WO2021033779A1 - イチイ属の毛状根の製造方法 - Google Patents

イチイ属の毛状根の製造方法 Download PDF

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plant material
cutting
cut
growing
roots
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PCT/JP2020/031802
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洋 南
多葉田　誉
一史 矢崎
博彰 草野
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北海道三井化学株式会社
国立大学法人京都大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H7/00—Gymnosperms, e.g. conifers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a hairy root of the genus Taxus.
  • a plant belonging to the genus Taxus of the family Taxus contains paclitaxel, which is a taxane-based anticancer agent used as a therapeutic agent for ovarian cancer, breast cancer, lung cancer, and the like.
  • taxane-based anticancer agents are produced as raw materials using plantations of taxus plants or plant cell culture methods, and are produced using these as precursors.
  • Taxus plants are slow-growing plants that take more than 10 years to grow to a height of 20 cm above the ground, and cell proliferation in plant cell culture is also extremely slow, 2-3 times in 2 to 4 weeks. It is insufficient for industrial production and it is difficult to obtain a large amount of paclitaxel.
  • Non-Patent Document 1 a method for producing Ichiikarus transformed to increase the content of a substance having a taxane skeleton structure by infecting Ichiikarus with Agrobacterium rhizogenes is disclosed (Patent Document 1). Further, a method for introducing a 10-deacetylbaccatin III-10 ⁇ -O-acetyltransferase gene using an Agrobacterium tumefaciens LBA4404 strain has been reported for the purpose of improving the production amount of paclitaxel (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 a method of introducing a ⁇ -glucuronidase gene into a Taxus cuspidata cell line using Agrobacterium tumefaciens EHA105 strain or Agrobacterium lysogenes ATCC15834 strain (Non-Patent Document 2), particle bombardment method A method for transiently expressing the ⁇ -glucuronidase gene and the luciferase gene using the drug (Non-Patent Document 3) has been reported.
  • Non-Patent Document 4 the conversion efficiency is about 2.8%).
  • an object of the present invention is to provide a method for efficiently producing a hairy root of the genus Taxus.
  • the present inventors have devised a method for efficiently producing hairy roots of the genus Taxus by immersing a plant material of the genus Taxus in the family Yews in a solution containing Agrobacterium Rhizobium rhizome and cutting it. I found it.
  • the present invention includes the following embodiments. ⁇ 1> A method for producing hairy roots by infiltrating Agrobacterium rhizogenes into a plant material of the genus Taxus of the family Yew.
  • C A growing step of growing the plant material cut in the cutting step and A method for producing hairy roots, including.
  • ⁇ 2> The method for producing a hairy root according to ⁇ 1>, wherein the plant material is a branch of the genus Taxus in the family Yew.
  • ⁇ 3> The method for producing a hairy root according to ⁇ 2>, wherein the branch is a young branch.
  • ⁇ 4> At least a part of the end portion of the plant material is cut to prepare a cut surface, and in the dipping step, the cut surface is immersed in a solution containing the Agrobacterium rhizogenes.
  • ⁇ 1> to ⁇ The method for producing a hairy root according to any one of 3>.
  • a plurality of cut surfaces of the plant material are cut to prepare a plurality of cut surfaces, and at least one of the plurality of cut surfaces is immersed in a solution containing the Agrobacterium rhizogenes in the dipping step. , ⁇ 4>.
  • the method for producing a hairy root ⁇ 6> The method for producing a hairy root according to ⁇ 5>, wherein the plurality of cut surfaces include at least one cut surface that is not immersed in the solution containing Agrobacterium rhizogenes.
  • ⁇ 7> The production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the Agrobacterium rhizogenes contains a target gene to be introduced into the plant material.
  • ⁇ 9> The method for producing a hairy root according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, wherein the plant material is yew (Taxus cuspidata).
  • ⁇ 10> A method for producing hairy roots by infiltrating Agrobacterium rhizogenes into a plant material of the genus Taxus of the family Yew.
  • A A dipping step of immersing at least a part of the plant material of the genus Taxus of the family Yew in a solution containing Agrobacterium rhizogenes under a reduced pressure environment.
  • B A cutting step of cutting the plant material immersed in the dipping step and a cutting step of cutting the plant material.
  • C A growing step of growing the plant material cut in the cutting step and
  • E A dipping step of immersing at least a part of the adventitious roots generated in the growing step in a solution containing Agrobacterium rhizogenes under a reduced pressure environment.
  • F The cutting step of cutting the soaked adventitious roots and
  • G A growing process for growing adventitious roots cut in the cutting process and A method for producing hairy roots, including.
  • a method for efficiently producing a hairy root of the genus Taxus is provided.
  • the target gene is introduced into Agrobacterium Rhizobium rhizogenes, and the target gene is transformed by the transformation method using the target gene with high efficiency. It is possible to obtain hairy roots of the genus Taxus into which.
  • 3 is an agarose gel electrophoresis diagram showing amplification of each gene of rollB, virD2, and EF1 ⁇ by PCR.
  • 3 is an agarose gel electrophoresis diagram showing amplification of each gene of (1) GFP, (2) virD2, (3) rollB, and (4) EF1 ⁇ by PCR.
  • the method for producing hairy roots according to the present invention is a method for producing hairy roots by infiltrating a plant material of the genus Taxus of the family Yew with Agrobacterium rhizogenes.
  • B) A cutting step of cutting the plant material immersed in the dipping step and a cutting step of cutting the plant material.
  • C A growing step of growing the plant material cut in the cutting step, including.
  • the "adventitious root” in the present invention means a root generated from a part other than the original root, for example, a branch or a stem.
  • the "hairy root” in the present invention refers to an adventitious root in which Agrobacterium Rhizobium infects a plant, and T-DNA possessed by Agrobacterium Rhizobium is sent to a plant cell and transferred to a chromosome. It means what was formed by being incorporated.
  • the dipping step in the present invention is a step of dipping at least a part of a plant material of the genus Taxus of the family Yew in a solution containing Agrobacterium rhizogenes under a reduced pressure environment.
  • the plant material of the genus Taxus of the family Taxus is not particularly limited as long as it can be used as a host of Agrobacterium lysogenes, which will be described later. Can be mentioned. Among these, Taxus cuspidata (Yew) is preferable.
  • the part and morphology used as the plant material is not particularly limited, and any part and morphology such as wood, branches, leaves, roots, adventitious roots, stems, seeds, and callus can be used. Branches are preferred from the viewpoint of more efficient transformation and improvement of rooting efficiency. In addition, among the branches, young branches obtained during the period of overwintering and new growth (spring to summer (March to September) in Japan) are preferable. Further, as will be described later, the adventitious root prepared in one embodiment of the present invention can be further subjected to infiltration of Agrobacterium Rhizobium rhizome as a plant material. When the plant material is a branch, preferably a young branch, the number of branches that survive infection with Agrobacterium rhizogenes increases, and the transformation efficiency tends to be further improved.
  • the size of the plant material of the genus Taxus used in the present invention is not particularly limited, but in the case of a branch, for example, 1 cm to 50 cm, preferably 10 to 40 cm, more preferably 20 to 30 cm, and most preferably 20. It can be up to 25 cm in length.
  • At least a part of the end of the plant material is cut to create a cut surface, and the cut surface can be immersed in a solution containing Agrobacterium rhizogenes (hereinafter, also referred to as "bacterial solution”). preferable.
  • bacterial solution a solution containing Agrobacterium rhizogenes
  • the plant material has a plurality of cut surfaces formed by cutting a plurality of ends thereof, and it is preferable to immerse at least one of the cut surfaces. By cutting a plurality of ends in this way, the rooting efficiency tends to be further improved.
  • the plant material has a plurality of cut surfaces
  • the solution containing Agrobacterium rhizogenes easily permeates the inside of the plant material from the cut surface immersed in the reduced pressure environment, and the transformation efficiency becomes higher. Tends to improve.
  • the cutting method is not particularly limited, and for example, the plant material may be cut using a knife.
  • the bacterial solution that infiltrates the plant material contains Agrobacterium rhizogenes, and is not particularly limited as long as the Agrobacterium rhizogenes can survive.
  • the bacterial solution include a solution containing Agrobacterium rhizogenes in a liquid such as distilled water, an isotonic solution, a buffer solution, an LB medium for tissue culture, or a YEB medium.
  • the bacterial solution preferably contains a surfactant in order to promote the infiltration of Agrobacterium rhizogenes.
  • a surfactant a nonionic surfactant is preferable.
  • the nonionic surfactant include SILWET-L77 (trade name), which is a kind of polyether-modified silicone, Tween 20 (trade name), Tween 80 (trade name), and the like.
  • the optical concentration (OD600) of the bacterial solution is not particularly limited, but is, for example, 0.05 to 2.0. From the viewpoint of more efficient transformation, the OD600 is preferably 0.1 to 1.0.
  • the number of bacteria in the bacterial solution is not particularly limited, but is, for example, 1.0 ⁇ 10 2 to 1.0 ⁇ 10 8 cfu / ml. From the viewpoint of more efficient transformation, the number of bacteria is preferably 1.0 ⁇ 10 4 to 1.0 ⁇ 10 6 cfu / ml.
  • the Agrobacterium rhizogenes contained in the bacterial solution is not particularly limited, but from the viewpoint of further improving the transformation efficiency, the A13 strain (MAFF210266), the ATCC15834 strain, and the LBA1344 strain or transformants thereof are preferable.
  • the Agrobacterium rhizogenes a transformant of A13 strain or A13 strain is preferable from the viewpoint of further improving the transformation efficiency.
  • These Agrobacterium rhizogenes can be used alone or in combination of two or more.
  • Agrobacterium rhizogenes may contain a wild-type strain, or may contain a mutant strain in which a target gene described later is integrated into a chromosome, and a gene intended for expression in a plant material is incorporated. It may contain a mutant strain containing the above-mentioned plasmid.
  • Examples of the plasmid contained in Agrobacterium include pBI121, pHKN29, pLC41, pSB131, U0009B, U0017S, pSB134, pNB131, and pIG121Hm, or those in which the target gene is introduced into these plasmids. Not limited.
  • the target gene refers to a target gene whose expression is intended to be expressed in yew.
  • the target gene is not particularly limited, and for example, when the purpose is to improve the productivity of the reporter genes such as green fluorescent protein (GFP) gene, luciferase (LUC) gene, ⁇ -glucuronidase (GUS) gene, and paclitaxel, Taxadiene synthase (TXS), taxadiene5 ⁇ hydroxylase (T5 ⁇ H), taxadiene 5 ⁇ -ol O-acetyltransferase (TDAT), taxan 10 ⁇ -hydroxylase (T10 ⁇ H), taxadiene 13 ⁇ -hydroxylase (T ⁇ H), taxan 2 ⁇ -O-benzoyltransferase (DBBT), 10 -Deacetylbaccin III-10-O-acetictransphase (DBAT), phenylalane aminomutase (PAM), Baccatin III: 3-amino, 3-phenylpropanoyltrance
  • the vacuum pressure under reduced pressure can be, for example, 30 kPa or less. From the viewpoint of further improving the transformation efficiency, the vacuum pressure under reduced pressure is preferably 20 kPa or less, more preferably 15 kPa or less, further preferably 10 kPa or less, particularly preferably 5 kPa or less, and most preferably 2.5 kPa or less.
  • the depressurizing time can be, for example, 1 minute to 2 hours. From the viewpoint of further improving the transformation efficiency and the rooting efficiency, the depressurizing time is preferably 1 minute to 30 minutes, more preferably 2 minutes to 10 minutes.
  • the time for returning the inside of the chamber to normal pressure is preferably 1 second to 30 minutes, more preferably 1 minute to 3 minutes, from the viewpoint of further improving rooting efficiency.
  • the number of repetitions can be, for example, 3 to 5 times.
  • the cutting step in the present invention is a step of cutting the plant material immersed in the dipping step.
  • the cutting in the present invention is to fix a plant material with a substance that can support it, and examples of the material used for fixing include soil, burnt soil, superabsorbent polymer, charcoal, water moss, etc., but are limited to these. There is nothing.
  • the fixing method is not particularly limited as long as it can be fixed to the extent that it can be grown, and a conventionally known method can be used.
  • the growing step in the present invention is a step of growing the plant material cut in the cutting step.
  • the growing process is not particularly limited as long as the cut plant material can be grown, and a conventionally known growing method can be adopted.
  • the cut plant material may be grown in an open field, or may be grown in a certain environment by an artificial meteorological machine. When growing in a constant environment with an artificial meteorological machine, it may be kept in the range of, for example, 10 ° C to 40 ° C, preferably in the range of 20 ° C to 30 ° C.
  • the illuminance may be maintained in the range of 1.0 klx to 15.0 klx, and preferably in the range of 2.0 klx to 6.0 klx.
  • the growing period is not particularly limited as long as the rooting of adventitious roots can be confirmed, and can be, for example, 2 weeks to February.
  • the adventitious roots obtained from the above steps (a) to (c) can be further infected with Agrobacterium Rhizobium rhizogenes for further transformation.
  • This further transformation may be carried out on simple adventitious roots generated without transformation in the above steps (a) to (c) to improve the transformation efficiency, and another transformation on hairy roots. You may make a conversion.
  • another transformation may be performed on the adventitious roots without selecting the mere adventitious roots and the hairy roots.
  • At least a part of the adventitious roots generated in the (e) growing step contains agrobacterium resogenes under a reduced pressure environment.
  • Production of hairy roots which includes a dipping step of immersing in a solution, (f) a cutting step of cutting adventitious roots soaked in the dipping step, and (g) a growing step of growing adventitious roots cut in the cutting step.
  • the method Between the (c) growing step and the (e) dipping step, a sorting step of (d) sorting adventitious roots generated from the plant material may be further provided.
  • the sorting step in the present invention is a step of sorting adventitious roots generated in the above-mentioned growing step, and can be arbitrarily performed.
  • the selection may be a step of selecting mere adventitious roots and hairy roots that are not infected with Agrobacterium rhizogenes, or a step of selecting hairy roots into which a specific gene has been introduced.
  • the sorting method is not particularly limited as long as the purpose of sorting can be achieved, but for example, sorting can be performed according to the state of introduction of a specific gene.
  • the state of introduction of a specific gene can be confirmed by a conventional method such as expression of a reporter gene or PCR method for a specific gene.
  • the (e) dipping step in the present invention is a step of immersing at least a part of the adventitious roots generated in the (c) growing step in a solution containing Agrobacterium rhizogenes under a reduced pressure environment. It can be carried out in the same manner as in (a) dipping step except that the selected adventitious roots are used instead of the plant material.
  • the composition of the bacterial solution and the environment at the time of immersion may be the same conditions as in (a) the immersion step, or may be different conditions.
  • the adventitious root may be used separately from the plant material (for example, a branch), or may be used without being separated from the plant material (for example, a branch).
  • the (f) cutting step in the present invention is a step of cutting the adventitious roots immersed in the (e) dipping step.
  • the (f) cutting process can be performed in the same manner as the (b) cutting process.
  • the material and fixing method may be the same as or different from the (b) cutting process.
  • the (g) growing step in the present invention is a step of growing adventitious roots cut in the (f) cutting step.
  • the (g) growing step can be carried out in the same manner as the (c) growing step.
  • the growing conditions in the growing step may be the same as or different from the growing conditions in the (c) growing step.
  • the transformation efficiency is further improved by further including (d) sorting step to (g) growing step in addition to each step of (a) dipping step to (c) growing step. Can be done.
  • Example 1 Inoculation of Agrobacterium Rhizobium (1) Culture of Agrobacterium Rhizobium Agrobacterium Rhizobium LBA1344, ATCC15834 and A13 (MAFF210266) are inoculated into YEB medium and shaken at 28 ° C. and 200 rpm for 2 days. After culturing, the cells were centrifuged at 6,500 rpm for 5 minutes at 20 ° C. and collected.
  • Genotyping of hairy roots (1) Genomic DNA extraction of adventitious roots Among the adventitious roots obtained by inoculating Agrobacterium risogenes, 49 long-length DNAs can be extracted and Example 2 described later can be performed. Each tip (root tip) was excised several cm (7 to 10 mg), frozen in liquid nitrogen, and crushed in a dairy pot. Transfer the crushed adventitious roots to a tube, add 1 ml of 2 ⁇ CTAB solution (2% hexadecyltrimethylammonium bromide, 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA), and add 65. Incubated at ° C for 1 hour.
  • CTAB solution 2% hexadecyltrimethylammonium bromide, 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA
  • the PCR reagent is KOD One (registered trademark) PCR Master Mix (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), a primer (SEQ ID NO: 1 and 2) for detecting the endogenous gene (EF1 ⁇ ) of Ichii, and for determining the residue of Agrobacterium tumefine.
  • Primers (SEQ ID NOs: 3 and 4) for detecting the virD2 gene used in the above and primers (SEQ ID NOs: 5 and 6) for detecting the rollB gene used for determining hairy roots were used. The primer sequences used are shown below.
  • Figure 2 shows the results of subjecting the amplified product to agarose gel electrophoresis after performing a PCR reaction according to a conventional method.
  • the formed root is a hairy root
  • the virD2 gene is amplified, it is determined that the root has residual Agrobacterium rhizogenes.
  • the yew endogenous gene (EF1 ⁇ ) was used as a positive control.
  • Genomic DNA was extracted from 49 roots rooted from young branches inoculated with Agrobacterium rhizogenes, and the transgene was confirmed by the above-mentioned PCR. As a result, the rolB gene was detected in 11 of them, and 4 of them were found.
  • the virD2 gene was amplified and the residual Agrobacterium rhizogenes was detected. As a result, 7 out of 45 adventitious roots, excluding 4 confirmed to have residual Agrobacterium rhizogenes, were hairy roots (transformation efficiency was about 15.6%). Sequence analysis was performed using the rollB gene amplification product obtained by PCR as a template, using the primers of SEQ ID NOs: 5 and 6 and using 3130 ml Genetic Analyser (manufactured by Life Technologies) according to a conventional method, and it was consistent with the A13 strain. The rolB gene introduced into the hairy root genomic DNA was derived from the A13 strain.
  • Example 2 Reinoculation of individuals inoculated with Agrobacterium Rhizobium rhizogens (1) Preparation of competent cells Agrobacterium Rhizobium rhogenes ATCC15834 strain and A13 strain (MAFF210266) were inoculated into 5 mL of YEB medium at 28 ° C. and 200 rpm. The cells were shake-cultured overnight. This culture solution was added to 250 mL of YEB medium and cultured with shaking at 28 ° C. and 200 rpm for 5 hours, and then centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. to collect bacteria.
  • Agrobacterium Rhizobium rhizogens ATCC15834 strain and A13 strain (MAFF210266) were inoculated into 5 mL of YEB medium at 28 ° C. and 200 rpm. The cells were shake-cultured overnight. This culture solution was added to 250 mL of YEB medium and cultured with shaking at 28 ° C. and 200
  • the cells were washed successively with 1 mM HEPES (pH 7.0) and 10% glycerol, collected under the above-mentioned centrifugation conditions, and then suspended in 2.5 mL of 10% glycerol. 40 ⁇ L of each was dispensed into a sterilization tube, frozen in liquid nitrogen, and then stored at ⁇ 80 ° C. This was used as a competent cell and used in the experiments described later.
  • the colonies of each Agrobacterium rhizogenes transformed in (2) were inoculated into a YEB medium containing 50 ⁇ M / mL kanamycin, cultured with shaking at 28 ° C. and 200 rpm for 2 days, and then cultured at 6,500 rpm for 5 minutes. , Centrifuged at 20 ° C. and collected. After collecting the root tips of each collected bacterial cell in 2.1 above, the top of the yew shoot is cut to form a new cut surface, and the root tips of 49 adventitious roots are cut again to form a cut surface. did. For the 49 adventitious roots of this young branch, 1. Inoculated and stored in the same manner as in (2). One month later, about 40 new roots were rooted from 49 adventitious roots inoculated with Agrobacterium rhizogenes. Forty-nine plants were collectively immersed in the bacterial solution without being separated from the shoots.
  • Genotyping of hairy roots obtained from re-inoculated individuals 3. 2. Use the 32 adventitious roots obtained in (3). (1), 2. In the same manner as in (2), genomic DNA was extracted and the transgene was confirmed by PCR. In addition, primers (SEQ ID NOs: 7 and 8) for detecting the GFP gene encoded by the plasmid pHKN29 were also used. The results of agarose gel electrophoresis are shown in FIG.
  • the GFP gene was detected in 14 out of 32 adventitious roots (Fig. 3 (1)), and no residual Agrobacterium rhizogenes was detected in these adventitious roots (Fig. 3 (2)).
  • the rollB gene was detected (the part surrounded by the white dotted line in FIG. 3 (3) indicates the expression of the rollB gene).
  • the transformation efficiency at this time was 12.5%. In this way, it was possible to obtain hairy roots by inoculating the individual once inoculated with Agrobacterium Rhizobium rhizogenes and rooting it again.
  • a method for efficiently producing a hairy root of the genus Taxus is provided.
  • the target gene is introduced into Agrobacterium Rhizobium rhizogenes, and the target gene is introduced with high efficiency by transforming the yew with the transformation method. Hairy roots can be obtained.

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Abstract

本発明は、イチイ属の毛状根を効率よく製造する方法を提供するものであって、イチイ科イチイ属の植物材料にアグロバクテリウム・リゾゲネスを浸潤させ毛状根を作成する方法であって、（ａ）前記イチイ科イチイ属の植物材料の少なくとも一部を、減圧環境下において、アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に、浸漬する浸漬工程と、（ｂ）前記浸漬工程で浸漬された植物材料を挿し木する挿し木工程と、（ｃ）前記挿し木工程で挿し木された植物材料を育成する育成工程と、を含む、毛状根の製造方法を用いる。

Description

イチイ属の毛状根の製造方法
　本発明は、イチイ属の毛状根の製造方法に関する。
　イチイ科イチイ属植物、例えばタイヘイヨウイチイ（Ｔａｘｕｓ　ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ　ＮＵＴＴ）には、卵巣癌、乳癌、肺癌などの治療薬として使用されるタキサン系抗がん剤であるパクリタキセルが含まれている。現在、タキサン系抗がん剤はイチイ属植物のプランテーション、或いは植物細胞培養法を用いて原料が生産され、これを前駆物質として製造が行われている。しかしながら、イチイ属植物は地上２０ｃｍの高さに成長するのに１０年以上かかる生長の遅い植物であり、また植物細胞培養での細胞増殖においても２～４週間で２～３倍と極めて遅く、工業的生産には不十分であり大量のパクリタキセルを得ることは困難である。
　この問題を解決するため、イチイカルスにアグロバクテリウム・リゾゲネスを感染させ、タキサン骨格構造を有する物質の含有量を高めるように形質転換されたイチイカルスの作出方法が開示されている（特許文献１）。また、パクリタキセルの生産量向上を目的としてアグロバクテリウム　ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株を用いて１０－デアセチルバッカチンＩＩＩ－１０β－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を導入する方法が報告されている（非特許文献１）。さらに他の遺伝子導入方法として、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０５株やアグロバクテリウム・リゾゲネスＡＴＣＣ１５８３４株を用いてＴａｘｕｓ　ｃｕｓｐｉｄａｔａ細胞株にβ－グルクロニダーゼ遺伝子を導入する方法（非特許文献２）、パーティクルボンバードメント法を用いてβ－グルクロニダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子を一過的に発現させる方法（非特許文献３）等が報告されている。
　加えて、Ｔａｘｕｓ　ｃｕｓｐｉｄａｔａの種苗にアグロバクテリウム・リゾゲネスＲ１０００株、Ａ４株及びＡＴＣＣ１５８３４株を感染させ、得られた１０７系統の根から安定的に生育する３系統の毛状根が得られた（形質転換効率約２．８％）という報告（非特許文献４）がある。
特開平７－２８９２４８号公報
Zhang et al. (2011) Plant Cell Tiss Organ Cult. 106:63-70. Ketchum et al. (2007) Plant Cell Rep. 26:1025-1033). Vongpaseuth et al. (2007) Biotechnol Prog. 23:1180-1185. Kim et al.(2009) J. Korean Soc.52:144-150.
　上述の様に、イチイ属の形質転換や遺伝子導入方法について種々検討がされているが、未だ導入効率は低く、また安定した形質転換された個体を獲得する手法は確立されていないのが現状である。そのため、高い効率の遺伝子導入法が求められている。
　そこで本発明は、イチイ属の毛状根を効率よく製造する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、イチイ科イチイ属の植物材料を、減圧環境下において、アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬し、挿し木することにより、イチイ属の毛状根を効率よく製造する方法を見出した。
　本発明には、以下の実施形態が含まれる。
　＜１＞　イチイ科イチイ属の植物材料にアグロバクテリウム・リゾゲネスを浸潤させ毛状根を製造する方法であって、
（ａ）前記イチイ科イチイ属の植物材料の少なくとも一部を、減圧環境下において、アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬する浸漬工程と、
（ｂ）前記浸漬工程で浸漬された植物材料を挿し木する挿し木工程と、
（ｃ）前記挿し木工程で挿し木された植物材料を育成する育成工程と、
を含む、毛状根の製造方法。
＜２＞　前記植物材料がイチイ科イチイ属の枝である、＜１＞に記載の毛状根の製造方法。
＜３＞　前記枝が若枝である、＜２＞に記載の毛状根の製造方法。
＜４＞　前記植物材料の少なくとも一部の端部を切断して切断面を作成し、前記浸漬工程において、前記切断面を前記アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬する、＜１＞～＜３＞のいずれか１つに記載の毛状根の製造方法。
＜５＞　前記植物材料の複数の端部を切断して複数の切断面を作成し、前記浸漬工程において、前記複数の切断面の少なくとも１つを前記アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬する、＜４＞に記載の毛状根の製造方法。
＜６＞　前記複数の切断面は、前記アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬しない少なくとも一つの切断面を含む、＜５＞に記載の毛状根の製造方法。
＜７＞　前記アグロバクテリウム・リゾゲネスが、前記植物材料に導入する目的遺伝子を含む、＜１＞～＜６＞のいずれか１つに記載の製造方法。
＜８＞　前記アグロバクテリウム・リゾゲネスが、Ａ１３株（ＭＡＦＦ２１０２６６）、ＡＴＣＣ１５８３４株、およびＬＢＡ１３４４株もしくはこれらの形質転換体からなる群より選ばれる少なくとも１種である、＜１＞～＜７＞のいずれか１つに記載の毛状根の製造方法。
＜９＞　前記植物材料がイチイ（Ｔａｘｕｓ　ｃｕｓｐｉｄａｔａ）である、＜１＞～＜８＞のいずれか１つに記載の毛状根の製造方法。
＜１０＞　イチイ科イチイ属の植物材料にアグロバクテリウム・リゾゲネスを浸潤させ毛状根を製造する方法であって、
（ａ）前記イチイ科イチイ属の植物材料の少なくとも一部を、減圧環境下において、アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬する浸漬工程と、
（ｂ）前記浸漬工程で浸漬された植物材料を挿し木する挿し木工程と、
（ｃ）前記挿し木工程で挿し木された植物材料を育成する育成工程と、
（ｅ）前記育成工程で生じた不定根の少なくとも一部を、減圧環境下において、アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に、浸漬する浸漬工程と、
（ｆ）前記浸漬された不定根を挿し木する挿し木工程と、
（ｇ）前記挿し木工程で挿し木された不定根を育成する育成工程と、
を含む、毛状根の製造方法。
　本発明の一実施形態では、イチイ属の毛状根を効率よく製造する方法が提供される。本発明の一実施形態の製造方法によれば、アグロバクテリウム・リゾゲネスに目的遺伝子を導入し、これを用いて該形質転換方法にてイチイ属の形質転換を行うことにより、高効率で目的遺伝子が導入されたイチイ属の毛状根の取得が可能となる。
イチイの枝から発生した不定根の様子を示した図である。 ＰＣＲにてｒｏｌＢ、ｖｉｒＤ２、ＥＦ１α各遺伝子の増幅を示したアガロース電気泳動図である。 ＰＣＲにて（１）ＧＦＰ、（２）ｖｉｒＤ２、（３）ｒｏｌＢ、（４）ＥＦ１αの各遺伝子の増幅を示したアガロース電気泳動図である。
　以下に本発明を詳細に説明する。
　本発明に係る毛状根の製造方法は、イチイ科イチイ属の植物材料にアグロバクテリウム・リゾゲネスを浸潤させ毛状根を製造する方法であって、
（ａ）前記イチイ科イチイ属の植物材料の少なくとも一部を、減圧環境下において、アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬する浸漬工程と、
（ｂ）前記浸漬工程で浸漬された植物材料を挿し木する挿し木工程と、
（ｃ）前記挿し木工程で挿し木された植物材料を育成する育成工程、
を含む。
　本発明における「不定根」とは本来の根以外の部分、例えば枝や茎から発生した根を意味する。また、本発明における「毛状根」とは、不定根のうち、アグロバクテリウム・リゾゲネスが植物に感染し、アグロバクテリウム・リゾゲネスが保有しているＴ－ＤＮＡが植物細胞に送り込まれ、染色体に組み込まれることで形成されたものを意味する。
＜（ａ）浸漬工程＞
　本発明における浸漬工程は、イチイ科イチイ属の植物材料の少なくとも一部を、減圧環境下において、アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬する工程である。
　イチイ科イチイ属の植物材料は、後述するアグロバクテリウム・リゾゲネスの宿主として使用できれば特に限定されないが、例えば、Ｔａｘｕｓ　ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｔａｘｕｓ　ｂａｃｃａｔａ、Ｔａｘｕｓ　ｘ　ｍｅｄｉａ、Ｔａｘｕｓ　ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ、Ｔａｘｕｓ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｔａｘｕｓ　ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｔａｘｕｓ　ｃｕｓｐｉｄａｔａ等を挙げることができる。これらの中でも、Ｔａｘｕｓ　ｃｕｓｐｉｄａｔａ（イチイ）が好ましい。
　植物材料として用いる部位および形態は、特に限定されず、木本、枝、葉、根、不定根、茎、種子、カルス等あらゆる部位および形態を用いることができる。形質転換をより効率的に行う観点および発根効率を向上させる観点から、枝が好ましい。また、枝の中でも、越冬し新たに伸長する時期（日本の春から夏（３月から９月頃））に得られる若枝が好ましい。また後述のとおり、本発明の一実施形態にて作成された不定根を植物材料としてさらにアグロバクテリウム・リゾゲネスの浸潤に供すこともできる。植物材料が枝、好ましくは若枝であると、アグロバクテリウム・リゾゲネスに感染しても生存している枝が多くなり、形質転換効率がより向上する傾向がある。
　本発明に用いるイチイ属の植物材料の大きさは、特に限定されるわけではないが、例えば枝の場合、例えば１ｃｍ～５０ｃｍ、好ましくは１０～４０ｃｍ、より好ましくは２０～３０ｃｍ、最も好ましくは２０～２５ｃｍの長さにすることができる。
　植物材料は、少なくとも一部の端部が切断されて切断面が作成されており、その切断面をアグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液（以下、「菌液」ともいう。）に浸漬することが好ましい。このように切断面を浸漬することで、アグロバクテリウム・リゾゲネスの感染効率がより向上する傾向にある。また、植物材料は、複数の端部が切断されて複数の切断面が作成されており、その切断面の少なくとも１つを浸漬することが好ましい。このように複数の端部を切断することで、発根効率がより向上する傾向にある。また、植物材料が複数の切断面を有する場合、その切断面の少なくとも１つを菌液に浸漬し、かつ、その切断面の少なくとも１つを菌液に浸漬しないことが好ましい。このように少なくとも１つの切断面を菌液に浸漬しないことで、減圧環境下において浸漬した切断面から植物材料の内部にアグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液が浸透しやすくなり、形質転換効率がより向上する傾向がある。
　切断する方法は、特に制限されず、例えば、刃物を用いて植物材料を切断すればよい。
　植物材料を浸潤させる菌液は、アグロバクテリウム・リゾゲネスを含み、アグロバクテリウム・リゾゲネスが生存できるものであれば特に制限されない。菌液としては、例えば、蒸留水、等張液、緩衝液、組織培養用のＬＢ培地やＹＥＢ培地などの液体中にアグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液を挙げることができる。
　菌液は、アグロバクテリウム・リゾゲネスの浸潤を促進するために界面活性剤を含むことが好ましい。界面活性剤としては、非イオン性の界面活性剤が好ましい。非イオン性の界面活性剤としては、例えばポリエーテル変性シリコーンの１種であるＳＩＬＷＥＴ－Ｌ７７（商品名）や、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ８０（商品名）などが例示される。
　菌液の光学濃度（ＯＤ６００）は、特に制限されないが、例えば０．０５～２．０である。形質転換をより効率的に行う観点から、ＯＤ６００は０．１～１.０が好ましい。
　菌液における菌数は、特に制限されないが、例えば１．０×１０２～１．０×１０８ｃｆｕ／ｍｌである。形質転換をより効率的に行う観点から、菌数は１．０×１０４～１.０×１０６ｃｆｕ／ｍｌが好ましい。
　菌液が含むアグロバクテリウム・リゾゲネスは、特に限定されないが、形質転換効率をより向上させる観点から、Ａ１３株（ＭＡＦＦ２１０２６６）、ＡＴＣＣ１５８３４株、およびＬＢＡ１３４４株もしくはこれらの形質転換体が好ましい。アグロバクテリウム・リゾゲネスとしては、形質転換効率をより向上させる観点から、これらの中でも、Ａ１３株又はＡ１３株の形質転換体が好ましい。これらアグロバクテリウム・リゾゲネスは、単独或いは複数種を混合して利用することができる。アグロバクテリウム・リゾゲネスは、野生株を含んでいてもよく、後述の目的遺伝子などが染色体中に組み込まれた変異株を含んでいてもよく、植物材料内での発現を意企する遺伝子が組み込まれたプラスミドを含む変異株を含んでいてもよい。
　アグロバクテリウムが含むプラスミドとしては、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＨＫＮ２９、ｐＬＣ４１、ｐＳＢ１３１、Ｕ０００９Ｂ、Ｕ００１７Ｓ、ｐＳＢ１３４、ｐＮＢ１３１、およびｐＩＧ１２１Ｈｍ、もしくはこれらのプラスミドに目的遺伝子が導入されたもの等があげられるが、これらに限定されるわけではない。
　本発明において目的遺伝子とは、イチイ内で発現を意企する目的の遺伝子を指す。目的遺伝子については、特に限定されず、例えばレポーター遺伝子である緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子やβ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、パクリタキセルの生産性向上を目的とする場合には、Ｔａｘａｄｉｅｎｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＴＸＳ）、ｔａｘａｄｉｅｎｅ５α　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（Ｔ５αＨ）、ｔａｘａｄｉｅｎｅ　５α－ｏｌ　Ｏ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＴＤＡＴ）、ｔａｘａｎ　１０β－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（Ｔ１０βＨ）、ｔａｘａｄｉｅｎｅ　１３α-ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ＴαＨ）、ｔａｘａｎ　２α－Ｏ－ｂｅｎｚｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＤＢＢＴ）、１０－ｄｅａｃｅｔｙｌｂａｃｃａｔｉｎ　ＩＩＩ－１０－Ｏ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＤＢＡＴ）、ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　ａｍｉｎｏｍｕｔａｓｅ（ＰＡＭ）、Ｂａｃｃａｔｉｎ　ＩＩＩ：３－ａｍｉｎｏ，３－ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＢＡＰＴ）、３’－Ｎ－ｄｅｂｅｎｚｏｙｌ－２－ｄｅｘｙｔａｘｏｌ－Ｎ－ｂｅｎｚｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＤＢＴＮＢＴ）等から選択されたパクリタキセルの合成に関与する酵素を生産するための遺伝子を挙げることができる。
　減圧環境下における浸漬は、真空ポンプなどによって大気圧よりも減圧されたチャンバー内において行われる。減圧下の真空圧力は、例えば３０ｋＰａ以下とすることができる。形質転換効率をより向上させる観点から、減圧下の真空圧力は、２０ｋＰａ以下が好ましく、１５ｋＰａ以下がより好ましく、１０ｋＰａ以下がさらに好ましく、５ｋＰａ以下が特に好ましく以下、２．５ｋＰａ以下が最も好ましい。
　また減圧する時間は、例えば１分間～２時間とすることができる。形質転換効率をより向上させる観点及び発根効率をより向上させる観点から、減圧する時間は、好ましくは１分間～３０分間であり、より好ましくは２分間～１０分間である。
　減圧環境下から常圧環境下に戻す際には、植物材料を菌液に浸漬した状態で行うことが、形質転換効率をより向上させる観点から好ましい。すなわち、植物材料を菌液に浸漬した状態でチャンバー内の圧力を常圧に戻すことが好ましい。チャンバー内を常圧に戻す時間は、発根効率をより向上させる観点から、１秒間～３０分間が好ましく、１分間～３分間がより好ましい。
　また、減圧環境下と常圧環境下を繰り返し付与することが、形質転換効率をより向上させる観点から好ましい。繰り返しの回数は、例えば３回～５回にすることができる。
＜（ｂ）挿し木工程＞
　本発明における挿し木工程は、浸漬工程で浸漬された植物材料を挿し木する工程である。
　本発明における挿し木とは、植物材料を支持しうる物質にて固定することであり、固定に用いる資材として土、焼土、超吸収性ポリマー、炭、水苔等が挙げられるがこれらに限定されることはない。固定方法は、育成できる程度に固定できれば特に制限されず、従来公知の方法を用いることができる。
＜（ｃ）育成工程＞
　本発明における育成工程は、挿し木工程で挿し木された植物材料を育成する工程である。
　育成工程は、挿し木された植物材料が育成できれば特に制限されず、従来公知の育成方法を採用することができる。例えば、挿し木された植物材料を、露地において育成させてもよく、人工気象機により一定環境下にして育成させてもよい。人工気象機により一定環境下で育成させる場合、例えば１０℃～４０℃の範囲に保てばよく、２０℃～３０℃の範囲に保つことが好ましい。また、照度は、１．０ｋｌｘ～１５．０ｋｌｘの範囲に保てばよく、２．０ｋｌｘ～６．０ｋｌｘの範囲に保つことが好ましい。育成期間は、不定根の発根が確認できれば特に制限されず、例えば２週間～２月とすることができる。
　本発明の一実施形態では、上述の（ａ）～（ｃ）工程から得られた不定根をさらにアグロバクテリウム・リゾゲネスに感染させ、さらなる形質転換を行うことができる。このさらなる形質転換は、上述の（ａ）～（ｃ）工程で形質転換されずに生じた単なる不定根に対して行って形質転換効率を向上させてもよく、毛状根に対して別の形質転換を行ってもよい。また、単なる不定根と毛状根を選別せずに、不定根に対して別の形質転換を行ってもよい。
　すなわち、本発明の一実施形態は、上述の（ａ）～（ｃ）工程に加え、（ｅ）育成工程で生じた不定根の少なくとも一部を、減圧環境下において、アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬する浸漬工程と、（ｆ）浸漬工程で浸漬された不定根を挿し木する挿し木工程と、（ｇ）挿し木工程で挿し木された不定根を育成する育成工程と、を含む、毛状根の製造方法である。（ｃ）育成工程と（ｅ）浸漬工程との間に、さらに（ｄ）植物材料から生じた不定根を選別する選別工程を有していてもよい。
＜（ｄ）選別工程＞
　本発明における選別工程は、上述の育成工程で生じた不定根を選別する工程であり、任意に行うことができる。選別は、アグロバクテリウム・リゾゲネスに感染していない単なる不定根と毛状根とを選別する工程であってもよく、特定の遺伝子が導入された毛状根を選別する工程であってもよい。選別方法は、選別するという目的を達成できれば特に制限されないが、例えば、特定の遺伝子の導入状態により選別することができる。特定の遺伝子の導入状態は、レポーター遺伝子の発現や特定遺伝子に対するＰＣＲ法などの常法により確認することができる。
＜（ｅ）浸漬工程＞
　本発明における（ｅ）浸漬工程は、（ｃ）育成工程で生じた不定根の少なくとも一部を、減圧環境下において、アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬する工程である。植物材料の代わりに選別された不定根を用いる以外は（ａ）浸漬工程と同様に行うことができる。菌液の組成や、浸漬時の環境は、（ａ）浸漬工程と同じ条件であってもよく、異なる条件であってもよい。
　不定根は、植物材料（例えば枝）から分離して用いてもよく、植物材料（例えば枝）から分離させずに用いてもよい。
＜（ｆ）挿し木工程＞
　本発明における（ｆ）挿し木工程は、（ｅ）浸漬工程で浸漬された不定根を挿し木する工程である。（ｆ）挿し木工程は、（ｂ）挿し木工程と同様に行うことができる。資材や固定方法は、（ｂ）挿し木工程と同一であってもよく、異なっていてもよい。
＜（ｇ）育成工程＞
　本発明における（ｇ）育成工程は、（ｆ）挿し木工程で挿し木された不定根を育成する工程である。（ｇ）育成工程は、（ｃ）育成工程と同様に行うことができる。（ｇ）育成工程における育成条件は、（ｃ）育成工程の育成条件と同じあってもよく、異なっていてもよい。
　毛状根の製造方法において、（ａ）浸漬工程～（ｃ）育成工程の各工程に加え、（ｄ）選別工程～（ｇ）育成工程をさらに含むことで、形質転換効率をより向上させることができる。
　以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
１．アグロバクテリウム・リゾゲネスの接種
（１）アグロバクテリウム・リゾゲネスの培養
　アグロバクテリウム・リゾゲネスＬＢＡ１３４４株、ＡＴＣＣ１５８３４株及びＡ１３株（ＭＡＦＦ　２１０２６６）をＹＥＢ培地に植菌し２８℃、２００ｒｐｍで２日間振とう培養した後６，５００ｒｐｍ、５分間、２０℃で遠心分離し集菌した。
（２）イチイへのアグロバクテリウム・リゾゲネス接種
　集菌した各菌体を、０．４６ｇの接種培地（ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類（富士フィルム和光純薬社製））、２０ｇのスクロース、０．１ｇのＭＥＳ、１００μＬのＢ５ビタミンｘ１０００倍液、２μＬの６－ベンジルアデニン（１ｇ／Ｌ　ＤＭＳＯ）、１ｍＬのアセトシリンゴン（１０ｇ／Ｌ　ＤＭＳＯ）、４０μＬのＳＩＬＷＥＴ　Ｌ－７７（商品名）を水に溶解し、１Ｎ水酸化カリウム溶液でｐＨ５．７に調整し、２００ｍＬのアグロバクテリウム・リゾゲネス懸濁液（菌液）を得た。イチイ（Ｔａｘｕｓ　ｃｕｓｐｉｄａｔａ）から若枝約２０ｃｍを採取し、基部から約５ｃｍの葉を除去した後、頂部及び基部を切断して切断面を２つ形成し、アグロバクテリウム・リゾゲネス懸濁液（菌液）に基部先端を含む切断面を浸漬した。このとき、もう一方の切断面(頂部)は菌液に浸漬しなかった。これを真空デシケーター（ｋａｒｔｅｌｌ社製）に移し真空ポンプ（アルバック機工社製：ＤＡ－３０Ｓ）で３分間真空（０ｋＰａ）まで減圧した後、常圧に戻すことを３回繰り返した。イチイ若枝を取り出し、１００倍希釈した植物活力剤（メネデール社製）を含む水で灌水した土（プロトリーフ社製：ＣＡＳＡ　ＧＲＡＩＮＥ　さし芽・種まきの土）に挿し木し、人工気象器（日本医科器械製作所社製：ＮＣ－３５０Ｓ）内で２３℃、２．６ｋｌｘで１ヶ月保管した。１ヶ月後、アグロバクテリウム・リゾゲネスを接種した若枝から約５０本が発根した（図１）。
２．毛状根のジェノタイピング
（１）不定根のゲノムＤＮＡ抽出
　アグロバクテリウム・リゾゲネスを接種し得られた不定根のうち、長さが長くＤＮＡを抽出しかつ後述の実施例２を行うことができる４９本について、それぞれの先端（根端）を数ｃｍ（７～１０ｍｇ）切除し液体窒素で凍結、乳鉢で破砕した。破砕した不定根をチューブに移し、２×ＣＴＡＢ溶液（２％の臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．４ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ）を１ｍｌ添加し、６５℃で１時間インキュベートした。これに等量のクロロフォルム／イソアミルアルコール（２４／１）を加え、２０分間混和した後、１２，０００×ｇで１０分間遠心分離した。遠心分離後上層を回収し、上記操作を繰り返した。得られた溶液に等量のイソプロパノールを添加し１６，０００×ｇで５分間遠心分離した後、上清を除去し７０％エタノール水溶液を添加し再度遠心分離した。上清を除去し沈殿を乾燥させた後ＴＥ緩衝液１００μＬに溶解し、ゲノムＤＮＡ溶液を得た。
（２）ＰＣＲによる導入遺伝子の確認
　不定根より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによる導入遺伝子の判定を行った。ＰＣＲ試薬はＫＯＤ　Ｏｎｅ（登録商標）　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡社製）を、またイチイの内在遺伝子（ＥＦ１α）を検出するプライマー（配列番号１、２）、アグロバクテリウム・リゾゲネスの残留を判定するために用いるｖｉｒＤ２遺伝子を検出するプライマー（配列番号３、４）、毛状根の判定に用いるｒｏｌＢ遺伝子を検出するプライマー（配列番号５、６）を使用した。使用したプライマー配列を以下に示す。
・配列番号１
CCCGGATCCTGAGACTGGAGTGATTAAGC
・配列番号２
TTGATGACTCCAACAGCAACAGT
・配列番号３
ATGCCCGATCGAGCTCAAGT
・配列番号４
CGAGCCTGCCGCTCAAGGCGCCGAA
・配列番号５
TTGGTGAACTGTGTGATGCCGCAA
・配列番号６
TCTATCTCGCGAGAAGATGCAGAA
　定法に従いＰＣＲ反応を行った後、増幅産物をアガロース電気泳動に供した結果を図２に示す。ここで、ｒｏｌＢ遺伝子が増幅されていれば形成した根が毛状根であり、ｖｉｒＤ２遺伝子が増幅されたものは根にアグロバクテリウム・リゾゲネスの残存があると判定される。加えてイチイの内在遺伝子（ＥＦ１α）を、ポジティブコントロールとして用いた。アグロバクテリウム・リゾゲネスを接種した若枝から発根した４９本の根からゲノムＤＮＡを抽出し前述のＰＣＲによる導入遺伝子の確認を行った結果、１１本からｒｏｌＢ遺伝子が検出され、このうち４本はｖｉｒＤ２遺伝子が増幅しアグロバクテリウム・リゾゲネスの残存が検出された。結果、不定根４９本からアグロバクテリウム・リゾゲネスの残存が確認された４本を除く４５本中、７本が毛状根であった（形質転換効率は約１５．６％）。ＰＣＲで得られたｒｏｌＢ遺伝子増幅産物を鋳型とし、配列番号５、６のプライマーを使用し定法に従い３１３０ｘｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製)を用いてシーケンス解析を実施したところ、Ａ１３株と一致し、イチイ毛状根ゲノムＤＮＡに導入されたｒｏｌＢ遺伝子はＡ１３株由来であった。
〔実施例２〕
３.アグロバクテリウム・リゾゲネスを接種した個体への再接種
（１）コンピテントセルの調製
　アグロバクテリウム・リゾゲネスＡＴＣＣ１５８３４株及びＡ１３株（ＭＡＦＦ２１０２６６）を５ｍＬのＹＥＢ培地に植菌し２８℃、２００ｒｐｍで一晩振とう培養した。この培養液を２５０ｍＬのＹＥＢ培地に添加し２８℃、２００ｒｐｍで５時間振とう培養した後、５，０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離し集菌した。１ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０％グリセロールで順に洗浄し、前述遠心分離条件で集菌した後、２．５ｍＬの１０％グリセロールに懸濁した。滅菌チューブに４０μＬずつ分注し液体窒素で凍結した後－８０℃で保存した。これをコンピテントセルとし、後述の実験に使用した。
（２）エレクトロポレーションによるアグロバクテリウムの形質転換
　各コンピテントセルを溶解後プラスミドｐＨＫＮ２９（Ｍｏｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｃｒｏｂｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔ．（２００３）１６：６６３－８）を１μｇ添加した。エレクトロポレーター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製：Ｇｅｎｅ－ｐｌｕｓｅｒ）にて２．５ｋＶ、２５μＦ、２００Ωの条件で定法に従い高電圧パルスをかけた後、速やかに８００μＬのＹＥＢ培地を添加し２８℃、１時間回復培養を行った。これを５０μＭ／ｍＬカナマイシンを含むＹＥＢ寒天培地に播種し、２８℃で３日間静置培養した。
（３）アグロバクテリウム・リゾゲネスの培養及び接種
　前述３．（２）で形質転換された各アグロバクテリウム・リゾゲネスのコロニーを５０μＭ／ｍＬのカナマイシンを含むＹＥＢ培地に植菌し２８℃、２００ｒｐｍで２日間振とう培養した後、６，５００ｒｐｍで、５分間、２０℃で遠心分離し集菌した。
　集菌した各菌体を前述２．１で根端を採取した後のイチイ若枝の頂部を切断して改めて切断面を形成し、４９本の不定根の根端を改めて切断して切断面を形成した。この若枝が有する４９本の不定根に対し、１．（２）と同様の方法にて接種、保管した。１ヶ月後、アグロバクテリウム・リゾゲネスを接種した４９本の不定根から新たに約４０本発根した。なお、４９本は、若枝から分離させずに、まとめて菌液に浸漬した。
４．再接種した個体から得られた毛状根のジェノタイピング
　前述の３．（３）で得られた不定根３２本を２．（１）、２．（２）と同様にゲノムＤＮＡ抽出、ＰＣＲによる導入遺伝子の確認を行った。また、プラスミドｐＨＫＮ２９にコードされるＧＦＰ遺伝子を検出するプライマー（配列番号７、８）も合わせて使用した。アガロース電気泳動の結果を図３に示す。
・配列番号７
CCACCCTCGTGACCACCTTCAC
・配列番号８
GAACTCCAGCAGGACCATGTGAT
　結果、不定根３２本中１４本からＧＦＰ遺伝子が検出され（図３（１））、これらの不定根からアグロバクテリウム・リゾゲネスの残存は検出されず（図３（２））、このうち４本からｒｏｌＢ遺伝子が検出された（図３（３）の白い点線で囲んだ部分がｒｏｌＢ遺伝子の発現を示す）。この時の形質転換効率は１２．５％であった。この様に、一度アグロバクテリウム・リゾゲネスを接種し発根させた個体を材料として再度接種を行うことで毛状根を得ることが可能であった。
　本発明によれば、イチイ属の毛状根を効率よく製造する方法が提供される。本発明の製造方法によれば、アグロバクテリウム・リゾゲネスに目的遺伝子を導入し、これを用いて該形質転換方法にてイチイの形質転換を行うことにより、高効率で目的遺伝子が導入されたイチイ毛状根の取得が可能となる。

Claims (10)

  1. 　イチイ科イチイ属の植物材料にアグロバクテリウム・リゾゲネスを浸潤させ毛状根を製造する方法であって、
    （ａ）前記イチイ科イチイ属の植物材料の少なくとも一部を、減圧環境下において、アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬する浸漬工程と、
    （ｂ）前記浸漬工程で浸漬された植物材料を挿し木する挿し木工程と、
    （ｃ）前記挿し木工程で挿し木された植物材料を育成する育成工程と、
    を含む、毛状根の製造方法。
  2. 　前記植物材料がイチイ科イチイ属の枝である、請求項１に記載の毛状根の製造方法。
  3. 　前記枝が若枝である、請求項２に記載の毛状根の製造方法。
  4. 　前記植物材料の少なくとも一部の端部を切断して切断面を作成し、前記浸漬工程において、前記切断面を前記アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬する、請求項１～３のいずれか１項に記載の毛状根の製造方法。
  5. 　前記植物材料の複数の端部を切断して複数の切断面を作成し、前記浸漬工程において、前記複数の切断面の少なくとも１つを前記アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬する、請求項４に記載の毛状根の製造方法。
  6. 　前記複数の切断面は、前記アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬しない少なくとも１つの切断面を含む、請求項５に記載の毛状根の製造方法。
  7. 　前記アグロバクテリウム・リゾゲネスが、前記植物材料に導入する目的遺伝子を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の製造方法。
  8. 　前記アグロバクテリウム・リゾゲネスが、Ａ１３株（ＭＡＦＦ２１０２６６）、ＡＴＣＣ１５８３４株、およびＬＢＡ１３４４株もしくはこれらの形質転換体からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１～７のいずれか１項に記載の毛状根の製造方法。
  9. 　前記植物材料がイチイ（Ｔａｘｕｓ　ｃｕｓｐｉｄａｔａ）である、請求項１～８のいずれか１項に記載の毛状根の製造方法。
  10. 　イチイ科イチイ属の植物材料にアグロバクテリウム・リゾゲネスを浸潤させ毛状根を製造する方法であって、
    （ａ）前記イチイ科イチイ属の植物材料の少なくとも一部を、減圧環境下において、アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬する浸漬工程と、
    （ｂ）前記浸漬工程で浸漬された植物材料を挿し木する挿し木工程と、
    （ｃ）前記挿し木工程で挿し木された植物材料を育成する育成工程と、
    （ｅ）前記育成工程で生じた不定根の少なくとも一部を、減圧環境下において、アグロバクテリウム・リゾゲネスを含む溶液に浸漬する浸漬工程と、
    （ｆ）前記浸漬工程で浸漬された不定根を挿し木する挿し木工程と、
    （ｇ）前記挿し木工程で挿し木された不定根を育成する育成工程と、
    を含む、毛状根の製造方法。
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