KR101431604B1 - ＭｕＳ１ 유전자를 이용한 비생물적 스트레스 내성 또는 바이오 에탄올 생산이 증진된 형질전환 효모의 제조 방법 및 그에 따른 효모 - Google Patents

ＭｕＳ１ 유전자를 이용한 비생물적 스트레스 내성 또는 바이오 에탄올 생산이 증진된 형질전환 효모의 제조 방법 및 그에 따른 효모 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고구마 유래의 MuS1(multiple stress responsible gene 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 효모에 형질전환시켜 MuS1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 효모의 비생물적 스트레스 내성 또는 발효 수율을 증가시키는 방법에 관한 것으로, MuS1 유전자를 이용하여 비생물적 스트레스에 강한 다양한 작물을 개발할 수 있고, 또한 상기 유전자를 도입시킨 산업적으로 매우 유용한 형질전환 효모를 제조하여 스트레스 내성의 증진으로 인해 당 바이오매스로부터 바이오 연료 생산 시 발효 수율을 향상시킬 수 있다.

Description

ＭｕＳ１ 유전자를 이용한 비생물적 스트레스 내성 또는 바이오 에탄올 생산이 증진된 형질전환 효모의 제조 방법 및 그에 따른 효모{Method for producing transgenic yeast with increased resistance to abiotic stress or bioethanol production using MuS1 gene and the yeast thereof}
본 발명은 MuS1 유전자를 이용한 비생물적 스트레스 내성 또는 바이오 에탄올 생산이 증진된 형질전환 효모의 제조 방법 및 그에 따른 효모에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고구마(Ipomoea batatas) 유래의 MuS1(multiple stress responsible gene 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 효모에 형질전환시켜 MuS1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 효모의 비생물적 스트레스 내성 또는 발효 수율을 증가시키는 방법, 상기 MuS1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 효모를 형질전환하는 단계를 포함하는 비생물적 스트레스 내성 또는 발효 수율이 증가된 형질전환 효모의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 비생물적 스트레스 내성 또는 발효 수율이 증가된 형질전환 효모 및 상기 MuS1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 효모의 비생물적 스트레스 내성 또는 발효 수율 증진용 조성물에 관한 것이다.
최근 급속한 산업화와 인구증가에 의해 지구규모의 환경문제와 식량문제가 제기되고 있어 사막화지역, 공해지역, 추운지역 등의 조건이 불리한 지역에서도 잘 자라는 환경재해 내성 농작물 개발이 활발히 이루어지고 있다. 고구마(Ipomoea batatas L. Lam)는 비교적 척박한 땅에도 재배가 가능할 뿐만 아니라 헥타르당 생산량이 약 22톤으로 높아 식량과 가축사료로 이용되는 대표적인 뿌리작물이다. 특히 고구마는 건물 중의 약 70%가 전분으로 이루어져 주정의 원료 작물로 오래전부터 이용되었으며, 바이오 에탄올 생산을 위한 친환경 대체에너지 작물로 최근 재조명되고 있다. 또한, 최근 건조를 포함한 다양한 스트레스 조건에서 고구마의 어린 뿌리에 특이적으로 과발현하는 유전자가 보고되고 있으며, 이러한 관점에서 스트레스 조건에서 특이적으로 강하게 발현하는 유전자의 분리는 환경재해 내성 식물체 및 각종 유용소재를 개발하는데 유용하게 이용될 수 있을 것이다(Kim et al., 2008 Plant Physiol Biochem 46, 196-204).
상기 유전자들 중에서, MuS1(multiple stress responsible gene I)은 고구마 뿌리의 건조에 반응하여 유도되는 것으로 알려져 있다. MuS1 발현은 고구마 식물에서 건조, 고염, 중금속 산화 및 식물 호르몬을 포함하는 다양한 스트레스에 의해 고도로 유도된다고 보고된 바 있다(Seo et al ., 2010 Genes Genome 32, 544-552). 그러나 MuS1 발현과 관련된 내성 메커니즘은 많은 종들에서 거의 알려져 있지 않다. 최근, 카드뮴 내성 메커니즘이 담배 식물에서 일부 보고되었고, 상기 메커니즘은 카드뮴 티올(cadmium thiol) 화합물, 전좌된 메탈로티오네인(metallothioneins) 및 피토켈라틴(phytochelatins)을 포함하는 복합체의 형성 및 형질전환 담배 식물의 액포 내 상기 복합체들의 후속적인 축적을 수반한다고 알려져 있다(Kim et al ., 2011 Plant Biotechnol. Rep. 5, 323-329). 본 발명에서는 MuS1이 다양한 스트레스 반응의 양성 조절자로서의 기능을 하고, 스트레스-내성 형질전환 식물 또는 효모 균주 개선에 유용하게 이용될 수 있다는 가능성을 확인하였다.
한편, 미생물의 발효에 의한 바이오 에탄올 생산 방식은 당질, 전분질 원료를 사용하여 미생물로 발효시켜 제조된다. 그러나, 현재의 에탄올 생산 방식은 에너지 수지면에서 개선이 필요하고, 단위 발효 용적당 생산성도 좋지 않으며 에탄올 함량이 낮아 증류 비용이 많이 요구된다. 이 때문에 최근 생산성 향상 및 생산비용 절감을 목적으로 새로운 발효기술 개발이 요구되고 있다.
한국등록특허 제0930593호에는 '고구마 뿌리 유래의 swDREB1 단백질 및 이를 코딩하는 유전자'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1073145호에는 '고수율 에탄올 생산 효모인 사카로마이세스 세레비지애 KK1과 이를 이용한 에탄올 발효법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 MuS1 유전자를 이용한 비생물적 스트레스 내성 또는 발효 수율이 증진된 형질전환 효모의 제조 방법 및 그에 따른 효모에 대해서는 기재된 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 고구마 유래의 MuS1(multiple stress responsible gene 1) 유전자를 과발현시킨 형질전환 효모가 염, 중금속, 에탄올 또는 젖산 등의 다양한 비생물적 스트레스에 내성을 나타내고, MuS1 유전자를 과발현시킨 형질전환 효모의 에탄올 발효 수율이 증가된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 고구마 유래의 MuS1(multiple stress responsible gene 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 효모에 형질전환시켜 MuS1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 효모의 비생물적 스트레스 내성 또는 발효 수율을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 MuS1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 효모를 형질전환하는 단계를 포함하는 비생물적 스트레스 내성 또는 발효 수율이 증가된 형질전환 효모의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 비생물적 스트레스 내성 또는 발효 수율이 증가된 형질전환 효모를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 MuS1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 효모의 비생물적 스트레스 내성 또는 발효 수율 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명을 통해, 다양한 스트레스 반응의 양성 조절자(positive regulator)로 작용하는 것으로 확인된 MuS1 유전자를 이용하여 비생물적 스트레스에 강한 다양한 작물을 개발할 수 있고, 또한 상기 유전자를 도입시킨 산업적으로 매우 유용한 형질전환 효모를 제조하여 스트레스 내성의 증진으로 인해 당 바이오매스로부터 바이오 연료 생산 시 발효 수율을 향상시킬 수 있다.
도 1은 MuS1 -발현 벡터의 모식도 및 MuS1 유전자의 발현 양상을 나타낸다. (A) MuS1 -발현 구축물의 도식적 다이어그램을 나타낸다. GPDp; GPD 프로모터, CYCt; CYC 종결자, URA3; 선별가능 마커로서 우라실을 코딩하는 유전자를 나타낸다. 화살표는 발현 방향을 나타낸다. (B) semiRT-PCR을 이용한 전사 수준에서의 MuS1 발현 분석을 나타낸다. PDA1의 산물은 하우스키핑 표준(housekeeping standard)으로 사용하였다. WT는 벡터 단독의 야생형 균주를 나타내고, TG는 MuS1 -발현 효모 균주를 나타낸다.
도 2는 MuS1 형질전환 효모의 스트레스 내성 분석을 나타낸다. 중-지수증식기(mid-log phase)의 효모 세포를 외인적 자극의 부재(A), 30mM H2O2(B), 0.6mM 메나디온(C), 10mM CdCl2(D), 10mM CuCl2(E), 0.1M FeCl2(F), 0.2M ZnSO4(G), 5M NaCl(H), 12%(I) 또는 16%(J) 에탄올, 또는 1M 젖산(K)을 포함하는 스트레스의 존재 하에 1시간 동안 30℃에서 진탕하면서 외인적 자극에 노출시켰고, 이어서 연속으로 희석했다 (100 내지 10-4). 희석된 용액(5㎕)을 YPD(yeast peptone dextrose) 아가 배지에 스팟팅하고, 2 내지 3일 동안 30℃에서 배양하였다. WT는 벡터 단독의 야생형 균주를 나타내고, TG는 MuS1 -발현 효모 균주를 나타낸다.
도 3은 MuS1 형질전환 효모의 회분식 발효(batch fermentation) 과정 동안의 발효 수율 및 세포 생존률을 나타낸다. (A) 회분식 에탄올 발효 과정 동안 TG 및 WT 균주 사이의 알콜 산출량 및 잔류 글루코스 함량을 나타낸다. 삼각형; TG 균주의 알콜 산출량, 역삼각형; WT 균주의 알콜 산출량, 원형; TG 균주의 잔류 글루코스 함량, 사각형; WT 균주의 잔류 글루코스 함량을 나타낸다. (B) 회분식 에탄올 발효 과정 동안 TG 균주 및 WT 균주 사이의 세포 생존률을 나타낸다. 세포 생존은 발효 24, 48 및 72시간 후 얻은 세포로 스팟팅 분석을 수행하여 결정하였다. 세포를 100부터 10-9까지 연속으로 희석하고, 이어서 YPD 아가 플레이트에 스팟팅하였다. WT는 벡터 단독의 야생형 균주를 나타내고, TG는 MuS1 -발현 효모 균주를 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 고구마 유래의 MuS1(multiple stress responsible gene 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 효모에 형질전환시켜 MuS1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 효모의 비생물적 스트레스 내성 또는 발효 수율을 증가시키는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 MuS1 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자 상동체는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
효모 발현 벡터는 프로모터 유전자, 해독개시 및 종결코돈이 제거된 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 터미네이터를 포함하며, 프로모터 유전자는 GAPDH, PGK, ADH, PHO5, GAL1 및 GAL10으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 효모 발현 벡터는 조합 효모 플라스미드(YIp : integrative yeast plasmid) 및 염색체 외 플라스미드 벡터(extrachromosomal plasmid vector)가 모두 가능하다. 상기 염색체 외 플라스미드 벡터는 에피솜 효모 플라스미드(YEp : episomal yeast plasmid), 복제 효모 플라스미드(YRp : replicative yeast plasmid) 및 효모 중심체 플라스미드(YCp : yeast centromer plasmid)로 나뉘어진다. 더 나아가, 인위적 효모 염색체들(YACs : artificial yeast chromosomes)도 본 발명에 따른 발현 벡터로서 가능하다.
또한, 특히 바람직한 효모 벡터는 복제 원점 ori 및 항생물질 저항성 카세트(antibiotic resistance cassette)를 함유하여 대장균(E. coli)에서 증식되고 선택될 수 있는 효모 복제 플라스미드(yeast replication plasmid)이다. 더 나아가, 이들은 H. polymorpha로부터의 HARS1과 같이 효모 세포에서 염색체와 관계없이 독립적 복제를 할 수 있는 ARS 서열, 그리고 URA3 또는 HLEU2와 같은 대사성 효모 선택 마커(metabolic yeast selection marker)를 가진다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 비생물적 스트레스는 과산화수소, 메나디온(menadione), 고염, 중금속, 에탄올 또는 젖산(lactic acid)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 중금속은 바람직하게는 카드뮴, 구리, 철 또는 아연일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 메나디온(menadione)은 비타민 K의 일종으로, 활성화 산소를 유발하고, 미생물이나 식물 플랑크톤에 대해 생육 억제 활성이 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 발효는 에탄올 발효일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 에탄올 발효는 과당과 같은 당분이 효모에 의해 이산화탄소 및 에탄올로 분해하여 이루어지는 발효로서, 발효 과정 중, 당분이나 전분이 당으로 분해되고 상기 당분을 젖산균이 젖산으로 변화시키면서 재료의 pH가 저하되거나 잡균이 사라지게 된다. 효모의 입장에서 당분 및 에탄올의 급격한 농도 변화는 스트레스로 작용하게 되는데, 본 발명의 MuS1 형질전환 효모는 젖산 또는 에탄올에 내성을 나타내어 발효 과정 동안의 스트레스에 큰 자극을 받지 않고, 발효 수율이 증가한 것을 확인하였다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 고구마 유래의 MuS1(multiple stress responsible gene 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 효모를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 효모를 배양하는 단계를 포함하는 비생물적 스트레스 내성 또는 발효 수율이 증가된 형질전환 효모의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하는 방법은 당업계에 공지된 일반적인 방법을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
효모의 형질전환은 핵산 분자 또는 벡터를 당업자에게 공지된 표준 방법, 바람직하게는 전기천공, 화학적 형질전환, 원형질 융합에 의한 형질전환, 또는 입자 밤바드먼트(bombardment)에 의해 세포 내로 도입되게 한다(참조: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Edited by: Fred M. Ausubel et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) , J. Sambrook and D. Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 비생물적 스트레스는 과산화수소, 메나디온(menadione), 고염, 중금속, 에탄올 또는 젖산(lactic acid)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 중금속은 바람직하게는 카드뮴, 구리, 철 또는 아연일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 발효는 에탄올 발효일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 비생물적 스트레스 내성 또는 발효 수율이 증가된 형질전환 효모를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 고구마 유래의 MuS1(multiple stress responsible gene 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는, 효모의 비생물적 스트레스 내성 또는 발효 수율 증진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 MuS1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하며, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 효모에 형질전환시킴으로써 효모의 비생물적 스트레스에 대한 내성 또는 발효 수율을 증진시킬 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1) MuS1 cDNA 클로닝 및 RT - PCR 분석
고구마(Ipomoea batatas (L.) Lam. cv. Yulmi) 뿌리에서 분리한 MuS1이 삽입된 TA 클로닝 벡터는 김선형 박사(서울시립대, 한국)로부터 제공받았다. 서열 정확성을 확인 후, MuS1을 제한효소 BamHI 및 EcoRI으로 절단시키고, 효모 발현 벡터 p426GPD의 상응하는 부위에 라이게이션하였다(도 1A). MuS1을 포함한 구축물은 PEG/LiCl 방법(Gietz and Woods, 2001 Biotechniques 30, 816-820)을 이용하여 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) BY4741(MATa, his3 Δ1, leu2 Δ0, met15 Δ0, ura3 Δ0)에 형질전환시켰다. 형질전환체들은 우라실이 없는 효모 합성 드롭-아웃(drop-out) 배지로 선별하였다. MuS1의 이소성 발현(ectopic expression)은 semiRT-PCR로 확인하였다. RNA 정제 키트(Promega)를 이용하여 중-지수증식기(mid-log phase)의 효모 세포(A600=2.0)로부터 총 RNA를 분리하였다. RT-PCR은 센스 5'-TCGGTCCCGTTTACGATAAG-3'(서열번호 2) 및 안티센스 프라이머 5'-ATGGAAGATACGACGCAACC-3'(서열번호 3)로 One-Step RT-PCR PreMix 키트(Intron)를 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 수행하였다. PCR 조건은 45℃에서 30분 동안의 cDNA 합성을 위한 역전사 반응; 94℃에서 5분 동안의 최초 변성; 94℃에서 30초 변성, 56℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 1분 중합의 25회 반응; 이어서 72℃에서의 추가적인 7분 중합으로 수행하였다. PDA1 유전자를 하우스키핑(housekeeping) 대조군으로 이용하였다.
2) 비생물적 스트레스 처리
MuS1 발현이 외인적(exogenous) 자극에 대한 스트레스 반응을 개선시키는지 여부를 시험하기 위해, 스팟팅 분석(spotting assay)을 수행하였다. 중-지수증식기의 효모 세포를 30℃에서 1시간 동안 30mM 과산화수소(H2O2), 0.6mM 메나디온(menadione), 10mM 카드뮴(CdCl2), 10mM 구리(CuCl2), 0.1M 철(FeCl2), 0.2M 아연(ZnSO4), 5M 염(NaCl), 12% 및 16% 에탄올 또는 1M 젖산(lactic acid)에 진탕(160rpm)하면서 노출시키고, 이어서 연속적으로 희석하였다(100 내지 10-4). 희석된 용액(5㎕)을 YPD(yeast peptone dextrose) 아가 배지에 스팟팅(spotting)한 후, 2 내지 3일간 30℃에서 배양하였다.
3) 발효 수율 분석
MuS1 -발현 TG(transgenic) 효모 균주의 에탄올 발효 수율을 분석하였다. TG 및 WT(wild type) 효모 균주를 포함하는 실험실-규모의 회분식 발효(batch fermentation)를 1% 효모 추출물 및 20% 글루코스를 함유하는 YG(yeast extract glucose) 배지에 30℃(공업용 발효에서 가장 빈번히 사용되는 일반적인 온도)에서 72시간 동안 수행하였다. 상기 효모 균주의 알콜 산출량 및 잔류 글루코스 함량을 측정하여 에탄올 발효 수율을 분석하였다. 회분식 발효는 4% 배양액(초기 A600 = 0.2)을 YG 배지에 접종하여 개시하였다. 산출된 알콜 농도는 알콜 비중계(hydrometer)에 따라 발효 후 증류물 내의 알콜의 백분율(v/v)로 결정하였다. 잔류하는 총 글루코스 농도는 세포를 스핀 다운하기 위해 원심분리 후 휴대용 굴절계(hand-held refractometer)를 이용하여 측정하였다.
또한, 회분식 발효 과정의 효모 세포를 24, 48 및 72시간에 수집하여 연속적으로 희석하였다(100 내지 10-9). 희석된 용액(5㎕)을 YPD 배지에 스팟팅한 후, 배양하여 세포 생존률을 분석하였다.
실시예 1. MuS1 형질전환 효모의 발현 분석
MuS1으로 형질전환시킨 효모 균주(transgenic, TG) 및 대조군으로 사용한 벡터만을 가진 효모 균주(wild type, WT)의 semiRT-PCR을 이용한 전사 수준에서의 MuS1 발현을 분석하였다. PDA1 RNA를 하우스키핑(housekeeping) 대조군으로 사용하였다.
그 결과, 도 1B에 나타낸 바와 같이, MuS1을 보유한 형질전환 효모 균주(TG)에서 단일 밴드의 MuS1이 검출된 반면, 벡터 단독의 효모 균주(WT)에서는 신호가 검출되지 않았다.
실시예 2. MuS1 형질전환 효모의 스트레스 내성 분석
MuS1으로 형질전환시킨 효모에 비생물적 스트레스 자극을 처리한 후, 스트레스 자극에 대한 내성을 분석하였다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, MuS1의 이소성 발현은 WT 균주에 비해 카드뮴 스트레스에 대한 TG 균주의 후천적 내성을 증진시킨 것을 확인하였다. 게다가, TG 균주는 카드뮴(CdCl2, 도 2D) 뿐만 아니라 구리(CuCl2, 도 2E), 철(FeCl2, 도 2F) 또는 아연(ZnSO4, 도 2G)의 중금속 스트레스에 대한 내성이 증가된 것으로 나타났다. 또한, TG 균주는 염(NaCl, 도 2H), 과산화수소(H2O2, 도 2B), 메나디온(MD, 도 2C), 에탄올(도 2I 및 2J) 또는 젖산(lactic acid, 도 2K)의 자극에 대하여 WT 균주에 비해 내성이 증진된 것을 확인하였다. 그러나, MuS1-발현 TG 균주는 t-BOOH(tert-butylhydroperoxide), 아세트산 및 고온에 대해서는 민감한 것으로 나타났다(데이터 미제시). 상기 결과는 MuS1이 다양한 스트레스 반응의 양성 조절자로서의 기능을 하고, 스트레스-내성 형질전환 효모가 유용하게 이용될 수 있다는 점을 나타낸다.
실시예 3. MuS1 형질전환 효모의 발효 수율 분석
MuS1 형질전환 효모의 에탄올 발효 수율을 알콜 산출량, 잔류 글루코스 함량 및 30℃(공업용 발효에서 가장 빈번히 사용되는 일반적인 온도)에서의 세포 생존으로 분석하였다. 그 결과, TG 및 WT 균주 사이의 알콜 산출량, 잔류 글루코스 함량 및 세포 생존률이 현저히 상이한 것을 확인하였다(도 3). 회분식 에탄올 발효 과정 동안, TG 균주의 알콜 산출량은 WT 균주의 알콜 산출량보다 10% 더 높았고, 잔류 글루코스 함량은 알콜 산출량과 반비례하여 TG 균주의 잔류 글루코스 함량이 WT 균주보다 낮은 것으로 나타났다(도 3A). 세포의 생존률 또한 MuS1 형질전환 TG 균주에서 WT 균주보다 더 높은 것을 확인하였다(도 3B). 상기 결과는 MuS1 발현이 발효 수율에 영향을 준다는 것을 나타내고, 이것은 TG 균주의 발효 과정 동안 산출된 발효 수율과 일치하는 잘 선별된 인자라는 것을 나타낸다. 그러나, 발효 과정 동안의 MuS1의 후천적 메커니즘은 아직 알려지지 않았다.
상기 결과는 적어도 진핵세포 시스템에서 MuS1의 기능과 관련하여, MuS1 -발현이 비생물적 스트레스의 공격에 대한 보호 작용을 할 수 있다는 점을 나타내며, 이는 개선된 산화환원 항상성을 유도할 수 있을 것으로 예측된다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Method for producing transgenic yeast with increased resistance to abiotic stress or bioethanol production using MuS1 gene and the yeast thereof <130> PN12217 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 717 <212> DNA <213> Ipomoea batatas <400> 1 atggccgaag aagcaacaag ccctaattct caacctcagt ccgagacggt tgagactcag 60 agcgaggagc agaggttgaa gtatttggag ttcgtgcaag ttgccgcgct ccactccatc 120 ctctgtgctg caaaggtcta cagttacgct aaggagaact tgggccctct caagcccggc 180 gttcagactg tggagggaac cgttaagacc gtcgtcggtc ccgtttacga taaggttcat 240 aatgttcctg gtgaagtcct caagtttgtc gatcgcaagg tggatgaatc cgttcacaag 300 attgaggatc gtgttcctcc atccgtcaag caggtgtcaa cccaagcttt cttaactgca 360 cagatggctc cagggtacgt ccgtgatgtt gtatctgaag tcaaaagtac tggtgtaatt 420 ctggcgaaaa gtgtatacac acagtatcag cctgctgcca aggggctgta caacaagtat 480 gagccagtag cagagcagta tgcttcgtct gcttggcggt ctctgaatca gctccccctt 540 gttcccaggg ttgctcaagc tgttgctccg acagcttctt actggtctga gagatacaac 600 cacactgttc aggttggtgc cgagaagggg tacaaggttg cgtcgtatct tccattggtg 660 cctactgaga agattgctaa actgttgaac aatggaagtc ctgtggagac cagctga 717 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcggtcccgt ttacgataag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atggaagata cgacgcaacc 20

Claims (12)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 고구마 유래의 MuS1(multiple stress responsible gene 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 효모에 형질전환시켜 MuS1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 효모의 메나디온(menadione), 에탄올 또는 젖산 스트레스 내성 또는 발효 수율을 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인 것을 특징으로 하는 효모의 메나디온, 에탄올 또는 젖산 스트레스 내성 또는 발효 수율을 증가시키는 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 발효는 에탄올 발효인 것을 특징으로 하는 효모의 메나디온, 에탄올 또는 젖산 스트레스 내성 또는 발효 수율을 증가시키는 방법.
  6. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 고구마 유래의 MuS1(multiple stress responsible gene 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 효모를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 효모를 배양하는 단계를 포함하는 메나디온(menadione), 에탄올 또는 젖산 스트레스 내성 또는 발효 수율이 증가된 형질전환 효모의 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인 것을 특징으로 하는 형질전환 효모의 제조 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제6항에 있어서, 상기 발효는 에탄올 발효인 것을 특징으로 하는 형질전환 효모의 제조 방법.
  11. 제6항, 제7항, 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 메나디온(menadione), 에탄올 또는 젖산 스트레스 내성 또는 발효 수율이 증가된 형질전환 효모.
  12. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 고구마 유래의 MuS1(multiple stress responsible gene 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는, 효모의 메나디온(menadione), 에탄올 또는 젖산 스트레스 내성 또는 발효 수율 증진용 조성물.
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