KR20080050578A

KR20080050578A - 알콜 아세틸 전이효소 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20080050578A
Application number: KR1020087005432A
Authority: KR
Inventors: 요시히로 나카오; 유키코 고다마; 도모코 시모나가
Original assignee: 산또리 가부시키가이샤
Priority date: 2005-09-13
Filing date: 2006-09-12
Publication date: 2008-06-09
Also published as: WO2007032524A2; EP1924687B1; JP2009507485A; WO2007032524A3; CA2621407A1; US20100159070A1; AU2006289720B2; EP1924687A2; CN1932014A; AU2006289720A1; JP4887367B2; CN1932014B; DK1924687T3

Abstract

본 발명은 알콜 아세틸 전이효소 유전자 및 그의 용도, 특히 향 및 풍미가 우수한 알콜성 음료를 제조하는 양조 효모, 상기 효모를 사용하여 제조한 알콜성 음료, 및 상기 알콜성 음료의 제조 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 생성물의 향 및 풍미에 기여하는 에스테르를 제조하는 능력이 양조 효모 알콜 아세틸 전이효소 Atf2p 를 인코딩하는 ATF2 유전자, 특히 라거 양조 효모에 특유한 비(非)ScATF2 유전자의 발현 수준을 조절함에 의해 제어된 효모, 및 상기 효모를 이용한 알콜성 음료의 제조 방법에 관한 것이다.

양조 효모, 에스테르-생성 능력, 알콜성 음료, 비(非)ScATF2 유전자

Description

알콜 아세틸 전이효소 유전자 및 이의 용도 {ALCOHOL ACETYL TRANSFERASE GENE AND USE THEREOF}

본 발명은 알콜 아세틸 전이효소 유전자 및 상기 유전자의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 특히 향 및 풍미가 우수한 알콜성 음료를 제조하는 양조 효모, 상기와 같은 효모를 사용하여 제조한 알콜성 음료, 및 이러한 알콜성 음료의 제조 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 양조 효모 내의 알콜 아세틸 전이효소 Atf2p 를 암호화하는 ATF2 유전자, 특히 생성물의 향 및 풍미에 기여하는 에스테르를 제조하는 능력이 맥주 효모에 특유한 비(非)ScATF2 유전자의 발현 수준을 조절함에 의해 제어되는 효모 및 상기와 같은 효모를 이용한 알콜성 음료의 제조 방법에 관한 것이다.

에스테르는 알콜성 음료의 중요한 방향 성분이다. 청주, 와인 및 위스키의 경우, 에스테르 함량을 증가시키면 음료에 화려한 (florid) 향이 제공되며, 또한 풍미에 있어서 높은 평가를 받게 되도록 하는 것으로 알려져 있다. 한편, 에스테르가 맥주에서도 중요한 방향 성분이지만, 과량의 에스테르는 생성되는 에스테르 냄새에 기인하여 환영받지 못한다. 따라서, 알콜성 음료의 유형에 따라 형성되는 에스테르의 양을 적절하게 제어하는 것이 중요하다.

과거에 알콜성 음료의 에스테르 함량을 증가시키기 위해 에스테르를 고 수준으로 생성하는 효모가 개발되었다. 이전에 보고된, 다량의 에스테르를 생성하는 효모를 효과적으로 분리하는 방법의 예로서는, 효모를 돌연변이유발 처리에 적용하여 (또는 적용하지 않고), 다량의 카프로산을 생성하며 세룰레닌과 같은 지방산 합성효소를 저해하는 약물에 저항성 있는 균주 및 5,5,5-트리플루오로-DL-류신과 같은 류신 유사체에 저항성 있고 다량의 이소아밀 알콜 및 이소아밀 아세테이트를 생성하는 균주를 수득하는 방법(일본 특허 공개공보 제 2002-253211 호), 및 위치 3 이 히드록실화된 프레그난 골격을 가진 스테로이드를 함유한 배지에서 성장시킨 균주를 획득하는 방법(일본 특허 공개공보 제 2002-191355 호)이 있다.

한편, 이전에 보고된, 유전 공학 기술을 이용한 효모 개발을 수반한 방법의 예로서는, 양조 효모에서 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 의 알콜 아세틸 전이효소 유전자 ATF1 를 고수준으로 발현시키는 것(일본 특허 공개공보 제 H06-062849 호), ATF1 의 발현을 저해시키는 것(일본 특허 공개공보 제 H06-253826 호), 및 양조 효모에서 에스테라아제 유전자 EST2 를 파괴하여 에스테르의 양을 증가시키는 것(일본 특허 공개공보 제 H09-234077 호) 이 있다.

상기 언급한 바와 같이, 생성물의 에스테르 함량을 증가시키는 돌연변이 균주가 획득되고 있지만, 그 결과로서 예기치 않은 발효 지연 또는 바람직하지 않은 방향 및 풍미 성분의 증가가 관찰되어, 실제 적용을 위한 효모의 개발에 문제가 야기되는 경우가 있다. 따라서, 발효 속도 또는 생성물 품질을 손상시키지 않고 목적량의 에스테르를 생성할 수 있는 효모를 육종하는 방법이 요구된다.

상기 언급한 문제를 해결하기 위해 예의 연구를 수행한 결과, 본 발명의 발명자들은 양조 효모로부터 공지의 단백질들보다 더 유리한 효과를 나타내는 알콜 아세틸 전이효소를 인코딩하는 유전자를 동정 및 분리하는데 성공하였다. 게다가, 본 발명의 발명자들은 또한, 효모에 상기 결과적인 유전자를 삽입 및 발현시켜 형질전환 효모를 제조함으로써 형성되는 에스테르의 양이 증가됨을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 양조 효모에 특징적으로 존재하는 신규한 알콜 아세틸 전이효소 유전자, 상기 유전자로 인코딩되는 단백질, 상기 유전자의 발현이 조절되는 형질전환된 효모, 및 상기 유전자의 발현이 조절된 효모를 이용하여 생성물에서 형성되는 에스테르의 양을 제어하는 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 하기 나타낸 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터, 상기 벡터가 삽입된 형질전환된 효모, 및 상기 형질전환된 효모를 이용한 알콜성 음료의 제조 방법을 제공한다.

(1) 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(a) 서열번호:1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(b) 서열번호:2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(c) 알콜 아세틸 전이효소 활성을 가지며 서열번호:2 의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(d) 알콜 아세틸 전이효소 활성을 가지며 서열번호:2 의 아미노산 서열과의 일치성이 60% 이상인 아미노산 서열을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(e) 엄격한 조건하에서 서열번호:1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며, 알콜 아세틸 전이효소 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및

(f) 엄격한 조건하에서 서열번호:2 의 아미노산 서열의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 알콜 아세틸 전이효소 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.

(2) 상기 (1) 에 있어서, 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(g) 서열번호: 2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하거나, 또는 서열번호: 2 의 아미노산 서열 중 1 내지 10 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 인코딩하고, 이때 상기 단백질은 알콜 아세틸 전이효소 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(h) 서열번호: 2 의 아미노산 서열과의 일치성이 90% 이상이며 알콜 아세틸 전이효소 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및

(i) 서열번호: 1 에 혼성화하거나 또는 고도로 엄격한 조건하에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화하며, 알콜 아세틸 전이효소 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.

(3) 상기 (1) 에 있어서, 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.

(4) 상기 (1) 에 있어서, 서열번호: 2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.

(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, DNA 인 폴리뉴클레오티드.

(6) 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(j) 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(k) RNAi 효과를 통해 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(l) 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물을 특이적으로 절단하는 활성을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

(m) 공동-억제 효과를 통해 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.

(7) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드로 인코딩되는 단백질.

(8) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터.

(8a) 상기 (8) 에 있어서, 하기 구성요소들이 포함된 발현 카세트를 포함한 벡터:

(x) 효모 세포에서 전사될 수 있는 프로모터;

(y) 상기 프로모터에 센스 방향 또는 안티센스 방향으로 연결된 상기 (1) 내지 (5) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나; 및

(z) 전사 종결 및 RNA 분자의 폴리아데닐화에 대하여 효모에서 기능할 수 있는 신호.

(9) 상기 (6) 의 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터.

(10) 상기 (8) 또는 (9) 의 벡터가 도입된 효모.

(11) 상기 (10) 에 있어서, 상기 (8) 의 벡터를 도입함에 의해 에스테르-생성 능력이 증가되는 효모.

(12) 상기 (9) 의 벡터를 도입함에 의해, 또는 상기 (5) 의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 와 관련된 유전자를 파괴함에 의해 상기 (5) 의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현이 억제되는 효모.

(13) 상기 (11) 에 있어서, 상기 (7) 의 단백질의 발현 수준을 증가시킴에 의해 에스테르-생성 능력이 증가되는 효모.

(14) 상기 (10) 내지 (13) 중 어느 하나의 효모를 사용함에 의한 알콜성 음료의 제조 방법.

(15) 상기 (14) 에 있어서, 양조된 알콜성 음료가 맥아 음료인 알콜성 음료의 제조 방법.

(16) 상기 (14) 에 있어서, 양조된 알콜성 음료가 와인인 알콜성 음료의 제조 방법.

(17) 상기 (14) 내지 (16) 중 어느 하나의 방법으로 제조되는 알콜성 음료.

(18) 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 알콜 아세틸 전이효소 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 고안된 프라이머 또는 탐침자 (probe) 를 사용하는 것을 포함하는, 시험 효모의 에스테르-생성 능력을 평가하는 방법.

(18a) 상기 (18) 의 방법을 사용함으로써 에스테르-생성 능력이 증가 또는 감소된 효모를 선별하는 방법.

(18b) 상기 (18a) 의 방법으로 선별된 효모를 사용함에 의한 알콜성 음료 (예를 들어, 맥주) 의 제조 방법.

(19) 하기를 포함하는 시험 효모의 에스테르-생성 능력을 평가하는 방법: 시험 효모를 배양함; 및 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 알콜 아세틸 전이효소 유전자의 발현 수준을 측정함.

(20) 하기를 포함하는, 효모의 선별 방법: 시험 효모를 배양함; 상기 (7) 의 단백질을 정량하거나 또는 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 알콜 아세틸 전이효소 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 표적 에스테르-생성 능력에 따른 상기 단백질의 양 또는 상기 유전자 발현 수준을 갖는 시험 효모를 선별함.

(20a) 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 시험 효모를 배양함; 상기 (7) 의 단백질의 에스테르-생성 능력 또는 알콜 아세틸 전이효소 활성을 측정함; 및 표적 에스테르 생성 능력 또는 표적 알콜 아세틸 전이효소 활성을 갖는 시험 효모를 선별함.

(21) 상기 (20) 에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 알콜 아세틸 전이효소 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 상기 참조 효모에서보다 상기 유전자가 더 높거나 또는 더 낮게 발현되는 시험 효모를 선별함.

(22) 상기 (20) 에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 상기 (7) 의 단백질을 정량함; 및 참조 효모에서보다 상기 단백질의 양이 더 많은 시험 효모를 선별함. 즉, 상기 (20) 에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 복수의 효모를 배양함; 각 효모에서 상기 (7) 의 단백질을 정량함; 및 이들 중 다량의 상기 단백질을 가진 시험 효모를 선별함. 즉, 상기 (20) 에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 복수의 효모를 배양함; 각 효모에서 상기 (7) 의 단백질을 정량함; 및 이들 중 상기 단백질을 많은 또는 적은 양으로 생성하는 시험 효모를 선별함.

(23) 하기를 포함하는 알콜성 음료의 제조 방법: 상기 (10) 내지 (13) 중 어느 하나에 따른 효모 또는 상기 (20) 내지 (22) 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 선별된 효모를 사용하여 알콜성 음료의 제조를 위한 발효를 수행함; 및 에스테르의 생성량을 조절함.

본 발명의 형질전환된 효모를 사용함에 의한 알콜류의 제조 방법에 따르면, 풍미가 강화된 알콜류가 생성될 수 있도록 에스테르 함량을 제어할 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1 은 맥주 발효 시험시의 시간에 따른 세포 성장을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.

도 2 는 맥주 발효 시험시의 시간에 따른 추출물 (당) 소비량을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 겉보기 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.

도 3 은 맥주 발효 시험시의 효모 내의 비(非)ScATF2 유전자의 발현 프로파일을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 검출된 신호의 강도를 나타낸다.

도 4 는 발효 시험시의 시간에 따른 세포 성장을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.

도 5 는 맥주 발효 시험시의 시간에 따른 추출물 (당) 소비량을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 겉보기 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 양식

본 발명자들은 효모의 알콜 아세틸 전이효소 활성을 증가 또는 감소시킴으로써 생성물에서의 에스테르를 제어하는 것이 가능하다는 생각을 품었다. 본 발명자들은 상기 개념에 기초하여 연구하였고, 그 결과, 일본 특허 공개공보 제 2004-283169 호에 개시된 방법에 따라 맵핑된 라거 양조 효모 게놈 정보에 기초한 라거 양조 효모에 유일한 알콜 아세틸 전이효소를 인코딩하는 비(非)ScATF2 유전자를 분리 및 동정하였다. 상기 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 1 로 표시된다. 나아가, 상기 유전자로 인코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 2 로 표시된다.

1. 본 발명의 폴리뉴클레오티드

먼저, 본 발명은 (a) 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 서열번호:2 의 아미노산 서열의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 일 수 있다.

본 발명의 표적 폴리뉴클레오티드는 상기 기술한 라거 양조 효모에서 유래한 알콜 아세틸 전이효소 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 한정되지 않으며, 상기 단백질에 대한 등가의 기능을 갖는 단백질들을 인코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드들도 이에 포함될 수 있다. 등가의 기능을 가진 단백질로서는, 예를 들어, (c) 알콜 아세틸 전이효소 활성을 가지며 서열번호: 2 의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 가진 단백질이 있다.

이러한 단백질에는, 알콜 아세틸 전이효소 활성을 가지며 서열번호: 2 의 아미노산 서열에서, 예를 들어, 1 내지 100, 1 내지 90, 1 내지 80, 1 내지 70, 1 내지 60, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 39, 1 내지 38, 1 내지 37, 1 내지 36, 1 내지 35, 1 내지 34, 1 내지 33, 1 내지 32, 1 내지 31, 1 내지 30, 1 내지 29, 1 내지 28, 1 내지 27, 1 내지 26, 1 내지 25, 1 내지 24, 1 내지 23, 1 내지 22, 1 내지 21, 1 내지 20, 1 내지 19, 1 내지 18, 1 내지 17, 1 내지 16, 1 내지 15, 1 내지 14, 1 내지 13, 1 내지 12, 1 내지 11, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6 (1 내지 수 개의 아미노산), 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1 개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열로 이루어진 단백질이 포함된다. 일반적으로, 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가의 수는 더 적은 것이 바람직하다. 또한, 이러한 단백질에는, (d) 알콜 아세틸 전이효소 활성을 가지며 서열번호: 2 의 아미노산 서열과의 일치성이 약 60% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상인 아미노산 서열을 가진 단백질이 포함된다. 일반적으로, 백분율 동일성이 더 높은 것이 바람직하다.

알콜 아세틸 전이효소 활성은, 예를 들어 일본 공개 특허 공보 제 253826 호에 기재된 방법으로 측정가능하다.

나아가, 본 발명은 또한 (e) 엄격한 조건하에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 알콜 아세틸 전이효소 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및 (f) 엄격한 조건하에서 서열번호: 2 의 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 알콜 아세틸 전이효소 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드를 염두에 둔다.

여기서, "엄격한 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드"란 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 탐침자로서 사용하여 콜로니 혼성화 기술, 플라크 혼성화 기술, 서던 (southern) 혼성화 기술 등에 의해 수득된, DNA 등의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 상기 혼성화 방법은, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning 제 3 판, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997] 등에 기재된 방법일 수 있다.

본원에 사용된 "엄격한 조건"이라는 용어는 낮은 엄격성 조건, 중간 엄격성 조건 또는 높은 엄격성 조건 중 임의일 수 있다. "낮은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 32℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "중간 엄격성 조건"은, 예를 들어, 42℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "높은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 50℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. 이들 조건하에서, 상동성이 더 높은, DNA 등의 폴리뉴클레오티드는 더욱 높은 온도에서 효율적으로 수득될 것으로 예상되지만, 혼성화 엄격성에는 온도, 탐침자 농도, 탐침자 길이, 이온 세기, 시간, 염 농도 및 기타를 비롯하여 복수의 요인들이 연루되므로, 당업자는 유사한 엄격성을 구현하기 위해 이들 요인들을 적절히 선택할 수 있다.

혼성화를 위해 시판중인 키트를 사용하는 경우에는, 예를 들어, Alkphos Direct Labeling Reagents (Amersham Pharmacia) 를 사용할 수 있다. 이 경우, 첨부된 프로토콜에 따라, 표지된 탐침자와 함께 하룻밤 인큐베이션한 후, 막을 0.1% (w/v) SDS 가 함유된 55℃ 의 1차 세정 완충액으로 세정하여, 혼성화된, DNA 등의 폴리뉴클레오티드를 검출한다.

혼성화될 수 있는 기타 폴리뉴클레오티드에는, 기본 매개변수를 사용하여 FASTA 및 BLAST 와 같은 상동성 검색 소프트웨어로 산출한 바, 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 일치성이 약 60% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상인 폴리뉴클레오티드가 포함된다.

아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열들 간의 일치성은 Karlin 및 Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST 를 사용하여 결정할 수 있다(Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 87: 2264-2268, 1990; Proc . Natl Acad . Sci . USA, 90: 5873, 1993). BLAST 알고리즘에 기초한 BLASTN 및 BLASTX 로 불리는 프로그램들이 개발되었다(Altschul SF 등, J. Mol . Biol . 215: 403, 1990). 뉴클레오티드 서열을 BLASTN 을 사용하여 서열분석하는 경우, 매개변수들은, 예를 들어, 스코어 = 100 및 단어 길이 = 12 이다. 아미노산 서열을 BLASTX 로 서열분석하는 경우, 매개변수들은, 예를 들어, 스코어 = 50 및 단어 길이 = 3 이다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램에 대한 기본 매개변수가 이용된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드에는, (j) 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; (k) RNAi 효과를 통해 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; (l) 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물을 특이적으로 절단하는 활성을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (m) 공동-억제 효과를 통해 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 이들 폴리뉴클레오티드는 벡터 내로 통합될 수 있는데, 상기 벡터는 상기 (a) 내지 (i) 의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 형질전환을 위해 세포 내로 도입될 수 있다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제시키는 것이 바람직한 경우 이들 폴리뉴클레오티드를 적절히 사용할 수 있다.

본원에 사용된 "DNA 의 전사물에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 구절은 소위 안티센스 DNA 를 지칭한다. 안티센스 기술은 특정 내인성 유전자의 발현을 억제하는 방법으로 공지되어 있으며, 다양한 출판물에 기재되어 있다(예컨대, Hirajima 및 Inoue: New Biochemistry Experiment Course 2 Nucleic Acids IV Gene Replication and Expression (Japanese Biochemical Society Ed., Tokyo Kagaku Dozin Co., Ltd.) pp.319-347, 1993 참조). 안티센스 DNA 의 서열은 바람직하게는 상기 내인성 유전자의 전부 또는 일부에 상보적이나, 상기 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 한 완전히 상보적이지는 않을 수 있다. 전사된 RNA 는 상기 표적 유전자의 전사물에 대한 상보성이 바람직하게는 90% 이상, 및 더욱 바람직하게는 95% 이상이다. 안티센스 DNA 의 길이는 적어도 염기 15 개 이상, 바람직하게는 염기 100 개 이상, 및 더욱 바람직하게는 염기 500 개 이상이다.

본원에 사용된 "RNAi 효과를 통해 DNA 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 구절은 RNA 간섭 (RNAi) 을 통해 내인성 유전자의 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "RNAi"는, 표적 유전자 서열과 동일하거나 유사한 서열을 가진 이중가닥 RNA 를 세포 내로 도입할 때, 도입된 외래 유전자 및 표적 내인성 유전자의 발현이 모두 억제되는 현상을 지칭한다. 본원에 사용되는 RNA 로서는, 예를 들어, 21 내지 25 개 염기 길이의 RNA 간섭을 유발하는 이중가닥 RNA, 예를 들어, dsRNA (double strand RNA, 이중가닥 RNA), siRNA (small interfering RNA, 소간섭 RNA) 또는 shRNA (short hairpin RNA, 짧은 헤어핀 RNA) 를 들 수 있다. 이러한 RNA 는 리포솜과 같은 전달 시스템을 이용하여 목적하는 부위로 국소적으로 전달될 수 있고, 또는 상기 기재한 이중가닥 RNA 를 생성하는 벡터가 그의 국소적 발현을 위해 사용될 수도 있다. 이러한 이중가닥 RNA (dsRNA, siRNA 또는 shRNA) 를 제조 및 사용하는 방법은 다수의 출판물로부터 공지되어 있다(예컨대 하기 참조: 일본 국내단계 PCT 공개 특허 공보 제 2002-516062 호; US 2002/086356A; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.; Genesis, 26(4), 240-244, 2000 April; Nature, 407:6802, 319-20, 2002 Sep. 21; Genes & Dev., Vol.16, (8), 948-958, 2002 Apr.15; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(8), 5515-5520, 2002 Apr. 16; Science, 296(5567), 550-553, 2002 Apr. 19; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99:9, 6047-6052, 2002 Apr. 30; Nature Biotechnology, Vol.20 (5), 497-500, 2002 May; Nature Biotechnology, Vol. 20(5), 500-505, 2002 May; Nucleic Acids Res, 30:10, e46,2002 May 15).

본원에 사용된 "DNA 의 전사물을 특이적으로 절단하는 활성을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 구절은 일반적으로 리보자임 (ribozyme) 을 지칭한다. 리보자임은 표적 DNA 의 전사물을 절단하여 상기 유전자의 기능을 저해하는 촉매 활성을 가진 RNA 분자이다. 리보자임의 설계는 공지된 다양한 출판물들에서 발견할 수 있다(예컨대 하기 참조: FEBS Lett. 228: 228, 1988; FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323: 349, 1986; Nucl. Acids. Res. 19: 6751, 1991; Protein Eng 3: 733, 1990; Nucl. Acids Res. 19: 3875, 1991; Nucl. Acids Res. 19: 5125, 1991; Biochem Biophys Res Commun 186: 1271, 1992). 또한, "공동-억제 효과를 통해 DNA 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 구절은 "공동-억제"에 의해 표적 DNA 의 기능을 저해하는 뉴클레오티드를 지칭한다.

본원에 사용된 "공동-억제"라는 용어는 표적 내인성 유전자와 동일한 또는 그와 유사한 서열을 가진 유전자를 세포 내로 형질전환시킬 때, 도입된 외래 유전자 및 표적 내인성 유전자의 발현이 모두 억제되는 현상을 지칭한다. 공동-억제 효과를 가진 폴리뉴클레오티드의 설계 또한 다양한 출판물들에서 발견할 수 있다(예컨대, 하기 참조: Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997, Martienssen R: Curr. Biol. 6: 810, 1996).

2. 본 발명의 단백질

본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (i) 중 어느 하나에 의해 인코딩되는 단백질을 제공한다. 본 발명의 바람직한 단백질은 서열번호:2 의 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 포함하며, 알콜 아세틸 전이효소 활성을 갖는다.

이러한 단백질에는, 서열번호:2 의 아미노산 서열에서 상기 언급한 수의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 가지며 알콜 아세틸 전이효소 활성을 갖는 것들이 포함된다. 또한, 이러한 단백질에는, 서열번호: 2 의 아미노산 서열에 대해 상기 기재된 바와 같은 상동성을 가지며 알콜 아세틸 전이효소 활성을 갖는 것들이 포함된다.

이러한 단백질은, 예를 들어, 문헌 [MOLECULAR CLONING 제 3 판, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Nuc . Acids . Res ., 10: 6487 (1982), Proc . Natl. Acad . Sci . USA 79: 6409 (1982), Gene 34: 315 (1985), Nuc . Acids . Res ., 13: 4431 (1985), Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82: 488 (1985)] 에 기재된, 위치지정 돌연변이를 이용하여 수득할 수 있다.

본 발명의 단백질의 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가는 상기 동일 아미노산 서열 중 임의의 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 것을 의미한다. 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가 중 2 개 이상의 유형이 동시에 일어날 수도 있다.

이하에, 상호 치환가능한 아미노산 잔기의 예를 열거한다. 동일한 그룹 내의 아미노산 잔기는 상호 치환가능하다. 이하 상기 그룹들을 제시한다.

그룹 A: 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, o-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌; 그룹 B: 아스파르트산, 글루탐산, 이소아스파르트산, 이소글루탐산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산 (2-aminosuberic acid); 그룹 C: 아스파라긴, 글루타민; 그룹 D: 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산; 그룹 E: 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린; 그룹 F: 세린, 트레오닌, 호모세린; 및 그룹 G: 페닐알라닌, 티로신.

본 발명의 단백질은 또한 Fmoc 방법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐 방법) 및 tBoc 방법 (t-부틸옥시카르보닐 방법) 과 같은 화학적 합성 방법으로 제조할 수도 있다. 또한, 예를 들어, Advanced ChemTech, PerkinElmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimazu Corp. 로부터 구매가능한 펩티드 합성기를 또한 화학적 합성에 사용할 수 있다.

3. 본 발명의 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 효모

이어서 본 발명은 상기 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 상기 (a) 내지 (i) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 (j) 내지 (m) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것이 포함된 벡터에 관한 것이다. 일반적으로, 본 발명의 벡터는 하기가 성분으로서 포함된 발현 카세트를 포함한다: (x) 효모 세포에서 전사할 수 있는 프로모터; (y) 상기 프로모터에 센스 또는 안티센스 방향으로 연결된 상기 (a) 내지 (i) 중 임의의 것으로 기재된 폴리뉴클레오티드; 및 (z) 전사 종결 및 RNA 분자의 폴리아데닐화에 관하여 상기 효모에서 기능하는 신호.

본 발명에 따르면, 후술되는 알콜성 음료 (예컨대, 맥주) 의 양조시에 상기 기재된 본 발명의 단백질을 고도로 발현시키기 위해서는, 이들 폴리뉴클레오티드를 상기 프로모터에 대해 센스 방향으로 도입하여 상기 (a) 내지 (i) 중 임의의 것으로 기재된 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 촉진시킨다. 나아가, 후술되는 알콜성 음료 (예컨대, 맥주) 의 양조시에 상기 본 발명의 단백질을 억제하기 위해서는, 이들 폴리뉴클레오티드를 상기 프로모터에 대해 안티센스 방향으로 도입하여 상기 (a) 내지 (i) 중 임의의 것으로 기재된 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제시킨다. 상기 본 발명의 단백질을 억제하기 위해서, 상기 폴리뉴클레오티드를, (j) 내지 (m) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 벡터 내로 도입할 수 있다. 본 발명에 따르면, 표적 유전자 (DNA) 를 파괴하여 상기 기술한 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현 또는 상기 기술한 단백질의 발현을 억제할 수 있다. 표적 유전자 내에서 유전자 산물의 발현에 관련된 영역, 예를 들어, 코딩 영역 또는 프로모터 영역에 또는 이로부터 하나 이상의 염기를 부가 또는 결실시키거나, 또는 이들 영역 전체를 결실시켜 유전자를 파괴시킬 수 있다. 이러한 유전자 파괴는 공지된 출판물들에서 찾아볼 수 있다(예컨대, 하기 참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4951(1979), Methods in Enzymology, 101, 202(1983), 일본 특허 공개공보 제 6-253826 호).

효모에 도입된 벡터는 다중복제(multicopy)형 (YEp 형), 단일복제형 (YCp 형), 또는 염색체 통합형 (YIp 형) 중 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, YEp24 (J. R. Broach 등, EXPERIMENTAL MAMPULATION OF GENE EXPRESSION, Academic Press, New York, 83, 1983) 는 YEp 형 벡터로 알려져 있고, YCp50 (M. D. Rose 등, Gene 60: 237, 1987) 는 YCp 형 벡터로 알려져 있으며, YIp5 (K. Struhl 등, Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 76: 1035, 1979) 는 YIp 형 벡터로 알려져 있고, 이들 모두 용이하게 입수가능하다.

효모에서 유전자 발현을 조정하는 프로모터/종결자는 이들이 양조 효모에서 기능하며, 발효액 중의 구성성분들에 의해 영향을 받지 않는 한 임의의 조합일 수 있다. 예를 들어, 글리세르알데히드류 3-포스페이트 탈수소효소 유전자 (TDH3) 의 프로모터, 또는 3-포스포글리세레이트 키나아제 유전자 (PGK1) 의 프로모터를 사용할 수 있다. 이들 유전자들은, 예를 들어, 문헌 [M. F. Tuite 등, EMBO J., 1, 603 (1982)] 에 상세히 기재된 바와 같이 사전에 클로닝된 것이며, 이들은 공지된 방법으로 용이하게 수득가능하다.

영양요구성 마커는 양조 효모에 대한 형질전환시 선별 마커로 사용될 수 없기 때문에, 예를 들어, 제네티신(geneticin)-저항성 유전자 (G418r), 구리-저항성 유전자 (CUP1) (Marin 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81, 337 1984) 또는 세룰레닌(cerulenin)-저항성 유전자 (fas2m, PDR4) (각각, Junji Inokoshi 등, Biochemistiy, 64, 660, 1992; 및 Hussain 등, Gene, 101 : 149, 1991) 가 사용될 수 있다.

상기 기재된 바와 같이 구축된 벡터를 숙주 효모에 도입한다. 숙주 효모의 예로서는, 양조하는데 사용될 수 있는 임의의 효모, 예를 들어, 맥주, 와인 및 사케 (sake) 용 양조 효모를 들 수 있다. 구체적으로, 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속(屬)과 같은 효모를 사용할 수 있다. 본 발명에 따르면, 라거 양조 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 파스토리아누스 (Saccharomyces pastorianus) W34/70 등, 사카로마이세스 칼스버겐시스 (Saccharomyces carlsbergensis) NCYC453 또는 NCYC456 등, 또는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953 또는 NBRC1954 등을 사용할 수 있다. 또한, 사카로마이세스 세레비지애 NCYC90 와 같은 위스키 효모, 일본양조협회 (Brewing Society of Japan) 로부터의 와인 효모 #1, 3 및 4 와 같은 와인 효모, 및 일본양조협회로부터의 사케 효모 #7 및 9 와 같은 사케 효모를 또한 사용할 수 있으나 이들에 한정되지는 않는다. 본 발명에서는, 사카로마이세스 파스토리아누스와 같은 라거 양조 효모를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

효모 형질전환 방법은 일반적으로 사용되는 공지된 방법일 수 있다. 예를 들어, 사용될 수 있는 방법으로는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 전기천공 방법 (Meth . Enzym ., 194: 182 (1990)), 스페로플라스트 (spheroplast) 방법 (Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 75: 1929(1978)), 리튬 아세테이트 방법 (J. Bacteriology, 153: 163 (1983)), 및 문헌 [Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 75: 1929 (1978), METHODS IN YEAST GENETICS, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual] 에 기재된 방법을 들 수 있다.

더욱 구체적으로, 숙주 효모를 표준 효모 영양 배지 (예컨대, YEPD 배지 (Genetic Engineering. Vol. 1, Plenum Press, New York, 117(1979)) 등) 에서 OD600 nm 가 1 내지 6 이 되도록 배양한다. 상기 배양 효모를 원심분리로 수집하고, 세정한 후, 약 1 내지 2 M 의 농도의 알칼리 금속 이온, 바람직하게는 리튬 이온으로 예비-처리한다. 상기 세포를 약 30℃에서 약 60 분간 방치되도록 한 후, 도입시킬 DNA (약 1 내지 20 ㎍) 와 함께 약 30℃에서 약 60 분간을 더 방치한다. 폴리에틸렌글리콜, 바람직하게는 약 4,000 달톤의 폴리에틸렌글리콜을 최종 농도가 약 20% 내지 50% 가 되도록 첨가한다. 약 30℃에서 약 30 분간 방치한 후, 상기 세포를 약 42℃에서 약 5 분간 가열한다. 바람직하게는, 상기 세포 현탁물을 표준 효모 영양 배지로 세정하고, 소정의 양의 새로운 표준 효모 영양 배지에 첨가한 후, 약 30℃에서 약 60 분간 방치한다. 그 후, 이를 선별 마커로서 항생물질 등이 함유된 표준 한천 배지에 시딩 (seeding) 하여 형질전환체를 수득한다.

다른 일반적인 클로닝 기술은, 예를 들어, 문헌 [MOLECULAR CLONING 제 3 판], 및 문헌 [METHODS IN YEAST GENETICS, A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)] 에서 찾아볼 수 있다.

4. 본 발명에 따른 알콜성 음료의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 알콜성 음료

상기 기재된 본 발명의 벡터를 표적 알콜성 생성물을 양조하기에 적합한 효모 내로 도입한다. 상기 효모는 증가된 에스테르의 함량을 가져 향 및 풍미가 강화된 목적하는 알콜성 음료를 제조하는데 사용될 수 있다. 덧붙여, 후술되는 본 발명의 효모 평가 방법에 의해 선별된 효모를 또한 사용할 수 있다. 표적 알콜성 음료에는, 예를 들어, 이들에 제한되는 것은 아니나 맥주, 유탄산 (sparkling) 알콜 음료 (happoushu) 와 같은 맥주맛 음료, 와인, 위스키, 사케 등이 있다. 나아가, 본 발명에 따르면, 필요할 경우, 에스테르 수준이 감소된 목적하는 알콜성 음료는 상기 표적 유전자의 발현이 억제된 양조 효모를 사용하여 제조가능하다. 다시 말해, 알콜성 음료를 제조하기 위한 발효를 위해 상기 기재된 본 발명의 벡터가 도입된 효모, 상기 기재된 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현이 억제된 효모 또는 후술되는 본 발명의 효모 평가 방법으로 선별된 효모를 사용하여 에스테르의 생성량을 제어시킴 (증가 또는 감소시킴) 으로써 에스테르 수준이 제어 (증가 또는 감소) 된 원하는 종류의 알콜성 음료를 제조할 수 있다.

이들 알콜성 음료를 제조하기 위해서, 본 발명에 따라 수득된 양조 효모를 모 균주 (parent strain) 대신 사용하는 것을 제외하고는 공지의 기술을 사용할 수 있다. 물질, 제조 장비, 제조 관리 등이 종래의 것과 정확히 동일할 수 있으므로, 에스테르의 함량이 제어된 알콜성 음료의 제조 비용을 증가시킬 필요가 없다. 따라서, 본 발명에 따르면, 향 및 풍미가 우수한 알콜성 음료를 기존의 설비를 사용하여 비용 증가 없이 제조할 수 있다.

5. 본 발명의 효모 평가 방법

본 발명은 서열번호:1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 알콜 아세틸 전이효소 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 설계된 프라이머 또는 탐침자를 사용하여 시험 효모의 에스테르-생성 능력을 평가하는 방법에 관한 것이다. 이러한 평가 방법을 위한 일반적인 기술은 공지되어 있으며, 예를 들어, WO01/040514, 일본 공개 특허 공보 제 8-205900 호 등에 기재되어 있다. 상기 평가 방법은 하기 기술된다.

먼저, 시험 효모의 게놈을 준비한다. 상기 준비를 위해, Hereford 방법 또는 아세트산칼륨 방법과 같은 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다(예컨대, METHODS IN YEAST GENETICS, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 130 (1990)). 알콜 아세틸 전이효소 유전자의 뉴클레오티드 서열 (바람직하게는, ORF 서열) 에 기초하여 설계된 프라이머 또는 탐침자를 사용하여, 수득한 시험 효모 게놈에서 상기 유전자 또는 상기 유전자에 특이적인 서열의 존재 여부를 결정한다. 상기 프라이머 또는 탐침자는 공지의 기술에 따라 설계될 수 있다.

상기 유전자 또는 상기 특이적 서열의 검출은 공지의 기술을 이용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 상기 특이적 서열의 일부 또는 전부가 포함된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열이 포함된 폴리뉴클레오티드를 하나의 프라이머로 사용하고, 상기 서열의 상류 또는 하류의 서열의 일부 또는 전부가 포함된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열이 포함된 폴리뉴클레오티드를 또 다른 프라이머로 사용하여 PCR 방법으로 상기 효모의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 산물의 존재 여부 및 상기 증폭된 산물의 분자량을 결정한다. 프라이머에 사용된 폴리뉴클레오티드의 염기의 수는 일반적으로 10 염기쌍 (bp) 이상, 바람직하게는 15 내지 25 bp 이다. 일반적으로, 상기 프라이머들 사이의 염기의 수는 적당하게는 300 내지 2000 bp 이다.

PCR 의 반응 조건으로는 특별한 제한이 없으나, 예를 들어, 변성 온도는 90 내지 95 ℃, 어닐링 (annealing) 온도는 40 내지 60℃, 신장 온도는 60 내지 75℃, 및 사이클 횟수는 10 이상일 수 있다. 결과적으로 생성된 반응 산물은, 예를 들어, 아가로오스 겔을 이용한 전기영동으로 분리하여, 증폭된 산물의 분자량을 측정할 수 있다. 상기 방법은, 증폭된 산물의 분자량이 상기 특정 부분의 DNA 분자를 포함하는 크기인지의 여부로 결정되는 바 효모의 에스테르 생성 능력의 예측 및 평가를 가능하게 한다. 또한, 증폭된 산물의 뉴클레오티드 서열을 분석함으로써, 상기 능력을 더욱 정확히 예측 및/또는 평가할 수 있다.

나아가, 본 발명에서는, 시험 효모를 배양하여 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 알콜 아세틸 전이효소 유전자의 발현 수준을 측정하여 상기 시험 효모의 에스테르-생성 능력을 평가한다. 상기 알콜 아세틸 전이효소 유전자의 발현 수준을 측정함에 있어서, 상기 시험 효모를 배양한 후, 알콜 아세틸 전이효소 유전자로부터 생성된 mRNA 또는 단백질을 정량한다. mRNA 또는 단백질의 정량은 공지의 기술을 이용함으로써 실시될 수 있다. 예를 들어, mRNA 는 노던 (Northern) 혼성화 또는 정량적 RT-PCR 로 정량할 수 있고, 단백질은, 예를 들어, 웨스턴 블랏팅 (Western blotting) 으로 정량할 수 있다(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons 1994-2003).

또한, 시험 효모를 배양하고, 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 갖는, 알콜 아세틸 전이효소 유전자의 발현 수준을 측정하여 표적 에스테르-생성 능력에 따른 유전자 발현 수준을 가진 시험 효모를 선별함으로써, 목적하는 알콜성 음료를 양조하는데 유리한 효모를 선별한다. 또한, 참조 효모 및 시험 효모를 배양하여 각 효모에서의 상기 유전자의 발현 수준을 측정 및 비교하여, 유리한 시험 효모를 선별할 수도 있다. 더욱 구체적으로, 예를 들어, 참조 효모 및 하나 이상의 시험 효모를 배양하고, 각 효모에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 알콜 아세틸 전이효소 유전자의 발현 수준을 측정한다. 참조 효모에서보다 상기 유전자가 더 많이 또는 더 적게 발현되는 시험 효모를 선별함으로써, 알콜성 음료를 양조하는데 적당한 효모를 선별할 수 있다.

다르게는, 시험 효모를 배양하고, 에스테르-생성 능력이 더 높거나 더 낮은, 또는 알콜 아세틸 전이효소 활성이 더 높거나 더 낮은 효모를 선별함으로써, 목적하는 알콜성 음료를 양조하는데 적당한 효모를 선별할 수 있다.

이들 경우에, 시험 효모 또는 참조 효모는, 예를 들어, 본 발명의 벡터가 도입된 효모, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현이 제어된 효모, 인공적으로 변이유발된 효모 또는 자연적으로 변이유발된 효모일 수 있다. 상기 에스테르-생성 능력은, 예를 들어, 문헌 [Method of J. Am. Soc. Brew. Chem. 49:152-157, 1991] 에 기재된 방법에 의해 측정가능하다. 알콜 아세틸 전이효소 활성은, 예를 들어, 문헌 [Appl. Microbiol. Biotechnol. 53: 596-600, 2000] 에 기재된 방법에 의해 측정가능하다. 돌연변이 처리는, 예를 들어, 자외선 조사 및 방사선 조사와 같은 물리적 방법, 및 EMS (에틸메탄 술포네이트) 및 N-메틸-N-니트로소구아니딘과 같은 약품으로의 처리와 관련된 화학적 방법을 비롯한 임의의 방법을 이용할 수 있다(예컨대, 하기 참조: Yasuji Oshima Ed., BIOCHEMISTRY EXPERIMENTS vol. 39, Yeast Molecular Genetic Experiments, pp. 67-75, JSSP).

또한, 참조 효모 또는 시험 효모로 사용된 효모의 예로서는, 양조에 사용될 수 있는 임의의 효모, 예를 들어, 맥주, 와인, 사케 등을 위한 양조 효모를 들 수 있다. 더욱 구체적으로, 사카로마이세스 속과 같은 효모를 사용할 수 있다(예컨대, S. 파스토리아누스, S. 세레비지애 및 S. 칼스버겐시스). 본 발명에 따르면, 라거 양조 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 파스토리아누스 W34/70; 사카로마이세스 칼스버겐시스 NCYC453 또는 NCYC456; 또는 사카로마이세스 세레비지애 NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953 또는 NBRC1954 등을 사용할 수 있다. 또한, 일본양조협회로부터의 와인 효모 #1, 3 및 4 와 같은 와인 효모; 및 일본양조협회로부터의 사케 효모 #7 및 9 와 같은 사케 효모를 또한 사용할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서, 사카로마이세스 파스토리아누스와 같은 라거 양조 효모를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 참조 효모 및 시험 효모는 상기 효모들로부터 임의 조합으로 선택될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 참조하여 더욱 상세히 기술할 것이다. 그러나, 본 발명은 후술되는 실시예에 제한되지 않는다.

실시예 1: 알콜 아세틸 전이효소 유전자 (비(非)ScATF2) 의 클로닝

일본 특허 공개공보 제 2004-283169 호에 기재된 비교 데이터베이스를 이용한 검색의 결과로서 라거 양조 효모로부터 특이적인 신규한 알콜 아세틸 전이효소 유전자 (비(非)ScATF2) (서열번호: 1) 가 발견되었다. 상기 획득한 뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여, 각각 상기 전장 유전자들을 증폭하도록 프라이머들인 비(非)ScATF2_for (서열번호: 3) 및 비(非)ScATF2_rv (서열번호: 4) 를 설계하였다. 게놈 서열분석 균주인 사카로마이세스 파스토리아누스 Weihenstephan 34/70 균주 (또한, "W34/70 균주"로 약기됨) 의 염색체 DNA 를 주형으로 사용하여 PCR 을 수행하여, 비(非)ScATF2 의 전장 유전자를 포함한 DNA 절편 (약 0.7 kb) 을 수득하였다.

이렇게 수득한 비(非)ScATF2 유전자 절편을 TA 클로닝에 의해 pCR2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen) 내로 삽입하였다. 비(非)ScATF2 유전자의 뉴클레오티드 서열들을 Sanger 방법 (F. Sanger, Science, 214: 1215, 1981) 으로 분석하여 뉴클레오티드 서열을 확인하였다.

실시예 2: 맥주 발효 시험 동안의 비(非)ScATF2 유전자의 발현 분석

라거 양조 효모인 사카로마이세스 파스토리아누스 W34/70 균주를 사용하여 맥주 발효 시험을 수행한 후, 발효 동안 효모 세포로부터 추출한 mRNA 를 DNA 마이크로어레이로 분석하였다.

맥아즙 (wort) 추출물 농도 12.69%

맥아즙 함량 70 L

맥아즙에 용해된 산소 농도 8.6 ppm

발효 온도 15 ℃

효모 주입율 (pitching rate) 12.8 x 10⁶ 개 세포/mL

발효주를 시간에 따라 표본추출하고, 효모 성장 양 (도 1) 및 겉보기 추출물 농도 (도 2) 의 시간에 따른 변화를 관찰하였다. 동시에, 효모 세포의 표본추출을 수행하고, 준비된 mRNA 를 비오틴으로 표지하고, 이를 맥주 효모 DNA 마이크로어레이에 혼성화하였다. GCOS; GeneChip Operating Software 1.0 (Affymetrix Co. 제조) 을 사용하여 신호를 검출하였다. 비(非)ScATF2 유전자의 발현 패턴은 도 3 에 나타나 있다. 그 결과, 일반적인 맥주 발효에서 비(非)ScATF2 유전자가 발현된다는 것이 확인되었다.

실시예 3: 비(非)ScATF2 유전자 고도 발현 균주의 구축

실시예 1 에 기재된 비(非)ScATF2/pCR2.1-TOPO 를 제한효소들인 SacI 및 NotI 으로 절단하여, 그의 단백질-인코딩 영역의 전체 길이가 포함된 DNA 절편을 제조하였다. 상기 절편을 제한효소들인 SacI 및 NotI 으로 처리된 pYCGPYNot 에 결찰하여, 비(非)ScATF2 고도 발현 벡터 비(非)ScATF2/pYCGPYNot 를 구축하였 다. pYCGPYNot 는 YCp-형 효모 발현 벡터이다. 삽입된 유전자는 피루베이트 키나아제 유전자 PYK1 프로모터에 의해 고도 발현된다. 상기 효모에는 제네티신-저항성 유전자 G418^r 이 선별 마커로 포함되고, 대장균 (Escherichia coli) 에는 선별 마커로서 암피실린-저항성 유전자 Amp^r 가 포함된다.

상기 방법으로 제조된 고도 발현 벡터를 사용하여, 상기 균주 사카로마이세스 파스토리아누스 Weihenstephaner 34/70 을 일본 특허 공개공보 제 H07-303475 호에 기재된 방법으로 형질전환시켰다. 형질전환체를 제네티신 300 mg/L 이 함유된 YPD 플레이트 배지 (1% 효모 추출물, 2% 폴리펩톤, 2% 포도당 및 2% 한천) 에서 선별하였다.

균주 W34/70-2

e 는 양조 효모에 특유한 알콜 아세틸 전이효소인 비(非)-ScEht1p 를 인코딩하는 유전자 비(非)-ScEHT1 이 파괴된 사카로마이세스 파스토리아누스 Weihenstephaner W34/70 의 포자 클론인 균주 W34/70-2 임을 유의하여야 한다. 상기 비(非)ScEHT1 유전자의 파괴는 문헌에 기재된 방법에 따라 수행되었다(Goldstein 등, Yeast, 15, 1541 (1999)). 유전자 파괴용 절편은 약물 저항성 마커 (pFA6a(G418r), pAG25(nat1), pAG32(hph)) 가 포함된 플라스미드를 주형으로 사용하는 PCR 로 제조되었다. 비(非)ScEHT1_delta_for (서열번호. 7) 및 비(非)ScETH1_delta_rv (서열번호. 8) 로 이루어진 프라이머들이 상기 PCR 프라이머들에 사용되었다. 양조 효모 사카로마이세스 파스토리아누스 균주 W34/70 으로부터 분리한 포자 클론 (W34/70-2) 을 상기 기재한 바와 같이 제조된 유전자 파 괴용 절편들로 형질전환하였다. 형질전환은 일본 특허 공개공보 제 H07-303475 호에 기재된 방법에 따라 수행하였고, 형질전환체는 제네티신 300 mg/L, 노르세오트리신 50 mg/L 또는 하이그로마이신 B 200 mg/L 이 함유된 YPD 플레이트 배지 (1% 효모 추출물, 2% 폴리펩톤, 2% 포도당, 2% 한천) 상에서 선별하였다.

실시예 4: 맥주 시험 양조에서 생성된 에스테르의 양 분석

모 균주 및 실시예 3 에서 수득한 비(非)ScATF2 고도 발현 균주를 사용하여 하기 조건 하에서 발효 시험을 수행하였다.

맥아즙 추출물 농도: 12 %

맥아즙 부피: 1 L

맥아즙에 용해된 산소 농도: 9.5 ppm

발효 온도: 15 ℃

효모 주입율: 5 g/L

효모 성장 (OD660) (도 4) 및 추출물 소비량 (도 5) 에 있어서의 시간-기반 변화를 조사하기 위해서 상기 발효액을 시간에 따라 표본추출하였다. 헤드 스페이스 기체 크로마토그래피를 이용하여 발효 완료시의 고급 알콜 및 추출물 농도의 정량을 수행하였다(J. Am. Soc. Brew. Chem. 49:152-157, 1991).

표 1 에 따르면, 발효 완료시에 형성된 에틸 아세테이트의 양은 모 균주에서는 33.0 ppm 인데 반해, 비(非)ScATF2 고도 발현 균주에서는 37.0 ppm 이었다. 형성된 이소아밀 알콜의 양은 모 균주에서 2.9 ppm 인데 반해, 비(非)ScATF2 고도 발현 균주에서는 3.8 ppm 이었다. 상기 결과에 기초하면, 비(非)ScATF2 고도 발현 균주에 의해 형성된 에틸 아세테이트 및 이소아밀 알콜의 양은 12 내지 31% 증가한 것으로 명백히 나타났다.

	모 균주	비(非)ScATF2 고도 발현 균주
에틸 아세테이트	33.0	37.0	(112%)
이소아밀 알콜	2.9	3.8	(131%)
단위: ppm 괄호 안의 값은 모 균주에 대한 상대적 값을 나타냄.

실시예 5: 비(非)ScATF2 유전자의 파괴

문헌에 기재된 방법에 따라 약물 저항성 마커 (pFA6a(G418r), pAG25(nat1), pAG32(hph)) 가 포함된 플라스미드를 주형으로 사용하는 PCR 을 이용하여 유전자 파괴용 절편들을 제조하였다(Goldstein 등, Yeast, 15, 1541 (1999)). 비(非)ScATF2_delta_for (서열번호. 5) 및 비(非)ScATF2_delta_rv (서열번호. 6) 로 이루어진 프라이머들을 상기 PCR 프라이머들로 사용하였다.

양조 효모 사카로마이세스 파스토리아누스 균주 W34/70 또는 양조 효모 사카로마이세스 파스토리아누스 균주 W34/70 으로부터 분리한 포자 클론 (W34/70-2) 을 상기 기재한 바와 같이 제조된 유전자 파괴용 절편들로 형질전환하였다. 형질전환은 일본 특허 공개공보 제 H07-303475 호에 기재된 방법에 따라 수행하였고, 형질전환체는 제네티신 300 mg/L, 노르세오트리신 50 mg/L 또는 하이그로마이신 B 200 mg/L 이 함유된 YPD 플레이트 배지 (1% 효모 추출물, 2% 폴리펩톤, 2% 포도당, 2% 한천) 상에서 선별하였다.

실시예 6: 맥주 시험 양조에서 형성된 에스테르의 양 분석

모 균주 및 실시예 5 에서 수득한 비(非)ScATF2 파괴 균주를 사용하여 하기 조건 하에서 발효 시험을 수행하였다.

맥아즙 추출물 농도: 12 %

맥아즙 부피: 1 L

맥아즙에 용해된 산소 농도: 10 ppm

발효 온도: 15 ℃

효모 주입율: 5 g/L

효모 성장 (OD660) 및 추출물 소비량에 있어서의 시간-기반 변화를 조사하기 위해서 상기 발효액을 시간에 따라 표본추출하였다. 헤드 스페이스 기체 크로마토그래피를 이용하여 문헌 [J. Am. Soc. Brew. Chem. 49:152-157, 1991] 에 기재된 방법에 따라 발효 완료시의 에스테르 농도의 정량을 수행하였다.

본 발명의 알콜성 음료 제조 방법에 따르면, 생성물에 화려한 향을 부여하는 에스테르의 함량을 증가시킴으로써 향 및 풍미가 우수한 알콜성 음료의 제조가 가능하다. 또한, 지나치게 높은 에스테르 함량이 바람직하지 않은 맥주와 같은 맥아 음료의 경우, 그에 함유된 에스테르의 양을 감소시킴으로써 보다 바람직한 향 및 풍미를 가진 알콜성 음료의 제조가 가능하다. 본 출원은 일본 특허 출원 제 2005-266068 호 (2005 년 9 월 13 일 제출) 및 제 2006-200892 호 (2006 년 7 월 24 일 제출) 에 대해 우선권을 주장하며, 이들은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조 병합된다. 상기 인용된 기타 모든 참조문헌들 또한 그들의 전문이 모 든 목적을 위해 본원에 병합된다.

<110> Suntory Limited <120> Alcohol acetyl transferase gene and use thereof <130> PCT06-0082 <150> JP2005-266068 <151> 2005-09-13 <150> JP2006-200892 <151> 2006-07-24 <160> 8 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1638 <212> DNA <213> Saccharomyces sp. <400> 1 atggatagtt tagaggaata cgaaccgcac gttacgcaag agctgatcga tcgtggccat 60 gcaaggcgca tgggccattt ggaaaactat tttgctgttt tgcgtaggca aaacatgtat 120 tcgaatttcg ctgtttatgg ggaactgaat aaggccgtta gcaagagaca actgagactt 180 gccttgaggt tattgcttct aaagtatcca attctttcgc atacaattgt tcccaaaaaa 240 taccctaacc acgaagcgta ttatctcagt caggaatatc tgaataagcc gtttcctcag 300 catgatttta tcaaggttat acctcaccta gaactggagg atttaatcat gaacagtcaa 360 tcagaataca gggaagtcat cggcaaaatt tcggaacaat ataagaatga taattttaaa 420 gtcacgagta gcttaatcga attagtcgct cctataatcg taccggcatg tgacccggaa 480 aggcccaatt ggaggcttat ttgtttacct agtagggata ctagcgcggg cgaggcgtgg 540 accaacttcg tttatgtcag taaccattgc ggctccgatg gtattagtgg aacgaatttt 600 tttcaggatt tgactgcttt actctctacg 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gctccacaaa cgttggtggt 1500 atgaacatgg acatgagcgt agttcagggc actctacgga atcggggcga atgggagtcg 1560 ttctgcgacg ttttctacca cgccatcggc gaatttgcgt cgcttggatg cgatactgcc 1620 gtcgcgggtc tcgtatag 1638 <210> 2 <211> 545 <212> PRT <213> Saccharomyces sp. <400> 2 Met Asp Ser Leu Glu Glu Tyr Glu Pro His Val Thr Gln Glu Leu Ile 1 5 10 15 Asp Arg Gly His Ala Arg Arg Met Gly His Leu Glu Asn Tyr Phe Ala 20 25 30 Val Leu Arg Arg Gln Asn Met Tyr Ser Asn Phe Ala Val Tyr Gly Glu 35 40 45 Leu Asn Lys Ala Val Ser Lys Arg Gln Leu Arg Leu Ala Leu Arg Leu 50 55 60 Leu Leu Leu Lys Tyr Pro Ile Leu Ser His Thr Ile Val Pro Lys Lys 65 70 75 80 Tyr Pro Asn His Glu Ala Tyr Tyr Leu Ser Gln Glu Tyr Leu Asn Lys 85 90 95 Pro Phe Pro Gln His Asp Phe Ile Lys Val Ile Pro His Leu Glu Leu 100 105 110 Glu Asp Leu Ile Met Asn Ser Gln Ser Glu Tyr Arg Glu Val Ile Gly 115 120 125 Lys Ile Ser Glu Gln Tyr Lys Asn Asp Asn Phe Lys Val Thr Ser Ser 130 135 140 Leu Ile Glu Leu Val Ala Pro Ile Ile Val Pro Ala Cys Asp Pro Glu 145 150 155 160 Arg Pro Asn Trp Arg Leu Ile Cys Leu Pro Ser Arg Asp Thr Ser Ala 165 170 175 Gly Glu Ala Trp Thr Asn Phe Val Tyr Val Ser Asn His Cys Gly Ser 180 185 190 Asp Gly Ile Ser Gly Thr Asn Phe Phe Gln Asp Leu Thr Ala Leu Leu 195 200 205 Ser Thr Ile Glu Glu Asn Gly Phe Asp Tyr Glu Glu Glu Ile Val Asp 210 215 220 Asn Asn Val Ile Ile Asp Tyr Asn Glu Asp His Lys Glu Ile Ser Lys 225 230 235 240 Leu Pro Ile Ser Ile Thr Asp Arg Ile Asp Tyr Lys Pro Arg Leu Thr 245 250 255 Ser Leu Pro Lys Phe Phe Leu Lys Asn Ile Val Ser Glu Tyr Cys Glu 260 265 270 Phe Arg Thr Ser Asn Glu Ser Thr Val Thr Ser Arg Tyr Ser Pro Ser 275 280 285 Ser Asn Ala Asn Ala Gly Phe Asn His Leu Leu His Phe Ser Ala Glu 290 295 300 Asp Thr Gln Gln Ile Arg Ser Glu Ile Lys Lys Lys Val His Ala Gly 305 310 315 320 Cys Thr Ile Thr Pro Phe Ile Gln Ala Cys Phe Phe Val Ala Leu Tyr 325 330 335 Arg His Asp Lys Val Phe Thr Lys Ser Phe Leu Glu Tyr Gly Phe Asp 340 345 350 Val Ala Leu Pro Ser Ser Thr Arg Arg Phe Leu Pro Asn Asp Glu Glu 355 360 365 Leu Arg Asp Ser Tyr Lys Tyr Gly Ala Asn Val Gly Gly Ser His Tyr 370 375 380 Thr Tyr Leu Ile Ser Ser Phe Asn Val Pro Glu Gly Asp Ala Asn Lys 385 390 395 400 Phe Trp Arg Leu Val Glu Tyr Tyr His Asp Cys Phe Leu Lys Ser Tyr 405 410 415 Asp Asn Gly Asp His Leu Ile Gly Leu Gly Thr Leu Gln Leu Asp Phe 420 425 430 Ile Val Gln Asn Lys Asn Val Asp Gln Ile Ile Ser Thr Thr Tyr Leu 435 440 445 Asp His Gln Arg Gly Gly Ala Ile Ile Ser Asn Thr Gly Phe Val Arg 450 455 460 Gln Asp Thr Thr Lys Pro Tyr Tyr Ala Arg Asp Leu Ile Phe Ser Gln 465 470 475 480 Ser Ala Gly Ala Leu Arg Phe Ala Phe Gly Leu Asn Val Cys Ser Thr 485 490 495 Asn Val Gly Gly Met Asn Met Asp Met Ser Val Val Gln Gly Thr Leu 500 505 510 Arg Asn Arg Gly Glu Trp Glu Ser Phe Cys Asp Val Phe Tyr His Ala 515 520 525 Ile Gly Glu Phe Ala Ser Leu Gly Cys Asp Thr Ala Val Ala Gly Leu 530 535 540 Val 545 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nonScATF2_for <400> 3 gagctcatag cggccatgga tagtttagag gaatacgaac 40 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nonScATF2_rv <400> 4 ggatcctatg cggccgcacc gaccgagagc agccacggca tg 42 <210> 5 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nonScATF2_delta_for <400> 5 ttaagatcta caaacgaaca ataggatcaa gaacagaaaa ctgcagtgaa ccttgacagt 60 cttgacgtgc 70 <210> 6 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nonScATF2_delta_rv <400> 6 tatcagctct gtccgatata ccgcctattt gctgtacgag cccgtccgag cgcacttaac 60 ttcgcatctg 70 <210> 7 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nonScEHT1_delta_for <400> 7 ggccggggaa gtaatagtcc cttcgaagat tttccttact atttaacagt ccttgacagt 60 cttgacgtgc 70 <210> 8 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nonScEHT1_delta _rv <400> 8 cttctgttgt atacatacat aagaatggct aggaaaagaa ccatataaca cgcacttaac 60 ttcgcatctg 70

Claims

하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(a) 서열번호:1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(b) 서열번호:2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(c) 알콜 아세틸 전이효소 활성을 가지며 서열번호:2 의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(d) 알콜 아세틸 전이효소 활성을 가지며 서열번호:2 의 아미노산 서열과의 일치성이 60% 이상인 아미노산 서열을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(e) 엄격한 조건하에서 서열번호:1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며, 알콜 아세틸 전이효소 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및

(f) 엄격한 조건하에서 서열번호:2 의 아미노산 서열의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 알콜 아세틸 전이효소 활성을 갖는 단백질을 인코 딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(g) 서열번호: 2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하거나, 또는 서열번호: 2 의 아미노산 서열 중 1 내지 10 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 인코딩하고, 이때 상기 단백질은 알콜 아세틸 전이효소 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(h) 서열번호: 2 의 아미노산 서열과의 일치성이 90% 이상이며 알콜 아세틸 전이효소 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및

(i) 서열번호: 1 에 혼성화하거나 또는 고도로 엄격한 조건하에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화하며, 알콜 아세틸 전이효소 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, 서열번호: 2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 인 폴리뉴클레오티드.
하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(j) 제 5 항에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(k) RNAi 효과를 통해 제 5 항에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(l) 제 5 항에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물을 특이적으로 절단하는 활성을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

(m) 공동-억제 효과를 통해 제 5 항에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드로 인코딩되는 단백질.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터.
제 6 항의 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터.
제 8 항 또는 제 9 항의 벡터를 포함한 효모.
제 10 항에 있어서, 제 8 항의 벡터를 도입함에 의해 에스테르-생성 능력이 증가되는 효모.
제 9 항의 벡터를 도입함에 의해, 또는 제 5 항의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 와 관련된 유전자를 파괴함에 의해 제 5 항의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현이 억제되는 효모.
제 11 항에 있어서, 제 7 항의 단백질의 발현 수준을 증가시킴에 의해 에스테르-생성 능력이 증가되는 효모.
제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 효모를 사용함에 의한 알콜성 음료의 제조 방법.
제 14 항에 있어서, 양조된 알콜성 음료가 맥아 음료인 알콜성 음료의 제조 방법.
제 14 항에 있어서, 양조된 알콜성 음료가 와인인 알콜성 음료의 제조 방법.
제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되는 알콜성 음료.
서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 알콜 아세틸 전이효소 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 고안된 프라이머 또는 탐침자 (probe) 를 사용하는 것을 포함하는, 시험 효모의 에스테르-생성 능력을 평가하는 방법.
하기를 포함하는 시험 효모의 에스테르-생성 능력을 평가하는 방법: 시험 효모를 배양함; 및 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 알콜 아세틸 전이효소 유전자의 발현 수준을 측정함.
하기를 포함하는, 효모의 선별 방법: 시험 효모를 배양함; 제 7 항에 따른 단백질을 정량하거나 또는 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 알콜 아세틸 전이효소 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 표적 에스테르-생성 능력에 따른 상기 단백질의 양 또는 상기 유전자 발현 수준을 갖는 시험 효모를 선별함.
제 20 항에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 알콜 아세틸 전이효소 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 상기 참조 효모에서보다 상기 유전자가 더 높거나 또는 더 낮게 발현되는 시험 효모를 선별함.
제 20 항에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 제 7 항에 따른 단백질을 정량함; 및 상기 참조 효모에서보다 단백질의 양이 더 많거나 더 적은 시험 효모를 선별함.
하기를 포함하는 알콜성 음료의 제조 방법: 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 효모 또는 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 선별된 효모를 사용하여 알콜성 음료의 제조를 위한 발효를 수행함; 및 에스테르의 생성량을 조절함.