KR102245298B1 - 증가된 edc 활성을 갖고 락테이트 생산능을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포, 그를 제조하는 방법, 그를 제조하는 방법, 및 그를 사용하여 락테이트를 생산하는 방법 - Google Patents

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Abstract

모세포에 비하여 EDC 효소의 활성이 증가되어 있는, 락테이트 생산능을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포, 그를 제조하는 방법, 및 그를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

증가된 EDC 활성을 갖고 락테이트 생산능을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포, 그를 제조하는 방법, 그를 제조하는 방법, 및 그를 사용하여 락테이트를 생산하는 방법{Genetically engineered yeast cell having enhanced EDC activity and producing lactate, method for producing yeast cell, and method for producing lactate using the same}
락테이트를 생산할 수 있는 유전적으로 조작된 효모 세포, 그를 제조하는 방법 및 상기 세포를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법에 관한 것이다.
락테이트는 식품, 제약, 화학, 전자 등 다양한 산업 분야에서 폭넓게 사용되는 유기산이다. 락테이트는 무색, 무취이고 물에 잘 용해되는 저휘발성 물질이다. 락테이트는 인체에 독성이 없어 향미제, 산미제, 보존제 등으로 활용되고 있고, 또한 환경친화적으로 대체 고분자 물질이고, 생분해성 플라스틱인 폴리락틱산 (polylactic acid: PLA)의 원료이다. PLA는 기술적으로는 고분자 중합을 위해 다이머인 락티드 (lactide)로 전환하여 개환 중합된 (ring-open polymerization) 폴리에스터계 수지이며, 필름, 시트, 섬유, 사출 등의 다양한 가공이 가능하다. 따라서, PLA는 폴리에틸렌 (PE), 폴리프로필렌 (PP), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET), 폴리스틸렌 (PS) 등 기존 범용 석유화학 플라스틱을 광범위하게 대체할 수 있는 바이오 플라스틱으로서 최근 수요가 크게 증가하고 있다. 또한, 락테이트는 수산기와 카르복실기를 동시에 갖고 있어 반응성이 크고, 그에 따라 락테이트 에스테르, 아세트알데이드, 프로필렌글리콜 등 공업적으로 중요한 화합물로의 전환이 용이하여, 화학공업 분야에 있어서도 차세대 대체 화학 원료로서 주목받고 있다.
현재, 락테이트는 산업적으로 석유화학적 합성 공정과 생물공학적 발효 공정에 의해 생산되고 있다. 석유화학적 합성 공정은, 원유에서 유래된 에틸렌을 산화시키고, 아세트알데히드를 거쳐 시안화수소 첨가 반응에 의해 락토니트릴을 만든 후, 증류시켜 정제하고, 염산이나 황산을 사용하여 가수분해함으로써 제조된다. 또한, 생물공학적 발효 공정은 전분, 수크로스, 말토스, 글루코스, 프럭토스, 자일로스 등의 재생가능한 탄수화물을 기질로 하여 락테이트를 제조할 수 있다. 따라서, 이러한 종래 기술에 의하더라도, 락테이트를 효율적으로 생산할 수 있는 균주 및 그를 이용한 락테이트 생산 방법이 요구되고 있다. 이와 같은 니즈에 부합하여 최근 미생물을 이용하여 락테이트를 생산하는 방법이 개발되고 있다. 그러나, 미생물의 경우 항상성으로 인해 하나의 물질만을 대량으로 생산하는 것이 제한된다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 연구하던 과정에서 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 락테이트를 효과적으로 생산할 수 있는 유전적으로 조작된 효모 세포를 제공한다.
다른 양상은 락테이트를 효과적으로 생산할 수 있는 유전적으로 조작된 효모 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 유전적으로 조작된 효모 세포를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 세포, 단백질, 또는 효소의 활성의 검출가능한 증가를 나타낼 수 있다. "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 주어진 유전적 변형 (genetic modification)을 갖지 않은 세포, 단백질, 또는 효소 (예, 본래 또는 "야생형 (wild-type)"의 세포, 단백질, 또는 효소)와 같은, 동일한 타입의 비교 세포, 단백질, 또는 효소의 수준 보다 더 높은 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포, 단백질, 또는 효소의 활성을 나타낼 수 있다. "세포의 활성 (cell activity)"이란 세포의 특정 단백질 또는 효소의 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 상기 변형된 또는 조작된 세포, 단백질, 또는 효소의 활성은 동일 타입의 조작되지 않은 세포, 단백질, 또는 효소, 예를 들면, 야생형 세포, 단백질, 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 세포 중 특정 단백질 또는 효소의 활성은 모세포, 예를 들면, 조작되지 않은 세포 중의 동일 단백질 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 단백질 또는 효소의 증가된 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 증가된 활성을 갖는 세포는, 유전적 변형을 갖지 않은 세포에 비하여 하나 이상의 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 증가시키는 유전적 변형 (genetic modification)을 갖는 것일 수 있다.
용어 "카피 수 증가 (copy number increase)"는 유전자의 도입 또는 증폭에 의한 것일 수 있으며, 조작되지 않은 세포에 존재하지 않는 유전자를 유전적 조작에 의해 갖게 되는 경우도 포함한다. 상기 유전자의 도입은 벡터와 같은 비히클을 매개하여 이루어질 수 있다. 상기 도입은 상기 유전자가 게놈에 통합되지 않은 임시적 (transient) 도입이거나 게놈에 삽입되는 것일 수 있다. 상기 도입은 예를 들면, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 상기 세포로 도입한 후, 상기 벡터가 세포 내에서 복제되거나 상기 폴리뉴클레오티드가 게놈으로 통합됨으로써 이루어질 수 있다.
외부에서 도입되거나 또는 카피 수가 증가되는 폴리뉴클레오티드는 내인성 (endogenous) 또는 외인성 (exogenous)일 수 있다. 상기 내인성 유전자는 미생물 내부에 포함된 유전물질 상에 존재하던 유전자를 말한다. 외인성 유전자는 숙주 세포 게놈으로 도입 (integration)되는 등의 숙주 세포 내로 유전자가 도입되는 것을 의미하며, 도입되는 유전자는 도입되는 숙주세포에 대해 동종 (homologous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다.
"이종성 (heterologous)"은 천연 (native)이 아닌 외인성 (foreign)을 의미할 수 있다.
용어 "유전자"는 전사 및 번역 중 하나 이상에 의하여 발현 산물, 예를 들면, mRNA 또는 단백질을 생성할 수 있는 핵산 단편을 의미하며, 코딩영역 또는 코딩영역 외 5'-비코딩 서열 (5'-non coding sequence)과 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence) 등의 조절 (regulatory) 서열을 포함할 수 있다.
"세포 (cell)", "균주 (strain)", 또는 "미생물 (microorganism)"은 교체 사용이 가능한 것으로서, 효모, 박테리아, 또는 곰팡이 등을 포함할 수 있다.
반면, 본 명세서에서 사용된 용어 "활성 감소 (decrease in activity)" 또는 "감소된 활성 (decreased activity)"은 모세포 (예, 유전적으로 조작되지 않은 세포) 중에서 측정된 것보다 더 낮은 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 갖는 세포를 나타낸다. 또한, "활성 감소 (decrease in activity)" 또는 "감소된 활성 (decreased activity)"은 본래의 (original) 또는 야생형 (wild-type)의 효소 또는 폴리펩티드보다 더 낮은 활성을 갖는 분리된 효소 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 활성 감소 또는 감소된 활성은 활성이 없는 것 (no activity)을 포함한다. 예를 들면, 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포 또는 효소에 대한 기질로부터 생성물로의 효소 전환 활성이 상기 변형을 갖지 않은 세포 또는 효소, 예를 들면, 모세포 또는 "야생형 (wild-type)"의 세포 또는 효소의 효소 전환활성에 비하여 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 효소 또는 세포의 감소된 활성은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 활성 감소는 변형되지 않은 유전자를 갖는 세포, 예를 들면, 모세포 또는 야생형 세포에 비하여, 효소가 발현되더라도 효소의 활성이 없거나 감소된 경우, 효소를 코딩하는 유전자가 발현되지 않거나 발현되더라도 본래 유전자 조작이 되지 않은 유전자에 비하여 발현량이 감소된 경우를 포함한다. 상기 감소된 활성을 갖는 세포는, 유전적 변형을 갖지 않은 세포에 비하여 하나 이상의 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 감소시키는 유전적 변형 (genetic modification)을 갖는 것일 수 있다.
용어 "모세포 (parent cell)"는 본래 세포 (original cell), 예를 들면, 조작된 효모 세포에 대하여 동일 타입의 유전적으로 조작되지 않은 세포를 나타낸다. 특정한 유전적 변형에 대하여, 상기 "모세포"는 상기 특정 유전적 변형 (genetic modification)을 갖지 않은 세포이지만, 다른 상항에 대하여는 동일한 것일 수 있다. 따라서, 상기 모세포는 주어진 단백질 (예를 들면, 아세트알데히드를 아세틸-CoA로 전환하는 것을 촉매하는 효소와 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질)의 증가된 활성을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포를 생산하는데 출발 물질 (starting material)로 사용된 세포일 수 있다.
용어 “모세포(parent cell)” 또는 “모균주 (parent strain)”는 해당 유전적 변형(subject genetic modification)을 위해 사용된 것일 수 있다. 상기 모세포는 상기 유전적 변형을 제외하고는 해당 세포(subject cell)와 동일하기 때문에, 상기 유전적 변형에 대한 기준 세포(reference cell)일 수 있다. 상기 “유전적 변형(genetic modification)”은 세포의 유전물질의 구성 또는 구조가 인위적으로 변경된 것을 의미한다. 상기 모세포는 해당 유전적 변형, 예를 들면 EDC의 활성이 증가되도록 하는 유전적 변형을 갖지 않는 세포일 수 있다. 상기 모세포는 모 효모 세포(parent yeast cell)일 수 있다.
용어 “야생형(wild-type)” 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 특정 유전적 변형을 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 상기 유전적 변형은 유전적으로 조작된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있게 하는 것일 수 있다.
용어 "파괴 (disruption)"는 언급된 유전자 (referenced gene)의 발현이 감소되도록 하는 유전적 변형을 나타낸다. 상기 파괴는 언급된 유전자의 발현이 없도록 하는 유전적 변형 (이하, 유전자의 "불활성화 (inactivation)"이라고 한다.) 또는 유전자의 발현은 있으나 감소된 수준으로 발현되도록 하는 유전적 변형 (이하, 유전자의 "감쇄 (attenuation)"이라고 한다.)을 포함한다. 상기 불활성화는 유전자의 기능적 산물 (functional product)이 발현되지 않는 것뿐만 아니라 발현은 되지만 기능적 산물이 발현되지 않는 것을 포함한다. 상기 감쇄는 유전자의 기능적 산물의 발현양 감소를 포함한다. 즉, 상기 감쇄는 유전자의 순 발현량은 증가하였더라도 기능적 산물의 발현량이 감소되는 것을 포함한다. 여기서 유전자의 기능적 산물이란 모세포 또는 야생형 세포에서 상기 유전자의 산물 (예, 효소)이 갖는 생화학적 또는 생리적 기능 (예, 효소 활성)을 보유하고 있는 것을 말한다. 따라서, 상기 파괴는 유전자의 기능적 파괴 (functional disruption)를 포함한다. 상기 유전적 변형은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 변형, 모세포의 유전물질에 대한 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 부가, 삽입, 또는 결실, 또는 모세포의 유전물질에 대한 화학적 변이를 포함한다. 그러한 유전적 변형은 언급된 종 (referenced species)에 대한 이질성 (heterologous), 동질성 (homologous), 또는 이질성 및 동질성 폴리펩티드를 위한 코딩 영역 (coding region) 및 그의 기능적 단편 (functional fragments thereof)에 대한 것을 포함한다. 또한, 상기 유전적 변형은 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시키는 비코딩 조절 영역 (non-coding regulatory regions)의 변형을 포함한다. 비코딩 영역은 5'-비코딩 서열(5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence)을 포함한다.
상기 유전자의 파괴는 상동 재조합, 지향된 돌연변이유발 (directed mutagenesis), 또는 분자 진화 (molecular evolution)와 같은 유전적 조작법에 의해 달성될 수 있다. 세포가 복수 개의 동일 유전자, 또는 유전자의 2 이상의 파라로그 (paralogs)를 포함한 경우, 하나 이상의 유전자는 파괴될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전적 변형은 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 하여 상기 유전자를 파괴되도록 한 후, 상동 재조합이 일어난 세포를 선별 마커를 사용하여 선별함으로써 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유전자"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 5'-비코딩 서열 (5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열 (3'-non coding sequence)의 조절 서열 (regulatory sequence)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 발명에서 사용된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 아미노산 잔기 또는 염기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가, 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLASTN(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50%이상, 55%이상, 60%이상, 65%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성이다.
본 명세서에 사용된 용어 "외인성 (exogenous)"은 언급된 분자 (referenced molecule) 또는 언급된 활성 (referenced activity)이 숙주 세포로 도입된 것을 의미한다. 분자는 예를 들면, 숙주 염색체 내로의 삽입에 의하는 것과 같은 코딩 핵산 (encoding nucleic acid)의 숙주 유전 물질 내로의 도입 또는 플라스미드와 같은 비염색체 유전물질로서 도입될 수 있다. 코딩 핵산의 발현과 관련하여, 상기 용어 "외인성"은 상기 코딩 핵산이 개체 내로 발현 가능한 형태로 도입된 것을 나타낸다. 생합성 활성과 관련하여, 상기 용어 "외인성"은 숙주 모세포에 도입된 활성을 나타낸다. 그 기원 (source)는 예를 들면, 숙주 모세포에 도입된 후 언급된 활성을 발현하는 동질성 (homologous) 또는 이질성 (heterologous) 코딩 핵산일 수 있다. 그러므로, 용어 "내인성 (endogenous)"은 상기 숙주 세포에 존재하는 언급된 분자 또는 활성을 나타낸다. 비슷하게, 코딩 핵산의 발현과 관련하여, 상기 용어 "내인성"은 개체 내에 포함된 코딩 핵산의 발현을 나타낸다. 용어 "이질성 (heterologous)"은 언급된 종 외의 다른 기원으로부터의 분자 또는 활성을 나타내고 용어 "동질성 (homologous)"은 숙주 모세포로부터의 분자 또는 활성을 나타낸다. 따라서, 코딩 핵산의 외인성 발현은 이질성 (heterologous) 또는 동질성 (homologous) 코딩 핵산 중 어느 하나 또는 둘 다를 이용할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 사용된 용어 "유전적 조작 (genetic engineering)" 또는 "유전적으로 조작된 (genetically engineered)"은 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형 (genetic modification)을 도입하는 행위 또는 그에 의하여 만들어진 세포를 나타낸다.
본 명세서에 사용된 용어 락테이트(lactate)는 젖산(lactic acid) 자체뿐만 아니라, 음이온 형태, 그의 염, 용매화물, 다형체 또는 그 조합을 포함하는 것으로 해석된다. 상기 염은 예를 들면 무기산염, 유기산염 또는 금속염일 수 있다. 무기산염은 염산염, 브롬산염, 인산염, 황산염 또는 이황산염일 수 있다. 유기산염은 포름산염, 초산염, 아세트산염, 프로피온산염, 젖산염, 옥살산염, 주석산염, 말산염, 말레인산염, 구연산염, 푸마르산염, 베실산염, 캠실산염, 에디실염, 트리플루오로아세트산염, 벤조산염, 글루콘산염, 메탄술폰산염, 글리콜산염, 숙신산염, 4-톨루엔술폰산염, 갈룩투론산염, 엠본산염, 글루탐산염 또는 아스파르트산염일 수 있다. 금속염은 칼슘염, 나트륨염, 마그네슘염, 스트론튬염 또는 칼륨염일 수 있다.
일 양상은 모세포에 비하여, EDC 효소의 활성이 증가되어 있는, 락테이트 생산능을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포를 제공한다.
상기 EDC 효소는 mRNA-디캡핑의 인헨서 단백질(Enhancer of mRNA-decapping protein)일 수 있다. 상기 EDC는 DCP1 및 DCP2에 의한 decapping하는 mRNA를 자극하는 mRNA-결합 단백질일 수 있다. 상기 EDC는 EDC1 또는 EDC2일 수 있다. EDC2는 서열번호 1의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 EDC2는 일례로 NP_010652.3의 NCBI 참조 번호를 갖는 것일 수 있다. EDC2를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. EDC1은 서열번호 3의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 EDC1은 일례로 NP_011293.1의 NCBI 참조 번호를 갖는 것일 수 있다. EDC1을 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 상기 EDC 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열의 변형을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자의 발현 조절 서열은 상기 유전자 발현을 위한 프로모터 서열 또는 전사 종결자 서열일 수 있다. 상기 발현 조절 서열은 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 모티프를 코딩하는 서열일 수 있다. 상기 모티프는 예를 들면, 이차 구조-안정화 모티프, RNA 불안정화 모티프, 스플라이스-활성화 모티프, 폴리아데닐화 모티프, 아데닌-풍부 서열 (adenine-rich sequence), 또는 엔도뉴클레아제 인식 부위일 수 있다. 상기 프로모터 서열은 상기 EDC 단백질을 코딩하는 유전자와 작동가능하게 연결된 외인성 프로모터일 수 있다. 상기 프로모터는 구성적 프로모터(constitutive promoter)일 수 있다. 상기 프로모터는 Covalently linked Cell Wall protein 12 (CCW12), Pyruvate DeCarboxylase 1(PDC1), phosphoglycerate kinase (PGK1), Transcription enhancer factor- 1(TEF-1), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (TDH1, TDH2 또는 TDH3), triose phosphate isomerase (TPI1), purine-cytosine permease (PCPL3), 또는 alcohol dehydrogenase (ADH1) 유전자 유래의 프로모터일 수 있다. 또한, 상기 발현 조절 서열은 변역 효율을 향상시키는 서열일 수 있다. 상기 번역 효율을 향상시키는 서열은 예를 들면 코작 컨센서스 서열(Kozak consensus sequence)와 같은 번역 과정의 개시를 향상시키는 서열일 수 있다.
또한, 상기 효모 세포는 상기 EDC 단백질을 코딩하는 유전자의 카피수 증가를 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 상기 EDC 단백질을 코딩하는 외인성(exogenous) 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 외인성 유전자는 유전자에 작동 가능하도록 연결된 외인성 프로모터에 의해 적절히 조절되는 것일 수 있다. 상기 프로모터에 관해서는 상술한 바와 같다.
상기 효모 세포는 사카로마이세스 (Saccharomyces), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 캔디다 (Candida), 피치아 (Pichia), 이사첸키아 (Issatchenkia), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces), 쉬조사카로마이스세 (Shizosaccharomyces) 또는 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis) 속에 속하는 것일 수 있다. 사카로마이세스 속은 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 사카로마이세스 바야누스 (S. bayanus), 사카로마이세스 보울라디 (S. boulardii), 사카로마이세스 불데리 (S. bulderi), 사카로마이세스 카리오카누스 (S. cariocanus), 사카로마이세스 카리오쿠스 (S. cariocus), 사카로마이세스 체발리에리 (S. chevalieri), 사카로마이세스 다이레넨시스 (S. dairenensis), 사카로마이세스 엘립소이데우스 (S. ellipsoideus), 사카로마이세스 유바야뉴스 (S. eubayanus), 사카로마이세스 엑시거스 (S. exiguus), 사카로마이세스 플로렌티누스 (S. florentinus), 사카로마이세스 클루이베리 (S. kluyveri), 사카로마이세스 마티니에 (S. martiniae), 사카로마이세스 모나센시스 (S. monacensis), 사카로마이세스 노르벤시스 (S. norbensis), 사카로마이세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로마이세스 파스토리아누스 (S. pastorianus), 사카로마이세스 스펜서로룸 (S. spencerorum), 사카로마이세스 투리센시스 (S. turicensis), 사카로마이세스 우니스포루스 (S. unisporus), 사카로마이세스 우바룸 (S. uvarum), 또는 사카로마이세스 조나투스 (S. zonatus)일 수 있다.
상기 효모 세포는 L-락테이트 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 피루베이트를 L-락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 피루베이트를 L-락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 효모 세포는 피루베이트를 L-락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 피루베이트를 L-락테이트로 전환하는 폴리펩티드는 피루베이트를 L-락테이트로 전환하는 것을 촉매하는 효소일 수 있으며, 이는 L-락테이트 데히드로게나제 (LDH)일 수 있다. 상기 L-락테이트 데히드로게나제는 NAD(P)-의존성 효소일 수 있다. 또한 상기 L-락테이트 데히드로게나제는 스테레오-특이적 (specific)일 수 있다. 상기 NAD(P)-의존성 효소는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.27로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 락테이트 생산능을 갖는 효모 세포는 락테이트 데히드로게나제의 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 적어도 하나의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 유전자는 외인성 (exogenous)일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 박테리아, 효모, 진균, 포유동물 또는 파충류로부터 유래한 것을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 락토바실루스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus), L. 불가리쿠스 (L. bulgaricus), L. 존소니 (L. johnsonii), L. 플란타룸(L. plantarum), 일본자라 (Pelodiscus sinensis japonicus), 오리너구리 (Ornithorhynchus anatinus), 병코돌고래 (Tursiops truncatus), 노르웨이산집쥐 (Rattus norvegicus), 개구리 (Xenopus laevis), 및 보스 타우루스 (Bos taurus)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 보스 타우루스로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 일본자라로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 오리너구리로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 병코돌고래로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 및 노르웨이산집쥐로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제 는 각각 서열번호 13, 14, 15, 16, 및 17의 아미노산 서열과 60%이상, 또는 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 또는 99%이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일례로, 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 13, 15, 17, 19, 및 21의 아미노산 서열과 95%이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또는 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 18의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 벡터 내 포함될 수 있다. 상기 벡터는 복제개시점, 프로모터, 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 터미네이터를 포함할 수 있다. 상기 복제 개시점은 효모 자가복제 서열 (autonomous replication sequence, ARS)을 포함할 수 있다. 상기 효모 자가복제서열은 효모 동원체 서열 (centrometric sequence, CEN)에 의해 안정화될 수 있다. 상기 프로모터는 CYC (cytochrome c), TEF (transcription elongation factor), GPD, ADH, 및 CCW12 유전자의 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 있다. 상기 CYC (cytochrome c), TEF (transcription elongation factor), GPD, ADH, 및 CCW12 유전자의 프로모터는 각각 서열번호 23, 24, 25, 26, 및 27의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 터미네이터는 PGK1 (phosphoglycerate kinase 1), CYC1 (cytochrome c 1), GAL1 (galactokinase 1), 및 TPS1 (trehalose-6-phosphate synthase 1) 유전자의 터미네이터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. CYC1 터미네이터는 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 벡터는 선별 마커를 더 포함할 수 있다. 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 효모 세포의 특정 위치에 게놈에 포함될 수 있다. 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 활성 단백질을 생산하기 위해 기능하는 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 "기능성 (functional)"인 것으로 고려된다.
상기 효모 세포는 단일의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 2 내지 10 카피수의 복수의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 효모 세포는 예를 들면 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 또는 1 내지 3 카피의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 효모 세포가 복수의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 각각의 폴리뉴클레오티드는 동일하거나 둘 이상의 상이한 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 조합일 수 있다. 외인성 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 복수의 카피는 숙주 세포의 게놈 내에 동일한 유전자좌 (locus) 또는 여러 유전자좌에 포함될 수 있고, 각 카피의 프로모터나 터미네이터가 동일하거나 상이할 수 있다.
상기 효모 세포는 락테이트로의 대사 산물의 흐름을 방해하는 경로의 활성이 감소된 것일 수 있다. 또한 상기 효모 세포는 락테이트로의 대사 산물의 흐름을 촉진하거나 도와주는 경로의 활성이 증가된 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 모세포에 비하여, 추가적으로 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드, 알데히드 데히드로게나제, 또는 그의 조합의 활성이 감소되도록 하는 유전적 변형을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 파괴된 변이를 갖는 것일 수 있다. 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 것을 촉매하는 효소일 수 있으며, EC 4.1.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 예를 들면, 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase)일 수 있으며, PDC1일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 5의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 pdc1일 수 있다.
상기 효모 세포는 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 파괴된 변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 시토크롬 c-의존성 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.4, 또는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.3으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 락테이트 시토크롬-c 옥시도리덕타제일 수 있고, CYB2 (CAA86721.1), CYB2A, 또는 CYB2B일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 7의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 7의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 8의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 파괴된 변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드는 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제일 수 있으며, NADH 또는 NADP의 NAD+ 또는 NADP+로의 산화를 이용하여 디히록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로의 환원을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 EC 1.1.1.8에 속하는 것일 수 있다. 상기 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제는 GPD1일 수 있다. 상기 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제는 서열번호 9의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 9의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 피루베이트를 D-락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 파괴된 변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 EC. 1.1.2.4에 속하는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 D-락테이트 데히드로게나제(D-lactate dehydrogenase, DLD) 일 수 있다. 상기 D-락테이트 데히드로게나제는 D-락테이트 페리시토크롬 C 옥시도리덕타제(D-lactate ferricytochrome C oxidoreductase)로 지칭될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 DLD1일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 서열번호 11의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 11의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 일례로 상기 유전자는 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 파괴된 변이를 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 아세트알데히드에서 에탄올로 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 EC. 1.1.1.1에 속하는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 NADH로부터 NAD+로의 전환을 이용하여, 아세트알데히드에서 에탄올로의 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 알코올 데히드로게나제 (alcohol dehydrogenase; Adh)일 수 있으며, Adh1, Adh2, Adh3, Adh4, Adh5, 또는 Adh6일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 서열번호 16의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 16의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 17의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 일례로 adh1, adh2, adh3, adh4, adh5, 또는 adh6일 수 있다.
또한 일례로 효모 세포는 그 모세포에 비하여 EDC의 활성이 증가되어 있고; 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 피루베이트를 D-락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 파괴된 변이를 갖고; 피루베이트를 L-락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 갖는 효모 세포일 수 있다. 상기 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지애일 수 있다.
다른 양상은 상기한 효모 세포를 포함하는, 락테이트를 생산하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 상기 효모 세포에 관해서는 상술한 바와 같다.
다른 양상은 효모 세포에 EDC 효소를 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계; 및 피루베이트를 L-락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계;를 포함하는 락테이트를 생산하는 효모 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 락테이트를 생산하는 효모 세포를 제조하는 방법은 효모 세포에 EDC 효소를 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 단계에 있어서, “효모 세포”, “EDC 효소”, 및 “EDC 효소를 코딩하는 유전자”에 대하여는 상술한 바와 같다.
EDC 효소를 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계는 EDC 효소를 과발현시킬 수 있다. EDC 효소의 과발현은 상기 EDC 효소를 코딩하는 유전자를 과발현시킨 효모 세포가 그 모세포에 비해 상기 EDC 효소 활성이 동일한 조건 하에서 모세포에 비해 더 많은 양으로 또는 다소 더 높은 정상 상태 수준으로 생산됨을 의미한다. 또한 이는 상기 EDC 효소를 코딩하는 mRNA가 동일한 조건 하에서 모세포에 비해 더 많은 양으로 또는 다시 다소 더 높은 정상 상태 수준으로 생산됨을 의미한다. 따라서 EDC 효소의 과발현은 적합한 효소 분석을 사용하여 상기 숙주 세포에서 상기 효소의 비활성 수준을 측정함으로써 측정될 수 있다. 상기 과발현시키는 단계는 활성을 증가시키는 유전적 변형을 갖는 것일 수 있다.
상기 락테이트를 생산하는 효모 세포를 제조하는 방법은 피루베이트를 L-락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 단계에 있어서, “락테이트로 전환하는 폴리펩티드”, 및 “락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자”에 대하여는 상술한 바와 같다. 상기 유전자의 도입은 벡터와 같은 비히클을 매개하여 이루어질 수 있다. 상기 도입은 상기 유전자가 게놈에 통합되지 않은 임시적 도입이거나 게놈에 삽입되는 것일 수 있다. 상기 도입은 예를 들면, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 상기 세포로 도입한 후, 상기 벡터가 세포 내에서 복제되거나 상기 폴리뉴클레오티드가 게놈으로 통합됨으로써 이루어질 수 있다.
또한, 상기 락테이트를 생산하는 효모 세포를 제조하는 방법은 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 피루베이트를 D-락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합을 파괴하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 단계에 있어서, “피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드”, “피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자”, “락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드”, “락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자”, “디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드”, “디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자”, “피루베이트를 D-락테이트로 전환하는 폴리펩티드”, “피루베이트를 D-락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자”, “아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드”, “아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자”, 및 “파괴”에 대하여는 상술한 바와 같다.
다른 양상은 상기한 효모 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 효모 세포에 관해서는 상술한 바와 같다.
상기 배양은 탄소원, 예를 들면, 글루코스를 함유하는 배지에서 수행될 수 있다. 효모 세포 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지는 상업적인 판매자로부터 입수 가능하고 또는 공지된 제조법에 따라 제조될 수 있다. 상기 배양에 사용되는 배지는 특정한 효모 세포의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.
상기 유전적으로 조작된 효모 세포에서 락테이트를 수득하기 위하여 배양 조건을 적절히 조절할 수 있다. 상기 세포는 증식을 위하여 호기성 조건에서 배양할 수 있다. 그 후 락테이트를 생산하기 위하여 상기 세포를 미세호기 조건 또는 혐기 조건에서 배양할 수 있다. 용어 "혐기 조건 (anaerobic conditions)"은 산소가 없는 환경을 나타낸다. 용어 "미세호기 조건 (microaerobic conditions)"은 배양 또는 성장 조건에 참조되어 사용되는 경우, 배지 중의 용존산소 (dissolved oxygen: DO) 농도가 액체 배지 중의 용존 산소에 대한 포화 (saturation)의 0% 보다 크고 약 10%이하로 유지되는 것을 의미한다. 미세호기 조건은 또한, 1% 미만의 산소를 가진 분위기 (atmosphere)로 유지된 봉인된 챔버 (sealed chamber) 내에 액체 배지 중 또는 고체 아가 플레이트 상에서 세포를 성장시키거나 유지시키는 (resting) 것을 포함한다. 산소의 농도는 예를 들면, 배양물을 N2/CO2 혼합물 또는 다른 적당한 비산소 기체로 스파징함으로써 유지될 수 있다. 상기 산소 조건은 용존산소 (dissolved oxygen: DO) 농도가 0% 내지 10%, 예를 들면 0 내지 8%, 0 내지 6%, 0 내지 4%, 또는 0 내지 2%로 유지하는 것을 포함한다.
용어 "배양 조건"은 효모 세포를 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 효모 세포가 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 효모 세포가 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류가 포함된다. 상기 탄소원은 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈, 또는 갈락토오즈일 수 있다. 효모 세포가 이용할 수 있는 질소원은 유기 질소 화합물, 또는 무기 질소 화합물일 수 있다. 질소원의 예는 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 또는 암모늄염일 수 있다.
상기 락테이트를 생산하는 방법은 배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다.
배양물로부터의 락테이트의 회수는 당해 기술분야에서 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법은 원심분리, 여과, 이온교환크로마토그래피 또는 결정화일 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.
일 양상에 따른 효모 세포에 의하면, 락테이트를 효율적으로 생산하는데 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 락테이트를 생산하는 효모 세포를 제조하는 방법에 의하면, 락테이트를 생산하는 효모 세포를 효율적으로 제조할 수 있다.
일 양상에 따른 락테이트를 생산하는 방법에 의하면, 락테이트를 효율적으로 생산할 수 있다.
도 1은 pCtB1 벡터를 나타내는 도면이다.
도 2는 pCS-Ex1.1 벡터를 나타내는 도면이다.
도 3은 pCS-Ex1 벡터를 나타내는 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. L- 락테이트 생산 균주의 제작
사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 야생형 균주(MATαura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3Δ1; MAL2-8C; SUC2, EUROSCARF accession number: 30000B)를 락테이트 생산 균주로 만들기 위해, 알코올 발효의 주요 효소인 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase: pdc1) 유전자와 알코올 데히드로게나제 (alcohol dehydrogenase: adh1) 유전자, 글리세롤 생합성의 주요 효소인 NAD-의존성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 (NAD-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase: gpd1) 유전자, 및 락테이트 분해 효소인 L-락테이트 시토크롬-c 옥시도리덕타제 (L-lactate cytochrome-c oxidoreductase 2: cyb2) 유전자와 D-락테이트 데히드로게나제 (D-lactate dehydrogenase: dld1) 유전자를 결실시키고, adh1 유전자 위치에 보스 타우루스(Bos Taurus) 유래의 락테이트 데히드로게나제 (lactate dehydrogenase: BtLDH) 유전자를 삽입하여 락테이트 생산 균주인 MD1304 균주를 제작하였다. 각 과정은 다음과 같다.
1.1 피루베이트 데카르복실라제 ( pdc1 ) 결실 균주의 제작
사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 야생형 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 증폭 산물로 260 bp의 DNA 조각(이하 '조각 1'이라고 지칭)을 얻었다. 또한 상기 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 29 및 30의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 증폭 산물로 257 bp의 DNA 조각(이하 '조각 2'라고 지칭)을 얻었다. 또한 pCtB1 벡터 (GenBank Accession Number KJ922019)를 주형으로 하고 T7 프라이머 및 T3 프라이머의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 증폭 산물로 1,955 bp의 DNA 조각(이하 '조각 3'이라고 지칭)을 얻었다. 도 1은 pCtB1 벡터 (GenBank Accession Number KJ922019)를 나타내는 도면이다. 상기 pCtB1 벡터는 서열번호 67의 폴리뉴클레오티드를 갖는다. 이렇게 얻어진 DNA 조각들, 즉 조각 1, 2, 및 3을 모두 섞어 서열번호 27 및 30의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 2,414 bp의 DNA 조각을 얻었고, 이는 PDC1 유전자를 URA3 terminator BLAST로 치환하는 DNA 조각이다.
얻어진 DNA 조각을 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 야생형 균주에 형질도입한 후, 우라실이 포함되어 있지 않은 최소 배지 (SD-URA; Yeast Nitrogen Base 6.7 g, Synthetic Drop-out without uracil 1.92 g, D-glucose 20 g, Bacto Agar 20 g /L)에서 자라는 균주를 선별하였다. 선별된 균주 중에서 야생형 균주에서는 2,904 bp의 DNA 조각이 확인되는 서열번호 31 및 32의 프라이머 조합을 이용한 PCR을 수행하여 2,947 bp의 DNA 조각이 확인되는 균주를 수득하였다.
수득된 균주를 YPD (Yeast Extract 10g, Bacto Peptone 20g, D-glucose 20g /L) 배지에서 하루동안 종균 배양한 후, 5-FOA 배지 (Yeast Nitrogen Base 6.7g, Synthetic Drop-out without uracil 1.92g, uracil 0.1g, D-glucose 20g, 5-fluoroorotic acid 1g, Bacto Agar 20g /L)에 도말하여 생장하는 균주를 선별하였다. 선별된 균주 중에서 다시 서열번호 31 및 32의 프라이머 조합을 이용한 PCR을 수행하여 1,553 bp의 DNA 조각이 확인되는 균주, 즉 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (Δpdc1) 균주 (이하 'MD1002 균주'로 지칭)를 수득하였다.
1.2 NAD -의존성 글리세롤-3- 포스페이트 데히드로게나제 ( gpd1 ) 결실 균주의 제작
사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 야생형 균주의 게놈 DNA을 주형으로 하고 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 증폭 산물로 278 bp의 DNA 조각(이하 '조각 4'라고 지칭)을 얻었다. 또한 상기 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 35 및 36의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 증폭 산물로 446 bp의 DNA 조각(이하 '조각 5'라고 지칭)을 얻었다. 또한 pCtB1 벡터 (GenBank Accession Number KJ922019)를 주형으로 하고 T7 프라이머 및 T3 프라이머의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 증폭 산물로 1,955 bp의 DNA 조각(이하 '조각 6'이라고 지칭)을 얻었다. 이렇게 얻어진 DNA 조각들, 즉 조각 4, 5, 및 6을 모두 섞어 서열번호 33 및 36의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 2,621 bp의 DNA 조각을 얻었고, 이는 GPD1 유전자를 URA3 terminator BLAST로 치환하는 DNA 조각이다.
얻어진 DNA 조각을 상기 MD1002 균주에 형질도입한 후, 우라실이 포함되어 있지 않은 최소 배지 (SD-URA; Yeast Nitrogen Base 6.7 g, Synthetic Drop-out without uracil 1.92 g, D-glucose 20 g, Bacto Agar 20 g /L)에서 자라는 균주를 선별하였다. 선별된 균주 중에서, 야생형 균주 또는 MD1002 균주에서는 2,160 bp의 DNA 조각이 확인되는 서열번호 37 및 38의 프라이머 조합을 이용한 PCR을 수행하여 2,860 bp의 DNA 조각이 확인되는 균주를 확보하였다. 확보된 균주를 YPD (Yeast Extract 10g, Bacto Peptone 20g, D-glucose 20g /L) 배지에서 하루 동안 종균 배양한 후, 5-FOA 배지 (Yeast Nitrogen Base 6.7g, Synthetic Drop-out without uracil 1.92g, uracil 0.1g, D-glucose 20g, 5-fluoroorotic acid 1g, Bacto Agar 20g /L)에 도말하여 생장하는 균주를 선별하였다. 선별된 균주 중에서 다시 서열번호 37 및 38을 이용한 PCR을 수행하여 1,466 bp의 DNA 조각이 확인되는 균주, 즉 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (Δpdc1 Δgpd1) 균주(이하 'MD1228 균주'로 지칭)를 수득하였다.
1.3 L- 락테이트 시토크롬 -c 옥시도리덕타제 ( cyb2 ) 결실 균주의 제작
사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 야생형 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 39 및 40의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 증폭 산물로 355 bp의 DNA 조각(이하 '조각 7'이라고 지칭)을 얻었다. 또한 상기 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 41 및 42의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 증폭 산물로 378 bp의 DNA 조각(이하 '조각 8'이라고 지칭)을 얻었다. 또한 pCtB1 벡터 (GenBank Accession Number KJ922019)를 주형으로 하고 T7 프라이머 및 T3 프라이머의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 증폭 산물로 1,955 bp의 DNA 조각(이하 '조각 9'라고 지칭)을 얻었다. 이렇게 얻어진 DNA 조각들, 즉 조각 7, 8, 및 9를 모두 섞어 서열번호 39 및 42의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 2,630 bp의 DNA 조각을 얻었고, 이는 CYB2 유전자를 URA3 terminator BLAST로 치환하는 DNA 조각이다.
얻어진 DNA 조각을 MD1128 균주에 형질도입한 후, 우라실이 포함되어 있지 않은 최소 배지 (SD-URA; Yeast Nitrogen Base 6.7 g, Synthetic Drop-out without uracil 1.92 g, D-glucose 20 g, Bacto Agar 20 g /L)에서 자라는 균주를 선별하였다. 선별된 균주 중에서 야생형 균주, MD1002 균주, 또는 MD1228 균주에서는 2,676 bp의 DNA 조각이 확인되는 서열번호 43 및 44의 프라이머 조합을 이용한 PCR을 수행하여 2,891 bp의 DNA 조각이 확인되는 균주를 확보하였다. 확보된 균주를 YPD (Yeast Extract 10g, Bacto Peptone 20g, D-glucose 20g /L) 배지에서 하루 동안 종균 배양한 후, 5-FOA 배지 (Yeast Nitrogen Base 6.7g, Synthetic Drop-out without uracil 1.92g, uracil 0.1g, D-glucose 20g, 5-fluoroorotic acid 1g, Bacto Agar 20g /L)에 도말하여 생장하는 균주를 선별하였다. 선별된 균주 중에서 다시 서열번호 43 및 44의 프라이머 조합을 이용한 PCR을 수행하여 1,497 bp의 DNA 조각이 확인되는 균주 즉, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (Δpdc1, Δgpd1, Δcyb2) 균주(이하 'MD1258 균주'라고 지칭)를 수득하였다.
1.4 D- 락테이트 데히드로게나제 ( dld1 ) 결실 균주의 제작
사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 야생형 균주의 게놈 DNA을 주형으로 하고 서열번호 45 및 46의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 증폭 산물로 366 bp의 DNA 조각(이하 '조각 10'이라고 지칭)을 얻었다. 또한 같은 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 47 및 48의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 증폭 산물로 365 bp의 DNA 조각(이하 '조각 11'이라고 지칭)을 얻었다. 또한 pCtB1 벡터 (GenBank Accession Number KJ922019)를 주형으로 하고 T7 프라이머 및 T3 프라이머의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 증폭 산물로 1,955 bp의 DNA 조각(이하 '조각 12'라고 지칭)을 얻었다. 이렇게 얻어진 DNA 조각들, 즉 조각 10, 11, 및 12를 모두 섞어 서열번호 45 및 48의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 2,628 bp의 DNA 조각을 얻었고, 이는 DLD1 유전자를 URA3 terminator BLAST로 치환하는 DNA 조각이다.
얻어진 DNA 조각을 MD1258 균주에 형질도입한 후, 우라실이 포함되어 있지 않은 최소 배지 (SD-URA; Yeast Nitrogen Base 6.7 g, Synthetic Drop-out without uracil 1.92 g, D-glucose 20 g, Bacto Agar 20 g /L)에서 자라는 균주를 선별하였다. 선별된 균주 중에서 야생형 균주, MD1002 균주, MD1228 균주, 또는 MD1258 균주에서는 2,998 bp의 DNA 조각이 확인되는 서열번호 49 및 50의 프라이머 조합을 이용한 PCR을 수행하여 3,209 bp의 DNA 조각이 확인되는 균주를 확보하였다. 확보된 균주를 YPD (Yeast Extract 10g, Bacto Peptone 20g, D-glucose 20g /L) 배지에서 하루동안 종균 배양한 후, 5-FOA 배지 (Yeast Nitrogen Base 6.7g, Synthetic Drop-out without uracil 1.92g, uracil 0.1g, D-glucose 20g, 5-fluoroorotic acid 1g, Bacto Agar 20g /L)에 도말하여 생장하는 균주를 선별하였다. 선별된 균주 중에서 다시 서열번호 49 및 50의 프라이머 조합을 이용한 PCR을 수행하여 1,815 bp의 DNA 조각이 확인되는 균주 즉, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (Δpdc1, Δgpd1, Δcyb2, Δdld1) 균주 (이하 'MD1257 균주'라고 지칭)를 수득하였다.
1.5 락테이트 데히드로게나제 ( LDH ) 과발현 벡터의 제작
사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 야생형 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 51 및 52의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 CCW12 프로모터를 포함하는 1,605 bp의 DNA 조각을 얻었다. 이 DNA 조각을 KpnI 으로 처리한 pCtB1 벡터와 섞어 In-fusion 키트를 이용하여 클로닝하여 효모 이목적 과발현 벡터인 pCtB1-CCW12 벡터 (이하 'MD0922 벡터'라고 지칭)를 얻었다. 얻어진 MD0922 벡터를 KpnI과 SacI으로 처리한 후, 서열번호 18로 합성된 보스 타우루스 유래의 락테이트 데히드로게나제 유전자 DNA 조각(이하 'BtLDH'라고 지칭)과 섞어 In-fusion 키트를 이용하여 pCS-Ex1.1 벡터에 클로닝하여 효모에서 락테이트 데히드로게나제 유전자를 과발현하는 양목적 벡터인 pCS-Ex1.1 BtLDH 벡터(이하 'MD1188' 벡터라고 지칭)를 얻었다. 상기 BtLDH 유전자는 CCW12 프로모터 하에서 전사되도록 하였다. 도 2는 pCS-Ex1.1 벡터를 나타내는 도면이다.
1.6 알코올 데히드로게나제 ( adh1 ) 결실 및 락테이트 생산 균주의 제작
사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 야생형 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 53 및 54의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 증폭 산물로 333 bp의 DNA 조각 (이하 '조각 13'이라고 지칭)을 얻었다. 또한 같은 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 55 및 56의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 증폭 산물로 397 bp의 DNA 조각(이하 '조각 14'라고 지칭)을 얻었다. 또한 상기 MD1188 벡터를 주형으로 하고 T7 프라이머 및 T3 프라이머의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 증폭 산물로 4,422 bp의 DNA 조각(이하 '조각 15'라고 지칭)을 얻었다. 이렇게 얻어진 DNA 조각들, 즉 조각 13, 14, 및 15를 모두 섞어 서열번호 53 및 56의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 5,094 bp의 DNA 조각을 얻었고, 이는 ADH1 유전자를 CCW12 프로모터-BtLDH 유전자-TPS1 터미네이터-URA3 terminator BLAST로 치환하는 DNA 조각이다.
얻어진 DNA 조각을 MD1257 균주에 형질도입한 후, 우라실이 포함되어 있지 않은 최소 배지 (SD-URA; Yeast Nitrogen Base 6.7 g, Synthetic Drop-out without uracil 1.92 g, D-glucose 20 g, Bacto Agar 20 g /L)에서 자라는 균주를 선별하였다. 선별된 균주 중에서 야생형 균주, MD1002 균주, MD1228 균주, MD1258 균주, 또는 MD1257 균주에서는 1,918 bp의 DNA 조각이 확인되는 서열번호 57 및 58의 프라이머 조합을 이용한 PCR을 수행하여 5276 bp의 DNA 조각이 확인되는 균주를 확보하였다. 확보된 균주를 YPD (Yeast Extract 10g, Bacto Peptone 20g, D-glucose 20g /L) 배지에서 하루동안 종균 배양한 후, 5-FOA 배지 (Yeast Nitrogen Base 6.7g, Synthetic Drop-out without uracil 1.92g, uracil 0.1g, D-glucose 20g, 5-fluoroorotic acid 1g, Bacto Agar 20g /L)에 도말하여 생장하는 균주를 선별하였다. 선별된 균주 중에서 다시 서열번호 57 및 58의 프라이머 조합을 이용한 PCR을 수행하여 3,882 bp의 DNA 조각이 확인되는 균주, 즉 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (Δpdc1, Δgpd1, Δcyb2, Δdld1, Δadh1::Btldh) 균주 (이하 'MD1304 균주'라고 지칭)를 수득하였다.
실시예 2. EDC2 과발현 균주의 제작
2.1 EDC2 과발현 벡터의 제작
락테이트 생산균주인 MD1304 균주에서 EDC2 유전자를 과발현하기 위하여 EDC2 과발현 벡터를 제작하였다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 야생형 균주의 게놈 DNA을 주형으로 하고 서열번호 59 및 60의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 증폭 산물로 EDC2 유전자를 포함하는 479 bp의 DNA 조각을 얻었다. 이 DNA 조각을 pRS426GPD 벡터에 클로닝하기 위해 XbaI과 XhoI으로 처리한 pRS426GPD 벡터 DNA와 섞어 In-fusion 키트를 이용하여 클로닝하여 효모 EDC2 과발현 벡터인 pRS426GPD EDC2 벡터를 얻었다. 그 후 얻어진 pRS426GPD EDC2 벡터로부터 서열번호 61 및 62의 프라이머 조합을 이용한 PCR을 수행하여 1,168 bp의 DNA 조각을 얻었고, 이는 GPD 프로모터-EDC2 유전자를 pCtB1으로 클로닝하기 위한 DNA 조각이다. 이 DNA 조각을 KpnI과 SacI으로 처리한 pCtB1 벡터 DNA와 섞어 In-fusion 키트를 이용하여 pCS-Ex1에 클로닝하여 효모 이목적 EDC2 과발현 벡터인 MD1152 벡터(pCS-Ex1 EDC2 벡터)를 얻었다. 도 3은 pCS-Ex1 벡터를 나타내는 도면이다. 상기 EDC2 유전자는 GPD 프로모터 하에서 전사되도록 하였다.
2.2 EDC2 과발현 균주, 및 대조군 균주의 제작
락테이트 생산균주인 MD1304 균주에서 EDC2 유전자를 과발현하기 위하여 EDC2 과발현 유전자 카세트를 유전자 기능이 없는 것으로 알려져 있는 PDC6 유전자와 대체하여 삽입하였다. 효모 이목적 EDC2 과발현 벡터인 MD1152 벡터를 주형으로 하고 서열번호 63 및 64의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 증폭 산물로 3,057 bp의 DNA 조각을 얻었고, 이는 PDC6 유전자를 GPD 프로모터-EDC2-TPS1 터미네이터-URA3 terminator BLAST로 치환하기 위한 DNA이다.
얻어진 DNA 조각을 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 야생형 균주에 형질도입한 후, 우라실이 포함되어 있지 않은 최소 배지 (SD-URA; Yeast Nitrogen Base 6.7 g, Synthetic Drop-out without uracil 1.92 g, D-glucose 20 g, Bacto Agar 20 g /L)에서 자라는 균주를 선별하였다. 선별된 균주 중에서 야생형 균주에서는 2,300 bp의 DNA 조각이 확인되는, 서열번호 65 및 66의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 3,429 bp의 DNA 조각이 확인되는 균주, 즉 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (Δpdc1, Δgpd1, Δcyb2, Δdld1, Δadh1::Btldh, Δpdc6::EDC2) 균주 (이하 'MD1304/EDC2 균주'라고 지칭)를 수득하였다.
대조군 균주를 제작하기 위하여, 빈 pCtB1 벡터를 주형으로 하고 서열번호 63 및 64의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR을 수행하여 증폭 산물로 2,029 bp의 DNA 조각을 얻었다. 얻어진 DNA 조각을 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 야생형 균주에 형질도입한 후, 우라실이 포함되어 있지 않은 최소 배지 (SD-URA; Yeast Nitrogen Base 6.7 g, Synthetic Drop-out without uracil 1.92 g, D-glucose 20 g, Bacto Agar 20 g /L)에서 자라는 균주를 선별하였다. 선별된 균주 중에서 야생형 균주에서는 2,300 bp의 DNA 조각이 확인되는 서열번호 65 및 66의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 2,401 bp의 DNA 조각이 확인되는 균주, 즉 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (Δpdc1, Δgpd1, Δcyb2, Δdld1, Δadh1::Btldh, Δpdc6) 균주(이하 'MD1304/Δpdc6 균주'라고 지칭)를 수득하였다.
실시예 3. EDC2 과발현 균주의 락테이트 생산능 평가
EDC2 유전자의 과발현이 락테이트 생산능에 미치는 영향을 평가하기 위하여 통상적으로 실시되는 배치 플라스크 테스트를 진행하였다. 배치 플라스크 테스트를 수행하기 위하여 지수적 생장 단계에 있는 MD1304/Δpdc6 균주와 MD1304/EDC2 균주를 회수하여 배치 플라스크 테스트용 배지인 YPD8 배지 (Yeast Extract 10g, Bacto Peptone 20g, D-Glucose 80g / 1L)에 세포 농도가 600 nm에서 흡광도 4.0이 되도록 접종하였다. 이 세포-배지 혼합액을 공기 중 습도가 95% 이상이고 산소 농도가 2.5%로 유지되고 있는 미호기 상태의 배양기에 넣고 충분히 교반하면서 30 ℃에서 배양하였다.
그 결과 표 1에 나타낸 바와 같이, EDC2가 과발현된 MD1304/EDC2 균주가 대조군인 MD1304/Δpdc6 균주에 비해 더 높은 락테이트 생산능 및 수율을 갖는 것을 확인하였다.
균주 O 시간 20 시간 40 시간 71 시간
MD1304/ㅿpdc6 OD600 3.97 ± 0.01 7.85 ± 0.27 10.96 ± 0.25 11.64 ± 0.18
D-글루코스 (g/L) 84.8 ± 2.7 52.9 ± 1.2 40.5 ± 1.6 38.9 ± 0.8
L-락테이트 (g/L) 0.2 ± 0.1 17.7 ± 0.5 25.2 ± 0.6 25.5 ± 0.7
수율 (g/g%) - 55 ± 3.7 56.6 ± 3.0 55.2 ± 1.4
MD1304/EDC2 OD600 4.04 ± 0.10 6.89 ± 0.23 9.17 ± 0.98 10.91 ± 0.48
D-글루코스 (g/L) 84.8 ± 2.7 50.8 ± 1.5 35.9 ± 1.6 25.2 ± 0.3
L-락테이트 (g/L) 0.2 ± 0.1 21.3 ± 0.3 31.2 ± 0.9 35.4 ± 0.2
수율 (g/g%) - 62.1 ± 2.0 63.5 ± 3.1 59.1 ± 0.6
ㅿ(EDC2) OD600 - - 12.2% -16.3% -6.3%
D-글루코스 (g/L) - + 6.6% + 10.6% +29.7 %
L-락테이트 (g/L) - + 20.4 % + 24.1% + 38.8%
수율 (g/g%) - + 12.9% + 12.2% + 7.1%
* Average ± S.D (n=3)
상기 표 1에서 ㅿ(EDC2)의 OD600, D-글루코스, L-락테이트, 및 수율의 값은 MD1304/ㅿpdc6에 비하여, EDC2의 활성이 증가된 MD1304/EDC2의 증가분을 나타낸 것이다.
<110> Samsung Electronic Co.Ltd <120> Genetically engineered yeast cell having enhanced EDC activity and producing lactate, method for producing yeast cell, and method for producing lactate using the same <130> PN106329KR <160> 67 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 145 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Met Gly Ser Glu Thr Lys His Ser Ala Lys Val Lys Ile Val Thr Arg 1 5 10 15 Glu Ser Pro Pro Ser Ala Lys Glu His Met Arg Pro Thr Lys Thr Gln 20 25 30 Ile Leu Val Pro Pro Thr Gln Ser Leu Pro Asn Gly Lys Lys Pro Asn 35 40 45 Phe Gly Lys Ser Thr Lys Gln Arg Arg Glu Pro Arg Glu Arg Thr Ser 50 55 60 Lys Thr Gly His Glu Asp Asp Lys Ala Thr Met Val Thr Val Asn Ile 65 70 75 80 Asp Ala Phe Leu His Asp Lys Ala Pro Lys Lys Lys Ser Cys Lys Tyr 85 90 95 Lys Lys Lys Lys Thr Arg Gln Tyr Gln Asp Arg Ala Ala Ala Ser Ile 100 105 110 Asp Ser Lys Pro His Val Ala Gly His Thr Ala Phe Ala Gly Ala Ser 115 120 125 Phe Thr Thr Asp Ile Pro His Glu Ala Ala Leu Pro Lys Pro Ser Phe 130 135 140 Val 145 <210> 2 <211> 438 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 atgggttccg agacaaaaca ttctgcaaaa gtcaagattg tcacaaggga aagtcctcct 60 tccgccaagg agcacatgcg ccccactaaa actcaaatat tagttccacc gacgcagagt 120 ttgcccaatg gcaagaaacc aaacttcggt aagtctacaa aacagcggcg agaacctagg 180 gaacgcacct cgaagacggg acacgaggac gataaggcaa cgatggtcac tgttaacata 240 gatgccttcc tacatgataa ggcccctaaa aaaaaatcgt gcaaatacaa gaagaagaaa 300 acgagacagt accaggatag ggcggcggcg tcgatcgatt cgaaaccgca cgtagctggt 360 catacggcct ttgccggtgc ttcgttcaca acagatatcc cacatgaggc agcgctaccc 420 aaacctagtt ttgtttga 438 <210> 3 <211> 175 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 Met Ser Thr Asp Thr Met Tyr Phe Asn Ser Ser Arg Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Ala Gly Arg Asn Lys Thr Asn Asn Leu Ile Lys Gln Lys Thr Arg Asn 20 25 30 Asn Arg Ala Arg Gly Asn Ala Ala Lys Asn Ala Asn Asn Asn Asn Tyr 35 40 45 Ile Thr Asp Ile Pro Pro Pro Gln Thr Leu Pro Asn Gly Gln Lys Pro 50 55 60 Asn Phe Gly His Ser Ser Asn Lys Lys Pro Ser Phe Asn Gln Lys Lys 65 70 75 80 His Ser Pro Pro Ser Ser Pro Ser Ser Thr Thr Thr Leu Gly Lys Lys 85 90 95 Asn Arg Gln Asn Asn Lys Glu Thr Pro Arg Gln Asn Asn Lys Asp Asp 100 105 110 Thr Arg Leu Leu Ser Gln Asn Leu Lys Asn Leu Leu Leu Asn Gln Lys 115 120 125 Gln Ser Pro His Gly Ser Gln Gly Ile Ile Pro Met Gly Cys Asn Gly 130 135 140 Ser Ala Lys Lys Leu Ser His Ser Tyr Ala Gly Ser Thr Phe Ala Thr 145 150 155 160 Asn Gly Pro Arg Glu Ala Lys Asn Leu Pro Lys Pro Ser Phe Leu 165 170 175 <210> 4 <211> 528 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 4 atgtcgacgg ataccatgta tttcaacagc tccaggctgt tgccatcggc tggcaggaac 60 aagacaaata atctaatcaa acaaaaaact agaaataatc gtgcgagggg aaatgctgct 120 aagaacgcca ataataacaa ctatatcaca gatataccac ctcctcaaac tcttcctaac 180 ggtcagaaac ctaacttcgg ccattcttcc aacaagaaac catcatttaa tcaaaagaag 240 cactctccac cttcttcccc ttcctctaca actactttag gtaaaaaaaa cagacagaat 300 aataaagaaa cgccacgaca gaacaacaaa gatgatactc gtttactgag tcagaaccta 360 aagaatctgc ttctgaacca gaaacaatcc ccgcatggct ctcaagggat aataccaatg 420 ggttgtaatg gcagtgccaa aaaactcagt cactcttatg caggctccac tttcgccact 480 aatggtccaa gggaggctaa aaacttgccc aaaccaagtt ttttataa 528 <210> 5 <211> 563 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 5 Met Ser Glu Ile Thr Leu Gly Lys Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Lys Gln 1 5 10 15 Val Asn Val Asn Thr Val Phe Gly Leu Pro Gly Asp Phe Asn Leu Ser 20 25 30 Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Glu Val Glu Gly Met Arg Trp Ala Gly Asn 35 40 45 Ala Asn Glu Leu Asn Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Ile 50 55 60 Lys Gly Met Ser Cys Ile Ile Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser 65 70 75 80 Ala Leu Asn Gly Ile Ala Gly Ser Tyr Ala Glu His Val Gly Val Leu 85 90 95 His Val Val Gly Val Pro Ser Ile Ser Ala Gln Ala Lys Gln Leu Leu 100 105 110 Leu His His Thr Leu Gly Asn Gly Asp Phe Thr Val Phe His Arg Met 115 120 125 Ser Ala Asn Ile Ser Glu Thr Thr Ala Met Ile Thr Asp Ile Ala Thr 130 135 140 Ala Pro Ala Glu Ile Asp Arg Cys Ile Arg Thr Thr Tyr Val Thr Gln 145 150 155 160 Arg Pro Val Tyr Leu Gly Leu Pro Ala Asn Leu Val Asp Leu Asn Val 165 170 175 Pro Ala Lys Leu Leu Gln Thr Pro Ile Asp Met Ser Leu Lys Pro Asn 180 185 190 Asp Ala Glu Ser Glu Lys Glu Val Ile Asp Thr Ile Leu Ala Leu Val 195 200 205 Lys Asp Ala Lys Asn Pro Val Ile Leu Ala Asp Ala Cys Cys Ser Arg 210 215 220 His Asp Val Lys Ala Glu Thr Lys Lys Leu Ile Asp Leu Thr Gln Phe 225 230 235 240 Pro Ala Phe Val Thr Pro Met Gly Lys Gly Ser Ile Asp Glu Gln His 245 250 255 Pro Arg Tyr Gly Gly Val Tyr Val Gly Thr Leu Ser Lys Pro Glu Val 260 265 270 Lys Glu Ala Val Glu Ser Ala Asp Leu Ile Leu Ser Val Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ser Asp Phe Asn Thr Gly Ser Phe Ser Tyr Ser Tyr Lys Thr Lys 290 295 300 Asn Ile Val Glu Phe His Ser Asp His Met Lys Ile Arg Asn Ala Thr 305 310 315 320 Phe Pro Gly Val Gln Met Lys Phe Val Leu Gln Lys Leu Leu Thr Thr 325 330 335 Ile Ala Asp Ala Ala Lys Gly Tyr Lys Pro Val Ala Val Pro Ala Arg 340 345 350 Thr Pro Ala Asn Ala Ala Val Pro Ala Ser Thr Pro Leu Lys Gln Glu 355 360 365 Trp Met Trp Asn Gln Leu Gly Asn Phe Leu Gln Glu Gly Asp Val Val 370 375 380 Ile Ala Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Gly Ile Asn Gln Thr Thr Phe 385 390 395 400 Pro Asn Asn Thr Tyr Gly Ile Ser Gln Val Leu Trp Gly Ser Ile Gly 405 410 415 Phe Thr Thr Gly Ala Thr Leu Gly Ala Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ile 420 425 430 Asp Pro Lys Lys Arg Val Ile Leu Phe Ile Gly Asp Gly Ser Leu Gln 435 440 445 Leu Thr Val Gln Glu Ile Ser Thr Met Ile Arg Trp Gly Leu Lys Pro 450 455 460 Tyr Leu Phe Val Leu Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Ile Glu Lys Leu Ile 465 470 475 480 His Gly Pro Lys Ala Gln Tyr Asn Glu Ile Gln Gly Trp Asp His Leu 485 490 495 Ser Leu Leu Pro Thr Phe Gly Ala Lys Asp Tyr Glu Thr His Arg Val 500 505 510 Ala Thr Thr Gly Glu Trp Asp Lys Leu Thr Gln Asp Lys Ser Phe Asn 515 520 525 Asp Asn Ser Lys Ile Arg Met Ile Glu Ile Met Leu Pro Val Phe Asp 530 535 540 Ala Pro Gln Asn Leu Val Glu Gln Ala Lys Leu Thr Ala Ala Thr Asn 545 550 555 560 Ala Lys Gln <210> 6 <211> 1692 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 6 atgtctgaaa ttactttggg taaatatttg ttcgaaagat taaagcaagt caacgttaac 60 accgttttcg gtttgccagg tgacttcaac ttgtccttgt tggacaagat ctacgaagtt 120 gaaggtatga gatgggctgg taacgccaac gaattgaacg ctgcttacgc cgctgatggt 180 tacgctcgta tcaagggtat gtcttgtatc atcaccacct tcggtgtcgg tgaattgtct 240 gctttgaacg gtattgccgg ttcttacgct gaacacgtcg gtgttttgca cgttgttggt 300 gtcccatcca tctctgctca agctaagcaa ttgttgttgc accacacctt gggtaacggt 360 gacttcactg ttttccacag aatgtctgcc aacatttctg aaaccactgc tatgatcact 420 gacattgcta ccgccccagc tgaaattgac agatgtatca gaaccactta cgtcacccaa 480 agaccagtct acttaggttt gccagctaac ttggtcgact tgaacgtccc agctaagttg 540 ttgcaaactc caattgacat gtctttgaag ccaaacgatg ctgaatccga aaaggaagtc 600 attgacacca tcttggcttt ggtcaaggat gctaagaacc cagttatctt ggctgatgct 660 tgttgttcca gacacgacgt caaggctgaa actaagaagt tgattgactt gactcaattc 720 ccagctttcg tcaccccaat gggtaagggt tccattgacg aacaacaccc aagatacggt 780 ggtgtttacg tcggtacctt gtccaagcca gaagttaagg aagccgttga atctgctgac 840 ttgattttgt ctgtcggtgc tttgttgtct gatttcaaca ccggttcttt ctcttactct 900 tacaagacca agaacattgt cgaattccac tccgaccaca tgaagatcag aaacgccact 960 ttcccaggtg tccaaatgaa attcgttttg caaaagttgt tgaccactat tgctgacgcc 1020 gctaagggtt acaagccagt tgctgtccca gctagaactc cagctaacgc tgctgtccca 1080 gcttctaccc cattgaagca agaatggatg tggaaccaat tgggtaactt cttgcaagaa 1140 ggtgatgttg tcattgctga aaccggtacc tccgctttcg gtatcaacca aaccactttc 1200 ccaaacaaca cctacggtat ctctcaagtc ttatggggtt ccattggttt caccactggt 1260 gctaccttgg gtgctgcttt cgctgctgaa gaaattgatc caaagaagag agttatctta 1320 ttcattggtg acggttcttt gcaattgact gttcaagaaa tctccaccat gatcagatgg 1380 ggcttgaagc catacttgtt cgtcttgaac aacgatggtt acaccattga aaagttgatt 1440 cacggtccaa aggctcaata caacgaaatt caaggttggg accacctatc cttgttgcca 1500 actttcggtg ctaaggacta tgaaacccac agagtcgcta ccaccggtga atgggacaag 1560 ttgacccaag acaagtcttt caacgacaac tctaagatca gaatgattga aatcatgttg 1620 ccagtcttcg atgctccaca aaacttggtt gaacaagcta agttgactgc tgctaccaac 1680 gctaagcaat aa 1692 <210> 7 <211> 591 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 7 Met Leu Lys Tyr Lys Pro Leu Leu Lys Ile Ser Lys Asn Cys Glu Ala 1 5 10 15 Ala Ile Leu Arg Ala Ser Lys Thr Arg Leu Asn Thr Ile Arg Ala Tyr 20 25 30 Gly Ser Thr Val Pro Lys Ser Lys Ser Phe Glu Gln Asp Ser Arg Lys 35 40 45 Arg Thr Gln Ser Trp Thr Ala Leu Arg Val Gly Ala Ile Leu Ala Ala 50 55 60 Thr Ser Ser Val Ala Tyr Leu Asn Trp His Asn Gly Gln Ile Asp Asn 65 70 75 80 Glu Pro Lys Leu Asp Met Asn Lys Gln Lys Ile Ser Pro Ala Glu Val 85 90 95 Ala Lys His Asn Lys Pro Asp Asp Cys Trp Val Val Ile Asn Gly Tyr 100 105 110 Val Tyr Asp Leu Thr Arg Phe Leu Pro Asn His Pro Gly Gly Gln Asp 115 120 125 Val Ile Lys Phe Asn Ala Gly Lys Asp Val Thr Ala Ile Phe Glu Pro 130 135 140 Leu His Ala Pro Asn Val Ile Asp Lys Tyr Ile Ala Pro Glu Lys Lys 145 150 155 160 Leu Gly Pro Leu Gln Gly Ser Met Pro Pro Glu Leu Val Cys Pro Pro 165 170 175 Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Lys Glu Asp Ile Ala Arg Lys Glu Gln Leu 180 185 190 Lys Ser Leu Leu Pro Pro Leu Asp Asn Ile Ile Asn Leu Tyr Asp Phe 195 200 205 Glu Tyr Leu Ala Ser Gln Thr Leu Thr Lys Gln Ala Trp Ala Tyr Tyr 210 215 220 Ser Ser Gly Ala Asn Asp Glu Val Thr His Arg Glu Asn His Asn Ala 225 230 235 240 Tyr His Arg Ile Phe Phe Lys Pro Lys Ile Leu Val Asp Val Arg Lys 245 250 255 Val Asp Ile Ser Thr Asp Met Leu Gly Ser His Val Asp Val Pro Phe 260 265 270 Tyr Val Ser Ala Thr Ala Leu Cys Lys Leu Gly Asn Pro Leu Glu Gly 275 280 285 Glu Lys Asp Val Ala Arg Gly Cys Gly Gln Gly Val Thr Lys Val Pro 290 295 300 Gln Met Ile Ser Thr Leu Ala Ser Cys Ser Pro Glu Glu Ile Ile Glu 305 310 315 320 Ala Ala Pro Ser Asp Lys Gln Ile Gln Trp Tyr Gln Leu Tyr Val Asn 325 330 335 Ser Asp Arg Lys Ile Thr Asp Asp Leu Val Lys Asn Val Glu Lys Leu 340 345 350 Gly Val Lys Ala Leu Phe Val Thr Val Asp Ala Pro Ser Leu Gly Gln 355 360 365 Arg Glu Lys Asp Met Lys Leu Lys Phe Ser Asn Thr Lys Ala Gly Pro 370 375 380 Lys Ala Met Lys Lys Thr Asn Val Glu Glu Ser Gln Gly Ala Ser Arg 385 390 395 400 Ala Leu Ser Lys Phe Ile Asp Pro Ser Leu Thr Trp Lys Asp Ile Glu 405 410 415 Glu Leu Lys Lys Lys Thr Lys Leu Pro Ile Val Ile Lys Gly Val Gln 420 425 430 Arg Thr Glu Asp Val Ile Lys Ala Ala Glu Ile Gly Val Ser Gly Val 435 440 445 Val Leu Ser Asn His Gly Gly Arg Gln Leu Asp Phe Ser Arg Ala Pro 450 455 460 Ile Glu Val Leu Ala Glu Thr Met Pro Ile Leu Glu Gln Arg Asn Leu 465 470 475 480 Lys Asp Lys Leu Glu Val Phe Val Asp Gly Gly Val Arg Arg Gly Thr 485 490 495 Asp Val Leu Lys Ala Leu Cys Leu Gly Ala Lys Gly Val Gly Leu Gly 500 505 510 Arg Pro Phe Leu Tyr Ala Asn Ser Cys Tyr Gly Arg Asn Gly Val Glu 515 520 525 Lys Ala Ile Glu Ile Leu Arg Asp Glu Ile Glu Met Ser Met Arg Leu 530 535 540 Leu Gly Val Thr Ser Ile Ala Glu Leu Lys Pro Asp Leu Leu Asp Leu 545 550 555 560 Ser Thr Leu Lys Ala Arg Thr Val Gly Val Pro Asn Asp Val Leu Tyr 565 570 575 Asn Glu Val Tyr Glu Gly Pro Thr Leu Thr Glu Phe Glu Asp Ala 580 585 590 <210> 8 <211> 1776 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 8 atgctaaaat acaaaccttt actaaaaatc tcgaagaact gtgaggctgc tatcctcaga 60 gcgtctaaga ctagattgaa cacaatccgc gcgtacggtt ctaccgttcc aaaatccaag 120 tcgttcgaac aagactcaag aaaacgcaca cagtcatgga ctgccttgag agtcggtgca 180 attctagccg ctactagttc cgtggcgtat ctaaactggc ataatggcca aatagacaac 240 gagccgaaac tggatatgaa taaacaaaag atttcgcccg ctgaagttgc caagcataac 300 aagcccgatg attgttgggt tgtgatcaat ggttacgtat acgacttaac gcgattccta 360 ccaaatcatc caggtgggca ggatgttatc aagtttaacg ccgggaaaga tgtcactgct 420 atttttgaac cactacatgc tcctaatgtc atcgataagt atatagctcc cgagaaaaaa 480 ttgggtcccc ttcaaggatc catgcctcct gaacttgtct gtcctcctta tgctcctggt 540 gaaactaagg aagatatcgc tagaaaagaa caactaaaat cgctgctacc tcctctagat 600 aatattatta acctttacga ctttgaatac ttggcctctc aaactttgac taaacaagcg 660 tgggcctact attcctccgg tgctaacgac gaagttactc acagagaaaa ccataatgct 720 tatcatagga tttttttcaa accaaagatc cttgtagatg tacgcaaagt agacatttca 780 actgacatgt tgggttctca tgtggatgtt cccttctacg tgtctgctac agctttgtgt 840 aaactgggaa accccttaga aggtgaaaaa gatgtcgcca gaggttgtgg ccaaggtgtg 900 acaaaagtcc cacaaatgat atctactttg gcttcatgtt cccctgagga aattattgaa 960 gcagcaccct ctgataaaca aattcaatgg taccaactat atgttaactc tgatagaaag 1020 atcactgatg atttggttaa aaatgtagaa aagctgggtg taaaggcatt atttgtcact 1080 gtggatgctc caagtttagg tcaaagagaa aaagatatga agctgaaatt ttccaataca 1140 aaggctggtc caaaagcgat gaagaaaact aatgtagaag aatctcaagg tgcttcgaga 1200 gcgttatcaa agtttattga cccctctttg acttggaaag atatagaaga gttgaagaaa 1260 aagacaaaac tacctattgt tatcaaaggt gttcaacgta ccgaagatgt tatcaaagca 1320 gcagaaatcg gtgtaagtgg ggtggttcta tccaatcatg gtggtagaca attagatttt 1380 tcaagggctc ccattgaagt cctggctgaa accatgccaa tcctggaaca acgtaacttg 1440 aaggataagt tggaagtttt cgtggacggt ggtgttcgtc gtggtacaga tgtcttgaaa 1500 gcgttatgtc taggtgctaa aggtgttggt ttgggtagac cattcttgta tgcgaactca 1560 tgctatggtc gtaatggtgt tgaaaaagcc attgaaattt taagagatga aattgaaatg 1620 tctatgagac tattaggtgt tactagcatt gcggaattga agcctgatct tttagatcta 1680 tcaacactaa aggcaagaac agttggagta ccaaacgacg tgctgtataa tgaagtttat 1740 gagggaccta ctttaacaga atttgaggat gcatga 1776 <210> 9 <211> 391 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 9 Met Ser Ala Ala Ala Asp Arg Leu Asn Leu Thr Ser Gly His Leu Asn 1 5 10 15 Ala Gly Arg Lys Arg Ser Ser Ser Ser Val Ser Leu Lys Ala Ala Glu 20 25 30 Lys Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr 35 40 45 Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Cys Lys Gly Tyr Pro Glu Val Phe 50 55 60 Ala Pro Ile Val Gln Met Trp Val Phe Glu Glu Glu Ile Asn Gly Glu 65 70 75 80 Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr Leu 85 90 95 Pro Gly Ile Thr Leu Pro Asp Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile 100 105 110 Asp Ser Val Lys Asp Val Asp Ile Ile Val Phe Asn Ile Pro His Gln 115 120 125 Phe Leu Pro Arg Ile Cys Ser Gln Leu Lys Gly His Val Asp Ser His 130 135 140 Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Ala Lys Gly 145 150 155 160 Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Ile Thr Glu Glu Leu Gly Ile Gln Cys 165 170 175 Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Ile Ala Thr Glu Val Ala Gln Glu His 180 185 190 Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr His Ile Pro Lys Asp Phe Arg Gly 195 200 205 Glu Gly Lys Asp Val Asp His Lys Val Leu Lys Ala Leu Phe His Arg 210 215 220 Pro Tyr Phe His Val Ser Val Ile Glu Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile 225 230 235 240 Cys Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Glu 245 250 255 Gly Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly 260 265 270 Leu Gly Glu Ile Ile Arg Phe Gly Gln Met Phe Phe Pro Glu Ser Arg 275 280 285 Glu Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr 290 295 300 Thr Cys Ala Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Leu Met Ala Thr 305 310 315 320 Ser Gly Lys Asp Ala Trp Glu Cys Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly Gln 325 330 335 Ser Ala Gln Gly Leu Ile Thr Cys Lys Glu Val His Glu Trp Leu Glu 340 345 350 Thr Cys Gly Ser Val Glu Asp Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln 355 360 365 Ile Val Tyr Asn Asn Tyr Pro Met Lys Asn Leu Pro Asp Met Ile Glu 370 375 380 Glu Leu Asp Leu His Glu Asp 385 390 <210> 10 <211> 1176 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 10 atgtctgctg ctgctgatag attaaactta acttccggcc acttgaatgc tggtagaaag 60 agaagttcct cttctgtttc tttgaaggct gccgaaaagc ctttcaaggt tactgtgatt 120 ggatctggta actggggtac tactattgcc aaggtggttg ccgaaaattg taagggatac 180 ccagaagttt tcgctccaat agtacaaatg tgggtgttcg aagaagagat caatggtgaa 240 aaattgactg aaatcataaa tactagacat caaaacgtga aatacttgcc tggcatcact 300 ctacccgaca atttggttgc taatccagac ttgattgatt cagtcaagga tgtcgacatc 360 atcgttttca acattccaca tcaatttttg ccccgtatct gtagccaatt gaaaggtcat 420 gttgattcac acgtcagagc tatctcctgt ctaaagggtt ttgaagttgg tgctaaaggt 480 gtccaattgc tatcctctta catcactgag gaactaggta ttcaatgtgg tgctctatct 540 ggtgctaaca ttgccaccga agtcgctcaa gaacactggt ctgaaacaac agttgcttac 600 cacattccaa aggatttcag aggcgagggc aaggacgtcg accataaggt tctaaaggcc 660 ttgttccaca gaccttactt ccacgttagt gtcatcgaag atgttgctgg tatctccatc 720 tgtggtgctt tgaagaacgt tgttgcctta ggttgtggtt tcgtcgaagg tctaggctgg 780 ggtaacaacg cttctgctgc catccaaaga gtcggtttgg gtgagatcat cagattcggt 840 caaatgtttt tcccagaatc tagagaagaa acatactacc aagagtctgc tggtgttgct 900 gatttgatca ccacctgcgc tggtggtaga aacgtcaagg ttgctaggct aatggctact 960 tctggtaagg acgcctggga atgtgaaaag gagttgttga atggccaatc cgctcaaggt 1020 ttaattacct gcaaagaagt tcacgaatgg ttggaaacat gtggctctgt cgaagacttc 1080 ccattatttg aagccgtata ccaaatcgtt tacaacaact acccaatgaa gaacctgccg 1140 gacatgattg aagaattaga tctacatgaa gattag 1176 <210> 11 <211> 587 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 11 Met Leu Trp Lys Arg Thr Cys Thr Arg Leu Ile Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 15 Pro Arg Gly Arg Leu Val Arg Arg Ser Cys Tyr Arg Tyr Ala Ser Thr 20 25 30 Gly Thr Gly Ser Thr Asp Ser Ser Ser Gln Trp Leu Lys Tyr Ser Val 35 40 45 Ile Ala Ser Ser Ala Thr Leu Phe Gly Tyr Leu Phe Ala Lys Asn Leu 50 55 60 Tyr Ser Arg Glu Thr Lys Glu Asp Leu Ile Glu Lys Leu Glu Met Val 65 70 75 80 Lys Lys Ile Asp Pro Val Asn Ser Thr Leu Lys Leu Ser Ser Leu Asp 85 90 95 Ser Pro Asp Tyr Leu His Asp Pro Val Lys Ile Asp Lys Val Val Glu 100 105 110 Asp Leu Lys Gln Val Leu Gly Asn Lys Pro Glu Asn Tyr Ser Asp Ala 115 120 125 Lys Ser Asp Leu Asp Ala His Ser Asp Thr Tyr Phe Asn Thr His His 130 135 140 Pro Ser Pro Glu Gln Arg Pro Arg Ile Ile Leu Phe Pro His Thr Thr 145 150 155 160 Glu Glu Val Ser Lys Ile Leu Lys Ile Cys His Asp Asn Asn Met Pro 165 170 175 Val Val Pro Phe Ser Gly Gly Thr Ser Leu Glu Gly His Phe Leu Pro 180 185 190 Thr Arg Ile Gly Asp Thr Ile Thr Val Asp Leu Ser Lys Phe Met Asn 195 200 205 Asn Val Val Lys Phe Asp Lys Leu Asp Leu Asp Ile Thr Val Gln Ala 210 215 220 Gly Leu Pro Trp Glu Asp Leu Asn Asp Tyr Leu Ser Asp His Gly Leu 225 230 235 240 Met Phe Gly Cys Asp Pro Gly Pro Gly Ala Gln Ile Gly Gly Cys Ile 245 250 255 Ala Asn Ser Cys Ser Gly Thr Asn Ala Tyr Arg Tyr Gly Thr Met Lys 260 265 270 Glu Asn Ile Ile Asn Met Thr Ile Val Leu Pro Asp Gly Thr Ile Val 275 280 285 Lys Thr Lys Lys Arg Pro Arg Lys Ser Ser Ala Gly Tyr Asn Leu Asn 290 295 300 Gly Leu Phe Val Gly Ser Glu Gly Thr Leu Gly Ile Val Thr Glu Ala 305 310 315 320 Thr Val Lys Cys His Val Lys Pro Lys Ala Glu Thr Val Ala Val Val 325 330 335 Ser Phe Asp Thr Ile Lys Asp Ala Ala Ala Cys Ala Ser Asn Leu Thr 340 345 350 Gln Ser Gly Ile His Leu Asn Ala Met Glu Leu Leu Asp Glu Asn Met 355 360 365 Met Lys Leu Ile Asn Ala Ser Glu Ser Thr Asp Arg Cys Asp Trp Val 370 375 380 Glu Lys Pro Thr Met Phe Phe Lys Ile Gly Gly Arg Ser Pro Asn Ile 385 390 395 400 Val Asn Ala Leu Val Asp Glu Val Lys Ala Val Ala Gln Leu Asn His 405 410 415 Cys Asn Ser Phe Gln Phe Ala Lys Asp Asp Asp Glu Lys Leu Glu Leu 420 425 430 Trp Glu Ala Arg Lys Val Ala Leu Trp Ser Val Leu Asp Ala Asp Lys 435 440 445 Ser Lys Asp Lys Ser Ala Lys Ile Trp Thr Thr Asp Val Ala Val Pro 450 455 460 Val Ser Gln Phe Asp Lys Val Ile His Glu Thr Lys Lys Asp Met Gln 465 470 475 480 Ala Ser Lys Leu Ile Asn Ala Ile Val Gly His Ala Gly Asp Gly Asn 485 490 495 Phe His Ala Phe Ile Val Tyr Arg Thr Pro Glu Glu His Glu Thr Cys 500 505 510 Ser Gln Leu Val Asp Arg Met Val Lys Arg Ala Leu Asn Ala Glu Gly 515 520 525 Thr Cys Thr Gly Glu 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agcaaatttt 60 gcatattcgt gttgcagtat tgcgataatg ggagtcttac ttccaacata acggcagaaa 120 gaaatgtgag aaaattttgc atcctttgcc tccgttcaag tatataaagt cggcatgctt 180 gataatcttt ctttccatcc tacattgttc taattattct tattctcctt tattctttcc 240 taacatacca agaaattaat cttctgtcat tcgcttaaac actatatcaa ta 292 <210> 22 <211> 655 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPD promoter <400> 22 agtttatcat tatcaatact cgccatttca aagaatacgt aaataattaa tagtagtgat 60 tttcctaact ttatttagtc aaaaaattag ccttttaatt ctgctgtaac ccgtacatgc 120 ccaaaatagg gggcgggtta cacagaatat ataacatcgt aggtgtctgg gtgaacagtt 180 tattcctggc atccactaaa tataatggag cccgcttttt aagctggcat ccagaaaaaa 240 aaagaatccc agcaccaaaa tattgttttc ttcaccaacc atcagttcat aggtccattc 300 tcttagcgca actacagaga acaggggcac aaacaggcaa aaaacgggca caacctcaat 360 ggagtgatgc aacctgcctg gagtaaatga tgacacaagg caattgaccc acgcatgtat 420 ctatctcatt ttcttacacc ttctattacc ttctgctctc tctgatttgg aaaaagctga 480 aaaaaaaggt tgaaaccagt tccctgaaat tattccccta cttgactaat aagtatataa 540 agacggtagg tattgattgt aattctgtaa atctatttct taaacttctt aaattctact 600 tttatagtta gtcttttttt tagttttaaa acaccagaac ttagtttcga cggat 655 <210> 23 <211> 289 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYC promoter <400> 23 atttggcgag cgttggttgg tggatcaagc ccacgcgtag gcaatcctcg agcagatccg 60 ccaggcgtgt atatatagcg tggatggcca ggcaacttta gtgctgacac atacaggcat 120 atatatatgt gtgcgacgac acatgatcat atggcatgca tgtgctctgt atgtatataa 180 aactcttgtt ttcttctttt ctctaaatat tctttcctta tacattagga cctttgcagc 240 ataaattact atacttctat agacacgcaa acacaaatac acacactaa 289 <210> 24 <211> 401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEF promoter <400> 24 atagcttcaa aatgtttcta ctcctttttt actcttccag attttctcgg actccgcgca 60 tcgccgtacc acttcaaaac acccaagcac agcatactaa atttcccctc tttcttcctc 120 tagggtgtcg ttaattaccc gtactaaagg tttggaaaag aaaaaagaga ccgcctcgtt 180 tctttttctt cgtcgaaaaa ggcaataaaa atttttatca cgtttctttt tcttgaaaat 240 tttttttttg atttttttct ctttcgatga cctcccattg atatttaagt taataaacgg 300 tcttcaattt ctcaagtttc agtttcattt ttcttgttct attacaactt tttttacttc 360 ttgctcatta gaaagaaagc atagcaatct aatctaagtt t 401 <210> 25 <211> 1468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH promoter <400> 25 gccgggatcg aagaaatgat ggtaaatgaa ataggaaatc aaggagcatg aaggcaaaag 60 acaaatataa gggtcgaacg aaaaataaag tgaaaagtgt tgatatgatg tatttggctt 120 tgcggcgccg aaaaaacgag tttacgcaat tgcacaatca tgctgactct gtggcggacc 180 cgcgctcttg ccggcccggc gataacgctg ggcgtgaggc tgtgcccggc ggagtttttt 240 gcgcctgcat tttccaaggt ttaccctgcg ctaaggggcg agattggaga agcaataaga 300 atgccggttg gggttgcgat gatgacgacc acgacaactg gtgtcattat ttaagttgcc 360 gaaagaacct gagtgcattt gcaacatgag tatactagaa gaatgagcca agacttgcga 420 gacgcgagtt tgccggtggt gcgaacaata gagcgaccat gaccttgaag gtgagacgcg 480 cataaccgct agagtacttt gaagaggaaa cagcaatagg gttgctacca gtataaatag 540 acaggtacat acaacactgg aaatggttgt ctgtttgagt acgctttcaa ttcatttggg 600 tgtgcacttt attatgttac aatatggaag ggaactttac acttctccta tgcacatata 660 ttaattaaag tccaatgcta gtagagaagg ggggtaacac ccctccgcgc tcttttccga 720 tttttttcta aaccgtggaa tatttcggat atccttttgt tgtttccggg tgtacaatat 780 ggacttcctc ttttctggca accaaaccca tacatcggga ttcctataat accttcgttg 840 gtctccctaa catgtaggtg gcggagggga gatatacaat agaacagata ccagacaaga 900 cataatgggc taaacaagac tacaccaatt acactgcctc attgatggtg gtacataacg 960 aactaatact gtagccctag acttgatagc catcatcata tcgaagtttc actacccttt 1020 ttccatttgc catctattga agtaataata ggcgcatgca acttcttttc tttttttttc 1080 ttttctctct cccccgttgt tgtctcacca tatccgcaat gacaaaaaaa tgatggaaga 1140 cactaaagga aaaaattaac gacaaagaca gcaccaacag atgtcgttgt tccagagctg 1200 atgaggggta tctcgaagca cacgaaactt tttccttcct tcattcacgc acactactct 1260 ctaatgagca acggtatacg gccttccttc cagttacttg aatttgaaat aaaaaaaagt 1320 ttgctgtctt gctatcaagt ataaatagac ctgcaattat taatcttttg tttcctcgtc 1380 attgttctcg ttccctttct tccttgtttc tttttctgca caatatttca agctatacca 1440 agcatacaat caactccaag ctggccgc 1468 <210> 26 <211> 252 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYC1 terminator <400> 26 tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg 60 aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt 120 tagtattaag aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt 180 acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt 240 taatttgcgg cc 252 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 ttgcataata ttgtccgctg 20 <210> 28 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattaca gggaacaaac ccaaatctga ttccaaggag 60 a 61 <210> 29 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt ctgttgaatt ggcttaagtc tgggtcc 57 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gtgtctagtc ttctattacg ct 22 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 ttgagataag cacactgca 19 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 caacatcacc caattcatcg 20 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 aacaaatcaa acacccacac c 21 <210> 34 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattact ataactacga aactgccaat accaagcca 59 <210> 35 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt tcgtttacaa caactaccca atgaagaacc 60 60 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 aaatacaccc atacatacgg ac 22 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 gtcctcggta gatcaggtc 19 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 aagtacatcc ttgtcgagcc 20 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 tctctataat gaagaccctt gtgc 24 <210> 40 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattact atgcgggaac tgtattagcg acatagg 57 <210> 41 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt cgacgtgctg tataatgaag tttatgaggg 60 60 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 gtggatattt acagaacgat gc 22 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 gcacaacacg agatctttca c 21 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 aaagagaaga ggtacaaagg agg 23 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 gtacggctcc tcaactctc 19 <210> 46 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattaca cggaagctca agaaatcttt ccagc 55 <210> 47 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt gctattgacc caaagagaat catgaac 57 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 tctctgatgc tgccaatagt c 21 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 cgtagccata ctaacttggt 20 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 tcatcacact ttgaacactg g 21 <210> 51 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 ctatagggcg aattggactg taccgaatat ctgtgtccta atga 44 <210> 52 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 ctcgaggggg ggcccggtac ctattgatat agtgtttaag cgaatgacag aag 53 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 tctcaccata tccgcaatga 20 <210> 54 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattacc aaggaagaaa gggaacgaga acaatgacga 60 g 61 <210> 55 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt gggtcaaatc gttggtagat acgttgttga 60 60 <210> 56 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 gtggaagaac gattacaaca gg 22 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 gtagccctag acttgatagc c 21 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 tgaatgacga tgaagataga gcc 23 <210> 59 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 gtttcgacgg attctagaaa acaatgggtt ccgagacaaa acattctgca 50 <210> 60 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 ctaattacat gactcgagtc aaacaaaact aggtttgggt agcgct 46 <210> 61 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 ctatagggcg aattggctag cttatcatta tcaatactcg ccatttcaaa gaata 55 <210> 62 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 taaggataag cagaaccgcg tgacataact aattacatga ctcgag 46 <210> 63 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 aatcttgtgc tattgcagtc ctcttttata tacagtataa tacgactcac tatagggcg 59 <210> 64 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 atgcgaattg cgtaattcac ggcgataacg tagtattaat taaccctcac taaagggaac 60 60 <210> 65 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 gcccacaact tatcaagtg 19 <210> 66 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 ttataagaca agcgcaggg 19 <210> 67 <211> 5457 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCtB1 vector <400> 67 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtacgcatt taagcataaa cacgcactat gccgttcttc tcatgtatat 180 atatatacag gcaacacgca gatataggtg cgacgtgaac agtgagctgt atgtgcgcag 240 ctcgcgttgc attttcggaa gcgctcgttt tcggaaacgc tttgaagttc ctattccgaa 300 gttcctattc tctagctaga aagtatagga acttcagagc gcttttgaaa accaaaagcg 360 ctctgaagac gcactttcaa aaaaccaaaa acgcaccgga ctgtaacgag ctactaaaat 420 attgcgaata ccgcttccac aaacattgct caaaagtatc tctttgctat atatctctgt 480 gctatatccc tatataacct acccatccac ctttcgctcc ttgaacttgc atctaaactc 540 gacctctaca ttttttatgt ttatctctag tattactctt tagacaaaaa aattgtagta 600 agaactattc atagagtgaa tcgaaaacaa tacgaaaatg taaacatttc ctatacgtag 660 tatatagaga caaaatagaa gaaaccgttc ataattttct gaccaatgaa gaatcatcaa 720 cgctatcact ttctgttcac aaagtatgcg caatccacat cggtatagaa tataatcggg 780 gatgccttta tcttgaaaaa atgcacccgc agcttcgcta gtaatcagta aacgcgggaa 840 gtggagtcag gcttttttta tggaagagaa aatagacacc aaagtagcct tcttctaacc 900 ttaacggacc tacagtgcaa aaagttatca agagactgca ttatagagcg cacaaaggag 960 aaaaaaagta atctaagatg ctttgttaga aaaatagcgc tctcgggatg catttttgta 1020 gaacaaaaaa gaagtataga ttctttgttg gtaaaatagc gctctcgcgt tgcatttctg 1080 ttctgtaaaa atgcagctca gattctttgt ttgaaaaatt agcgctctcg cgttgcattt 1140 ttgttttaca aaaatgaagc acagattctt cgttggtaaa atagcgcttt cgcgttgcat 1200 ttctgttctg taaaaatgca gctcagattc tttgtttgaa aaattagcgc tctcgcgttg 1260 catttttgtt ctacaaaatg aagcacagat gcttcgttaa tgtgctgcaa ggcgattaag 1320 ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgaattgta 1380 atacgactca ctatagggcg aattgggtac cgggcccccc ctcgaggtcg acggtatcga 1440 taagcttgat atcgaattcc tgcagcccgg gggatccact agttctagag cggccgccac 1500 cgcggtggag ctcggttctg cttatcctta cgacgtgcct gactacgcct gaacccgatg 1560 caaatgagac gatcgtctat tcctggtccg gttttctctg ccctctcttc tattcacttt 1620 ttttatactt tatataaaat tatataaatg acataactga aacgccacac gtcctctcct 1680 attcgttaac gcctgtctgt agcgctgtta ctgaagctgc gcaagtagtt ttttcaccgt 1740 ataggccctc tttttctctc tctttctttc tctcccgcgc tgatctcttc ttcgaaacac 1800 agagtgcacc ataccacctt ttcaattcat catttttttt ttattctttt ttttgatttc 1860 ggtttccttg aaattttttt gattcggtaa tctccgaaca gaaggaagaa cgaaggaagg 1920 agcacagact tagattggta tatatacgca tatgtagtgt tgaagaaaca tgaaattgcc 1980 cagtattctt aacccaactg cacagaacaa aaacctccag gaaacgaaga taaatcatgt 2040 cgaaagctac atataaggaa cgtgctgcta ctcatcctag tcctgttgct gccaagctat 2100 ttaatatcat gcacgaaaag caaacaaact tgtgtgcttc attggatgtt cgtaccacca 2160 aggaattact ggagttagtt gaagcattag gtcccaaaat ttgtttacta aaaacacatg 2220 tggatatctt gactgatttt tccatggagg gcacagttaa gccgctaaag gcattatccg 2280 ccaagtacaa ttttttactc ttcgaagaca gaaaatttgc tgacattggt aatacagtca 2340 aattgcagta ctctgcgggt gtatacagaa tagcagaatg ggcagacatt acgaatgcac 2400 acggtgtggt gggcccaggt attgttagcg gtttgaagca ggcggcagaa gaagtaacaa 2460 aggaacctag aggccttttg atgttagcag aattgtcatg caagggctcc ctatctactg 2520 gagaatatac taagggtact gttgacattg cgaagagcga caaagatttt gttatcggct 2580 ttattgctca aagagacatg ggtggaagag atgaaggtta cgattggttg attatgacac 2640 ccggtgtggg tttagatgac aagggagacg cattgggtca acagtataga accgtggatg 2700 atgtggtctc tacaggatct gacattatta ttgttggaag aggactattt gcaaagggaa 2760 gggatgctaa ggtagagggt gaacgttaca gaaaagcagg ctgggaagca tatttgagaa 2820 gatgcggcca gcaaaactaa tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc 2880 ccccacatcc gctctaaccg aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat 2940 ttattttttt atagttatgt tagtattaag aacgttattt atatttcaaa tttttctttt 3000 ttttctgtac agacgcgtgt acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt 3060 tttgggacgc tcgaaggctt taatttgcgt ctgtagcgct gttactgaag ctgcgcaagt 3120 agttttttca ccgtataggc cctctttttc tctctctttc tttctctccc gcgctgatct 3180 cttcttcgaa acatcatgaa taaaaagaaa aaggaaatca agaaaaaaaa gccataattt 3240 atcccacatt tttttttatt gtcgctgttc acaccgcata acgaagatat tggctagcta 3300 accagctttt gttcccttta gtgagggtta atttcgagct tggcgtaatc atggtcatag 3360 ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc 3420 ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc 3480 tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 3540 cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg 3600 ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg 3660 ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag 3720 gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 3780 gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 3840 taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 3900 accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 3960 tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 4020 cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 4080 agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 4140 gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca 4200 gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 4260 tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 4320 acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 4380 cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc 4440 acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 4500 acttggtctg acatcagaag aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat 4560 cgggagcggc gataccgtaa agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt 4620 cagcaatatc acgggtagcc aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc 4680 cacagtcgat gaatccagaa aagcggccat tttccaccat gatattcggc aagcaggcat 4740 cgccatgggt cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgct cgccttgagc ctggcgaaca 4800 gttcggctgg cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg 4860 cttccatccg agtacgtgct cgctcgatgc gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg 4920 tagccggatc aagcgtatgc agccgccgca ttgcatcagc catgatggat actttctcgg 4980 caggagcaag gtgagatgac aggagatcct gccccggcac ttcgcccaat agcagccagt 5040 cccttcccgc ttcagtgaca acgtcgagca cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca 5100 gccacgatag ccgcgctgcc tcgtcttgca gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct 5160 tgacaaaaag aaccgggcgc ccctgcgctg acagccggaa cacggcggca tcagagcagc 5220 cgattgtctg ttgtgcccag tcatagccga atagcctctc cacccaagcg gccggagaac 5280 ctgcgtgcaa tccatcttgt tcaattcgag tgcattcaac atcagccata ctcttccttt 5340 ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 5400 gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccac 5457

Claims (20)

  1. 모세포에 비하여, EDC 효소의 활성이 증가되어 있는, 락테이트 생산능을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포로서,
    상기 효모 세포는 EDC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가되어 있는 것이고,
    피루베이트를 L-락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이고,
    추가로 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 피루베이트를 D-락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 파괴된 변이를 갖는 것인 효모 세포.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 효모 세포는 상기 EDC을 코딩하는 유전자의 카피 수 증가 또는 상기 EDC을 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열의 변형을 갖는 것인 효모 세포.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 효모 세포는 EDC를 코딩하는 외인성 유전자를 갖는 것인 효모 세포.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 EDC 효소는 EDC1 효소 또는 EDC2 효소인 것인 효모 세포.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 EDC2 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 효모 세포.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 EDC2 효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산을 코딩하는 것인 효모 세포.
  8. 청구항 1에 있어서, 사카로마이세스 (Saccharomyces), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 캔디다 (Candida), 피치아 (Pichia), 이사첸키아 (Issatchenkia), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces), 쉬조사카로마이세스 (Shizosaccharomyces) 또는 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis) 속인 것인 효모 세포.
  9. 청구항 1에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애인 것인 효모 세포.
  10. 청구항 1에 있어서, 미호기성 또는 혐기성 조건에서 락테이트 생산능을 갖는 것인 효모 세포.
  11. 삭제
  12. 청구항 1에 있어서, 피루베이트를 L-락테이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 효모 세포.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 효모 세포에 EDC 효소를 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계;
    피루베이트를 L-락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계; 및
    피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 피루베이트를 D-락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 파괴하는 단계를 포함하는 락테이트를 생산하는 효모 세포를 제조하는 방법.
  16. 삭제
  17. 청구항 15에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애인 것인 방법.
  18. 청구항 1의 효모 세포를 배양하여 락테이트를 생산하는 단계를 포함하는 락테이트를 생산하는 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  20. 청구항 18에 있어서, 상기 배양은 미세호기 (microaerobic) 조건에서 수행되는 것인 방법.
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