CN109679943A

CN109679943A - 一种苦皮藤倍半萜合成酶CaTPS3及其基因序列

Info

Publication number: CN109679943A
Application number: CN201910091026.4A
Authority: CN
Inventors: 乔建军; 许然然; 李伟国; 闫晓光; 梁冬梅; 张玉婷
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2019-01-30
Filing date: 2019-01-30
Publication date: 2019-04-26

Abstract

本发明公开了一种苦皮藤倍半萜合成酶CaTPS3及其基因序列,该基因全长1662bp，编码553个氨基酸，酶蛋白分子量大小为64.06KDa，以pRS426‑URA酵母蛋白表达质粒为载体，以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae WQ011为宿主，实现了苦皮藤倍半萜合成酶CaTPS3的异源表达，重组菌WQ011/pRS426‑URA‑CaTPS3可以同时生成α‑桉叶醇(α‑Eudesmol)和愈创醇(5‑Azulenemethanol)两种倍半萜醇。50mL摇瓶产量为α‑桉叶醇0.08mg/L和愈创醇0.25mg/L。该基因的获得对苦皮藤倍半萜化合物的研究具有深远的意义。

Description

一种苦皮藤倍半萜合成酶CaTPS3及其基因序列

技术领域

本发明属于酶基因工程及酶工程领域，具体涉及一种来源于苦皮藤(Celastrusangulatus)的倍半萜合成酶CaTPS3以及基因序列CaTPS-25470。

背景技术

萜类化合物是化学结构和构象最为复杂的天然产物，目前发现的萜类化合物有80000种左右，占据天然产物的三分之一，广泛分布于植物和微生物中。萜类化合物的生物合成需要的最基本的结构单元是二甲基烯丙基焦磷酸Dimethylallyl diphosphate，DMAPP和异戊烯基焦磷酸Isopentenyl diphosphate，IPP来自于甲羟戊酸途径和脱氧木酮糖磷酸酯途径。不同数量的DMAPP和IPP首尾聚合再经过特殊的萜合酶的催化形成单萜(C₁₀)倍半萜(C₁₅)和二萜(C₂₀)等天然产物。倍半萜类化合物是萜类化合物中结构和种类最多的一种，已经被广泛应用于生物制药、天然绿色农药杀虫和杀菌剂、燃料替代品和食品级香料和调味剂等行业开发使用。

α-桉叶醇(α-Eudesmol)和愈创醇(5-Azulenemethanol)等倍半萜类化合物具有显著的生物活性。如α-桉叶醇可以阻断钙离子通道，抑制过度活跃的神经，可以帮助脑部受创后的辅助治疗；愈创醇具有镇咳、祛痰作用，用于治疗支气管炎。

苦皮藤(Celastrus angulatus)属卫矛科(Celastraceae)南蛇藤属(Celastrus)多年生藤本植物，广泛分布于我国黄河、长江流域的丘陵和山区。苦皮藤的杀虫活性(拒食活性、麻醉活性、毒杀活性)成分主要分布在根皮中。研究证明其中所含的杀虫活性成分主要是以β-二氢沉香呋喃多元醇酯倍半萜类化合物及其生物碱，取代基的不同决定着化合物的活性不同。目前研究主要集中在对苦皮藤中的有效成分苦皮藤素进行分离与结构鉴定和杀虫作用机理研究，没有对苦皮藤素生物合成中倍半萜合成酶的相关文献。因此研究苦皮藤倍半萜合成酶的功能及其序列特征对萜类化合物的分布具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种苦皮藤倍半萜合成酶CaTPS3及其基因序列，还提供了包含本发明基因的质粒及包含该表达质粒的宿主细胞，并利用宿主细胞(重组菌)诱导表达该倍半萜合成酶CaTPS3生成倍半萜类化合物。

本发明的技术方案是：

一种苦皮藤倍半萜合成酶，记为CaTPS3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码上述苦皮藤倍半萜合成酶CaTPS3的基因，记为CaTPS-25470，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组质粒，记为pRS426-URA-CaTPS3，含有编码苦皮藤倍半萜合成酶CaTPS3的基因，半乳糖诱导型启动子PGal1,10，尿嘧啶营养缺陷筛选标签。

一种重组菌，记为WQ011/pRS426-URA-CaTPS3，含有上述重组质粒。

本发明的有益效果是：本发明一种苦皮藤倍半萜合成酶CaTPS3及其基因序列,该基因全长1662bp，编码553个氨基酸，酶蛋白分子量大小为64.06KDa，以pRS426-URA酵母蛋白表达质粒为载体，以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae WQ011为宿主，实现了苦皮藤倍半萜合成酶CaTPS3的异源表达，重组菌WQ011/pRS426-URA-CaTPS3可以同时生成α-桉叶醇(α-Eudesmol)和愈创醇(5-Azulenemethanol)两种倍半萜醇。50mL摇瓶产量为α-桉叶醇0.08mg/L和愈创醇0.25mg/L。该基因的获得对倍半萜的生产及运用具有重要意义，同时该基因的获得对苦皮藤倍半萜化合物的形成机制和生物胁迫机理研究奠定基础。

附图说明

图1为WQ011/pRS426-URA-CaTPS3重组酵母菌株验证DNA琼脂糖凝胶图谱(目的条带大小为1662bp)；

M：标准DNA分子尺；泳道1为CaTPS-25470基因DNA样品；

图2为外标法标准曲线；

图3为WQ011/pRS426-URA-CaTPS3重组酵母菌株产物GC-MS图谱；

A为发酵产物的GC图谱；B为保留时间11.82min峰的质谱图和NIST14谱库中α-桉叶醇质谱图比较；C为保留时间12.05min峰的质谱图和NIST14谱库中愈创醇质谱图比较。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

本发明倍半萜合成酶基因来源于苦皮藤植株，植物在2017年5月11日采集于陕西省杨凌示范区西北农林大学博览园。

选用新鲜采集的苦皮藤植株进行RNA提取，并通过反转录PCR获得其cDNA序列，构建cDNA文库。使用PacBio ISO-Seq平台进行测序，通过在Interpro(http://www.ebi.ac.uk/interpro)中进行BLAST比对获得具有PF_03936Terpene synthase family结构域的目的基因。以cDNA序列为模板，设计引物扩增CaTPS-25470基因序列，并通过酶切连接到WQ011/pRS426-URA-CaTPS3质粒上获得pRS426-URA-CaTPS3酵母宿主表达质粒。采用醋酸锂酵母化学转化法，将重组质粒pRS426-URA-CaTPS3转化如酿酒酵母宿主WQ011，通过URA缺陷型筛选平板，筛选获得WQ011/pRS426-URA-CaTPS3重组酵母菌株，实现苦皮藤的倍半萜合成酶CaTPS3的高效表达。

实施例1.所述的WQ011/pRS426-URA-CaTPS3菌株苦皮藤倍半萜合成酶基因CaTPS-25470的克隆及表达

采用RNAprep pure Plant Kit提取苦皮藤总RNA。采用Clontech SMARTer PCRcDNASynthesis Kit合成第一链cDNA，第一链cDNA经过PCR扩增合成第二链cDNA，然后双链DNA经过二次PCR扩增后，用于SMRTbell建库，并采用PacBio ISO-Seq平台进行测序。

根据测序获得的CaTPS-25470基因序列SEQ ID NO.2，设计引物扩增目的基因，引物序列如下：

引物CaTPS-25470-F:5'CGCGGATCCATGGCAGCAACCACCCAATC 3'(SEQ ID NO.3)

引物CaTPS-25470-R：5'CCGCTCGAGTTAATCTTGCATTGGTATTTGTTGA3'(SEQ ID NO.4)

以反转录获得的cDNA序列为模板，采用上述引物，PCR扩增CaTPS-25470基因序列。反应体系为50ul，包括ddH₂O 18ul，dNTP mixture 1ul,CaTPS-25470-F引物1ul，CaTPS-25470-R引物1ul，DNA模板1ul，2×Phanta Max 25ul，Fidelity DNA polymerase 1ul。扩增过程为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃终延伸5min。

PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶检测条带大小，用Universal DNA PurificationKit回收目的片段。

用BamHI和XhoI酶切纯化的DNA片段和pRS426-URA质粒，酶切后的产物经过Universal DNA Purification Kit回收得到酶切片段，经过T4 DNA ligase连接酶进行连接，得到重组质粒。酶切体系为：BamHI1.5μL，XhoI 1.5μL，DNA片段或质粒42μL，cut smartbuffer 5μL。37℃水浴2h。连接体系为：目的酶切基因片段7μL与酶切质粒1μL，T4连接酶1μL，10×T4 ligase buffer1μL。16℃过夜连接。

采用醋酸锂转化法，进行酵母转化，操作步骤如下：

(1)酿酒酵母菌株WQ011划线YPD平板，30℃培养，至长出单菌落约1-3mm。从YPD平板挑取一环酵母菌接种于含有5mL YPD液体培养基中，180r/min，30℃，摇床培养14～16h。

(2)按照1％接种量，将菌液接入50mL YEPD液体培养基中，180r/min，30℃培养至OD₆₀₀＝0.5(约3-5h)。

(3)5000r/min，4℃冷冻离心6min，收集菌体。

(4)加入25mL无菌去离子水悬浮菌体，5000r/min，4℃冷冻离心6min。

(5)重复上一步操作一次。

(6)用1mL浓度为0.1mol/L的LiAc缓冲液重悬菌体，静置5min。5000r/min，4℃冷冻离心5min后，弃去上清。

(7)用500μL 0.1mol/L的LiAc缓冲液重悬菌体，每100μL分装到一个离心管中，制成酵母感受态细胞。

(8)ssDNA经过煮沸12min后冰上迅速冷却。

(9)在分装好的酵母感受态细胞中，加入100-500ng的载体或线性DNA。之后旋转加入如下混合物中。转化混合物的成分如下：1)PEG-4000 50％(w/v)，620μl；2)LiAc1.0mol/L，90μl；3)SS-DNA(10mg/ml)，40μl。

(10)30℃培养箱中孵育30min。

(12)42℃水浴热激20min。

(15)6000r/min离心1min，弃掉部分上清液，重悬菌体，取100μL涂板，30℃培养2-3天，长出转化子。

(16)挑取少许单菌落，加入50μl除菌的20mM NaOH溶液混匀。

(17)置于PCR仪中，按照程序：99℃，5min；4℃，1min循环3次。

(18)取出菌液，8000r/min离心5分钟，取上清作为PCR模板。

(19)反应体系为10ul，包括CaTPS-25470-F引物1ul，CaTPS-25470-R引物1ul，DNA模板3ul，2×Taq Master Mix 5ul。扩增过程为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃终延伸5min。

(20)PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶检测条带大小是否正确。

结果表明(如图1所示)：挑选的转化子在1200bp和2000bp之间有单一条带，证明转化子为阳性克隆子。

实施例2.诱导发酵

(1)将转化子WQ011/pRS426-URA-CaTPS3转接至50mL合成培养基(without URA)中，180r/min，30℃，摇床培养30h。

(2)在30h时添加终浓度10g/L半乳糖诱导表达至90-120h，在36h和72h时添加终浓度10g/L乙醇作为补充碳源。

(3)发酵液采用3mL正己烷萃取发酵产物15min进行GC-MS检测。

实施例3.GC-MS检测发酵产物

(1)GC-MS检测方法

色谱柱：TG-5MS；离子源；EI，70eV；进样量：1uL；进样温度：200℃；检测器温度：280℃；柱温：240℃；程序升温：初始温度70℃，10℃/min升温到280℃，维持5min。

(2)采用外标法计算产量。分别准确配制0.02，0.04，0.06，0.08和1.0mg/L标准品，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线(如图2所示)。

结果表明：GC-MS谱图中的目标峰，经过与NIST14数据库中的参考质谱数据比较发现，WQ011/pRS426-URA-CaTPS3菌株发酵液正己烷萃取物在保留时间11.82min的色谱峰为α-桉叶醇(α-Eudesmol)，50mL摇瓶产量为0.08mg/L(如图3A、3B所示)。在保留时间12.05min的色谱峰为愈创醇，50mL摇瓶产量为0.25mg/L(如图3A、3C所示)。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的若干改进或变形，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，也应视为在本发明的专利保护范围内。

<110> 天津大学

<120> 一种苦皮藤倍半萜合成酶CaTPS3及其基因序列

<130>

<160> 4

<170>

<210> 1

<211> 553

<212> PRT

<213> 苦皮藤

<400> 1

Met Ala Ala Thr Thr Gln Ser Val Glu Ala Pro Arg Arg Leu Ala Asn

5 10 15

Phe Ala Pro Ala Val Trp Ala His Asp Asp Phe Ala Ser Phe Ala Ser

20 25 30

Asp Gln Asp Ser Glu Tyr Gly Ser Tyr Thr Lys Arg Val Glu Glu Leu

35 40 45

Lys Val Gln Val Asn Asp Met Leu Leu Ser Thr Asn Asp Ile Val Glu

50 55 60

Lys Ile Glu Leu Ile Asp Leu Leu Gly Arg Leu Gly Ile Ser Tyr His

65 70 75 80

Phe Glu Ser Glu Ile Glu Asp His Leu Lys Lys Asn Leu Asp Met Val

85 90 95

Lys Thr Lys Leu Val Asp Asp Gln Ile Glu Tyr Asn Leu Tyr Ala Val

100 105 110

Ala Phe Leu Phe Arg Val Phe Arg Gln Tyr Gly Tyr Lys Ile Ser Cys

115 120 125

Asp Val Phe Asp Lys Phe Lys Gly Asp Asp Gly Lys Leu Lys Met Ser

130 135 140

Leu Ala Ser Asp Val Glu Gly Met Leu Ser Leu Tyr Gln Ala Ser His

145 150 155 160

Leu Ser Met His Gly Glu Asp Val Leu Asp Glu Ala Leu Asp Phe Ser

165 170 175

Lys Thr Ser Leu Arg Ser Ala Val Thr Gln Leu Asn Pro His Phe Ala

180 185 190

Asn Gln Val Ala His Ala Leu Gln Gln Pro Tyr Gln Lys Gly Ile Pro

195 200 205

Arg Ile Glu Ser Arg Gln Tyr Ile Asn Phe Tyr Glu Glu Asp Glu Ser

210 215 220

Arg Asn Glu Ile Leu Leu Lys Leu Ala Lys Ile Asp Phe Asn Arg Val

225 230 235 240

Gln Leu Leu His Gln Gln Glu Leu Ser Gln Val Ser Arg Trp Tyr Lys

245 250 255

Asp Leu Gln Ile Ala Ser Asn Phe Pro Tyr Ala Arg Asp Arg Ile Ala

260 265 270

Glu Ile Tyr Met Trp Thr Val Gly Ser Asn Phe Glu Pro His Tyr Gly

275 280 285

Arg Val Arg Ile Phe Leu Thr Lys Ser Val Thr Met Ile Ser Ile Leu

290 295 300

Asp Asp Thr Tyr Asp Ala Tyr Gly Thr Ile Glu Glu Leu Arg Leu Leu

305 310 315 320

Thr Asp Ala Ile Glu Arg Trp Asp Ile Ser Ala Ile Asp Gln Leu Pro

325 330 335

Asp Tyr Met Lys Val Leu Tyr Lys Met Ile Leu Asn Leu Tyr Asp Glu

340 345 350

Phe Glu Asn Glu Leu Lys Asn Glu Gly Arg Ser Ser Cys Val Ala Tyr

355 360 365

Ala Arg Asp Ala Leu Arg Glu Met Val Lys Ala Tyr His Val Glu Ala

370 375 380

Glu Trp Cys Asn Lys Gly Tyr Val Pro Thr Phe Asp Glu Tyr Met Glu

385 390 395 400

Asn Ala Leu Ile Thr Ser Cys Tyr His Ala Ile Pro Ala Ala Cys Phe

405 410 415

Leu Gly Met Gly Glu Ile Ala Gly Ile Arg Glu Phe Glu Trp Leu Lys

420 425 430

Ser Ile Pro Lys Met Val Arg Ala Ser Glu Met Ile Gly Arg Leu Met

435 440 445

Asp Asp Ile Met Ser His Lys Glu Glu Gln Lys Arg Gly His Val Ala

450 455 460

Ser Ser Val Glu Cys Phe Met Lys Gln Tyr Gly Val Ser Glu Glu Glu

465 470 475 480

Val Val Glu Asp Phe Gln Lys Arg Val Ala Asn Ala Trp Lys Asp Ile

485 490 495

Asn Glu Glu Cys Met Arg Pro Thr Ala Val Ser Leu His Leu Leu Met

500 505 510

Pro Ile Leu Asn Leu Thr Arg Ile Ile Asp Val Val Tyr Lys Asn Asp

515 520 525

Asp Gly Tyr Ser Asn Pro Val Asn Leu Lys Glu His Val Lys Ser Leu

530 535 540

Phe Ile Gln Gln Ile Pro Met Gln Asp

545 550 553

<210> 2

<211> 1662

<212> DNA

<213> 苦皮藤

<400> 2

atggcagcaa ccacccaatc cgtagaagct ccacggcggt tggccaactt cgcccctgcc 60

gtttgggctc acgatgactt tgcttctttt gcttctgatc aagactcgga gtacggatcg 120

tacacaaaga gagtggagga gttgaaagta caagtgaatg atatgttgtt gtctacaaat 180

gatattgtgg agaaaattga gttgattgac ttgttgggtc gtcttggtat ttcatatcac 240

tttgaaagtg aaattgaaga ccaccttaag aaaaatcttg acatggtcaa aactaaactg 300

gtggatgacc aaattgagta taacctatat gccgttgcat ttctattccg cgtctttaga 360

caatatggtt ataaaatttc ttgtgatgtg tttgacaaat ttaagggaga tgatggaaag 420

ttgaaaatga gtctagctag tgatgtggag gggatgctaa gcttgtatca agcttctcac 480

ttgagcatgc atggagagga tgttttagat gaagcacttg atttttcaaa aacttctctt 540

cgttccgcgg tgacccaatt gaacccacac tttgcaaacc aagttgccca tgcattgcaa 600

caaccttatc aaaagggcat tccaagaatc gagtcaaggc aatacatcaa tttctatgaa 660

gaggatgagt ctcggaatga aattctgctc aaattagcga aaatcgattt taatcgagta 720

caattgttgc accaacaaga gttaagtcag gtctcaaggt ggtataaaga cttgcagatt 780

gcttcaaact ttccttatgc aagagacaga attgctgaaa tctatatgtg gactgttgga 840

tccaactttg aaccacatta tggacgtgtt agaatttttc ttaccaaaag tgtgacaatg 900

atatcaattt tagacgacac atacgatgca tatggtacaa ttgaagaact ccgactcttg 960

accgatgcga tagagaggtg ggacattagt gccattgatc aactaccaga ttacatgaaa 1020

gttctttaca agatgattct aaatctctac gatgaattcg agaacgaatt gaaaaacgaa 1080

ggaagatctt cctgtgtcgc ttatgctaga gacgcgttaa gagaaatggt gaaagcctac 1140

cacgttgaag ccgagtggtg caacaaaggt tacgtaccaa cattcgacga gtacatggag 1200

aatgcactga tcacaagctg ttatcatgca attccagctg catgttttct aggcatggga 1260

gaaattgcag gaataagaga atttgaatgg ctcaaaagca tccctaaaat ggttagggct 1320

tccgagatga ttggtcgtct tatggatgac ataatgtcac ataaggagga acaaaagagg 1380

gggcatgttg cctcaagtgt tgagtgtttt atgaagcaat atggtgtgtc agaagaagag 1440

gtggttgaag attttcaaaa gagggttgcg aatgcttgga aggatattaa tgaagagtgt 1500

atgagaccaa ctgccgtgtc tcttcatctt ctgatgccaa ttctgaacct aacacgcatc 1560

atcgatgttg tctacaagaa cgacgatggg tattcaaatc cagtcaattt gaaggagcat 1620

gtcaagtctt tattcattca acaaatacca atgcaagatt aa 1662

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgcggatcca tggcagcaac cacccaatc 29

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccgctcgagt taatcttgca ttggtatttg ttga 34

Claims

1.一种苦皮藤倍半萜合成酶，记为CaTPS3，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述苦皮藤倍半萜合成酶CaTPS3的基因，记为CaTPS-25470，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组质粒，记为pRS426-URA-CaTPS3，其特征在于，含有权利要求2所述基因，半乳糖诱导型启动子PGal1,10，尿嘧啶营养缺陷筛选标签。

4.一种重组菌，记为WQ011/pRS426-URA-CaTPS3，其特征在于，含有权利要求3所述重组质粒。