CN109810999A - 一种利用微生物发酵生产橙花醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于可再生香料以及食品、化工原料生产领域，具体涉及一种利用微生物发酵生产橙花醇的方法。该方法是将橙花基焦磷酸合成酶和橙花醇合成酶基因在微生物中表达，以生产橙花醇。本发明实现了改造微生物直接合成橙花醇，不需要化学合成得到，减少了对环境的污染，是一种可再生的、低消耗的、环保的技术。通过微生物生产橙花醇可直接应用于工业生产。

Description

一种利用微生物发酵生产橙花醇的方法

技术领域

本发明属于可再生香料以及食品、化工原料生产领域，具体涉及一种利用微生物发酵生产橙花醇的方法。

背景技术

橙花醇，分子式C10H18O，分子量154.25，是一种单萜烯，存在于许多如柠檬草和啤酒花等精油中，最初是从橙花油中分离出来的。橙花醇有着令人愉快的玫瑰和橙花的香气，香气较平和，微带柠檬样的果香，橙花醇是香叶醇的异构体，其香气比香叶醇柔和优美，相对偏清，并带有新鲜的清香和柑橘香调。橙花醇是一种具有玫瑰花香的贵重的香料，用于配制玫瑰型和橙花型等花香香精，在饮食、食品、日化高档香精的调配中被广泛使用，同时也是合成另一些重要香料的中间品，且是合成这些重要香料的关键原料。目前，橙花醇主要是通过化学法合成，但是，目前的化学合成法不但成本高，还会造成环境污染，消耗珍贵的石油资源。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种利用微生物发酵生产橙花醇的方法，方法简单，易行，适用于大规模生产。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种利用微生物发酵生产橙花醇的方法，包括将橙花基焦磷酸合成酶基因和橙花醇合成酶的基因中转入微生物体内，得到重组菌株后进行发酵；所述的微生物为选细菌、真菌、放线菌、支原体、藻类、立克次体、螺旋体、衣原体或病毒。

以上所述的方法中，进一步的，将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因和羟甲基戊二酰辅酶A合成酶的基因转入上述重组菌株内；

以上所述的方法中，更进一步的，将异戊烯二磷酸异构酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸激酶的基因转入上述重组菌株内；

以上所述的方法中，优选的，所述的微生物为大肠杆菌或酵母；

以上所述的方法中，优选的，所述的橙花基焦磷酸合成酶基因、橙花醇合成酶基因、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因、异戊烯二磷酸异构酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸激酶基因均来源于酿酒酵母；

以上所述的方法中，优选的，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

相比于化学合成法，微生物合成法不受原料限制、过程绿色环保、产物单一、产量有较大的提升空间，有更大的发展潜力，实现橙花醇的生物合成对人类的健康、环保、可持续发展具有重要的意义。

本发明的优点是在微生物中引入外源基因来生产橙花醇，不需要利用石油资源来进行化学合成，减少了对石油资源的消耗，减少了对环境的污染，实现了可持续发展。同时，由于绝大多数微生物生长、代谢速度快，易于代谢工程改造，不受天气、季节等因素影响，可以实现连续生产。

附图说明

图1质粒pLZ03的结构示意图；

合成NDPS1和GmNES基因，并构建到表达载体pET28a上，得到质粒pLZ03。

图2为发酵提取产物后用气相色谱质谱联用仪鉴定有橙花醇的示意图。

图3质粒pBBR1mcs-tHMG1的结构示意图；

Saccharomyces cerevisiaetHMG1基因通过无缝克隆方法在BamHI位点克隆于pBBR1mcs上。

图4质粒pLZ02的结构示意图；

Saccharomyces cerevisiae ERG13基因通过无缝克隆方法在BamHI位点克隆于pBBR1mcs-tHMG1上，得到质粒pLZ02，pLZ02同时表达Saccharomyces cerevisiae tHMG1和ERG13基因。

图5质粒pET21a-15A结构示意图；

扩增pET21a上除复制子之外的片段和p15a复制子片段，将扩增得到的两基因片段通过无缝克隆方法构建得到质粒pET21a-15A。

图6质粒pET21a-15A-IDI1结构示意图；

Saccharomyces cerevisiaeIDI1基因通过无缝克隆方法在NdeI位点克隆于pET21a-15A上。

图7质粒pET21a-15A-IDI1-MVD1的结构示意图；

Saccharomyces cerevisiae MVD1基因通过无缝克隆方法在BamHI位点克隆于pET21a-15A-IDI1上，质粒pET21a-15A-IDI1-MVD1同时表达Saccharomyces cerevisiaeIDI1和MVD1基因。

图8质粒pET21a-15A-IDI1-MVD1-ERG8的结构示意图；

Saccharomyces cerevisiae ERG8基因通过无缝克隆方法在BamHI位点克隆于pET21a-15A-IDI1-MVD1上，质粒pET21a-15A-IDI1-MVD1-ERG8同时表达SaccharomycescerevisiaeIDI1、MVD1和ERG8基因。

图9质粒pLZ01的结构示意图；

Saccharomyces cerevisiae ERG12基因通过无缝克隆方法在BamHI位点克隆于pET21a-15A-IDI1-MVD1-ERG8上，得到质粒pLZ01，质粒pLZ01同时表达Saccharomycescerevisiae IDI1、MVD1、ERG8和ERG12基因。

具体实施方式

本发明实施例所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

一种利用微生物发酵生产橙花醇的方法，包括下述步骤：

1)合成编码橙花基焦磷酸合成酶和橙花醇合成酶的基因NDPS1和GmNES：

编码橙花基焦磷酸合成酶和橙花醇合成酶的基因NDPS1(Solanum lycopersicumND PS1基因序列为SEQ ID NO.1所示)和GmNES(Glycine max GmNES基因序列为SEQ IDNO.3所示)由南京金唯智公司合成。

以合成的GmNES基因为模板，通过使用如下引物PCR扩展GmNES基因片段：

GmNES上游引物：CTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGACAACATCTACATCAA

GmNES下游引物：TCCACCAGTCATGCTAGCCATATTATTCAATCACGAACTGCA

扩增得到的GmNES基因片段通过无缝克隆方法在NdeI位点克隆于pET28a上，得到质粒pET28a-GmNES。

以合成的NDPS1基因为模板，通过使用如下引物PCR扩展NDPS1基因片段：

NDPS1上游引物：GGACAGCAAATGGGTCGCGGATCAATAAGGAGATATACCATGTCTGCTCGTGGTCTGAA

NDPS1下游引物：TGTCGACGGAGCTCGAATTCGGATCCTTAGTAGGTATGACCACCAA

扩增得到的NDPS1基因片段通过无缝克隆方法在BamHI位点克隆于pET28a-GmNES上，得到质粒得到质粒pLZ03，质粒示意图见图1。

2)将质粒pLZ03转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到菌株BL21(DE3)/pLZ03，利用卡那霉素筛选获得成功地转化子，挑单克隆于10mL LB培养基中37℃、220rpm培养12h后，转接2mL菌液入200mL LB培养基中37℃、220rpm培养，当OD600达到0.6-0.8时，加入0.1mM的IPTG进行诱导表达，诱导后培养温度改为30℃诱导表达，24h后，取20mL发酵液进行橙花醇提取。

定性定量分析实验如下：

提取方法为：在20mL发酵液中，加入芳樟醇作为内标，再加入20mL乙酸乙酯萃取10min，再静置分层，将上层有机层转入50mL的烧瓶进行旋转蒸发浓缩。待有机相浓缩至1mL左右，过滤后转移入样品瓶中。

将处理好的样品用气相色谱质谱联用仪(安捷伦7890-5975)检测，使用的柱子为Agilent HP-5ms柱子，氦气流速1mL/min，进样量为1μL，程序温度为：80℃维持1min，再以10℃/min升至260℃，维持240℃3min。

定性和定量分析实验结果：气相色谱质谱联用仪结果(图2)表明，表达pLZ03质粒，大肠杆菌产生了橙花醇；由GC-MS定量分析，经换算后，步骤2)中发酵液中的橙花醇量为5.13±0.18mg/L。

该实施例结果证明在大肠杆菌BL21(DE3)内表达NDPS1和GmNES基因，即编码橙花基焦磷酸合成酶和橙花醇合成酶的基因，可生产得到橙花醇。

实施例2:

一种利用微生物发酵生产橙花醇的方法，包括下述步骤：

1)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1和羟甲基戊二酰辅酶A合成酶的基因ERG13的获得：

以Saccharomyces cerevisiae的基因组为模板，通过使用如下引物PCR扩展各基因片段，加下划线的是酶切位点：

tHMG1上游引物：CCGCTCTAGAACTAGTGGATCAATAAGGAGATATACCATGGACCAATTGGTGAAAAC

tHMG1下游引物：GAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCTTAGGATTTAATGCAGGTGA

ERG13上游引物：CTGCATTAAATCCTAAGGATCAATAAGGAGATATACCATGAAACTCTCAACTAAACT

ERG13下游引物：GAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCTTATTTTTTAACATCGTAAG。

2)质粒pLZ02的获得：

将步骤1)扩增得到的tHMG1基因片段通过无缝克隆方法在BamHI位点克隆于pBBR1mcs上，得到质粒pBBR1mcs-tHMG1，其示意图见图3。

将扩增得到的ERG13基因片段通过无缝克隆方法在BamHI位点克隆于pBBR1mcs-tHMG1上，得到质粒pLZ02，其示意图见图4。

3)利用大肠杆菌发酵生产橙花醇

将质粒pLZ03和pLZ02共转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到菌株BL21(DE3)/pLZ03/pLZ02，利用卡那霉素和氯霉素筛选获得成功地转化子，挑单克隆于10mL LB培养基中37℃、220rpm培养12h后，转接2mL菌液入200mL LB培养基中37℃、220rpm培养，当OD600达到0.6-0.8时，加入0.1mM的IPTG进行诱导表达，诱导后培养温度改为30℃，其余步骤同实施例1。

由GC-MS定量分析，经换算后，步骤3)中发酵液中的橙花醇量为10.27±0.24mg/L。

实施例3：

一种利用微生物发酵生产橙花醇的方法，包括下述步骤：

1)异戊烯二磷酸异构酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸激酶的基因IDI1，MVD1，ERG8和ERG12的获得：

以Saccharomyces cerevisiae的基因组为模板，通过使用如下引物PCR扩展各基因片段，加下划线的是酶切位点：

IDI1上游引物：ACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACTGCCGACAACAATAGTA

IDI1下游引物：TCCACCAGTCATGCTAGCCATATTATAGCATTCTATGAATTTGC

MVD1上游引物：CAGCAAATGGGTCGCGGATCAATAAGGAGATATACCATGACCGTTTACACAGCATC

MVD1下游引物：TCGACGGAGCTCGAATTCGGATCCTTATTCCTTTGGTAGACCAG

EGR8上游引物：CTACCAAAGGAATAAGGATCAATAAGGAGATATACCATGTCAGAGTTGAGAGCCTT

ERG8下游引物：TCGACGGAGCTCGAATTCGGATCCTTATTTATCAAGATAAGTTT

ERG12上游引物：TATCTTGATAAATAAGGATCAATAAGGAGATATACCATGTCATTACCGTTCTTAAC

ERG12下游引物：TCGACGGAGCTCGAATTCGGATCCTTATGAAGTCCATGGTAAAT。

2)构建质粒pLZ03

(1)通过使用如下引物PCR扩增pET21a上除复制子之外的片段和p15a复制子片段：

pET21a上游引物：GCAGACCAAAACGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTC

pET21a下游引物：GGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTT

p15a上游引物：AAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCC

p15a下游引物：GAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCGTTTTGGTCTGC

将扩增得到的两基因片段通过无缝克隆方法连接构建得到质粒pET21a-15A，其示意图见图5。

(2)将扩增得到的IDI1基因片段通过无缝克隆方法在NdeI位点克隆于pET21a-15A上，得到质粒pET21a-15A-IDI1，其示意图见图6。

将扩增得到的MVD1基因片段通过无缝克隆方法在BamHI位点克隆于pET21a-15A-IDI1上，得到质粒pET21a-15A-IDI1-MVD1，其示意图见图7。

将扩增得到的ERG8基因片段通过无缝克隆方法在BamHI位点克隆于pET21a-15A-IDI1-MVD1上，得到质粒pET21a-15A-IDI1-MVD1-ERG8，其示意图见图8。

将扩增得到的ERG12基因片段通过无缝克隆方法在BamHI位点克隆于pET21a-15A-IDI1-MVD1-ERG8上，得到质粒pLZ01，其示意图见图9。

3)利用大肠杆菌发酵生产橙花醇

将质粒pLZ03和pLZ01共转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到菌株BL21(DE3)/pLZ03/pLZ01，利用卡那霉素和氨苄青霉素筛选获得成功地转化子，挑单克隆于10mL LB培养基中37℃、220rpm培养12h后，转接2mL菌液入200mL LB培养基中37℃、220rpm培养，当OD600达到0.6-0.8时，加入0.1mM的IPTG进行诱导表达，诱导后培养温度改为30℃，其余步骤同实施例1。

由GC-MS定量分析，经换算后，步骤3)中发酵液中的橙花醇量为14.26±0.21mg/L。

实施例4：

一种利用微生物发酵生产橙花醇的方法，包括下述步骤：

将实施例1,2,3制备的质粒pLZ03、pLZ02和pLZ01共转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到菌株BL21(DE3)/pLZ03/pLZ02/pLZ01，利用卡那霉素、氯霉素和氨苄青霉素筛选获得成功地转化子，挑单克隆于10mL LB培养基中37℃、220rpm培养12h后，转接2mL菌液入200mL LB培养基中37℃、220rpm培养，当OD600达到0.6-0.8时，加入0.1mM的IPTG进行诱导表达，诱导后培养温度改为30℃，其余步骤同实施例1。

由GC-MS定量分析，经换算后，步骤2)中发酵液中的橙花醇量为20.31±0.20mg/L。

序列表

<110> 湖北工业大学

<120> 一种利用微生物发酵生产橙花醇的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 783

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtctgctc gtggtctgaa caaaatttca tgttctttaa atctgcagac cgagaagctg 60

tgctacgaag acaacgataa cgatttagat gaggagctga tgccgaaaca tatcgcttta 120

atcatggatg gcaaccgccg ctgggccaaa gataaaggtt tagaagtgta cgagggccac 180

aagcacatca ttccgaaact gaaagaaatt tgcgacatca gcagcaagct gggtatccag 240

atcatcaccg cctttgcctt cagcaccgag aactggaaac gcagcaaaga agaggtggac 300

tttttactgc agatgttcga ggaaatctac gacgagttta gccgtagcgg cgtgcgcgtg 360

agcatcattg gctgcaaaag cgatctgccg atgactttac agaaatgcat tgcactgacc 420

gaagagacca ccaaaggcaa taagggttta catttagtga ttgctttaaa ttatggcggc 480

tactacgaca ttttacaagc taccaagagc atcgtgaaca aggccatgaa tggtttactg 540

gatgtggaag atattaataa aaatttattt gatcaagagc tggaaagtaa atgcccgaac 600

ccggatctgc tgatccgtac cggcggcgaa cagcgcgtga gcaacttttt actgtggcag 660

ctggcctaca ccgagttcta cttcaccaac actttattcc cggattttgg cgaagaggat 720

ttaaaagagg ccatcatgaa cttccagcag cgccatcgtc gctttggtgg tcatacctac 780

taa 783

<210> 2

<211> 260

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Ala Arg Gly Leu Asn Lys Ile Ser Cys Ser Leu Asn Leu Gln

1 5 10 15

Thr Glu Lys Leu Cys Tyr Glu Asp Asn Asp Asn Asp Leu Asp Glu Glu

20 25 30

Leu Met Pro Lys His Ile Ala Leu Ile Met Asp Gly Asn Arg Arg Trp

35 40 45

Ala Lys Asp Lys Gly Leu Glu Val Tyr Glu Gly His Lys His Ile Ile

50 55 60

Pro Lys Leu Lys Glu Ile Cys Asp Ile Ser Ser Lys Leu Gly Ile Gln

65 70 75 80

Ile Ile Thr Ala Phe Ala Phe Ser Thr Glu Asn Trp Lys Arg Ser Lys

85 90 95

Glu Glu Val Asp Phe Leu Leu Gln Met Phe Glu Glu Ile Tyr Asp Glu

100 105 110

Phe Ser Arg Ser Gly Val Arg Val Ser Ile Ile Gly Cys Lys Ser Asp

115 120 125

Leu Pro Met Thr Leu Gln Lys Cys Ile Ala Leu Thr Glu Glu Thr Thr

130 135 140

Lys Gly Asn Lys Gly Leu His Leu Val Ile Ala Leu Asn Tyr Gly Gly

145 150 155 160

Tyr Tyr Asp Ile Leu Gln Ala Thr Lys Ser Ile Val Asn Lys Ala Met

165 170 175

Asn Gly Leu Leu Asp Val Glu Asp Ile Asn Lys Asn Leu Phe Asp Gln

180 185 190

Glu Leu Glu Ser Lys Cys Pro Asn Pro Asp Leu Leu Ile Arg Thr Gly

195 200 205

Gly Glu Gln Arg Val Ser Asn Phe Leu Leu Trp Gln Leu Ala Tyr Thr

210 215 220

Glu Phe Tyr Phe Thr Asn Thr Leu Phe Pro Asp Phe Gly Glu Glu Asp

225 230 235 240

Leu Lys Glu Ala Ile Met Asn Phe Gln Gln Arg His Arg Arg Phe Gly

245 250 255

Gly His Thr Tyr

260

<210> 3

<211> 1605

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggacaaca tctacatcaa acaagccctc gtgctgaaag aagttaaaca cgtgttccag 60

aagctgattg gcgaggaccc gatggagagc atgtacatgg tggatacgat ccagcgtctg 120

ggtatcgagc accacttcga ggaagagatc gaggccgcgc tgcagaaaca gcatctgatc 180

ttcagcagcc atctgagcga tttcgccaac aaccacaagc tctgcgaagt ggcgctgcca 240

ttccgtctgc tgcgccaacg tggtcactac gtgctcgccg acgtgttcga caatctgaag 300

agcaacaaga aggagttccg cgagaaacac ggcgaagacg tgaagggtct gatcagtctg 360

tacgaagcga cccagctggg tatcgaaggt gaagacagtc tggacgacgc cggttatctg 420

tgccatcagc tgctgcatgc gtggctgacg cgtcacgagg agcataacga ggcgatgtac 480

gtggccaaaa cgctgcagca cccactgcat tacgatctga gccgcttccg tgacgatacc 540

agcattctgc tgaacgactt caagaccaag cgtgagtggg agtgcctcga agaactggcc 600

gagatcaaca gcagtattgt gcgcttcgtg aatcagaacg agattaccca agtttataag 660

tggtggaagg acctcggtct gaacaatgag gtgaagttcg cgcgctacca accgctgaag 720

tggtacatgt ggccgatggc gtgcttcacc gacccacgtt tcagtgagca gcgcatcgag 780

ctgaccaagc cgattagtct ggtttatatc attgacgaca tctttgacgt gtatggcacg 840

ctcgaccagc tgacgctctt taccgacgcc attaaacgct gggaactggc cagcaccgag 900

caactgccag acttcatgaa gatgtgtctg cgcgtgctgt acgagattac caatgacttc 960

gccgagaaga tctgcaagaa acacggcttc aacccgatcg aaaccctcaa acgcagttgg 1020

gtgcgtctgc tcaacgcctt tctggaagaa gcccattggc tcaacagcgg tcatctgccg 1080

cgtagcgcgg agtatctgaa caatggcatc gtgagcaccg gtgtgcacgt ggtgctcgtt 1140

cacagcttct tcctcatgga ctacagtatc aacaacgaga tcgtggcgat cgtggacaac 1200

gttccacaga tcatccatag cgtggcgaag atcctccgtc tgagtgatga tctggaaggt 1260

gccaaaagtg aagaccaaaa cggcctcgac ggcagctaca tcgactgcta catgaacgag 1320

catcaagatg ttagtgccgg tgacgcccag cgccatgtgg cccatctcat tagctgcgag 1380

tggaaacgtc tgaatcgcga gattctgacc cagaatcagc tgccgagtag cttcacgaac 1440

ttctgtctga acgccgcgcg catggttccg ctgatgtacc attaccgcag caatccgggc 1500

ctcagtacgc tgcaagaaca tgtgaagctc ctcagcaaca acgccgttgc gggtgccgaa 1560

cgccacgttg ttcacatcct ctgtctgcag ttcgtgattg aataa 1605

<210> 4

<211> 534

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Asp Asn Ile Tyr Ile Lys Gln Ala Leu Val Leu Lys Glu Val Lys

1 5 10 15

His Val Phe Gln Lys Leu Ile Gly Glu Asp Pro Met Glu Ser Met Tyr

20 25 30

Met Val Asp Thr Ile Gln Arg Leu Gly Ile Glu His His Phe Glu Glu

35 40 45

Glu Ile Glu Ala Ala Leu Gln Lys Gln His Leu Ile Phe Ser Ser His

50 55 60

Leu Ser Asp Phe Ala Asn Asn His Lys Leu Cys Glu Val Ala Leu Pro

65 70 75 80

Phe Arg Leu Leu Arg Gln Arg Gly His Tyr Val Leu Ala Asp Val Phe

85 90 95

Asp Asn Leu Lys Ser Asn Lys Lys Glu Phe Arg Glu Lys His Gly Glu

100 105 110

Asp Val Lys Gly Leu Ile Ser Leu Tyr Glu Ala Thr Gln Leu Gly Ile

115 120 125

Glu Gly Glu Asp Ser Leu Asp Asp Ala Gly Tyr Leu Cys His Gln Leu

130 135 140

Leu His Ala Trp Leu Thr Arg His Glu Glu His Asn Glu Ala Met Tyr

145 150 155 160

Val Ala Lys Thr Leu Gln His Pro Leu His Tyr Asp Leu Ser Arg Phe

165 170 175

Arg Asp Asp Thr Ser Ile Leu Leu Asn Asp Phe Lys Thr Lys Arg Glu

180 185 190

Trp Glu Cys Leu Glu Glu Leu Ala Glu Ile Asn Ser Ser Ile Val Arg

195 200 205

Phe Val Asn Gln Asn Glu Ile Thr Gln Val Tyr Lys Trp Trp Lys Asp

210 215 220

Leu Gly Leu Asn Asn Glu Val Lys Phe Ala Arg Tyr Gln Pro Leu Lys

225 230 235 240

Trp Tyr Met Trp Pro Met Ala Cys Phe Thr Asp Pro Arg Phe Ser Glu

245 250 255

Gln Arg Ile Glu Leu Thr Lys Pro Ile Ser Leu Val Tyr Ile Ile Asp

260 265 270

Asp Ile Phe Asp Val Tyr Gly Thr Leu Asp Gln Leu Thr Leu Phe Thr

275 280 285

Asp Ala Ile Lys Arg Trp Glu Leu Ala Ser Thr Glu Gln Leu Pro Asp

290 295 300

Phe Met Lys Met Cys Leu Arg Val Leu Tyr Glu Ile Thr Asn Asp Phe

305 310 315 320

Ala Glu Lys Ile Cys Lys Lys His Gly Phe Asn Pro Ile Glu Thr Leu

325 330 335

Lys Arg Ser Trp Val Arg Leu Leu Asn Ala Phe Leu Glu Glu Ala His

340 345 350

Trp Leu Asn Ser Gly His Leu Pro Arg Ser Ala Glu Tyr Leu Asn Asn

355 360 365

Gly Ile Val Ser Thr Gly Val His Val Val Leu Val His Ser Phe Phe

370 375 380

Leu Met Asp Tyr Ser Ile Asn Asn Glu Ile Val Ala Ile Val Asp Asn

385 390 395 400

Val Pro Gln Ile Ile His Ser Val Ala Lys Ile Leu Arg Leu Ser Asp

405 410 415

Asp Leu Glu Gly Ala Lys Ser Glu Asp Gln Asn Gly Leu Asp Gly Ser

420 425 430

Tyr Ile Asp Cys Tyr Met Asn Glu His Gln Asp Val Ser Ala Gly Asp

435 440 445

Ala Gln Arg His Val Ala His Leu Ile Ser Cys Glu Trp Lys Arg Leu

450 455 460

Asn Arg Glu Ile Leu Thr Gln Asn Gln Leu Pro Ser Ser Phe Thr Asn

465 470 475 480

Phe Cys Leu Asn Ala Ala Arg Met Val Pro Leu Met Tyr His Tyr Arg

485 490 495

Ser Asn Pro Gly Leu Ser Thr Leu Gln Glu His Val Lys Leu Leu Ser

500 505 510

Asn Asn Ala Val Ala Gly Ala Glu Arg His Val Val His Ile Leu Cys

515 520 525

Leu Gln Phe Val Ile Glu

530

Claims (6)

1.一种利用微生物发酵生产橙花醇的方法，包括将橙花基焦磷酸合成酶基因和橙花醇合成酶的基因中转入微生物体内，得到重组菌株后进行发酵；所述的微生物为选细菌、真菌、放线菌、支原体、藻类、立克次体、螺旋体、衣原体或病毒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因和羟甲基戊二酰辅酶A合成酶的基因转入权利要求1获得的重组菌株后，再进行发酵。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：将异戊烯二磷酸异构酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸激酶的基因转入权利要求1获得的重组菌株或权利要求2获得的菌株后，再进行发酵。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，所述的微生物为大肠杆菌或酵母。

5.根据权利要求1或2或3所述的方法，所述的橙花基焦磷酸合成酶基因、橙花醇合成酶基因、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因、羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因、异戊烯二磷酸异构酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸激酶基因均来源于酿酒酵母。

6.根据权利要求1或2或3所述的方法，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21 (DE3)。