CN112391327A

CN112391327A - 一种用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN112391327A
Application number: CN201910749161.3A
Authority: CN
Inventors: 李依婷; 张汝兵; 刘炜; 咸漠; 杨爱国
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS; Tobacco Research Institute of CAAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS; Tobacco Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-08-14
Filing date: 2019-08-14
Publication date: 2021-02-23
Anticipated expiration: 2039-08-14
Also published as: CN112391327B

Abstract

本发明公开了一种用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌及其构建方法与应用，属于生物工程技术领域。所述工程菌的构建方法包括如下步骤：向能够产生牻牛儿基焦磷酸的受体菌株中导入烟草香叶醇和橙花醇合成酶基因，得到重组菌；从所述重组菌中获得所述用于生产香叶醇和橙花醇的工程菌。本发明成功运用生物工程技术实现了香叶醇和橙花醇生物合成途径的异源重建及产物的联产，摇瓶发酵法香叶醇和橙花醇产量分别达到137.3mg/L和62.8mg/L；同时并通过重组菌株的高密度发酵技术，香叶醇和橙花醇产量分别提高约10倍。

Description

一种用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌及其制备方法与应用。

背景技术

香叶醇(又称牻牛儿醇，学名是反-3，7-甲基-2，6-辛二烯-1-醇，Geraniol)与其同分异构体橙花醇(顺-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醇，Nerol)均是一种非环单萜醇类化合物，是玫瑰油、马丁香油和香茅油等香精油的主要成分之一。香叶醇是玫瑰油的主要成分(约占40％～60％)，具有玫瑰花的香味，是一种名贵的香料。橙花醇具有令人愉快的玫瑰和橙花的香气，香气较平和，微带柠檬样的果香，其香气比香叶醇柔和优美，相对偏清。香叶醇和橙花醇可用于香精和食用香精，是玫瑰系香精的主剂，还可广泛应用于药物、烟草、食品配料。此外，还可用作天然低毒防虫剂，是一类新型的化学防癌制剂。目前国内对香叶醇的年需求量超过1000吨，供不应求，缺口达上百吨。国内橙花醇的需求量也不低于500吨，也存在生产能力不足的问题。

橙花醇和香叶醇可以从天然植物中提取得到，也可通过化学方法合成。目前，大部分产品主要通过化学合成方法，是以月桂烯为原料，在催化剂的作用下与盐酸反应得到月桂烯的一级氯化物，再通过和乙酸钠反应，得乙酸香叶酯和乙酸橙花酯的混合物。然后再经过水解、蒸馏得到香叶醇和橙花醇的混合物，最后再通过精馏分别得到香叶醇和橙花醇产品。此外还可以柠檬醛为原料制备橙花醇和香叶醇，方法包括催化氢化法，醇铝法，硼氢化钠法。尹显洪采用相转移催化法对硼氢化钠法进行改进，用水和苯作混合溶剂替代纯有机溶剂，提高了反应速率。但是，化学合成法存在环境污染、条件苛刻等问题，且化学合成产物“非天然”，作为食品添加剂，消费者的认可度低，影响了产品的下游应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌及其构建方法与应用。

首先，本发明提供了一种用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌，宿主菌为大肠杆菌，在宿主菌中表达烟草来源的香叶醇和橙花醇合成酶TPS2a，所述香叶醇和橙花醇合成酶TPS2a的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述宿主菌还表达牻牛儿基焦磷酸合成酶。

所述香叶醇和橙花醇合成酶TPS2a的编码基因tps2a的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述宿主菌还表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶和异戊烯焦磷酸异构酶。

第二，本发明还提供上述用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)克隆烟草香叶醇和橙花醇合成酶基因tps2a；

(2)表达载体的构建：将橙花醇合成酶基因tps2a连接到pYJM26质粒的BglII和XhoI双酶切位点之间，得到重组质粒pT2a；

(3)重组菌转化：将pYJM14质粒与步骤(2)所得重组质粒pT2a转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌。

步骤(1)具体为：提取烟草叶片组织的RNA，采用逆转录酶将RNA转化为cDNA模板，以逆转录反应得到的cDNA为模板，正向引物为：5'-ATGGCCACCTCCATAAGACCTGCAA-3'，反向引物为：5'-TTATAGGGATGGATTGGGAGTCAAT-3'，进行PCR扩增；凝胶电泳回收片段大小为1854bp的目的基因tps2a。

步骤(2)具体为：将橙花醇合成酶基因tps2a进行TA克隆，连接到

克隆载体中，得到重组质粒pEASY-T2a；以重组质粒pEASY-T2a为模版，采用正向引物T2a-F(5'-GAAGATCTATGGCCACCTCCATAAGACCTGCAA-3')和反向引物T2a-R(5'-CCCTCGAGTTATAGGGATGGATTGGGAGTCAAT-3')进行PCR扩增，凝胶电泳回收片段大小约为1870bp的目的基因片段；将所得目的基因片段与pYJM26质粒分别用BglII和XhoI进行双酶切，回收分别得到外源基因片段和载体片段，将载体与外源片段按摩尔比1:5的比例进行连接，得到重组质粒pT2b。

所述pYJM26质粒，即pACY-mvaE-mvaS-GPPS2质粒，是携带有来源于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(mvaE，GenBankNo.AAG02438)，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(mvaS，GenBankNo.AAG02439)；以及来源于北美冷杉(Abies grandis)的牻牛儿基焦磷酸合成酶基因(GPPS2，GenBankNo.AF513112.1)的pACYCDuet-1。pYJM26的构建方法参见Yang J,etal.Metabolic engineering of Escherichia coli for the biosynthesis of alpha-pinene.Biotechnology for Biofuels,2013,6:60。

所述pYJM14质粒，即pTrc-low质粒，是携带有来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的甲羟戊酸激酶基因(ERG12，GenBankNo.NM_001182715.1)，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因(ERG8，GenBankNO.NM_001182727.1)，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因(ERG19，GenBank NO.X97557.1)，异戊烯焦磷酸异构酶基因(IDI1，GenBank NO.NM_001183931.1)的pTrcHis2B。该质粒的构建方法参见Yang J,et al.Metabolic engineering ofEscherichia coli for the biosynthesis of alpha-pinene.Biotechnology forBiofuels,2013,6:60。

第三，本发明还提供了上述用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌在发酵联产香叶醇和橙花醇中的应用。

上述应用具体为：将构建的用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌接种于一级种子培养基中，培养为一级种子液，一级种子液接种于二级种子培养基中，培养为二级种子液，二级种子液接种于发酵培养基中，发酵培养。

所述一级种子培养基为LB液体培养基(或称LB种子培养基)，一级种子液的培养温度为37℃，培养时间为8-12h。

所述一级种子培养基和二级种子培养基中均含有终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素和终浓度为34μg/mL的氯霉素。

所述二级种子培养基为M9液体培养基(或称M9种子培养基)，一级种子液接种到二级种子培养基中的质量份数为2％wt；二级种子液的培养温度为37℃，培养时间为8-12h。

所述发酵培养基为液体培养基，包括酵母粉、K₂HPO₄·3H₂O、citric acid·H₂O、柠檬酸铁铵、葡萄糖、MgSO₄·7H₂O、1000×微量元素母液、氨苄青霉素、氯霉素。

发酵培养基中各组分含量为：5g/L酵母粉，9.8g/LK₂HPO₄·3H₂O，2.1g/Lcitricacid·H₂O，0.3g/L柠檬酸铁铵，20g/L葡萄糖，0.4g/LMgSO₄·7H₂O；1ml/L的1000×微量元素母液，发酵液中氨苄青霉素和氯霉素终浓度分别为100μg/mL和34μg/mL；发酵培养基pH7.0。

发酵培养基制备方法为：其中：K₂HPO₄·3H₂O 9.8g/L，Citric acid·H₂O 2.1g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，(NH₄)₂SO₄3.0g/L混合后调至pH 7.0，121℃，20min高压蒸气灭菌。1000×微量元素母液采用0.22μm滤菌膜过滤除菌；转接种子液时，发酵培养基中分别补加单独除菌的葡萄糖、MgSO₄·7H₂O、1000×微量元素母液及氨苄青霉素和氯霉素。

所述1000×微量元素母液中含有(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 3.7g/L，ZnSO₄·7H₂O 2.9g/L，H₃BO₃24.7g/L，CuSO₄·5H₂O 2.5g/L，MnCl₂·4H₂O 15.8g/L。

二级种子液接种到发酵培养基中的质量份数为5％wt，在发酵罐中发酵。发酵条件为：5L小型发酵罐，通气量1-2vvm，溶氧0-20％，转速400-1000rpm，37℃培养至OD600为12时添加终浓度为0.3mM的IPTG，用氨水调pH，控制pH在7.0，30℃诱导表达继续发酵48h。发酵过程中维持葡萄糖浓度为0.1-0.5g/L。

有益效果

本发明从烟草中克隆到一种新的香叶醇和橙花醇合成酶TPS2a及其编码基因tps2a，通过在大肠杆菌体内表达烟草单萜合成酶TPS2a，实现了以葡萄糖为原料联产香叶醇和橙花醇的代谢途径，可用于其大量生产，摇瓶发酵香叶醇和橙花醇产量分别达到137.3mg/L和62.89mg/L。同时并通过重组菌株的高密度发酵技术，香叶醇和橙花醇产量分别提高约10倍。该路线原料廉价、可持续供应，具有规模化发展的潜力。

附图说明

图1为目的基因tps2a的PCR电泳图。

图2为香叶醇和橙花醇混合标准品GC图。

图3为橙花醇标准品GC-MS分子碎片质谱图。

图4为香叶醇标准品GC-MS分子碎片质谱图。

图5为工程菌合成出的橙花醇和香叶醇GC-MS图。

图6为工程菌合成出的橙花醇GC-MS分子碎片质谱图。

图7为工程菌合成出的香叶醇GC-MS分子碎片质谱图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

以下实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

香叶醇和橙花醇的检测方法：取发酵液2ml，然后12000g离心1min，取上清1ml并加入等体积乙酸乙酯于涡旋振荡器上混匀5min，然后静置10min，取上层有机相进行过滤后放置在液相小瓶中待测。检测条件：GC-MS仪器型号：岛津TQ8050；离子源：EI；检测器：四级杆；样品检测：取液相小瓶中液体进行检测。GC仪器型号：岛津GC 2010Pro；分离柱型号：DB-5；进样量：1μl；检测器：氢火焰检测器(FID)；柱温：80℃保温2min，然后以30℃/min的速度升温至160℃，接着以3℃/min的速度升温至170℃，最后以50℃/min升温到300℃；取上层有机相进行检测。

质粒：pYJM26，即pACY-mvaE-mvaS-GPPS2，是携带有来源于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(mvaE，GenBank No.AAG02438)，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(mvaS，GenBankNo.AAG02439)；以及来源于北美冷杉(Abiesgrandis)的牻牛儿基焦磷酸合成酶基因(GPPS2，GenBank No.AF513112.1)的pACYCDuet-1。pYJM26为中国科学院青岛生物能源与过程研究所已构建和保存的质粒，其具体构建方法如下：

将采用化学合成的两端含有酶切位点Nco I和Pst I的HMG-CoA还原酶基因(mvaE，GI：9937382)和HMG-CoA合成酶基因(mvaS，GI：9937382)通过限制性内切酶Nco I和Pst I以串联的形式连接到pACYDute-1质粒的第一个多克隆表达位点，得到质粒pACYC-mvaE-mvaS。将化学合成的两端含有酶切位点Bgl II和Xho I的香叶基焦磷酸合成酶基因(GPPS，GI：22535958)，利用限制性内切酶Bgl II和Xho I连接到质粒pACYC-mvaE-mvaS质粒的第二个多克隆表达位点，得到质粒pYJM26。具体构建方法参见专利CN104120148A和文献Yang J,etal.Metabolic engineering ofEscherichia coli for the biosynthesis ofalpha-pinene.Biotechnology for Biofuels,2013,6:60。

pYJM14，即pTrc-low，是携带有来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甲羟戊酸激酶基因(ERG12，GenBank No.NM_001182715.1)，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因(ERG8，GenBank NO.NM_001182727.1)，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因(ERG19，GenBankNO.X97557.1)，异戊烯焦磷酸异构酶基因(IDI1，GenBank NO.NM_001183931.1)的pTrcHis2B。质粒pYJM14为中国科学院青岛生物能源与过程研究所已构建和保存的质粒，具体的构建方法如下：

分别以商品化质粒pTrchis2B质粒(购自Invitrogen)和酿酒酵母(S.cerevisiae)基因组为模板，扩增出质粒pTrchis2B的部分片段SFIBhB，SFB12hB，以及酿酒酵母MVA途径的下游4个基因的片段ERG12(SF128h12，SFB12h12)；ERG8(SF128h8，SF819h8)；ERG19(SF819h19，SF19IhI)；IDI(SF19IhI，SFIBhI)，然后以这些片段或pTrchis2B骨架为模板，通过普通PCR或者重叠PCR扩增出组装质粒的6个SFs片段SF128，SF819，SF19I，SFIB，SFB12，SF。4个基因ERG12，ERG8，ERG19，IDI之间的3个RBS序列是在PCR扩增时，通过设计引物时引入，使得4个基因由单一的trc(trp-lac promoter)启动子作用下进行表达。表1为pTrc-low质粒构建的过程中片段扩增的引物及模板，表2为所用到的引物序列汇总。

表1片段扩增的引物与模板

Table1PCR templates and primers for fragment construction

表2pTrc-low构建引物序列汇总

Table2 Primersequences used to construct pTrc-low

将扩增的6个SFs片段SF128，SF819，SF19I，SFIB，SFB12，SFB按等摩尔比例在1.5mLEP管中混匀，密封后沸水浴使其变性，室温自然冷却(退火)。取适量体积连接液转化大肠杆菌感受态细胞，活化后，取100μL涂布LB平板(Amp抗性)，37℃培养过夜。挑取30个转化子37℃,180rpm振荡培养8h，各取2μL菌液为模板进行菌落PCR扩增鉴定，筛选阳性克隆。经PCR获得的阳性克隆扩大培养后，提取质粒，分别用不同的限制性内切酶进行单酶切和双酶切鉴定，以验证重组质粒的正确性。

具体构建方法还可参见专利CN104120148A和文献Yang J,et al.Metabolicengineering of Escherichia coli for the biosynthesis of alpha-pinene.Biotechnology for Biofuels,2013,6:60。

M9种子培养基(g/L)：20葡萄糖，15.2Na₂HPO₄·12H₂O，3KH₂PO₄，1NH₄Cl，0.5NaCl，0.4MgSO₄，发酵液中氨苄青霉素和氯霉素终浓度分别为100μg/mL和34μg/mL，pH7.0。其中：15.2Na₂HPO₄·12H₂O，3KH₂PO₄，1NH₄Cl，0.5NaCl混合后调至pH 7.0，121℃，20min高压蒸气灭菌。葡萄糖储液为500g/L，115℃，30min单独灭菌；MgSO₄·7H₂O储液为200g/L，121℃，20min单独灭菌；抗生素采用0.22μm滤菌膜过滤除菌；转接种子液时，发酵培养基中分别补加单独除菌的葡萄糖、MgSO₄·7H₂O及抗生素。

发酵培养基(g/L)：5酵母粉，9.8K₂HPO₄·3H₂O，2.1citric acid·H₂O，0.3柠檬酸铁铵，20葡萄糖，0.4MgSO₄·7H₂O；1ml/L的1000×微量元素((NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 3.7g/L，ZnSO₄·7H₂O 2.9g/L，H₃BO₃24.7g/L，CuSO₄·5H₂O 2.5g/L，MnCl₂·4H₂O 15.8g/L)，发酵液中氨苄青霉素和氯霉素终浓度分别为100μg/mL和34μg/mL，pH7.0。其中：K₂HPO₄·3H₂O 9.8g/L，Citric acid·H₂O 2.1g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，(NH₄)₂SO₄3.0g/L混合后调至pH 7.0，121℃，20min高压蒸气灭菌。1000×微量元素采用0.22μm滤菌膜过滤除菌；转接种子液时，发酵培养基中分别补加单独除菌的葡萄糖、MgSO₄·7H₂O、1000×微量元素储液及抗生素。

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

实施例1用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌的构建：

(1)克隆烟草香叶醇和橙花醇合成酶基因tps2a；

具体为：

(1)克隆烟草香叶醇和橙花醇合成酶基因tps2a

提取烟草叶片组织的RNA，采用逆转录酶将RNA转化为cDNA模板，以逆转录反应得到的cDNA为模板，正向引物为：5'-ATGGCCACCTCCATAAGACCTGCAA-3'，反向引物为：5'-TTATAGGGATGGATTGGGAGTCAAT-3'，利用TakaRa公司PrimeSTAR MaxDNA聚合酶进行PCR扩增；PCR条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸5min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，图1的M为DNAmarker DL2000，目的基因TPS2a片段大小为1854bp，符合预期的大小。

(2)表达载体的构建：将橙花醇合成酶基因tps2a连接到pYJM26质粒的BglII和XhoI双酶切位点之间，得到重组质粒pT2a：

采用琼脂糖凝胶电泳胶回收试剂盒的方法回收目的基因片段，将目的片段进行TA克隆，连接到载体

克隆载体中，然后将其转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株中，转化条件为：在100μL感受态细胞中加入5μL连接产物，轻轻混匀后冰浴30min；迅速放入42℃水浴中热激90s，立即置于冰上2-3min；加入800μL LB培养基，37℃慢摇培养1h；将菌液6000rpm离心1min，弃700μL上清，悬浮菌体，涂布于含有氨苄抗生素(Amp，100mg/L)的LB平板上，37℃倒置暗培养12～16h。采用菌落PCR进行阳性克隆筛选，挑选阳性单克隆菌落，提取质粒后送交测序。经测序分析，克隆得到烟草的单萜合成酶基因TPS2a，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其含有1854个碱基，编码的蛋白命名为单萜合成酶TPS2a，共618个氨基酸，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。并由此得到将单萜合成酶基因tps2a插入到

克隆载体的重组质粒，命名为pEASY-T2a。

以质粒pEASY-T2a为模版，采用正向引物T2a-F(5'-GAAGATCTATGGCCACCTCCATAAGACCTGCAA-3')和反向引物T2a-R(5'-CCCTCGAGTTATAGGGATGGATTGGGAGTCAAT-3')进行PCR扩增，PCR扩增条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火15s，72℃延伸30s，以上变性、退火、延伸三步重复进行35个循环后，72℃再延伸5min。利用胶回收试剂盒(购自Omega)回收目的基因片段。将所得基因片段与pYJM26载体分别用BglII和XhoI进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1:5的比例，16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有34mg/L氯霉素(Cm)的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pT2a(pACY-mvaE-mvaS-GPPS2-T2a)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。

(3)重组菌转化：将pYJM14质粒与步骤(2)所得重组质粒pT2a转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素素和氯霉素抗生素的LB固体平板，得到用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌。

发酵产橙花醇和香叶醇

挑取步骤(3)获得的白色单克隆在10ml的LB液体培养基中，于37℃摇床培养活化，作为种子。种子菌浓度OD600为1.0左右时，取扩培后的菌液按1％wt接种量接入100ml发酵培养基中，37℃培养，菌浓度OD600长至0.6左右加入终浓度为0.5mM的IPTG，在30℃继续培养。

产物检测

发酵48h后，取最终发酵液检测产量，GC-MS结果表明(图5)，获得了62.8mg/L的橙花醇和137.3mg/L的香叶醇。

实施例2于联产香叶醇和橙花醇的工程菌在发酵联产香叶醇和橙花醇中的应用：

在LB种子液培养基中接种实施例1中所得固体LB平板上制备得到的工程菌单菌落，并加入终浓度为100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素，37℃生长8-12h，得到一级种子液；将得到的一级种子液分别按2％(wt)接种量转接至500mL发酵摇瓶中，含100mLM9种子培养基，得到二级种子液。将二级种子液按5％wt的接种量接种至含有2L发酵培养基的5L小型发酵罐中，通气量1-2vvm，溶氧控制在0-20％左右，转速400-1000rpm，37℃培养至OD600约为12时，添加终浓度为0.3mM的IPTG，30℃诱导表达，用氨水调pH，控制pH在7.0。得到的香叶醇和橙花醇产物通过GC-MS对其进行定性和定量分析。培养过程中对发酵液中残余葡萄糖进行检测，并通过变速流加浓度为600g/L的糖液，维持发酵液中葡萄糖浓度在0.5g/L以下，IPTG诱导后继续发酵48h。采用与气相色谱连接的在线气体进样对尾气进行进样分析。GC-MS结果表明，获得了607.2mg/L的橙花醇和1405.5mg/L的香叶醇。

以上所述仅为本发明的实施例，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院烟草研究所，中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 一种用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌及其构建方法与应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 618

<212> PRT

<213> 香叶醇和橙花醇合成酶TPS2a

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(618)

<400> 1

1 MetAlaThrSerIleArgProAlaThrProSerLeuSerPhePheSerGlyArgLysAla

21 SerLeuValSerLysAlaLysAlaCysSerMetSerLysAlaAsnSerThrSerProLys

41 AlaGluProProLeuSerHisSerSerIleProThrAsnMetAsnThrHisArgArgSer

61 GlyAsnTyrLysProProThrTrpHisPheGluTyrIleGlnSerIleAsnAsnAspTyr

81 ValGlyAspAsnTyrThrLysArgLeuAsnLysLeuLysGluGluMetArgLysLysLeu

101 LysMetMetAspAspValAspGlyGluGluLeuAspLysLeuGluLeuIleAspAsnLeu

121 GlnArgLeuGlyLeuSerTyrHisPheLysGluGluIlePheGlnIleLeuArgSerIle

141 HisGlnGlnHisIleLeuGlnLysLysGlyArgAsnIleIleAlaGlyGluTyrSerLeu

161 LeuTyrAlaThrAlaLeuLysPheLysLeuLeuArgGluHisAspPheAspIleSerGln

181 AspIleLeuAsnSerPheLysIleGluAsnGlyAsnPheLysGluSerLeuGlyLysAsp

201 ProLysGlyMetLeuGlnLeuTyrGluAlaSerPhePheAlaThrGluThrGluAsnThr

221 LeuLysSerAlaThrArgValThrLysSerGluLeuLysAsnTyrLeuGluAsnTyrGlu

241 HisGlyGluGluAsnIleThrAlaThrLeuValArgHisAlaLeuGluLeuProSerHis

261 TrpMetMetLeuArgLeuGluThrArgTrpPheIleAsnValTyrGluLysMetProAsn

281 AlaAsnProLeuLeuLeuGluLeuAlaLysLeuAspPheAsnIleValGlnAlaThrHis

301 GlnGluGluLeuArgAspValSerArgTrpTrpLysThrThrCysLeuAlaGluLysLeu

321 ProPheSerArgAspArgLeuAlaGluAlaPhePheTrpGlyValGlyIleValPheGlu

341 ProGlnGlnGlyHisCysArgValMetLeuThrLysIleIleAlaPheValThrSerIle

361 AspAspIleTyrAspIleTyrGlyThrTyrProGluLeuLeuPheThrAspAlaValGlu

381 ArgTrpGluLeuThrAlaMetGluGlnLeuProGluTyrMetLysValMetTyrLeuAla

401 LeuPheAsnThrIleAsnGluMetAlaTyrGluValLeuLysGluGlnGlyIleAsnIle

421 LeuProTyrLeuSerLysSerTrpAlaAspLeuCysLysAlaTyrLeuArgGluAlaArg

441 TrpTyrTyrAsnGlyHisLysProThrLeuGlnGluTyrMetAspAsnAlaTrpIleSer

461 IleSerIleProMetIleLeuIleHisAlaPhePheLeuValThrAsnProIleThrLys

481 GluGluLeuGluSerLeuSerLysTyrProAspIleIleArgTrpSerSerThrIlePhe

501 ArgPheValAspAspLeuGlyThrSerSerAspGluLeuLysArgGlyAspValProLys

521 SerIleGlnCysTyrIleAsnGluLysGlyValSerGluGluGluAlaArgGluArgIle

541 GlnHisLeuIleLysGluThrTrpGluMetMetAsnLysAlaGlnArgGluAsnLeuLeu

561 PheSerArgIlePheValGluIleAlaLysAsnIleAlaArgThrAlaGlnCysMetTyr

581 LeuHisGlyAspGlyHisGlyIleGlnAsnAlaGluIleLysAsnSerIleSerLysIle

601 LeuPheGluHisIleThrValProAsnProLeuThrProAsnProSerLeu***

<210> 2

<211> 1854

<212> DNA

<213> 香叶醇和橙花醇合成酶TPS2a的编码基因tps2a

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(1854)

<400> 2

atggccacct ccataagacc tgcaactcct tctctttcct ttttcagtgg tagaaaggca 60

tcacttgtat caaaagccaa agcctgcagc atgtctaaag ctaattccac tagtccaaaa 120

gctgaaccac cattgagtca cagctctatt cccacaaata tgaataccca taggcgttct 180

gggaattaca aacctcctac atggcatttc gaatatatcc aatccattaa caatgattat 240

gtgggagaca actatacgaa gcgattaaat aaactgaagg aggaaatgcg gaagaagttg 300

aagatgatgg acgatgttga tggagaagaa ttagacaagc tggagctgat tgacaactta 360

caaagacttg gactgagtta ccacttcaag gaagaaatct ttcaaatttt gagaagcata 420

caccaacaac atatattaca gaagaagggc agaaacataa tcgcgggaga atattcatta 480

ttatacgcta cagctttgaa atttaaactc ttgagagaac atgattttga tatttctcaa 540

gatatattga acagtttcaa gattgagaac ggtaatttca aggaaagtct tggtaaagac 600

ccaaaaggaa tgttgcaatt gtacgaagct tcgttttttg ctacagaaac agaaaacact 660

ttgaaatccg ctacaagagt cacaaagtcg gagctgaaga attatcttga aaattatgaa 720

cacggtgagg agaatataac agcaacatta gtccgccatg cattggaact cccttcgcat 780

tggatgatgt tgagattaga gacaagatgg ttcataaacg tttatgagaa aatgccaaac 840

gctaatcctc ttctgcttga gcttgccaag ttggacttca acattgttca agcaacacat 900

caagaagaat taagagatgt atcaaggtgg tggaagacca catgcctggc agagaagttg 960

ccattttcaa gggacagact agcggaggct ttcttttggg gagtagggat agtatttgag 1020

cctcaacaag gacattgccg agtaatgctg acaaagatca ttgcttttgt tacatccatt 1080

gatgatattt atgatattta tgggacttat cctgagttac tcttcactga tgctgtagaa 1140

agatgggagc taacagcaat ggagcaactt ccggaataca tgaaagtaat gtaccttgcg 1200

ctgttcaaca caatcaatga aatggcatat gaagttctaa aagagcaggg tatcaacatc 1260

ctaccctacc tttcaaaatc atgggcagat ttgtgcaaag cttatttacg agaagcaaga 1320

tggtactata atggacataa gccaactctg caagaataca tggataacgc atggatctca 1380

atttcaattc ctatgatatt aatccacgca ttcttcttag ttaccaaccc aattaccaaa 1440

gaggaattgg aatcactaag caagtaccca gacataattc gctggtcttc aacaattttt 1500

cgcttcgtcg atgatttagg gacatcatct gatgaattga agagggggga cgttccaaaa 1560

tctatacagt gttacataaa cgaaaagggt gtttccgaag aagaggcaag agaacgcata 1620

caacatttga taaaggagac atgggaaatg atgaacaaag ctcagagaga aaacttgcta 1680

ttttctagaa tatttgttga aatcgcaaag aatattgcaa gaacggcaca gtgcatgtat 1740

ctgcatggag atgggcatgg aattcaaaac gctgaaatta aaaatagcat atccaaaata 1800

ctttttgagc atatcacagt tcctaatcca ttgactccca atccatccct ataa 1854

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 正向引物

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(25)

<400> 3

atggccacct ccataagacc tgcaa 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 反向引物

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(25)

<400> 4

ttatagggat ggattgggag tcaat 25

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 正向引物T2a-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(33)

<400> 5

gaagatctat ggccacctcc ataagacctg caa 33

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 反向引物T2a-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(33)

<400> 6

ccctcgagtt atagggatgg attgggagtc aat 33

Claims

1.一种用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌，其特征在于：宿主菌为大肠杆菌，在宿主菌中表达烟草来源的香叶醇和橙花醇合成酶TPS2a，所述香叶醇和橙花醇合成酶TPS2a的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述宿主菌还表达牻牛儿基焦磷酸合成酶基因(GPPS2，GenBank No.AF513112.1)。

2.根据权利要求1所述的用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌，其特征在于：所述香叶醇和橙花醇合成酶TPS2a的编码基因tps2a的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌，其特征在于：所述宿主菌还表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(mvaE，GenBankNo.AAG02438)、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(mvaS，GenBankNo.AAG02439)、甲羟戊酸激酶基因(ERG12，GenBankNo.NM_001182715.1)、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因(ERG8，GenBankNO.NM_001182727.1)、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因(ERG19，GenBank NO.X97557.1)和异戊烯焦磷酸异构酶基因(IDI1，GenBankNO.NM_001183931.1)。

4.一种权利要求1-3任一项所述的用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)克隆烟草香叶醇和橙花醇合成酶基因tps2a，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

5.根据权利要求4所述的用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌的构建方法，其特征在于：步骤(1)具体为：提取烟草叶片组织的RNA，采用逆转录酶将RNA转化为cDNA模板，以逆转录反应得到的cDNA为模板，正向引物为：5'-ATGGCCACCTCCATAAGACCTGCAA-3'，反向引物为：5'-TTATAGGGATGGATTGGGAGTCAAT-3'，进行PCR扩增；凝胶电泳回收片段大小为1854bp的目的基因tps2a。

6.根据权利要求4所述的用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌的构建方法，其特征在于：步骤(2)具体为：将橙花醇合成酶基因tps2a进行TA克隆，连接到

克隆载体中，得到重组质粒pEASY-T2a；以重组质粒pEASY-T2a为模版，采用正向引物T2a-F(5'-GAAGATCTATGGCCACCTCCATAAGACCTGCAA-3')和反向引物T2a-R(5'-CCCTCGAGTTATAGGGATGGATTGGGAGTCAAT-3')进行PCR扩增，凝胶电泳回收片段大小约为1870bp的目的基因片段；将所得目的基因片段与pYJM26质粒分别用BglII和XhoI进行双酶切，回收分别得到外源基因片段和载体片段，将载体与外源片段按摩尔比1:5的比例进行连接，得到重组质粒pT2a。

7.根据权利要求6所述的用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌的构建方法，其特征在于：所述pYJM26质粒，携带有来源于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(mvaE，GenBank No.AAG02438)，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(mvaS，GenBank No.AAG02439)；以及来源于北美冷杉(Abies grandis)的牻牛儿基焦磷酸合成酶基因(GPPS2，GenBank No.AF513112.1)。

8.根据权利要求4所述的用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌的构建方法，其特征在于：所述pYJM14质粒，携带有来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甲羟戊酸激酶基因(ERG12，GenBank No.NM_001182715.1)，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因(ERG8，GenBankNO.NM_001182727.1)，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因(ERG19，GenBank NO.X97557.1)，异戊烯焦磷酸异构酶基因(IDI1，GenBank NO.NM_001183931.1)的pTrcHis2B。

9.一种权利要求1-3任一项所述的用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌在发酵联产香叶醇和橙花醇中的应用。

10.根据权利要求9所述的用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌在发酵联产香叶醇和橙花醇中的应用，其特征在于：将构建的用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌接种于一级种子培养基中，培养为一级种子液，一级种子液接种于二级种子培养基中，培养为二级种子液，二级种子液接种于发酵培养基中，发酵培养。