KR20080049033A

KR20080049033A - 글리세롤 채널 유전자 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20080049033A
Application number: KR1020087005791A
Authority: KR
Inventors: 요시히로 나카오; 유키코 고다마; 도모코 시모나가
Original assignee: 산또리 가부시키가이샤
Priority date: 2005-09-01
Filing date: 2006-08-31
Publication date: 2008-06-03
Also published as: CA2620117A1; US20090269437A1; WO2007026957A2; JP2009506751A; EP1919936A2; WO2007026957A3; AU2006285605A1

Abstract

본 발명은 글리세롤 채널 유전자 및 그의 용도, 구체적으로 바디와 감칠맛이 우수한 알콜성 음료를 제조하는 양조 효모, 상기 효모를 사용하여 제조한 알콜성 음료, 상기 알콜성 음료의 제조 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 제품의 바디와 감칠맛에 기여하는 글리세롤을 생산하는 능력이 양조 효모 글리세롤 채널 Fps1p 를 인코딩하는 FPS1 유전자, 특히 라거 양조 효모에 특이적인 비(非)-ScFPS1 유전자의 발현 수준을 제어함에 의해 제어된 효모, 및 상기 효모를 이용한 알콜성 음료의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

글리세롤 채널 유전자 및 그의 용도 {GLYCEROL CHANNEL GENE AND USE THEREOF}

본 발명은, 글리세롤 채널 유전자 및 그 유전자의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 바디 (body) 와 감칠맛 (mellowness) 이 우수한 알콜성 음료를 제조하는 양조 효모, 상기와 같은 효모를 사용하여 제조한 알콜성 음료, 및 이러한 알콜성 음료의 제조 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 양조 효모 내의 글리세롤 채널 Fps1p 를 코딩하는 FPS1 유전자, 맥주 효모에 특징적인 비(非)-ScFPS1 유전자의 발현 수준을 제어함으로써 제품의 바디와 감칠맛을 제어할 수 있게 하는 효모 및 상기와 같은 효모를 이용한 알콜성 음료의 제조 방법에 관한 것이다.

바디와 감칠맛뿐 아니라 감미로움에 기여하는 것으로 언급되는 글리세롤은 중요한 맛 성분 중의 하나이다.

알콜성 음료의 글리세롤 수준을 상승시키기 위해 글리세롤 고-생산 효모를 개발해왔다. 효모를 돌연변이화시켜 글리세롤 고-생산 효소를 효율적으로 단리시키기 위한, 알릴 알콜 또는 피라졸에 대한 내성 특성을 지표로서 이용하는 방법 (일본 심사 특허 출원 (Kokoku) 제 H7-89901 호), 글리세롤 모노클로로히드린에 대 한 내성 특성을 지표로서 이용하는 방법 (일본 공개 특허 출원 제 H10-210968 호), 및 염에 대한 내성 특성을 지표로서 이용하는 방법 (일본 공개 특허 출원 제 H7-115956 호), 아미노산 유사체에 대한 내성 특성을 지표로서 이용하는 방법 (J. Ferment. Bioeng., 80, 218-222 (1995) 이 보고되어 있다.

한편, 맥주 효모 또는 와인 효모에서 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나아제 GPD1 을 고 발현시키는 방법이 유전자 조작 기술을 통한 효모 개발을 이용한 방법으로서 보고되어 있다 (FEMS Yeast Res. 2: 225-232 (2002), Appl. Environ. Microbiol. 65: 143-149 (1999)).

발명의 개시

상기에서 나타낸 바와 같이, 최종 생산물에서 글리세롤 수준을 증가시키기 위해서, 변이주를 개발하여 왔다. 그러나, 그 결과로서 예상하지 못한 발효 지연 및 바람직하지 못한 향미 성분의 증가가 일부 경우에서 관찰되었었고, 그리하여 이러한 효모를 실용적으로 이용하는 데에는 문제가 있었다. 이에 따라, 발효 속도 또는 제품의 품질 둘 중 하나를 양보하지 않으면서 충분한 양의 글리세롤을 생산할 수 있는 효모의 개발 방법이 요구되었다.

본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위해 예의 연구를 거듭하였고, 그 결과 라거 (lager) 양조 효모로부터 기존의 단백질보다 유리한 효과를 가진 글리세롤 채널을 인코딩하는 유전자를 식별 및 단리하는 것에 성공했다. 게다가, 수득한 유전자를 효모에 전입시켜 발현시킨 형질전환된 효모를 제조해 글리세롤 생산량이 증가하는 것을 확인하여 본 발명을 완성했다.

따라서, 본 발명은 라거 양조 효모에 특징적으로 존재하는 신규 글리세롤 채널 유전자, 그 유전자에 의해 인코딩된 단백질, 그 유전자의 발현이 제어되는 형질전환된 효모, 그 유전자의 발현이 제어되는 효모를 사용하는 것에 의하는 제품 내 글리세롤 양을 제어하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 하기 폴리뉴클레오티드, 그 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터, 그 벡터가 도입된 형질전환된 효모, 그 형질전환된 효모를 이용함으로 인한 알콜성 음료의 제조 방법 등을 제공한다.

(1) 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(a) 서열번호:1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(b) 서열번호:2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(c) 글리세롤 채널 활성을 가지며 서열번호:2 의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(d) 글리세롤 채널 활성을 가지며 서열번호:2 의 아미노산 서열과의 일치성이 60% 이상인 아미노산 서열을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(e) 엄격한 조건하에서 서열번호:1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화 (hybridization) 하며, 글리세롤 채널 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및

(f) 엄격한 조건하에서 서열번호:2 의 아미노산 서열의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 글리세롤 채널 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.

(2) 상기 (1) 에 있어서, 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(g) 서열번호: 2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하거나, 또는 서열번호: 2 의 아미노산 서열 중 1 내지 10 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 인코딩하고, 이때 상기 단백질은 글리세롤 채널 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드;

(h) 글리세롤 채널 활성을 가지며 서열번호: 2 의 아미노산 서열과의 일치성이 90% 이상인 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

(i) 서열번호: 1 에 혼성화하거나 또는 고도로 엄격한 조건하에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화하며, 글리세롤 채널 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.

(3) 상기 (1) 에 있어서, 서열번호: 1 로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.

(4) 상기 (1) 에 있어서, 서열번호: 2 로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.

(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, DNA 인 폴리뉴클레오티드.

(6) 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(j) 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(k) RNAi 효과를 통해 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(l) 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물을 특이적으로 절단하는 활성을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

(m) 공동-억제 효과를 통해 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.

(7) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드로 인코딩되는 단백질.

(8) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터.

(8a) 상기 (8) 에 있어서, 하기 구성요소들이 포함된 발현 카세트를 포함한 벡터:

(x) 효모 세포에서 전사될 수 있는 프로모터;

(y) 상기 프로모터에 센스 방향으로 연결된 상기 (1) 내지 (5) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나; 및

(z) 전사 종결 및 RNA 분자의 폴리아데닐화에 대하여 효모에서 기능할 수 있는 신호.

(9) 상기 (6) 의 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터.

(10) 상기 (8) 또는 (9) 의 벡터가 도입된 효모.

(11) 상기 (10) 에 있어서, 글리세롤-생성 능력이 증가되는 효모.

(12) 상기 (9) 의 벡터를 도입함에 의해, 또는 상기 (5) 의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 와 관련된 유전자를 파괴함에 의해 상기 (5) 의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현이 억제되는 효모.

(13) 상기 (10) 에 있어서, 상기 (7) 의 단백질의 발현 수준을 증가시킴에 의해 글리세롤-생성 능력이 증가되는 효모.

(14) 상기 (10) 내지 (13) 중 어느 하나의 효모를 사용함에 의한 알콜성 음료의 제조 방법.

(15) 상기 (14) 에 있어서, 양조된 알콜성 음료가 맥아 음료인 알콜성 음료의 제조 방법.

(16) 상기 (14) 에 있어서, 양조된 알콜성 음료가 와인인 알콜성 음료의 제조 방법.

(17) 상기 (14) 내지 (16) 중 어느 하나의 방법으로 제조되는 알콜성 음료.

(18) 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 글리세롤 채널 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 고안된 프라이머 또는 탐침자 (probe) 를 사용하는 것을 포함하는, 시험 효모의 글리세롤-생성 능력을 평가하는 방법.

(18a) 상기 (18) 의 방법을 사용함으로써 고 또는 저 글리세롤-생성 능력을 가진 효모를 선별하는 방법.

(18b) 상기 (18a) 의 방법으로 선별된 효모를 사용함에 의한 알콜성 음료 (예를 들어, 맥주) 의 제조 방법.

(19) 하기를 포함하는 시험 효모의 글리세롤-생성 능력을 평가하는 방법: 시험 효모를 배양함; 및 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 글리세롤 채널 유전자의 발현 수준을 측정함.

(20) 하기를 포함하는, 효모의 선별 방법: 시험 효모를 배양함; 상기 (7) 의 단백질을 정량하거나 또는 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 글리세롤 채널 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 표적 글리세롤-생성 능력에 따른 상기 단백질의 양 또는 상기 유전자 발현 수준을 갖는 시험 효모를 선별함.

(20a) 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 시험 효모를 배양함; 글리세롤-생성 능력 또는 글리세롤 채널 활성을 측정함; 및 표적 글리세롤 생성 능력 또는 표적 글리세롤 채널 활성을 갖는 시험 효모를 선별함.

(21) 상기 (20) 에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 글리세롤 채널 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 상기 참조 효모에서보다 상기 유전자가 더 높거나 또는 더 낮게 발현되는 시험 효모를 선별함.

(22) 상기 (20) 에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 상기 (7) 의 단백질을 정량함; 및 참조 효모에서보다 상기 단백질의 양이 더 많거나 더 적은 시험 효모를 선별함. 즉, 상기 (20) 에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 복수의 효모를 배양함; 각 효모에서 상기 (7) 의 단백질을 정량함; 및 이들 중 상기 단백질의 양이 많거나 또는 적은 시험 효모를 선별함.

(23) 하기를 포함하는 알콜성 음료의 제조 방법: 상기 (10) 내지 (13) 중 어느 하나에 따른 효모 또는 상기 (20) 내지 (22) 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 선별된 효모를 사용하여 알콜성 음료의 제조를 위한 발효를 수행함; 및 글리세롤의 생성량을 조절함.

도면의 간단한 설명

도 1 은 맥주 발효 시험시의 시간에 따른 세포 성장을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.

도 2 는 맥주 발효 시험시의 시간에 따른 추출물 (당) 소비량을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 겉보기 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.

도 3 은 맥주 발효 시험시의 효모 내의 비(非)-ScFPS1 유전자의 발현 프로파일을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 검출된 신호의 강도를 나타낸다.

도 4 는 발효 시험시의 시간에 따른 세포 성장을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.

도 5 는 맥주 발효 시험시의 시간에 따른 추출물 (당) 소비량을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며, 세로축은 겉보기 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.

도 6 은 맥주 발효 시험시의 시간에 따른 글리세롤 생성을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내며 세로축은 글리세롤 수준 (g/L) 을 나타낸다.

본 발명을 실시하기 위한 최선의 양태

본 발명자들은 효모의 글리세롤 채널 활성을 증가 또는 감소시킴으로써 생성물에서의 글리세롤을 제어하는 것이 가능하다는 생각을 품었다. 본 발명자들은 상기 개념에 기초하여 연구하였고, 그 결과, 일본 특허 출원 공개 제 2004-283169 호에 개시된 방법에 따라 맵핑된 라거 양조 효모 게놈 정보에 기초한 라거 양조 효모에 유일한 글리세롤 채널을 인코딩하는 비(非)-ScFPS1 유전자를 단리 및 식별하였다. 상기 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 1 로 표시된다. 나아가, 상기 유전자로 인코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 2 로 표시된다.

1. 본 발명의 폴리뉴클레오티드

먼저, 본 발명은 (a) 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 서열번호:2 의 아미노산 서열의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 일 수 있다.

본 발명의 표적 폴리뉴클레오티드는 상기 기술한 라거 양조 효모에서 유래한 글리세롤 채널 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 한정되지 않으며, 상기 단백질에 대한 등가의 기능을 갖는 단백질들을 인코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드들도 이에 포함될 수 있다. 등가의 기능을 가진 단백질로서는, 예를 들어, (c) 글리세롤 채널 활성을 가지며 서열번호: 2 의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 가진 단백질이 있다.

이러한 단백질에는, 글리세롤 채널 활성을 가지며 서열번호: 2 의 아미노산 서열에서, 예를 들어, 1 내지 100, 1 내지 90, 1 내지 80, 1 내지 70, 1 내지 60, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 39, 1 내지 38, 1 내지 37, 1 내지 36, 1 내지 35, 1 내지 34, 1 내지 33, 1 내지 32, 1 내지 31, 1 내지 30, 1 내지 29, 1 내지 28, 1 내지 27, 1 내지 26, 1 내지 25, 1 내지 24, 1 내지 23, 1 내지 22, 1 내지 21, 1 내지 20, 1 내지 19, 1 내지 18, 1 내지 17, 1 내지 16, 1 내지 15, 1 내지 14, 1 내지 13, 1 내지 12, 1 내지 11, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6 (1 내지 수 개의 아미노산), 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1 개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열로 이루어진 단백질이 포함된다. 일반적으로, 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가의 수는 더 적은 것이 바람직하다. 또한, 이러한 단백질에는, (d) 글리세롤 채널 활성을 가지며 서열번호: 2 의 아미노산 서열과의 일치성이 약 60% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상인 아미노산 서열을 가진 단백질이 포함된다. 일반적으로, 백분율 동일성이 더 높은 것이 바람직하다.

글리세롤 채널 활성은, 예를 들어 문헌 [Eur. J. Biochem. 271:771-779, 2004] 에 기재된 방법으로 측정가능하다.

나아가, 본 발명은 또한 (e) 엄격한 조건하에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 글리세롤 채널 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및 (f) 엄격한 조건하에서 서열번호: 2 의 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 글리세롤 채널 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드를 염두에 둔다.

여기서, "엄격한 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드"란 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 탐침자로서 사용하여 콜로니 혼성화 기술, 플라크 혼성화 기술, 서던 (southern) 혼성화 기술 등에 의해 수득된, DNA 등의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 상기 혼성화 방법은, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning 제 3 판, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997] 등에 기재된 방법일 수 있다.

본원에 사용된 "엄격한 조건"이라는 용어는 낮은 엄격성 조건, 중간 엄격성 조건 또는 높은 엄격성 조건 중 임의일 수 있다. "낮은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 32℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "중간 엄격성 조건"은, 예를 들어, 42℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "높은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 50℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. 이들 조건하에서, 상동성이 더 높은, DNA 등의 폴리뉴클레오티드는 더욱 높은 온도에서 효율적으로 수득될 것으로 예상되지만, 혼성화 엄격성에는 온도, 탐침자 농도, 탐침자 길이, 이온 세기, 시간, 염 농도 및 기타를 비롯하여 복수의 요인들이 연루되므로, 당업자는 유사한 엄격성을 구현하기 위해 이들 요인들을 적절히 선택할 수 있다.

혼성화를 위해 시판중인 키트를 사용하는 경우에는, 예를 들어, Alkphos Direct Labeling Reagents (Amersham Pharmacia) 를 사용할 수 있다. 이 경우, 첨부된 프로토콜에 따라, 표지된 탐침자와 함께 하룻밤 인큐베이션한 후, 막을 0.1% (w/v) SDS 가 함유된 55℃ 의 1차 세정 완충액으로 세정하여, 혼성화된, DNA 등의 폴리뉴클레오티드를 검출한다.

혼성화될 수 있는 기타 폴리뉴클레오티드에는, 기본 매개변수 (default parameter) 를 사용하여 FASTA 및 BLAST 와 같은 상동성 검색 소프트웨어로 산출한 바, 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 일치성이 약 60% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상인 폴리뉴클레오티드가 포함된다.

아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열들 간의 일치성은 Karlin 및 Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST 를 사용하여 결정할 수 있다 (Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 87: 2264-2268, 1990; Proc . Natl Acad . Sci . USA, 90: 5873, 1993). BLAST 알고리즘에 기초한 BLASTN 및 BLASTX 로 불리는 프로그램들이 개발되었다 (Altschul SF 등, J. Mol . Biol . 215: 403, 1990). 뉴클레오티드 서열을 BLASTN 을 사용하여 서열분석하는 경우, 매개변수들은, 예를 들어, 스코어 = 100 및 단어 길이 = 12 이다. 아미노산 서열을 BLASTX 로 서열분석하는 경우, 매개변수들은, 예를 들어, 스코어 = 50 및 단어 길이 = 3 이다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램에 대한 기본 매개변수가 이용된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드에는, (j) 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; (k) RNAi 효과를 통해 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; (l) 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물을 특이적으로 절단하는 활성을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (m) 공동-억제 효과를 통해 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 이들 폴리뉴클레오티드는 벡터 내로 혼입될 수 있는데, 상기 벡터는 상기 (a) 내지 (i) 의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 형질전환을 위해 세포 내로 도입될 수 있다. 따라서, 상기 DNA 의 발현을 억제시키는 것이 바람직한 경우 이들 폴리뉴클레오티드를 적절히 사용할 수 있다.

본원에 사용된 "DNA 의 전사물에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 구절은 소위 안티센스 DNA 를 지칭한다. 안티센스 기술은 특정 내인성 (endogenous) 유전자의 발현을 억제하는 방법으로 공지되어 있으며, 다양한 출판물에 기재되어 있다(예컨대, Hirajima 및 Inoue: New Biochemistry Experiment Course 2 Nucleic Acids IV Gene Replication and Expression (Japanese Biochemical Society Ed., Tokyo Kagaku Dozin Co., Ltd.) pp.319-347, 1993 참조). 안티센스 DNA 의 서열은 바람직하게는 상기 내인성 유전자의 전부 또는 일부에 상보적이나, 상기 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 한 완전히 상보적이지는 않을 수 있다. 전사된 RNA 는 상기 표적 유전자의 전사물에 대한 상보성이 바람직하게는 90% 이상, 및 더욱 바람직하게는 95% 이상이다. 안티센스 DNA 의 길이는 적어도 염기 15 개 이상, 바람직하게는 염기 100 개 이상, 및 더욱 바람직하게는 염기 500 개 이상이다.

본원에 사용된 "RNAi 효과를 통해 DNA 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 구절은 RNA 간섭 (RNAi) 을 통해 내인성 유전자의 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "RNAi"는, 표적 유전자 서열과 동일하거나 유사한 서열을 가진 이중가닥 RNA 를 세포 내로 도입할 때, 도입된 외래 유전자 및 표적 내인성 유전자의 발현이 모두 억제되는 현상을 지칭한다. 본원에 사용되는 RNA 로서는, 예를 들어, 21 내지 25 개 염기 길이의 RNA 간섭을 유발하는 이중가닥 RNA, 예를 들어, dsRNA (double strand RNA, 이중가닥 RNA), siRNA (small interfering RNA, 소간섭 RNA) 또는 shRNA (short hairpin RNA, 짧은 헤어핀 RNA) 를 들 수 있다. 이러한 RNA 는 리포솜과 같은 전달 시스템을 이용하여 목적하는 부위로 국소적으로 전달될 수 있거나, 또는 상기 기재한 이중가닥 RNA 를 생성하는 벡터가 그의 국소적 발현을 위해 사용될 수도 있다. 이러한 이중가닥 RNA (dsRNA, siRNA 또는 shRNA) 를 제조 및 사용하는 방법은 다수의 출판물로부터 공지되어 있다 (예컨대 하기 참조: 일본 국내단계 PCT 공개 특허 공보 제 2002-516062 호; US 2002/086356A; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.; Genesis, 26(4), 240-244, 2000 April; Nature, 407:6802, 319-20, 2002 Sep. 21; Genes & Dev., Vol.16, (8), 948-958, 2002 Apr.15; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(8), 5515-5520, 2002 Apr. 16; Science, 296(5567), 550-553, 2002 Apr. 19; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99:9, 6047-6052, 2002 Apr. 30; Nature Biotechnology, Vol.20 (5), 497-500, 2002 May; Nature Biotechnology, Vol. 20(5), 500-505, 2002 May; Nucleic Acids Res, 30:10, e46,2002 May 15).

본원에 사용된 "DNA 의 전사물을 특이적으로 절단하는 활성을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 구절은 일반적으로 리보자임 (ribozyme) 을 지칭한다. 리보자임은 표적 DNA 의 전사물을 절단하여 상기 유전자의 기능을 저해하는 촉매 활성을 가진 RNA 분자이다. 리보자임의 설계는 공지된 다양한 출판물들에서 발견할 수 있다 (예컨대 하기 참조: FEBS Lett. 228: 228, 1988; FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323: 349, 1986; Nucl. Acids. Res. 19: 6751, 1991; Protein Eng 3: 733, 1990; Nucl. Acids Res. 19: 3875, 1991; Nucl. Acids Res. 19: 5125, 1991; Biochem Biophys Res Commun 186: 1271, 1992). 또한, "공동-억제 효과를 통해 DNA 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 구절은 "공동-억제"에 의해 표적 DNA 의 기능을 저해하는 뉴클레오티드를 지칭한다.

본원에 사용된 "공동-억제"라는 용어는 표적 내인성 유전자와 동일한 또는 그와 유사한 서열을 가진 유전자를 세포 내로 형질전환시킬 때, 도입된 외래 유전자 및 표적 내인성 유전자의 발현이 모두 억제되는 현상을 지칭한다. 공동-억제 효과를 가진 폴리뉴클레오티드의 설계 또한 다양한 출판물들에서 발견할 수 있다 (예컨대, 하기 참조: Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997, Martienssen R: Curr. Biol. 6: 810, 1996).

2. 본 발명의 단백질

본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (i) 중 어느 하나에 의해 인코딩되는 단백질을 제공한다. 본 발명의 바람직한 단백질은 서열번호:2 의 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며, 글리세롤 채널 활성을 갖는다.

이러한 단백질에는, 서열번호:2 의 아미노산 서열에서 상기 언급한 수의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 가지며 글리세롤 채널 활성을 갖는 것들이 포함된다. 또한, 이러한 단백질에는, 서열번호: 2 의 아미노산 서열에 대해 상기 기재된 바와 같은 상동성을 가지며 글리세롤 채널 활성을 갖는 것들이 포함된다.

이러한 단백질은, 예를 들어, 문헌 [MOLECULAR CLONING 제 3 판, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Nuc . Acids. Res., 10: 6487 (1982), Proc . Natl. Acad . Sci . USA 79: 6409 (1982), Gene 34: 315 (1985), Nuc . Acids. Res., 13: 4431 (1985), Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82: 488 (1985)] 에 기재된, 위치지정 돌연변이를 이용하여 수득할 수 있다.

본 발명의 단백질의 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가는 상기 동일 아미노산 서열 중 임의의 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 것을 의미한다. 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가 중 2 개 이상의 유형이 동시에 일어날 수도 있다.

이하에, 상호 치환가능한 아미노산 잔기의 예를 열거한다. 동일한 그룹 내의 아미노산 잔기는 상호 치환가능하다. 이하 상기 그룹들을 제시한다.

그룹 A: 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, o-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌; 그룹 B: 아스파르트산, 글루탐산, 이소아스파르트산, 이소글루탐산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산 (2-aminosuberic acid); 그룹 C: 아스파라긴, 글루타민; 그룹 D: 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산; 그룹 E: 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린; 그룹 F: 세린, 트레오닌, 호모세린; 및 그룹 G: 페닐알라닌, 티로신.

본 발명의 단백질은 또한 Fmoc 방법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐 방법) 및 tBoc 방법 (t-부틸옥시카르보닐 방법) 과 같은 화학적 합성 방법으로 제조할 수도 있다. 또한, 예를 들어, Advanced ChemTech, PerkinElmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimazu Corp. 로부터 구매가능한 펩티드 합성기를 또한 화학적 합성에 사용할 수 있다.

3. 본 발명의 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 효모

이어서 본 발명은 상기 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 상기 (a) 내지 (i) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 (j) 내지 (m) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것이 포함된 벡터에 관한 것이다. 일반적으로, 본 발명의 벡터는 하기가 성분으로서 포함된 발현 카세트를 포함한다: (x) 효모 세포에서 전사할 수 있는 프로모터; (y) 상기 프로모터에 센스 또는 안티센스 방향으로 연결된 상기 (a) 내지 (i) 중 임의의 것으로 기재된 폴리뉴클레오티드; 및 (z) 전사 종결 및 RNA 분자의 폴리아데닐화에 관하여 상기 효모에서 기능하는 신호. 본 발명에 따르면, 후술되는 알콜성 음료 (예컨대, 맥주) 의 양조시에 상기 기재된 본 발명의 단백질을 고도로 발현시키기 위해서는, 이들 폴리뉴클레오티드를 상기 프로모터에 대해 센스 방향으로 도입하여 상기 (a) 내지 (i) 중 임의의 것으로 기재된 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 촉진시킨다. 나아가, 후술되는 알콜성 음료 (예컨대, 맥주) 의 양조시에 상기 본 발명의 단백질을 억제하기 위해서는, 이들 폴리뉴클레오티드를 상기 프로모터에 대해 안티센스 방향으로 도입하여 상기 (a) 내지 (i) 중 임의의 것으로 기재된 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제시킨다. 상기 본 발명의 단백질을 억제하기 위해서, 상기 폴리뉴클레오티드를, (j) 내지 (m) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 벡터 내로 도입할 수 있다. 본 발명에 따르면, 표적 유전자 (DNA) 를 파괴하여 상기 기술한 DNA 의 발현 또는 상기 기술한 단백질의 발현을 억제할 수 있다. 표적 유전자 내에서 유전자 산물의 발현에 관련된 영역, 예를 들어, 코딩 영역 또는 프로모터 영역에 또는 이로부터 하나 이상의 염기를 부가 또는 결실시키거나, 또는 이들 영역 전체를 결실시켜 유전자를 파괴시킬 수 있다. 이러한 유전자 파괴는 공지된 출판물들에서 찾아볼 수 있다(예컨대, 하기 참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4951(1979), Methods in Enzymology, 101, 202(1983), 일본 특허 출원 공개 제 6-253826 호).

효모에 도입된 벡터는 다중복제(multicopy)형 (YEp 형), 단일복제형 (YCp 형), 또는 염색체 통합형 (YIp 형) 중 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, YEp24 (J. R. Broach 등, EXPERIMENTAL MAMPULATION OF GENE EXPRESSION, Academic Press, New York, 83, 1983) 는 YEp 형 벡터로 알려져 있고, YCp50 (M. D. Rose 등, Gene 60: 237, 1987) 는 YCp 형 벡터로 알려져 있으며, YIp5 (K. Struhl 등, Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 76: 1035, 1979) 는 YIp 형 벡터로 알려져 있고, 이들 모두 용이하게 입수가능하다.

효모에서 유전자 발현을 조정하는 프로모터/종결자는 이들이 양조 효모에서 기능하며, 발효액 중의 구성성분들에 의해 영향을 받지 않는 한 임의의 조합일 수 있다. 예를 들어, 글리세르알데히드류 3-포스페이트 데히드로게나아제 유전자 (TDH3) 의 프로모터, 또는 3-포스포글리세레이트 키나아제 유전자 (PGK1) 의 프로모터를 사용할 수 있다. 이들 유전자들은, 예를 들어, 문헌 [M. F. Tuite 등, EMBO J., 1, 603 (1982)] 에 상세히 기재된 바와 같이 사전에 클로닝된 것이며, 이들은 공지된 방법으로 용이하게 수득가능하다.

영양요구성 마커는 양조 효모에 대한 형질전환시 선별 마커로 사용될 수 없기 때문에, 예를 들어, 제네티신(geneticin)-내성 유전자 (G418r), 구리-내성 유전자 (CUP1) (Marin 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81, 337 1984) 또는 세룰레닌(cerulenin)-내성 유전자 (fas2m, PDR4) (각각, Junji Inokoshi 등, Biochemistiy, 64, 660, 1992; 및 Hussain 등, Gene, 101 : 149, 1991) 가 사용될 수 있다.

상기 기재된 바와 같이 구축된 벡터를 숙주 효모에 도입한다. 숙주 효모의 예로서는, 양조하는데 사용될 수 있는 임의의 효모, 예를 들어, 맥주, 와인 및 사케 (sake) 용 양조 효모를 들 수 있다. 구체적으로, 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속(屬)과 같은 효모를 사용할 수 있다. 본 발명에 따라, 라거 양조 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 파스토리아누스 (Saccharomyces pastorianus) W34/70 등, 사카로마이세스 칼스버겐시스 (Saccharomyces carlsbergensis) NCYC453 또는 NCYC456 등, 또는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953 또는 NBRC1954 등을 사용할 수 있다. 또한, 사카로마이세스 세레비지애 NCYC90 와 같은 위스키 효모, 일본양조협회 (Brewing Society of Japan) 로부터의 와인 효모 #1, 3 및 4 와 같은 와인 효모, 및 일본양조협회로부터의 사케 효모 #7 및 9 와 같은 사케 효모를 또한 사용할 수 있으나 이들에 한정되지는 않는다. 본 발명에서는, 사카로마이세스 파스토리아누스와 같은 라거 양조 효모를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

효모 형질전환 방법은 일반적으로 사용되는 공지된 방법일 수 있다. 예를 들어, 사용될 수 있는 방법으로는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 전기천공 방법 (Meth . Enzym ., 194: 182 (1990)), 스페로플라스트 (spheroplast) 방법 (Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 75: 1929(1978)), 리튬 아세테이트 방법 (J. Bacteriology, 153: 163 (1983)), 및 문헌 [Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 75: 1929 (1978), METHODS IN YEAST GENETICS, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual] 에 기재된 방법을 들 수 있다.

더욱 구체적으로, 숙주 효모를 표준 효모 영양 배지 (예컨대, YEPD 배지 (Genetic Engineering. Vol. 1, Plenum Press, New York, 117(1979)) 등) 에서 OD600 nm 가 1 내지 6 이 되도록 배양한다. 상기 배양 효모를 원심분리로 수집하고, 세정한 후, 약 1 내지 2 M 의 농도의 알칼리 금속 이온, 바람직하게는 리튬 이온으로 예비-처리한다. 상기 세포를 약 30℃에서 약 60 분간 방치되도록 한 후, 도입시킬 DNA (약 1 내지 20 ㎍) 와 함께 약 30℃에서 약 60 분간을 더 방치한다. 폴리에틸렌글리콜, 바람직하게는 약 4,000 달톤의 폴리에틸렌글리콜을 최종 농도가 약 20% 내지 50% 가 되도록 첨가한다. 약 30℃에서 약 30 분간 방치한 후, 상기 세포를 약 42℃에서 약 5 분간 가열한다. 바람직하게는, 상기 세포 현탁물을 표준 효모 영양 배지로 세정하고, 소정의 양의 새로운 표준 효모 영양 배지에 첨가한 후, 약 30℃에서 약 60 분간 방치한다. 그 후, 이를 선별 마커로서 항생물질 등이 함유된 표준 한천 배지에 시딩 (seeding) 하여 형질전환체를 수득한다.

다른 일반적인 클로닝 기술은, 예를 들어, 문헌 [MOLECULAR CLONING 제 3 판], 및 문헌 [METHODS IN YEAST GENETICS, A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)] 에서 찾아볼 수 있다.

4. 본 발명에 따른 알콜성 음료의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 알콜성 음료

상기 기재된 본 발명의 벡터를 표적 알콜성 생성물을 양조하기에 적합한 효모 내로 도입한다. 상기 효모는 증가된 글리세롤의 함량을 가져 바디와 감칠맛이 강화된 목적하는 알콜성 음료를 제조하는데 사용될 수 있다. 덧붙여, 후술되는 본 발명의 효모 평가 방법에 의해 선별된 효모를 또한 사용할 수 있다. 표적 알콜성 음료에는, 예를 들어, 이들에 제한되는 것은 아니나 맥주, 유탄산 (sparkling) 알콜 음료 (happoushu) 와 같은 맥주맛 음료, 와인, 위스키, 사케 등이 있다. 나아가, 본 발명에 따르면, 필요할 경우, 글리세롤 수준이 감소된 목적하는 알콜성 음료는 상기 표적 유전자의 발현이 억제된 양조 효모를 사용하여 제조가능하다. 다시 말해, 알콜성 음료를 제조하기 위한 발효를 위해 상기 기재된 본 발명의 벡터가 도입된 효모, 상기 기재된 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현이 억제된 효모 또는 후술되는 본 발명의 효모 평가 방법으로 선별된 효모를 사용하여 글리세롤의 생성량을 제어시킴 (증가 또는 감소시킴) 으로써 글리세롤 수준이 제어 (증가 또는 감소) 된 원하는 종류의 알콜성 음료를 제조할 수 있다.

이들 알콜성 음료를 제조하기 위해서, 본 발명에 따라 수득된 양조 효모를 모균주 (parent strain) 대신 사용하는 것을 제외하고는 공지의 기술을 사용할 수 있다. 물질, 제조 장비, 제조 관리 등이 종래의 것과 정확히 동일할 수 있으므로, 글리세롤의 함량이 증가된 알콜성 음료의 제조 비용을 증가시킬 필요가 없다. 따라서, 본 발명에 따르면, 바디와 감칠맛이 우수한 알콜성 음료를 기존의 설비를 사용하여 비용 증가 없이 제조할 수 있다.

5. 본 발명의 효모 평가 방법

본 발명은 서열번호:1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 글리세롤 채널 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 설계된 프라이머 또는 탐침자를 사용하여 시험 효모의 글리세롤-생성 능력을 평가하는 방법에 관한 것이다. 이러한 평가 방법을 위한 일반적인 기술은 공지되어 있으며, 예를 들어, WO01/040514, 일본 공개 특허 출원 제 8-205900 호 등에 기재되어 있다. 상기 평가 방법은 하기 기술된다.

먼저, 시험 효모의 게놈을 준비한다. 상기 준비를 위해, Hereford 방법 또는 아세트산칼륨 방법과 같은 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다 (예컨대, METHODS IN YEAST GENETICS, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 130 (1990)). 글리세롤 채널 유전자의 뉴클레오티드 서열 (바람직하게는, ORF 서열) 에 기초하여 설계된 프라이머 또는 탐침자를 사용하여, 수득한 시험 효모 게놈에서 상기 유전자 또는 상기 유전자에 특이적인 서열의 존재 여부를 결정한다. 상기 프라이머 또는 탐침자는 공지의 기술에 따라 설계될 수 있다.

상기 유전자 또는 상기 특이적 서열의 검출은 공지의 기술을 이용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 상기 특이적 서열의 일부 또는 전부가 포함된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열이 포함된 폴리뉴클레오티드를 하나의 프라이머로 사용하고, 상기 서열의 상류 또는 하류의 서열의 일부 또는 전부가 포함된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열이 포함된 폴리뉴클레오티드를 또 다른 프라이머로 사용하여 PCR 방법으로 상기 효모의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 산물의 존재 여부 및 상기 증폭된 산물의 분자량을 결정한다. 프라이머에 사용된 폴리뉴클레오티드의 염기의 수는 일반적으로 10 염기쌍 (bp) 이상, 바람직하게는 15 내지 25 bp 이다. 일반적으로, 상기 프라이머들 사이의 염기의 수는 적당하게는 300 내지 2000 bp 이다.

PCR 의 반응 조건으로는 특별한 제한이 없으나, 예를 들어, 변성 온도는 90 내지 95 ℃, 어닐링 (annealing) 온도는 40 내지 60℃, 신장 온도는 60 내지 75℃, 및 사이클 횟수는 10 이상일 수 있다. 결과적으로 생성된 반응 산물은, 예를 들어, 아가로오스 겔을 이용한 전기영동으로 분리하여, 증폭된 산물의 분자량을 측정할 수 있다. 상기 방법은, 증폭된 산물의 분자량이 상기 특정 부분의 DNA 분자를 포함하는 크기인지의 여부로 결정되는 바 효모의 글리세롤 생성 능력의 예측 및 평가를 가능하게 한다. 또한, 증폭된 산물의 뉴클레오티드 서열을 분석함으로써, 상기 능력을 더욱 정확히 예측 및/또는 평가할 수 있다.

나아가, 본 발명에서는, 시험 효모를 배양하여 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 글리세롤 채널 유전자의 발현 수준을 측정하여 상기 시험 효모의 글리세롤-생성 능력을 평가한다. 상기 글리세롤 채널 유전자의 발현 수준을 측정함에 있어서, 상기 시험 효모를 배양한 후, 글리세롤 채널 유전자로부터 생성된 mRNA 또는 단백질을 정량한다. mRNA 또는 단백질의 정량은 공지의 기술을 이용함으로써 실시될 수 있다. 예를 들어, mRNA 는 노던 (Northern) 혼성화 또는 정량적 RT-PCR 로 정량할 수 있고, 단백질은, 예를 들어, 웨스턴 블랏팅 (Western blotting) 으로 정량할 수 있다(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons 1994-2003).

또한, 시험 효모를 배양하고, 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 글리세롤 채널 유전자의 발현 수준을 측정하여 표적 글리세롤-생성 능력에 따른 유전자 발현 수준을 가진 시험 효모를 선별함으로써, 목적하는 알콜성 음료를 양조하는데 유리한 효모를 선별한다. 또한, 참조 효모 및 시험 효모를 배양하여 각 효모에서의 상기 유전자의 발현 수준을 측정 및 비교하여, 유리한 시험 효모를 선별할 수도 있다. 더욱 구체적으로, 예를 들어, 참조 효모 및 하나 이상의 시험 효모를 배양하고, 각 효모에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 글리세롤 채널 유전자의 발현 수준을 측정한다. 참조 효모에서보다 상기 유전자가 더 많이 또는 더 적게 발현되는 시험 효모를 선별함으로써, 알콜성 음료를 양조하는데 적당한 효모를 선별할 수 있다.

다르게는, 시험 효모를 배양하고, 글리세롤-생성 능력이 더 높거나 더 낮은, 또는 글리세롤 채널 활성이 더 높거나 더 낮은 효모를 선별함으로써, 목적하는 알콜성 음료를 양조하는데 적당한 효모를 선별할 수 있다.

이들 경우에, 시험 효모 또는 참조 효모는, 예를 들어, 본 발명의 벡터가 도입된 효모, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현이 제어된 효모, 인공적으로 변이유발된 효모 또는 자연적으로 변이유발된 효모일 수 있다. 상기 글리세롤-생성 능력은, 예를 들어, 문헌 [Enzymatic Analysis, vol.4 1825-1831, 1974] 에 기재된 방법에 의해 측정가능하다. 글리세롤 채널 활성은, 예를 들어, 문헌 [Eur J. Biochem 271:771-779, 2004] 에 기재된 방법에 의해 측정가능하다. 돌연변이 처리는, 예를 들어, 자외선 조사 및 방사선 조사와 같은 물리적 방법, 및 EMS (에틸메탄 술포네이트) 및 N-메틸-N-니트로소구아니딘과 같은 약물로의 처리와 관련된 화학적 방법을 비롯한 임의의 방법을 이용할 수 있다 (예컨대, 하기 참조: Yasuji Oshima Ed., BIOCHEMISTRY EXPERIMENTS vol. 39, Yeast Molecular Genetic Experiments, pp. 67-75, JSSP).

또한, 참조 효모 또는 시험 효모로 사용된 효모의 예로서는, 양조에 사용될 수 있는 임의의 효모, 예를 들어, 맥주, 와인, 사케 등을 위한 양조 효모를 들 수 있다. 더욱 구체적으로, 사카로마이세스 속과 같은 효모를 사용할 수 있다 (예컨대, S. 파스토리아누스, S. 세레비지애 및 S. 칼스버겐시스). 본 발명에 따르면, 라거 양조 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 파스토리아누스 W34/70; 사카로마이세스 칼스버겐시스 NCYC453 또는 NCYC456; 또는 사카로마이세스 세레비지애 NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953 또는 NBRC1954 등을 사용할 수 있다. 또한, 일본양조협회로부터의 와인 효모 #1, 3 및 4 와 같은 와인 효모; 및 일본양조협회로부터의 사케 효모 #7 및 9 와 같은 사케 효모를 또한 사용할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서, 사카로마이세스 파스토리아누스와 같은 라거 양조 효모를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 참조 효모 및 시험 효모는 상기 효모들로부터 임의 조합으로 선택될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 참조하여 더욱 상세히 기술할 것이다. 그러나, 본 발명은 후술되는 실시예에 제한되지 않는다.

실시예 1: 글리세롤 채널 (비(非)-ScFPS1) 유전자의 클로닝

일본 특허 출원 공개 제 2004-283169 호에 기재된 비교 데이터베이스를 이용한 검색의 결과로서 라거 양조 효모로부터 특이적인 신규한 글리세롤 채널 유전자 (비(非)-ScFPS1) (서열번호: 1) 가 발견되었다. 상기 획득한 뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여, 각각 상기 전장 유전자들을 증폭하도록 프라이머들인 비(非)-ScFPS1_for (서열번호: 3) 및 비(非)-ScFPS1_rv (서열번호: 4) 를 설계하였다. 게놈 서열분석 균주인 사카로마이세스 파스토리아누스 Weihenstephan 34/70 균주의 염색체 DNA 를 주형으로 사용하여 PCR 을 수행하여, 비(非)-ScFPS1 의 전장 유전자 를 포함한 DNA 단편 (약 2 kb) 을 수득하였다.

이렇게 수득한 비(非)-ScFPS1 유전자 단편을 TA 클로닝에 의해 pCR2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen) 내로 삽입하였다. 비(非)-ScFPS1 유전자의 뉴클레오티드 서열들을 Sanger 방법 (F. Sanger, Science, 214: 1215, 1981) 으로 분석하여 뉴클레오티드 서열을 확인하였다.

실시예 2: 맥주 발효 동안의 비(非)-ScFPS1 유전자의 발현 분석

라거 양조 효모인 사카로마이세스 파스토리아누스 W34/70 균주를 사용하여 맥주 발효 시험을 수행한 후, 발효 동안 효모 세포로부터 추출한 mRNA 를 DNA 마이크로어레이로 분석하였다.

맥아즙 (wort) 추출물 농도 12.69%

맥아즙 함량 70 L

맥아즙 내 용존 산소 농도 8.6 ppm

발효 온도 15 ℃

효모 투입률 (pitching rate) 12.8 x 10⁶ 개 세포/mL

발효주를 시간에 따라 표본추출하고, 효모 성장 양 (도 1) 및 겉보기 추출물 농도 (도 2) 의 시간에 따른 변화를 관찰하였다. 동시에, 효모 세포의 표본추출을 수행하고, 준비된 mRNA 를 비오틴으로 표지하고, 이를 맥주 효모 DNA 마이크로어레이에 혼성화하였다. GCOS; GeneChip Operating Software 1.0 (Affymetrix Co. 제조) 을 사용하여 신호를 검출하였다. 비(非)-ScFPS1 유전자 의 발현 패턴은 도 3 에 나타나 있다. 그 결과, 일반적인 맥주 발효에서 비(非)-ScFPS1 유전자가 발현된 것이 확인되었다.

실시예 3: 비(非)-ScFPS1 유전자 고발현주 (highly expressed strain) 의 구축

실시예 1 에 기재된 비(非)-ScFPS1/pCR2.1-TOPO 를 제한효소들인 SacI 및 NotI 으로 절단하여, 그의 단백질-인코딩 영역의 전체 길이가 포함된 DNA 단편을 제조하였다. 상기 단편을 제한효소들인 SacI 및 NotI 으로 처리된 pYCGPYNot 에 결찰하여, 비(非)-ScFPS1 고발현 벡터 비(非)-ScFPS1/pYCGPYNot 를 구축하였다. pYCGPYNot 는 YCp-형 효모 발현 벡터이다. 삽입된 유전자는 피루베이트 키나아제 유전자 PYK1 프로모터에 의해 고발현된다. 상기 효모에는 제네티신-내성 유전자 G418^r 이 선별 마커로 포함되고, 대장균 (Escherichia coli) 에는 선별 마커로서 암피실린-내성 유전자 Amp^r 가 포함된다.

상기 방법으로 제조된 고발현 벡터를 사용하여, 상기 균주 사카로마이세스 파스토리아누스 Weihenstephaner 34/70 을 일본 특허 출원 공개 제 H07-303475 호에 기재된 방법으로 형질전환시켰다. 형질전환체를 제네티신 300 mg/L 이 함유된 YPD 플레이트 배지 (1% 효모 추출물, 2% 폴리펩톤, 2% 포도당, 2% 한천) 에서 선별하였다.

실시예 4: 맥주 발효 시험에 있어서 글리세롤 생성량의 분석

모균주 (34/70 주) 및 실시예 3 에서 수득한 비(非)-ScFPS1 고발현주를 이용 하여 하기 조건으로 발효 시험을 수행했다:

맥아즙 추출물 농도 12.8 %

맥아즙 함량 1 L

맥아즙 내 용존 산소 농도 약 10 ppm

발효 온도 15 ℃ (고정)

효모 투입률 맥아즙 1 ℓ 당 6 g 의 젖은 효모 세포

발효액을 시간에 따라 표본추출하고, 효모 성장률 (OD660) (도 4), 추출물 소비량 (도 5) 및 글리세롤 생성량 (도 6) 의 시간에 따른 변화를 측정했다. 발효액 내 글리세롤을 F-키트 글리세롤 (제품 번호 148270, Roche 제조) 를 이용해 정량했다 (Method of Enzymatic Analysis, vol.4 1825-1831, 1974, 등 참조). 발효 종료시 글리세롤 양은 모균주에 있어서는 1.6 g/L 이었고, 비(非)-ScFPS1 고발현주에 있어서는 2.1 g/L 로, 모균주의 약 1.3 배였다.

실시예 5: 비(非)-ScFPS1 유전자의 파괴

문헌 [Goldstein 등, yeast. 15 1541 (1999)) 에 따라, 약물-내성 마커를 포함하는 플라스미드 (pFA6a (G418 ^r ) 또는 pAG25 (nat1)) 를 주형으로서 이용하는 PCR 을 수행하여 유전자 파괴용 단편을 제조한다.

유전자 파괴용으로 제조한 단편으로, 맥주 효모 사카로마이세스 파스토리아 누스 W34/70 균주 또는 포자 클로닝 주 (W34/70-2) 를 형질전환한다. 형질 전환은 일본 특허 출원 공개 제 H-07-303475 호에 기술한 방법에 따라 수행한다. 선별용 약물의 농도는 각각 제네티신 300 mg/L 및 노우르세오트리신 (noureseothricin) 50 mg/L 이다.

실시예 6: 맥주 발효 시험에서의 글리세롤 생성량의 분석

모균주 및 실시예 5 에서 수득한 비(非)-ScFPS1-파괴주를 이용해, 하기 조건으로 맥주 양조 시험을 실시한다.

맥아즙 추출 농도 13%

맥아즙 함량 1 L

맥아즙 내 용존 산소 농도 약 10 ppm

발효 온도 15℃ 일정하게

효모 투입 맥아즙 1 L 당 6 g 의 젖은 효모 세포

발효액을 시간에 따라 표본추출하여, 시간에 따른 세포 성장 (OD66), 당 소비량 및 글리세롤 생성을 관찰한다. 발효액 내 글리세롤을 F-키트 글리세롤 (제품 번호 148270, Roche 제조) 을 이용해 정량한다 (Method of Enzymatic Analysis,vol.4 1825-1831,1974, etc. 참조).

본 발명의 알콜성 음료의 제조 방법을 이용해 맛이 우수한 알콜성 음료를 제조할 수 있는데, 이는 본 방법으로 제품에 바디 또는 감칠맛을 제공하는 글리세롤 양을 제어할 수 있기 때문이다.

<110> Suntory Limited <120> Glycerol channel gene and use thereof <130> PCT06-0079 <150> JP2005-253281 <151> 2005-09-01 <150> JP2006-55562 <151> 2006-03-01 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1986 <212> DNA <213> yeast <400> 1 atgagtaatc ctcaaaaggc cttaaacgat tttctgtcca atgaatcagt ccacactcat 60 gagagttcta gaaaacaatc tcataataga cgctcatcgg acgaaggacg ttcttcctca 120 caaccctcac atcatcattc caacggtcac aataataatg gtagccctgg taacggtaat 180 gatggggaca acgatgatgg ttatgactat gagatgcaag attatagacc gtcgcaacaa 240 agcgcgcttc ccacacctac atacgtccca cagtattctg taggaagtgg gccctctttc 300 ccgatccagg aggtcgttcc taacgcgtac ataaacacac aagacacgaa ccataaagat 360 aacggtccgc caagtgcaag tagtaataga gcattcagac caagaggcca aaccaccgta 420 tcagcgaacg tacttaacgt cgaggatttt tataagaatg gagatgacgc gtatactata 480 ccagagtcgc atctgtcgag aagaaggagc agatcaaggg ctgagagcaa cactggtcac 540 agcgccacta cgggcgctac aaatgcaagg actactggcg ctcaaaccaa tatggaaaat 600 aacgagccgc cacgtagcgt tcctattatg gtgaagccaa aaacgctgta ccagaatcct 660 caaactccaa cagttttgcc ttccacgtac catccgatca acaaatggtc ttcggtgaaa 720 aacacttact tgaaggaatt tctggctgaa tttatgggaa caatggttat gattattttc 780 ggtagtgccg tcgtatgtca agtcaatgtt gcgggcaaaa tacagcaaga caacttcaat 840 tcagctctgg ataatattaa agtcaccgat tcctccgcag aaacgataga aactatgaag 900 agtctaactt cgctagtatc ttctgttgca ggcggtacgt ttgacgatgt ggcactgggt 960 tgggctgctg ccgtcgtgat gggatatttc tgtgctggtg gtagtgctat ctccggtgct 1020 catttgaatc catctattac attggcaaat ctggtatata gaggtttccc cctaaagaag 1080 gtgccctatt attttgctgg acaactgatc ggggccttta cgggtgcttt gattttgttt 1140 atttggtata aaagagtgct acaagaggca tacggcgata tatggataag cgaaagtgtt 1200 gcgggaatgt tttgtgtttt tccaaagcct tatttaagtt caggaagaca atttttttcc 1260 gaatttctat gtggggctat gttgcaagct ggtacatttg cgttgaccga tccttataca 1320 tgtttgtcat ccgatgtttt cccgttaatg atgttcattc tgatttttgt cataaatgcc 1380 tccatggcct atcaaacggg tacagcaatg aatttggctc gtgacttagg cccacgtctc 1440 gccttgtacg ctgttggatt tgaccataga atgctttgga tacaccacca tcatttcttt 1500 tgggtaccta tggtaggtcc atttcttggt gcattaatgg gcgggctggt ttatgatgtt 1560 tgtatttatc agggtcatga atctccagtc aattggtctt taccagtcta taaggaaatg 1620 ataatgagag cttggttcag aagacccggt tggaaaaaga gaaacagagc tagaagaaca 1680 tcggacttga gtgatttctc ctacaacaac gatgacgatg acgatgagtt cggtgaaaga 1740 atggctcttc aaaagacaaa aactaagtca tccatttcag acaacgaaaa tgaagctggt 1800 gaaaagaaag tccaatttaa gtctgttcag cgtggtaaaa gaacgttcgg aggtatacca 1860 accattcttg aagaagagga ttctatcgaa acagcttcac taggtgcgac taccacagat 1920 tccatgggat tgtctgatat atcttcagaa gattctcatt tcgggaattt aaagaaagta 1980 acgtag 1986 <210> 2 <211> 661 <212> PRT <213> yeast <400> 2 Met Ser Asn Pro Gln Lys Ala Leu Asn Asp Phe Leu Ser Asn Glu Ser 1 5 10 15 Val His Thr His Glu Ser Ser Arg Lys Gln Ser His Asn Arg Arg Ser 20 25 30 Ser Asp Glu Gly Arg Ser Ser Ser Gln Pro Ser His His His Ser Asn 35 40 45 Gly His Asn Asn Asn Gly Ser Pro Gly Asn Gly Asn Asp Gly Asp Asn 50 55 60 Asp Asp Gly Tyr Asp Tyr Glu Met Gln Asp Tyr Arg Pro Ser Gln Gln 65 70 75 80 Ser Ala Leu Pro Thr Pro Thr Tyr Val Pro Gln Tyr Ser Val Gly Ser 85 90 95 Gly Pro Ser Phe Pro Ile Gln Glu Val Val Pro Asn Ala Tyr Ile Asn 100 105 110 Thr Gln Asp Thr Asn His Lys Asp Asn Gly Pro Pro Ser Ala Ser Ser 115 120 125 Asn Arg Ala Phe Arg Pro Arg Gly Gln Thr Thr Val Ser Ala Asn Val 130 135 140 Leu Asn Val Glu Asp Phe Tyr Lys Asn Gly Asp Asp Ala Tyr Thr Ile 145 150 155 160 Pro Glu Ser His Leu Ser Arg Arg Arg Ser Arg Ser Arg Ala Glu Ser 165 170 175 Asn Thr Gly His Ser Ala Thr Thr Gly Ala Thr Asn Ala Arg Thr Thr 180 185 190 Gly Ala Gln Thr Asn Met Glu Asn Asn Glu Pro Pro Arg Ser Val Pro 195 200 205 Ile Met Val Lys Pro Lys Thr Leu Tyr Gln Asn Pro Gln Thr Pro Thr 210 215 220 Val Leu Pro Ser Thr Tyr His Pro Ile Asn Lys Trp Ser Ser Val Lys 225 230 235 240 Asn Thr Tyr Leu Lys Glu Phe Leu Ala Glu Phe Met Gly Thr Met Val 245 250 255 Met Ile Ile Phe Gly Ser Ala Val Val Cys Gln Val Asn Val Ala Gly 260 265 270 Lys Ile Gln Gln Asp Asn Phe Asn Ser Ala Leu Asp Asn Ile Lys Val 275 280 285 Thr Asp Ser Ser Ala Glu Thr Ile Glu Thr Met Lys Ser Leu Thr Ser 290 295 300 Leu Val Ser Ser Val Ala Gly Gly Thr Phe Asp Asp Val Ala Leu Gly 305 310 315 320 Trp Ala Ala Ala Val Val Met Gly Tyr Phe Cys Ala Gly Gly Ser Ala 325 330 335 Ile Ser Gly Ala His Leu Asn Pro Ser Ile Thr Leu Ala Asn Leu Val 340 345 350 Tyr Arg Gly Phe Pro Leu Lys Lys Val Pro Tyr Tyr Phe Ala Gly Gln 355 360 365 Leu Ile Gly Ala Phe Thr Gly Ala Leu Ile Leu Phe Ile Trp Tyr Lys 370 375 380 Arg Val Leu Gln Glu Ala Tyr Gly Asp Ile Trp Ile Ser Glu Ser Val 385 390 395 400 Ala Gly Met Phe Cys Val Phe Pro Lys Pro Tyr Leu Ser Ser Gly Arg 405 410 415 Gln Phe Phe Ser Glu Phe Leu Cys Gly Ala Met Leu Gln Ala Gly Thr 420 425 430 Phe Ala Leu Thr Asp Pro Tyr Thr Cys Leu Ser Ser Asp Val Phe Pro 435 440 445 Leu Met Met Phe Ile Leu Ile Phe Val Ile Asn Ala Ser Met Ala Tyr 450 455 460 Gln Thr Gly Thr Ala Met Asn Leu Ala Arg Asp Leu Gly Pro Arg Leu 465 470 475 480 Ala Leu Tyr Ala Val Gly Phe Asp His Arg Met Leu Trp Ile His His 485 490 495 His His Phe Phe Trp Val Pro Met Val Gly Pro Phe Leu Gly Ala Leu 500 505 510 Met Gly Gly Leu Val Tyr Asp Val Cys Ile Tyr Gln Gly His Glu Ser 515 520 525 Pro Val Asn Trp Ser Leu Pro Val Tyr Lys Glu Met Ile Met Arg Ala 530 535 540 Trp Phe Arg Arg Pro Gly Trp Lys Lys Arg Asn Arg Ala Arg Arg Thr 545 550 555 560 Ser Asp Leu Ser Asp Phe Ser Tyr Asn Asn Asp Asp Asp Asp Asp Glu 565 570 575 Phe Gly Glu Arg Met Ala Leu Gln Lys Thr Lys Thr Lys Ser Ser Ile 580 585 590 Ser Asp Asn Glu Asn Glu Ala Gly Glu Lys Lys Val Gln Phe Lys Ser 595 600 605 Val Gln Arg Gly Lys Arg Thr Phe Gly Gly Ile Pro Thr Ile Leu Glu 610 615 620 Glu Glu Asp Ser Ile Glu Thr Ala Ser Leu Gly Ala Thr Thr Thr Asp 625 630 635 640 Ser Met Gly Leu Ser Asp Ile Ser Ser Glu Asp Ser His Phe Gly Asn 645 650 655 Leu Lys Lys Val Thr 660 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gagctcatag cggccatgag taatcctcaa aaggccttaa 40 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggatcctatg cggccgctat acctctttgt acaaatttat at 42

Claims

하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(a) 서열번호:1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(b) 서열번호:2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(c) 글리세롤 채널 활성을 가지며 서열번호:2 의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(d) 글리세롤 채널 활성을 가지며 서열번호:2 의 아미노산 서열과의 일치성이 60% 이상인 아미노산 서열을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(e) 엄격한 조건하에서 서열번호:1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며, 글리세롤 채널 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및

(f) 엄격한 조건하에서 서열번호:2 의 아미노산 서열의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 글리세롤 채널 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(g) 서열번호: 2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하거나, 또는 서열번호: 2 의 아미노산 서열 중 1 내지 10 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 인코딩하고, 이때 상기 단백질은 글리세롤 채널 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드;

(h) 글리세롤 채널 활성을 가지며 서열번호: 2 의 아미노산 서열과의 일치성이 90% 이상인 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

(i) 서열번호: 1 에 혼성화하거나 또는 고도로 엄격한 조건하에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화하며, 글리세롤 채널 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, 서열번호: 1 로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.
제 1 항에 있어서, 서열번호: 2 로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 인 폴리뉴클레오티드.
하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(j) 제 5 항에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(k) RNAi 효과를 통해 제 5 항에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(l) 제 5 항에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물을 특이적으로 절단하는 활성을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

(m) 공동-억제 효과를 통해 제 5 항에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드로 인코딩되는 단백질.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터.
제 6 항의 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터.
제 8 항 또는 제 9 항의 벡터를 포함한 효모.
제 10 항에 있어서, 글리세롤-생성 능력이 상승되는 효모.
제 9 항의 벡터를 도입함에 의해, 또는 제 5 항의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 와 관련된 유전자를 파괴함에 의해 제 5 항의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현이 억제되는 효모.
제 10 항에 있어서, 제 7 항의 단백질의 발현 수준을 증가시킴에 의해 글리세롤-생성 능력이 상승되는 효모.
제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 효모를 사용함에 의한 알콜성 음료의 제조 방법.
제 14 항에 있어서, 양조된 알콜성 음료가 맥아 음료인 알콜성 음료의 제조 방법.
제 14 항에 있어서, 양조된 알콜성 음료가 와인인 알콜성 음료의 제조 방법.
제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되는 알콜성 음료.
서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 글리세롤 채널 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 고안된 프라이머 또는 탐침자 (probe) 를 사용하는 것을 포 함하는, 시험 효모의 글리세롤-생성 능력을 평가하는 방법.
하기를 포함하는 시험 효모의 글리세롤-생성 능력을 평가하는 방법: 시험 효모를 배양함; 및 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 글리세롤 채널 유전자의 발현 수준을 측정함.
하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 시험 효모를 배양함; 제 7 항에 따른 단백질을 정량하거나 또는 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 글리세롤 채널 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 표적 글리세롤-생성 능력에 따른 상기 단백질의 양 또는 상기 유전자 발현 수준을 갖는 시험 효모를 선별함.
제 20 항에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 글리세롤 채널 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 상기 참조 효모에서보다 상기 유전자가 더 높거나 또는 더 낮게 발현되는 시험 효모를 선별함.
제 20 항에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 제 7 항에 따른 단백질을 정량함; 및 참조 효모에서보다 상기 단백질의 양이 더 많거나 더 적은 시험 효모를 선별함.
하기를 포함하는 알콜성 음료의 제조 방법: 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 효모 또는 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 선별된 효모를 사용하여 알콜성 음료의 제조를 위한 발효를 수행함; 및 글리세롤의 생성량을 조절함.