CN103571835A - 一种生产紫杉二烯的系统和微生物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产紫杉二烯的系统和微生物及其应用，属于合成生物学领域。生产紫杉二烯的系统包含甲羟戊酸途径和紫杉二烯合成相关基因或其功能等同体。甲羟戊酸途径的相关基因为来源于大肠杆菌BL21的atoB、idi和来源于酿酒酵母INVSC1的erg13、thmg1、erg12、erg8、mvd1；紫杉二烯合成的相关基因ggpps和ts基因核苷酸序列如SEQIDNO.1和2所示。生产紫杉二烯的微生物为含有生产紫杉二烯的系统的微生物，通过将该系统转化到微生物中得到生产紫杉二烯的微生物。本发明构建的微生物能稳定产生紫杉二烯的培养物，为后续进一步利用微生物产生紫杉醇奠定了基础，具有广阔的应用前景。

Description

一种生产紫杉二烯的系统和微生物及其应用

技术领域

本发明属于合成生物学领域，涉及一种生产紫杉二烯的系统和微生物及其应用。

背景技术

1963年美国科学家首次从一种太平洋杉树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物，并发现其对鼠肿瘤细胞有很高活性。后来通过Ⅱ-Ⅲ期临床研究发现，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效，是现在最有潜能且商业应用最为成熟的一种抗癌药。现今获得紫杉醇的方法主要有三种：（1）最传统的从天然植物树皮中提取，（2）从植物叶片等组织中提取中间产物巴卡亭III等，随后通过化学合成生产紫杉醇，（3）利用植物组织培养后提取紫杉醇。这三种都是依赖于植物源的方式获得产物，因而价格一直很高，而且随着逐年的砍伐，可利用的红豆杉等植物已经越来越少，这很大程度的限制了利用该药物去治疗更多患者。

自从1993年，首次报道从太平洋红豆杉树木中分离到一株能独立生物合成产生紫杉醇的内生真菌以来，国内外就有大量的文献专注于解决紫杉醇的生物合成以及相关的紫杉烷类化合物这一问题。同时，另外一些科研工作者致力于阐明紫杉醇的合成途径，但目前仍有至少五步反应的功能基因还未克隆出来，在这些酶中，研究者一致认为催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成紫杉二烯的紫杉二烯合酶（Taxadiene synthase，TS）是合成紫杉二烯的第一个决定性步骤。

紫杉醇属于异戊二烯类超家族化合物，至今已报道有超过30000种被鉴定为异戊二烯类。而异戊二烯类超家族化合物都来源于相同的两个中间产物：异戊烯焦磷酸（IPP，isopentenyldiphosphate）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP，dimethylallyl diphosphate）。自然界中存在两个异戊二烯合成途径来提供IPP和DMAPP这两种通用的萜类化合物前体：（1）甲羟戊酸途径（MVA途径），主要存在于高等真核生物（动物，植物线粒体，真菌和酵母等）和部分细菌中，（2）非甲羟戊酸途径（DXP或MEP途径），主要存在于植物质体、原生生物和大多数细菌中，而链霉菌、部分植物等同时含有MVA和MEP途径。近年来，利用改造微生物內源的MEP或MVA途径，或者导入改造的外源MEP或MVA途径生产萜类化合物引起了人们的广泛兴趣。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种生产紫杉二烯的系统。

本发明的另一目的在于提供一种生产紫杉二烯的微生物。

本发明的另一目的在于提供上述生产紫杉二烯的系统或微生物的应用。

本发明的再一目的还在于提供一种提高生产紫杉二烯能力的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种生产紫杉二烯的系统，包含甲羟戊酸途径和紫杉二烯合成相关基因或其功能等同体（同功能基因）中的一种或多种。所述的甲羟戊酸途径的相关基因包括（1）将乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A的基因atoB或其功能等同体、（2）将乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A缩合为HMG-CoA的基因erg13或其功能等同体、（3）将HMG-CoA还原为甲羟戊酸的基因thmg1或其功能等同体、（4）将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的基因erg12或其功能等同体、（5）将甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化为甲羟戊酸-5-焦磷酸的基因erg8或其功能等同体、（6）将甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧生成异戊烯焦磷酸的基因mvd1或其功能等同体和（7）将异戊烯焦磷酸异构为二甲基烯丙基焦磷酸的基因idi或其功能等同体；所述的紫杉二烯合成的相关基因包括（8）将异戊二烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸缩合为牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸的基因牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶ggpps基因或其功能等同体和（9）将牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸环化为紫杉二烯的紫杉二烯合酶ts基因或其功能等同体。

优选的，所述的甲羟戊酸途径相关基因或其功能共同体和紫杉二烯合成相关基因或其功能共同体被设置在同一个载体或相互不同的载体上。由此，可以进一步提高采用该系统转化微生物的效率。

所述的甲羟戊酸途径的相关基因优选为来源于大肠杆菌BL21（DE3）的atoB（CP001509.3:2216470-2217654）、idi（CP001509.3:2863926-2864474）和来源于酿酒酵母INVSC1的erg13（329138949:19060-20535）、thmg1（329138949:115734-117239）、erg12（329138949:684467-685798）、erg8（329138949:712316-713671）、mvd1（329138953:701895-703085）。

所述的紫杉二烯合成的相关基因优选为来源于Taxus canadensis（加拿大红豆杉）经过密码子优化的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶ggpps基因（序列如SEQ ID NO.1所示）和来源于Taxus brevifolia（短叶红豆杉）经过密码子优化的紫杉二烯合酶ts基因（序列如SEQ ID NO.2所示）。

一种生产紫杉二烯的微生物为含有上述生产紫杉二烯的系统的微生物。通过将生产紫杉二烯的系统转化到微生物中得到生产紫杉二烯的微生物，通过表达该微生物的基因组中所包含的外源基因，可以使该微生物过表达甲羟戊酸途径或牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶或紫杉二烯合酶的至少一种。

优选的，所述的生产紫杉二烯的微生物为将甲羟戊酸途径相关基因或其功能共同体和紫杉二烯合成相关基因或其功能共同体中的一种或多种整合到微生物基因组中。

所述的微生物为选自真核微生物、原核微生物和病毒的至少一种。

优选的，所述的微生物为选自细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母的至少一种。

优选的，所述的微生物为丝状真菌。

优选的，所述的微生物为酵母。

优选的，所述微生物为大肠杆菌。

优选的，所述微生物为芽孢杆菌。

优选的，所述微生物为链霉菌。

优选的，所述微生物不含內源的甲羟戊酸途径。

更优选的，所述微生物含有內源的甲羟戊酸途径。

优选的，所述的生产紫杉二烯的微生物为含有质粒pMH1、质粒pFZ81和质粒pXC02的大肠杆菌；所述的质粒pMH1启动子为lac启动子，复制子为p15A复制子，包含atoB、erg13和thmg1基因，pMH1的序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.3所示；所述的质粒pFZ81启动子为lac启动子，复制子为pBBR1MCS复制子，包含erg12、erg8、mvd1和idi基因，pFZ81的序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.4所示；所述的质粒pXC02启动子为T7强启动子，复制子为pSC101低拷贝复制子，包含ggpps和ts基因，pXC02的序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.5所示。

更优选的，所述的生产紫杉二烯的微生物为含有质粒pMH1、质粒pFZ81和质粒pFZ131的大肠杆菌；所述的质粒pFZ131包含与pXC02相同的ggpps和ts基因，启动子为T7强启动子，只是复制子为pBBR322高拷贝复制子。

上述生产紫杉二烯的系统或微生物在生产紫杉二烯中的应用。

一种提高生产紫杉二烯能力的方法为增加上述系统中任一基因或其功能等同体的表达。

合成生物学与代谢工程等的发展使得在目标微生物中表达外源基因成为可能，通过选择合适的表达元件能很好的完成外源基因在选定微生物中的表达与功能重建。本发明以大肠杆菌这一不含甲羟戊酸途径的微生物为例，通过导入甲羟戊酸途径相关基因或功能共同体、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶与紫杉二烯合酶成功的在大肠杆菌体内合成了紫杉二烯。这表明即使微生物不含甲羟戊酸途径亦可利用外源导入的甲羟戊酸途径来用于合成紫杉二烯等萜类化合物，这类微生物可以是大肠杆菌，芽孢杆菌等含有MEP途径的微生物。相对于不含甲羟戊酸途径的微生物，对酵母，丝状真菌和链霉菌等含有內源甲羟戊酸途径的微生物进行甲羟戊酸途径的改造则更为便捷，可通过表达部分或者全部相关基因亦或是全部外源的相关基因以达到改造甲羟戊酸途径的目的，因此本发明所建立的甲羟戊酸途径改造与对牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶及紫杉二烯合酶的改造完全可以通过选用合适的表达元件在其他微生物中进行重现。目前还无法利用常用微生物直接生产紫杉醇，而利用微生物生产紫杉二烯这一重要的紫杉醇合成中间产物能为今后微生物生产紫杉醇提供一定的指导。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明利用外源的甲羟戊酸途径获得了稳定生产紫杉二烯的大肠杆菌。本发明构建的微生物能稳定产生紫杉二烯的培养物，为后续进一步利用微生物生产紫杉醇奠定了基础，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是甲羟戊酸途径示意图。

图2是紫杉二烯合成途径示意图。

图3是质粒pMH1示意图。

图4是质粒pFZ81示意图。

图5是质粒pFZ131示意图。

图6是质粒pXC02示意图。

图7是T2菌株摇瓶发酵产物GC-MS分析结果图。

图8是T2与T4菌株生产紫杉二烯的GC-MS分析结果比较。

图9是紫杉二烯定量标准曲线；其中，A是紫杉二烯的标准曲线，Y=-31766.7+5576.48*X，R∧2=0.9911，W:Equal；B是内标物的标准曲线，Y=-11808.6+11273.7*X，R∧2=0.9977，W:Equal。

图10是T4菌株紫杉二烯发酵结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

通过从大肠杆菌和酿酒酵母基因组DNA中扩增相应基因构建了用于大肠杆菌表达的甲羟戊酸途径和紫杉二烯合成途径，并实现了重组大肠杆菌T2和T4稳定生产紫杉二烯，相关反应途径见图1和图2。

实施例中所用到的引物如表1所示：

表1引物列表

实施例1甲羟戊酸途径质粒构建

用Qiagen公司的Blood and Cell Culture DNA Mini Kit纯化获得大肠杆菌BL21(DE3)基因组DNA和酿酒酵母INVSC1基因组DNA。

质粒pMH1含有甲羟戊酸途径前三个基因：来源于大肠杆菌BL21(DE3)的atoB基因（乙酰乙酰辅酶A硫酯酶），来源于酿酒酵母INVSC1的erg13（HMG-CoA合酶，3-羟甲基-戊二酸单酰辅酶A合酶）和thmg1（HMG-CoA还原酶，3-羟甲基-戊二酸单酰辅酶A还原酶，删除了HMG1的跨膜区域）。质粒pFZ81含有甲羟戊酸途径后四个基因：来源于酿酒酵母INVSC1的erg12（甲羟戊酸激酶），erg8（甲羟戊酸-5-磷酸激酶）和mvd1（甲羟戊酸-5-焦磷酸激酶），来源于大肠杆菌BL21(DE3)的idi（异戊烯焦磷酸异构酶）基因。所有基因均通过PCR扩增获得，所用引物见表1。

具体构建方法如下：

（1）质粒pMH1的构建

首先利用simple cloning方法（You,C.,et al.,2012.Simple Cloning via Direct Transformationof PCR Product DNA Multimer to Escherichia coli and Bacillus subtilis.Applied andenvironmental microbiology.78,1593-1595.），将pBBR1MCS质粒的复制子替换为来源于pMSD15质粒的p15A复制子。以质粒pBBR1MCS为模板用引物pBBR1MCS1-p15A-f和pBBR1MCS1-p15A-r进行扩增获得pBBR1MCS片段，同时p15A复制子用引物p15A-f和p15A-r扩增（引物序列见表1）获得p15A片段，经PCR产物纯化后用Nanodrop测定DNA浓度，然后将20ng PCR扩增的p15A片段和等摩尔的pBBR1MCS片段混合，经过一轮PCR扩增，扩增条件为：98℃，2min预变性，然后30个PCR循环98℃，20s；60℃，20s；72℃，6min，最后72℃充分延伸10min。随后转化大肠杆菌XL1-blue获得质粒pBBR1MCS/p15A。

用引物pBBR1MCS1-f和pBBR1MCS1-r以pBBR1MCS/p15A为模板扩增pMH1质粒骨架，同时用AtoB-f，AtoB-r；ERG13-f，ERG13-r；tHMG1-f，tHMG1-r为引物扩增相应基因。经PCR产物纯化之后，取50ng pMH1质粒骨架和等摩尔的各基因扩增产物混合，并用去离子水调整体积到5μL，随后加入至15μL的Gibson缓冲液（Gibson,D.G.,2011.Enzymaticassembly of overlapping DNA fragments.Methods Enzymol.498,349-361.）中混匀，50℃反应1h后转化大肠杆菌XL1-blue，挑取克隆，并将阳性克隆测序获得质粒pMH1，该质粒示意图如图3所示，序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.3所示。该质粒控制基因表达的为中等强度的lac启动子，质粒复制子为p15A复制子。

（2）质粒pFZ81的构建

用引物pBBR1MCS2-f和pBBR1MCS2-r以pBBR1MCS-2为模板扩增pFZ81质粒骨架，同时用ERG12-f，ERG12-r；ERG8-f，ERG8-r；MVD1-f，MVD1-r；Idi-f，Idi-r为引物扩增相应基因。经PCR产物纯化之后，取50ng pFZ81质粒骨架和等摩尔的各基因扩增产物混合，并用去离子水调整体积到5μL，随后加入至15μL的Gibson缓冲液中混匀，50℃反应1h后转化大肠杆菌XL1-blue，挑取克隆，并将阳性克隆测序获得质粒pFZ81，该质粒示意图如图4所示，序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.4所示。该质粒控制基因表达的为中等强度的lac启动子，质粒复制子为pBBR1MCS复制子。

实施例2紫杉二烯产生代谢途径质粒构建

将来源于Taxus canadensis经过密码子优化的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶ggpps基因（序列如SEQ ID NO.1所示）和来源于Taxus brevifolia经过密码子优化的紫杉二烯合酶ts基因进行基因合成（序列如SEQ ID NO.2所示），随后分别用引物GS-duet-f，GS-duet-r和TS-duet-f，TS-duet-r扩增，同时载体pETduet-1用duet-TG-f，duet-TG-r进行扩增，在用Gibson方法将三个片段连接到一起，获得质粒pFZ131（图5）。质粒pFZ131的复制子经过simplecloning方法替换为pSC01复制子，具体操作如下：质粒pFZ131用引物duet-pSC101-f，duet-pSC101-r扩增，用pSC101-f，pSC101-r引物以pSC101质粒为模板扩增pSC101复制子，再将两个片段连起来获得质粒pXC02，该质粒所用引物见表1，质粒示意图如图6所示，序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.5所示。

实施例3紫杉二烯生产菌株的构建

将甲羟戊酸途径的两个质粒pMH1和pFZ81同时转入大肠杆菌BL21(DE3)中获得BL21(DE3)/pMH1/pFZ81，随后将pXC02转化进入BL21(DE3)/pMH1/pFZ81中，获得紫杉二烯生产菌株T2。将pFZ131转化进入BL21(DE3)/pMH1/pFZ81中，获得紫杉二烯生产菌株T4。

实施例4T2与T4菌株摇瓶发酵生产紫杉二烯

挑取十个T2或者T4菌株的单菌落到含2%（V/V）甘油的LB培养基中（同时含有100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素），于30℃，220rpm过夜培养，随后按1%（V/V）接种量接种到新鲜的同一培养基中30℃，220rpm继续培养至OD₆₀₀约为0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导表达，加入诱导剂3小时后，加入1/5培养基体积的正癸烷进行双相发酵。诱导表达后根据设定的时间点进行取样，每次取样为正癸烷相1mL，培养基5mL，正癸烷相8000g离心3min后收集上清进行GC-MS分析。

GC-MS分析条件为：

GC-MS为安捷伦7890A气相色谱配备5975MS，气相色谱柱为HP-5柱（30m*0.32mm*25μm），每次分析进样1μL，GC条件为50℃维持1分钟，10℃/分钟的速率升温到220℃，再在220℃维持10分钟。结果如图7所示，与Ajikumar等人报道GC-MS谱图对比（Ajikumar,P.K.,et al.,2010.Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction inEscherichia coli.Science.330,70-74.），表明T2和T4菌株能产生紫杉二烯。并且T4生产紫杉二烯的能力明显高于T2菌株（图8）

结论：本发明中构建的T2和T4菌株为一种可产生异戊二烯焦磷酸（IPP）和二甲烯丙基焦磷酸（DMAPP）的微生物，并能够将IPP，DMAPP转化为牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate），再继续将牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸转化为紫杉二烯（taxadiene）的微生物。pFZ131与pXC02相比，采用更高拷贝的pBBR322复制子，其产量高于低拷贝表达的pXC02，这表明为了得到较高紫杉二烯产量需要增加GGPPS和TS的表达量。

实施例5紫杉二烯的GC-MS定量方法

首先将紫杉二烯溶于正己烷中，配成1g/L的溶液，向正己烷中加入内标物β-石竹烯（β-caryophyllene）使内标物的浓度也为1g/L，再用正己烷进行逐级稀释，配成一系列浓度分别为500ppm、200ppm、100ppm、10ppm的溶液。将溶液转入有内置管的样品瓶中，进行进行GC-MS(气相色谱-质谱联用仪）检测。使用柱子为HP-5MS，离子源为CI源，氦气流速1mL/min，进样量1μL，程序升温程序为：100℃1min，以10℃/min升温至220℃保持8min。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作紫杉二烯（图9A）和内标物（图9B）的标准曲线，根据同浓度时峰面积之比计算出紫杉二烯对于内标物的相对响应因子Rf。最后使用内标法对T4菌株发酵产物中的紫杉二烯进行定量，获得的最高产量为1.84mg/L（图10）。

计算得相对响应因子公式为Rf=（A1/C1）/（A_IS/C_IS）=0.4776

其中A1：紫杉二烯峰面积；A_IS：内标物峰面积；C1：紫杉二烯浓度；C_IS：内标物浓度。

待测样品中紫杉二烯含量的计算公式：C=（A*C_IS）/（A_IS*Rf）

其中A：待测样品紫杉二烯峰面积；A_IS：内标物峰面积；C：待测样品中紫杉二烯含量；C_IS：内标物浓度。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  武汉大学

<120>  一种生产紫杉二烯的系统和微生物及其应用

<130>  1

<160>  37   

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  919

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  经过密码子优化的GGPPS序列

<400>  1

gtcgacagaa ggagatatac atatgtttga tttcaatgaa tatatgaaaa gtaaggctgt       60

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tcgtcagaac tgagcatgc                                                   919

 

<210>  2

<211>  2421

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  经过密码子优化的TS序列

<400>  2

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<210>  3

<211>  4515

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  pMH1序列（不含骨架载体序列）

<400>  3

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tctttcatca atgttataca gttggaactt tcaacatttt gtgcaggatc ttgtcctaat      480

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<210>  4

<211>  4667

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  pFZ81序列（不含骨架载体序列）

<400>  4

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ttcccccaat acttaagggt tgcgatgttg acgggtgcgg taacggatgc tgtgtaaacg     1860

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gtttgtacgg gaggttcgat atcggcacca gattctttag ttatttttct aaaggaacgt     2160

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tcattcctct caagagactc aaatatctga tcgctgtaat cgtcatgagt ctcgtgtaag     2280

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cataggcaaa caaacatata caggaaacaa aacgctgcat ggtagtggaa ggattcggat     4260

agttgagcta acaacggatc caaaagacta acgagttcct gagacaagcc atcggtggct     4320

tgttgagcct tggccaattt ttgggagttt acttgatcct cggtgatggc attgaaatca     4380

ttgatggacc acttatgatt aaagctaatg tccgggaagt ccaattcaat agtatctggt     4440

gcagatgact cgcttattag caggtaggtt ctcaacgcag acacactagc agcgacggca     4500

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<210>  5

<211>  3315

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  pXC02序列（不含骨架载体序列）

<400>  5

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tgggaactct atttcaattg ctatgtgcag gagcgtgaat ggttagaagc gggctacatt     1920

cctaccttcg aagagtactt aaaaacctat gccatttccg tcggtttagg cccgtgcact     1980

ctgcagccta tcttgctgat gggtgagctg gtaaaggatg atgtggtgga aaaagttcac     2040

tacccgtcga atatgtttga actggtaagt ctgagttggc gtctgacaaa cgacaccaaa     2100

acgtaccagg cagaaaaggc acgtgggcaa caggcaagcg gtatcgcgtg ttatatgaag     2160

gataatccgg gcgctactga ggaagatgcc attaagcata tctgccgtgt tgtggatcgc     2220

gctcttaaag aagcgtcatt cgaatatttt aaacctagta atgatattcc gatgggttgt     2280

aagtcattca ttttcaatct tcgcctgtgc gtgcaaattt tttacaaatt tattgacggc     2340

tacggaatcg ccaacgaaga aatcaaagac tatattcgta aagtttacat cgatccaatc     2400

caggtctaag aaggagatat acatatgttt gatttcaatg aatatatgaa aagtaaggct     2460

gttgcggtag acgcggctct ggataaagcg attccgctgg aatatcccga gaagattcac     2520

gaatcgatgc gctactccct gttagcagga gggaaacgcg ttcgtccggc attatgcatc     2580

gcggcctgtg aactcgtcgg cggttcacag gacttagcaa tgccaactgc ttgcgcaatg     2640

gaaatgattc acacaatgag cctgattcat gatgatttgc cttgcatgga caacgatgac     2700

tttcggcgcg gtaaacctac taatcataag gtttttggcg aagatactgc agtgctggcg     2760

ggcgatgcgc tgctgtcgtt tgccttcgaa catatcgccg tcgcgacctc gaaaaccgtc     2820

ccgtcggacc gtacgcttcg cgtgatttcc gagctgggaa agaccatcgg ctctcaagga     2880

ctcgtgggtg gtcaggtagt tgatatcacg tctgagggtg acgcgaacgt ggacctgaaa     2940

accctggagt ggatccatat tcacaaaacg gccgtgctgc tggaatgtag cgtggtgtca     3000

ggggggatct tggggggcgc cacggaggat gaaatcgcgc gtattcgtcg ttatgcccgc     3060

tgtgttggac tgttatttca ggtggtggat gacatcctgg atgtcacaaa atccagcgaa     3120

gagcttggca agaccgcggg caaagacctt ctgacggata aggctacata cccgaaattg     3180

atgggcttgg agaaagccaa ggagttcgca gctgaacttg ccacgcgggc gaaggaagaa     3240

ctctcttctt tcgatcaaat caaagccgcg ccactgctgg gcctcgccga ttacattgcg     3300

tttcgtcaga actga                                                      3315

 

<210>  6

<211>  50

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  P15A-f

<400>  6

gcattgccgc cgtgggtttc tcgagcgggg cggagatttc ctggaagatg                  50

 

<210>  7

<211>  52

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  P15A-r

<400>  7

ggggccactt tttgccggag ctcgagaaat attttatctg attaataaga tg               52

 

<210>  8

<211>  52

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  pBBR1MCS1-p15A-f

<400>  8

catcttatta atcagataaa atatttctcg agctccggca aaaagtggcc cc               52

 

<210>  9

<211>  50

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  pBBR1MCS1-p15A-r

<400>  9

catcttccag gaaatctccg ccccgctcga gaaacccacg gcggcaatgc                  50

 

<210>  10

<211>  55

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  pBBR1MCS1-f

<400>  10

tttgaaagat gggtccgtca cctgcattaa atcctaagga tccactagtt ctaga            55

 

<210>  11

<211>  59

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  pBBR1MCS1-r

<400>  11

ttttatattc ctcctagtcg actctagagg atccccgggc tgcaggaatt cgatatcaa        59

 

<210>  12

<211>  59

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  atoB-f

<400>  12

cccggggatc ctctagagtc gactaggagg aatataaaat gaaaaattgt gtcatcgtc        59

 

<210>  13

<211>  49

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  atoB-r

<400>  13

gttgagagtt tcatttagct gtcctcctta attcaaccgt tcaatcacc                   49

 

<210>  14

<211>  46

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  ERG13-f

<400>  14

acggttgaat taaggaggac agctaaatga aactctcaac taaact                      46

 

<210>  15

<211>  49

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  ERG13-r

<400>  15

tggctgctgc ccatagtgta atcctcctta ttttttaaca tcgtaagat                   49

 

<210>  16

<211>  47

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  tHMG1-f

<400>  16

atgttaaaaa ataaggagga ttacactatg ggcagcagcc atcatca                     47

 

<210>  17

<211>  23

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  tHMG1-r

<400>  17

ttaggattta atgcaggtga cgg                                               23

 

<210>  18

<211>  59

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  pBBR1MCS2-f

<400>  18

cagaaaacga ttatctgcat ttacccagct taaataagag ctccaattcg ccctatagt        59

 

<210>  19

<211>  55

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  pBBR1MCS2-r

<400>  19

ttaagaacgg taatgacatg gttaattcct cctactgcag gaattcgata tcaag            55

 

<210>  20

<211>  42

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  ERG12-f

<400>  20

ctgcagtagg aggaattaac catgtcatta ccgttcttaa ct                          42

 

<210>  21

<211>  44

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  ERG12-r

<400>  21

ctcaactctg acatttgatc tgcctcctat gaagtccatg gtaa                        44

 

<210>  22

<211>  51

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  ERG8-f

<400>  22

ttaccatgga cttcatagga ggcagatcaa atgtcagagt tgagagcctt c                51

 

<210>  23

<211>  53

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  ERG8-r

<400>  23

gatgctgtgt aaacggtcat gagtattacc tcctatttat caagataagt ttc              53

 

<210>  24

<211>  50

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  MVD1-f

<400>  24

atcttgataa ataggaggta atactcatga ccgtttacac agcatccgtt                  50

 

<210>  25

<211>  55

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  MVD1-r

<400>  25

tgcccatata gtaatcctcc tcccgggctg cagttattcc tttggtagac cagtc            55

 

<210>  26

<211>  51

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  Idi-f

<400>  26

ggaataactg cagcccggga ggaggattac tatatgggca gcagccatca t                51

 

<210>  27

<211>  24

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  Idi-r

<400>  27

ttatttaagc tgggtaaatg caga                                              24

 

<210>  28

<211>  40

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  TS-duet-f

<400>  28

ctttaagaag gagatatacc atgtctagct ctacgggtac                             40

 

<210>  29

<211>  41

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  TS-duet-r

<400>  29

acatatgtat atctccttct ttagacctgg attggatcga t                           41

 

<210>  30

<211>  41

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  GS-duet-f

<400>  30

atcgatccaa tccaggtcta aagaaggaga tatacatatg t                           41

 

<210>  31

<211>  39

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  GS-duet-r

<400>  31

cggccgcaag cttgtcgact cagttctgac gaaacgcaa                              39

 

<210>  32

<211>  39

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  duet-TG-f

<400>  32

ttgcgtttcg tcagaactga gtcgacaagc ttgcggccg                              39

 

<210>  33

<211>  40

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  duet-TG-r

<400>  33

gtacccgtag agctagacat ggtatatctc cttcttaaag                             40

 

<210>  34

<211>  41

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  duet-pSC101-f

<400>  34

gtttgcgggc agcaaaaccc ggcagcagtc gcttcacgtt c                           41

 

<210>  35

<211>  41

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  duet-pSC101-r

<400>  35

atccgtcagt atcagcataa gctacggggt ctgacgctca g                           41

 

<210>  36

<211>  41

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  pSC101-f

<400>  36

ctgagcgtca gaccccgtag cttatgctga tactgacgga t                           41

 

<210>  37

<211>  41

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  pSC101-r

<400>  37

gaacgtgaag cgactgctgc cgggttttgc tgcccgcaaa c                           41

Claims (10)

1.一种生产紫杉二烯的系统，其特征在于：包含甲羟戊酸途径和紫杉二烯合成相关基因或其功能等同体中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的生产紫杉二烯的系统：其特征在于：所述的甲羟戊酸途径相关基因或其功能共同体和紫杉二烯合成相关基因或其功能共同体被设置在同一个载体或相互不同的载体上。

3.根据权利要求1所述的生产紫杉二烯的系统，其特征在于：所述的紫杉二烯合成的相关基因为经过密码子优化的ggpps和ts基因，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。

4.一种生产紫杉二烯的微生物，其特征在于：为包含权利要求1-3任一项所述的系统的微生物，所述的微生物为选自真核微生物、原核微生物和病毒的至少一种。

5.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于：所述的微生物为丝状真菌、酵母、链霉菌、芽孢杆菌或大肠杆菌。

6.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于：所述的微生物为基因组DNA中整合了权利要求1-3任一项所述的系统的核酸序列一种或多种。

7.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于：所述的微生物为含有质粒pMH1、质粒pFZ81和质粒pXC02的大肠杆菌；所述的质粒pMH1启动子为lac启动子，复制子为p15A复制子，包含atoB、erg13和thmg1基因；所述的质粒pFZ81启动子为lac启动子，复制子为pBBR1MCS复制子，包含erg12、erg8、mvd1和idi基因；所述的质粒pXC02启动子为T7强启动子，复制子为pSC101低拷贝复制子，包含ggpps和ts基因；或为含有质粒pMH1、质粒pFZ81和质粒pFZ131的大肠杆菌；所述的质粒pFZ131启动子为T7强启动子，复制子为pBBR322高拷贝复制子，包含ggpps和ts基因。

8.权利要求4-7任一项所述的微生物的制备方法，其特征在于包含如下步骤：将权利要求1-3任一项所述的系统转化微生物中。

9.权利要求1-3任一项所述的系统或权利要求4-7任一项所述的微生物在生产紫杉二烯中的应用。

10.一种提高生产紫杉二烯能力的方法，其特征在于：增加权利要求1-3任一项所述的系统中的任一基因或其功能等同体的表达。

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