JPH08500973A

JPH08500973A - タキソール、関連タキサン及び他の新規な抗癌／抗ウイルス性化合物原料としてのイチイ培養組織

Info

Publication number: JPH08500973A
Application number: JP6503690A
Authority: JP
Inventors: リチャードエヌアーテカ; エナクシャウィックレメシンヘ
Original assignee: ザペンステイトリサーチファウンデーション
Priority date: 1992-05-21
Filing date: 1993-05-11
Publication date: 1996-02-06
Also published as: CA2136213A1; EP0642586A4; AU4242993A; WO1993023555A1; EP0642586A1

Abstract

(57)【要約】イチイ外植片由来の安定な長期組織培養物及び水耕で成長させた根が得られる満足すべき培養法が開発された。これらの培養物は、精製タキソール及びタキソール関連化合物生産に迅速な再現性があり、連続的に入手できる原料となる。培養法としては、試験管内組織培養及び水耕が含まれる。培養は、イチイの茎又は根組織又は水耕で成長させた根で開始される。タキソール生産は、バイオリアクターの使用によりコマーシャルレベルまで調整される。スクリーニング分析により、タキソール及びタキソール関連化合物の原料としてイチイ植物種及び培養物が供給される。現在イチイ木から直接抽出されているものと同一の組成物を得ることの他に、タキソール様活性を示す新規な組成物が新規なイチイ源から精製され、化学療法剤の開発に新たな展望を提示した。

Description

【発明の詳細な説明】タキソール、関連タキサン及び他の新規な抗癌／抗ウイルス性化合物原料としてのイチイ培養組織本出願は、1992年5月21日出願の米国出願第07/886,619号の一部継続出願であり、その内容を参考として引用する。発明の背景本発明は、タキソール、１０−デアセチルバッカチンIII、７−エピ−１０− デアセチルバッカチンIII、バッカチンIII、７−エピ−バッカチンIII、９−ジヒドロ−１３−アセチルバッカチンIII、セファロマンニン、１０−アセチルタキソール、７−エピ−１０−デアセチルタキソール、７−エピ−タキソール、これらの化合物の既知及び新規な他の天然誘導体及びタキソールを生成する生化学経路における前駆体及び中間体を含む他の関連タキサン及びタキソールの活性誘導体原料としてのイチイ(Taxus)培養組織に関する。本発明は、また、水耕又は組織培養を用いてイチイ培養茎及びイチイ根からタキソール及び関連化合物を生産する方法に関する。タキソールは、臨床上著しく有益な特性を有する。タキソールは、微小管(mic rotubule)集合を促進しかつチュブリン解離過程を阻害することが既知の唯一の植物産物である。タキソール及びタキソール関連化合物は、癌モデル分析及び微小管安定化分析において活性が陽性である。タキソールは、強力な癌化学療法剤の新規な種類の原型であると考えられている(Suffness & Cordell, 1985)。タキソールは、細胞のＧ２／Ｍ期における細胞を阻止する抗ミトティック剤として作用する細胞複製の強力な阻害剤である(Schiff & Horowitz, 1980;Horowit zら，1986)。生体外及び生体内の双方における重合チュブリンへの化学量論的結合能及びカルシウム安定集合微小管構造を形成するチュブリン集合の誘発能の点でユニークである。それらの構造は、希釈、カルシウムイオン、低温及び多数の微小管破壊薬剤による解重合に抵抗する。微小管は、外因性グアノシン５′−トリホスフェート又は微小管結合タンパクの存在しないときに低温においてチュブリンを集合している(Schiff & Horowitz,1980; Parness & Horowitz,19 81; Howard & Timasheff, 1988)。タキソールは、組織培養において可能性のある化学療法剤をスクリーンするために用いられたＫＢ癌細胞系に対して活性を示す。臨床前評価実験で、タキソールはマウス固形腫瘍系及び白血病細胞系の双方に対して活性を有することが示されている(Waniら，1971; Suffness & Cordell, 1985;Donehowerら，1987)。タキソールは、ＯＶＣＡＲ−３ヒト卵巣癌腫異種植皮モデルに活性であり後生的、進行性及び薬剤不応性卵巣癌の治療に有望であることが示されている(McGuireら， 1989; Thigpenら，1990; Einzigら，1991; Markman, 1991)。タキソールはＩＩＩ期試験を合格し米国食品医薬品局より不応性卵巣癌の治療における薬剤として承認されている。タキソールの驚くべき効果は、非小細胞肺癌の治療に顕著な活性を有する(Ettinger, 1992)ように転移性乳癌の治療にも報告されている(Holmesら，1991)。タキソール(NSC-125973)(Clinical Brochure; タキソール，NSC-125973 Drug Regulatory Affairs Branchから入手，CTEP，国立癌研究所，Bethesda，MD 2 0892)は、Wani及び共同研究者らによって1969年に米国北西部産イチイ，Taxus brevifolia Nutt.の幹樹皮から最初に単離され、1971年に分子構造が発表された複合体化学を有する細胞毒性ジテルペンである。タキソールは、Taxus brevifo liaの他にT. baccata, T. canadensis, T. cuspidata及びT. x mediaを含むイチイ属の他の種（Waniら，1971; Witherupら，1990; Vidensekら，1990）及び葉、若い茎、木質幹、木部、樹皮及び根を含む植物部分（Millerら，1981;Witherup ら，1990; Vidensekら，1990; Strobelら，1992及びWickremesinhe,1992）からも単離されている。タキソールの他に、多数の密接に関連した細胞毒性タキサン誘導体はイチイ属から単離されている（McLaughlinら，1981; Miller, 1981; Kingstonら，1982;H uangら，1986）。タキサン骨格、タキソールの基本的バックボーン及び関連タキサンジテルペノイドを有する１００を超える化合物は種々のイチイ属植物から単離されている(Kingston, 1991)。タキソール及びタキサンを含む関連ジテルペノイドは、イチイ属以外では報告されていない(Jaziriら，1991)。最初のうちは、タキソール及びその前駆体の製造に追究された原料はイチイ木の樹皮及び他の上記間質部分であった。これはそれらの部分が得るのに最も容易であるので合理的な方法であった。イチイ葉は、タキソール及びそのバッカチン前駆体の安定な原料として注目されてきた(Holton, 1992- Second Workshop On Taxus And Taxol; DeFuria, 1993 -International Yew Resources Conference)。タキソール製造原料としてイチイの他の部分も少しだけ探究されたが、将来性はなかった。例えば、イチイ根のタキソール分析及び含量に関する２件の発表には、根から抽出されたタキソールレベルがタキソールの初期の原料である樹皮から抽出されたレベルに比べて１／３〜１／４容量単位がしかないことを示すことから、根が有益な原料であることを教示も示唆もしていない（Vidensekら，1990 ;Strobelら，1992)。これらの報告は両方ともT. brevifoliaに限られている。タキソールを用いてＩ期及びＩＩ期の臨床実験は行われてきたが、タキソールの供給が限られるので広範囲の臨床実験は不可能であった。タキソールが広範囲の癌に対して顕著な活性を示す可能性が強い(Second National Cancer Institut eWorkshop on Taxol and Taxus, 1992)ことから、新旧両臨床使用の供給を十分に入手できかつそれらの使用に至る試験を行うことは重要である。残念ながら、タキソール製造は容易でなく代替が難しい天然原料に依存している。前述のように、タキソールは通常T.brevifoliaの乾燥した幹の樹皮から抽出されていた。更に、タキソールはT. baccata、T. cuspidata、T. canadensis及びT. media cvs. Densiformis及びHicksiiのような他種のイチイ（Taxus属，Tax aceae科）から抽出されていた(Waniら，1971; Vidensekら，1990; Witherupら， 1990;Wickremesinhe, 1992)。表１においては、イチイ属の種々の植物組織に見られるタキソールの文献に含まれた報告値を纏めたものである。本発明を除いて、根は樹皮より低いレベルを示していた。タキソールは天然源から抽出されていたが、抽出は非常に骨の折れるものであり、問題の化合物がイチイに非常に低濃度で見られることから（乾燥重量として０．０２％）、現在及び予期された要求の双方に非常に不十分な収量が考えられる。更に、初めの抽出液は色素、高度水耕の小皮物質、ワックス等が混入し、除去しなければならない。現在の樹皮抽出手順に基づくと、１kgのタキソールを製造するために７，２００kgの樹皮を必要とし、1993年の計画目標は２３０kgである(Stull, 1992)。199 2年７月現在、タキソールは１，７００人以上の不応性卵巣癌患者に用いられてきた(Arbuck, 1992)。タキソールの多くの適用が明らかにされるにつれて、タキソールを製造するために要する樹皮の量が増加し、深刻な環境上の関心並びに不足せず長期わたる供給についての関心を生じるであろう。 Taxus植物（イチイ）の培養は、直ちにタキソール製造の要求を解決する見込みはない。イチイ属の植物は、生長速度が極めて緩慢でありかつ増殖期間が長い。これにより、これらの化合物の豊富な供給を生じる植物種をスクリーンすることを目的とした育種計画を行うことを難しくしている。イチイのすべての生長が極めて緩慢であるとともに得られたタキソールの収量が少ないことにより、この薬剤の十分かつ連続的な供給を維持するために別の経路を必要とすることが広くいきわたっている。世界中の化学者がタキソールの全合成を達成する試みに関与した（Gueritte-V oegeleinら，1987）が、それほどの成功をはたさなかった。これは、主に前駆体が合成されなかったので、天然源がなお合成過程を開始するのに必要されるためである。バッカチン IIIから開始するタキソールの部分的合成が報告されている（Mang atalら，1989；Denisら，1990；Ojimaら，1991）。バッカチン IIIはタキソールの天然前駆体であり、T.baccata(Chauviere，1981；Denisら，1988)及び他のイチイ属植物（Witherupら; 1990）の葉から抽出することができる。使用した種々の方法がタキソールを生成することがあるとしても、たいていはタキソール及びタキソール関連化合物を微量より多く供給することはないのでほとんど実用価値がない(Denisら，1988)。イチイ組織の細胞培養は、可能なタキソール源である。しかし、安定な長期培養物は生産されていない。根が培養を開始するために用いられるべきである場合には、克服しなければならなかった方法に伴う課題はすべての種類の根が試験管内無菌培養で増殖するのに適応しないという事実を含んでいた。特に、イチイ植物が土壌で緩慢に生長することからイチイ根が培養で増殖することは予想されず、根を安定な培養を維持するために最適な速度で増殖させる培養条件を開発する見込みがなかった。安定な長期培養を開始することが実行可能になってさえも、この分野における当業者は細胞が必ずしも天然生長条件と同一の機能を培養内で行わないことが周知であるので、根が土壌で生長する場合に生じる化合物の生産は予想されなかった。即ち、細胞は培養内修飾する傾向があり、これらの修飾は培養条件によって異なる。生体内の構造的構築から中断された細胞は、必ずしも組織状態でのように組織崩壊状態では振る舞わない。通常、組織崩壊細胞培養は組織状態で生産した化合物については不安定である。これらの課題及び制限にもかかわらず、根の無菌培養が多くの植物から確立されることが成功してきており、これらの根培養によってたいていの場合無傷の上記間質植物部分より低いか又はこれに匹敵するレベルにもかかわらず医薬的に重要な化合物が生産された（Ishimaruら，1990；Jhaら，1991；Senら，1991;Ishim aruら，1992）。根の培養に用いられた植物の場合、根自体がSanguisorbaのような医薬用に用いられており、問題の化合物が根に存在していることを示していた。他の植物部分に由来する他の化合物の場合、根の培養は論理的な原料ではなかった。根の培養は、草質植物あるいは“軟質植物”に試みられており、通常観賞植物あるいは“木部”植物、例えばイチイには試みられていない。大量生産に適したタキソール及びタキソール関連化合物の迅速な再現性があり、連続的に入手でき、継続できる原料を開発することが直ちに非常に求められている。イチイ木が極めてゆっくりと生長するので、イチイ木を植えることは有望な解決ではない。化学合成は成功してなく、部分的合成には植物材料から抽出しなければならず更に植物組織に低レベルで見られるバッカチン IIIが出発物質として必要である。タキサン環含有アルカロイド化合物はT. brevifoliaの細胞培養から得られているが、この方法を用いる問題があった。本発明で述べられる方法は、タキソール及び関連タキサンを現在のタキソール生産方法で可能であるよりも大量に生産する、過剰生産さえするイチイ培養組織を用いるタキソール供給の課題に対する解決を提示するものである。本発明の態様は、タキソール原料として樹皮に比べて相対的に低収量のために根の使用なしに教示しているイチイ根のタキソール分析及び含量に関する報告にもかかわらずイチイ根を使用するものである。本発明のもう１つの態様は、水耕培養における根の成長である。植物を成長させるこの方法は経済的に重要な果物、野菜及び観賞植物の業務用温室生産の多数の経済的に重要な植物に確立されている(Moss, 1984; Adler & Wilcox, 1987;Hi cklentonら，1987; Knight & Mitchell, 1987; Kratkyら，1988; Lardizabal& T hompson, 1988; Mortleyら，1991; Brentlinger, 1992)が、根自体には提案されていない。これは、植物の上記間質部分がイチイ植物での場合のように最初の中心領域である場合、根は通常考慮されないためである。また、水耕培養は費用がかかり特殊な培地や装置が必要であるので、これはイチイ木からの樹皮を剥がし切断するより追究された方法ではなかった。本発明の利点は、タキソール利用可能性が野性のイチイ木に現在依存することを排除することである。更に、本発明は、臨床使用に現在必要とされるキログラム量を単離するために多数伐採されることを必要とするイチイ木の保存を促進するものである。他の利点としては、癌患者のためにタキソール及び関連化合物の生産の利用可能性及び信頼性の増加が含まれる。発明の要約イチイ植物の成功した組織培養は、予想外に高収量のタキソール及びタキソール関連化合物及びより精製された化合物を生産した。“培養”としては、茎及び根の試験管内組織培養及び根の水耕培養が含まれる。茎及び根は天然植物由来であり、根はカルス培養由来であってもよい。タキソールは、充実性腫瘍及び白血病細胞系の双方に対する抗腫瘍活性並びに臨床試験において化学療法剤としての活性が証明された細胞毒性ジテルペンである。タキソールは、微小管の集合を促進しかつチュブリン解離過程を阻害することが現在知られる唯一の植物産物である。この機序は、タキソールがこの方法で癌増殖を攻撃する新しい種類の化学療法剤の原型であることを示している。本明細書で開示される本発明の目的の場合、“タキソール”は一般的にはタキソールに構造上関連する化合物を包含することを意味し、タキソールを生成することができる生化学経路におけるタキソールの前駆体、それらの経路の中間体及びタキソールの誘導体及び二次代謝物（１０−デアセチルバッカチン III、７−エピ− １０−デアセチルバッカチン III，，バッカチン III、７−エピバッカチン III 、９−ジヒドロ−１３−アセチルバッカチン III、セファロマンニン、１０−デアセチルタキソール、７−エピ１０−デアセチルタキソール、７−エピタキソール）及びこれらの化合物の他の既知及び未知の天然誘導体及びタキソール生産及び／又は新規な抗腫瘍／抗ウイルス性化合物の生産をもたらす関連タキサンを含むように定義される。 “タキソール様活性”は、効果的な化学療法を予測する少なくとも１種の試験：微小管安定化分析、癌モデル分析又は臨床試験において陽性結果を示す組成物を意味する。イチイ外植片由来の安定な長期細胞系が得られる満足すべき組織培養法が開発された。安定な培養物は、継代培養が繰り返された後タキソール生産レベルを維持するものである。長期培養物は、少なくとも１年間、好ましくは２年以上安定なままであるものである。本発明の方法によって生産された培養物は、７年までの間安定なままである。細胞系の若干は馴化され、即ち長期にわたって維持する栄養培養基に補足として植物ホルモンを必要としない。本発明の方法の使用によって確立された細胞系は、タキソール及びタキソール関連化を生産することができる。これらの細胞系は、タキソール及びタキソール関連化合物の製造に迅速に再現でき、連続して入手できる原料を生じるものである。この生産は、バイオリアクターに細胞系を使用することによりコマーシャルレベルまで調整される。現在イチイ木から直接抽出されていると同一の組成物を得ることの他に、タキソール様活性を示す新規な組成物がイチイ細胞系の抽出液から精製されて、化学療法剤開発の新しい展望を提示した。イチイ培養物を生産する以前には組合わせられていな段階を組合わせかつ新規な方法及び組成物を使用することにより、満足すべき長期増殖が達成され、異なった細胞系が生産された。イチイ属由来細胞の培養物を確立する方法は、タキソール及びタキソール関連化合物を培養環境に分泌する細胞系を生産するのに成功した。試験管内組織培養法の段階には下記のことが含まれる。（１）培養を開始するために用いられる外植片に適切な組織源を選択する全体的組織源はイチイ属植物である。タキソールが単離される種々の種類としては、T. brevifolia Nutt, T. baccata, T. cuspidata, T. canadensis cv.Cap itata, T. media cv. Densiformis及びT. media cv.Hicksiiが挙げられる。単離発現培養を生産するために用いられる好ましい外植片源は、直接抽出されるタキソール量が他の種類から匹敵する方法で出発物質の匹敵する量から抽出された量と比較した場合高いイチイである。その基準により、例えばT. media、特にT. m edia cv.Hicksiiは茎が培養を開始するために組織外植片として用いられるとT. brevifoliaより好ましい原料である。組織外植片は、ペトリ皿又はマジェンタ（スクエア皿）のような適切な組織培養容器に移した組織の一部である。次いでその外植片は本明細書に記載されるように培養される。樹皮は通常のタキソール源であったものであり、葉及び根もタキソールを発現することができる。しかしながら、外植片の好ましい組織源は茎、特に若く新しい多肉の茎であることが判明した。若い茎は、植物の新しい生長時期の開始に出るものである。Taxus media cv.Hicksiiの若い茎部は、Taxus media植物の茎がT axus brevifolia及び他のイチイ属植物より高いレベルのタキソールを含むために特に好ましい。直径約０．３−０．５mmの外植片が適している。本発明においては、根外植片がより好ましい。（２）カルス誘導培地で外植片を培養してカルスを形成する成功したイチイ培養に至る要因の組合わせの１つには、外植片を増殖するカルス誘導培地の使用がある。外植片を形成するために、イチイから得られた組織を表面滅菌で処理し、無菌条件下で切片にする。切片化は、直径約３−５mmの若い茎から長さ約６−８mmの薄片に茎を切断し、その切片をカルス誘導栄養培地を含む組織培養容器、通常ペトリ皿に移すことにより行われる。これは、外植片からカルス増殖の形成を開始及び促進することができる培地である。好ましい培地は、2,4−Ｄ及びキネチンのような植物ホルモンを単独であるいは組合わせて補足したGamborgのB5培地（G amborgら，1968）である。Murashige/Skoog培地(Murashige & Skoog,1962)もこの目的に適し、補足されてもよい。ゲルライト(Scott Laboratories, West War wick, R.I.)のようなゲル化剤又は寒天が栄養培地と混合されて外植片の維持及び増殖用培養容器内で固体支持体を形成する。（３）サブクローン増殖を促進する間隔で使用カルス切片を継代培養する未分化細胞の球状小集塊が観察されると、カルス形成が決定される。これは、通常外植片の９０％に約２−４週間で生じる。継代培養は最初に４−６週間隔で行われるが、培養増殖の関数として変えられる。（４）細胞系を生じるサブクローンを選択するタキソールを生産することができる細胞系を作成するに当たり重要な段階は、カルスのサブクローンを生じる継代培養するために選ばれるカルス試料を選択することである。物理的選択基準が本発明の態様として開発された。赤く呈色されたカルス組織は、赤色がカルス増殖を阻害するフェノール浸出液の存在を示すために選択してはならない。黄色を示すカルス切片は、継代培養するために選択されることが好ましい。暗所で良好に増殖する培養物は薄黄色〜薄茶色である。砕けやすさは、もう１つの選択基準である。これは、カルスの砕けやすく脆い組織を観察することにより決定される。本発明の目的に満足すべき細胞系を生じると考えられる試料を示すもう１つの要因は、カルス細胞の相対増殖速度である。最初、カルスはすべてゆっくりと増殖し、約２−４ヵ月かかって２倍になる。好ましい倍加時間は約５−１６日である。継代培養は約４−６週の間隔で行われるが、色によって示されるカルスの状態によって及び増殖後のカルスのサイズによって短くても長くてもよい。これらの基準に従うカルス試料を連続継代培養することにより、これらの基準に関して相対的に均一なサブクローンが生じる。培養に置かれている外植片とサブクローンの出現との間の時間は変動するが、間隔は年で測られるものもある。（５）維持培地の固体支持体上で細胞系を培養する満足すべきイチイ培養に重要な他の２要因は、膜いかだの形の固体支持体及び長期培養増殖用維持培地である。次いで使用サブクローンに最適な培養条件を培養増殖を行うと考えられる要因：光の有無、温度、ｐＨ、植物ホルモン及び糖類を含む培地補足の多可変解析により求める。スクロースは、イチイ培養の栄養培地に糖として当業者により用いられている。予想外に、スクロースのあり又はなしでフルクトース及びグルコースが培養増殖を促進するために本発明に用いられる。また驚くべきことに、培養を促進するために単一糖として用いられる場合以前にスクロースに勧められたよりも高い濃度が見られた。単独で用いられた高濃度のフルコースあるいはフルクトースも優れた結果を示した。これらの糖プロトコールはいずれもイチイに報告されていない。カゼイン加水分解物は、最適増殖を支持するのに有益である。最適な培養維持要因には、細胞を支持する膜いかだの使用を含めた。この構造は、継代培養、抽出液の収集及び細胞懸濁液の形成を促進した。安定な培養増殖を達成した後、細胞系は維持培地に維持される。細胞系の場合馴化が生じるものがあり、即ち、ホルモン補足の要求なしで維持される。カルス細胞系の他に、砕けやすいカルス小集塊の細胞（２−３グラム）の接種源を三角フラスコに含んだ液体培地（通常１００mlの培地を含有する２５０mlフラスコ）に移すことにより上記のように十分に確立された安定なカルス培養から細胞懸濁培養が誘導される。フラスコは当業者に既知の回転振盪器に配置され、約１２５rpmで操作される。本発明の範囲でイチイ細胞系の重要な使用は、タキソール及びタキソール関連化合物を生産することである。本発明の方法で開発されたカルス及び懸濁細胞系は、タキソール、セファロマンニン及びバッカチンを含むタキソール生産をもたらす生化学経路の前駆体及び中間体並びにタキソールの活性誘導体を生産する。生物性及び無生物性両エリシター、前駆体供給及び他の誘発法は、二次代謝生産を促進するのに有効である。タキソール及びタキソール関連化合物は、カルス、懸濁培養物及び培養基から抽出される。“活性”組成物は、微小管安定化分析、癌モデル分析、臨床試験又はこれらの試験の組合わせで陽性結果を示すことができるものである。これらの細胞系は、無制限に維持することができ、現在無菌条件で５−７年維持されているものがあり、タキソール、タキソールの活性誘導体及び前駆体の生産能を保持するために連続原料である。大量リアクターで十分に増殖すると考えられ、細胞を凍結保存することができる。タキソール生産能は、凍結保存又は４−１０℃で保存した後も保持される。細胞系は、大量のタキソール及びタキソール関連化合物を生産するためにバイオリアクターで増殖する原料として適している。これらの組成物のあるものは培養基に見出され、培養基を収集することにより得られる。別のバイオリアクター設計を使用すると、所望の二次代謝物だけを溶液から抽出する交換樹脂を用いて溶液中に見られる二次代謝物が溶液から容易に取り出され、培養増殖には培地補足が必要ない。他の組成物は細胞内に生産及び保持され、細胞から抽出されなければならない。イチイ由来細胞系のバイオリアクターでの増殖は、現在実行可能であるよりもかなり多量の生産を可能にする。この方法は、化学療法剤の継続できる供給源として役立つばかりでなく本化合物を単離するために現在伐採している多数の木を守るものである。タキソールは、種々のイチイ属植物すべての根及び本発明によって培養され評価された品種に見出される。レベルは、上記間質部分に見られるレベルに匹敵する量から２−４倍量までの範囲である。本発明の目的は、イチイ根を増殖することを包含する。水耕で培養された根、試験管内培養根、不定根、茎又は葉由来カルスからの根及びアグロバクテリウム形質転換根培養物を含むイチイ根を使用するタキソール及び関連タキサンの長期にわたって安定な生産を生じる満足すべき方法が開発された。本発明の方法の使用により確立された根は、タキソール及びタキソール関連化合物を生産することができる。これらの根は、タキソール及びタキソール関連化合物の生産に迅速に再現でき、連続的に入手できる原料を示すものである。この生産は、コマーシャルレベルまで調整される。現在イチイ木から直接抽出されていると同一の組成物を得ること他に、タキソール様活性を示す新規な組成物がイチイ根の抽出液から精製されて、化学療法剤開発の新しい展望を提示した。水耕で培養された根、試験管内培養された正常な根、不定根、茎又は葉から生産されたカルスからの根及びアグロバクテリウム形質転換カルス又は根培養物を含むイチイ根は、タキソール並びに生物活性化合物及び前駆体の豊富な供給を生じる可能性がある。タキソールの迅速に得られかつ継続できる原料を供給する他に、多くの利点の可能性がある。タキソール及び関連化合物の生産に水耕生産根の使用で認められた利点としては次のものがある：（１）遺伝的に安定な根はすべてのイチイ属植物及び入手できる栽培品種から短期間で容易に生産することができ、それによりタキソールと共に新規なタキサン及び関連化合物の高生産原料の探索がはかどる、（２）二次代謝物の供給制御能が天候、病気及び市場の要求にかなう政策に依存しない、（３）微生物系のものと類似の菌下部改良計画を開始することができる、（４）タキソール及びその誘導体のような新規な生産物を新規な方法から容易に得ることができるが、これは既存の方法で得ることができない、（５）根の抽出液は非常にきれいであり、それにより抽出及び精製を難しくするクロロフィル及び他の色素を含む葉、茎又は樹皮から得られた抽出液から必要な多くの精製の要求を克服する及び（６）水耕で成長した植物の根は植物の上の部分よりかなり急速に成長し、休眠期間であるとしても連続的に成長が維持される。イチイ属から水耕で成長した根又は無菌的に成長した根におけるタキソール及び関連化合物の生産及び評価は、新規な成果である。更に、イチイ樹皮からのタキソール及び関連タキサンを精製する抽出プロトコールは非常に複雑であり、茎及び葉からの抽出はクロロフィル、他の色素、ワックス及び未知の疎水性化合物の存在のためにより複雑な方法となる。反対に、水耕で増殖したものを含む茎組織培養又は根培養からのタキソール抽出液は、比較的きれいであり使用するのに精製の必要が少ない。茎、葉又は樹皮を塩化メチレンで抽出する場合、根培養の比較純度の例として、根では生じない暗褐色又は緑色の粘性抽出液がある。茎、葉又は樹皮からの抽出液はＨＰＬＣで直接分析することができるが、高度疎水性化合物の存在は純粋でない試料に生じる基線の移動を生じるカラムを詰まらせる。更に、ＨＰＬＣを行う最初のピークが広がり、水溶性色素の混入物を示し、それによりバッカチンの精製についての課題を生じる。この事情を回避するために、疎水性化合物を除去するために塩化メチレン抽出及び水溶性化合物を除去するためにSepak C18カートリッジの前に分配するへキサンを用いて最初の精製段階を加えることが必要である。これは、根抽出液については色素を含まず疎水性化合物もほとんどないので必要がない。本発明にしたがって培養された根は、無菌条件下で無制限に維持しかつタキソール、タキソールの活性誘導体及び前駆体の生産能を保持することができるためにタキソールの連続原料である。大量バイオリアクターで十分に増殖し、凍結保存することができる。タキソール生産能は、凍結保存又は４−１０℃で保存した後保持される。根は、大量のタキソール及びタキソール関連化合物を生産するバイオリアクターで増殖するために原料として適している。これらの組成物は培養基に見出されるものがあり、培地を集めることにより得られる。種々のバイオリアクターを用いると、所望の二次代謝物だけを溶液から抽出する交換樹脂を用いて溶液中に見られる二次代謝物が溶液から容易に取り出され、培養増殖には培地補足が必要ない。他の組成物は細胞内に生産及び保持され、根から抽出されなければならない。膜を透過することができる化合物はタキソール抽出を容易にする。イチイ由来根のバイオリアクターでの増殖は、現在実行可能であるよりもかなり多量の生産を可能にする。この方法は、化学療法剤の継続できる供給源として役立つばかりでなく本化合物を単離するために現在伐採している多数の木を守るものである。根の抽出液には、植物の他の部分から得られるよりも精製段階が少なくてよくかつ通常精製された組成物が得られる。根は、植物の上記間質部分に存在するより色素及びワックスのような混入物をわずかしか含まない。従って、根はクロマトグラフィーによってより多くのタキサンを良好に分割することができる。植物の上の部分は、植物の上記間質部分に極めて豊富なワックス、クロロフィルのような色素及び他の妨害化合物が混入されている。事実植物の上の部分から物質を精製した後でさえ、これらの試料が詰まっているＨＰＬＣカラムについてなお課題がある。種々のタキサンに対応するＨＰＬＣからの実際のプロファイルは、根が原料物質であるとより純粋である。必要とされる精製段階が多いほど、損失が多くて低回収となり、それにより労力、溶媒等のために価格が高くなる。根を植物の二次代謝物源として用いてきたが、イチイ植物から使用されてなくかつ木部植物からの化合物源として勧められていない。イチイ植物の根を用いる利点は、イチイ植物がゆっくりと生長し適度な生長には特別な条件を必要とすることである。価格が高くかつタキソール及び関連タキサンに対する要求が増えることとともにこの課題は、水耕で成長した植物からの根の使用を極めて魅力のあるものにする。タキソールは根で合成され蓄積する植物の残りに輸送されると考えられる。これにより根は組織（酵素）のすべてが存在するためにタキソール関連化合物の生合成の実験に理想的であり、従って根はタキソール及び他の新規な抗腫瘍化合物の部分的合成に用いられるべき前駆体の良好な原料である。更に、根培養は容易に誘発にされやすい。根のような組織化された組織は、典型的には不均一な細胞培養より均一であるために細胞培養より課題が少ない。細胞懸濁液は、根培養について課題のないタキソールとコクロマトグラフィー処理する未知の化合物について固有の課題を有する。カルス由来根、即ちアグロバクテリウム感染されていないものにおいては、天然根からのソモクローナル変異について課題がある。組織培養において木部植物根を開始することを難しくする天然根の緩慢な生長を克服するために、比較的速く増殖することが観察されているソモクローナル変異体が用いられる。アクロバクテリウムリゾゲネス菌に関して多くの情報があるが、植物細胞と相互作用についてはほとんど知られない。特定の細菌株が植物に感染する多くの場合があるが、感染することができない多くの植物もある。過程が標準となる前に植物がどのように細菌と相互作用するかについて多くの知識が必要である。細菌の宿主感染能に影響する最も重要な因子は、癒傷応答である。植物及び組織は癒傷応答で異なり、顕著な癒傷応答を有する植物のみが容易に感染することができる。イチイのような木質植物は容易に傷害されず、従って感染が難しい(Potryku s, 1991)。本発明の方法及び組成物は、新規なスクリーニング試験を容易にしてイチイ属植物及び栽培品種が安定な長期培養又は水耕培養を受けることができかつ原料がタキソール及びタキソール関連化合物を生じると考えられることが決定される。これらの組成物の迅速に再現でき、連続して得られ、入手しやすくかつ継続できる原料の他に、タキソール関連化合物において未知の変異に到達する鍵である天然原料からは得られない変異も本発明で提供される。これらの変異は、報告されているものより更に効力のある化学療法剤とすることができる。タキソール様活性を有するイチイ培養細胞抽出液の以前には未知の成分は、ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）によりピークとして溶離された。これらのピークは、微小管安定化分析で陽性である物質を含有する。天然原料には存在しない組成物であるタキソール様活性を有する組成物の生産は化学療法剤の開発の展望が広がる。また、細胞系がこれらの組成物に関係するＨＰＬＣプロファイルが異なるので、細胞培養は新規な治療剤の有効な原料であると考えられる。細胞系は、特定の環境条件下培養で生じるタキソール及びタキソール関連化合物の量及び種類が異なる。表Ｖは、生産されたタキソール％範囲に関する細胞系の中での差異を示すものである。微小管を安定化することができる及び／又は癌モデル系、例えば試験物質の細胞に対する毒性に基づくものにおいて陽性結果を示すことができる場合にはピークの成分はタキソール様である。本発明のもう１つの態様は、突然変異を誘発することにより新規なイチイ細胞系を生産することである。使用細胞系の突然変異は、放射線照射及び化学突然変異原によって誘発される。本明細書に記載されるカルス及びサブクローン選択基準並びにカルスを誘発し細胞系を生産する方法を用いて突然変異原料から細胞系を生産する。紫外線、特にＵＶ−Ａ及びエチルメタンスルホンのような化学突然変異原が適切な突然変異原である。ソモクローナル変異に基づく天然に存在する突然変異の選択も有効である。本発明のもう１つの態様は、イチイ植物の試験管内培養からの再生である。タキソール生産植物の再生の場合、１６時間体制によって高オーキシン：サイトカイニン比で培養したカルスを誘導してオーキシン：サイトカイニン比を連続的に減少させることにより器官形成を行なった［例えば、２ＩＰ（２−イソペンテニルアデニン）２−１０mg/lをＩＢＡ（インドール−３−酪酸）０．１−２．０mg /lと併用したものに対して］。次いでこれらのカルスによって生産されたシュートを無菌的に切除し（大体シュート１cmの段階で）、２０g/lのスクロースで補足したGamborgのB-5基本培地に入れて根形成を誘導した。次いで、十分に根付いたシュートをメトローミックス２００のびんに入っている無菌培地に移し、馴化し、温室に移して植物に発育させる。タキソールの生産が増加した培養から植物を再生すると、天然植物が生産することができるより多量のタキソール及びタキソール関連化合物を生産することができる植物原料を供給する。広範囲のイチイ属植物及び本明細書に記載される最適化条件で増殖された品種を生物性（即ち菌類抽出液）及び無生物性（即ち重金属）、植物成長調節物質、タキソール生化学経路の前駆体及び／又は中間体（即ち酢酸塩、メバロン酸）で生体内及び生体外の双方で誘導するとタキソール及び関連タキサン及び／又は新規な抗腫瘍化合物が増加する。水耕で増殖した植物から根を得ることの主な利点は遺伝的に安定なことであり、組織培養で根を扱うと典型的な課題を克服する一様な結果を生じる。タキソール及び関連タキサンの誘導が成功したために、タキソール及び関連タキサンの生合成に関与する遺伝子力刺激されることが考えられた。この知識に基づいて、ｃＤＮＡライブラリーが構築され、これらのライブラリーの微分スクリーニングにより、タキソール生合成に関与する推定遺伝子を同定した。これらの遺伝子は、タキソール及び関連化合物を過剰生産するために用いることができる可能性のあるタバコ植物及び／又は細菌系で過剰発現すると考えられる。生物性及び無生物性双方のエリシター、前駆体の供給及び他の誘導手法が二次代謝物生産を高めるのに有効である。定義 “活性”組成物：微小管安定化分析、癌モデル分析、臨床試験又はこれらの試験の組合わせで陽性結果を示すことができるもの。バイオリアクター：根を大量に増殖させる装置。エアーリフト： Kontes（Ctyoliftエアーリフトバイオリアクター） Braun Biotech（Biostatエアーリフトバイオリアクター） LH 発酵（５００回連続）攪拌： New Brunswick（CelliGen & BioFlo） LH 発酵灌流： New Brunswick（CelliGen & BioFlo）メンブランフロー：栄養培地が根を支持する膜上を流動し、該培地は再循環される。他の新規な設計も適している。カルス：脱分化細胞の小集塊癌モデル系：結果が試験物質によって生じ、該結果が試験物質の臨床効果を予想するように求められた生体外及び生体内系。細胞培養：試験管内で維持された生細胞の組成物。細胞系：増殖の特徴が特定の環境条件下で安定になり、これらの特徴によって他の細胞系から区別される試験管内細胞集団。細胞懸濁液：固体基質に結合せずむしろ液体に懸濁する生細胞の組成物。凝集塊：カルス表面に観察できる細胞の球状又は結節小集塊。順化培地：培養細胞が培地に種々の代謝物並びに他の細胞増殖及び分裂成分を分泌した培地。培養増殖速度：本明細書では培養内の細胞が有糸分裂によって倍加する速度を意味する；倍加速度。潜伏植物：外因は上記植物間質部分の増殖を促進しない。誘発法：培養で生産されるタキソール又はタキソール関連化合物の収量を増加させる細胞培養に適用された手法；この実験作用の機序は免疫的であり、即ち細胞はタキソールを生成することにより異種物質に対する防御を開始する。無生物性：例としては、重金属の塩、バナジン酸塩：鉛及び水銀が挙げられる。生物性：例としては、オートクレーブにかけた菌類細胞壁断片及び胞子が挙げられる。砕けやすさ：砕けやすく脆い組織コンシステンシー。馴化細胞系：継代培養で維持され維持のためにホルモンで補足された栄養培地を必要としない試験管内細胞；これらの培養は通常比較的に急速な増殖速度を特徴とする。馴化：細胞が維持される栄養培地に補足としてホルモンを使用せずに連続継代培養によって細胞系を維持することができる条件。毛根病：植物部分の根様組織の増殖がある広葉植物の病気。これは、クラウンゴールに似た腫瘍状態である。毛根病は、Ｒｉプラスミドを含むアグロバクテリウムリゾゲネス菌によって誘導される。水耕：植物の水培養。根が土壌なしで発育する植物培養系。生体外：文字どおり“ガラス内”で、生体材料の維持、一般に増殖及び繁殖の生体内条件に似ている人工的環境。生体内：文字どおり“生命内”。生細胞又は生物内で起こる生物反応に関係する。培地：細胞、組織、胚等の生存材料の生育用栄養組成物。栄養膜法（ＮＦＴ）：根に酸素及び水の双方を十分に供給することができる植物を成長させる法。植物根は、十分な植物成長に水及び酸素双方を必要とする。土壌中の根は、豊富な水がある場合酸素は奪われている。反対に、良好な通気は通常水の不足と関係がある。ＮＦＴにおいては、植物は栄養液の極めて浅い流れで根系を発育させる。発育根マットの下の部分が溶液中で完全に発育するように、溶液の深さを調節する。上の部分は表面のすぐ上に突出するが、液体膜で覆われたままである。この露出した上の部分は、良好に通気することができる。各植物によって生じた根マットは広範囲でからみ合っており、この条件により植物が自己支持するようになる。他の標準又は新規な水耕系も本発明に適切である。保持時間：試料をカラムに導入した時間から計数するクロマトグラフィーカラムを一定の化合物が溶離する時間。二次代謝物：細胞の一次代謝物網の一部でない代謝物。二次代謝物は、通常ある方法（例えば防御）で特殊化した細胞にのみ存在する。振盪フラスコ：回転振盪器で細胞を培養するために用いることができる任意の容器、例えば三角フラスコ。スパージング：液体培地に空気を入れる（吹き込む）。安定な培養増殖：培養の倍加時間が特定の培養条件下で平衡に達し、タキソール生産レベルが維持される細胞培養増殖の状態。サブクローン：親培養からの細胞試料由来の培養物。継代培養：培養細胞試料由来の細胞培養組成物、該試料は試料が得られた細胞培養を含むものより別の組織培養容器に移される。組織培養：試験管内で維持された生存組織の組成物；“細胞培養”及び“組織培養”は、本明細書では多数の細胞が試験管内で維持される組成物を意味するのでたいてい交換可能で用いられる。アグロバクテリウムリゾゲネスアグロバクテリウムツメファシエンスに密接に関連した桿状グラム陰性菌種。アグロバクテリウムリゾゲネスには、Ｔｉプラスミドに密接に関連するＲｉプラスミドと呼ばれる大きなプラスミドが存在する。A.リゾゲネスとＲｉプラスミドの組合わせは、ある種の植物において毛根病として知られる腫瘍増殖が誘起される。図面の簡単な説明本発明の他の目的及び利点は、下記の詳細な説明を読み図面を参照すると明らかになるであろう。図１．クロシルカラムで分離したタキサン標準のＨＰＬＣプロファイル：１．タキソール；２．７−エピ−１０−デアセチルタキソール；３．セファロマンニン；４．１０−デアセチルタキソール；５．バッカチンＶ；６．９−ジヒドロー１３−アセチルバッカチン III；７．バッカチン III；８．７−エピ−１０− デアセチルバッカチン III；９．１０−デアセチルバッカチン III。図２． T.media cv.Hickii（ＣＲ−１カルス）の茎培養のＨＰＬＣプロファイル。図３． T. media cv.Hickiiの根培養のＨＰＬＣプロファイル。図４． T. Canadensisの根培養のＨＰＬＣプロファイル。図５． T. cuspidataの根培養のＨＰＬＣプロファイル。好ましい実施態様の詳細な説明本発明を用いて、安定な長期イチイ細胞系を生産する点で成功が得られ、種々の形態のイチイ根が水耕で成長した。下記の段階の組合わせは、イチイ細胞系の作成には新規である。本発明の培養は、T. brevifolia、T. canadensis、T. chinensis、T.floridan a、T. globosa、T. sumatana、T. yunnanensisを含むイチイ属植物及びT. bacca ta、T. cuspidata及びT. mediaの種々の品種及びイチイ属の他のものから誘導される。カルスを誘導する組織源として若い茎の外植片又は根が好ましい。若い茎はイチイ植物の新しい成長として生じるものであり、茎は直径約０．３−０．５mmである。Taxus media cv. Hicksiiの若い茎は、これらの茎がTaxus brevifoliaの茎を含むイチイ属植物より高レベルのタキソールを生成すると見られるために好ましい。根のような他の植物部分はカルス生成能を有するが、若い茎が一致した基準に基づいて最良の結果を示した。しかしながら、根由来カルス及び他の原料からの根は、組織培養又は水耕で培養した場合最も高いタキソール量を生産する。イチイの若い茎の外植片は表面滅菌され、無菌条件下で切片にされる。切片は、カルス誘導培地で増殖される。適切な培地としては、GamborgのB5ビタミン、カゼイン加水分解物（１．０g/l）及び全量２５−４０g/lのフルクトース、グルコース及びスクロースの組合わせで強化されたGamborgのB5培地(Gamborgら，196 8)（材料及び方法）がある。細胞系の場合、高濃度のグルコース、フルクトース又はスクロース（４０−８０g/l）は栄養培地中スクロースの標準２０−３０g/l より好ましい。驚くべきことに、グルコース及び／又はフルクトースはスクロースに置き変わってもよい。植物ホルモンは、カルス誘導の植物成長調節物質として培地を補足するために用いられる。オーキシンはカイネチンと組合わせて用いられ、後者は０．１−１．０mg/lの範囲である。使用するホルモンの比率を決定するに当たり、高オーキシン：サイトカイニン比はカルス誘導の場合、例えば１ mg/l2， 4−Ｄ：0.2mg/ｌカイネチン；５mg/ｌのナフタレン酢酸（ＮＡＡ）：１mgカイネチンが好ましい。オーキシンに関しては、ＮＡＡ（１．０−５．０mg/ｌの範囲で）、2,4−Ｄ（0.1-2.5mg/ｌの範囲で）又はＩＢＡ（インドール酪酸、1.0-5.0 mg/ｌの範囲で）が適切である。具体的な実施態様においては、１ppmの2,4−Ｄ及び0.2ppmのカイネチンが単独で又はゲル化剤としてゲルライト又は寒天と組合わせて培養に添加される。ゲルライトで約２g/ｌ濃度にゲル化した培地を含むペトリ皿である組織培養容器に外植片を入れる。無菌ペトリ皿に分配される前に、培地は滅菌、例えば１２１℃で約１５分間オートクレーブにかけられる。外植片は、完全な暗所で約２３−２５℃の温度でインキュベートされる。培地のｐＨは、5.5-5.7の範囲に維持されることが好ましい。培養は明るい所で、例えば冷白色蛍光灯で２４時間サイクルの１６時間増殖することが好ましい。一般に、誘導カルスは最初は極めてゆっくりと成長し、カルスがしばしば継代培養される場合でさえカルス成長に有害なフェノール浸出液（カルスを赤色に変える）を生じる。本明細書の“材料及び方法”の項で更に詳細に記載されるように、サブクローンは比較増殖速度、赤色呈色、黄色呈色及び砕けやすさを含む物理的基準に基づく誘導カルスの継代培養から選ばれる。本明細書で開示された基準によって選ばれた継代培養を表ＩＶに示されるような培地上の固体支持体、好ましくは膜いかだ(Sigma Chemical Co.)に移す。膜いかだは、この系が“メンブランフロー”型バイオリアクターに似ているためにカルス培養に好ましかった。いかだの使用により、培養基が容易に変更及び操作されるので、大量培養に容易に適応させることができる。いかだを使用する他の理由は、寒天又は他のゲル化剤より膜いかだで良好に増殖し、更に分析及び継代培養目的のためにカルスを回収することがより容易である。組織培養において正常な根を培養する方法は次の通りである。根は、組織培養で数種の方法：水耕で成長させた植物根端及び茎／葉外植片から生じた不定根により生産される。これは、Cephalotaxus harr ingtonia（本邦産イヌガヤ）を用いてWickremesinhe & Arteca(1993)の方法で成功したこの方法に従って行われる。外植片源の各々を表面滅菌によって処理し、無菌条件下で切片にする。次いで、外植片を根端及び根切片用根誘導培地を含む組織培養容器、通常ペトリ皿又は茎／葉外植片用カルス誘導培地（急速成長カルスが確立されると、根誘導培地に移した）に移す。これらの培地は、外植片からの根カルス増殖を開始及び促進することができる。好ましい培地は、オーキシン及びサイトカイニンのような植物ホルモンが単独であるいは組合わせて補足されたGamborgのB5培地（Gamborgら，1968）である。Murashige & Skoog(Murashige & Skoog, 1962) のような他の組織培養基等もこの目的のために適切であり、代用される。ゲルライト(Scott Laboratories,West Warwick,R.I.)のようなゲル化剤又は寒天を栄養培地と混合して外植片の維持及び増殖のために培養容器内に固体支持体を形成する。選択された根又はカルスをサブクローン増殖を促進する間隔で継代培養する。２−４週後に活発に増殖する根が移植に選択される。未分化細胞の球状小集塊が観察されるとカルス形成が決定される。これは、典型的には約２−４週間以内に外植片の９０％で生じる。継代培養は最初４−６週間隔で行った。倍加は最初極めてゆっくりであるが、培養内時間に関して使用クローンの倍加速度５−１６日まで増大し、クローンによって２−３週間毎に継代培養することができる。前述の植物種／栽培品種の各々に対して安定なカルス系を確立した後、カルスは通常根を開始するのに４−６週間かかる根誘導培地に移される。組織培養において“毛根”を培養する方法は次の通りである。水耕で成長させたイチイ植物の幼根及びシュートにアグロバクテリウムリゾゲネス株11325、15834等の数種の菌株を移植する。挿し木に標準プロトコールを用いて個々のアグロバクテリウム株を移植する。イチイ幼根及びシュートを表面滅菌し、GamborgのB5培地に置く。外植片に注射器の先端で無菌的に傷つけ、適切な菌株を移植する。４８時間後、外植片を滅菌水ですすぎ、５００μg/mｌのカルベニシリンを含有する新鮮な培地に置く。４−６週後、感染部位に出た“毛根 ”を茎又は根から切除し、残存しているアグロバクテリウムを死滅させるためにカルベニシリンを含有するGamborgのB5培地に置く。形質転換根を２週間毎に細菌のすべてを死滅させる抗生物質を用いて少なくとも３回継代培養する。形質転換根を移してフラスコを振盪し、数週間増殖して用いうるコマーシャルベースによる発酵槽に移す。これらには、容量１．５〜２６０リットルの空気分散系、自由攪拌バッチ系及び推進剤混合発酵系を含めた。上の方がコマーシャルベースによる生産に好ましい。根の生体外及び生体内増殖は次の手順によって最適化される。次いで選択サブクローンの最適培養条件が培養増殖に影響すると考えられる要因：光の有無、ガス組成、温度、ｐＨ、植物ホルモン及び糖を含む培地補足分の多変量分析により決定される。安定な培養増殖が達成された後、根培養が維持培地に保持される。根培養の場合、馴化が起こり、即ち培養がホルモン補足分の要求なしで維持される。固体支持体上で増殖された根の他に、上記の確立された安定根の根端を三角フラスコ（通常１００mlの培地を含む２５０mlフラスコ）に含まれた液体培地に移した。フラスコを当業者に既知の回転振盪機に置き、約１２５rpmで操作した。タキソール及びタキソール関連化合物を生産する水耕によるイチイ根、試験管内正常根の増殖、不定根、茎及び葉外植片由来カルスの根並びにアグロバクテリウム形質転換根を培養する方法が含まれる段階は次の通りである。（１）適切な組織が挿し木源及び開始根形成として選ばれる全体的組織源は、イチイ属植物である。タキソールが単離される種々の植物種としては、T. brevifolia、T. canadensis、T.chinensis、T. floridana、T.glo bosa、T. sumatrana、T. yunnanensisが挙げられ、T. baccata、T. cuspidata及びT. mediaの種々の栽培品種及びイチイ属の他のものが根形成された。用いられる挿し木、植物種又は栽培品種の選択基準は、次の特性に基づくものである：ａ．高タキソール生産ｂ．高９−ジヒドロ−１３−アセチルバッカチンIII生産ｃ．高バッカチンIII生産ｄ．高レベルの他の既知のタキソール前駆体ｅ．ＨＰＬＣ分析により求められた高レベルの未知のタキサン。図２−５に示されるように、以前には同定可能でないピーク（ピークＡ−Ｋ）が組織培養抽出液に出現する。プロファイルは、根（図３−５）由来培養と比べた茎（図２）及び種々の植物種の根培養物で異なっている。保持時間は次の通りである。 A = 33.6 B = 34.9 C = 36.1 D = 37.9 E = 39.9 F = 42.3 G = 44.4 H = 46.2 J = 50.8 K = 51.8 挿し木は２種類の方法--一方は土壌ミックス中及び他方は溶液中で根形成される。イチイ植物は挿し木から比較的増殖が容易であるが、方法は異なる。イチイ挿し木は極めてトポフィティックであり、親植物で示す生育習性を維持する。１例においては、挿し木は９月から霜後の12月まで採取した。これらは休眠中植物の根であり、根培養からのタキソールの高収量が説明される。代謝根活性は、植物の休眠中高いものである。霜後に取った挿し木は典型的には霜なしの挿し木より容易に根形成する。挿し木を取った後、茎の下の方の部分から葉を取り除く。８，０００ppmのＩＢＡ−タルク及び殺菌剤をほとんどの品種に用いたが、５，０００〜１０，０００ppmＩＢＡの急速な浸漬が好ましいものがある。用いることができる多くの種類の培地があるが、砂又は砂／ピートミックスが好ましい。挿し木の下端を６８〜７５゜Ｆに維持し、上端は冷却し、乾燥を防ぐためにミスト下に配置する。挿し木は植付の８〜９週間後に分枝根を示す（Dir &Heuser, 1987）。この期間の後、根を洗浄し植物を水耕に移す。挿し木を土壌に置く代わりは、挿し木の下端を前述のように処理し直接水耕に置くことである。根におけるタキソール及び関連タキサン生産の最大生産と共に根／シュート成長の最適化をもたらす組合わせの要因の１つは、まずイチイ植物の成長を最大にすることである。これは、根形成挿し木を水耕に移すことにより達成される。根帯域においては栄養レベルの最適化(Hoagland & Arnon, 1938)は、ＣＯ₂/Ｏ₂の組合わせ；温度及びオーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、エチレン、ブラシノステロイド、アブシジン酸、シコセル、Ｂ９のような成長抑制物質及び他の調節物質を含む植物成長調節物質を単独で又は組合わせを試験することにより達成される。更に、水耕で成長した植物のシュートにも最適化されたガス組成（ＣＯ₂多量）、環境条件、例えば光、温度、湿度及び植物成長調節物質が必要である。根及びシュートに対するこれらのパラメーターの各々の最適条件は使用される種及び所望される特定のタキサンで異なり、根を高レベルのタキソール、９− ジヒドロ−１３−アセチルバッカチンIII、バッカチンIII、他の既知及び未知タキサンに対して成長させるかが使用される最適条件を要求する。タキソール、タキソールの活性誘導体、セファロマンニン、バッカチン並びにタキソールの他の前駆体及び中間体は、標品と植物抽出液の保持時間を比較することによるＨＰＬＣ分析を用いて試験することができる。この分析は、カルスを抽出し、ＨＰＬＣ分析を抽出液で行い、主ピークの成分を集めることにより達成される。これらのピークの成分を本明細書に開示される微小管安定化分析（図５、材料及び方法）及び試験管内癌モデル系で活性を試験する。スクリーンに適切な癌細胞系としては、Ｂ１６黒色腫；ＭＸ−１乳異種植皮；Ｐ３８８白血病；ＫＢ；Ｌ１２１０白血病が挙げられる。タキソール活性は、抽出液がタキソールと同様の方法で微小管活性の安定化能を有することを示すことにより細胞系においても確認される。タキソールのもう１つの同定手段は、カルス細胞系を抽出し、この抽出液をＨＰＬＣで精製し、Ｈ¹ 及び２−Ｄ高分解能核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析を用いてタキソールを同定することにより達成される（Falzoneら，1992）。増殖速度を最大にするために種々のバイオリアクター設計が有効であり、タキソール、タキソールの活性誘導体、セファロマンニン、バッカチン及び他のタキソール前駆体が細胞系の各々によって生成され、溶液中に分泌されている（Weat her & Giles,1988; Payneら，１９８７）。種々のゲル及びメンブランリアクターに固定化した植物細胞もバイオリアクターに用いられている（Brodelius, 1985）。アルギン酸塩、寒天、アガロース、κ−カラゲナン、ポリアクリルアミド、ポリウレタン及び種々の膜配置が細胞をからみつけるために用いられている（Brodelius, 1988; Smidsrod & Skjak-Braek, 1990）。光レベル、ガス組成／溶存酸素、温度、植物ホルモン、増殖培地のｐＨ、栄養素、ビタミン及びタキソールの培地からの除去のような環境条件を最適化することにより、所望の化合物抽出が最大となる。本発明の細胞系に見出されたタキソールレベルは、Taxus media cv. Hicksii の茎、葉及び樹皮より少なくとも１〜２倍高い（表Ｉ）。これらのレベルは更に増大される。一般に種々の組織培養の場合、低又は検出できないレベルの二次産物を生産する培養は、培養条件の最適化、前駆体供給、生物性（Heinstein,1985 ;Fukuiら，1990）及び無生物性エリシターの使用、例えば紫外線照射（Kartusch & Mittendorfer, 1990）及び重金属イオン（Threlfall & Whitehead, 1988）の使用を含む種々の手段によって高められることが示されている。前駆体をTripte rygium wilfordiiの細胞培養に添加すると、抗腫瘍化合物トリプジオリド（Misa waら，1985）の生産を増大することが報告されている。前駆体供給、本明細書で定義される生物性及び無生物性エリシターは、イチイ培養に関する使用に適している。本発明によれば、イチイ培養からイチイを再生して別のタキソール及び更におもしろいことには、恐らく培養内で同定されたタキソール様活性を有する新規な化合物が得られる。タキソール活性は、抽出液がタキソールと同様の方法で微小管活性の安定化能を有することを示すことにより細胞系においても確認される。タキソールのもう１つの同定手段は、根を抽出し、この抽出液をＨＰＬＣで精製し、Ｈ¹及び２− Ｄ高分解能核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析を用いてタキソールを同定することにより達成される（Falzoneら，1992）。増殖速度を最大にするために種々の水耕系及びバイオリアクター設計が有効であり、タキソール、タキソールの活性誘導体、セファロマンニン、バッカチン及び他のタキソール前駆体根細胞の各々によって生成され、溶液中に分泌されている（Bloom,1989; Hiltonら，1988）。光レベル、ガス組成／溶存酸素及び／又はＣＯ₂、温度、植物ホルモン、増殖培地のｐＨ、栄養素、ビタミン及びタキソールの培地からの除去のような環境条件を最適化することにより、所望の化合物抽出が最大となる。本発明の根に見出されたタキソールレベルは、植物の他の部分より少なくとも１〜２倍高い（表Ｉ）。これらのレベルは更に増大される。一般に種々の根培養の場合、低又は検出できないレベルの二次産物を生産する培養は、培養条件の最適化、前駆体供給、生物性（Heinstein,1985; Fukuiら，1990）及び無生物性エリシターの使用、例えば紫外線照射（Kartusch & Mittendorfer, 1990）及び重金属イオン（Threlfall & Whitehead, 1988）の使用を含む種々の手段によって高められることが示されている。前駆体を根に添加すると、二次代謝物生産を増大することが示されている。前駆体供給、本明細書で定義される生物性及び無生物性エリシターは、イチイ根培養に関する使用に適している。放射線照射及び化学的突然変異原によって根に突然変異を誘発すると、タキソール、１０−デアセチルバッカチンIII、７−エピ−１０−デアセチルバッカチンIII、バッカチンIII、７−エピーバッカチンIII、９−ジヒドロ−１３−アセチルバッカチンIII、セファロマンニン、１０−デアセチルタキソール、７−エピ１０−デアセチルタキソール、７−エピタキソール、これらの化合物の他の既知及び未知の天然誘導体及びタキソールを生成する生化学経路における前駆体及び中間体を含む他の関連タキサン及びタキソールの活性誘導体が得られる。更に、振盪培養及び大量精製と連結された大量バイオリアクターにおける生物性及び無生物性エリシター、前駆体の供給及び他の誘発法により生成物の収量が増加される。本発明は、下記実施例で更に詳細に説明される。これらの実施例は具体的に説明するために含められ、本発明を限定するものとみなされるべきではない。実施例１カルス細胞系Ｇ１のイチイからの調製春にペンシルバニア州立大学の構内にある木から新しく出ているTaxus mediac v. Hicksiiの多肉（多汁質）茎を採取し、直ちに処理した。茎から葉を取り除き、茎を３cmの切片に切断した。試験されたイチイの全植物種において最高レベルのタキソールを含有するために、若い多肉茎組織を選択した。これらの外植片をエタノール中で２０秒間表面滅菌し、直ちに１０％漂白液（v/v）とトゥイーン２０に２０分間入れ、滅菌水で３回すすぎ、無菌条件下で切片にした。他の標準表面滅菌手順も適している。表面滅菌した茎を無菌条件下で切片に切断し、２５℃の明暗所で２，４−Ｄ、カイネチン又は２，４−Ｄとカイネチンのあり及びなしのGamborgのB5培地に置いた。未分化カルス組織は最初は緩慢に増殖するが、多数の継代培養により安定な増殖特徴を有するＧ１と称する砕けやすい黄色がかった細胞系を得た。この細胞系は、２５℃の暗所においてGamborgのB5培地で外因性ホルモンの供給なしで増殖する。細胞系Ｇ１をカゼイン加水分解物、グルコース及びフルクトースで補足した培地に維持し、この細胞系の増殖速度が顕著に増大することが見られた（表III）。他の細胞系はＧ１由来とした。カルス細胞系Ｇ１を表IIIに示されている修飾G amborgのB5培地でサブクローンした。次いでカルス細胞系を２５℃の暗所で表II に示される液体培地を含有する膜いかだに移した。この細胞系をサブクローンし、安定な増殖特徴を有する細胞系を誘導した（ＣＲ１）（実施例２参照）。実施例２本発明の方法に従ってカルスから調製されたタキソール生産細胞系ＣＲ−１の特徴Ｇ１と称するカルスから誘導されたＣＲ−１を称するカルス誘導細胞系は、次の特徴を有する：栄養培地がGamborgのB5培地である培養内で増殖する；２０− ２５℃の暗所で増殖する；外因性植物ホルモンを必要としない（馴化系である）；培地にカゼイン加水分解物、グルコース及びフルクトースの培地に加えることによりその基線に比べて増殖速度の増大を示す；倍加時間５−１６日間及び培養内安定な増殖を示す。細胞系は、タキソール、タキソールの活性誘導体、セファロマンニン、バッカチン及びタキソールの他の前駆体を増殖培地に分泌することができた。ＣＲ１と称するカルス由来細胞系は継代培養後カルスの急速な増殖を生じた：膜いかだに植え込んだ３ｇのカルスが新しい培地を添加した７−１０週間以内に継代培養なしで５０−７０ｇのカルスを生成した。標品タキソール及びセファロマンニンは、各々保持時間３１及び２５分を有する。ＣＲ−１のようなカルス試料は標品タキソール及びセファロマンニンに相当する保持時間を有するが、Ｓ２のような懸濁系はピークがずれ、各々３２及び２５分で溶離する。保持時間のこのずれは、これらの化合物の懸濁系からの精製が困難になる。これは、根培養に関して問題ない。実施例３本発明の方法に従って調製されたタキソール生産懸濁細胞系Ｓ３及びＳＲ−１の特徴更に、２種の懸濁培養系をカルス細胞系Ｇ１から本発明の方法によって作成した。表ＩＶに示される修飾GamborgのB5培地を用いて２５℃の暗所で増殖した場合安定な増殖特徴を有する懸濁培養系Ｓ３を誘導した。本方法で作成した懸濁細胞系は典型的には緩慢に増殖するが、サブクローン化により細胞系Ｓ３を得、適度な増殖速度を有した。本細胞系（Ｓ３）は、タキソール、タキソールのその前駆体及び活性誘導体を生成し、これらの化学物質を溶液中に分泌し、交換樹脂を用いて溶液から容易に取り除くことができる。ＳＲ−１と称するもう１つの懸濁培養細胞系を、膜いかだで増殖させたＣＲ１カルス系からユニークな方法で得た。微細な細胞懸濁液は、カルスＣＲ１が膜いかだで増殖する栄養溶液中に見出された。栄養培地中の懸濁液にカルス細胞系ＣＲ１を変えた細胞を表ＩＶに示されるGamborgのB5培地中約２４−２６℃の暗所で攪拌しながら１リットルの振盪フラスコで増殖する本発明の方法を用いて、ＣＲ１の懸濁培養を作成した。この懸濁培養をＳＲ−１と称した。懸濁培養ＳＲ− １は、タキソール、タキソールの活性誘導体、セファロマンニン、バッカチン及びタキソールの他の前駆体を増殖培地に分泌することができる。実施例４本発明の方法に従って調製されたタキソール生産懸濁細胞系ＬＧ３の特徴暗所で増殖する細胞系Ｇ１（実施例１）の細胞試料を１２時間明るい所、１２時間暗所の光サイクルに２５℃で移した。明るい所に移すと最初は増殖速度が減速し、褐色に変色した。細胞死を避けるために、本カルス系を２，４−Ｄ及びカイネチンを含有するいくつかのホルモン体制に置いた。これらの細胞系をサブクローン化し、GamborgのB5培地で増殖するＬＧ３と称するカルス細胞系を明るい所で選択した（表III）。ＬＧ３には、増殖するために外因性植物ホルモン（1ppm2 ,4−Ｄ及び0.２ppmカイネチン）が必要である。本カルス系は膜いかだに馴化し、懸濁培養が開始した。ＬＧ３を２−イソペンチルアデニン及びインドール−３ −酪酸（0.1、1.0及び5.0ppm）の種々の組合わせからなる種々のホルモン体制で継代培養した。この細胞系は、タキソール、タキソールの活性誘導体、セファロマンニン、バッカチン及びタキソールの他の前駆体を増殖培地に分泌することができる。カルス細胞系ＬＧ３を２５℃の明るい所でサイトカイニン及びオーキシンの１０種類のホルモン体制で継代培養した。本方法を用いることにより、シュート形成が誘導された。本手法は、優れたタキソール生産能による植物の再生においてかつ無菌条件下で増殖された植物のタキソールレベルを高める手段として貴重である。ＬＧＳ−３は、ＬＧ３由来の懸濁培養である。実施例５イチイ培養からタキソール及びタキソール関連化合物の抽出及び分析ＨＰＬＣ分析を用いてTaxus media cv. Hicksii細胞系ＣＲ１、Ｓ３、ＳＲ１及びＬＧ３の各々のおけるタキソール、セファロマンニン及びバッカチンを同定した（材料及び方法参照）。これは、植物試料と標品との間の保持時間を比較することにより達成した。タキソール活性も抽出液が標品と同様の方法で微小管安定化能を有することを示すことにより確認された。タキソールが細胞系に含有することを証明する３番目はタキソールをＨＰＬＣで精製しこの精製試料を核磁気共鳴分析によりタキソールを同定することによった。タキソールの誘導体及び追加の前駆体も細胞系の各々においてＨＰＬＣで同定した。これは、細胞系の各々を抽出し、この抽出液をＨＰＬＣで処理し、主ピークを集め、これらの試料を試験管内微小管安定化分析で試験することにより達成した（材料及び方法参照）。 Taxus media cv. Hicksii細胞系ＣＲ１、Ｓ３、ＳＲ１の誘発されない培養で生産されたタキソールレベル及びＬＧ３タキソールレベルは、ＨＰＬＣ分析で求めた場合若い茎からの抽出液に見られるレベルより２−３倍高かった。以前には同定されていないタキソール活性を有するピークを表すＨＰＬＣプロファイル及び細胞系間のプロファイル差が更に興味深かった。例えば、細胞系ＳＲ−１及びＳ−３のＨＰＬＣクロマトグラムプロファイルの差異は、同一条件下細胞系ＣＲ −１（７）ＨＰＬＣプロファイルと比較した場合明らかであった。ピーク４、タキソール様活性を示しかつＣＲ−１に存在するピークは、Ｓ−３には消えているか存在しない。ピーク５はＣＲ−１に存在するが、ＳＲ−１には消えている。おもしろいことに、ＣＲ−１に見られたピーク４も５もカルス及び培養細胞抽出液のピークを検出するために用いられる条件下でT. media Hicksiiの直接抽出液には検出されなかった。培養の種々の増殖パラメーターを使用するかあるいは種々のＨＰＬＣ法が適用される場合には他のプロファイルが生じることが予想される。ＣＲ−１の方法が本明細書に記載される。疎水性に基づく他の方法又は環含有構造の他の区別方法も適する。実施例６タキソール及びタキソール関連化合物の培養からの収量を増大させる誘発及び前駆体供給懸濁培養系Ｓ３及びＳＲ１を１リットルのフラスコ中GamborgのB5培地で増殖させる（表ＩＶ）。生物性（オートクレーブにかけた菌類細胞壁断片及び胞子）及び無生物性（重金属の塩：バナジン酸塩、鉛及び水銀）誘発がエリシターとして適している。両細胞系及び誘発法により、高レベルのタキソール、その前駆体及びタキソール誘導体が得られる。生体内及び生体外の両方で増殖された根をエリシターとして適切な生物性（オートクレーブにかけた菌類の細胞壁断片及び胞子）及び無生物性（重金属の塩：バナジン酸塩、鉛及び水銀）ストレスで誘発させた。評価されたイチイ属植物／栽培品種すべてを種々の程度に誘発させ、種々のタキサンを増加した。タキソール生化学経路の前駆体及び／又は中間体（即ち酢酸塩、メバロン酸）を供給した根により、タキソールの増加及び広範囲のタキサンが得られ、その個々のレベルはイチイ属植物／栽培品種に依存した。実施例７タキソール及び関連タキサン収量を増加するイチイ培養の突然変異の誘発細胞系ＣＲ１、Ｓ３、ＳＲ１及びＬＧ３に高レベルのタキソール、そのタキソールの前駆体及び活性誘導体を生産する突然変異を誘発させるために、ＵＶ照射処理及びＥＭＳのような化学的突然変異原に供する。選択基準及びタキソール生産細胞系を培養する方法は、本明細書に開示された方法に準じる。この方法でタキソール生産細胞の産生を高める突然変異が選ばれる。高レベルのタキソール、そのタキソールの前駆体及び活性誘導体を生産するイチイ根に突然変異を誘発させるために、ＵＶ照射処理及びＥＭＳのような化学的突然変異原に供する。突然変異を誘発させる他に、天然に存在する自然突然変異も選ばれる。選択基準及びタキソール及び関連タキサン生産根を培養する方法は、本明細書に開示された方法に準じる。この方法でタキソール及び関連タキサン生産根の産生を高める突然変異が選ばれる。実施例８不活性状態の細胞系及び根保存イチイ培養に好ましい新規な保存方法は、インキュベーション温度を４−１０ ℃まで低下させることである。増殖は、冬眠様状態まで遅くなる。細胞又は根を正常に戻すために、温度を増殖に最適なまで徐々に上げた。カルス細胞系ＣＲ１及びＬＧ３はマジェンタＧＡ−７容器内に置かれた膜いかだ上に維持され、Ｓ３及びＳＲ１の振盪培養は１リットルの振盪フラスコに維持され２週間毎に継代培養される。対数期の増殖中細胞培養ＣＲ１、ＬＧ３、３及びＳＲ１の長期保存の凍結保存は、凍結保護剤としてソルビトール及びＤＭＳＯを用いる標準凍結保存法を用いて達成される。凍結保存は、二次代謝物の合成及び蓄積の生合成能が保存から取り出した後無傷のままである細胞培養の長期保存の可能性が大きいことを示した。根培養はマジェンタＧＡ−７容器内に置かれた膜いかだ上に維持され、振盪培養は１リットルの振盪フラスコに維持され２週間毎に継代培養される。対数期の増殖中根培養の長期保存の凍結保存は、凍結保護剤としてソルビトール及びＤＭＳＯを用いる標準凍結保存法を用いて達成される。凍結保存は、二次代謝物の合成及び蓄積の生合成能が保存から取り出した後無傷のままである根の長期保存の可能性が大きいことを示した。実施例９イチイ根由来試験管内組織培養安定な培養増殖が達成された後、根培養を支持培地に保持する。根培養の場合、馴化が起こり、即ち培養がホルモン補足分を必要とせずに維持される。次いで選択サブクローンに最適な培養条件を培養増殖に影響すると考えられる要因：光の有無、ガス組成、温度、ｐＨ、植物ホルモン及び糖を含む培地補足分の多変量分析により求める。無菌正常根及び“毛根”を次の条件：正常根用ホルモンを含み“毛根”用ホルモンなしで２５℃、ｐＨ５．６、２１％Ｏ₂残りについては空気で暗所で保持された維持培地で増殖し、増殖／タキサン生産の多変量分析の根端原料として用いる。いくらかの根端をGamborgのB5、Murashige & Skoog、McCownの木質植物液体培地に移し、通気する。増殖速度／タキサン生産が１ヵ月かけて評価されるが、他の期間も結果によっては適している。最適基本栄養組成物を求めた後、ビタミンの種々のレベルの結果を評価する。例えば、GamborgのB5培地が最適であると見られる場合、ビタミンはB5培地に見られるものの１／２×、１×、２×、３×及び４×に変動する。ビタミンが最適化された後、スクロース、グルコース又はフルクトースのような可変糖が１／２×、１×、２×及び３×に変動する。糖濃度及び種類を最適化した後、１５〜３０℃の温度の影響を評価する。最適温度が確立された後、ｐＨ3. 5〜7.0の影響を評価する。前述のパラメーターのすべてを最適化した後、根の１／２を暗所に保持し、一方の１／２の根を明るい所（５０μｅ m^-2ｓ^-1）に移し、馴化させる。馴化中、糖がすべて除去される時間に根が炭素源として光合成を使用することができるまで増殖培地から糖が徐々に除去される。根が光に馴化した後、５０〜１００mEμ^-2ｓ^-1の可変光レベル及び評価された増殖速度／タキサンに供する。光レベルを最適化した後、ＣＯ₂レベルを0.03〜3 .0％に変えながら一定に保持する。更に、二酸化炭素レベルを暗所で増殖した根に変え、増殖速度／タキサンを評価する。実施例１０イチイ根からのタキソール及びタキソール関連化合物の抽出及び分析ＨＰＬＣ分析を用いて評価したイチイ属植物／栽培品種の各々においてタキソール、１０−デアセチルバッカチンIII、７−エピ−１０−デアセチルバッカチンIII、バッカチンIII、７−エピバッカチンIII、９−ジヒドロ−１３−アセチルバッカチンIII、セファロマンニン、１０−デアセチルタキソール、７−エピ１０−デアセチルタキソール、７−エピタキソール、これらの化合物の他の既知及び未知の天然誘導体を同定した（材料及び方法参照）。タキソール及び関連タキサン及びイチイ属植物／栽培品種と異なった特定のタキサン、例えば９−ジヒドロ−１３−アセチルバッカチンIIIの量がTaxus canadensisに主に見られた。これは、植物試料及び標品との間の保持時間を比較することにより達成された（図１）。タキソール活性も抽出液が標品タキソールと同様の方法で微小管安定化能を有することを示すことにより確認した。タキソールがイチイ植物の根に含有することを証明する３番目はタキソールをＨＰＬＣで精製しこの精製試料を核磁気共鳴分析によりタキソールを同定することによった。タキソールの誘導体及び追加の前駆体も種々のイチイ属植物／栽培品種の各々の根においてＨＰＬＣで同定した。これは、根培養の各々を抽出し、この抽出液をＨＰＬＣで処理し、主ピークを集め、これらの試料を試験管内微小管安定化分析で試験することにより達成した（材料及び方法参照）。使用した標準に相当しない多数のタキサンもあった。イチイ根の誘発されない培養で生産されたタキソールレベルは、大体ＨＰＬＣ分析で求めた場合他の植物からの抽出液に見られるレベルより２−３倍高かった。以前には同定されていないタキソール活性を有するピークを表す根抽出液からのＨＰＬＣプロファイル及び種々のイチイ属植物／栽培品種から得られた根間のプロファイル差が更に興味深かった。例えば、Taxus media、Taxus canadensis 及びTaxus cuspidataのＨＰＬＣクロマトグラムプロファイルの差異は、図３− ５に示されるものと比較した場合明らかであった。含めていない他のプロファイルもイチイ属植物／栽培品種間に広範囲の差異を示している。実施例１１タキソール及び関連タキサンを生産するイチイ根の成長用水耕の使用通気養液中で植物を成長させることによる水耕、栄養膜法及び他の水耕系で根を成長させると、タキソール及び関連タキサンが生産される。また、新規な系も設計され評価される。系を最適化するためには、ガス組成、溶存酸素、スパージ速度及び攪拌速度、光、増殖培地のｐＨ、養分及び有機補足分、樹脂の使用による培地からの二次産物の除去及び誘発のような環境条件の適切な調整が必要である。根の成長は“栄養膜法”に適している。本系は、根を支持する膜上を流動する栄養液を有し再循環される。伝導性を測定することにより必要とされる養分を添加することができ、溶液から一列にサンプリングすることにより培養液中のタキソール、タキソール誘導体及び前駆体の存在を分析することができる。本増量系は膜いかだ上での根の成長と似ている。本系はまた、ノズル、蠕動ポンプ及びタイマーからなる系により断続的に根に噴霧された栄養培地を有し、それにより根全体に均一に養分を供給することにより、更に養分吸収、効率及び養分使用の最少化を高めることにより最適化することができる。根形成挿し木は、通常１／４強度のHoagland液に移し、次の条件下：２１％酸素／0.03％二酸化炭素／残りは窒素が栄養液に通気され、２０〜２５℃、ｐＨ４〜５、植物成長調節物質なしで１ヵ月間馴化させる。植物の上部を相対湿度６０〜９０％、放射照度５０μE m^-2s^-1、周囲レベルＣＯ₂/Ｏ₂及び２０〜２５℃に維持する。増殖速度は、Artecaら(1985)に示されている方法によってこの馴化中、通常約１ヵ月モニターされる。馴化期間後、前述の他のパラメーターを一定に保持しながら１／４、１／２、３／４及び全強度のHoagland液を評価することにより全養分を変える。次いで増殖速度／タキサン生産を評価する。基本栄養組成物が決定された後、１ヵ月の馴化期間に組込み、別のパラメーター設定を評価する。植物の馴化期間後に評価された次のパラメーター設定は、可変レベルの窒素、カリウム又はリンの影響である。例えば１／２強度のHoagland が最適である場合には、窒素、カリウム又はリンレベルを１／２Hoagland液にみられたレベルの１／２、１Ｘ、２Ｘ及び４Ｘに変え、増殖速度／タキサンを評価する。養分を最適化した後、可変レベルのＣＯ₂０．０３〜５％を栄養液に吹き込み、増殖速度及びタキサン生産を評価する。ＣＯ₂レベルを最適化した後、前述の最適化されたパラメーターのすべてを一定に保ち温度を１５〜２５℃に変え、その後増殖速度及びタキサン生産を評価する。全パラメーターを根帯域において最適化した後、これらを馴化期間中一定に保持する。植物の上部を光レベル５０〜５００μE m^-2s^-1に供し、増殖速度及びタキサン生産を評価する。光レベルを最適化した後、ＣＯ₂レベル0.03〜0.3％に変え増殖速度及びタキサン生産を評価しながら一定に保持する。光及びＣＯ₂レベルが最適化された後、一定に保持され、バイオマスを増大させるためにホルモン処理する。これは２方法、根を通すかあるいは葉噴霧で達成することができる。適用された濃度範囲は、根及びシュート適用間で異なり、根濃度の方が常に低い。水耕で成長させた植物の根及びシュート双方のバイオマス生産を最大にするために、ジベレリン、サイトカイニン又はブラシノステロイドをジベレリンの場合１〜１００ppm及びサイトカイニン又はブラシノステロイドの場合０．０１〜１p pmの濃度で根に適用する。葉散布を用いる場合、ジベレリンは１００〜５００pp mにわたって適用され、ブラシノステロイド又はサイトカイニンは１〜１０ppmにわたって適用される。処理後、増殖速度及びタキサン生産を評価する。十分なバイオマスが得られた後、Cycocelのような成長抑制物質を葉に５００〜１０００ppmの濃度で適用するこにより植物の上部の成長を遅らせてから増殖速度及びタキサン生産を評価する。実施例１２タキソール及びタキソール関連化合物を生産するバイオリアクターにおける培養物又は根の使用懸濁細胞系ＳＲ１をエアーリフト型攪拌及び潅流バイオリアクターで増殖すると、タキソールが生成される。また、新規な培養槽も設計される。系を最適化するためには、ガス組成、溶存酸素、スパージ速度及び攪拌速度、温度、増殖培地のｐＨ、養分及び有機補足分、樹脂の使用による培地からの二次産物の除去及び誘発のような環境条件の適切な調整が必要である。カルス系ＣＲ１の増殖は“メンブランフロー”バイオリアクターに適している。本系は、カルスを支持する膜上を流動する栄養液を有し再循環される。伝導性を測定することにより必要とされる養分を添加することができ、溶液から一列にサンプリングすることにより培養液中のタキソール、タキソール誘導体及び前駆体の存在を分析することができる。本増量系は膜いかだ上でのカルス細胞系ＣＲ１の増殖と似ている。本系はまた、ノズル、蠕動ポンプ及びタイマーからなる系により断続的にカルスに噴霧された栄養培地を有し、それによりカルス全体に均一に養分を供給することにより、更に養分吸収、効率及び養分使用の最少化を高めることにより最適化することができる。根をエアーリフト型攪拌及び潅流バイオリアクターで増殖すると、タキソール及び関連タキサン生産が得られる。また、新規な培養槽も設計される。系を最適化するためには、ガス組成、溶存酸素、スパージ速度及び攪拌速度、温度、光、増殖培地のｐＨ、養分及び有機補足分、樹脂の使用による培地からの二次産物の除去及び誘発のような環境条件の適切な調整が必要である。根の増殖は“メンブランフロー”バイオリアクターに適している。本系は、根支持する膜上を流動する栄養液を有し再循環される。伝導性を測定することにより必要とされる養分を添加することができ、溶液から一列にサンプリングすることにより培養液中のタキソール、タキソール誘導体及び前駆体の存在を分析することができる。本増量系は膜いかだ上での根の増殖と似ている。本系はまた、ノズル、蠕動ポンプ及びタイマーからなる系により断続的に根に噴霧された栄養培地を有し、それにより根全体に均一に養分を供給することにより、更に養分吸収、効率及び養分使用の最少化を高めることにより最適化することができる。本発明は種々の変更及び変形を受けやすいが、その個々の実施態様は図面の例によって示してきており、ここで詳細に記載される。しかしながら、本発明を開示された具体的な形に限定するものではなくて、反対に本発明が添付の請求の範囲によって定義される本発明の真意及び範囲内に属する変更、等価及び変形をすべて包含するものであることは理解されるべきである。材料及び方法１．微小管安定化バイオアッセイ微小管安定化バイオアッセイを用いて組成物の微小管形成の安定化能をスクリーンする。微小管バイオアッセイの結果と癌モデル分析における組成物の化学療法作用との間に予想的直接相関がある。従って、微小管安定化バイオアッセイは臨床試験に有効な化学療法剤のスクリーニング試験として当業者に認識されている。バイオアッセイを行うために、ニューロン微小管（ＭＴ）タンパク質を新鮮な子ウシ脳を用いてShelanskiら(1973)の方法に従って調製する。１Ｍグルタミン酸の存在下に４回循環する（Hamel & Lin, 1981）ことによって、１回循環したＭＴタンパク質から内因性微小管会合タンパク質（ＭＡＰ）を取り出す。循環を完了した後、得られた最後の微小管沈降物を冷ＰＭバッファーに可溶化し、更に Weingartenら(1975)によるホスホセルロースクロマトグラフィーで精製する。暗視野顕微鏡を用いる分析を次のように行う。（１）試験抽出液は上記のようにＰＭバッファーに可溶化したものである。ＰＭバッファー：５０mMl，４−ピペリジンジエタンスルホン酸（Ｐｉｐｅｓ）ｐＨ６．９；１mM硫酸マグネシウム；１mMエチレングリコールービス（ｂ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸［ＥＧＴＡ］チュブリン及びＭｇ −ＧＴＰ貯蔵液。２．タキソール生産細胞系を生産するカルス及びサブクローンの物理的選択基準（図２及び３参照）イチイ茎外植片の約９０％が開始約２−４週間後にカルス誘導を示した。黄色呈色カルスを選び、外植片から分離し、継代培養した。カルスは、最初緩慢な増殖を示し、約３−６ヵ月以上で倍加するだけであることが特徴的である。克服されるべきもう１つの難点は、ほとんどのカルスが継代培養後１−３週間以内に茶色がかった色に変化し、最後に死滅することである。赤色に呈色した浸出液は、細胞死が起こりそうなもう１つの徴候であった。黄色に呈色した砕けやすいカルスの凝集塊を継代培養に選択した。赤色及び褐色に呈色した凝集塊は選択しなかった。選択できる凝集塊はたいてい褐色に呈色した（死）カルス細胞で囲まれており、生細胞はしばしば褐色に呈色したカルスから突出している結節として出てくる。３．タキソール及び関連タキサンの抽出根培養を回収し、凍結乾燥し、オムニミックスホモジナイザ（OmniInternatio nal, Waterbury, Connecticut）で均質化することによるメタノールと塩化メチレンの１：１ミックスで抽出し、次いで１５分間音波処理した。この抽出液をワットマン＃１ろ紙でろ過し、ろ液を減圧下で濃縮乾固した。次いで残留物を塩化メチレンと水に分配し、塩化メチレン画分を窒素流れ下で濃縮乾固した。次いで最終沈降物／残留物を酸性メタノール（０．１％酢酸）に懸濁し、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析の０．２ミクロンナイロンフィルターでろ過した。固相抽出カートリッジ（Ｃ₁₈ Sep-pakカートリッジ；Waters,Milford,Mas sachusetts）は、根抽出液が葉、茎、樹皮、カルス及び細胞懸濁培養に比べて非常にきれいであるので不要であった（Wickremesinhe & Arteca, 1993c）。４．ＨＰＬＣによる同定フェニル保護モジュール（Rainin Instrument Co. Inc., Woburn,Massachuset ts）を含むCurosil G 4 mカラム（４．６mm×２５０mm；Phenomenex,Torrance, CA）で分析用ＨＰＬＣを行った。１０mM酢酸塩バッファー（ｐＨ＝４．０）：アセトニトリル（５６：４４）からなる移動相を０．６mlの流速で用いた。吸光度２２７nmでモニターすることによりタキソールを検出した。試料毎に２回注入を行い、タキソール及びセファロマンニンを定量するために２ピーク領域の平均を用いた。ピークを同定するために、１０−デアセチルバッカチンIII、７−エピ−１０ −デアセチルバッカチンIII、バッカチンIII、７ −エピバッカチンIII、９−ジヒドロ−１３−アセチルバッカチンIII、セファロマンニン、１０−デアセチルタキソール、７−エピ１０−デアセチルタキソール、７−エピタキソール及びタキソールの標品を用いた。０．００１〜１０mg／注入の標品量を注入することにより主要タキサンすべての線状曲線が決定された。タキソールのピークは、それらを集め次いで微小管安定化バイオアッセイ及びＮＭＲ分析で分析することにより確認した。５．核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）標品タキソール及び根から精製したタキソールを重水素で標識した塩化メチレンに可溶化し、１Ｈ及び１３ＣＮＭＲスペクトルをFalzoneら(1992)によって記載されている一次元及び二次元法で分析した。６．７．８．９．参考文献本明細書で用いた方法、手法及び／又は組成を補足、説明、背景提示又は教示するために、下記の参考文献を参考として本明細書に引用する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｄ 305/14 7329−4ＣＣ１２Ｐ 17/02 7432−4Ｂ (72)発明者ウィックレメシンヘエナクシャアメリカ合衆国ペンシルバニア州 16801 ステイトカレッジグラデュエイトサークル６エイチ

Claims

【特許請求の範囲】１．タキソール、タキソール生成する生化学経路の前駆体又は中間体及びタキソールの誘導体からなる群より選ばれた精製化合物の生産方法であって、（ａ）イチイ属植物の組織外植片を培養を形成しかつ培養細胞によって化合物を生産することができる条件下で培養し；（ｂ）培養又は培養の順化培地から化合物を集める；ことを含む方法。２．組織が根又は若い茎を含む請求項１記載の方法。３．根が休眠植物由来である請求項２記載の方法。４．更に、培養中誘発法を適用することにより化合物の二次代謝物の生産を高めることを含む請求項１記載の方法。５．誘発法が培養にタキソール前駆体を供給することを含む請求項３記載の方法。６．タキソール前駆体が酢酸塩である請求項５記載の方法。７．誘発法が菌類抽出液を加えることを含む請求項４記載の方法。８．更に、集めた化合物を単離及び精製して非タキソール含有化合物及び混入物を除去することを含む請求項１記載の方法。９．根が毛根である請求項２記載の方法。 10．毛根が無毛イチイ根にアグバクテリウムを感染することにより生産される請求項９記載の方法。 11．培養が根の試験管内組織培養による請求項１記載の方法。 12．培養が根の水耕増殖による請求項１記載の方法。 13．化合物が９−ジヒドロ−１３−アセチルバッカチン−３であり、イチイ属植物がTaxus canadensisである請求項１記載の方法。 14．イチイが更にTaxus media cv. Hicksiiとして定義される請求項１記載の方法。 15．化合物が癌モデル系の細胞増殖を阻害するか又は微小管安定化バイオアッセイで陽性結果を生じることができる請求項１記載の方法。 16．癌モデル系がＢ１６黒色腫、ＭＸ−１乳異種植皮、Ｐ３８８白血病、ＫＢ及びＬ１２１０白血病からなる群より選ばれた細胞系を含む請求項15記載の方法。 17．イチイ培養から細胞系を確立する方法であって、（ａ）若い茎及び根からなる群から外植片の組織源を選択し；（ｂ）外植片をカルス誘導培地で培養してカルスを形成し；（ｃ）カルスの選択切片を継代培養してサブクローン増殖を促進し；（ｄ）サブクローンを選択して細胞系を発育させ；（ｅ）細胞系を維持培地中の固体支持体上で培養する；段階を含む方法。 18．イチイが更にTaxus media cv. Hicksiiとして定義される請求項17記載の方法。 19．カルス誘導培地が植物ホルモンで補足したGamborgのB5培地を含む請求項17 記載の方法。 20．植物ホルモンが2,4−Ｄ、カイネチン及び2,4−Ｄとカイネチンとの組合わせからなる群より選ばれる請求項19記載の方法。 21．カルスの選択切片が、他のカルスの増殖速度に比べて増殖速度が高いこと、増殖を阻害する浸出液の存在を示す赤色呈色がないこと、黄色呈色の存在及び砕けやすさからなる群より選ばれた基準に基づいて選ばれる請求項17記載の方法。 22．細胞系を維持するための固体支持体が膜いかだを含み、維持培地が表ＩＶによる修飾GamborgのB5培地を含む請求項17記載の方法。 23．維持培地がカゼイン加水分解物、グルコース及びフルクトースを含む請求項 17記載の方法。 24．グルコース及びフルクトースの濃度が合計約10−40g/lである請求項23記載の方法。 25．維持培地がスクロース、グルコース及びフルクトースからなる群より選ばれた糖を含み、該糖の濃度が約４０−８０g/lである請求項17記載の方法。 26．カゼイン加水分解物が約０．２−１．０g/lである請求項23記載の方法。 27．根が休眠期の植物由来である請求項17記載の方法。 28．該化合物がタキソール、タキソール生産をもたらす生化学経路の前駆体又は中間体及びタキソールの誘導体からなる群より選ばれる請求項１記載の方法の生産物である精製化合物。 29．イチイ組織由来の細胞系であって、下記の特徴を有する細胞系。（ａ）培養内で安定な長期増殖；及び（ｂ）タキソール、タキソール生産をもたらす生化学経路の前駆体又は中間体及びタキソールの誘導体からなる群より選ばれた化合物を発現する能力。 30．イチイがTaxus media cv. Hicksiiを含む請求項29記載の細胞系。 31．化合物が癌モデル系の細胞増殖を阻害するか又は微小管安定化バイオアッセイで陽性結果を生じることができる請求項29記載の細胞系。 32．癌モデル系がＢ１６黒色腫、ＭＸ−１乳異種植皮、Ｐ３８８白血病、ＫＢ及びＬ１２１０白血病からなる群より選ばれた細胞系を含む請求項31記載の細胞系。 33． Taxus media cv. Hicksiiの茎、葉又は樹皮の直接抽出により生産されるより少なくとも約１−２倍増加するタキソール量を生産するとして定義された請求項29記載の細胞系。 34．タキソールの生産方法であって、（ａ）イチイ由来の細胞系又は水耕培養根をバイオリアクターに入れ；（ｂ）タキソールが細胞系又は根によって生産されかつバイオリアクターの栄養培地に分泌されるようにバイオリアクターを操作し；（ｃ）培地からタキソールを集める；ことを含む方法。 35．細胞系が請求項17記載の方法に従って生産される請求項34記載の方法。 36．微小管安定化活性を示す化合物であって、クロシルＧカラム、No.40からのＨＰＬＣプロファイルで溶離するピーク、安定なイチイ細胞系からの抽出液又は水耕で成長させた根からなる群から選ばれる化合物。 37．イチイ細胞系がＣＲ−１であり、選択されたピークが３１分で溶離する請求項36記載の化合物。 38．図３−５のピークＡ−Ｋからなる群より選ばれた請求項36記載の化合物。