KR20080036586A - 술페이트 아데닐전이효소 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아황산염 생성 능력이 조절된 양조 효모, 아황산염 양이 조절된 알콜성 음료의 제조 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 양조 효모 술페이트 아데닐전이효소 Met3p 를 인코딩하는 MET3 유전자, 특히 라거 양조 효모에 특이적인 비(非)-ScMET3 유전자의 발현 수준을 조절함에 의해 생성물의 풍미에 기여하는 아황산염-생성 능력이 조절된 효모 및 상기 효모를 이용한 알콜성 음료의 제조 방법에 관한 것이다.

양조 효모, 아황산염-생성 능력, 알콜성 음료, 술페이트 아데닐전이효소

Description

술페이트 아데닐전이효소 유전자 및 이의 용도 {SULFATE ADENYLTRANSFERASE GENE AND USE THEREOF}

본 발명은 술페이트 아데닐전이효소 유전자 및 이의 용도, 특히, 풍미 안정성이 강화된 알콜성 음료를 제조하는 양조 효모, 상기 효모로 제조된 알콜성 음료 및 상기 음료의 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 양조 효모 술페이트 아데닐전이효소 Met3p 를 인코딩하는 MET3 유전자, 예를 들어 라거 양조 효모에 특이적인 비(非)-ScMET3 유전자의 발현 수준을 제어함에 의해 생성물의 풍미에 기여하는 아황산염 생성 능력이 조절된 효모, 및 상기 효모를 이용한 알콜성 음료의 제조 방법에 관한 것이다.

아황산염은 항산화 활성이 높은 화합물로 공지되어 왔으며, 따라서 식품, 음료, 약학 제품 등의 분야에서 널리 사용되어 왔다(예를 들어, 일본 특허 출원 공개공보 제 H06-040907 호 및 2000-093096 호). 알콜성 음료에서, 아황산염은 항산화제로 사용되어 왔다. 예를 들어, 장시간의 숙성을 필요로 하는 와인에 있어서 품질 유지에서 중요한 역할을 하는 것을 고려하여, 잔류 농도 350 ppm (백만분율) 까지의 첨가는 일본의 보건복지노동부에 의해 허용된다. 나아가, 저장 수명 (품질 유지 기간) 은 맥주 양조에서 생성물의 아황산염 농도에 따라 다르다는 것이 또한 공지되어 있다. 따라서, 풍미 안정성 등의 관점에서 상기 화합물의 함량을 증가시키는 것이 매우 중요하다.

생성물에서의 아황산염 함량을 증가시키는 가장 손쉬운 방법은 아황산염을 첨가하는 것이다. 그러나, 아황산염을 식품 첨가제로 처리하면, 제품 개발 상의 제약 및 소비자의 식품 첨가제에 관련관 부정적 이미지 등의 몇 가지 문제가 발생한다.

한편, 효모는 효모 생활 주기에 필요한 황 함유 화합물을 생합성으로 생성한다. 아황산염은 중간체 대사산물로서 생성된다. 따라서, 효모의 상기 능력을 이용하면, 아황산염을 첨가하지 않고 생성물에서의 아황산염 함량을 증가시킬 수 있다.

양조 공정 동안 발효주 내의 아황산염 함량을 증가시키는 방법으로는, (1) 공정 제어에 기초한 방법 및 (2) 효모 증식에 기초한 방법이 있다. 공정 제어에 기초한 방법에서는, 아황산염의 생성량이 초기 산소 공급량에 반비례하기 때문에, 공급되는 산소의 양을 감소시켜 아황산염의 생성량을 증가시키고 산화를 방지할 수 있다.

한편, 효모 증식에 기초한 방법에서는 유전자 조작 기술이 이용된다. 효모의 황 대사에서, 아황산염은 황 함유 아미노산 또는 황 함유 비타민의 생합성에서 생성되는 중간체이다. 아황산염은 세포의 외부에서 흡수되는 황산염 이온의 3 단계 반응의 환원에 의해 생성된다.

MET3 유전자는 제 1 반응을 촉매하는 효소를 인코딩하는 유전자이고; MET14 유전자는 제 2 반응을 촉매하는 효소를 인코딩하는 유전자이다. Korch 등은 MET3 유전자 및 MET14 유전자의 발현 수준을 증가시킴으로써 효모의 아황산염 생성 능력을 증가시키고자 시도하였는데, MET14 가 더 효과적임을 발견하였다(C. Korch 등, Proc . Eur . Brew . Conv . Conger., Lisbon, 201-208, 1991). 사용된 MET 3 유전자는 와인 효모에서 분리한 것이었다. 수득된 결과는 약 0.8 ppm 을 나타내었는데, 이는 실제 맥주 제품에서 약 10 % 의 아황산염 함량에 해당한다. Hansen 등은 아황산염에 대한 환원효소를 인코딩하는 MET10 유전자를 파괴하여 생성되는 아황산염의 환원을 방지함으로써 아황산염의 생성량을 증가시키고자 하였다(J. Hansen 등, Nature Biotech., 1587-1591, 1996).

나아가, Fujimura 등은 효모의 아황산염 이온 유출 펌프를 인코딩하는 SSU1 유전자들 중에서 라거 양조 효모에 유일한 비(非)-ScSSU1 유전자의 발현 수준을 증가시켜 균체 (fungal body) 밖으로의 아황산염의 배출을 증진시킴으로써 맥주에서의 아황산염 함량을 증가시키고자 하였다(Fujimura 등, Abstract of 2003 Annual Conference of the Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochem., 159, 2003).

그럼에도 불구하고, 효모에 의해 제조되는 알콜성 음료의 저장 수명 및 풍미 안정성을 향상시키기 위해 효모에 의한 아황산염의 생성량을 증가시키는 새로운 방법 및 물질이 필요하다. 상기 언급한 바와 같이, 생성물에서 아황산염 함량을 증가시키는 가장 손쉬운 방법은 외래의 또는 효모에 의해 생성된 것이 아닌 아황산염을 첨가하는 것이다. 그러나, 최근의 소비자들의 선호도, 즉 식품 첨가제 기피 및 천연 물질 사용의 관점에서 식품 첨가제의 사용을 최소화하는 것이 바람직하다. 따라서, 외부에서 아황산염을 첨가하지 않고 풍미 안정성에 유효한 아황산염 함량을 달성하는 것이 바람직하다. 그러나, 상기 기재한 바와 같은 공정 제어에 기초한 방법은 산소 부족으로 인해 효모의 성장 속도가 저하되어 발효 지연 및 품질 손실이 발생할 수 있기 때문에, 실용적이지 않을 수 있다.

나아가, 유전자 조작 기술을 사용하여 효모를 증식시킴에 있어서, 10 배 이상의 아황산염 함량을 달성하였다는 것을 언급하는 보고가 있다(J. Hansen 등, Nature Biotech., 1587-1591, 1996). 그러나, 발효 지연 및 아세트알데히드 및 1-프로판올과 같은 바람직하지 않은 풍미 성분의 증가와 같은 문제점이 존재한다. 따라서, 상기 효모는 실제 사용을 위해서는 좋지 않다. 따라서, 발효 속도 및 생성물의 품질을 손상시키지 않으면서 풍부한 양의 아황산염을 생성할 수 있는 효모를 증식시키는 방법에 대한 필요성이 존재해 왔다.

본원에 개시된 물질 및 방법들은 상기 문제를 해결하며, 그 결과 기존의 단백질들에 비해 유리한 효과를 가진 라거 양조 효모로부터의 술페이트 아데닐전이효소를 인코딩하는 유전자를 동정 및 분리하는데 성공하였다. 나아가, 상기 수득한 유전자를 도입하여 발현시킴으로써 효모를 형질전환하여, 아황산염의 생성량이 증가된 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 특별히 라거 양조 효모에 존재하는 신규한 술페이트 아데닐전이효소 유전자, 상기 유전자에 의해 인코딩되는 단백질, 상기 유전자의 발현이 제어되는 형질전환된 효모, 상기 유전자의 발현이 제어되는 효모를 이용함으로써 생성물 중의 아황산염의 양을 제어하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 하기 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터, 상기 벡터가 도입된 형질전환된 효모, 상기 형질전환된 효모를 사용함에 의한 알콜성 음료의 제조 방법 등을 제공한다.

(1) 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(a) 서열번호:1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(b) 서열번호:2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(c) 술페이트 아데닐전이효소 활성을 가지며 서열번호:2 의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(d) 술페이트 아데닐전이효소 활성을 가지며 서열번호:2 의 아미노산 서열과의 일치성이 60% 이상인 아미노산 서열을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

(e) 엄격한 조건하에서 서열번호:1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며, 술페이트 아데닐전이효소 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및

(f) 엄격한 조건하에서 서열번호:2 의 아미노산 서열의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 술페이트 아데닐전이효소 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.

(2) 상기 (1) 에 있어서, 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(g) 서열번호: 2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하거나, 또는 서열번호: 2 의 아미노산 서열 중 1 내지 10 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 이때 상기 단백질은 술페이트 아데닐전이효소 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드;

(h) 서열번호: 2 의 아미노산 서열과의 일치성이 90% 이상이며 술페이트 아데닐전이효소 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

(i) 서열번호: 1 에 혼성화하거나 또는 엄격한 조건하에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화하며, 술페이트 아데닐전이효소 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.

(3) 상기 (1) 에 있어서, 서열번호: 1 로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.

(4) 상기 (1) 에 있어서, 서열번호: 2 로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.

(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, DNA 인 폴리뉴클레오티드.

(6) 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

(j) 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(k) RNAi 효과를 통해 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(l) 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물을 특이적으로 절단하는 활성을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

(m) 공동-억제 효과를 통해 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.

(7) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드로 인코딩되는 단백질.

(8) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터.

(8a) 상기 (8) 에 있어서, 하기 구성요소들이 포함된 발현 카세트를 포함한 벡터:

(x) 효모 세포에서 전사될 수 있는 프로모터;

(y) 상기 프로모터에 센스 또는 안티센스 방향으로 연결된 상기 (1) 내지 (5) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나; 및

(z) 전사 종결 및 RNA 분자의 폴리아데닐화에 대하여 효모에서 기능할 수 있는 신호.

(9) 상기 (6) 의 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터.

(10) 상기 (8) 또는 (9) 의 벡터가 도입된 효모.

(11) 상기 (10) 에 있어서, 상기 (8) 의 벡터를 도입함에 의해 아황산염 생성 능력이 강화된 효모.

(12) 상기 (9) 의 벡터를 도입함에 의해, 또는 상기 (5) 의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 와 관련된 유전자를 파괴함에 의해 상기 (5) 의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현이 억제된 효모.

(13) 상기 (10) 에 있어서, 상기 (7) 의 단백질의 발현 수준을 증가시킴에 의해 아황산염 생성 능력이 향상된 효모.

(14) 상기 (10) 내지 (13) 중 어느 하나의 효모를 사용함에 의한 주류 (alcoholic liquor) 의 제조 방법.

(15) 상기 (14) 에 있어서, 양조주가 맥아주 (malt liquor) 인 주류의 제조 방법.

(16) 상기 (14) 에 있어서, 양조주가 와인인 주류의 제조 방법.

(17) 상기 (14) 내지 (16) 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 주류.

(18) 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 술페이트 아데닐전이효소 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 설계된 프라이머 또는 탐침자 (probe) 를 사용하는 것을 포함하는, 시험 효모의 아황산염 생성 능력 평가 방법.

(18a) 상기 (18) 에 기재된 방법을 사용하여 아황산염 생성 능력이 높거나 낮은 효모를 선별하는 방법.

(18b) 상기 (18a) 에 기재된 방법으로 선별된 효모를 사용함에 의한 주류 (예를 들어, 맥주) 의 제조 방법.

(19) 하기를 포함하는 시험 효모의 아황산염 생성 능력 평가 방법: 시험 효모를 배양함; 및 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 술페이트 아데닐전이효소 유전자의 발현 수준을 측정함.

(19a) 상기 (19) 에 기재된 방법으로 시험 효모를 평가하고 술페이트 아데닐전이효소 유전자의 발현 수준이 높은 효모를 선별하는 것을 포함하는, 고도의 아황산염 생성 능력을 가진 효모를 선별하는 방법.

(19b) 상기 (19a) 에 기재된 방법으로 선별된 효모를 사용함에 의한 주류 (예를 들어, 맥주) 의 제조 방법.

(20) 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 시험 효모를 배양함; 상기 (7) 의 단백질을 정량하거나 또는 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 술페이트 아데닐전이효소 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 표적 아황산염 생성 능력에 따른 상기 단백질 양 또는 상기 유전자 발현 수준을 갖는 시험 효모를 선별함.

(21) 상기 (20) 에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 술페이트 아데닐전이효소 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 참조 효모에 비해 상기 유전자가 더 많이 또는 더 적게 발현된 시험 효모를 선별함.

(22) 상기 (20) 에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 상기 (7) 의 단백질을 정량함; 및 참조 효모에 비해 상기 단백질을 더 많거나 또는 더 적은 양으로 가진 시험 효모를 선별함.

(23) 하기를 포함하는 알콜성 음료의 제조 방법: 상기 (10) 내지 (13) 중 어느 하나에 따른 효모 또는 상기 (20) 내지 (22) 중 어느 하나에 따른 방법으로 선별된 효모를 이용하여 알콜성 음료의 제조를 위한 발효를 수행함; 및 아황산염 생성량을 조절함.

벡터에 작동가능하게 연결된 술페이트 아데닐전이효소 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 효모를 사용함에 의한 알콜성 음료의 제조 방법에 따르면, 생성물에서의 항산화 활성을 가진 아황산염의 함량이 증가되어 풍미가 강화되고 저장 수명이 향상된 알콜성 음료를 제조할 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1 은 맥주 양조 시험시의 시간에 따른 세포 성장을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내고, 세로축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.

도 2 는 맥주 양조 시험시의 시간에 따른 당 소비량을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내고, 세로축은 겉보기 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.

도 3 은 맥주 양조 시험시의 효모에서의 비(非)-ScMET3 유전자의 발현 거동을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내고, 세로축은 검출된 신호의 휘도를 나타낸다.

도 4 는 비(非)-ScMET3-고도 발현 균주를 사용한 양조 시험시의 시간에 따른 세포 성장을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내고, 세로축은 660 nm 에서의 광학 밀도 (OD660) 를 나타낸다.

도 5 는 비(非)-ScMET3-고도 발현 균주를 사용한 맥주 양조 시험 시의 시간에 따른 당 소비량을 나타낸다. 가로축은 발효 시간을 나타내고, 세로축은 겉보기 추출물 농도 (w/w%) 를 나타낸다.

도 6 은 비(非)-ScMET3-고도 발현 균주를 사용한 완성된 맥주에서의 아황산염 농도를 나타낸다.

발명의 실시를 위한 최선의 양식

아황산염 이온 유출 펌프의 발현 수준을 증가시키는 공지의 방법에서는, 과잉의 아황산염이 균체에 축적되지 않기 때문에 적절한 발효율이 유지될 수 있다. 그러나, 균체 내에서의 아황산의 생합성 반응이 제한 요인일 수 있는 가능성이 있다. 따라서, 본원에서는 출발 물질인 황산염 이온으로부터 아황산까지의 환원 경로를 강화함으로써 아황산염 생성을 강화하는 물질 및 방법이 개시된다.

본 발명자들은 상기 개념에 기초하여 연구하였고, 그 결과, 일본 특허 출원 공개공보 제 2004-283169 호에 개시된 방법에 따라 맵핑된 라거 양조 효모 게놈 정보에 기초한 라거 양조 효모에 유일한 술페이트 아데닐전이효소를 인코딩하는 비(非)-ScMET3 유전자를 분리 및 동정하였다. 상기 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 1 로 표시된다. 나아가, 상기 유전자로 인코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 2 로 표시된다.

1. 본 발명의 폴리뉴클레오티드

먼저, 본 발명은 (a) 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 서열번호:2 의 아미노산 서열의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 일 수 있다.

본 발명의 표적 폴리뉴클레오티드는 라거 양조 효모에서 유래한 술페이트 아데닐전이효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 한정되지 않으며, 상기 단백질에 대한 등가의 기능을 갖는 단백질들을 인코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드들도 이에 포함될 수 있다. 등가의 기능을 가진 단백질로서는, 예를 들어, (c) 술페이트 아데닐전이효소 활성을 가지며 서열번호: 2 의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 가진 단백질이 있다.

이러한 단백질에는, 술페이트 아데닐전이효소 활성을 가지며 서열번호: 2 의 아미노산 서열에서, 예를 들어, 1 내지 100, 1 내지 90, 1 내지 80, 1 내지 70, 1 내지 60, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 39, 1 내지 38, 1 내지 37, 1 내지 36, 1 내지 35, 1 내지 34, 1 내지 33, 1 내지 32, 1 내지 31, 1 내지 30, 1 내지 29, 1 내지 28, 1 내지 27, 1 내지 26, 1 내지 25, 1 내지 24, 1 내지 23, 1 내지 22, 1 내지 21, 1 내지 20, 1 내지 19, 1 내지 18, 1 내지 17, 1 내지 16, 1 내지 15, 1 내지 14, 1 내지 13, 1 내지 12, 1 내지 11, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6 (1 내지 수 개의 아미노산), 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1 개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열로 이루어진 단백질이 포함된다. 일반적으로, 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가의 수는 더 적은 것이 바람직하다. 또한, 이러한 단백질에는, (d) 술페이트 아데닐전이효소 활성을 가지며 서열번호: 2 의 아미노산 서열과의 일치성이 약 60% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상인 아미노산 서열을 가진 단백질이 포함된다. 일반적으로, 백분율 동일성이 더 높은 것이 바람직하다.

술페이트 아데닐전이효소 활성은, 예를 들어 문헌 [Klonus 등, Plant J. 6(1): 105-12, 1994 Jul.] 의 방법에 의해 측정할 수 있다.

나아가, 본 발명은 또한 (e) 엄격한 조건하에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 술페이트 아데닐전이효소 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및 (f) 엄격한 조건하에서 서열번호: 2 의 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 술페이트 아데닐전이효소 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드를 염두에 둔다.

여기서, "엄격한 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드"란 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 의 전부 또는 일부를 탐침자로서 사용하여 콜로니 혼성화 기술, 플라크 혼성화 기술, 서던 (southern) 혼성화 기술 등에 의해 수득된, DNA 등의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 상기 혼성화 방법은, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning 제 3 판, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997] 등에 기재된 방법일 수 있다.

본원에 사용된 "엄격한 조건"이라는 용어는 낮은 엄격성 조건, 중간 엄격성 조건 또는 높은 엄격성 조건 중 임의일 수 있다. "낮은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 32℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "중간 엄격성 조건"은, 예를 들어, 42℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "높은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 50℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. 이들 조건하에서, 상동성이 더 높은, DNA 등의 폴리뉴클레오티드는 더욱 높은 온도에서 효율적으로 수득될 것으로 예상되지만, 혼성화 엄격성에는 온도, 탐침자 농도, 탐침자 길이, 이온 세기, 시간, 염 농도 및 기타를 비롯하여 복수의 요인들이 연루되므로, 당업자는 유사한 엄격성을 구현하기 위해 이들 요인들을 적절히 선택할 수 있다.

혼성화를 위해 시판중인 키트를 사용하는 경우에는, 예를 들어, Alkphos Direct Labeling Reagents (Amersham Pharmacia) 를 사용할 수 있다. 이 경우, 첨부된 프로토콜에 따라, 표지된 탐침자와 함께 하룻밤 인큐베이션한 후, 막을 0.1% (w/v) SDS 가 함유된 55℃ 의 1차 세정 완충액으로 세정하여, 혼성화된 DNA 를 검출한다.

혼성화될 수 있는 기타 폴리뉴클레오티드에는, 기본 매개변수를 사용하여 FASTA 및 BLAST 와 같은 상동성 검색 소프트웨어로 산출한 바, 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 에 대한 일치성이 약 60% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상인 폴리뉴클레오티드가 포함된다.

아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열들 간의 일치성은 Karlin 및 Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST 를 사용하여 결정할 수 있다(Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990; Proc . Natl Acad . Sci . USA, 90: 5873, 1993). BLAST 알고리즘에 기초한 BLASTN 및 BLASTX 로 불리는 프로그램들이 개발되었다(Altschul SF 등, J. Mol . Biol . 215: 403, 1990). 뉴클레오티드 서열을 BLASTN 을 사용하여 서열분석하는 경우, 매개변수들은, 예를 들어, 스코어 = 100 및 단어 길이 = 12 이다. 아미노산 서열을 BLASTX 로 서열분석하는 경우, 매개변수들은, 예를 들어, 스코어 = 50 및 단어 길이 = 3 이다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램에 대한 기본 매개변수가 이용된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드에는, (j) 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; (k) RNAi 효과를 통해 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; (l) 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물을 특이적으로 절단하는 활성을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (m) 공동-억제 효과를 통해 상기 (5) 에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 이들 폴리뉴클레오티드는 벡터 내로 통합될 수 있는데, 상기 벡터는 상기 (a) 내지 (i) 의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 형질전환을 위해 세포 내로 도입될 수 있다. 따라서, 상기 DNA 의 발현을 억제시키는 것이 바람직한 경우 이들 폴리뉴클레오티드를 적절히 사용할 수 있다.

본원에 사용된 "DNA 의 전사물에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 구절은 소위 안티센스 DNA 를 지칭한다. 안티센스 기술은 특정 내인성 유전자의 발현을 억제하는 방법으로 공지되어 있으며, 다양한 출판물에 기재되어 있다(예컨대, Hirajima 및 Inoue: New Biochemistry Experiment Course 2 Nucleic Acids IV Gene Replication and Expression (Japanese Biochemical Society Ed., Tokyo Kagaku Dozin Co., Ltd.) pp.319-347, 1993 참조). 안티센스 DNA 의 서열은 바람직하게는 상기 내인성 유전자의 전부 또는 일부에 상보적이나, 상기 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 한 완전히 상보적이지는 않을 수 있다. 전사된 RNA 는 상기 표적 유전자의 전사물에 대한 상보성이 바람직하게는 90% 이상, 및 더욱 바람직하게는 95% 이상이다. 안티센스 DNA 의 길이는 적어도 염기 15 개 이상, 바람직하게는 염기 100 개 이상, 및 더욱 바람직하게는 염기 500 개 이상이다.

본원에 사용된 "RNAi 효과를 통해 DNA 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 구절은 RNA 간섭 (RNAi) 을 통해 내인성 유전자의 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "RNAi"는, 표적 유전자 서열과 동일하거나 유사한 서열을 가진 이중가닥 RNA 를 세포 내로 도입할 때, 도입된 외래 유전자 및 표적 내인성 유전자의 발현이 모두 억제되는 현상을 지칭한다. 본원에 사용되는 RNA 로서는, 예를 들어, 21 내지 25 개 염기 길이의 RNA 간섭을 유발하는 이중가닥 RNA, 예를 들어, dsRNA (double strand RNA, 이중가닥 RNA), siRNA (small interfering RNA, 소간섭 RNA) 또는 shRNA (short hairpin RNA, 짧은 헤어핀 RNA) 를 들 수 있다. 이러한 RNA 는 리포솜과 같은 전달 시스템을 이용하여 목적하는 부위로 국소적으로 전달될 수 있고, 또는 상기 기재한 이중가닥 RNA 를 생성하는 벡터가 그의 국소적 발현을 위해 사용될 수도 있다. 이러한 이중가닥 RNA (dsRNA, siRNA 또는 shRNA) 를 제조 및 사용하는 방법은 다수의 출판물로부터 공지되어 있다(예컨대 하기 참조: 일본 국내단계 PCT 공개 특허 공보 제 2002-516062 호; US 2002/086356A; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.; Genesis, 26(4), 240-244, 2000 April; Nature, 407:6802, 319-20, 2002 Sep. 21; Genes & Dev., Vol.16, (8), 948-958, 2002 Apr.15; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(8), 5515-5520, 2002 Apr. 16; Science, 296(5567), 550-553, 2002 Apr. 19; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99:9, 6047-6052, 2002 Apr. 30; Nature Biotechnology, Vol.20 (5), 497-500, 2002 May; Nature Biotechnology, Vol. 20(5), 500-505, 2002 May; Nucleic Acids Res, 30:10, e46,2002 May 15).

본원에 사용된 "DNA 의 전사물을 특이적으로 절단하는 활성을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 구절은 일반적으로 리보자임 (ribozyme) 을 지칭한다. 리보자임은 표적 DNA 의 전사물을 절단하여 상기 유전자의 기능을 저해하는 촉매 활성을 가진 RNA 분자이다. 리보자임의 설계는 공지된 다양한 출판물들에서 발견할 수 있다(예컨대 하기 참조: FEBS Lett. 228: 228, 1988; FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323: 349, 1986; Nucl. Acids. Res. 19: 6751, 1991; Protein Eng 3: 733, 1990; Nucl. Acids Res. 19: 3875, 1991; Nucl. Acids Res. 19: 5125, 1991; Biochem Biophys Res Commun 186: 1271, 1992). 또한, "공동-억제 효과를 통해 DNA 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 구절은 "공동-억제"에 의해 표적 DNA 의 기능을 저해하는 뉴클레오티드를 지칭한다.

본원에 사용된 "공동-억제"라는 용어는 표적 내인성 유전자와 동일한 또는 그와 유사한 서열을 가진 유전자를 세포 내로 형질전환시킬 때, 도입된 외래 유전자 및 표적 내인성 유전자의 발현이 모두 억제되는 현상을 지칭한다. 공동-억제 효과를 가진 폴리뉴클레오티드의 설계 또한 다양한 출판물들에서 발견할 수 있다(예컨대, 하기 참조: Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997, Martienssen R: Curr. Biol. 6: 810, 1996).

2. 본 발명의 단백질

본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (f) 중 어느 하나에 의해 인코딩되는 단백질을 제공한다. 본 발명의 바람직한 단백질은 서열번호:2 의 아미노산 서열에서 1 개 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 포함하며, 술페이트 아데닐전이효소 활성을 갖는다.

이러한 단백질에는, 서열번호:2 의 아미노산 서열에서 상기 언급한 수의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 가지며 술페이트 아데닐전이효소 활성을 갖는 것들이 포함된다. 또한, 이러한 단백질에는, 서열번호: 2 의 아미노산 서열에 대해 상기 기재된 바와 같은 상동성을 가지며 술페이트 아데닐전이효소 활성을 갖는 것들이 포함된다.

이러한 단백질은, 예를 들어, 문헌 [MOLECULAR CLONING 제 3 판, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Nuc . Acids . Res ., 10: 6487 (1982), Proc . Natl. Acad . Sci . USA 79: 6409 (1982), Gene 34: 315 (1985), Nuc . Acids . Res ., 13: 4431 (1985), Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82: 488 (1985)] 에 기재된, 위치지정 돌연변이를 이용하여 수득할 수 있다.

본 발명의 단백질의 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가는 상기 동일 아미노산 서열 중 임의의 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 것을 의미한다. 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가 중 2 개 이상의 유형이 동시에 일어날 수도 있다.

이하에, 상호 치환가능한 아미노산 잔기의 예를 열거한다. 동일한 그룹 내의 아미노산 잔기는 상호 치환가능하다. 이하 상기 그룹들을 제시한다.

그룹 A: 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, o-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌; 그룹 B: 아스파르트산, 글루탐산, 이소아스파르트산, 이소글루탐산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산 (2-aminosuberic acid); 그룹 C: 아스파라긴, 글루타민; 그룹 D: 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산; 그룹 E: 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린; 그룹 F: 세린, 트레오닌, 호모세린; 및 그룹 G: 페닐알라닌, 티로신.

본 발명의 단백질은 또한 Fmoc 방법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐 방법) 및 tBoc 방법 (t-부틸옥시카르보닐 방법) 과 같은 화학적 합성 방법으로 제조할 수도 있다. 또한, 예를 들어, Advanced ChemTech, PerkinElmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimazu Corp. 로부터 구매가능한 펩티드 합성기를 또한 화학적 합성에 사용할 수 있다.

3. 본 발명의 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 효모

이어서 본 발명은 상기 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 상기 (a) 내지 (i) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 (j) 내지 (m) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것이 포함된 벡터에 관한 것이다. 일반적으로, 본 발명의 벡터는 하기가 성분으로서 포함된 발현 카세트를 포함한다: (x) 효모 세포에서 전사할 수 있는 프로모터; (y) 상기 프로모터에 센스 또는 안티센스 방향으로 연결된 상기 (a) 내지 (i) 중 임의의 것으로 기재된 폴리뉴클레오티드; 및 (z) 전사 종결 및 RNA 분자의 폴리아데닐화에 관하여 상기 효모에서 기능하는 신호. 본 발명에 따르면, 후술되는 알콜성 음료 (예컨대, 맥주) 의 양조시에 상기 기재된 본 발명의 단백질을 고도로 발현시키기 위해서는, 이들 폴리뉴클레오티드를, 상기 (a) 내지 (i) 중 임의의 것으로 기재된 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 촉진시키는 센스 방향으로 상기 프로모터 내로 도입한다. 상기 본 발명의 단백질을 억제하기 위해서, 상기 폴리뉴클레오티드를, (j) 내지 (m) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 도입할 수 있다. 본 발명에 따르면, 표적 유전자 (DNA) 를 파괴하여 상기 DNA 또는 상기 단백질의 발현을 억제할 수 있다. 표적 유전자 내에서 유전자 산물의 발현에 관련된 영역, 예를 들어, 코딩 영역 또는 프로모터 영역에 또는 이로부터 하나 이상의 염기를 부가 또는 결실시키거나, 또는 이들 영역 전체를 결실시켜 유전자를 파괴시킬 수 있다. 이러한 유전자 파괴는 공지된 출판물들에서 찾아볼 수 있다(예컨대, 하기 참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4951(1979), Methods in Enzymology, 101, 202(1983), 일본 특허 출원 공개공보 제 6-253826 호).

효모에 도입된 벡터는 다중복제(multicopy)형 (YEp 형), 단일복제형 (YCp 형), 또는 염색체 통합형 (YIp 형) 중 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, YEp24 (J. R. Broach 등, EXPERIMENTAL MAMPULATION OF GENE EXPRESSION, Academic Press, New York, 83, 1983) 는 YEp 형 벡터로 알려져 있고, YCp50 (M. D. Rose 등, Gene 60: 237, 1987) 는 YCp 형 벡터로 알려져 있으며, YIp5 (K. Struhl 등, Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 76: 1035, 1979) 는 YIp 형 벡터로 알려져 있고, 이들 모두 용이하게 입수가능하다.

효모에서 유전자 발현을 조정하는 프로모터/종결자는 이들이 양조 효모에서 기능하며, 발효액 중의 아미노산, 당, 고급 알콜 또는 에스테르의 농도에 영향을 끼치지 않는 한 임의의 조합일 수 있다. 예를 들어, 글리세르알데히드류 3-포스페이트 탈수소효소 유전자 (TDH3) 의 프로모터, 또는 3-포스포글리세레이트 키나아제 유전자 (PGK1) 의 프로모터를 사용할 수 있다. 이들 유전자들은, 예를 들어, 문헌 [M. F. Tuite 등, EMBO J., 1, 603 (1982)] 에 상세히 기재된 바와 같이 사전에 클로닝된 것이며, 이들은 공지된 방법으로 용이하게 수득가능하다.

영양요구성 마커는 양조 효모에 대한 형질전환시 선별 마커로 사용될 수 없기 때문에, 예를 들어, 제네티신(geneticin)-저항성 유전자 (G418r), 구리-저항성 유전자 (CUP1) (Marin 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81, 337 1984) 또는 세룰레닌(cerulenin)-저항성 유전자 (fas2m, PDR4) (각각, Junji Inokoshi 등, Biochemistiy, 64, 660, 1992; 및 Hussain 등, Gene, 101 : 149, 1991) 가 사용될 수 있다.

상기 기재된 바와 같이 구축된 벡터를 숙주 효모에 도입한다. 숙주 효모의 예로서는, 양조하는데 사용될 수 있는 임의의 효모, 예를 들어, 맥주, 와인 및 사케 (sake) 용 양조 효모를 들 수 있다. 구체적으로, 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속(屬)과 같은 효모를 사용할 수 있다. 본 발명에 따르면, 라거 양조 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 파스토리아누스 (Saccharomyces pastorianus) W34/70, 사카로마이세스 칼스버겐시스 (Saccharomyces carlsbergensis) NCYC453 또는 NCYC456, 또는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953 또는 NBRC1954 를 사용할 수 있다. 또한, 사카로마이세스 세레비지애 NCYC90 와 같은 위스키 효모, 일본양조협회 (Brewing Society of Japan) 로부터의 와인 효모 #1, 3 및 4 와 같은 와인 효모, 및 일본양조협회로부터의 사케 효모 #7 및 9 와 같은 사케 효모를 또한 사용할 수 있으나 이들에 한정되지는 않는다. 본 발명에서는, 사카로마이세스 파스토리아누스와 같은 라거 양조 효모를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

효모 형질전환 방법은 일반적으로 사용되는 공지된 방법일 수 있다. 예를 들어, 사용될 수 있는 방법으로는, 이들에 제한되는 것은 아니나, 전기천공 방법 (Meth . Enzym ., 194: 182 (1990)), 스페로플라스트 (spheroplast) 방법 (Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 75: 1929(1978)), 리튬 아세테이트 방법 (J. Bacteriology, 153: 163 (1983)), 및 문헌 [Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 75: 1929 (1978), METHODS IN YEAST GENETICS, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual] 에 기재된 방법을 들 수 있다.

더욱 구체적으로, 숙주 효모를 표준 효모 영양 배지 (예컨대, YEPD 배지 (Genetic Engineering. Vol. 1, Plenum Press, New York, 117(1979)) 등) 에서 OD600 nm 가 1 내지 6 이 되도록 배양한다. 상기 배양 효모를 원심분리로 수집하고, 세정한 후, 약 1 내지 2 M 의 농도의 알칼리 이온 금속 이온, 바람직하게는 리튬 이온으로 예비-처리한다. 상기 세포를 약 30℃에서 약 60 분간 방치되도록 한 후, 도입시킬 DNA (약 1 내지 20 ㎍) 와 함께 약 30℃에서 약 60 분간을 더 방치한다. 폴리에틸렌글리콜, 바람직하게는 약 4,000 달톤의 폴리에틸렌글리콜을 최종 농도가 약 20% 내지 50% 가 되도록 첨가한다. 약 30℃에서 약 30 분간 방치한 후, 상기 세포를 약 42℃에서 약 5 분간 가열한다. 바람직하게는, 상기 세포 현탁물을 표준 효모 영양 배지로 세정하고, 소정의 양의 새로운 표준 효모 영양 배지에 첨가한 후, 약 30℃에서 약 60 분간 방치한다. 그 후, 이를 선별 마커로서 항생물질 등이 함유된 표준 한천 배지에 시딩 (seeding) 하여 형질전환체를 수득한다.

다른 일반적인 클로닝 기술은, 예를 들어, 문헌 [MOLECULAR CLONING 제 3 판], 및 문헌 [METHODS IN YEAST GENETICS, A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)] 에서 찾아볼 수 있다.

4. 본 발명에 따른 알콜성 음료의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 알콜성 음료

상기 기재된 본 발명의 벡터를 표적 알콜성 생성물을 양조하기에 적합한 효모 내로 도입한다. 상기 효모는 아황산염의 함량 증가에 따라 풍미가 강화된 목적하는 알콜성 음료를 제조하는데 사용될 수 있다. 덧붙여, 본 발명의 효모 평가 방법에 의해 선별된 효모를 또한 사용할 수 있다. 표적 알콜성 음료에는, 예를 들어, 이들에 제한되는 것은 아니나 맥주, 와인, 위스키, 사케 등이 있다.

이들 알콜성 음료를 제조하기 위해서, 본 발명에 따라 수득된 양조 효모를 모 균주 (parent strain) 대신 사용하는 것을 제외하고는 공지의 기술을 사용할 수 있다. 물질, 제조 장비, 제조 관리 등이 종래의 것과 정확히 동일할 수 있으므로, 아황산염의 함량이 증가된 알콜성 음료의 제조 비용을 증가시킬 필요가 없다. 따라서, 본 발명에 따르면, 기존의 설비를 사용하여 풍미가 강화된 알콜성 음료를 비용 증가 없이 제조할 수 있다.

나아가, 상기 유전자가 고도 발현되는 효모에서는 배양 배지 내의 황산염 이온이 효율적으로 혼입되므로, 황 공급원이 적게 함유된 원료, 예컨대 맥주의 경우 맥아 비율이 낮은 맥아즙의 경우에도 효모의 충분한 성장 및/또는 알콜성 발효가 가능할 수 있다.

다르게는, 황 함유 아미노산에 대한 합성 시스템의 기능이 지나치게 활성인 효모에서는, 경로 중에 알콜성 음료에 바람직하지 않은 이취 (off-flavor) 를 야기하는 황화수소를 중간체-대사산물로서 포함한 황 함유 화합물이 간혹 다량 생성되어 축적된다. 이러한 효모의 상기 유전자 기능을 억제하거나 또는 파괴함으로써, 출발 물질로서의 황산염 이온의 혼입을 억제할 수 있다. 그 결과, 이취가 감소된 알콜성 음료를 제조할 수 있다.

5. 본 발명의 효모 평가 방법

본 발명은 서열번호:1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 술페이트 아데닐전이효소 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 설계된 프라이머 또는 탐침자를 사용하여 시험 효모의 아황산염 생성 능력을 평가하는 방법에 관한 것이다. 이러한 평가 방법을 위한 일반적인 기술은 공지되어 있으며, 예를 들어, WO01/040514, 일본 공개 특허 출원 제 8-205900 호 등에 기재되어 있다. 상기 평가 방법은 하기 기술된다.

먼저, 시험 효모의 게놈을 준비한다. 상기 준비를 위해, Hereford 방법 또는 포타슘 아세테이트 방법과 같은 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다(예컨대, METHODS IN YEAST GENETICS, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 130 (1990)). 술페이트 아데닐전이효소 유전자의 뉴클레오티드 서열 (바람직하게는, ORF 서열) 에 기초하여 설계된 프라이머 또는 탐침자를 사용하여, 수득한 시험 효모 게놈에서 상기 유전자 또는 상기 유전자에 특이적인 서열의 존재 여부를 결정한다. 상기 프라이머 또는 탐침자는 공지의 기술에 따라 설계될 수 있다.

상기 유전자 또는 상기 특이적 서열의 검출은 공지의 기술을 이용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 상기 특이적 서열의 일부 또는 전부가 포함된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열이 포함된 폴리뉴클레오티드를 하나의 프라이머로 사용하고, 상기 서열의 상류 또는 하류의 서열의 일부 또는 전부가 포함된 폴리뉴클레오티드 또는 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열이 포함된 폴리뉴클레오티드를 또 다른 프라이머로 사용하여 PCR 방법으로 상기 효모의 핵산을 증폭시켜, 증폭된 산물의 존재 여부 및 상기 증폭된 산물의 분자량을 결정한다. 프라이머에 사용된 폴리뉴클레오티드의 염기의 수는 일반적으로 10 염기쌍 (bp) 이상, 및 바람직하게는 15 내지 25 bp 이다. 일반적으로, 상기 프라이머들 사이의 염기의 수는 적당하게는 300 내지 2000 bp 이다.

PCR 의 반응 조건으로는 특별한 제한이 없으나, 예를 들어, 변성 온도는 90 내지 95 ℃, 어닐링 (annealing) 온도는 40 내지 60℃, 신장 온도는 60 내지 75℃, 및 사이클 횟수는 10 이상일 수 있다. 결과적으로 생성된 반응 산물은, 예를 들어, 아가로오스 겔을 이용한 전기영동으로 분리하여, 증폭된 산물의 분자량을 측정할 수 있다. 상기 방법은, 증폭된 산물의 분자량이 상기 특정 부분의 DNA 분자를 포함하는 크기인지의 여부로 결정되는 바 효모의 아황산염 생성 능력의 예측 및 평가를 가능하게 한다. 또한, 증폭된 산물의 뉴클레오티드 서열을 분석함으로써, 그의 능력을 더욱 정확히 예측 및/또는 평가할 수 있다.

나아가, 본 발명에서는, 시험 효모를 배양하여 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 술페이트 아데닐전이효소 유전자의 발현 수준을 측정하여 상기 시험 효모의 아황산염 생성 능력을 평가한다. 이 경우, 상기 시험 효모를 배양한 후, 술페이트 아데닐전이효소 유전자로부터 생성된 mRNA 또는 단백질을 정량한다. mRNA 또는 단백질의 정량은 공지의 기술을 이용함으로써 실시될 수 있다. 예를 들어, mRNA 는 노던 (Northern) 혼성화 또는 정량적 RT-PCR 로 정량할 수 있고, 단백질은, 예를 들어, 웨스턴 블랏팅 (Western blotting) 으로 정량할 수 있다(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons 1994-2003).

또한, 시험 효모를 배양하고, 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 갖는, 술페이트 아데닐전이효소 유전자의 발현 수준을 측정하여 표적 아황산염 생성 능력에 따른 유전자 발현 수준을 가진 시험 효모를 선별함으로써, 목적하는 알콜성 음료를 양조하는데 유리한 효모를 선별한다. 또한, 참조 효모 및 시험 효모를 배양하여 각 효모에서의 상기 유전자의 발현 수준을 측정 및 비교하여, 유리한 시험 효모를 선별할 수도 있다. 더욱 구체적으로, 예를 들어, 참조 효모 및 하나 이상의 시험 효모를 배양하고, 각 효모에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 술페이트 아데닐전이효소 유전자의 발현 수준을 측정한다. 참조 효모에 비해 상기 유전자가 더 많이 발현되는 시험 효모를 선별함으로써, 알콜성 음료를 양조하는데 적당한 효모를 선별할 수 있다.

다르게는, 시험 효모를 배양하고, 아황산염 생성 능력이 더 높거나 또는 술페이트 아데닐전이효소 활성이 더 높은 효모를 선별함으로써, 목적하는 알콜성 음료를 양조하는데 적당한 효모를 선별할 수 있다.

이들 경우에, 시험 효모 또는 참조 효모는, 예를 들어, 본 발명의 벡터가 도입된 효모, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현이 강화 또는 억제된 효모, 인공적으로 변이유발된 효모 또는 자연적으로 변이유발된 효모일 수 있다. 술페이트 아데닐전이효소 활성은, 예를 들어, 문헌 [Klonus 등, Plant J. 6(1): 105-12, 1994 Jul.] 의 방법에 의해 측정할 수 있다. 돌연변이 처리는, 예를 들어, 자외선 조사 및 방사선 조사와 같은 물리적 방법, 및 EMS (에틸메탄 술포네이트) 및 N-메틸-N-니트로소구아니딘과 같은 약품으로의 처리와 관련된 화학적 방법을 비롯한 임의의 방법을 이용할 수 있다(예컨대, 하기 참조: Yasuji Oshima Ed., BIOCHEMISTRY EXPERIMENTS vol. 39, Yeast Molecular Genetic Experiments, pp. 67-75, JSSP).

또한, 참조 효모 또는 시험 효모로 사용된 효모의 예로서는, 양조에 사용될 수 있는 임의의 효모, 예를 들어, 맥주, 와인, 사케 등을 위한 양조 효모를 들 수 있다. 더욱 구체적으로, 사카로마이세스 속과 같은 효모를 사용할 수 있다(예컨대, S. 파스토리아누스, S. 세레비지애 및 S. 칼스버겐시스). 본 발명에 따르면, 라거 양조 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 파스토리아누스 W34/70; 사카로마이세스 칼스버겐시스 NCYC453 또는 NCYC456; 또는 사카로마이세스 세레비지애 NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953 또는 NBRC1954 를 사용할 수 있다. 또한, 일본양조협회로부터의 와인 효모 #1, 3 및 4 와 같은 와인 효모; 및 일본양조협회로부터의 사케 효모 #7 및 9 와 같은 사케 효모를 또한 사용할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서, 사카로마이세스 파스토리아누스와 같은 라거 양조 효모를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 참조 효모 및 시험 효모는 상기 효모들로부터 임의 조합으로 선택될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 참조하여 더욱 상세히 기술할 것이다. 그러나, 본 발명은 후술되는 실시예에 제한되지 않는다.

실시예 1: 술페이트 아데닐전이효소 (비(非)- ScMET3 ) 유전자의 클 로닝

일본 특허 출원 공개공보 제 2004-283169 호에 기재된 비교 데이터베이스를 이용한 검색의 결과로서 라거 양조 효모로부터 특정 신규한 술페이트 아데닐전이효소 유전자 (비(非)-ScMET3) (서열번호: 1) 가 발견되었다. 상기 획득한 뉴클레오티드 서열 정보에 기초하여, 각각 상기 전장 유전자들을 증폭하도록 프라이머들인 비(非)-ScMET3_for (서열번호: 3) 및 비(非)-ScMET3_rv (서열번호: 4) 를 설계하였다. 게놈 서열분석 균주인 사카로마이세스 파스토리아누스 Weihenstephan 34/70 균주의 염색체 DNA 를 주형으로 사용하여 PCR 을 수행하여, 비(非)-ScMET3 의 전장 유전자를 포함한 DNA 절편들을 수득하였다.

이렇게 수득한 비(非)-ScMET3 유전자 절편을 TA 클로닝에 의해 pCR2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen) 내로 삽입하였다. 비(非)-ScMET3 유전자의 뉴클레오티드 서 열들을 Sanger 방법 (F. Sanger, Science, 214: 1215, 1981) 으로 분석하여 뉴클레오티드 서열을 확인하였다.

실시예 2: 맥주 양조 시험 동안의 비(非)- ScMET3 유전자의 발현 분석

라거 양조 효모인 사카로마이세스 파스토리아누스 Weihenstephan 34/70 균주를 사용하여 맥주 양조 시험을 수행하고, 이어서 발효 동안에 맥주 효모 균체로부터 추출한 mRNA 를 DNA 마이크로어레이로 검출하였다.

맥아즙 (wort) 추출물 농도 12.69%

맥아즙 함량 70 L

맥아즙에 용해된 산소 농도 8.6 ppm

발효 온도 15 ℃

효모 주입 12.8 x 10⁶ 개 세포/mL

상기 발효주를 시간에 따라 표본추출하고, 효모 성장의 양 (도 1) 및 겉보기 추출물 농도 (도 2) 의 시간에 따른 변화를 관찰하였다. 동시에, 효모 균체를 표본추출하고, 준비된 mRNA 를 일본 특허 출원 공개공보 제 2004-283169 호에 기재된 바와 같이 비오틴으로 표지하여 이를 맥주 효모 DNA 마이크로어레이에 혼성화하였다. GCOS; GeneChip Operating Software 1.0 (Affymetrix Co. 제조) 을 사용하여 신호를 검출하였다. 비(非)-ScMET3 유전자의 발현 패턴은 도 3 에 나타나 있다. 그 결과, 일반적인 맥주 발효에서 비(非)-ScMET3 유전자가 발현된 것이 확인되었다.

실시예 3: 비(非)- ScMET3 유전자의 구성적 발현

실시예 1 에 기재된 비(非)-ScMET3/pCR2.1-TOPO 를 제한효소들인 SacI 및 NotI 로 절단하여 비(非)-ScMET3 유전자가 포함된 DNA 절편을 제조하였다. 상기 절편을 제한효소 SacI 및 NotI 로 처리한 pUP3GLP2 에 연결하여, 비(非)-ScMET3 구성적 발현 벡터인 pUP-nonScMET3 을 구축하였다. 효모 발현 벡터인 pUP3GLP2 는 상동성 재조합 부위에 오로티딘-5-인산 탈탄산효소 유전자 URA3 을 갖는 YIp 형 (염색체 통합형) 효모 발현 벡터이다. 상기 도입된 유전자는 글리세릴알데히드-3-인산 탈수소효소 유전자인 TDH3 의 프로모터 및 종결자에 의해 구성적으로 발현되었다. 갈락토키나아제 GAL1 의 프로모터 및 종결자의 제어 하에 효모용 선별 마커로서의 약물-저항성 유전자 YAP1 을 도입하였는데, 이에 의해 발현은 갈락토오스가 함유된 배양 배지에서 유도된다. 대장균 (E. coli) 용의 선별 마커로서의 암피실린-저항성 유전자 Amp^r 도 역시 포함되었다.

상기 방법으로 제조된 구성적 발현 벡터를 사용하여, 일본 특허 출원 공개공보 제 07-303475 호에 기재된 방법에 따라 사카로마이세스 파스토리아누스 Weihenstephan 34/70 균주를 형질전환시켰다. 균체 내에 아황산염이 축적되어 있는 경우 효모 자체가 아황산염에 의해 손상되기 때문에 비(非)-ScMET3 유전자에 대한 올바른 평가가 수행될 수 없다. 따라서, 먼저, 일본 특허 출원 공개공보 제 2004-283169 호에 기재된 방법에 따라 아황산염 유출 펌프를 인코딩하는 비(非)-ScSSU1 유전자가 고도 발현되는 균주를 제조하였다. 그 후, 상기 수득한 균주를 모균주로 사용하고, 이를 pUP-비(非)-ScMET3 로 형질전환하였다. 1.0 mg/L 세룰레닌이 함유된 YPGal 플레이트 배지 (1% 효모 추출물, 2% 폴리펩톤, 2% 갈락토오스, 2% 한천) 에서 세룰레닌-저항성 균주들을 선별하였다.

실시예 4: 맥주 양조 시험 동안 생성된 아황산염의 양 분석

모 균주, 및 실시예 3 에서 수득한 비(非)-ScMET3-고도 발현 균주들 (2 개 균주) 을 사용하여 하기 조건 하에 맥주 양조 시험을 수행하였다.

맥아즙 추출물 농도 11.96%

맥아즙 함량 1 L

맥아즙에 용해된 산소 농도 약 10 ppm

발효 온도 15 ℃, 항온

효모 주입 맥아즙 1 L 당 젖은 효모 세포 6 g

상기 발효액을 시간에 따라 표본추출하여, 시간에 따른 세포 성장 (OD660) (도 4) 및 당 소비 (도 5) 를 관찰하였다. 산성 조건 하에서의 증류 및 알칼리로의 적정에 의해 과산화수소 용액 중에서 아황산염을 수집하여 발효 완료 시의 아황산염 함량을 정량하였다(Revised BCOJ Beer Analysis Method, 일본양조협회).

발효 완료 시에 생성된 아황산염의 양에 있어서, 모 균주가 25.4 ppm 을 생성한 반면, 비(非)-ScMET3-고도 발현 균주들은 각각 32.3 ppm 및 33.8 ppm 을 생성하였다(도 6). 따라서, 비(非)-ScMET3 의 고도 발현에 의해 아황산염의 생성량의 약 30 % 가 증가될 수 있는 것으로 나타났다. 이들 경우, 성장 속도 및 추출물 소비 속도에 있어서 모 균주 및 구성적 발현 균주 간 차이가 거의 없었다.

상기 결과로부터 인식할 수 있듯이, 아황산염 생성 능력이 강화된 효모에서 본원에 기재된 바와 같은 라거 양조 효모에 유일한 술페이트 아데닐전이효소를 구성적으로 발현시킴에 의해, 발효 절차 또는 시간을 변경시키지 않고 맥주와 같은 알콜성 음료에 있어서 항산화제로서 기능하는 아황산염의 생성량을 특이적으로 증가시키는 것이 가능해졌다. 따라서, 풍미가 강화되고 저장 수명이 긴 (품질이 우수한) 알콜성 음료를 제조할 수 있다.

실시예 5: 황 공급원이 적게 함유된 맥아즙을 이용한 맥주 양조 시험

실시예 3 에서 제조한 고도 발현 벡터를 이용하여 사카로마이세스 파스토리아누스 Weihenstephan 34/70 균주를 형질전환하여, Sc 및 비(非)-ScMET3 (단독) 고도 발현 균주들을 각각 수득한다. 그 후, 황 공급원이 적게 함유된 맥아즙으로서 맥아 비율이 24% 인 맥아즙을 제조한다. 이어서, 모 균주 및 수득된 고도 발현 균주를 사용하여, 하기 조건 하에서 맥주 양조 시험을 수행한다.

맥아즙 추출물 농도 13%

맥아즙 함량 2 L

맥아즙에 용해된 산소 농도 약 8 ppm

발효 온도 15 ℃, 항온

효모 주입 맥아즙 2 L 당 젖은 효모 세포 10.5 g

상기 발효액을 시간에 따라 표본추출하여, 시간에 따른 세포 성장 (OD660) 및 당 소비를 관찰한다.

실시예 6: MET3 유전자의 파괴

문헌 (Goldstein 등, yeast. 15 1541 (1999)) 에 따라, 주형으로서 약물-저항성 마커 (pFA6a (G418 ^r ) 또는 pAG25 (nat1)) 가 포함된 플라스미드를 사용한 PCR 을 수행하여 MET3 유전자 파괴용 절편을 제조한다.

제조된 상기 유전자 파괴용 절편을 이용하여, W34/70 균주 또는 포자 (spore) 클로닝 균주 (W34/70-2) 를 형질전환한다. 상기 형질전환은 일본 특허 출원 공개공보 제 H07-303475 호에 기재된 방법에 따라 수행한다. 선별을 위한 약물의 농도는, 각각 제네티신에 있어서는 300 mg/L 및 노르세오트리신 (nourseothricin) 에 있어서는 50 mg/L 이다.

실시예 7: 맥주 양조 시험시에 생성된 황 함유 화합물의 양 분석

모 균주 및 실시예 6 에서 수득한 유전자-파괴 균주를 사용하여, 하기 조건 하에서, 맥주 양조 시험을 수행한다.

맥아즙 추출물 농도 13%

맥아즙 함량 2 L

맥아즙에 용해된 산소 농도 약 8 ppm

발효 온도 15 ℃, 항온

효모 주입 맥아즙 2 L 당 젖은 효모 세포 10.5 g

상기 발효액을 시간에 따라 표본추출하여, 시간에 따른 세포 성장 (OD660) 및 당 소비를 관찰한다. 헤드-스페이스 기체 크로마토그래피를 이용하여 배양액 중의 황 함유 화합물에 대한 분석을 수행한다.

본 발명의 알콜성 음료의 제조 방법에 따르면, 생성물 중의 항산화 작용을 가진 아황산염의 함량의 증가로 인해, 풍미가 강화되고 저장 수명이 긴 (품질이 우수한) 알콜성 음료를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 효모는 황 공급원으로서의 황산염 이온을 효율적으로 감소시켜 성장에 필요한 황-함유 화합물을 합성할 수 있어, 황 함유 아미노산의 함량이 낮은 원료, 예컨대, 유탄산주 (happoushu) 맥아즙을 사용하여 바람직한 알콜성 발효를 수행할 수 있다. 나아가, 이취로서의 황 함유 화합물이 고도 생성되는 효모에서 상기 유전자의 발현을 억제함으로써, 바람직한 풍미를 가진 알콜성 음료를 제조할 수 있다.

본 출원은 2005 년 8 월 12 일 제출된 일본 특허 출원 제 2005-235011 호 및 2006 년 3 월 23 일 제출된 일본 특허 출원 제 2006-84289 호에 대한 우선권을 주장하며, 이들의 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조 병합된다. 상기 인용된 모든 기타 참조문헌들 또한 그들의 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조 병합된다.

<110> Suntory Limited <120> Sulfate adenylyltransferase gene and use thereof <130> PCT06-0071 <150> JP2005-235011 <151> 2005-08-12 <150> JP2006-84289 <151> 2006-03-24 <160> 4 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1557 <212> DNA <213> yeast <400> 1 atgcctgctc ctcacggtgg tgttttacaa gacttggtcg ctagagatgc gtcaaagaag 60 aaagaactgt tagccgaagc ccaatcttca gacatcttag tgtggaactt aaccccaaga 120 caactctgtg atattgaatt gattttgaat ggtgggtttt ctccactaac tggcttcttg 180 aacgaaaatg attactccac agtcgttaca gactcgagat tagcagacgg cacactatgg 240 actattccta ttacactgga cgtcgatgaa tcattcgcaa accaaataaa acctgacaca 300 agaattgccc tataccaaga tgatgaaatt cctattgcta tcatctcagt ccaggacgtt 360 tataagccaa acaagtctat cgaagctgaa aaggtcttca gaggtgatcc tgaacatcct 420 gctatcaact acttgtttaa cgaagctggt gaatattacg ttggtggttc attagaggcc 480 attcaattac ctcaacatta tgactaccca ggcttacgta aaaccccagc tcaattgaga 540 ttggaattcc aatcaagaca atgggaccgt gtcgtcgcct tccaaactcg taacccaatg 600 cacagagccc acagagagct gaccgttaga gccgctagag aagctaatgc taaggtcttg 660 attcatccag ttgtcgggtt gactaaaccg ggtgatatcg atcaccatac ccgtgttcgc 720 gtctaccaag aaatcatcaa acgttatcct aacggtatag ccttcttgtc cttgttgcca 780 ttagcaatga gaatgagtgg tgacagagaa gctgtatggc atgcgattat cagaaaaaat 840 tatggtgctt cccacttcat cgttggtaga gatcatgcag gcccaggttc gaactccaag 900 ggtgtcgatt tctatggccc atatgatgcg caagagttgg ttgaatccta caagcatgaa 960 ttggatatcg aagtggttcc atttagaatg gtaacctact taccagatga agatcgttat 1020 gctccaattg accaaattga caccacaaag acaaaaactt tgaacatctc aggtacagaa 1080 ttaagacgcc gcttaagagt tggtggtgaa atccctgaat ggttttcata tcctgaagtg 1140 gttaaaatct tgagagagtc aaatccacca agacccaagc aggggttcgc cattgtccta 1200 ggtgagtccc taaccgtttc acgtgaacaa ttatcgatcg ccttattatc aacattctta 1260 caattcggtg gtggcagata ctataagatc ttcgagcatg acaataaaac tgaattactg 1320 tctttgattc cagattttat tggttctggt tctggtttaa ttattccaaa ccaatgggaa 1380 agtgaaaagg actctattgc tggcaaacaa aacatttacc tattagactc atctagctca 1440 gctgatatca agctagaatc aagtaacgaa ttaatttcac atattttcaa aaagtcgttt 1500 atggcagata ctataagatc ttcgagcatg acaataaaac tgaattactg tctttga 1557 <210> 2 <211> 518 <212> PRT <213> yeast <400> 2 Met Pro Ala Pro His Gly Gly Val Leu Gln Asp Leu Val Ala Arg Asp 1 5 10 15 Ala Ser Lys Lys Lys Glu Leu Leu Ala Glu Ala Gln Ser Ser Asp Ile 20 25 30 Leu Val Trp Asn Leu Thr Pro Arg Gln Leu Cys Asp Ile Glu Leu Ile 35 40 45 Leu Asn Gly Gly Phe Ser Pro Leu Thr Gly Phe Leu Asn Glu Asn Asp 50 55 60 Tyr Ser Thr Val Val Thr Asp Ser Arg Leu Ala Asp Gly Thr Leu Trp 65 70 75 80 Thr Ile Pro Ile Thr Leu Asp Val Asp Glu Ser Phe Ala Asn Gln Ile 85 90 95 Lys Pro Asp Thr Arg Ile Ala Leu Tyr Gln Asp Asp Glu Ile Pro Ile 100 105 110 Ala Ile Ile Ser Val Gln Asp Val Tyr Lys Pro Asn Lys Ser Ile Glu 115 120 125 Ala Glu Lys Val Phe Arg Gly Asp Pro Glu His Pro Ala Ile Asn Tyr 130 135 140 Leu Phe Asn Glu Ala Gly Glu Tyr Tyr Val Gly Gly Ser Leu Glu Ala 145 150 155 160 Ile Gln Leu Pro Gln His Tyr Asp Tyr Pro Gly Leu Arg Lys Thr Pro 165 170 175 Ala Gln Leu Arg Leu Glu Phe Gln Ser Arg Gln Trp Asp Arg Val Val 180 185 190 Ala Phe Gln Thr Arg Asn Pro Met His Arg Ala His Arg Glu Leu Thr 195 200 205 Val Arg Ala Ala Arg Glu Ala Asn Ala Lys Val Leu Ile His Pro Val 210 215 220 Val Gly Leu Thr Lys Pro Gly Asp Ile Asp His His Thr Arg Val Arg 225 230 235 240 Val Tyr Gln Glu Ile Ile Lys Arg Tyr Pro Asn Gly Ile Ala Phe Leu 245 250 255 Ser Leu Leu Pro Leu Ala Met Arg Met Ser Gly Asp Arg Glu Ala Val 260 265 270 Trp His Ala Ile Ile Arg Lys Asn Tyr Gly Ala Ser His Phe Ile Val 275 280 285 Gly Arg Asp His Ala Gly Pro Gly Ser Asn Ser Lys Gly Val Asp Phe 290 295 300 Tyr Gly Pro Tyr Asp Ala Gln Glu Leu Val Glu Ser Tyr Lys His Glu 305 310 315 320 Leu Asp Ile Glu Val Val Pro Phe Arg Met Val Thr Tyr Leu Pro Asp 325 330 335 Glu Asp Arg Tyr Ala Pro Ile Asp Gln Ile Asp Thr Thr Lys Thr Lys 340 345 350 Thr Leu Asn Ile Ser Gly Thr Glu Leu Arg Arg Arg Leu Arg Val Gly 355 360 365 Gly Glu Ile Pro Glu Trp Phe Ser Tyr Pro Glu Val Val Lys Ile Leu 370 375 380 Arg Glu Ser Asn Pro Pro Arg Pro Lys Gln Gly Phe Ala Ile Val Leu 385 390 395 400 Gly Glu Ser Leu Thr Val Ser Arg Glu Gln Leu Ser Ile Ala Leu Leu 405 410 415 Ser Thr Phe Leu Gln Phe Gly Gly Gly Arg Tyr Tyr Lys Ile Phe Glu 420 425 430 His Asp Asn Lys Thr Glu Leu Leu Ser Leu Ile Pro Asp Phe Ile Gly 435 440 445 Ser Gly Ser Gly Leu Ile Ile Pro Asn Gln Trp Glu Ser Glu Lys Asp 450 455 460 Ser Ile Ala Gly Lys Gln Asn Ile Tyr Leu Leu Asp Ser Ser Ser Ser 465 470 475 480 Ala Asp Ile Lys Leu Glu Ser Ser Asn Glu Leu Ile Ser His Ile Phe 485 490 495 Lys Lys Ser Phe Met Ala Asp Thr Ile Arg Ser Ser Ser Met Thr Ile 500 505 510 Lys Leu Asn Tyr Cys Leu 515 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 ctgtttccca caattgctgt 20 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 tcaaagacag taattcagtt ttat 24

Claims (23)

1. 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

   (a) 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

   (b) 서열번호:2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

   (c) 술페이트 아데닐전이효소 활성을 가지며 서열번호:2 의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

   (d) 술페이트 아데닐전이효소 활성을 가지며 서열번호:2 의 아미노산 서열과의 일치성이 60% 이상인 아미노산 서열을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드;

   (e) 엄격한 조건 하에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 술페이트 아데닐전이효소 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드; 및

   (f) 엄격한 조건 하에서 서열번호: 2 의 아미노산 서열의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하며 술페이트 아데닐전이효소 활성을 가진 단백질 을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.
2. 제 1 항에 있어서, 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

   (g) 서열번호: 2 의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하거나, 또는 서열번호: 2 의 아미노산 서열에서 1 내지 10 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 이 때 상기 단백질이 술페이트 아데닐전이효소 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드;

   (h) 서열번호: 2 의 아미노산 서열과의 일치성이 90% 이상이고 술페이트 아데닐전이효소 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

   (i) 서열번호: 1 에 혼성화하거나 또는 엄격한 조건하에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 혼성화하며, 술페이트 아데닐전이효소 활성을 가진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
3. 제 1 항에 있어서, 서열번호: 1 로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.
4. 제 1 항에 있어서, 서열번호: 2 로 이루어진 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 폴리뉴클레오티드.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 인 폴리뉴클레오티드.
6. 하기로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드:

   (j) 제 5 항에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;

   (k) RNAi 효과를 통해 제 5 항에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;

   (l) 제 5 항에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 전사물을 특이적으로 절단하는 활성을 가진 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

   (m) 공동-억제 효과를 통해 제 5 항에 따른 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현을 억제하는 RNA 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 단백질.
8. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터.
9. 제 6 항의 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터.
10. 제 8 항 또는 제 9 항의 벡터를 포함한 효모.
11. 제 10 항에 있어서, 제 8 항의 벡터를 도입함에 의해 아황산염-생성 능력이 강화된 효모.
12. 제 9 항의 벡터를 도입함에 의해, 또는 제 5 항의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 에 관련된 유전자를 파괴함에 의해 제 5 항의 폴리뉴클레오티드 (DNA) 의 발현이 억제된 효모.
13. 제 10 항에 있어서, 제 7 항의 단백질의 발현 수준을 증가시킴에 의해 아황산염-생성 능력이 증가된 효모.
14. 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 효모를 배양하는 것을 포함하는, 알콜성 음료의 제조 방법.
15. 제 14 항에 있어서, 양조된 알콜성 음료가 맥아 음료인 알콜성 음료의 제조 방법.
16. 제 14 항에 있어서, 양조된 알콜성 음료가 와인인 알콜성 음료의 제조 방법.
17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 알콜성 음료.
18. 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 술페이트 아데닐전이효소 유전자의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 고안된 프라이머 또는 탐침자 (probe) 를 사용하는 것을 포함하는, 시험 효모의 아황산염-생성 능력 평가 방법.
19. 하기를 포함하는 시험 효모의 아황산염-생성 능력 평가 방법: 시험 효모를 배양함; 및 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 술페이트 아데닐전이효소 유전자의 발현 수준을 측정함.
20. 하기를 포함하는, 효모의 선별 방법: 시험 효모를 배양함; 제 7 항에 따른 단백질을 정량하거나 또는 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 술페이트 아데닐전이효소 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 표적 아황산염 생성 능력에 따른 상기 단백질의 양 또는 상기 유전자 발현 수준을 갖는 시험 효모를 선별함.
21. 제 20 항에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 서열번호: 1 의 뉴클레오티드 서열을 가진 술페이트 아데닐전이효소 유전자의 발현 수준을 측정함; 및 상기 참조 효모에 비해 상기 유전자가 더 높게 또는 더 낮게 발현된 시험 효모를 선별함.
22. 제 20 항에 있어서, 하기를 포함하는 효모의 선별 방법: 참조 효모 및 시험 효모를 배양함; 각 효모에서 제 7 항에 따른 단백질을 정량함; 및 상기 참조 효모에 비해 상기 단백질의 양이 더 많거나 또는 더 적은 시험 효모를 선별함.
23. 하기를 포함하는 알콜성 음료의 제조 방법: 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 효모 또는 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 선별된 효모를 사용하여 알콜성 음료의 제조를 위한 발효를 수행함; 및 아황산염의 생성량을 조절함.

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