CN110904148A - 一种合成紫杉二烯的植物表达载体、菌株dzggppsts和盾叶薯蓣及其制备方法 - Google Patents

一种合成紫杉二烯的植物表达载体、菌株dzggppsts和盾叶薯蓣及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种合成紫杉二烯的植物表达载体、菌株DZGGPPSTS和盾叶薯蓣及其制备方法。该载体包含红豆杉牻牛儿基焦磷酸合酶基因GGPPS表达盒CaMV35S‑GGPPS‑Tnos以及红豆杉紫杉二烯合酶基因TS表达盒CaMV35S2‑TS‑CaMV 3'UTR。菌株DZGGPPSTS由所述载体转入根癌农杆菌中得到且保藏编号为CCTCC NO：M2019685；将所述载体通过菌株DZGGPPSTS介导整合到盾叶薯蓣基因组中并通过再生得到能合成紫杉二烯的转基因植株；本发明同时超表达GGPPS基因和超表达TS基因，以盾叶薯蓣作为受体植物，得到合成紫杉二烯能力强的转基因植株。

Description

一种合成紫杉二烯的植物表达载体、菌株DZGGPPSTS和盾叶薯 蓣及其制备方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种合成紫杉二烯的植物表达载体、菌株DZGGPPSTS和盾叶薯蓣及其制备方法。
背景技术
来源于红豆杉的紫杉醇是迄今最重要的植物抗癌药物，从上世纪九十年代以来一直是临床上治疗乳腺癌、子宫癌、肺癌和头颈癌的一线药物，对其它肿瘤的治疗还在研究中。此外，其它紫杉烷抗癌药物(如Taxotere、Abraxane)也相继被开发并在临床上应用，紫杉烷类抗肿瘤药物研究成为药物研发的热点之一。发现新紫杉烷是新药研发的关键。世界上红豆杉资源有限，共11种，我国有4种和1变种，都生长缓慢、紫杉醇和紫杉烷含量很低，一般为干重的0.01％左右，甚至更低。经过20多年的研究，红豆杉中的紫杉烷几乎被分离殆尽，发现新紫杉烷越来越难，即使有，也会因含量太低而不能进行药效学研究。开辟新的紫杉烷资源对于紫杉烷类药物研究具有重要意义。
紫杉二烯是合成紫杉醇和紫杉烷的共同前体物质，利用植物基因工程技术可以使非红豆杉属植物合成紫杉二烯，这为开辟新的紫杉烷资源带来了希望。但已报道的转基因植物中紫杉二烯含量都很低，如拟南芥为0.025mg/kg(干重)、烟草为27mg/kg(干重)、人参为16mg/kg(干重)，不利于发现和分离新紫杉烷。因此，如何培育出合成紫杉二烯能力强的转基因植物成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种合成紫杉二烯的植物表达载体、菌株DZGGPPSTS和盾叶薯蓣及其制备方法。本发明采用同时超表达GGPPS基因以促进紫杉二烯的底物GGPP合成和超表达TS基因以促进GGPP转化为紫杉二烯的策略，以盾叶薯蓣作为受体植物，所得到的转基因盾叶薯蓣植株中紫杉二烯含量大都显著高于已报道的转基因拟南芥、烟草和人参，有利于今后进一步系统分析转基因植株中的紫杉烷成份。
本发明是这样实现的：
本发明的目的之一，在于提供一种合成紫杉二烯的植物表达载体，所述载体包含红豆杉牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合酶基因GGPPS的表达盒和红豆杉紫杉二烯合酶基因TS的表达盒；
所述红豆杉牻牛儿基焦磷酸合酶基因GGPPS的表达盒为CaMV35S-GGPPS-Tnos，包括：花椰菜花叶病毒35S基因启动子序列CaMV35S，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的红豆杉牻牛儿基焦磷酸合酶基因GGPPS，和农杆菌胭脂碱合酶基因终止子序列Tnos；
所述红豆杉紫杉二烯合酶基因TS的表达盒为CaMV35S2-TS-CaMV 3'UTR包括：含重复增强子的花椰菜花叶病毒35S基因启动子序列CaMV35S2、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的红豆杉紫杉二烯合酶基因TS和花椰菜花叶病毒35S基因的3'非翻译序列CaMV 3'UTR。
具体地，所述载体为pCAMBIA-GGPPS-TS，所述载体为在植物双元载体pCAMBIA-Pnos-PNN上克隆有所述红豆杉牻牛儿基焦磷酸合酶基因GGPPS的表达盒CaMV35S-GGPPS-Tnos和所述红豆杉紫杉二烯合酶基因TS的表达盒CaMV35S2-TS-CaMV 3'UTR。
本发明的目的之二，在于提供一种培育能合成紫杉二烯的转基因盾叶薯蓣植株的菌株DZGGPPSTS，该菌株由所述的pCAMBIA-GGPPS-TS载体转入根癌农杆菌中得到，且该菌株的保藏编号为CCTCC NO：M2019685。
本发明的目的之三，在于提供一种培育能合成紫杉二烯的转基因盾叶薯蓣植株的方法，所述方法包括如下步骤：
步骤1、将所得基因工程菌菌株DZGGPPSTS转化盾叶薯蓣细胞，并获得再生植株；
步骤2、对再生植株进行鉴定，筛选出转基因植株盾叶薯蓣。
优选地，所述步骤1中所述基因工程菌菌株DZGGPPSTS转化盾叶薯蓣细胞并获得再生植株的具体步骤为：
S1、在含卡那霉素和利福平的YEP液体培养基中培养基因工程菌菌株DZGGPPSTS后，离心收集菌体，用液体培养基重新悬浮得到的菌液备用；
S2、盾叶薯蓣幼茎消毒后切成小段，接种在愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织并在愈伤组织增殖培养基上增殖；将增殖后的愈伤组织块切成薄片，浸泡在步骤S1制备得到的菌液中；
S3、将所述愈伤组织块取出吸干菌液后，转移到共培养基上培养；
S4、共培养结束后，将愈伤组织块转移到选择再生培养基上培养形成不定芽；
S5、不定芽分别继代在选择再生培养基上进行增殖，每个不定芽增殖所形成的芽构成一个无性系；
S6、将不定芽转到生根培养基上诱导生根、形成完整的转基因植株盾叶薯蓣。
所述S1中卡那霉素和利福平的浓度均为50mg/L；所述悬浮用的液体培养基包括1/2MS培养基+20g/L蔗糖+1mg/L BA+0.5mg/L NAA+200μM乙酰丁香酮。
所述S2中愈伤组织诱导培养基包括1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+2mg/L BA+1mg/L NAA；所述愈伤组织增殖培养基包括1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+1mg/L BA+0.5mg/L NAA；培养条件为温度25±1℃、光照强度15-20μmol m-2s-1、光周期16h。
所述S3中共培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+1mg/L BA+0.5mg/L NAA+200μM As；培养条件为温度25±1℃、光照强度15-20μmol m-2s-1、光周期16h。
所述S4中所述选择再生培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+3mg/L BA+0.2mg/L NAA+60mg/L Kan+100mg/L特美汀，培养条件为温度25±1℃、光照强度30-45μmolm-2s-1、光周期16h。
所述S6中生根培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+1mg/L吲哚丁酸+50mg/L特美汀，培养条件为温度25±1℃、光照强度30-45μmol m-2s-1、光周期16h。
本发明具有的有益效果是：
1、本发明首次利用同时超表达GGPPS基因以促进紫杉二烯的底物GGPP合成和超表达TS基因以促进GGPP转化为紫杉二烯的策略来培育合成紫杉二烯的转基因植物，并得到了实现该策略的一种合成紫杉二烯的植物表达载体pCAMBIA-GGPPS-TS，含CaMV35S-GGPPS-Tnos和CaMV35S2-TS-CaMV 3'UTR两个基因表达盒。
2、本发明首次利用盾叶薯蓣作为转基因受体植物，发现容易得到合成紫杉二烯能力强的转基因植株。将上述载体转入根癌农杆菌中得到菌株DZGGPPSTS，通过菌株DZGGPPSTS的介导将CaMV35S-GGPPS-Tnos和CaMV35S2-TS-CaMV 3'UTR两个基因表达盒同时转入盾叶薯蓣基因组中，通过再生得到转基因植株，所得到的转基因植株中紫杉二烯含量大都显著高于文献报道的其它转基因植物，如拟南芥、烟草、人参等。
其中，本发明的菌株的保藏日期为2019年9月3日，保藏编号为CCTCCNO.M2019685。其分类命名为根癌农杆菌DZGGPPSTS(agrobacterium tumefaciens)，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072。
附图说明
图1为本发明实施例提供的合成紫杉二烯的植物表达载体pCAMBIA-GGPPS-TS的结构示意图；
图2为本发明实施例提供的黄姜转基因植株的培育图；其中(a)盾叶薯蓣幼茎形成的愈伤组织；(b)农杆菌DZGGPPSTS感染过的盾叶薯蓣愈伤组织在选择再生培养基上形成的抗性愈伤组织；(c)抗性愈伤组织形成的不定芽；(d)抗性不定芽生根形成的完整植株；(e)转基因植株经过GUS染色后呈现蓝色；(f)非转基因盾叶薯蓣植株GUS染色后显黄白色，无蓝色；(g)转基因植株的PCR鉴定，M为DNA marker，泳道1-11为GUS染色阳性的植株(L1-L11)PCR结果，都有630bp的特异带(TS基因片段)，而非转基因植株(阴性对照，泳道12)则没有；
图3为转基因盾叶薯蓣植株合成紫杉二烯的GC-MS分析结果；其中(a)非转基因植株叶片的GC图谱；(b)转基因植株L8的叶片GC图谱，在13.35min处有一明显的峰；(c)转基因植株L8的根状茎GC图谱，在13.52min处有一明显的峰；(d)为对(b)中2号峰进行MS分析，得到m/z 272、257、229、122、121和107等紫杉二烯裂解特征碎片。
具体实施方式
实施例1表达紫杉二烯的载体pCAMBIA-GGPPS-TS的构建
根据花椰菜花叶病毒35S基因启动子序列(CaMV35S)(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)、加拿大红豆杉(Taxus canadensis)牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合酶基因GGPPS序列(Genbank accession:AF081514)(其中原序列中编码N末端98个氨基酸组成的质体信号肽序列被去掉，并补加起始密码子ATG)(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)和农杆菌胭脂碱合酶基因终止子序列(Tnos)(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)组合成一个GGPPS基因表达盒CaMV35S-GGPPS-Tnos(S1)。
(2)根据含重复增强子的花椰菜花叶病毒35S基因启动子序列(CaMV35S2)(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)、短叶红豆杉(Taxus brevifolia)紫杉二烯合酶基因TS序列(Genbank accession:U48796)(其中原序列中编码N末端60个氨基酸组成的质体信号肽序列被去掉，并补加起始密码子ATG)(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)和花椰菜花叶病毒35S基因的3'非翻译序列(CaMV 3'UTR)(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)组合成一个TS基因表达盒CaMV35S2-TS-CaMV 3'UTR(S2)。
(3)合成序列S1和S2，并将S1和S2克隆到植物双元载体pCAMBIA-Pnos-PNN上，得到载体pCAMBIA-GGPPS-TS(如图1所示)。
实施例2合成紫杉二烯的转基因盾叶薯蓣植株制备方法
1、用冻融法将实施例1制备得到的载体pCAMBIA-GGPPS-TS转入根癌农杆菌EHA105中，得到基因工程菌菌株DZGGPPSTS。该菌株保存在中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M2019685。
2、取盾叶薯蓣幼茎，用自来水清洗，在含～1％有效氯浓度的次氯酸钠溶液中消毒15min，再用无菌水漂洗3次后，切成小段，接种在1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+2mg/LBA+1mg/L NAA上诱导愈伤组织(图2a)，愈伤组织形成后，切成小块，在1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+1mg/L BA+0.5mg/L NAA上增殖。培养条件为温度25±1℃、光照强度30-45μmol m-2s-1、光周期16h。
3、挑基因工程菌DZGGPPSTS单菌落在2ml含50mg/L卡那霉素(Kan)和50mg/L利福平(Rif)的YEP液体培养基中培养至浑浊，再取1ml菌液于50ml所述YEP液体培养基中培养至OD600值达到0.8左右。培养条件为28℃，200rpm。
4、离心收集菌体，用液体1/2MS+20g/L蔗糖+1mg/L BA+0.5mg/L NAA+200μM乙酰丁香酮(As)培养基重新悬浮，备用。
5、将盾叶薯蓣愈伤组织切成薄片(约1.5mm厚)，在上述菌液中浸泡大约20-30min。
6、将愈伤组织块取出，放在无菌吸水纸上吸干菌液后，转移到共培养基上培养3天。共培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+1mg/L BA+0.5mg/L NAA+200μM As。培养条件为温度25±1℃、光照强度15-20μmol m-2s-1、光周期16h。
7、共培养结束后，将愈伤组织块转移到选择再生培养基上，每3周更换一次培养基。在选择再生培养基上，4-5周后部分愈伤组织形成抗性愈伤组织(图2b)，7-8周后形成不定芽(图2c)。选择再生培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+3mg/L BA+0.2mg/LNAA+60mg/L Kan+100mg/L特美汀(timentin)，培养条件为温度25±1℃、光照强度30-45μmol m-2s-1、光周期16h。
8、不定芽形成后，将各不定芽编号，分别继代在选择再生培养基上进行增殖，每个不定芽增殖所形成的芽构成一个无性系。
9、将不定芽转到生根培养基上诱导生根、形成完整植株(图2d)。生根培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+1mg/L吲哚丁酸(IBA)+50mg/L特美汀，培养条件为温度25±1℃、光照强度30-45μmol m-2s-1、光周期16h。
10、在每个无性系的生根植株中，取2-3株进行GUS染色，显蓝色的植物为转基因植株(图2e)，非转基因植株GUS染色后为黄白色，无蓝色(图2f)。
11、在GUS染色阳性的无性系中再取1-2株植株，用试剂盒提取其基因组DNA，进一步用PCR方法确认它们是否为转基因植株。同时也提取非转基因植株的基因组DNA。以基因组DNA为模板，用短叶红豆杉紫杉二烯合酶基因TS的特异引物TSPCR-F(5′-ctggcactagcaaggtggtttc-3′)和TSPCR-R(5′-cagaaacatctgtaagcctggc-3′)进行PCR反应，通过电泳检测扩增产物，有630bp特异片段的为转基因植株(图2g)。
12、转基因植株炼苗后移栽到温室的花盆中，2个月后移置室外，秋季收获地下根状茎。次年春季将转基因和非转基因的根状茎种于室外的试验地中，常规栽培管理，于秋季收集叶片和根状茎，60℃烘干，分别研磨成粉末。
实施例3转基因盾叶薯蓣植株合成紫杉二烯的检测分析
1、按有关文献报道的方法提取转基因和非转基因植株的叶片和根状茎样品，并用气相色谱-质谱(GC-MS)联用仪进行分析。图3为转基因盾叶薯蓣植株合成紫杉二烯的GC-MS分析结果；(a)非转基因植株叶片的GC图谱；(b)转基因植株L8的叶片GC图谱，在13.35min处有一明显的峰；(c)转基因植株L8的根状茎GC图谱，在13.52min处有一明显的峰；(d)对(b)中2号峰进行MS分析，得到m/z 272、257、229、122、121和107等紫杉二烯裂解特征碎片。图3的分析结果证明本发明的转基因植株可以合成紫杉二烯。
2、不同转基因盾叶薯蓣植株叶和根状茎中紫杉二烯含量如表1所示。
表1-不同转基因盾叶薯蓣植株叶和根状茎中紫杉二烯含量
Figure BDA0002278570570000081
由表1可知，不同各转基因植株间合成能力存在较大差异(表1)，通过选择可以获得合成紫杉二烯能力强的植株，如L8，叶片中紫杉二烯含量达到145mg/kg(干重)。
本发明证明，采用同时超表达GGPPS基因以促进紫杉二烯的底物GGPP合成和超表达TS基因以促进GGPP转化为紫杉二烯的策略，以合成IPP和DAMPP能力强的盾叶薯蓣作为受体植物，容易得到合成紫杉二烯能力强的转基因植株，有利于今后进一步系统分析转基因植株中的其它紫杉烷成份。
所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不限制本发明，凡在本发明之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 一种合成紫杉二烯的植物表达载体、菌株DZGGPPSTS和盾叶薯蓣及其制备方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 537
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcacgacaca cttgtctact ccaaaaatat caaagataca gtctcagaag accaaagggc 180
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ttgcgataaa ggaaaggcca tcgttgaaga tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg 360
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg 60
attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg 120
acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg 180
atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg 240
ttactagatc ggg 253
<210> 4
<211> 807
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgtattggc tagagcagct tgccaacatg gtggagcacg acactctcgt ctactccaag 60
aatatcaaag atacagtctc agaagaccaa agggctattg agacttttca acaaagggta 120
atatcgggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcacttcat caaaaggaca 180
gtagaaaagg aaggtggcac ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggctatcgtt 240
caagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg 300
gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg 360
gagcacgaca ctctcgtcta ctccaagaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg 420
gctattgaga cttttcaaca aagggtaata tcgggaaacc tcctcggatt ccattgccca 480
gctatctgtc acttcatcaa aaggacagta gaaaaggaag gtggcaccta caaatgccat 540
cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat 600
ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag 660
caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct 720
tcgcaagacc ttcctctata taaggaagtt catttcattt ggagaggaca cgctgaaatc 780
accagtctct ctctacaaat ctatctc 807
<210> 5
<211> 2409
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgagcagca gcactggcac tagcaaggtg gtttccgaga cttccagtac cattgtggat 60
gatatccctc gactctccgc caattatcat ggcgatctgt ggcaccacaa tgttatacaa 120
actctggaga caccgtttcg tgagagttct acttaccaag aacgggcaga tgagctggtt 180
gtgaaaatta aagatatgtt caatgcgctc ggagacggag atatcagtcc gtctgcatac 240
gacactgcgt gggtggcgag gctggcgacc atttcctctg atggatctga gaagccacgg 300
tttcctcagg ccctcaactg ggttttcaac aaccagctcc aggatggatc gtggggtatc 360
gaatcgcact ttagtttatg cgatcgattg cttaacacga ccaattctgt tatcgccctc 420
tcggtttgga aaacagggca cagccaagta caacaaggtg ctgagtttat tgcagagaat 480
ctaagattac tcaatgagga agatgagttg tccccggatt tccaaataat ctttcctgct 540
ctgctgcaaa aggcaaaagc gttggggatc aatcttcctt acgatcttcc atttatcaaa 600
tatttgtcga caacacggga agccaggctt acagatgttt ctgcggcagc agacaatatt 660
ccagccaaca tgttgaatgc gttggaaggt ctcgaggaag ttattgactg gaacaagatt 720
atgaggtttc aaagtaaaga tggatctttc ctgagctccc ctgcctccac tgcctgtgta 780
ctgatgaata caggggacga aaaatgtttc acttttctca acaatctgct cgacaaattc 840
ggcggctgcg tgccctgtat gtattccatc gatctgctgg aacgcctttc gctggttgat 900
aacattgagc atctcggaat cggtcgccat ttcaaacaag aaatcaaagg agctcttgat 960
tatgtctaca gacattggag tgaaaggggc atcggttggg gcagagacag ccttgttcca 1020
gatctcaaca ccacagccct cggcctgcga actcttcgca tgcacggata caatgtttct 1080
tcagacgttt tgaataattt caaagatgaa aacgggcggt tcttctcctc tgcgggccaa 1140
acccatgtcg aattgagaag cgtggtgaat cttttcagag cttccgacct tgcatttcct 1200
gacgaaagag ctatggacga tgctagaaaa tttgcagaac catatcttag agaggcactt 1260
gcaacgaaaa tctcaaccaa tacaaaacta ttcaaagaga ttgagtacgt ggtggagtac 1320
ccttggcaca tgagtatccc acgcttagaa gccagaagtt atattgattc atatgacgac 1380
aattatgtat ggcagaggaa gactctatat agaatgccat ctttgagtaa ttcaaaatgt 1440
ttagaattgg caaaattgga cttcaatatc gtacaatctt tgcatcaaga ggagttgaag 1500
cttctaacaa gatggtggaa ggaatccggc atggcagata taaatttcac tcgacaccga 1560
gtggcggagg tttatttttc atcagctaca tttgaacccg aatattctgc cactagaatt 1620
gccttcacaa aaattggttg tttacaagtc ctttttgatg atatggctga catctttgca 1680
acactagatg aattgaaaag tttcactgag ggagtaaaga gatgggatac atctttgcta 1740
catgagattc cagagtgtat gcaaacttgc tttaaagttt ggttcaaatt aatggaagaa 1800
gtaaataatg atgtggttaa ggtacaagga cgtgacatgc tcgctcacat aagaaaaccc 1860
tgggagttgt acttcaattg ttatgtacaa gaaagggagt ggcttgaagc cgggtatata 1920
ccaacttttg aagagtactt aaagacttat gctatatcag taggccttgg accgtgtacc 1980
ctacaaccaa tactactaat gggtgagctt gtgaaagatg atgttgttga gaaagtgcac 2040
tatccctcaa atatgtttga gcttgtatcc ttgagctggc gactaacaaa cgacaccaaa 2100
acatatcagg ctgaaaaggc tcgaggacaa caagcctcag gcatagcatg ctatatgaag 2160
gataatccag gagcaactga ggaagatgcc attaagcaca tatgtcgtgt tgttgatcgg 2220
gccttgaaag aagcaagctt tgaatatttc aaaccatcca atgatatccc aatgggttgc 2280
aagtccttta tttttaacct tagattgtgt gtccaaatct tttacaagtt tatagatggg 2340
tacggaatcg ccaatgagga gattaaggac tatataagaa aagtttatat tgatccaatt 2400
caagtatga 2409
<210> 6
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtcgatcgac aagctcgagt ttctccataa taatgtgtga gtagttccca gataagggaa 60
ttagggttcc tatagggttt cgctcatgtg ttgagcatat aagaaaccct tagtatgtat 120
ttgtatttgt aaaatacttc tatcaataaa atttctaatt cctaaaacca aaatccagta 180
ctaaaatcca gatcccccga atta 204

Claims (10)

1.一种合成紫杉二烯的植物表达载体，其特征在于，所述载体包含红豆杉牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合酶基因GGPPS的表达盒和红豆杉紫杉二烯合酶基因TS的表达盒；
所述红豆杉牻牛儿基焦磷酸合酶基因GGPPS的表达盒为CaMV35S-GGPPS-Tnos，包括：花椰菜花叶病毒35S基因启动子序列CaMV35S、核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的红豆杉牻牛儿基焦磷酸合酶基因GGPPS和农杆菌胭脂碱合酶基因终止子序列Tnos；
所述红豆杉紫杉二烯合酶基因TS的表达盒为CaMV35S2-TS-CaMV 3'UTR包括：含重复增强子的花椰菜花叶病毒35S基因启动子序列CaMV35S2、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的红豆杉紫杉二烯合酶基因TS和花椰菜花叶病毒35S基因的3'非翻译序列CaMV 3'UTR。
2.如权利要求1所述的一种合成紫杉二烯的植物表达载体，其特征在于，所述载体为pCAMBIA-GGPPS-TS，为在植物双元载体pCAMBIA-Pnos-PNN上克隆有所述红豆杉牻牛儿基焦磷酸合酶基因GGPPS的表达盒CaMV35S-GGPPS-Tnos和所述红豆杉紫杉二烯合酶基因TS的表达盒CaMV35S2-TS-CaMV 3'UTR。
3.一种菌株DZGGPPSTS，其特征在于，该菌株由权利要求2所述的pCAMBIA-GGPPS-TS载体转入根癌农杆菌中得到，且该菌株的保藏编号为CCTCC NO：M2019685。
4.一种合成紫杉二烯的转基因盾叶薯蓣植株，其特征在于，将权利要求1-2所述的红豆杉牻牛儿基焦磷酸合酶基因GGPPS的表达盒CaMV35S-GGPPS-Tnos和所述红豆杉紫杉二烯合酶基因TS的表达盒CaMV35S2-TS-CaMV 3'UTR同时整合到盾叶薯蓣基因组中。
5.一种权利要求4所述的表达紫杉二烯的转基因盾叶薯蓣植株的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1、将权利要求3所得基因工程菌菌株DZGGPPSTS转化盾叶薯蓣细胞，并通过植物组织培养技术获得再生植株；
步骤2、对再生植株进行鉴定，筛选出转基因盾叶薯蓣植株。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中所述基因工程菌菌株DZGGPPSTS转化盾叶薯蓣细胞和获得再生植株的具体步骤为：
S1、在含卡那霉素和利福平的YEP液体培养基中培养基因工程菌菌株DZGGPPSTS后，离心收集菌体，用液体培养基重新悬浮得到的菌液备用；
S2、盾叶薯蓣幼茎消毒后切成小段，接种在愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织并在愈伤组织增殖培养基上进行增殖；将增殖后的愈伤组织块切成薄片，浸泡在步骤S1制备得到的菌液中；
S3、将所述愈伤组织块取出吸干菌液后，转移到共培养基上培养；
S4、共培养结束后，将愈伤组织块转移到选择再生培养基上培养诱导不定芽；
S5、不定芽分别继代在选择再生培养基上进行增殖，每个不定芽增殖所形成的芽构成一个无性系；
S6、将不定芽转到生根培养基上诱导生根、形成完整的转基因植株。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述S1中卡那霉素和利福平的浓度均为50mg/L；所述悬浮用的液体培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+1mg/L BA+0.5mg/L NAA+200μM乙酰丁香酮。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述S2中愈伤组织诱导培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+2mg/L BA+1mg/L NAA；所述愈伤组织增殖培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+1mg/L BA+0.5mg/L NAA；培养条件为温度25±1℃、光照强度30-45μmol m-2s-1、光周期16h。
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述S3中共培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+1mg/L BA+0.5mg/L NAA+200μM As；培养条件为温度25±1℃、光照强度15-20μmol m-2s-1、光周期16h。
10.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述S4中所述选择再生培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+3mg/L BA+0.2mg/L NAA+60mg/L Kan+100mg/L特美汀，培养条件为温度25±1℃、光照强度30-45μmol m-2s-1、光周期16h；
所述S6中生根培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+1mg/L吲哚丁酸+50mg/L特美汀，培养条件为温度25±1℃、光照强度30-45μmol m-2s-1、光周期16h。
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