CN113215131A

CN113215131A - 磷酸水解酶及其应用

Info

Publication number: CN113215131A
Application number: CN202110625731.5A
Authority: CN
Inventors: 赵广荣; 雷登伟
Original assignee: Georgia Institute Of Technology Tianjin University Shenzhen
Current assignee: Georgia Institute Of Technology Tianjin University Shenzhen
Priority date: 2021-06-04
Filing date: 2021-06-04
Publication date: 2021-08-06
Anticipated expiration: 2041-06-04
Also published as: CN113215131B

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及磷酸水解酶及其应用。本发明成功构建了大肠杆菌(Escherichia coli)来源的一种磷酸水解酶NudJ的重组表达载体。应用这种磷酸水解酶，其氨基酸序列用SEQ ID No.1所示，极大提高了单萜醇橙花醇和冰片的生物合成产量。

Description

磷酸水解酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及磷酸水解酶及其应用。

背景技术

橙花醇和冰片是重要的单萜醇类化合物。橙花醇(Nerol)，化学名为3,7-二甲基-2,6-辛二烯醇，是一种非环化的单萜醇；而冰片(Borneol)，别称龙脑，化学名为1,7,7-三甲基双环[2.2.1]庚-2-醇，是一种双环结构的单萜醇。橙花醇和冰片可作为香精香料，添加于食品、化妆品和日化清洁品等产品中。此外，冰片是传统中药天然冰片和合成冰片的主要成分，能够用于热病神昏、惊厥、中风痰厥、胸痹心痛、咽喉肿痛等的治疗；冰片也是TRPM8受体的激活剂，能够用于术后镇痛和干眼治疗；冰片具有对人体血脑屏障(BBB)的调节作用和促渗透性，已被添加于速效救心丸、复方丹参片，以及右旋莰醇与依达拉奉的复方制剂等药品中治疗心脑疾病。

橙花醇和冰片具有广泛的应用，全球每年对橙花醇的需求约为5000吨左右。橙花醇是由一分子橙花基焦磷酸(NPP)直接去焦磷酸化合成，而冰片先由冰片基焦磷酸合成酶(Bornyl Diphosphate Synthase,BPPS)催化一分子牻牛儿基焦磷酸(GPP)或一分子NPP生成冰片基焦磷酸(BPP)中间体，再通过BPP中间体去焦磷酸化合成。但是，目前发现的催化NPP去焦磷酸化反应的橙花醇合成酶活性低，而催化冰片合成中BPP去焦磷酸化反应的酶还未发现，异戊烯焦磷酸前体的去焦磷酸化过程严重限制了橙花醇和冰片生物合成的产量。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了磷酸水解酶及其应用，通过采用所述的磷酸水解酶可以提高生物合成单萜醇橙花醇和冰片的产量。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了酶，其具有：

(I)、如SEQ ID No.1、11、3、8中任意所示的氨基酸序列；或

(II)、如(I)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或(III)、与如(I)或(II)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列；

在本发明的一些具体实施方案中，所述取代、缺失或添加一个或多个氨基酸中的多个为2个、3个、4个或5个。

在本发明的一些具体实施方案中，所述酶包括磷酸水解酶NudJ，其具有如SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列；和/或

所述酶包括酶NudC，其具有如SEQ ID No.11所示的氨基酸序列。

本发明还提供了编码所述酶的核酸分子。

在本发明的一些具体实施方案中，编码所述酶的核酸分子具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

(Ⅱ)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或

(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(Ⅳ)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或两个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

(V)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)或(Ⅳ)所述核苷酸序列具有至少90％序列一致性的核苷酸序列。

本发明还提供了表达载体，包括所述的核酸分子。

本发明还提供了重组菌株，包括所述酶、所述的核酸分子或所述的表达载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株包括大肠杆菌(Escherichiacoli)。

本发明还提供了所述酶、所述的核酸分子或所述的表达载体在合成单萜醇橙花醇和/或冰片中的应用。

本发明还提供了合成单萜醇橙花醇和/或冰片的方法，取所述的重组菌株培养、发酵，收集发酵液，纯化，获得单萜醇橙花醇和/或冰片。

本发明成功构建了大肠杆菌(Escherichia coli)来源的一种磷酸水解酶NudJ的重组表达载体。应用这种磷酸水解酶，其氨基酸序列用SEQ ID No.1所示，极大提高了单萜醇橙花醇和冰片的生物合成产量。

具体实施方式

本发明公开了磷酸水解酶及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明所使用的是大肠杆菌E.coliBW25113(DE3)菌株。下述实施例中涉及的大肠杆菌E.coliDH5α菌株购买自北京全式金生物技术有限公司；所用的表达载体pRSFDuet-1、pETDuet-1和pCDFDuet-1均来源于金斯瑞生物科技股份有限公司；所用Seamless CloningMix同源重组试剂盒购买自博迈德生物技术有限公司。

下述实施例中培养基配方：

LB液体培养基：10g/LNaCl、10g/L蛋白胨和5g/L酵母粉，余量为水，0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。LB固体培养基再加1.5％(w/v)琼脂粉。

M9Y液体培养基：无水Na₂HPO₄6.78 g/L，KH₂PO₄3 g/L，NH₄Cl 1g/L，NaCl 0.5g/L，酵母粉2g/L，余量为水，0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。灭菌后加入灭菌的MgSO₄0.24 g/L，CaCl₂11.1 mg/L，葡萄糖10g/L。抗生素浓度分别为，氨苄青霉素100μg/L；硫酸卡那霉素50μg/L。母液1M MgSO₄和1M CaCl₂在121℃下灭菌20min，50％Glucose母液在高压下115℃灭菌15min。

实施例中涉及的橙花醇和冰片检测方法：

工程菌株发酵结束后，取5mL发酵液于15mL离心管中，加入2mL乙酸乙酯，在MIX-2500迷你混合仪上振荡60min，7500rpm离心5min。离心后，取上层有机相1mL，用适量无水硫酸钠脱水，经0.22μm有机系微孔滤膜过滤后进行气相色谱(GC)检测。所用气相色谱为Agilent 7820A气相色谱，采用火焰离子化检测器(FID)，色谱柱型号为HP-5(30m×0.25mm,0.25μm filmthickness)。检测条件为：进样量1μL；分流比为10:1；氮气流速为3mL/min；进样口温度为250℃，检测器温度270℃。升温程序为：100℃，保持1min；以15℃/min速率升到250℃；之后250℃维持5min；320℃后运行5min。

本发明提供的磷酸水解酶及其应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1构建磷酸水解酶的表达载体和重组菌株

利用在pRSFDuet-1载体上第一套T7启动子之后连接了经S488T突变改造的甜舌草(Phyla dulcis)来源的冰片基焦磷酸合成酶PdtBPPSS488T基因和第二套T7启动子之后连接了SltNPPS基因的质粒pENB为基本骨架，质粒序列见SEQ ID No.2，将磷酸水解酶基因连接在PdtBPPS基因之后，构建磷酸水解酶的重组表达载体和重组菌株。具体步骤如下：

步骤1.构建磷酸水解酶RdgB的表达载体和重组菌株，酶RdgB的氨基酸序列特征如SEQ ID No.3所示。首先分别设计克隆rdgB基因两端的引物RdgB-F和RdgB-R；pENB载体和RdgB基因两端连接处的引物NBP-F和NBP-R。引物的序列和编号见表1。以大肠杆菌E.coliBW25113(DE3)菌株为模板，利用引物对RdgB-F/RdgB-R进行PCR扩增rdgB目的基因片段；以质粒pENB为模板，利用引物对NBP-F/NBP-R扩增包含SltNPPS和PdtBPPSS488T基因的载体片段。PCR扩增程序为95℃变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃加强延伸10min，降至4℃。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳验证、纯化回收后，用SeamlessCloningMix同源重组试剂盒进行连接。同源重组体系共10μL，包括载体片段3.5μL，目的基因片段共1.5μL，2×Seamless Cloning Mix 5μL。反应条件为50℃，15min。将连接产物热转化至E.coliDH5α感受态细胞，感受态在卡那霉素抗性的LB固体培养基培养过夜后，挑取单菌落在卡那霉素抗性的LB液体培养基中培养并提取质粒，测序确认构建正确，得到重组表达载体pNBP1。

同时，设计全长的Enterococcus faecalis来源的EfmvaE基因(AAG02439.1)，以及全长的Enterococcus faecalis来源的EfmvaS基因(WP_002357756.1)并在EfmvaS基因中引入A110G突变，分别将EfmvaE基因和EfmvaSA110G基因连接在pETDuet-1质粒的第一套和第二套T7启动子后，全人工合成，得到萜类合成甲羟戊酸途径上游模块的质粒载体pMAP。设计全长的Methanosarcina mazei来源的MmMK基因(WP_011033702.1)，以及全长的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C来源的ERG8(NP_013947.1),ERG19(P32377.2)和IDI1(NP_015208.1)基因，将这些基因先后连接在pCDFDuet-1质粒的第一套T7启动子后，全人工合成，得到萜类合成甲羟戊酸途径下游模块的质粒载体pISP。

将质粒pNBP1、pMAP和pISP同时电击转化至大肠杆菌E.coli BW25113(DE3)感受态中，在含氨苄、链霉和卡那霉素三抗压力下培养并筛选阳性克隆，得到重组菌株NBP1。同样，将质粒pENB、pMAP和pISP同时电击转化至大肠杆菌E.coli BW25113(DE3)感受态中，筛选得到对照菌株NBP0。

步骤2.采用与步骤1相同的策略，构建磷酸水解酶PhoA的表达载体pNBP2，酶PhoA的氨基酸序列特征如SEQ ID No.8所示。其中，以大肠杆菌E.coli BW25113(DE3)菌株为模板，利用引物对PhoA-F/PhoA-R进行PCR扩增phoA目的基因片段；以质粒pENB为模板，利用引物对PNJ-F/PNBJ-R扩增包含PdtBPPSS488T基因和SltNPPS基因的载体片段(见表1)。

将质粒pNBP2、pMAP和pISP同时电击转化至大肠杆菌E.coliBW25113(DE3)感受态中，在含氨苄、链霉和卡那霉素三抗压力下培养并筛选阳性克隆，得到重组菌株NBP2。

步骤3.采用与步骤1相同的策略，构建磷酸水解酶NudC的表达载体pNBP3，酶NudC的氨基酸序列特征如SEQ ID No.11所示。其中，以大肠杆菌E.coli BW25113(DE3)菌株为模板，利用引物对NudC-F/NudC-R进行PCR扩增nudC目的基因片段；以质粒pENB为模板，利用引物对PNJ-F/PNBJ-R扩增包含PdtBPPSS488T基因和SltNPPS基因的载体片段(见表1)。

将质粒pNBP3、pMAP和pISP同时电击转化至大肠杆菌E.coli BW25113(DE3)感受态中，在含氨苄、链霉和卡那霉素三抗压力下培养并筛选阳性克隆，得到重组菌株NBP3。

4.采用与实施例1相同的策略，构建磷酸水解酶NudJ的表达载体pNBP4，酶NudJ的氨基酸序列特征如SEQ ID No.1所示。其中，以大肠杆菌E.coli BW25113(DE3)菌株为模板，利用引物对NudJ-F/NudJ-R进行PCR扩增nudJ目的基因片段；以质粒pENB为模板，利用引物对PNJ-F/PNBJ-R扩增包含PdtBPPSS488T基因和SltNPPS基因的载体片段(见表1)。

将质粒pNBP4、pMAP和pISP同时电击转化至大肠杆菌E.coli BW25113(DE3)感受态中，在含氨苄、链霉和卡那霉素三抗压力下培养并筛选阳性克隆，得到重组菌株NBP4。

表1引物序列

实施例2重组菌株生物合成橙花醇或冰片

将重组菌株NBP0、NBP1、NBP2、NBP3和NBP4按1％接种比例分别接种在含氨苄、链霉和卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm，震荡培养12h。将培养后的菌种转接到M9Y发酵培养基中，接种值控制为0.1，添加氨苄、链霉和卡那霉素，以及1mM MgSO₄、0.1mM CaCl₂和10g/L葡萄糖，30℃，250rpm培养。当菌株生长到OD₆₀₀值在1.0-1.2时，加入0.5mM IPTG，继续发酵60h后检测橙花醇和冰片的量。

通过气相色谱对对照菌株NBP0和重组菌株NBP1-NBP4的检测，发现对照菌株NBP0合成10.59mg/L橙花醇和10.27mg/L冰片。重组菌株NBP1-NBP4中橙花醇产量相较于对照菌株增加25％以上，尤其利用磷酸水解酶NudJ，橙花醇产量提高17倍，达到185.54mg/L。但利用磷酸水解酶RdgB和PhoA，冰片合成分别降低5％和23％，利用磷酸水解酶NudC，冰片合成提高59％，而利用磷酸水解酶NudJ，冰片产量显著提高到28.26mg/L，是对照菌株NBP0的2.75倍(详见表2)。

表2磷酸水解酶对橙花醇合成的影响

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学佐治亚理工深圳学院

<120> 磷酸水解酶及其应用

<130> MP21005450

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 5

<211> 153

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Phe Lys Pro His Val Thr Val Ala Cys Val Val His Ala Glu Gly

1 5 10 15

Lys Phe Leu Val Val Glu Glu Thr Ile Asn Gly Lys Ala Leu Trp Asn

20 25 30

Gln Pro Ala Gly His Leu Glu Ala Asp Glu Thr Leu Val Glu Ala Ala

35 40 45

Ala Arg Glu Leu Trp Glu Glu Thr Gly Ile Ser Ala Gln Pro Gln His

50 55 60

Phe Ile Arg Met His Gln Trp Ile Ala Pro Asp Lys Thr Pro Phe Leu

65 70 75 80

Arg Phe Leu Phe Ala Ile Glu Leu Glu Gln Ile Cys Pro Thr Gln Pro

85 90 95

His Asp Ser Asp Ile Asp Cys Cys Arg Trp Val Ser Ala Glu Glu Ile

100 105 110

Leu Gln Ala Ser Asn Leu Arg Ser Pro Leu Val Ala Glu Ser Ile Arg

115 120 125

Cys Tyr Gln Ser Gly Gln Arg Tyr Pro Leu Glu Met Ile Gly Asp Phe

130 135 140

Asn Trp Pro Phe Thr Lys Gly Val Ile

145 150

<210> 2

<211> 6193

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60

gagatatacc atgagcagcc aatacaccgc tggtcgtcgt agcggtaatt atgaagcaaa 120

catgtgggat tttgactaca tccaaagcag cagcagccag ttcaccgaag atcgttatct 180

ggaacgtgcg agcgaactgg ttgtgcaggt taaaaagctg ctggaagaag aactgaccga 240

accgattcaa cagctggaac tgatcgatga cctgcaaaat atgggtgtta gctatcactt 300

tgaagacgaa attaaacaga tcctgaagag catgtacgat gaccgtgtta aaaagtacaa 360

cagcaaggat agcaagaacg tgcgtgacct gtacagcacc gctctggaat ttcgtctgag 420

ccgtcaacat ggtttcacca ttagccagga agttttcgat tgcttcaaga acaacaaggg 480

tggttttgaa gcaagcctgg cggaagacac ccgtggtctg ctgcaactgt acgaagcaag 540

cttcatgctg atggaaggtg aagaaaccct ggaacaggct aaagaatttg caaccagctt 600

cctgctgaaa aagctggaag atgacaccaa gcacggtatc ctggttgatg aaaatctgag 660

cctgagcgtg tttcatgctc tggaactgcc gatccactgg cgtacccaac gtcataacgc 720

acgttggttc attgatgcgt atgaaaaacg tagcaatcgt aacagcgttg tgctggaact 780

ggcgaaggtt gacttcaata ttgtgcaagc tacctaccaa caggaaatta aacacatcag 840

ccgttggtgg gagcagaccc gtctggctga aaagctgccg tttgcacgtg atcgtctggt 900

tgaaaacttc ctgtggaccg tgggttggct gcgtgaaccg caatacggtt atgcacgtat 960

catgtgcacc aaactgttta ttttcatcac ctacgttgat gacatttttg acgtgtatgg 1020

taccctggaa gaactgcagc tgttccgtga tgttattcgt cgttgggaca tcgaagcgat 1080

gggtcaactg ccgaattata tgcagatgtg ttttctggca attgataatt tcatcaacga 1140

aatggcgtac gacgttctga aagaacaaga atttgtgatt atcccgcatc tgcgtaagat 1200

gtgggctgat ctgtgcacca gctattgtca ggaagcagaa tggtactata acaagtacat 1260

gccgaccatg gacgaatata ttaataacgc gtgcattagc atcagcaccc cgctgatcct 1320

gagcaatacc tactttgttg tgaccaaccc gattgaagaa gaagttgtgc aaaacttcta 1380

caagaacccg gatgttgtgc gttatagcgc gatgatcctg cgtctggctg atgacctggg 1440

taccagcgaa tttgaagcag aacgtggtga cgttccgaag gcgattgaat gttatatgaa 1500

cgaaagcggt gcgagccgtg aagaagctcg tgaacacgtg aaattcatga tttgggaagc 1560

gtggaaaaag atcaataagg aactgctgag caacgctagc ttcccgcaat ttttcctgcg 1620

taatgcggct gatctgggtc gtgctggtca attcatgtac cagcatggtg acggtttcgg 1680

tgttaacccg catcaccata aagaagacgt gagcaccctg tttttcgaac cgctgtaaga 1740

attcctgttc gaaccattcg cctaaaagct tgcggccgca taatgcttaa gtcgaacaga 1800

aagtaatcgt attgtacacg gccgcataat cgaaattaat acgactcact ataggggaat 1860

tgtgagcgga taacaattcc ccatcttagt atattagtta agtataagaa ggagatatac 1920

atatgtctgc tagaggtttg aacaagattt cgtgcagctt gaacttgcaa actgaaaagt 1980

tgtgttacga agataacgat aacgatttgg atgaagaatt gatgccaaag cacattgctt 2040

tgatcatgga tggtaacaga agatgggcta aggataaggg tttggaagtt tacgaaggtc 2100

acaagcacat tattccaaag ttgaaggaaa tttgtgacat ttcttctaag ttgggtatcc 2160

aaattatcac tgctttcgct ttctctactg aaaactggaa gagatccaag gaagaagttg 2220

atttcttgtt gcaaatgttc gaagaaatct acgatgaatt ttctcgttcg ggtgttagag 2280

tttctattat cggttgtaag tccgacttgc caatgacttt gcaaaagtgt atcgctttga 2340

ctgaagaaac tactaagggt aacaagggtt tgcacttggt tattgctttg aactacggtg 2400

gttactacga catcttgcaa gctactaagt ctattgttaa caaggctatg aacggtttgt 2460

tggatgttga agatatcaac aagaacttgt tcgatcaaga attggaatct aagtgtccaa 2520

acccagattt gttgatcaga actggtggtg aacaaagagt ttctaacttc ttgttgtggc 2580

aattggctta cactgaattt tacttcacca acactttgtt cccagatttc ggtgaagaag 2640

atttgaagga agctatcatg aacttccaac aaagacacag aagattcggt ggtcacactt 2700

actaactcga gagatctctg cagtctggta aagaaaccgc tgctgcgaaa tttgaacgcc 2760

agcacatgga ctcgtctact agcgcagctt aattaaccta ggctgctgcc accgctgagc 2820

aataactagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttgctgaaac 2880

ctcaggcatt tgagaagcac acggtcacac tgcttccggt agtcaataaa ccggtaaacc 2940

agcaatagac ataagcggct atttaacgac cctgccctga accgacgaca agctgacgac 3000

cgggtctccg caagtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt 3060

ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgaattaat tcttagaaaa actcatcgag 3120

catcaaatga aactgcaatt tattcatatc aggattatca ataccatatt tttgaaaaag 3180

ccgtttctgt aatgaaggag aaaactcacc gaggcagttc cataggatgg caagatcctg 3240

gtatcggtct gcgattccga ctcgtccaac atcaatacaa cctattaatt tcccctcgtc 3300

aaaaataagg ttatcaagtg agaaatcacc atgagtgacg actgaatccg gtgagaatgg 3360

caaaagttta tgcatttctt tccagacttg ttcaacaggc cagccattac gctcgtcatc 3420

aaaatcactc gcatcaacca aaccgttatt cattcgtgat tgcgcctgag cgagacgaaa 3480

tacgcggtcg ctgttaaaag gacaattaca aacaggaatc gaatgcaacc ggcgcaggaa 3540

cactgccagc gcatcaacaa tattttcacc tgaatcagga tattcttcta atacctggaa 3600

tgctgttttc ccggggatcg cagtggtgag taaccatgca tcatcaggag tacggataaa 3660

atgcttgatg gtcggaagag gcataaattc cgtcagccag tttagtctga ccatctcatc 3720

tgtaacatca ttggcaacgc tacctttgcc atgtttcaga aacaactctg gcgcatcggg 3780

cttcccatac aatcgataga ttgtcgcacc tgattgcccg acattatcgc gagcccattt 3840

atacccatat aaatcagcat ccatgttgga atttaatcgc ggcctagagc aagacgtttc 3900

ccgttgaata tggctcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 3960

ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggcatgca 4020

gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctacgctcg gtcgttcgac tgcggcgagc 4080

ggtgtcagct cactcaaaag cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataaagccgg 4140

aaagaacatg tgagcaaaaa gcaaagcacc ggaagaagcc aacgccgcag gcgtttttcc 4200

ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagccag aggtggcgaa 4260

acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 4320

ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 4380

cgctttctca tagctcacgc tgttggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 4440

tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 4500

gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc attggtaact 4560

gatttagagg actttgtctt gaagttatgc acctgttaag gctaaactga aagaacagat 4620

tttggtgagt gcggtcctcc aacccactta ccttggttca aagagttggt agctcagcga 4680

accttgagaa aaccaccgtt ggtagcggtg gtttttcttt atttatgaga tgatgaatca 4740

atcggtctat caagtcaacg aacagctatt ccgttactct agatttcagt gcaatttatc 4800

tcttcaaatg tagcacctga agtcagcccc atacgatata agttgtaatt ctcatgttag 4860

tcatgccccg cgcccaccgg aaggagctga ctgggttgaa ggctctcaag ggcatcggtc 4920

gagatcccgg tgcctaatga gtgagctaac ttacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg 4980

ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga 5040

gaggcggttt gcgtattggg cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga gacgggcaac 5100

agctgattgc ccttcaccgc ctggccctga gagagttgca gcaagcggtc cacgctggtt 5160

tgccccagca ggcgaaaatc ctgtttgatg gtggttaacg gcgggatata acatgagctg 5220

tcttcggtat cgtcgtatcc cactaccgag atgtccgcac caacgcgcag cccggactcg 5280

gtaatggcgc gcattgcgcc cagcgccatc tgatcgttgg caaccagcat cgcagtggga 5340

acgatgccct cattcagcat ttgcatggtt tgttgaaaac cggacatggc actccagtcg 5400

ccttcccgtt ccgctatcgg ctgaatttga ttgcgagtga gatatttatg ccagccagcc 5460

agacgcagac gcgccgagac agaacttaat gggcccgcta acagcgcgat ttgctggtga 5520

cccaatgcga ccagatgctc cacgcccagt cgcgtaccgt cttcatggga gaaaataata 5580

ctgttgatgg gtgtctggtc agagacatca agaaataacg ccggaacatt agtgcaggca 5640

gcttccacag caatggcatc ctggtcatcc agcggatagt taatgatcag cccactgacg 5700

cgttgcgcga gaagattgtg caccgccgct ttacaggctt cgacgccgct tcgttctacc 5760

atcgacacca ccacgctggc acccagttga tcggcgcgag atttaatcgc cgcgacaatt 5820

tgcgacggcg cgtgcagggc cagactggag gtggcaacgc caatcagcaa cgactgtttg 5880

cccgccagtt gttgtgccac gcggttggga atgtaattca gctccgccat cgccgcttcc 5940

actttttccc gcgttttcgc agaaacgtgg ctggcctggt tcaccacgcg ggaaacggtc 6000

tgataagaga caccggcata ctctgcgaca tcgtataacg ttactggttt cacattcacc 6060

accctgaatt gactctcttc cgggcgctat catgccatac cgcgaaaggt tttgcgccat 6120

tcgatggtgt ccgggatctc gacgctctcc cttatgcgac tcctgcatta ggaaattaat 6180

acgactcact ata 6193

<210> 3

<211> 197

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Gln Lys Val Val Leu Ala Thr Gly Asn Val Gly Lys Val Arg Glu

1 5 10 15

Leu Ala Ser Leu Leu Ser Asp Phe Gly Leu Asp Ile Val Ala Gln Thr

20 25 30

Asp Leu Gly Val Asp Ser Ala Glu Glu Thr Gly Leu Thr Phe Ile Glu

35 40 45

Asn Ala Ile Leu Lys Ala Arg His Ala Ala Lys Val Thr Ala Leu Pro

50 55 60

Ala Ile Ala Asp Asp Ser Gly Leu Ala Val Asp Val Leu Gly Gly Ala

65 70 75 80

Pro Gly Ile Tyr Ser Ala Arg Tyr Ser Gly Glu Asp Ala Thr Asp Gln

85 90 95

Lys Asn Leu Gln Lys Leu Leu Glu Thr Met Lys Asp Val Pro Asp Asp

100 105 110

Gln Arg Gln Ala Arg Phe His Cys Val Leu Val Tyr Leu Arg His Ala

115 120 125

Glu Asp Pro Thr Pro Leu Val Cys His Gly Ser Trp Pro Gly Val Ile

130 135 140

Thr Arg Glu Pro Ala Gly Thr Gly Gly Phe Gly Tyr Asp Pro Ile Phe

145 150 155 160

Phe Val Pro Ser Glu Gly Lys Thr Ala Ala Glu Leu Thr Arg Glu Glu

165 170 175

Lys Ser Ala Ile Ser His Arg Gly Gln Ala Leu Lys Leu Leu Leu Asp

180 185 190

Ala Leu Arg Asn Gly

195

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctcacttac ataaggagca tcgatatgca aaaagttgtc ctcgcaac 48

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggttcgaaca ggaattctta accattacgt aaagcgtcca gca 43

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agaattcctg ttcgaaccat tcgcctaaaa gc 32

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctccttatgt aagtgaggca aaattatttc tacaggggaa ttgttatcc 49

<210> 8

<211> 471

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr

1 5 10 15

Pro Val Thr Lys Ala Arg Thr Pro Glu Met Pro Val Leu Glu Asn Arg

20 25 30

Ala Ala Gln Gly Asp Ile Thr Ala Pro Gly Gly Ala Arg Arg Leu Thr

35 40 45

Gly Asp Gln Thr Ala Ala Leu Arg Asp Ser Leu Ser Asp Lys Pro Ala

50 55 60

Lys Asn Ile Ile Leu Leu Ile Gly Asp Gly Met Gly Asp Ser Glu Ile

65 70 75 80

Thr Ala Ala Arg Asn Tyr Ala Glu Gly Ala Gly Gly Phe Phe Lys Gly

85 90 95

Ile Asp Ala Leu Pro Leu Thr Gly Gln Tyr Thr His Tyr Ala Leu Asn

100 105 110

Lys Lys Thr Gly Lys Pro Asp Tyr Val Thr Asp Ser Ala Ala Ser Ala

115 120 125

Thr Ala Trp Ser Thr Gly Val Lys Thr Tyr Asn Gly Ala Leu Gly Val

130 135 140

Asp Ile His Glu Lys Asp His Pro Thr Ile Leu Glu Met Ala Lys Ala

145 150 155 160

Ala Gly Leu Ala Thr Gly Asn Val Ser Thr Ala Glu Leu Gln Asp Ala

165 170 175

Thr Pro Ala Ala Leu Val Ala His Val Thr Ser Arg Lys Cys Tyr Gly

180 185 190

Pro Ser Ala Thr Ser Glu Lys Cys Pro Gly Asn Ala Leu Glu Lys Gly

195 200 205

Gly Lys Gly Ser Ile Thr Glu Gln Leu Leu Asn Ala Arg Ala Asp Val

210 215 220

Thr Leu Gly Gly Gly Ala Lys Thr Phe Ala Glu Thr Ala Thr Ala Gly

225 230 235 240

Glu Trp Gln Gly Lys Thr Leu Arg Glu Gln Ala Gln Ala Arg Gly Tyr

245 250 255

Gln Leu Val Ser Asp Ala Ala Ser Leu Asn Ser Val Thr Glu Ala Asn

260 265 270

Gln Gln Lys Pro Leu Leu Gly Leu Phe Ala Asp Gly Asn Met Pro Val

275 280 285

Arg Trp Leu Gly Pro Lys Ala Thr Tyr His Gly Asn Ile Asp Lys Pro

290 295 300

Ala Val Thr Cys Thr Pro Asn Pro Gln Arg Asn Asp Ser Val Pro Thr

305 310 315 320

Leu Ala Gln Met Thr Asp Lys Ala Ile Glu Leu Leu Ser Lys Asn Glu

325 330 335

Lys Gly Phe Phe Leu Gln Val Glu Gly Ala Ser Ile Asp Lys Gln Asp

340 345 350

His Ala Ala Asn Pro Cys Gly Gln Ile Gly Glu Thr Val Asp Leu Asp

355 360 365

Glu Ala Val Gln Arg Ala Leu Glu Phe Ala Lys Lys Glu Gly Asn Thr

370 375 380

Leu Val Ile Val Thr Ala Asp His Ala His Ala Ser Gln Ile Val Ala

385 390 395 400

Pro Asp Thr Lys Ala Pro Gly Leu Thr Gln Ala Leu Asn Thr Lys Asp

405 410 415

Gly Ala Val Met Val Met Ser Tyr Gly Asn Ser Glu Glu Asp Ser Gln

420 425 430

Glu His Thr Gly Ser Gln Leu Arg Ile Ala Ala Tyr Gly Pro His Ala

435 440 445

Ala Asn Val Val Gly Leu Thr Asp Gln Thr Asp Leu Phe Tyr Thr Met

450 455 460

Lys Ala Ala Leu Gly Leu Lys

465 470

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctcacttac ataaggagca tcgatatgaa acaaagcact attgcactgg 50

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggttcgaaca ggaattctta tttcagcccc agagcgg 37

<210> 11

<211> 257

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Asp Arg Ile Ile Glu Lys Leu Asp His Gly Trp Trp Val Val Ser

1 5 10 15

His Glu Gln Lys Leu Trp Leu Pro Lys Gly Glu Leu Pro Tyr Gly Glu

20 25 30

Ala Ala Asn Phe Asp Leu Val Gly Gln Arg Ala Leu Gln Ile Gly Glu

35 40 45

Trp Gln Gly Glu Pro Val Trp Leu Val Gln Gln Gln Arg Arg His Asp

50 55 60

Met Gly Ser Val Arg Gln Val Ile Asp Leu Asp Val Gly Leu Phe Gln

65 70 75 80

Leu Ala Gly Arg Gly Val Gln Leu Ala Glu Phe Tyr Arg Ser His Lys

85 90 95

Tyr Cys Gly Tyr Cys Gly His Glu Met Tyr Pro Ser Lys Thr Glu Trp

100 105 110

Ala Met Leu Cys Ser His Cys Arg Glu Arg Tyr Tyr Pro Gln Ile Ala

115 120 125

Pro Cys Ile Ile Val Ala Ile Arg Arg Asp Asp Ser Ile Leu Leu Ala

130 135 140

Gln His Thr Arg His Arg Asn Gly Val His Thr Val Leu Ala Gly Phe

145 150 155 160

Val Glu Val Gly Glu Thr Leu Glu Gln Ala Val Ala Arg Glu Val Met

165 170 175

Glu Glu Ser Gly Ile Lys Val Lys Asn Leu Arg Tyr Val Thr Ser Gln

180 185 190

Pro Trp Pro Phe Pro Gln Ser Leu Met Thr Ala Phe Met Ala Glu Tyr

195 200 205

Asp Ser Gly Asp Ile Val Ile Asp Pro Lys Glu Leu Leu Glu Ala Asn

210 215 220

Trp Tyr Arg Tyr Asp Asp Leu Pro Leu Leu Pro Pro Pro Gly Thr Val

225 230 235 240

Ala Arg Arg Leu Ile Glu Asp Thr Val Ala Met Cys Arg Ala Glu Tyr

245 250 255

Glu

<210> 12

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cctcacttac ataaggagca tcgatatgga tcgtataatt gaaaaattag atcacgg 57

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggttcgaaca ggaattctta ctcatactct gcccgacaca t 41

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cctcacttac ataaggagca tcgatatgtt taaaccgcac gttaccgt 48

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggttcgaaca ggaattctta gatgacaccc tttgtaaaag gccag 45

Claims

1.酶，其特征在于，其具有：

(I)、如SEQ ID No.1、11、3、8中任意所示的氨基酸序列；或

(II)、如(I)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或

(III)、与如(I)或(II)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的酶，其特征在于，所述取代、缺失或添加一个或多个氨基酸中的多个为2个、3个、4个或5个。

3.如权利要求1或2所述的酶，其特征在于，所述酶包括磷酸水解酶NudJ，其具有如SEQID No.1所示的氨基酸序列；和/或

所述酶包括酶NudC，其具有如SEQ ID No.11所示的氨基酸序列。

4.编码如权利要求1至3任一项所述酶的核酸分子。

5.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，编码如权利要求1至3任一项所述酶的核酸分子具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

(Ⅱ)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或

6.表达载体，其特征在于，包括如权利要求4或5所述的核酸分子。

7.重组菌株，其特征在于，包括如权利要求1至3任一项所述酶、如权利要求4或5所述的核酸分子或如权利要求6所述的表达载体。

8.如权利要求7所述的重组菌株，其特征在于，包括大肠杆菌(Escherichia coli)。

9.如权利要求1至3任一项所述酶、如权利要求4或5所述的核酸分子或如权利要求6所述的表达载体在合成单萜醇橙花醇和/或冰片中的应用。

10.合成单萜醇橙花醇和/或冰片的方法，其特征在于，取如权利要求7或8所述的重组菌株培养、发酵，收集发酵液，纯化，获得单萜醇橙花醇和/或冰片。