KR101240507B1

KR101240507B1 - 신규 알콜 탈수소효소 ＨｐＡＤＨ１ 및 이를 이용한 바이오에탄올의 제조 방법

Info

Publication number: KR101240507B1
Application number: KR1020100069048A
Authority: KR
Inventors: 권오석; 수완나랑시 수리사; 오두병
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-07-17
Filing date: 2010-07-16
Publication date: 2013-03-11
Also published as: KR20110007981A

Abstract

　본 발명은 신규 에탄올 탈수소효소 및 이를 이용한 바이오에탄올의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 탈수소효소 및 생산 방법은 바이오매스로부터 높은 효율로 에탄올을 생산할 수 있다.

Description

신규 알콜 탈수소효소 ＨｐＡＤＨ１ 및 이를 이용한 바이오에탄올의 제조 방법{New alcohol dehydrogenase HpADH1 and a method for preparing bioethanol using it}

본 발명은 신규 에탄올 탈수소효소 및 이를 이용한 바이오에탄올의 생산방법에 관한 것이다.

현재 바이오연료에 대한 연구가 전세계적으로 활발하게 이루어지고 있으며, 바이오연료들 중 대표적인 것이 바이오에탄올 및 바이오디젤이다.　

브라질, 미국, 서유럽, 일본 등에서는 공업용 알콜의 90% 이상이 곡물 발효로 제조되는 반면, 국내에서는 전량이 합성알콜이다.

현재 바이오에탄올 생산에 사용되는 원료, 즉 바이오매스는 대부분이 곡류 유래의 전분이나 열대작물에서 얻어지는 당류이다. 미국의 경우는 대부분이 옥수수 전분의 가수분해 시 얻어지는 포도당을 원료로 하여 바이오에탄올을 생산하고 있고 브라질의 경우에는 사탕수수에서 얻어지는 설탕을 원료로 하여 바이오에탄올을 생산하고 있다. 하지만 사람이 식량으로 먹을 수 있는 농작물을 에너지원으로 쓰는 것은, 아직도 상당수의 인류가 식량난으로 허덕이고 있는 시점에서 비판을 받고 있을 뿐만 아니라 현재 기술로는 인류가 필요로 하는 양만큼의 에탄올을 공급하기에 기술이 충분히 발전하지 못한 문제점이 있다.

현재, 연료 에탄올은 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis) (제트. 모빌리스 (Z. mobilis))를 이용하여 옥수수 전분 또는 등나무 시럽으로부터 생산한다. 그러나, 상기 당 공급원 둘 다는 석유계 자동차 연료의 대체를 실현하는 데 필요한 양을 공급하지 못하며, 현재까지 발효 속도 수율, 에탄올 내성 측면에서 만족할 만한 수준에 도달하지는 못한 실정이다.

자일로스 발효능이 없는 Z. mobilis에 대사공학적으로 자일로스 발효 경로를 도입하여 포도당과 자일로스를 모두 발효하여 에탄올을 생산하는 재조합 균주의 개발이 미국의 NREL(National Renewable Energy Laboratory)의 연구진에서 의해 시도되었으나, 재조합 Z. mobilis가 당가수분해를 위한 전처리 과정에서 상당량 발생하는 아세트산(acetic acid)에 대한 저항성이 매우 약하다는 치명적인 단점을 지니고 있어 상용화되지 못하고 있다.

S. cerevisiae는 전분 및 당류 유래 자원을 이용한 바이오에탄올 생산에 이용되어 상업적인 가능성을 검증받은 균주이나, 하지만, S. cerevisiae는 자일로스를 발효하지 못하는 약점을 지니고 있다. S. cerevisiae가 자일로스를 발효하지 못하지만, 그 이성체인 자일룰로스(xylulose)를 발효하여 에탄올을 생산할 수 있다는 사실에 근거하여 자일로스를 자일룰로스로 전환시키는 효소인 자일로스 이성질화 효소(xylose isomerase)를 도입하여 자일로스를 발효하려는 많은 연구가 이루어졌지만, 세균 유래의 자일로스 이성질화 효소가 S. cerevisiae에서 활성발현이 되지 않으므로 성공하지 못하였다. 또 다른 접근방법으로 자일로스를 자일룰로스로 전환시키는 효소인 자일로스 환원효소(xylose reductase, XR), 자일리톨탈수소효소(xylitoldehydrogenase, XDH) 및 자일룰로키나제(xylulokinase, XK)의 유전자들(XYL1, XYL2 및 XYL3)을 S. cerevisiae에 도입하는 연구가 이루어졌으나 그 속도가 포도당에 비해서 매우 느리고 다량의 자일리톨(xylitol)이 부산물로 생산됨으로 인하여 에탄올 수율이 현저히 낮아 바이오에탄올 생산에 이용되기는 어렵다.

그 외, 야생형 E. coli을 이용하려는 시도가 있었는데, 이는 소량의 에탄올을 생산하고 다량의 유기산을 생성하는 문제점이 있다. 따라서 유전자 재조합 기법을 이용하여 대장균의 유기산 생성 대사 경로를 제거하고 에탄올 생성 경로의 활성화가 시도되었으나, E. coli의 특성상 발효조 내에 생산되는 에탄올에 저항성을 가지지 못하기 때문에 고농도 에탄올 생산공정(>60 g/L)의 구현이 어렵다는 단점과 재조합 대장균의 생육이 전처리 후에 생성되는 알데하이드(aldehyde) 및 유기산(organic acid)과 같은 억제(inhibitory) 물질에 매우 민감하다는 단점이 있다.

본 발명자들은 1) 바이오매스의 가수분해 과정에서 생산되는 미생물 생육 저해 물질에 저항성을 가지며, 2) 에탄올 수율의 향상을 위하여 부산물이 최소로 생산되며 3) 에탄올을 특이적으로 생산하고 4) 생성된 에탄올에 의하여 생육 및 발효 저해를 받지 않고 5) 육탄당 뿐만 아니라 오탄당인 자일로스 등을 발효할 수 있으며 6) 40℃ 이상의 고온에서 발효가 가능하며, 7) 대량생산 공정이 가능한 균주를 찾던 중 메탄올 자화효모인 H. polymorpha가 40℃ 이상의 고온에서 발효가 가능하며, 자일로스 발효능이 있고, 각종 독성물질에 대한 내성이 강한 특성을 갖고 있음을 주지하여 전체 유전체 서열을 해독하였다. 나아가 한세눌라의 유전체 서열을 바탕으로 에탄올 발효에 관련된 유전자를 탐색하던 전통효모 S. cerevisiae의 알코올 탈수소 효소 ADH1 단백질과 유사한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자 HpADH1의 존재를 확인하였다. 이 유전자를 과발현하여 그 생화학적 효소반응 특성을 규명하고, 한세눌라 폴리모파의 유전체로부터 해당 유전자를 결실하거나 과발현하여 그 생리학적 기능을 검증하였으며 나아가 과발현 균주의 에탄올 발효 수율이 현격하게 향상됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규한 에탄올 탈수소효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 상기 신규한 에탄올 탈수소효소를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 상기 신규한 에탄올 탈수소효소의 유전자를 구성하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드들 중 어느 하나와 엄격한 조건 하에서 혼성화하며 에탄올 탈수소효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 목적은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 숙주세포를 형질전환한 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 1) 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 형질전환체를 제조하는 단계; 2) 단계 1)의 형질전환체를 탄소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및 3) 단계 2)의 배지로부터 에탄올을 회수하는 단계를 포함하는 에탄올의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알코올 탈수소효소 활성을 갖는, 하기 (ⅰ) 내지 (ⅳ) 중 어느 하나의 폴리펩티드:

(ⅰ) 서열번호 1로 구성되는 폴리펩티드;

(ⅱ) 서열번호 1로 구성되는 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드;

(ⅲ) 서열번호 2로 구성되는 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 코드되는 폴리펩티드; 및

(ⅳ) 서열번호 2로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의하여 코드되는 폴리펩티드를 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 2의 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 혼성화되며, 알콜 탈수소효소, 바람직하게는 에탄올 탈수소효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

아울러 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 벡터로 숙주세포를 형질전환한 형질전환체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 형질전환체를 제조하는 단계; 2) 단계 1)의 형질전환체를 상기 탄소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및 3) 단계 2)의 배지로부터 에탄올을 회수하는 단계를 포함하는 에탄올의 제조 방법을 제공한다.

H. polymorpha은 오랫동안 에탄올 생산의 표적 미생물로 주목받아 왔으나, 아직까지 H. polymorpha 유래의 ADH에 대한 유전학적 또는 생리학적 특성은 보고된 바 없다. 본 발명자들은 샷건 방식과 포스미드클론 말단 시퀀싱을 이용하여 H. polymorpha DL1균주의 전체 게놈을 확인하였다. S. cerevisiae ADH1(ScADH1)의 아미노산 서열을 이용하여, H. polymorpha 게놈 서열상에서 ScADH1과 74.8%의 아미노산 서열 상동성(identity)을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 유전자를 확인하였다.

효모의 알콜 탈수소효소(yeast alcohol dehydrogenase)(이하, ADH라 한다)는 NADH 또는 NADPH의 환원 및 그 역반응에 수반하여 알데하이드의 에탄올로의 환원을 촉매화하는 산화환원효소(oxidoreductase)이다. ADH 유전자의 서열은 몇몇 효모에서 잘 보전되어 있으나, 유전자의 수, 생리학적 작용 및 조절은 서로 다르다. 현재까지 ADH를 코드하는 유전자들은 S. cerevisiae 및 P. stipitis의 경우 각각 7 종류(ADH1 내지 ADH7) 이상이 Genbank에 제출된 반면,　K. lactis의 경우 4 종류의 유전자들(ADH1 내지 ADH4)이 제출되었다.

현재까지 H. polymorpha 유래 ADH의 유전적 또는 생리학적 특성이 보고된 바는 없으나, H. polymorpha의 ADH 시스템을 이해하는 것은 단순히 상기 유전자에 대한 기초적인 정보를 제공하는 것뿐만 아니라 상기 균주에서 에탄올 발효를 증가시킬 수 있는 기회를 제공하는 것이기도 하다.

본 발명자들은 H. polymorpha의 ADH1 유전자를 분리하고, 그 아미노산 서열을 분석하였으며(서열번호 1), 상기 단백질이 에탄올 탈수소효소 활성을 가지는 것을 확인하였다.

서열번호 1:

mtsipktqka vvfetnggpl lykdipvpqp kpneilvnvk ysgvchtdlh awkgdwpldt klplvggheg agvvvakgan vtnfeigdya gikwlngscm gcefcqqgae pncpeadlsg ythdgsfqqy atadavqaak ipkgtnladv apilcagvtv ykalktaels pgqwvaisga ggglgslavq yavamglrvl gidggdekak lfeslggevf idftkekdiv gavqkatngg phgvinvsvs paaisqscqy vrtlgkvvlv glpagavces pvfehviksi qirgsyvgnr qdtaesidff rgkvkapik vglselpkv felmeqgkia gryvldtsk

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또한 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 2의 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 혼성화되며, 에탄올 탈수소효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

이때, "엄격한 혼성화 조건"이란, 예를 들면 65℃ 4x SSC에서 혼성화, 다음 65℃로 1시간, 0.1x SSC에서 세척을 의미한다. 다른 엄격한 조건은 50% 포름아미드 중 42℃ 4x SSC에서 혼성화이다. 또 다른 엄격한 조건은 PerfectHyb^TM(TOYOBO) 용액 중 65℃ 2.5시간 혼성화, 그 다음에 (1) 0.05% SDS를 포함하는 2 xSSC로 25℃ 5분, (2) 0.05% SDS를 포함하는 2 xSSC로 25℃ 15분 및 (3) 0.1% SDS를 포함하는 0.1 xSSC로 50℃ 20분의 세척이다. 이렇게 분리된 폴리뉴클레오티드는 아미노산 수준에서 서열 번호 2의 아미노산 서열과 높은 상동성을 가지거나, 에탄올 탈수소효소 활성을 갖는 단백질, 즉 폴리펩티드를 코드한다고 생각된다.

본 명세서에서 "에탄올 탈수소효소 활성"이란 자일로스(xylose), 글루코스(glucose), 아라비노스, 만노스 및 갈락토스와 같은 당, 녹말(전분), 셀룰로스, 글리세롤 등과 같은 바이오매스로부터 에탄올을 생산하는 활성을 말한다. 그러나 상기 바이오매스가 이들에 제한되는 것은 아니다.

서열번호 2:

atgacttccattccaaagactcaaaaggccgttgttttcgagaccaacggtggtcctcttctctacaaggacatccctgttccacaaccaaagccaaatgagattcttgtcaacgtcaagtactccggtgtttgccacaccgatctccacgcttggaagggtgactggccattggacaccaaacttccactggtcggtggtcacgagggtgctggtgttgttgttgctaagggtgccaacgttaccaactttgaaatcggtgactacgctggtatcaaatggttgaacggctcgtgcatgggttgtgagttctgtcaacaaggtgcagagccaaactgtcctgaggccgacctttccggttacacgcacgacggttctttccaacaatacgccactgctgatgctgtccaggctgccaagattccaaagggaactaacctggctgacgttgctccaattctctgtgctggtgtcactgtgtacaaggcattgaagactgccgaattgagcccaggccaatgggttgctatctctggtgctggtggaggattgggttctcttgccgttcaatacgctgtcgccatgggcctgagagtcctgggtatcgatggtggtgacgaaaaggctaagctcttcgagagcttgggcggagaagtcttcatcgatttcaccaaggaaaaggacattgtcggagccgtccagaaggcaaccaacggtggtccacacggtgttatcaacgtttctgtgtctccagcagctatctctcaatcctgccaatacgtgagaactcttggtaaggttgttcttgttggtcttccagccggtgctgtttgcgagtctccagttttcgagcacgttatcaagtctatccagattagaggttcctacgttggtaacagacaggacactgccgagtcgattgacttcttcgtcagaggcaaggttaaggctccaatcaaggttgttggcctttctgagctgccaaaggtgttcgagttgatggagcaaggaaagattgctggaagatacgttcttgacacttccaaatag

또한 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 2의 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 혼성화되며, 에탄올 탈수소효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

이때, 벡터는 pESC 벡터, pESC-HIS 벡터, pESC-LEU 벡터, pESC-TRP 벡터, pESC-URA 벡터, Gateway pYES-DEST52 벡터, pAO815 벡터, pGAPZ A B & C 벡터, pGAPZAlpha A B & C 벡터, pPIC3.5K 벡터, pPIC6 A B & C 벡터, pPIC6Alpha A B & C 벡터, pPIC9K 벡터, pYC2/CT 벡터, pYD1 효모 발현 벡터, pYES2 벡터, pYES2/CT 벡터, pYES2/NT A B & C 벡터, pYES3/CT 벡터, p427-TEF 벡터, p417-CYC 벡터, pTEF-MF 벡터 및 pGAL-MF 벡터, pDLG, pDLMOX 로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 상기 폴리뉴클레오티드를 유전학적으로 안정하게 도입할 수 있는 것이라면 어느 것이든 무방하다.

또한 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 2의 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 혼성화되며, 에탄올 탈수소효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 숙주세포를 형질전환한 형질전환체를 제공한다.

이때, 숙주세포는 박테리아 또는 효모인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 박테리아는 스타필로코코스 에우리우스(Staphylococcus aureus), 대장균(E. coli), 바실러스 세레우스(B. cereus), 살모넬라 타이피뮤림(Salmonella typimurium), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 및 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이며, 더욱더 바람직하게는 대장균, 바실러스 세레우스이고, 더더욱 바람직하게는 대장균이다.

또한 상기 효모는 사카로미세스(Saccharomyces)속, 사카로미코시스(Saccharomycopsis) 속, 사카로미코데스(Saccharomycodes)속, 시조사카로미세스(Schizosaccharomyces)속, 이카하미아(Wickerhamia) 속, 데바리오미세스(Debaryomyces)속, 한세눌라 (Hansenula)속. 한세니아스포라(Hanseniaspora)속, 리포미세스(Lypomyces)속, 피키아(Pichia)속, 클로케라(Kloeckera) 속, 칸디다(Candida) 속, 자이고사카로미세스(Zygosaccharomyces) 속, 오가타에아(Ogataea) 속, 쿠라이시아(Kuraishia) 속, 코마가텔라 (Komagataella) 속, 야로위아(Yarrowia) 속, 윌리옵시스(Williopsis) 속, 나카자와에아(Nakazawaea )속, 클루이베로미시스(Kluyveromyces)속, 토루라스포라(Torulaspora)속, 시테로마이세스(Citeromyces) 속, 왈토미세스(Waltomyces)속, 크립토코쿠스(Cryptococcus)속, 마이크로코쿠스(Micrococcus)속, 엑시구오박테리움(Exiguobacterium) 속, 노카르디아(Nocardia) 속, 무코르(Mucor)속, 암브로시오지마(Ambrosiozyma)속, 시스토필로바시지움(Cystofilobasidium)속, 메토슈니코 이아(Metschnikowia)속, 트리코스포론(Trichosporon)속, 산토필로미세스(Xanthophyllomyces)속, 부렐라(Bullera)속, 펠로미세스(Fellomyces)속, 필로바시듐(Filobasidium)속, 홀터마니아(Holtermannia)속, 파피아(Phaffia)속,로도토룰라(Rhodotorula)속, 스포리디오보루스(Sporidiobolus)속, 스포로보로미세스(Sporobolomyces)속, 윌롭시스(Willopsis)속, 지고아스쿠스(Zygoascus)속, 할로페락스(Haloferax)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 류코스포리디움(leucosporidium)속, 미소지마(Myxozyma)속, 트리코스포리엘라(Trichosporiella)속, 알칼리제네스(Alcaligenes)속인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 효모는 피키아(Pichia), 한세눌라(Hansenula)또는 캔디다(Candida)속에 속하며, 더더욱 바람직하게는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha) 또는 캔디다 보이디니이(Candida boidinii) 종이다. 매우 바람직하게는 상기 효모는 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha)이다.

또한 본 발명은

1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 2의 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건 하에서 혼성화되며, 에탄올 탈수소효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 형질전환체를 제조하는 단계;

2) 단계 1)의 형질전환체를 탄소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및

3) 단계 2)의 배지로부터 에탄올을 회수하는 단계를 포함하는 에탄올의 제조 방법을 제공한다.

상기 단계 2)에서 탄소원은 녹말, 셀룰로스, 오탄당, 육탄당 또는 글리세롤인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 탄소원은 자일로스(xylose), 글루코스(glucose), 포도당, 아라비노스, 크실로스, 만노스 또는 갈락토스인 것이 바람직하며, 더더욱 바람직하게는 상기 탄소원은 글루코스 또는 글리세롤이다.　

본 발명의 에탄올 탈수소효소는 바이오매스로부터 바이오에탄올을 고수율로 생산할 수 있다. 또한, 본 탈수소효소는 바이오디젤 생산의 부산물인 글리세롤을 이용함으로써 본 발명 단독으로는 물론 기존의 바이오디젤 생산방법과도 효율적으로 이용될 수 있다.

도 1은 ClustalW2 프로그램을 이용하여 다른 세포질 ADH들(Sc=S. cerevisiae; Kl=Kluyveromyces lactis; Ps= Pichia stipitis )과 HpADH1의 아미노산 서열을 정렬한 것을 나타낸 그림이다. 밑줄 그은 것은 NAD(P+)-결합 모이에티(moiety)를 표시하는 것이다. 굵은 글씨는 NAD(H)-의존성 ADH 중 보존되는 Lys 잔기를 가리킨다. 회색 및 검은색 하이라이트는 각각 촉매적(catalytic) 및 구조적 Zn²⁺ 결합 잔기를 의미한다.
도 2 (왼쪽)는 H. polymorpha DL1-L 및 HpADH1 결실 주의 AHD 이소자임 분석을 나타낸 그림이다. 도 2 (오른쪽)는 YPD-성장 세포의 단백질 추출물의 에탄올 산화 활성을 나타낸 그림이다.
도 3은 pDLG-HpADH1 벡터의 제조(A) 및 DL1-L과 비교한 pDLG-HpADH1/△HpADH1주의 ADH 활성을 나타내는 그림이다(B). 상기 세포는 mid-log기까지 YPD 배지에서 배양하였으며, 물질 및 방법에 기재한 것과 같이, 무세포 추출액의 인 비트로 ADH 활성을 측정하였다.
도 4는 H. polymorpha DL1-L, ADH-결실주 및 ADH-과발현주의 YPD(검은색 기호) 또는 YPE(백색 기호) 배지에서 성장을 나타내는 그림이다. 사각형, 삼각형, 및 원은 각기 DL1-L, △HpADH1, pDLG-HpADH1/△HpADH1 균주를 가리킨다.
도 5는 HpADH1의 결실 및 과발현 효과를 나타내는 그림이다. A. 글루코스 배지에서의 세포 생물량, B. 글루코스 배지에서의 에탄올 생산량, C. 글리세롤 배지에서의 세포 생물량, D. 글리세롤 배지에서의 에탄올 생산량을 가리킨다. 사각형, 삼각형, 및 원은 각각 DL1-L, △HpADH1, pDLG-HpADH1/△HpADH1 균주를 가리킨다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세하게 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> HpADH1 의 서열 분석

본 발명자들은 샷건 방식과 포스미드클론 말단 시퀀싱을 이용하여 H. polymorpha DL1 균주의 전체 게놈을 확보하였다.

H. polymorpha DL1　균주의 유전체 서열 정보를 대상으로 S. cerevisiae ADH1 단백질과 유사한 단백질을 코딩할 수 있는 유전자를 검색하였다. 그 결과 찾아낸 유전자는 HpADH1로 나타내었으며, 이 유전자는 총 349개의 아미노산으로 구성되었으며 아미노산 서열상 ScADH1과 74.8%의 상동성(identity)을 갖는 폴리펩타이드를 코드하는 것으로 분석되었다. 표 1은 효모 ADH들 및 HpADH1과의 아미노산 서열 비교 리스트이다. HpADH1은 이들 효모 ADH들 중에서, C. albicans ADH2 및 C. utilis ADH1에 대하여 각각 78.5.%와 78.9%의 높은 아미노산 서열 상동성을 보였다. 다른 효모 유래의 세포질 ADH와 HpADH1의 정렬한 결과 아연-결합 리간드(zinc-binding ligands) 및 NAD(P⁺) 결합 모이에티(binding moiety)와 같은 ADH 단백질 계통 중에 보존되는 몇몇 모티프(motif)들을 확인하였다(도 1). 다른 세포질 ADH들과 마찬가지로, 상기 HpADH1 아미노산 서열에는 N-말단 소포체 타겟팅 연장 신호를 갖고 있지 않았는바, 이는 HpADH1 단백질이 세포질 내에 위치하는 것을 의미한다.

다른 균주 유래의 다른 ADH 유전자들과 HpADH1과의 아미노산 서열 상동성(Hp=Hansenula polymorpha DL1; Sc=Saccharomyces cerevisiae; Ps=Pichia stipitis CBS6054;　 Kl=Kluyveromyces lactis NRRL Y-1140; Ca=Candida albicans SC5314; Cu=C. utilis ATCC9950)

ADH	HpADH1
ADH	%일치성(Identities)	%유사성(Similarities)
ScADH1	74.8	83.4
ScADH2	75.4	84.2
PsADH1	76.8	86.5
PsADH2	75.4	85.4
KlADH1	75.1	82.6
KlADH2	72.5	82.2
CaADH1	63.4	71.3
CaADH2	78.5	88.3
CuADH1	78.9	88.3

< 실시예 2> 대장균에서의 재조합 HpADH1 의 제조

<2-1> E. coli 에서 과발현하기 위한 pET28a - Hp ADH 1 벡터의 제조

HpADH1 효소의 생화학적 특성을 조사하기 위하여, HpADH1를 코드하는 유전자를 pET28a⁺발현 벡터(Novagen)에 클로닝하였다. 프라이머 pETADH1F 및 pETADH1R(표 2)를 이용하여 HpADH1(1,047bp)를 PCR 증폭한 후 그 산물을 NdeI과 HindIII 제한효소로 절단한 후 동일한 제한효소로 절단한 pET28a⁺발현 벡터와 연결하여 E. coli DH5α에 형질전환하였다. 형질전환 대장균을 30 ㎍/㎖ 카나마이신(kanamycin)을 포함하는 LB 한천 배지(1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 1.5% Agar)에 도말하였다. 재조합 균주로부터 벡터를 분리하여 제한효소 절단 및 DNA 시퀀싱을 통하여 pET28a-HpADH1 발현벡터의 제작을 확인하였다. 이 재조합 발현 벡터로부터 발현되는 HpADH1 단백질은 N-말단에 6xHis 친화말단을 포함하게 되며 이 벡터를 대장균 E. coli BL21 (DE3) 발현균주에 형질전환하여 T7 RNA 합성효소에 의하여 단백질이 발현되도록 하였다.

프라이머

이름	서열(5'->3')
HpADH1F	CGAGCG AAGCTT ATGACTTCCATTCCAAAGACTCAAAAGGCC
HpADH1R	CGAGCT ACTAGT CTATTTGGAAGTGTCAAGAACGTATCTTCC
Del ADH1 NF	GTCCTTGATTTTCCGTTTGAGTACCTCG
Del ADH1 NR	AGCTCGGTACCCGGGGATCCCTCATTTGGCTTTGGTTGTGGAACAGG
Del ADH1 CF	GCACATCCCCCTTTCGCCAGGCTCCAATCAAGGTTGTTGGCCTTTCTG
Del ADH1 CR	TCAGTAGCTTGTGTTTTTCTGCCGTAGTG
LacZ_NF	TCCCCGGGTACCGAGCT
LacZ_NR	CACCGGTAGCTAATGATCCC
LacZ_CF	CGAACATCCAAGTGGGCCGA
LacZ_CR	CTGGCGAAAGGGGGATGTGC
pETADH1F	CGAGCGCATATGACTTCCATTCCAAAGACTCAAAAGGCC
pETADH1R	CGAGCTAAGCTTCTATTTGGAAGTGTCAAGAACGTATCTTCC

AAGCTT:HindIII 위치, ACTAGT:SpeI 위치, CATATG:NdeI 위치

<2-2> 재조합 HpADH I 단백질의 발현 및 정제

pET28a-HpADH1으로 형질전환(transform)된 E. coli BL21(DE3)를 밤새 배양한 후, OD₆₀₀가 0.2가 되도록 LB-카나마이신(kanamycin) 배지에 재접종하였다. 3시간 동안 180 rpm, 37℃에서 배양하였다. 그 후, 1 mM의 IPTG를 첨가하여 단백질의 발현을 유도하고, 상기 세포를　16℃에서 180 rpm으로 진탕배양하였다. 24시간 유도 후, 20분간 6,500 rpm에서 원심분리하여 세포들을 수득하였다. 세포 침전물(pellet)을 용해 버퍼(50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, 1 mM PMSF, pH 8.0)에 현탁한 후 음파 처리(sonication)하여 세포를 파쇄하고, 이 파쇄액을 다시 원심분리하여 상층액을 취하였다. 곧바로 제조사의 설명서에 따라 현탁액을 자연 조건(native condition) 하에서　 Ni-NTA 아가로즈 수지(agarose resin) (Qiagen)를 이용하여 단백질을 친화력 정제(affinity purification)하였다. 용해 버퍼에 당해 수지를 평형상태로 만든 후, 단백질 추출액을 수지와 함께 섞어 두 시간 동안 4℃에서 부드럽게 흔들어 주었다. 그 후, 상기 혼합물을 칼럼에 넣고 세척 버퍼(50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, 1% triton X100, 1 mM PMSF, pH 8.0)로 8회 세척하였다. 250 mM 이미다졸을 포함하는 용출(elution) 버퍼를 가하여 His-친화말단을 포함하고 있는 HpADH1 단백질을 용출(elute)시켰다. 마지막으로, 투석버퍼(pH 8.0, 50 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl)에서 4℃에서 밤새 투석(dialysis)하여 이미다졸을 제거하였다. SDS-PAGE 및 쿠마시 브릴리언트 블루 R250 염색으로 모든 정제 분획을 분석하였다.

재조합 단백질의 발현은 항-히스티딘(anti-his) 및 항 토끼-알칼리성 인산분해효소(anti rabbit-alkaline phosphatase)의 콘쥬게이트(conjugate) 항체를 이용하여 웨스턴블랏에 의하여 확인하였다. 상기 정제된 단백질들은 SDS-PAGE 상에서 ScADHs 및 KlADHs들과 같은 다른 효모 ADH 서브유닛들과 동일한 범위 내인 약 37 kDa의 분자량을 보였다. 나아가 자연 상태(native)-PAGE 겔의 ADH 활성 분석을 통하여 상기 His-HpADH1 단백질이 활성을 갖고 있음을 확인하였다.

<2-3> ADH 활성의 측정

상기와 같이 추출물을 제조하여, 하기의 과정에 따라 알콜 산화에 있어 ADH 활성을 측정하는데 사용하였다. ADH1의 동적 특성의 경우, E. coli에서 발현된 수용성 재조합 ADH1 단백질의 탈수소효소(dehydrogenase) 및 환원효소(reductase) 활성을 모두 측정하였다.

탈수소효소 활성

50 mM glycine-KOH buffer pH 9.0, 1 mM NAD⁺로 구성된, ADH 활성 분석 혼합물(assay mixture)에 적절한 양의 단백질액을 첨가한 후 100 mM의 에탄올을 첨가함으로써 반응을 시작하였다(Postma, E., C. Verduyn, W. A. Scheffers, and J. P. Van Dijken. 1989. Enzymic analysis of the crabtree effect in glucose-limited chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol. 55:468-477). 총 반응액의 부피는 1 ㎖이 되도록 하였으며 OD₃₄₀에서의 흡광도 변화를 반응개시 후 15초 및 45초에서 기록하였다. 효소 활성 단위는 분당 NADH 1 μmol을 생산하기에 필요한 효소의 양으로 하였다.

환원효소 활성

50 mM potassium phosphate 버퍼, pH 6.0, 0.15 mM NADH, 적당량의 단백질용액을 포함하고 있는 효소반응 혼합액에 100mM의 아세트알데하이드를 첨가함으로써 반응을 시작하였다(Cornelis Verduyn, G. J. B., W. Alexander Scheffers, Johnnes P. Van Dijken,. 1988. Substrate specificity of alcohol dehydrogenase from the yeast Hansenyls polymorpha CBS 4732 and Candida utilis CBS 621. Yeast 4:143-148). 총 반응부피는 1 ㎖로 하였으며 NADH가 산화되어　NAD⁺를 형성하는데 따른 OD₃₄₀에서의 흡광도 감소를 반응 개시 1분 후에 기록하였다. 효소 활성 단위는 분 당 NADH 1 μmol을 소모하는 효소 양으로 정하였다.

다양한 종류의 알콜 및 알데하이드를 대상으로 HpADH1의 기질(substrate) 특이성을 측정하였다. 알콜 산화의 경우, 분석 조건은 2 ㎍의 정제된 HpADH1 단백질을 가한(apply) 것을 제외하고는, 상기 탈수소효소 활성 측정 방법과 동일하며 100 mM의 알콜 기질을 첨가하자 반응을 개시하였다. 환원효소활성의 기질특이성 분석을 위해서는 상기 환원효소 활성 측정 방법을 사용하였으며 100 mM의 알데하이드 또는 케톤을 기질로 사용하였고 정제된 단백질의 2 ㎍을 사용하였다.

한편 에탄올 0.1 ~ 20 mM 또는 아세트알데하이드 1 ~ 100 mM 범위의 다양한 기질에 대한 K _m 및 K _cat 를 측정하였다. 시그마 플롯 10.0 소프트웨어(Sigma plot 10.0 software)의 한-위치 리간드 결합 방정식(one-site ligand binding equation)을 이용하여 상기 데이터를 도표화(plot)하고 계산하였다. 각각의 실험은 최소 3번 반복하였으며 10% 미만의 표준 오차를 갖는다. 단백질 정량은 BSA를 표준으로 사용하여 Biorad 사의 단백질 분석방법에 따라 실시하였으며 정제된 단백질의 경우 OD₂₈₀을 측정함으로써 정량하였다.

<2-4> 재조합 HpADH1 의 생화학적 특성

일정량의 보조인자(NAD⁺ 또는 NADH) 존재 하에 기질 농도를 달리하여 효소활성을 분석함으로써 HpADH1의 에탄올과 알데하이드에 대한 반응속도상수(kinetic constants)를 결정하였다(표 3). 에탄올에서 HpADH1는 에탄올에 대하여 알데하이드에 대한 것보다 8배나 낮은 K _m 값을 보였다. 반면, 양쪽 기질에서 모두 비슷한 범위의 대사회전수(turnover number, K _cat )와 촉매효율(catalytic efficiency, K _cat /K _m )를 보였다. 기존에 보고된 다른 효모 유래의 ADH1 및 ADH2와 비교할 때, HpADH1의 알데하이드에 대한 K _m 은 ScADH1, KlADH1 및 KlADH2의 것과 거의 동일한 수준이었으며 ScADH1에 비해서는 21배 정도 높았다. 반면, HpADH1의 에탄올에 대한 촉매효율은 이들 효소들 경우보다 매우 높았다.

HpADH1의 효소반응 속도상수 측정 및 비교

	에탄올			아세트알데하이드
	K _m (mM)	K _cat (min^-1)	K _cat / K _m (min^-1.mM^-1)	K _m (mM)	K _cat (min^-1)	K _cat / K _m (min^-1.mM^-1)
HpADH1^a	0.25	2.1 x 10⁵	8.4 x 10⁵	1.94	2.0 x 10⁵	1.0 x 10⁵
ScADH1^b	17	2.0 x 10⁴	1.2 x 10³	1.1	1.0 x 10⁵	9.3 x 10⁴
ScADH2^b	0.81	7.8 x 10³	9.6 x 10³	0.09	6.2 x 10⁴	6.9 x 10⁵
KlADH1^c	27	2.5 x 10⁵	9.3 x 10³	1.2	3.6 x 10⁵	3.0 x 10⁵
KlADH2^c	23	2.8 x 10⁴	1.2 x 10³	1.7	3.3 x 10⁴	2.0 x 10⁴

a: 표준 오차 범위는 10% 미만임.

b: Ganzhorn의 방법으로 데이터를 계산함 (Ganzhorn, A., D. Green, A. Hershey, R. Gould, and B. Plapp.1987. Kinetic characterization of yeast alcohol dehydrogenases. Amino acid residue 294 and substrate specificity. J. Biol. Chem. 262:3754-3761).

c: Bozzi 등의 논문으로부터 데이터 유래 (Bozzi A, Saliola M, Falcone C, Bossa F, Martini F. 1997. Structural and biochemical studies of alcohol dehydrogenase isozymes from Kluyveromyces lactis. Biochim Biophys Acta. 1339:133-42).

에탄올 및 아세트알데하이드(acetaldehyde)에 대한 HpADH1 및 다른 ADH들의 반응속도상수를 실온에서 측정하였다. [NAD⁺] 또는 [NADH]는 0.15 mM로 일정하게 유지하였다.

HpADH1의 기질특이성을 다른 알콜 및 알데하이드를 사용하여 측정하였다(표 4). 에탄올에 대한 활성을 기준으로 HpADH1은 중간 사슬길이 알콜(C2 ~ C5)에 최대 3.5배에 이르는 높은 산화활성을 보였다. 반면 메탄올(C1)에 대해서는 ADH 활성을 보이지 않았다. 2차 알콜 2-프로판올(2-propanol)에 대해 HpADH1은 상대적으로 높은 활성을 보였으나, 2-옥탄올(2-octanol)을 이용하였을 때는 상대적으로 낮은 활성을 보였다. 한편 아세트알데하이드에 대해 높은 환원 활성이 관찰되었다(표 4). 이러한 결과에 기초하여 HpADH1은 환원 활성에서는 아세트알데하이드에 매우 특이적인데 반하여, 알콜 산화에 있어서는 많은 종류의 기질에 대한 특이성을 갖는 것을 확인하였다.

HpADH1의 기질 특이성

기질	상대적 특이성 ^a,b
1차 알콜
메탄올(methanol)	0
에탄올(ethanol)	100
1-프로판올(1-propanol)	161
1-부탄올(1-butanol)	188
1-펜탄올(1-pentanol)	358
1-옥탄올(1-octanol)	89
2차 알콜
2-프로판올(2-propanol)	190
2-펜탄올(2-pentanol)	20
2-옥탄올(2-octanol)	78
알콜 유도체(derivatives)
2-메톡시 에탄올 (2-methoxy ethanol)	34
1,2 부탄디올(1, 2butanediol)	14
알데하이드 및 케톤
아세트알데하이드(acetaldehyde)	1,346
포름알데하이드(formaldehyde)	8
아세톤(acetone)	0

a: 에탄올 산화 활성을 100으로 할 때, 상대적인 활성.

b: 각 기질에서의 표준 오차는 10% 미만임.

< 실시예 3> HpADH1 의 생리적 활성 분석

<3-1> 균주 및 생장 조건

본 발명에서는 HpADH1 유전자 제거(disruption)에 있어 우라실 영양요구성(auxotrophic) 균주인 H. polymorpha DL1-LdU(leu2 △ ura3 :: lacZ)를　수여자(recipient) 세포로 이용하였다.　 따라서 각종 활성 비교분석 실험을 위해 H. polymorpha DL1-L(leu2) 균주를 대조군 균주로 이용하였다. 일반적으로 H. polymorpha 세포는 37℃에서 YPD(1% yeast extract, 2% bactopeptone, 2% glucose) 또는 SC(0.67% YNB without amino acids, 2% glucose, drop-out mix without uracil and/or leucine)에서 배양하였다. 필요한 경우, 글루코스 대신에 에탄올을 동일한 최종 농도인 2%로 사용하였다. 발효를 위해서, 10% 글루코스 또는 글리세롤이 보충된 YNBC(0.05% yeast extract, 0.34% (NH₄)₂SO₄, amino acids)를 이용하였으며 Ryabova(Ryabova, O. B., O. M. Chmil, and A. A. Sibirny. 2003. Xylose and cellobiose fermentation to ethanol by the thermotolerant methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. FEMS Yeast Res 4)가 보고한 펩톤(peptone) 및 유레아(urea)에 의하여 에탄올 축적량이 감소하는 것을 방지하였다. pDLG-HpADH1 벡터의 제조 및 증식을 위해 E. coli DH5a를 숙주로 이용하였으며 형질전환 후 37℃ 조건 하, 100 ㎍/㎖엠피실린(ampicillin)이 첨가된 LB 배지(1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl)에서 배양하였다.

<3-2> HpADH1 유전자의 결실( disruption )

H. polymorpha DL1 균주의 전장 게놈 서열 정보상 ORF로 추정되는 서열로부터 코딩될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 전통효모 S. cerevisiae의 ScADH1 단백질의 아미노산 서열을 이용하여 상동성 검색을 실시한 결과 HpADH1 유전자를 선별하였으며 이 유전자의 생리적 기능을 탐색하기 위하여 아래와 같이 결손 균주를 제작하였다. 즉 Kim 등에 의해 기술된 바와 같이 two-step PCR 및 세포 내 재조합 방법(Kim, M. W., E. J. Kim, J. Y. Kim, J. S. Park, D. B. Oh, Y. Shimma, Y. Chiba, Y. Jigami, S. K. Rhee, and H. A. Kang. 2006. Functional characterization of the Hansenula polymorpha HOC1, OCH1, and OCR1 genes as members of the yeast OCH1 mannosyltransferase family involved in protein glycosylation. J Biol Chem 281:6261-6272)을 사용하여 lacZ - Ura3 - lacZ 결실 카세트(casssette)를 이용하여 HpADH1 유전자를 대체하였다. 구체적으로는, HpADH1 유전자의 업스트림 및 다운스트림 서열을 포함하는 DNA 단편들을 제조하기 위하여 H. polymorpha DL1 균주의 염색체를 주형으로 △ADH1NF//△ADH1NR 및 △ADH1CF//△ADH1CR을 각각 프라이머 쌍(표 2)으로 이용하여, 첫 번째 PCR을 수행하였다. 그 결과 HpADH1 유전자의 업스트림 DNA 단편 △ADH1N'과 다운스트림 DNA 단편 △ADH1C'을 확보하였다. 한편 타겟 유전자 결실 변이주 선별마커인 URA3 표지유전자의 서열을 포함하는 DNA 단편들을 확보하기 위하여 플라스미드 pLacUR3를 주형으로 LacZNF//LacZNR 및 LacZCF//LacZCR를 각각 프라이머 쌍으로 이용하여 PCR을 수행하여 URA3 표지 유전자 카세트의 업스트림 DNA 단편인 URA3N'과 다운스트림 DNA 단편인 URA3C'을 확보하였다.

그 후 △ADH1N' 및 URA3N'을 주형으로 사용하고 △ADH1NF//LacZNR를 프라이머 쌍으로 사용하여 2차(second-round) PCR을 수행함으로써 HpADH1 및 lacZ - Ura3 - lacZ의 N-말단 융합 단편을 제조하였다. 마찬가지로 △ADH1C' 및 URA3C'을 주형으로 사용하고 LacZCF//△ADH1CR을 프라이머 쌍으로 이용하여 HpADH1 및 lacZ - Ura3 - lacZ의 C-말단 융합 단편을 제조하였다. 이들 N-말단 및 C-말단 융합 산물은 서로 중복되는 100 bp의 서열을 포함한다. 세포 내 재조합을 위하여, 양 융합 단편들을 H. polymorpha DL1-LdU균주에 형질전환(Hill, J., K. A. G. Donald, and D. E. Griffiths. 1991. DMSO-enhanced Whole cell yeast transformation. Nucl. Acids Res. 19:5791) 하였으며 형질전환주를 우라실이 결핍된 SC-Ura 플레이트(plate)에 도말하였다. 이 배지에서 성장하는 우라실 영양요구성이 제거된 형질전환균주를 YPD 배지 배양 SC-Ura 배지 배양 등을 통해 안정화시키고 선별한 후 해당 균주의 염색체 DNA를 대상으로 HpADH1 유전자에 대한 PCR을 실시하여 HpADH1 유전자 제거 여부를 확인하였다.

<3-3> Hp ADH1 및 ADH 이소자임의 결실 분석

HpADH1의 생리학적 역할을 확인하기 위하여, 전술한 바와 같이, 2단계 PCR 및 세포 내 재조합 방법에 의해 HpADH1 유전자를 결실시켰다(△HpADH1). 확보된 돌연변이 후보균주의 염색체 DNA를 정제한 후 주형으로 사용하여 △ADH1NF 및 △ADH1CR을 프라이머로 이용하여 PCR을 수행하여 HpADH1결실 여부를 확인하였다. 야생형의 경우 2.9 kb 단편으로 검출된 것과 달리 ADH1 결실 돌연변이(△HpADH1 )는 3.5kb 단편의 존재로 검출되었다. 그 후, ADH 이소자임의 전기영동 패턴(electrophoretic pattern)을 DL1-L 및 △HpADH1과 비교하였다. YPD(2% 글루코스) 및 YPE(2% 에탄올)에서 배양된 이들 균주의 세포 파쇄액을 Native PAGE 로 분리하였다. 겔 하나는 ADH 활성 검출을 위해 염색하였고, 동시에 다른 겔은 쿠마시 브릴리언트 블루 용액으로 염색하여 대조군 겔로 이용하였다. NAD⁺-의존성 에탄올 산화와 관련하여, 도 2A에서 나타난 것과 같이 글루코스 및 에탄올 배지에서 H. polymorpha DL1-L로부터 최소한 4개의 ADH 밴드가 뚜렷하게 나타난 것이 관찰되었다. 본 발명에서 관찰한 H. polymorpha DL1-L의 ADH 이소자임 발현 양상은 메탄올-배양된 H. polymorpha CBS4732의 이소자임 패턴에 상응하나, 자일로스(xylose)-배양된 NCYC495세포로부터 유래된 것과는 약간의 차이를 보였다. 그 경우, ADH 이소자임 하나가 추가적으로 나타났으며, 이는 자일로스와 같이 다른 탄소원에 대한 반응의 결과로 보인다. 본 발명에서 관찰한 바에 의하면 △ HpADH1 균주에서는 이소자임 하나가 전혀 존재하지 않았으므로, 이것이 HpADH1일 것으로 판단된다. 더구나, △HpADH1균주의 세포 파쇄액의 ADH 활성을 분석한 결과 전체 ADH 활성이 야생형 균주인 DL1-L 균주에 비해 6%만이 남아있는 것으로 확인되었다(도 2B). 한편 상기 이소자임은 글루코스 또는 에탄올 배지 양쪽 모두에서 강하게 발현되었다.

<3-4> H. polymorpha △ HpADH1 결실 균주의 기능보완 (complementation) 및 과발현을 위한 pDLG - Hp ADH 1 의 제조

H. polymorpha DL1-L의 게놈 DNA로부터 전장 HpADH1 유전자를 증폭하기 위하여 프라이머 HpADH1F 및 HpADH1R(표 2)를 이용하여 PCR을 수행하였고 상기 PCR 산물을　 HindIII 및 SpeI 제한효소로 절단하고 이를 같은 종류의 제한효소로 절단된 pDLG 벡터에 삽입하여 P_GAPDH 프로모터 및 GAPDH 전사종결 신호(terminator) 통제 하에 HpADH1 유전자가 전사되는 재조합벡터 pDLG-HpADH1를 확보하였다(도 3A). 확보한 벡터 내의 HpADH1유전자는 DNA 시퀀싱으로 확증하였다.

<3-5> pDLG - HpADH1 벡터를 이용한 HpADH1 결실 균주의 기능보완 및 과발현

상기 언급한 바와 같이 HpADH1 유전자를 HpADH1 결실 세포에 도입하여 HpADH1 과발현 주, 즉 pDLG-HpADH1/△HpADH1균주를 제조하였다. pDLG-HpADH1 벡터로 형질전환된 균주에서는 P_GAPDH 프로모터를 통하여 HpADH1표적 단백질이 항시 발현(constitutive expression)되게 된다(도 3A). 이 벡터 상에는 루이신 영양요구성 균주인 △HpADH1에 형질전환한 후 형질전환 여부 확인 및 안정화를 위한 표지 유전자로 사용할 수 있는 Leu2 유전자를 포함하고 있다. 상기 플라스미드를 △HpADH1 결실 게놈으로 안정적으로 도입한 후 PCR로 HpADH1 유전자의 도입을 확인하였다. 형질전환 균주는 YPD 배지에서의 성장능이 회복되었으며 세포 파쇄액(lysate)의 ADH 활성을 측정한 결과 야생형 균주인 H. polymorpha DL1-L에 비하여 ADH 활성이 3배 이상 증가한 것으로 관찰되었다(도 3B). ADH 활성을 분석하기 위하여, H. polymorpha DL-1L, △HpADH1, 및 pDLG-HpADH1/△HpADH1 균주를 37℃, 180 rpm에서 24시간 동안 YPD 및 YPE 배지에서 배양하였다. 원심분리에 의해 세포를 회수한 후 세포파쇄 완충액(50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF)에 다시 현탁하였으며 glass bead를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄액을 원심분리 후 상층액을 회수하여 효소활성 측정에 사용하였다.

<3-6> 세포 증식에 있어 HpADH1 의 영향

YPD 및 YPE 액체 배지에서 야생형 및 HpADH1결실 돌연변이 세포의 성장을 분석하였다. 글루코스 배지에서, HpADH1 결실 세포는 DL1-L 세포에 비하여 성장이 훨씬 저해되었다. 그러나 이러한 성장저해 표현형은 pDLG-HpADH1/△HpADH1 형질전환 균주에서는 제거되었다. 글루코스 배지에서와는 달리, 에탄올 배지에서는 모든 균주들이 비슷한 비율로 자랐다(도4). 그러나 에탄올 배지에서 8시간 배양한 후에는 △H pAD H1 결실 균주 및 pDLG-HpADH1/△ HpADH1 형질전환 균주 모두 에탄올에 의하여 성장이 약간 느려졌다.

< 실시예 4> 에탄올 생산

<4-1> 에탄올 생산

야생형인 H. polymorpha DL1-L과 비교하여 △HpADH1 결실 변이주 및 pDLG-HpADH1/△HpADH1기능보완 형질전환균주에 대하여 에탄올 발효능을 평가하였다. 단일 탄소원으로 10% 글루코스나 10% 글리세롤 그리고 아미노산을 보충한 semisynthetic YNB(SYNB) 배지 100 ㎖이 들어있는 250 ㎖ 플라스크에 세포를 배양하였다(Ryabova, O. B., O. M. Chmil, and A. A. Sibirny. 2003. Xylose and cellobiose fermentation to ethanol by the thermotolerant methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. FEMS Yeast Res 4:157-164). 5 일 내지 6일 동안 호흡-발효(respiro-fermentative) 조건 하(100rpm), 37℃에서 배양하였다. 생체량(biomass)은 OD₆₆₀으로부터 계산하였다(Hyun Ah Kang, W. K., Won-Kyuong Hong, Moo Woong Kim, Jeong-Yoon Kim, Jung-Hoon Sohn, Eui-Sung Choi, Keun-Bum Choe, Sang Ki Rhee. 2001. Development of expression systems for the production of recombinant human serum albumin using the MOX promoter in Hansenula polymorpha DL-1. Biotechnology and Bioengineering 76:175-185). 제조업체의 메뉴얼에 따라 EnzyChrom^TM 에탄올 분석 키트(ECET-100, BioAssay Systems)를 이용하여 에탄올을 정량하였다.

<4-2> 글루코스 및 글리세롤로부터 에탄올의 생산

에탄올 형성에 있어 HpADH1의 결실 및 과발현 효과를 평가하기 위하여, 호흡-발효 조건 하, H. polymorpha DL1-L, △HpADH1, 및 pDLG-HpADH1/△HpADH1 균주의 글루코스 및 글리세롤(도 5)로부터 에탄올 생산을 측정하였다. 글루코스 배지의 경우, △HpADH1의 생장은 1~3일째에, 다른 균주들에 비하여 명백하게 저조하였다. 4~5일 사이에서는 HpADH1과 DL1-L의 생체량은 비슷해졌다. 반면, pDLG-HpADH1/△HpADH1 형질전환 균주의 경우 배양 초기 그 성장속도가 타 균주들에 비해 매우 빨랐으며 2일을 정점으로 완만하게 감소하였다. 배양 중 각 균주의 생체량 변화양상과 마찬가지로 에탄올 생산량에 있어서도 pDLG-HpADH1/△HpADH1 형질전환 균주가 배양 4일째에 36 g/l에 달하는 가장 높은 에탄올 생산량을 보인데 반하여, △HpADH1균주는 DL1-L의 30% 수준의 에탄올 생산능을 보였다.　

글리세롤 배지에서 발효시키는 경우 모든 균주가 비슷한 성장 패턴을 보였으나, pDLG-HpADH1/△HpADH1 형질전환 균주는 4~6일 동안 여전히 완만하지만 지속적인 성장을 유지하였다. DL1-L과 pDLG-HpADH1/△HpADH1 형질전환 균주의 에탄올 생산량이 비슷한 반면, 글루코스 배지에서와 마찬가지로, △HpADH1균주는 에탄올을 거의 생산하지 못하였다. 5일째 pDLG-HpADH1/△HpADH1 형질전환 균주의 에탄올 생산 수준은 DL1-L의 생산 수준보다 약간 높았다.

본 발명은 글루코스 및 글리세롤로부터 에탄올을 생산하는 방법 및 상기 에탄올을 생산하는 재조합 효모 등을 제공한다. 고온 내성, 오탄당인 자일로스 발효능, 각종 독성물질에 대한 내성 등으로 바이오매스를 이용한 바이오에탄올을 생산하기 위한 우수한 균주로 개발될 수 있는 한세눌라 폴리모파를 이용한 에탄올 생산 방법을 제공한다. 또한 바이오디젤의 부산물인 글리세롤을 이용하여 바이오에탄올을 생산함으로써 종래 식량자원을 원료로 이용하는 한계가 있었던 바이오에탄올 생산방법의 문제점을 해결하며, 바이오연료 본래의 목적에 더욱 부합하는 방안을 제시한다.

<110> korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> New dehydrogenase HpADH1 and a method for preparing bioethanol using it <130> 9p-06-61 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 349 <212> PRT <213> Hansenula polymorpha <400> 1 Met Thr Ser Ile Pro Lys Thr Gln Lys Ala Val Val Phe Glu Thr Asn 1 5 10 15 Gly Gly Pro Leu Leu Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Gln Pro Lys Pro 20 25 30 Asn Glu Ile Leu Val Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp 35 40 45 Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Asp Thr Lys Leu Pro Leu 50 55 60 Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Lys Gly Ala Asn 65 70 75 80 Val Thr Asn Phe Glu Ile Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Ser Cys Met Gly Cys Glu Phe Cys Gln Gln Gly Ala Glu Pro Asn 100 105 110 Cys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln 115 120 125 Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Lys Ile Pro Lys Gly 130 135 140 Thr Asn Leu Ala Asp Val Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Val Thr Val 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Leu Lys Thr Ala Glu Leu Ser Pro Gly Gln Trp Val Ala 165 170 175 Ile Ser Gly Ala Gly Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala 180 185 190 Val Ala Met Gly Leu Arg Val Leu Gly Ile Asp Gly Gly Asp Glu Lys 195 200 205 Ala Lys Leu Phe Glu Ser Leu Gly Gly Glu Val Phe Ile Asp Phe Thr 210 215 220 Lys Glu Lys Asp Ile Val Gly Ala Val Gln Lys Ala Thr Asn Gly Gly 225 230 235 240 Pro His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Pro Ala Ala Ile Ser Gln 245 250 255 Ser Cys Gln Tyr Val Arg Thr Leu Gly Lys Val Val Leu Val Gly Leu 260 265 270 Pro Ala Gly Ala Val Cys Glu Ser Pro Val Phe Glu His Val Ile Lys 275 280 285 Ser Ile Gln Ile Arg Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Gln Asp Thr Ala 290 295 300 Glu Ser Ile Asp Phe Phe Val Arg Gly Lys Val Lys Ala Pro Ile Lys 305 310 315 320 Val Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Lys Val Phe Glu Leu Met Glu Gln 325 330 335 Gly Lys Ile Ala Gly Arg Tyr Val Leu Asp Thr Ser Lys 340 345 <210> 2 <211> 1050 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha <400> 2 atgacttcca ttccaaagac tcaaaaggcc gttgttttcg agaccaacgg tggtcctctt 60 ctctacaagg acatccctgt tccacaacca aagccaaatg agattcttgt caacgtcaag 120 tactccggtg tttgccacac cgatctccac gcttggaagg gtgactggcc attggacacc 180 aaacttccac tggtcggtgg tcacgagggt gctggtgttg ttgttgctaa gggtgccaac 240 gttaccaact ttgaaatcgg tgactacgct ggtatcaaat ggttgaacgg ctcgtgcatg 300 ggttgtgagt tctgtcaaca aggtgcagag ccaaactgtc ctgaggccga cctttccggt 360 tacacgcacg acggttcttt ccaacaatac gccactgctg atgctgtcca ggctgccaag 420 attccaaagg gaactaacct ggctgacgtt gctccaattc tctgtgctgg tgtcactgtg 480 tacaaggcat tgaagactgc cgaattgagc ccaggccaat gggttgctat ctctggtgct 540 ggtggaggat tgggttctct tgccgttcaa tacgctgtcg ccatgggcct gagagtcctg 600 ggtatcgatg gtggtgacga aaaggctaag ctcttcgaga gcttgggcgg agaagtcttc 660 atcgatttca ccaaggaaaa ggacattgtc ggagccgtcc agaaggcaac caacggtggt 720 ccacacggtg ttatcaacgt ttctgtgtct ccagcagcta tctctcaatc ctgccaatac 780 gtgagaactc ttggtaaggt tgttcttgtt ggtcttccag ccggtgctgt ttgcgagtct 840 ccagttttcg agcacgttat caagtctatc cagattagag gttcctacgt tggtaacaga 900 caggacactg ccgagtcgat tgacttcttc gtcagaggca aggttaaggc tccaatcaag 960 gttgttggcc tttctgagct gccaaaggtg ttcgagttga tggagcaagg aaagattgct 1020 ggaagatacg ttcttgacac ttccaaatag 1050

Claims

알코올 탈수소효소 활성을 갖는, 하기 (i) 또는 (ii) 중 어느 하나의 폴리펩티드:
(ⅰ) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드; 및
(ⅱ) 서열번호 2로 구성되는 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 코드되는 폴리펩티드.
제 1항의 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
제 2항에 있어, 서열번호 2로 기재되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
삭제
제 2항 또는 제 3항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제 5항의 벡터로 숙주세포를 형질전환한 형질전환체.
제 6항에 있어, 상기 숙주세포는 박테리아 또는 효모인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
제 7항에 있어 상기 박테리아는 스타필로코코스 에우리우스(Staphylococcus aureus), 대장균(E. coli), 바실러스 세레우스(B. cereus), 살모넬라 타이피뮤림(Salmonella typimurium), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 및 리스테리아 모노사이토게네스
(Listeria monocytogenes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
제 7항에 있어서, 상기 효모는 피키아(Pichia), 한세눌라(Hansenula) 또는 캔디다(Candida)속에 속하는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
제 9항에 있어서, 상기 효모는 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha)인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
1) 제 5항의 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 형질전환체를 제조하는 단계;
2) 단계 1)의 형질전환체를 탄소원을 포함하는 배지 내에서 배양하는 단계; 및
3) 단계 2)의 배지로부터 에탄올을 회수하는 단계를 포함하는 에탄올의 제조 방법.
제 11항에 있어서, 상기 단계 1)의 숙주세포는 박테리아 또는 효모인 것을 특징으로 하는 에탄올의 제조 방법.
제 12항에 있어서, 상기 숙주세포는 스타필로코코스 에우리우스(Staphylococcus aureus), 대장균(E. coli), 바실러스 세레우스(B. cereus), 살모넬라 타이피뮤림(Salmonella typimurium), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 및 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 12항에 있어서, 상기 효모는 피키아(Pichia), 한세눌라(Hansenula) 또는 캔디다(Candida)속에 속하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 14항에 있어서, 상기 효모는 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha)인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 11항에 있어서, 상기 탄소원은 녹말, 셀룰로스, 오탄당, 육탄당 또는 글리세롤인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 16항에 있어서, 상기 탄소원은 자일로스, 글루코스, 아라비노스, 만노스 및 갈락토스인 것을 특징으로 하는 제조 방법.