＥ１２９の位置、ならびにＡ３４中のＦ９４の位置の突然変異が、単独でまたは組み合わされて、ヒト癌細胞において、増進されたＥＥＶ産生および増進されたウイルス伝播につながることを立証する。
図１０Ａ〜１０Ｂは、ＥＥＶ産生およびウイルス伝播に対する、Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換の非存在下での、異なる変異体ワクシニアウイルス置換および置換の組み合わせに関するデータを提供する。Ａ）ＢＳＣ−４０細胞の感染後に形成されるコメットの代表的な画像は、Ａ３４ Ｋ１５１Ｅ置換の非存在下のいくつかの変異体ワクシニアウイルスが、Ａ３４中の置換を含まないコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００７、上部左）に比較して、増加したウイルス伝播およびＥＥＶ産生の指標であるより長いコメットテールを生じることを示す。Ｂ）Ｕ−２ ＯＳ細胞をＭＯＩ ０．６で１時間、ワクシニアウイルスに感染させた。感染２２時間後、上清を収集し、清澄化し、そして細胞の新規プレートを感染させるために用いた。二次感染の１５時間後、ルシフェラーゼレベル（ＲＬＵとして測定）を決定した。Ａ３４中の置換を含まないコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００７）のルシフェラーゼレベルに比較したルシフェラーゼレベルを、倍増加として報告する。大部分の単一の置換および置換組み合わせに関して、より高いルシフェラーゼレベルが観察され、変異体ワクシニアウイルスが、より強い伝播が可能であることを立証する。ＩＧＶ−００７はコペンハーゲン（対照）であり、ＩＧＶ−０６０はＡ３３ Ａ８８Ｄ置換であり、ＩＧＶ−０６１はＡ３３ Ｅ１２９Ｍ置換であり、ＩＧＶ−０６２はＡ３４ Ｆ９４Ｈ置換であり、ＩＧＶ−０６３はＡ３３ Ａ８８ＤおよびＥ１２９Ｍ置換であり、ＩＧＶ−０６４はＡ３３ Ａ８８ＤおよびＡ３４ Ｆ９４Ｈ置換であり、ＩＧＶ−０６５はＡ３３Ｅ Ｅ１２９ＭおよびＡ３４ Ｆ９４Ｈ置換であり、ＩＧＶ−０６６はＡ３３ Ａ８８ＤおよびＥ１２９ＭならびにＡ３４ Ｆ９４Ｈ置換である。エラーバーはＳＤを示す（ｎ＝３）。アステリスクは、Ａ３４中に置換を含まないコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００７）に対する統計的有意性を示す（＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊＜０．０００１；一方向ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）。
図１１Ａ〜１１Ｂは、ＥＥＶ産生およびウイルス伝播に対する、Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換に加えた、異なる変異体ワクシニアウイルス置換および置換の組み合わせに関するデータを提供する。Ａ）ＢＳＣ−４０細胞感染後に形成されるコメットの代表的な画像は、Ａ３４ Ｋ１５１Ｅ置換の存在下の変異体ワクシニアウイルスが、Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００６、上部左）に比較して、増加したウイルス伝播およびＥＥＶ産生の指標であるより長いコメットテールを生じることを示す。Ｂ）Ｕ−２ ＯＳ細胞をＭＯＩ ０．３３で１時間、ワクシニアウイルスに感染させた。感染２２時間後、上清を収集し、清澄化し、そして細胞の新規プレートを感染させるために用いた。二次感染の１５時間後、ルシフェラーゼレベル（ＲＬＵとして測定）を決定した。Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００６）のルシフェラーゼレベルに比較したルシフェラーゼレベルを、倍増加として報告する。大部分の変異体組み合わせに関して、より高いルシフェラーゼレベルが観察され、変異体ワクシニアウイルスが、より強く伝播可能であることを立証する。ＩＧＶ−００６はコペンハーゲンＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換（対照）であり、ＩＧＶ−０６７はＡ３３ Ａ８８ＤおよびＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−０６８はＡ３３ Ｅ１２９ＭおよびＡ３４ Ｋ１５１置換であり、ＩＧＶ−０７３はＡ３４ Ｆ９４ＨおよびＫ１５１Ｋ置換であり、ＩＧＶ−０６９はＡ３３ Ａ８８ＤおよびＥ１２９ＭならびにＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−０７０はＡ３３ Ａ８８ＤならびにＡ３４ Ｆ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−０７１はＡ３３ Ｅ１２９ＭならびにＡ３４ Ｆ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−０７２はＡ３３ Ａ８８ＤおよびＥ１２９ＭならびにＡ３４ Ｆ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換である。エラーバーはＳＤを示す（ｎ＝３）。アステリスクは、コペンハーゲンＡ３４ Ｋ１５１Ｅ（ＩＧＶ−００６）に対する統計的有意性を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＜０．０００１；一方向ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）。
実施例６
癌細胞におけるＥＥＶ総物理的粒子産生および特異的感染性に関する置換変異体の影響をさらに評価するため、感染２４時間後のＨｅＬａ Ｓ３細胞（子宮頸腺癌）において産生される物理的および感染性ＥＥＶの数を決定した。感染ＨｅＬａ Ｓ３細胞由来の上清を収集し、そして塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配によって精製して、精製ＥＥＶを得た。実施例１に記載するようなプラークアッセイによって、感染性ＥＥＶを力価決定した。ビリオンサイズ粒子（ＶＳＰ）の物理的数およびＢ５抗体で染色されるこれらの粒子の割合を、Ａｐｏｇｅｅによって定量化した。Ａ３３中のＡ８８ＤおよびＥ１２９Ｍ置換ならびにＡ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０５１）、Ａ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０５２）、ならびにＡ３３中のＡ８８Ｄ置換ならびにＡ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０７０）を含有するウイルス変異体は、野生型Ａ３３およびＡ３４配列を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００７）に比較した際、ＥＥＶ膜タンパク質Ｂ５に関する抗体染色によって測定すると、より高い割合の物理的ＥＥＶ粒子を生じた（図１２Ａ）。生じる物理的ＥＥＶ粒子の増加に加えて、ウイルス変異体（ＩＧＶ−０５１、ＩＧＶ−０５２およびＩＧＶ−０７０）は、野生型Ａ３３およびＡ３４配列を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００７）ならびにＡ３４中のＫ１５１Ｅ置換を含むコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００６；ウイルス伝播およびＥＥＶ産生を増加させる既知の突然変異）に比較した際、ＰＦＵで割ったＶＳＰの感染性を計算することによって測定される特異的感染性の増加を伴うＥＥＶを産生した（図１２Ｂ）。この研究はさらに、Ａ３３およびＡ３４への突然変異の取り込み、特にＡ３３中のＡ８８およびＥ１２９の位置、ならびにＡ３４中のＦ９４の位置の突然変異をＡ３４中のＫ１５１Ｅ置換と組み合わせると、特異的感染性が増加した、増進された感染性ＥＥＶ産生につながることを立証する。
図１２Ａ〜１２Ｂは、ＨｅＬａ Ｓ３（子宮頸腺癌）細胞株における物理的ＥＥＶの産生および特異的感染性におけるワクシニアウイルスの異なる変異体に関するデータを提供する。ＨｅＬａ Ｓ３細胞（子宮頸腺癌）を異なるワクシニアウイルス変異体に感染させた。感染２４時間後、上清からウイルス粒子を収集し、そしてＣｓＣｌ勾配によって精製した。ＥＥＶ密度に対応する勾配バンドを回収した。ウイルスサイズ粒子（ＶＳＰ）の総数、Ｂ５＋ ＶＳＰの割合、および上清中に産生された感染性ウイルスを定量化した。Ａ）Ｂ５＋ ＶＳＰ（ＥＥＶエンベロープタンパク質の存在の指標）の割合をＡｐｏｇｅｅによって定量化した。データは、野生型Ａ３３およびＡ３４配列を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００７）に対する各組換えウイルス変異体の倍増加として報告される。Ｂ）ＥＥＶ粒子の特異的感染性を、上清中の物理的ＶＳＰあたりの感染性ウイルスの比として計算する。データは、野生型Ａ３３およびＡ３４配列を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００７）と比較した倍増加として報告される。野生型Ａ３３およびＡ３４配列を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス、ならびにＡ３４中にＫ１５１Ｅ置換を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００６）に比較した、物理的および感染性ＥＥＶウイルス粒子の量の増加は、変異体ワクシニアウイルスが、ＥＥＶ産生ならびにその特異的感染性を増加させることを立証する。ＩＧＶ−００７はコペンハーゲン（対照）であり、ＩＧＶ−００６はコペンハーゲンＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換（対照）であり、ＩＧＶ−０５１はＡ３３ Ａ８８ＤおよびＥ１２９ＭならびにＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−０５２はＡ３４ Ｆ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−０７０はＡ３３ Ａ８８ＤならびにＡ３４ Ｆ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換である。
実施例７
ウェスタンリザーブ（ＷＲ）ワクシニアウイルス株におけるＥＥＶ産生およびウイルス伝播に対するウイルス変異体の影響を、ＲＫ−１３（ウサギ腎臓）およびＶＥＲＯ−Ｂ４（アフリカミドリザル腎臓）細胞株を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。野生型Ａ３３およびＡ３４配列（ＩＧＶ−０１３）、Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−１１７；ウイルス伝播およびＥＥＶ産生を増加させる既知の突然変異）、Ａ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−１１８）、Ａ３３中のＡ８８Ｄ置換ならびにＡ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−１１９）、ならびにＡ３３中のＡ８８ＤおよびＥ１２９Ｍ置換ならびにＡ３４中のＦ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−１２０）を含有するＷＲワクシニアウイルスを、実施例１に記載するように生成し、そして製造した。実施例１に記載する伝播アッセイを用いて、変異体伝播を評価した。野生型Ａ３３およびＡ３４配列を含有するＷＲワクシニアウイルス（ＩＧＶ−０１３）に比較して、変異体ワクシニアウイルスは、より高い度合いの相対光単位（ＲＬＵ）を生じ、増進されたウイルス伝播を示す（図１３）。これらの研究は、ＷＲのような他のワクシニアウイルス株において、Ａ３３およびＡ３４への突然変異の取り込み、特に、Ａ３３中のＡ８８およびＥ１２９の位置、ならびにＡ３４中のＦ９４の位置の突然変異をＡ３４中のＫ１５１Ｅ置換と組み合わせると、増進されたＥＥＶ産生およびしたがってウイルス伝播を導くことを例示する。
図１３Ａ〜１３Ｂは、ＥＥＶ産生およびウイルス伝播に対する、ウェスタンリザーブ株上のＡ３４中のＫ１５１Ｅ置換と組み合わせた、異なる変異体ワクシニアウイルス置換に関するデータを提供する。Ａ）ＲＫ−１３細胞を、ＭＯＩ ５０で１時間、ワクシニアウイルスに感染させた。感染２４時間後、上清を収集し、清澄化し、そして細胞の新規プレートを感染させるために用いた。二次感染２４時間後、ルシフェラーゼレベル（ＲＬＵとして測定）を決定した。ウェスタンリザーブワクシニアウイルス（ＩＧＶ−０１３）のルシフェラーゼレベルに比較した変異体のルシフェラーゼレベルを倍増加として報告する。Ｂ）ＶＥＲＯ−Ｂ４細胞を、ＭＯＩ ５０で１時間、ワクシニアウイルスに感染させた。感染２４時間後、上清を収集し、清澄化し、そして細胞の新規プレートを感染させるために用いた。二次感染２４時間後、ルシフェラーゼレベル（ＲＬＵとして測定）を決定した。ウェスタンリザーブワクシニアウイルス（ＩＧＶ−０１３）のルシフェラーゼレベルに比較した変異体のルシフェラーゼレベルを倍増加として報告する。すべての変異体組み合わせに関して、より高いルシフェラーゼレベルが観察され、変異体ワクシニアウイルスが、より強く伝播可能であることが立証された。ＩＧＶ−０１３は野生型Ａ３３およびＡ３４配列を含むウェスタンリザーブ（対照）であり、ＩＧＶ−１１７はウェスタンリザーブＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換（対照）であり、ＩＧＶ−１１８はＡ３４ Ｆ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−１１９はＡ３３ Ａ８８ＤならびにＡ３４ Ｆ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−１２０はＡ３３ Ａ８８ＤおよびＥ１２９ＭならびにＡ３４ Ｆ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換である。エラーバーはＳＤを示す（ｎ＝３）。アステリスクは、ウェスタンリザーブ（ＩＧＶ−０１３）に対する統計的有意性を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＜０．０００１；一方向ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）。
実施例８
次の選択は、ＨＣＴ１１６結腸直腸ヒト癌細胞の感染後の増進されたウイルス伝播およびＥＥＶ産生が可能な変異体を同定した。配列決定した集団内で増加した頻度を示す４つの変異体を同定した（図１４）。４つの変異体のうち、Ａ３４配列に対するＲ９１Ｓ置換を含有するものは、最終選択ラウンドにおいて、最大の濃縮を示した（図１４）。
図１４は、ＨＣＴ １１６ヒト結腸直腸癌細胞に対する感染および選択後、増進されたウイルス伝播およびＥＥＶ産生が可能な変異体を同定する、定向進化プロセスの最終ラウンドにおける、特定のワクシニアウイルス変異体の頻度に関するデータを提供する。ライブラリーの代表的な分画を、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）または個々のプラークのサンガー配列決定を用いて、最終選択ラウンド後に配列決定した。総集団の割合として表される、４つの最も蔓延している変異体の頻度は、選択の経過に渡って有意に増加した。Ｒ９１Ｓ、Ｔ１２７Ｅ、Ｒ８４Ｇ、またはＦ９４Ｈ置換を含有するＡ３４変異体に関する濃縮は、ワクシニアウイルスが、ヒト癌細胞感染後、伝播し、そしてＥＥＶを産生する能力を、これらの置換が増加させることを立証する。
ＢＳＣ−４０（アフリカミドリザル腎臓）およびＵ−２ ＯＳ（ヒト骨肉腫）細胞株を用い、ＥＥＶ産生およびウイルス伝播に対する置換変異体の影響をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。野生型Ａ３３およびＡ３４配列（ＩＧＶ−００７）、Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−００６；ウイルス伝播およびＥＥＶ産生を増加させる既知の突然変異）、Ａ３４中のＲ９１ＳおよびＫ１５１Ｅ置換ならびにＡ５６中のＩ２６９Ｆ置換（ＩＧＶ−０８４）、Ａ３４中のＴ１２７ＥおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０８５）、Ａ３４中のＲ８４ＧおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０８６）、またはＡ３４中のＲ９１ＡおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０８７）を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルスを、実施例１に記載するように生成し、そして製造した。実施例１に記載するように、コメットアッセイを行った。野生型Ａ３４配列を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルスに比較した、変異体ワクシニアウイルスに関するより長いコメットテールの存在（図１５Ａ）は、変異体ワクシニアウイルスによって、ウイルスがより伝播し、そしてＥＥＶ産生が増加したことを示す。実施例１に記載する伝播アッセイを用いて、変異体伝播を評価した。Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００６）に比較して、Ａ３４中のＲ９１ＳおよびＫ１５１Ｅ置換ならびにＡ５６中のＩ２６９Ｆ置換（ＩＧＶ−０８４）、Ａ３４中のＴ１２７ＥおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０８５）、またはＡ３４中のＲ８４ＧおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０８６）、またはＡ３４中のＲ９１ＡおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０８７）は、より高いルシフェラーゼレベルを生じ、変異体ワクシニアウイルスが、より強い伝播が可能であることを示す（図１５Ｂ）。異なるヒト結腸直腸癌細胞株における上清中の感染性ウイルス粒子産生（ＥＥＶ産生）に対する置換変異体の影響を、ＨＣＴ １１６細胞（結腸直腸癌腫）、ＨＴ−２９細胞（結腸直腸腺癌）、Ｃｏｌｏ２０５細胞（結腸直腸腺癌）、およびＳＷ−５２０細胞（結腸直腸腺癌）を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。上記細胞株すべてを、３のＭＯＩで感染させ、そしてウイルス吸着１時間後、徹底的に３回洗浄した（１回洗浄したＣｏｌｏ２０５細胞以外）。感染２４時間後、上清を収集し、そして実施例１に記載するようなプラークアッセイを行うことによって、生じた感染性ウイルス粒子（潜在的なＥＥＶ）の数を決定した。４つの細胞株すべてにおいて、Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換およびＡ３４中のＴ１２７置換の組み合わせ（ＩＧＶ−０８５）、またはＡ３４中のＲ８４Ｇ置換（ＩＧＶ−０８６）を含有する置換変異体は、上清中により多数の感染性ウイルス粒子を生じ、ＥＥＶ粒子形成増加が示唆された（図１５Ｃ〜１５Ｆ）。この研究はさらに、Ａ３４に対する突然変異の取り込み、特にＡ３４中のＲ８４、Ｒ９１、およびＴ１２７での突然変異をＡ３４中のＫ１５１ＥおよびＡ５６中のＩ２６９Ｆと組み合わせると、ヒト結腸直腸癌細胞において、増進されたＥＥＶ産生および増進されたウイルス伝播が導かれることをさらに例示する。
図１５Ａ〜Ａ１５Ｆは、Ａ３４置換を含有するさらなるワクシニアウイルス変異体のウイルス伝播およびＥＥＶ産生に関するデータを提供する。Ａ）ＢＳＣ−４０細胞の感染後に形成されるプラークの代表的な画像は、変異体ワクシニアウイルスがより長いコメットテールを生じることを示し、これは、野生型Ａ３３およびＡ３４配列を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（上部左）、ならびにＡ３４中にＫ１５１Ｅ置換を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（ウイルス伝播およびＥＥＶ産生を増加させる既知の突然変異；上部右）に比較して、より優れたおよび増進されたＥＥＶ産生の指標である。Ｂ）ウイルス伝播を測定する２段階感染性アッセイであって、ここで、Ｕ−２ ＯＳ細胞をまず、等しい感染多重度（ＭＯＩ）のワクシニアウイルスに感染させ、次いで、感染２２時間後に上清を収集し、そしてこれを用いてＵ−２ ＯＳ細胞の新規プレートを感染させた。ウイルスから発現されるルシフェラーゼを感染１５時間後に測定し、そしてルシフェラーゼの増加したレベルは、感染のより高い速度と相関する。したがって、より高いルシフェラーゼは、伝播増加の指標である。ＩＧＶ−００６（Ａ３４中にＫ１５１Ｅ置換を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス）中のルシフェラーゼ発現に比較した倍増加として、データを提供する。Ａ３４中のＲ９１ＳおよびＫ１５１置換ならびにＡ５６中のＩ２６９Ｆ置換（ＩＧＶ−０８４）、Ａ３４中のＴ１２７ＥおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０８５）、Ａ３４中のＲ８４ＧおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０８６）、またはＡ３４中のＲ９１ＡおよびＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−０８７）を含有するワクシニアウイルス変異体は、Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換を含むコペンハーゲンウイルス（ＩＧＶ−００６）に比較して、ウイルス伝播の２．５倍を超える増加を示し、これは、癌における腫瘍溶解活性改善を導きうる。Ｃ）ＨＣＴ １１６（結腸直腸癌腫）、Ｄ）ＨＴ−２９（結腸直腸癌腫）、Ｅ）Ｃｏｌｏ２０５（結腸直腸腺癌）、およびＦ）ＳＷ−６２０（結腸直腸腺癌）細胞株の感染２４時間後の上清中の感染性ウイルスの定量化。細胞株を３のＭＯＩでワクシニアウイルスに感染させた。感染２４時間後、上清中に産生された感染性ウイルス粒子（ＥＥＶ）の数をプラークアッセイによって決定した。ＩＧＶ−００７はコペンハーゲン（対照）であり、ＩＧＶ−００６はコペンハーゲンＡ３４ Ｋ１５１置換であり、ＩＧＶ−０８４はコペンハーゲンＡ３４ Ｒ９１ＳおよびＫ１５１Ｅ置換ならびにＡ５６ Ｉ２６９Ｆ置換であり、ＩＧＶ−０８５はコペンハーゲンＡ３４ Ｔ１２７ＥおよびＫ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−０８６はコペンハーゲンＡ３４ Ｒ８４ＧおよびＫ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−０８７はコペンハーゲンＡ３４ Ｒ９１ＡおよびＫ１５１Ｅ置換である。エラーバーはＳＤを示す（ｎ＝３）。アステリスクは、Ａ３４Ｒ遺伝子中にＫ１５１Ｅ置換を含むコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００６）に対する統計的有意性を示す（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＜０．０００１；通常の一方向ＡＮＯＶＡ後、Ｔｕｋｅｙの多数比較検定）。
実施例９
次の選択は、Ｃｏｌｏ ２０５結腸直腸ヒト癌細胞の感染後の増進されたウイルス伝播およびＥＥＶ産生が可能な変異体を同定した。配列決定した集団内で増加した頻度を示す２つの変異体を同定した（図１７）。２つの変異体のうち、Ｂ５配列に対するＳ１９７Ｆ置換を含有するものは、最終選択ラウンドにおいて、最大の濃縮を示した（図１７）。
図１７は、Ｃｏｌｏ ２０５ヒト結腸直腸癌細胞に対する感染および選択後、増進されたウイルス伝播およびＥＥＶ産生が可能な変異体を同定する、定向進化プロセスの最終ラウンドにおける、特定のワクシニアウイルス変異体の頻度に関するデータを提供する。ライブラリーの代表的な分画を、アンプリコン次世代配列決定（ＮＧＳ）を用いた最終選択ラウンド後に配列決定した。総集団の割合として表される、２つの最も蔓延している変異体の頻度は、選択の経過に渡って有意に増加した。Ｓ１９７ＦまたはＳ１９７Ｖ置換を含有するＢ５変異体に関する濃縮は、ワクシニアウイルスが、ヒト癌細胞感染後、伝播し、そしてＥＥＶを産生する能力を、これらの置換が増加させることを立証する。
実施例１０
以下の選択は、ワクシニアウイルスをワクチン接種されたドナー由来の血清の非存在下または存在下での、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞の感染後、増進されたウイルス伝播およびＥＥＶ産生が可能な変異体を同定した。配列決定された集団内で増加した頻度を示す変異体が、血清の非存在下で３つ、および血清の存在下で２つ、全部で５つ同定された（図１８）。
図１８Ａ〜１８Ｂは、ワクシニアウイルスをワクチン接種されたドナー由来の血清の非存在下または存在下での、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞の感染後、増進されたウイルス伝播およびＥＥＶ産生が可能な変異体を同定する、定向進化プロセスの最終ラウンドにおける特定のワクシニアウイルス変異体の頻度に関するデータを提供する。ライブラリーの代表的な分画を、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）または個々のプラークのサンガー配列決定のいずれかを用いて、最終選択ラウンド後に配列決定した。総集団の割合として表される、５つの最も蔓延している変異体の頻度は、選択の経過に渡って有意に増加した。Ｎ３９ＧおよびＳ２７３Ｉ置換、Ｓ１９９Ｍ置換、Ｌ９０ＲおよびＳ２７３Ｖ置換、Ｋ２２９ＣおよびＳ２７３Ｌ置換、またはＳ２７３Ｉ置換を含有するＢ５変異体に関する濃縮は、ワクシニアウイルスが、ヒト乳癌細胞感染後、ウイルス伝播を増進し、そしてＥＥＶを産生する能力を、これらの置換が増加させることを立証する。
ＢＳＣ−４０（アフリカミドリザル腎臓）およびＵ−２ ＯＳ（ヒト骨肉腫）細胞株を用い、ＥＥＶ産生およびウイルス伝播に対する置換変異体の影響をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。野生型Ａ３３、Ａ３４、およびＢ５配列（ＩＧＶ−００７）、Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−００６；ウイルス伝播およびＥＥＶ産生を増加させる既知の突然変異）、Ｂ５中のＫ２２９ＣおよびＳ２７３Ｌ置換（ＩＧＶ−１１０）、Ｂ５中のＮ３９ＧおよびＳ２７３Ｉ置換（ＩＧＶ−１１２）、Ｂ５中のＳ１９９Ｍ置換（ＩＧＶ−１１６）、Ｂ５中のＬ９０ＲおよびＳ２７３Ｖ置換（ＩＧＶ−１１４）、またはＢ５中のＳ２７３Ｉ置換（ＩＧＶ−１１１）を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルスを、実施例１に記載するように生成し、そして製造した。実施例１に記載するように、コメットアッセイを行った。野生型Ｂ５配列を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルスに比較した、変異体ワクシニアウイルスに関するより長いコメットテールの存在（図１９Ａ）は、変異体ワクシニアウイルスによって、ウイルスＥＥＶ型がより多く産生されていることを示す。実施例１に記載する伝播アッセイを用いて、変異体伝播を評価した。Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換のみを含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００６）に比較して、Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換およびＢ５中の大部分の置換の組み合わせは、より高いルシフェラーゼ活性を生じ、変異体ワクシニアウイルスが、より強く伝播可能であることを示す（図１９Ｂ）。特に、Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換とＢ５中のＳ２７３Ｌ置換（ＩＧＶ−１０９）、Ｂ５中のＳ２７３Ｉ置換（ＩＧＶ−１１１）、Ｂ５中のＮ３９ＧおよびＳ２７３Ｉ置換（ＩＧＶ−１１２）、Ｂ５中のＬ９０ＲおよびＳ２７３Ｖ置換（ＩＧＶ−１１４）、またはＢ５中のＳ１９９Ｍ置換（ＩＧＶ−１１６）の組み合わせは、有意に増進された伝播につながる。この研究はさらに、Ｂ５に対する突然変異の取り込みが、単独でまたは組み合わせで、癌細胞において、増進されたＥＥＶ産生および増進されたウイルス伝播を導くことをさらに例示する。
図１９Ａ〜１９Ｂは、Ｂ５置換を含有するワクシニアウイルス変異体のウイルス伝播およびＥＥＶ産生に関するデータを提供する。Ａ）ＢＳＣ−４０細胞の感染後に形成されるコメットの代表的な画像は、Ｂ５中の置換およびＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換の組み合わせを含む変異体ワクシニアウイルスがより長いコメットテールを生じることを示し、これは、コペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００７、上部左）に比較して、増加したＥＥＶ産生の指標である。Ｂ）Ｕ−２ ＯＳ細胞をＭＯＩ ０．３３で１時間、ワクシニアウイルスに感染させた。感染２２時間後、上清を収集し、そして細胞の新規プレートを感染させるために用いた。二次感染１５時間後、ルシフェラーゼレベル（ＲＬＵとして測定）を決定した。Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００６）のルシフェラーゼレベルに比較した、ウイルス変異体のルシフェラーゼレベルを、倍増加として報告する。大部分の変異体組み合わせに関して、より高いルシフェラーゼレベルが観察され、変異体ワクシニアウイルスが、より強く伝播可能であることを立証した。ＩＧＶ−００７はコペンハーゲン（対照）であり、ＩＧＶ−００６はコペンハーゲンＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換（対照）であり、ＩＧＶ−１０９はＢ５ Ｓ２７３ＬおよびＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−１１０はＢ５ Ｋ２２９ＣおよびＳ２７３ＬならびにＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−１１１はＢ５ Ｓ２７３ＩおよびＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−１１２はＢ５ Ｎ３９ＧおよびＳ２７３ＩならびにＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−１１３はＢ５ Ｓ２７３ＶおよびＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−１１４はＢ５ Ｌ９０ＲおよびＳ２７３ＶならびにＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−１１５はＢ５ Ｎ３９ＧおよびＳ２７３ＩならびにＡ３４ Ｆ９４ＨおよびＫ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−１１６はＢ５ Ｓ１９９ＭおよびＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換である。エラーバーはＳＤを示す（ｎ＝３）。アステリスクは、コペンハーゲンＡ３４Ｒ＿Ｋ１５１Ｅ（ＩＧＶ−００６）に対する統計的有意性を示す（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊＜０．０００１；一方向ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）。
実施例１１
異なるヒト癌細胞株における、上清中の感染性ウイルス粒子産生（ＥＥＶ産生）に対する置換変異体の影響を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（乳腺癌）、ＭＣＦ７細胞（乳腺癌）、Ｔ４７Ｄ細胞（乳癌）、およびＨＣＴ １１６細胞（結腸直腸癌）を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。野生型Ａ３３、Ａ３４、およびＢ５配列（ＩＧＶ−００７）、Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−００６；ウイルス伝播およびＥＥＶ産生を増加させる既知の突然変異）を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス、ならびにＡ３４中のＫ１５１Ｅ置換ならびにＢ５中のＫ２２９ＣおよびＳ２７３Ｌ置換（ＩＧＶ−１１０）、Ｂ５中のＳ２７３Ｉ置換（ＩＧＶ−１１１）、Ｂ５中のＮ３９ＧおよびＳ２７３Ｉ置換（ＩＧＶ−１１２）、Ｂ５中のＬ９０ＲおよびＳ２７３Ｖ置換（ＩＧＶ−１１４）、またはＢ５中のＳ１９９Ｍ置換（ＩＧＶ−１１６）の組み合わせを含有するワクシニアウイルス変異体を、実施例１に記載するように生成し、そして製造した。上記のすべての細胞株を、３のＭＯＩで感染させ、そしてウイルス吸着の１時間後、徹底的に３回洗浄した。感染２４時間後、上清を収集し、そして産生された感染性ウイルス（ＥＥＶ）粒子の数を、実施例１に記載するようなプラークアッセイを行うことによって決定した。４つの細胞株すべてにおいて、Ａ３４中のＫ１５１置換、ならびにＢ５中のＫ２２９ＣおよびＳ２７３Ｌ置換（ＩＧＶ−１１０）、Ｂ５中のＳ２７３Ｉ置換（ＩＧＶ−１１１）、Ｂ５中のＮ３９ＧおよびＳ２７３Ｉ置換（ＩＧＶ−１１２）、Ｂ５中のＬ９０ＲおよびＳ２７３Ｖ置換（ＩＧＶ−１１４）、またはＢ５中のＳ１９９Ｍ置換（ＩＧＶ−１１６）の組み合わせを含有する置換変異体は、上清中により多数の感染性ウイルス粒子を生じ、ＥＥＶ粒子形成の増加が示唆された（図２０Ａ〜２０Ｄ）。この研究は、Ｂ５への突然変異の取り込みが、異なる癌細胞株において、増進された感染性ＥＥＶ産生につながることを立証する。
図２０Ａ〜２０Ｄは、代表的なヒト癌細胞株において、上清に放出されたワクシニアウイルス感染性ビリオン（潜在的にＥＥＶ）に関するデータを提供する。Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（乳腺癌）、Ｂ）ＭＣＦ７細胞（乳腺癌）、Ｃ）Ｔ４７Ｄ細胞（乳癌）、およびＤ）ＨＣＴ１１６細胞（結腸直腸癌）を、３のＭＯＩでワクシニアウイルスに感染させた。感染２４時間後、プラークアッセイによって、上清に放出された感染性ウイルス粒子（ＥＥＶ）の数を決定した。各癌細胞株において産生された、上清中の感染性ウイルスの倍増加を、野生型Ａ３３、Ａ３４、およびＢ５配列を含有するコペンハーゲンウイルス（ＩＧＶ−００７）に比較して、各ウイルス変異体に関して計算した。試験したすべての癌細胞株において、野生型Ａ３３、Ａ３４、およびＢ５配列を含有するコペンハーゲンに比較して、ワクシニアウイルス変異体に関して感染性ウイルスの有意な増加がある。ＩＧＶ−００７はコペンハーゲン（対照）であり、ＩＧＶ−００６はコペンハーゲンＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換（対照）であり、ＩＧＶ−１１０はＢ５ Ｋ２２９ＣおよびＳ２７３ＬならびにＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−１１１はＢ５ Ｓ２７３ＩおよびＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−１１２はＢ５ Ｎ３９ＧおよびＳ２７３ＩならびにＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−１１４はＢ５ Ｌ９０ＲおよびＳ２７３ＶならびにＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−１１６はＢ５ Ｓ１９９ＭおよびＡ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ置換である。エラーバーはＳＤを示す（ｎ＝３）。アステリスクは、野生型Ａ３３、Ａ３４、およびＢ５配列を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００７）に対する統計的有意性を示す（＊ｐ＜０．５；＊＊＊＊＜０．０００１；一方向ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）。
実施例１２
マウス癌モデルで行ったｉｎ ｖｉｖｏ選択は、ヒト患者由来癌細胞を含有するマウスをワクシニアウイルスに感染させた後、増進された伝播およびＥＥＶ産生が可能な変異体を同定した。配列決定された集団内で増加した頻度を示す、結腸直腸癌の患者由来異種移植（ＰＤＸ)マウス両側モデルを用いて２つ、そしてヒト化血液系もまた含有する結腸直腸癌の患者由来異種移植（ＰＤＸ）マウス両側モデルを用いて６つの、総数８の変異体が同定された（図２１）。
図２１Ａ〜２１Ｂは、ｉｎ ｖｉｖｏで増進された伝播が可能な変異体を同定するための定向進化プロセスにおける、特定のワクシニアウイルス変異体の頻度に関するデータを提供する。ライブラリーの代表的な分画を、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）または個々のプラークのサンガー配列決定（プラーク配列決定）を用いて、最終選択ラウンド後に配列決定した。総集団の割合として表される、８つの最も蔓延している変異体の頻度は、選択の経過に渡って有意に増加した。ストーク領域内またはその周辺での多数の置換を含有するＢ５変異体およびＡ３３／Ａ３４変異体に関する濃縮は、ワクシニアウイルスが、ｉｎ ｖｉｖｏで、ヒト癌細胞感染後の伝播を増進させる能力を、これらの置換が増加させることを立証する。
ＢＳＣ−４０（アフリカミドリザル腎臓）およびＵ−２ ＯＳ（ヒト骨肉腫）細胞株を用い、ＥＥＶ産生およびウイルス伝播に対する置換変異体の影響をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。野生型Ａ３３、Ａ３４、およびＢ５配列（ＩＧＶ−００７）、Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換（ＩＧＶ−００６；ウイルス伝播およびＥＥＶ産生を増加させる既知の突然変異）を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス、ならびにＡ３４中のＫ１５１Ｅ置換と、Ｂ５中のＩ２３６Ｐ、Ｖ２３８Ｒ、Ｔ２４０Ｒ、およびＥ２４３Ｇ置換（ＩＧＶ−１０１）、Ｂ５中のＶ２３３Ｄ、Ｉ２３６Ｌ、Ｖ２３８Ｗ、Ｔ２４０Ｙ、およびＥ２４３Ｒ置換（ＩＧＶ−１０２）、Ｂ５中のＤ２６３Ｖ、Ｅ２６８Ｔ、Ｅ２７０Ｇ、Ｅ２７２Ｐ、およびＥ２７５Ｓ置換（ＩＧＶ−１０３）、Ｂ５中のＮ９４Ｔ置換（ＩＧＶ−１０４）、Ａ３３中のＭ６３Ｒ置換およびＡ３４中のＭ６６Ｔ置換（ＩＧＶ−１０５）、Ｂ５中のＮ２４１Ｇ、Ｅ２４３Ｓ、Ｖ２４７Ｗ、Ｄ２４８Ｙ、Ｇ２５０Ａ、およびＡ２７６Ｆ置換（ＩＧＶ−１０６）、Ｂ５中のＤ２６３Ａ、Ｅ２７０Ｓ、Ｅ２７２Ｇ、およびＥ２７５Ｆ置換（ＩＧＶ−１０７）、またはＢ５中のＮ２４１Ｔ、Ｅ２４３Ｖ、Ｖ２４７Ｓ、Ｇ２５０Ｒ、およびＡ２７６Ｆ置換（ＩＧＶ−１０８）を含有する変異体を、実施例１に記載するように生成し、そして製造した。実施例１に記載するように、コメットアッセイを行った。野生型Ａ３３、Ａ３４、およびＢ５配列を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルスに比較した、変異体ワクシニアウイルスに関するより長いコメットテールの存在（図２２Ａ〜２２Ｃ）は、変異体ワクシニアウイルスによって、ウイルスがよりよく伝播し、そしてしたがってより多いＥＥＶ型が産生されたことを示す。実施例１に記載する伝播アッセイを用いて、変異体伝播をさらに評価した。野生型Ａ３３、Ａ３４、およびＢ５配列を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００７）に比較して、Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換およびＡ３３／Ａ３４またはＢ５中の置換の組み合わせは、より高いルシフェラーゼレベルを生じ、変異体ワクシニアウイルスが、より強い伝播が可能であることを示す（図２２Ｄ）。特に、Ａ３４中のＫ１５１Ｅ置換と、Ｂ５中のＶ２３３Ｄ、Ｉ２３６Ｌ、Ｖ２３８Ｗ、Ｔ２４０Ｙ、およびＥ２４３Ｒ置換（ＩＧＶ−１０２）、Ａ３３中のＭ６３ＲおよびＡ３４中のＭ６６Ｔ置換（ＩＧＶ−１０５）、Ｂ５中のＮ２４１Ｇ、Ｅ２４３Ｓ、Ｖ２４７Ｗ、Ｄ２４８Ｙ、Ｇ２５０Ａ、およびＡ２７６Ｆ置換（ＩＧＶ−１０６）、Ｂ５中のＤ２６３Ａ、Ｅ２７０Ｓ、Ｅ２７２Ｇ、およびＥ２７５Ｆ置換（ＩＧＶ−１０７）、またはＢ５中のＮ２４１Ｔ、Ｅ２４３Ｖ、Ｖ２４７Ｓ、Ｇ２５０Ｒ、およびＡ２７６Ｆ置換（ＩＧＶ−１０８）の組み合わせは、有意に増進された伝播を導いた。この研究はさらに、Ａ３３、Ａ３４、またはＢ５に対する突然変異の取り込みが、単独でまたは組み合わせて、癌細胞において、増進されたＥＥＶ産生および増進されたウイルス伝播を導くことをさらに例示する。
図２２Ａ〜２２Ｄは、Ａ３３／Ａ３４またはＢ５置換を含有するさらなるワクシニアウイルス変異体のウイルス伝播およびＥＥＶ産生に関するデータを提供する。Ａ）ＢＳＣ−４０細胞の感染後に形成されるコメットの代表的な画像は、Ｂ５中の置換およびＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換の組み合わせを含む変異体ワクシニアウイルスが、より長いコメットテールを生じることを示し、これは、コペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００７、左）に比較して、増加した伝播およびＥＥＶ産生の指標である。Ｂ）ＢＳＣ−４０細胞の感染後に形成されるコメットの代表的な画像は、Ａ３３／Ａ３４またはＢ５中の置換およびＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換の組み合わせを含む変異体ワクシニアウイルスが、より長いコメットテールを生じることを示し、これは、コペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００７、上部左）に比較して、増加した伝播およびＥＥＶ産生の指標である。Ｃ）ＢＳＣ−４０細胞の感染後に形成されるコメットの代表的な画像は、Ｂ５中の置換およびＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換の組み合わせを含む変異体ワクシニアウイルスが、より長いコメットテールを生じることを示し、これは、コペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００７、上部左）に比較して、増加した伝播およびＥＥＶ産生の指標である。Ｄ）Ｕ−２ ＯＳ細胞を、１のＭＯＩで１時間、ワクシニアウイルスに感染させた。感染２２時間後に上清を収集し、そしてこれを用いて細胞の新規プレートを感染させた。ルシフェラーゼ発現レベル（ＲＬＵとして測定される）を二次感染の１５時間後に決定した。野生型Ａ３３、Ａ３４、およびＢ５配列を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（ＩＧＶ−００７）のルシフェラーゼ発現レベルに比較した、変異体のルシフェラーゼ発現レベルを、倍増加として報告する。すべての変異体組み合わせに関して、より高いルシフェラーゼレベルが観察され、変異体ワクシニアウイルスが、より強く伝播可能であることを立証した。ＩＧＶ−００７はコペンハーゲン（対照）であり、ＩＧＶ−００６はコペンハーゲンＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換（対照）であり、ＩＧＶ−１０１はＢ５ Ｉ２３６Ｐ、Ｖ２３８Ｒ、Ｔ２４０Ｒ、およびＥ２４３ＧならびにＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−１０２はＢ５ Ｖ２３３Ｄ、Ｉ２３６Ｌ、Ｖ２３８Ｗ、Ｔ２４０Ｙ、およびＥ２４３ＲならびにＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−１０３はＢ５ Ｄ２６３Ｖ、Ｅ２６８Ｔ、Ｅ２７０Ｇ、Ｅ２７２Ｐ、およびＥ２７５ＳならびにＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−１０４はＢ５ Ｎ９４ＴおよびＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−１０５はＡ３３ Ｍ６３ＲならびにＡ３４ Ｍ６６ＴおよびＫ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−１０６はＢ５ Ｎ２４１Ｇ、Ｅ２４３Ｓ、Ｖ２４７Ｗ、Ｄ２４８Ｙ、Ｇ２５０Ａ、およびＡ２７６ＦならびにＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換であり、ＩＧＶ−１０７はＢ５ Ｄ２６３Ａ、Ｅ２７０Ｓ、Ｅ２７２Ｇ、およびＥ２７５ＦならびにＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換であり、そしてＩＧＶ−１０８はＢ５ Ｎ２４１Ｔ、Ｅ２４３Ｖ、Ｖ２４７Ｓ、Ｇ２５０Ｒ、およびＡ２７６ＦならびにＡ３４ Ｋ１５１Ｅ置換である。エラーバーはＳＤを示す（ｎ＝３）。アステリスクは、コペンハーゲン（ＩＧＶ−００７）に対する統計的有意性を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＜０．０００１；一方向ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定）。
定向進化を通じて同定されたすべてのワクシニアウイルス置換変異体の要約を表２に提供する。
表２
Figure 2021106576
Figure 2021106576
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本明細書に記載するような治療法を指す態様において、こうした態様はまた、その治療における使用に関する、あるいはその治療において使用するための薬剤の製造に関するさらなる態様である。
本発明は、その特定の態様に言及して記載されてきているが、当業者には、多様な変化が作製可能であり、そして同等物は、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく置換可能であることが理解されなければならない。さらに、特定の状況、物質、組成物、単数または複数のプロセス工程が、本発明の目的、精神および範囲に適応するように、多くの修飾を作製してもよい。こうしたすべての修飾は、本発明に付随する請求項の範囲内であると意図される。

Claims (72)

  1. ａ）変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
    ｂ）変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；または
    ｃ）変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
    を含む、複製可能組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ＯＶＶ）であって、
    変異体Ａ３３ポリペプチドおよび変異体Ａ３４ポリペプチドが、それぞれ、対応する野生型Ａ３３ポリペプチドおよび野生型Ａ３４ポリペプチドに比較して、各々、増進されたウイルス伝播または増進された細胞外エンベロープビリオン（ＥＥＶ）産生を提供する、前記ＯＶＶ。
  2. 変異体Ｂ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＯＶＶであって、変異体Ｂ５ポリペプチドが、対応する野生型Ｂ５ポリペプチドに比較して、増進されたウイルス伝播または増進されたＥＥＶ産生を提供する、前記ＯＶＶ。
  3. さらに：
    ａ）変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
    ｂ）変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
    の一方または両方を含む、請求項２のＯＶＶであって、変異体Ａ３３ポリペプチドおよび変異体Ａ３４ポリペプチドが、それぞれ、対応する野生型Ａ３３ポリペプチドおよび野生型Ａ３４ポリペプチドに比較して、各々、増進されたウイルス伝播または増進されたＥＥＶ産生を提供する、前記ＯＶＶ。
  4. 変異体Ａ３３ポリペプチドが、Ｍ６３、Ａ８８、およびＥ１２９の１つまたはそれより多くの置換を含む、請求項１または請求項３のＯＶＶ。
  5. 置換が、Ｍ６３Ｒ置換、Ａ８８Ｄ置換、およびＥ１２９Ｍ置換の１つまたはそれより多くである、請求項４のＯＶＶ。
  6. 変異体Ａ３３ポリペプチドがＡ８８Ｄ置換およびＥ１２９Ｍ置換を含む、請求項５のＯＶＶ。
  7. 変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項４〜６のいずれか一項のＯＶＶ。
  8. 変異体Ａ３４ポリペプチドが、Ｍ６６、Ｆ９４、Ｒ８４、Ｒ９１、Ｔ１２７、およびＫ１５１の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの置換を含む、請求項１または請求項３のＯＶＶ。
  9. 置換が、Ｍ６６Ｔ置換、Ｆ９４Ｈ置換、Ｒ８４Ｇ置換、Ｒ９１Ｓ置換、Ｒ９１Ａ置換、Ｔ１２７Ｅ置換、およびＫ１５１Ｅ置換の１つまたはそれより多くである、請求項８のＯＶＶ。
  10. 変異体Ａ３４ポリペプチドがＫ１５１Ｅ置換を含む、請求項９のＯＶＶ。
  11. 変異体Ａ３４ポリペプチドがＦ９４Ｈ置換を含む、請求項９のＯＶＶ。
  12. ワクシニアウイルスが変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項８〜１１のいずれか一項のＯＶＶ。
  13. ワクシニアウイルスが、変異体Ａ３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、変異体Ａ３３ポリペプチドが、Ｍ６３、Ａ８８、およびＥ１２９の１つ、２つ、または３つの置換を含み；そして変異体Ａ３４ポリペプチドが、Ｍ６６、Ｆ９４、Ｒ８４、Ｒ９１、Ｔ１２７、およびＫ１５１の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの置換を含む、請求項１または請求項３のＯＶＶ。
  14. 変異体Ａ３３ポリペプチドが、Ｍ６３Ｒ置換、Ａ８８Ｄ置換、およびＥ１２９Ｍ置換の１つ、または３つを含み；そして変異体Ａ３４ポリペプチドが、Ｍ６６Ｔ置換、Ｆ９４Ｈ置換、Ｒ８４Ｇ置換、Ｒ９１Ｓ置換、Ｒ９１Ａ置換、Ｔ１２７Ｅ置換、およびＫ１５１Ｅ置換の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つを含む、請求項１３のＯＶＶ。
  15. 変異体Ａ３４ポリペプチドがＫ１５１Ｅ置換を含む、請求項１４のＯＶＶ。
  16. 変異体Ａ３３ポリペプチドがＡ８８Ｄ置換を含み；そして変異体Ａ３４ポリペプチドがＦ９４Ｈ置換を含む、請求項１４のＯＶＶ。
  17. 変異体Ａ３３ポリペプチドがＥ１２９Ｍ置換を含み、そして変異体Ａ３４ポリペプチドがＦ９４Ｈ置換を含む、請求項１４のＯＶＶ。
  18. 変異体Ａ３３ポリペプチドがＡ８８Ｄ置換およびＥ１２９置換を含み、そして変異体Ａ３４ポリペプチドがＦ９４Ｈ置換を含む、請求項１４のＯＶＶ。
  19. 変異体Ａ３３ポリペプチドがＡ８８Ｄ置換およびＥ１２９Ｍ置換を含み、そして変異体Ａ３４ポリペプチドがＫ１５１Ｅ置換を含む、請求項１４のＯＶＶ。
  20. 変異体Ａ３３ポリペプチドがＡ８８Ｄ置換を含み、そして変異体Ａ３４ポリペプチドがＦ９４Ｈ置換およびＫ１５１Ｅ置換を含む、請求項１４のＯＶＶ。
  21. 変異体Ａ３３ポリペプチドがＥ１２９Ｍ置換を含み、そして変異体Ａ３４ポリペプチドがＦ９４Ｈ置換およびＫ１５１Ｅ置換を含む、請求項１４のＯＶＶ。
  22. 変異体Ａ３３ポリペプチドがＡ８８Ｄ置換およびＥ１２９Ｍ置換を含み、そして変異体Ａ３４ポリペプチドがＦ９４Ｈ置換およびＫ１５１Ｅ置換を含む、請求項１４のＯＶＶ。
  23. 変異体Ｂ５ポリペプチドが、Ｎ３９、Ｌ９０、Ｎ９４、Ｓ１９９、Ｋ２２９、Ｖ２３３、Ｉ２３６、Ｖ２３８、Ｔ２４０、Ｎ２４１、Ｅ２４３、Ｖ２４７、Ｄ２４８、Ｇ２５０、Ｄ２６３、Ｅ２６８、Ｅ２７０、Ｄ２７２、Ｓ２７３、Ｄ２７５、およびＡ２７６の位で、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれより多くのアミノ酸置換を含む、請求項２または請求項３のＯＶＶ。
  24. 変異体Ｂ５ポリペプチドがＳ１９７ＦまたはＳ１９７Ｖ置換を含む、請求項２３のＯＶＶ。
  25. 変異体Ｂ５ポリペプチドがＳ１９９Ｍ置換を含む、請求項２３のＯＶＶ。
  26. 変異体Ｂ５ポリペプチドがＳ２７３Ｌ置換またはＳ２７３Ｉ置換を含む、請求項２３のＯＶＶ。
  27. 変異体Ｂ５ポリペプチドがＮ３９Ｇ置換を含む、請求項２３のＯＶＶ。
  28. 変異体Ｂ５ポリペプチドがＮ９４Ｔ置換を含む、請求項２３のＯＶＶ。
  29. 変異体Ｂ５ポリペプチドがＬ９０Ｒ置換およびＳ２７３Ｖ置換を含む、請求項２３のＯＶＶ。
  30. 変異体Ｂ５ポリペプチドがＮ３９Ｇ置換およびＳ２７３Ｉ置換を含む、請求項２３のＯＶＶ。
  31. 変異体Ｂ５ポリペプチドがＫ２２９Ｃ置換およびＳ２７３Ｌ置換を含む、請求項２３のＯＶＶ。
  32. 変異体Ｂ５ポリペプチドが、Ｄ２６３Ａ置換、Ｅ２７０Ｓ置換、Ｅ２７２Ｇ置換、およびＥ２７５Ｆ置換を含む、請求項２３のＯＶＶ。
  33. 変異体Ｂ５ポリペプチドが、Ｉ２３６Ｐ置換、Ｖ２３８Ｒ置換、Ｔ２４０Ｒ置換、およびＥ２４３Ｇ置換を含む、請求項２３のＯＶＶ。
  34. 変異体Ｂ５ポリペプチドが、Ｖ２３３Ｄ置換、Ｉ２３６Ｌ置換、Ｖ２３８Ｗ置換、Ｔ２４０Ｙ置換、およびＥ２４３Ｒ置換を含む、請求項２３のＯＶＶ。
  35. 変異体Ｂ５ポリペプチドが、Ｄ２６３Ｖ置換、Ｅ２６８Ｔ置換、Ｅ２７０Ｇ置換、Ｅ２７２Ｐ置換、およびＥ２７５Ｓ置換を含む、請求項２３のＯＶＶ。
  36. 変異体Ｂ５ポリペプチドが、Ｎ２４１Ｔ置換、Ｅ２４３Ｖ置換、Ｖ２４７Ｓ置換、Ｇ２５０Ｒ置換、およびＡ２７６Ｆ置換を含む、請求項２３のＯＶＶ。
  37. 変異体Ｂ５ポリペプチドが、Ｎ２４１Ｇ置換、Ｅ２４３Ｓ置換、Ｖ２４７Ｗ置換、Ｄ２４８Ｙ置換、Ｇ２５０Ａ置換、およびＡ２７６Ｆ置換を含む、請求項２３のＯＶＶ。
  38. Ｋ１５１Ｅ置換を含む変異体Ａ３４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１および３〜３７のいずれか一項のＯＶＶ。
  39. 変異体Ａ５６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜３８のいずれか一項のＯＶＶ。
  40. 変異体Ａ５６ポリペプチドがアミノ酸２６９の置換を含む、請求項３９のＯＶＶ。
  41. アミノ酸２６９の置換がＩ２６９Ｆ置換である、請求項４０のＯＶＶ。
  42. 免疫調節ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、請求項１〜４１のいずれか一項のＯＶＶ。
  43. Ｊ２Ｒ発現および／または機能の欠如を生じる修飾を含む、請求項１〜４１のいずれか一項のＯＶＶ。
  44. ｉ）免疫調節ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸；およびｉｉ）Ｊ２Ｒ発現および／または機能の欠如を生じる修飾の両方を含む、請求項１〜４１のいずれか一項のＯＶＶ。
  45. リスター、ニューヨーク市衛生局、ワイエス、コペンハーゲン、ウェスタンリザーブ、ワクシニアアンカラ、ＥＭ６３、池田、ダリアン、ＬＩＶＰ、天壇、ＩＨＤ−Ｊ、タシケント、ベルン、パリ、および大連からなる群より選択されるワクシニアウイルス株に基づいて構築されている、請求項１〜４４のＯＶＶ。
  46. ａ）請求項１〜４５のいずれか一項のＯＶＶ；および
    ｂ）薬学的に許容されうる賦形剤
    を含む、組成物。
  47. 腫瘍を有する個体において腫瘍溶解を誘導する方法であって、請求項１〜４５のいずれか一項のＯＶＶまたは請求項４６の組成物の有効量を、個体に投与する工程を含む、前記方法。
  48. 前記投与が、ＯＶＶまたは組成物の単回用量を投与する工程を含む、請求項４７の方法。
  49. 単回用量が、ＯＶＶの少なくとも１０６プラーク形成単位（ｐｆｕ）を含む、請求項４８の方法。
  50. 前記投与が、ＯＶＶまたは組成物の複数回用量を投与する工程を含む、請求項４７の方法。
  51. ＯＶＶウイルスまたは組成物を１日おきに投与する、請求項５０の方法。
  52. ＯＶＶウイルスまたは組成物を週１回投与する、請求項５０の方法。
  53. ＯＶＶウイルスまたは組成物を１週おきに投与する、請求項５０の方法。
  54. 腫瘍が、脳癌腫瘍、頭頸部癌腫瘍、食道癌腫瘍、皮膚癌腫瘍、肺癌腫瘍、胸腺癌腫瘍、胃癌腫瘍、結腸癌腫瘍、肝臓癌腫瘍、卵巣癌腫瘍、子宮癌腫瘍、膀胱癌腫瘍、精巣癌腫瘍、結腸癌腫瘍、乳癌腫瘍、または膵臓癌腫瘍である、請求項４７〜５３のいずれか一項の方法。
  55. 腫瘍が結腸直腸癌である、請求項４７〜５３のいずれか一項の方法。
  56. 腫瘍が非小細胞肺癌である、請求項４７〜５３のいずれか一項の方法。
  57. 腫瘍が乳癌である、請求項４７〜５３のいずれか一項の方法。
  58. 腫瘍がトリプルネガティブ乳癌である、請求項５７の方法。
  59. 腫瘍が固形腫瘍である、請求項４７〜５８のいずれか一項の方法。
  60. 腫瘍が液状腫瘍である、請求項４７〜５８のいずれか一項の方法。
  61. 腫瘍が再発性である、請求項４７〜６０のいずれか一項の方法。
  62. 腫瘍が原発性腫瘍である、請求項４７〜６０のいずれか一項の方法。
  63. 腫瘍が転移性である、請求項４６〜６２のいずれか一項の方法。
  64. 個体に第二の癌療法を投与する工程をさらに含む、請求項４６〜６３のいずれか一項の方法。
  65. 第二の癌療法が、化学療法、生物学的療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、抗血管療法、凍結療法、毒素療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、細胞療法、遺伝子療法、および手術より選択される、請求項６４の方法。
  66. 第二の癌療法が免疫チェックポイント阻害剤である、請求項６４の方法。
  67. 免疫チェックポイント阻害剤が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ９６、ＣＤ７３、ＣＤ４７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＳＦ１Ｒ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋデルタ、ＰＩ３Ｋガンマ、ＴＡＭ、アルギナーゼ、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ９６、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１２２、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２より選択される免疫チェックポイント阻害剤に特異的な抗体である、請求項６６の方法。
  68. 個体が免疫無防備状態である、請求項４７〜６７のいずれか一項の方法。
  69. ＯＶＶまたは組成物の前記投与が、動脈内、腹腔内、膀胱内、またはクモ膜下腔内投与である、請求項４７〜６８のいずれか一項の方法。
  70. ＯＶＶまたは組成物の前記投与が腫瘍内投与である、請求項４７〜６８のいずれか一項の方法。
  71. ＯＶＶまたは組成物の前記投与が腫瘍周辺投与である、請求項４７〜６８のいずれか一項の方法。
  72. ＯＶＶまたは組成物の前記投与が静脈内投与である、請求項４７〜６８のいずれか一項の方法。
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