JP4900746B2 - 香気成分高生産性酵母 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵母の育種に関し、更に詳細には香気成分のうち特にカプロン酸エチルと酢酸イソアミルの両香気成分を高生産する酵母の育種に関する。また、本発明は、清酒の香気成分であるカプロン酸エチル及び酢酸イソアミルが共に高生成するアルコール飲料又はパンの製造法に関する。
【0002】
【従来の技術】
一般に、香りはアルコール飲料や食品の品質を決定する上で重要な要素となっている。特に清酒醸造において、吟醸香の主要香気成分である酢酸イソアミルとカプロン酸エチルの2つは果実香様の非常に好ましい成分である。従来、酢酸イソアミル高生成酵母、カプロン酸エチル高生成酵母の育種は知られているが、両香気成分を同時に高生成する酵母の育種に成功した例は報告されていない。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
飲食品に香気成分を付与しようとする場合、別途、香気成分を抽出しておきあるいはこれを化学合成しておき、これを飲食品に添加することが広く行なわれている。しかし、抽出には多大なコストを要するし、化学合成した香料は安全性指向や天然物指向の現代の消費者のニーズに必ずしも適合したものではない。
【0004】
本発明は、このような業界の要望に応えるため、特に発酵食品にあって、従来の性質に更に香気成分を高生成する性質を有する酵母の有用性に着目し、しかもそのうえ、重要な香気成分であるカプロン酸エチルと酢酸イソアミルを同時に生成するだけでなく多量に生成する新規な変異酵母を育種し、これを用いて高品質のアルコール飲料やパン類を製造する目的でなされたものである。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記した目的を達成するためになされたものであって、各方面から検討の結果、突然変異処理に着目しただけでなく、その選択方法にも着目した。そして、酵母を変異処理した後、セルレニンと5,5,5−トリフルオロ−DL−ロイシンの双方を含有した培地で培養したところ、全く予期せざることに、コロニーが生成しただけでなく、生じたコロニー中にカプロン酸エチルと酢酸イソアミルの双方を同時に生成し且つそれらを多量に生成する変更酵母が多数存在するという新規にして有用な知見を得た。
【0006】
そして更に、このようにして育種、分離した酵母を用い、常法にしたがって清酒、パン等の発酵食品を製造したところ、香気にすぐれ、高品質の製品が得られることもはじめて確認し、これらの新知見に基づき更に研究を行い、遂に本発明の完成に至ったものである。
以下、本発明について詳述する。
【0007】
本発明を実施するには、酵母を変異処理した後(自然変異も包含される)、セルレニン及びロイシンアナログ含有選択培地を用いて培養し、生育した菌株(つまり、セルレニン及びロイシンアナログの双方に耐性を有する菌株)から、カプロン酸エチル及び酢酸イソアミルの双方を高生成する菌株をスクリーニングすればよい。
【0008】
選択の具体的態様としては、はじめにセルレニン含有培地を用いてセルレニン耐性菌を得た後、次にロイシンアナログ含有培地を用いてロイシンアナログ耐性菌を得(あるいはその逆の処理によって)、両方の薬剤に耐性を有する菌株を選択することにより、目的とする香気成分高生成酵母、すなわちカプロン酸エチル及び酢酸イソアミルを同時に高生成する酵母を得ることができる。また、選択培地としては、セルレニンとロイシンアナログの双方を含有した培地も使用可能であり、その場合は一度の処理で目的酵母を得ることができる。
【0009】
本発明において変異酵母を得るには変異方法としては、いかなる方法でも良い。変異の物理的方法としては、紫外線照射、放射線照射などがあり、化学的方法としては、変異剤、例えば、エチルメタンスルホネート、N−メチル−N−ニトログアニジン、亜硝酸、アクリジン系色素などの溶液に懸濁させる変異方法がある。また、取得頻度は低くなるが、自然変異においても目的とする変異酵母を取得することができる。
【0010】
本発明においては、これらの変異方法が適宜使用できるが、変異酵母の選別に特色を有するものであって、選択培地としてセルレニン含有培地、ロイシンアナログ含有培地、又は両薬剤含有培地を使用し、両薬剤耐性酵母を選別する必要がある。したがって、両薬剤を同時に含有した培地を使用する場合には、両薬剤耐性菌を1回の操作で得ることが可能であるが、1種類の薬剤を含有する培地を使用する場合には、セルレニン耐性菌を得た後、ロイシンアナログ耐性菌を得ること(あるいはこの順序を逆にすることも可能である)が必要であり、2回の操作を必要とする。なお、これらの選択処理は、必要に応じてくり返したり、選択培地の組み合わせを自由に変更したりすることが可能である。
【0011】
はじめに、セルレニン含有培地を用いるカプロン酸エチル高生成酵母の育種について述べる。本発明者らは、カプロン酸エチル生成の律速がカプロン酸であることを見出し、脂肪酸合成酵素に変異を有し、カプロン酸の量が多い変異酵母を新規に育種する方法を検討した結果、セルレニン含有培地を使用することにより、カプロン酸を多量に生成する変異酵母を選択することに成功し、そのうえ更に、この変異酵母を用いることにより、香りの高いアルコール飲料等を製造することにも成功した。
【0012】
セルレニンは脂肪酸合成酵素を阻害する抗生物質として知られており、セルレニンに対して耐性を獲得したということは脂肪酸合成酵素もしくはその機能に変化が生じたということを意味している。
そこで、このセルレニン耐性株の性質を検討したところ、カプロン酸を含む中級脂肪酸が親株よりも増加した株が多数存在することを見出した。
セルレニンの添加は、固体培養、液体培養のいずれでもよく、10〜100μM、好ましくは15〜35μM、更に好ましくは25μM程度添加して使用するのが好ましい。
また、変異酵母の生育培地に添加する薬剤としてはセルレニンに限定することなく、脂肪酸合成酵素を阻害する他の薬剤で、カプロン酸を高生産させる能力のあるものならいずれでもよい。
処理酵母としては、清酒酵母、焼酎酵母、ビール酵母、ワイン酵母、パン酵母などの何れの酵母でもセルレニン耐性株を得ることが出来る。
【0013】
実施するにあたっては、各種酵母を変異処理した後、セルレニン含有培地に移し、30℃、1週間程度培養して生育した菌株を分離し、これから、カプロン酸をよく生成する酵母を採用すればよい。
ここで得られる変異酵母は、清酒酵母、焼酎酵母、ビール酵母、ワイン酵母、パン酵母のいずれにおいてもカプロン酸をよく生成するようになっているので、これらを用いて清酒、焼酎、ビール、ワイン、パンなどを製造すれば、カプロン酸エチルの多いそれぞれの製品を製造することが出来る。
【0014】
次に、ロイシンアナログ含有培地を用いる酢酸イソアミル高生成酵母の育種について述べる。本発明者らは、酢酸イソアミル生成の律速がイソアミルアルコールであることを見出し、更に次の知見を得た。すなわち、イソアミルアルコールは酵母がロイシンを生合成する経路の途中から生成されるが、ロイシンが蓄積すると、このロイシンによりロイシン生合成経路が阻害されるので、イソアミルアルコールの生合成も抑えられることになる。そこで、本発明者らは、ロイシンが蓄積してもロイシン生合成経路が阻害しない突然変異株を求め、鋭意検討した結果、ロイシンアナログ含有培地を使用することにより、酢酸イソアミル、イソアミルアルコール等の香気成分を多量に生成する変異酵母を選択することに成功し、そのうえ更に、この変異酵母を用いることにより、芳香性豊かなアルコール飲料又はパン類等を製造することに成功した。
【0015】
この方法を実施するにあたっては、上記したセルレニン耐性酵母の育種と同様の方法を行なえばよいが、選別培地に5,5,5−トリフルオロ−DL−ロイシンを含有させなければならない。5,5,5−トリフルオロ−DL−ロイシンは固体培地、例えばYNB寒天培地には0.01〜10mM、好ましくは0.5〜5mM、更に好ましくは1mM程度添加しておけば十分である。
また、変異酵母の選択培地に添加する薬剤としては5,5,5−トリフルオロ−DL−ロイシンに限定することなく、ロイシンアナログであって、イソアミルアルコール、酢酸イソアミルを増加させる事のできるものならば何でも良い。
処理酵母は上に述べたのと同様に、いずれの酵母でもよい。
【0016】
目的酵母を育種するには、各種酵母は、変異処理された後、5,5,5−トリフルオロ−DL−ロイシン含有固体培地に添加され、30℃で2日間程度培養して、生じたコロニーを分離し、これからイソアミルアルコールおよび酢酸イソアミルをよく生成する酵母を採用すればよい。
ここに得られる酵母は酢酸イソアミルをよく生成するので、上記いずれの酵母においてもそれぞれ芳香豊かなアルコール類又はパンを製造することが出来る。
【0017】
本発明に係る酵母を育種するには、セルレニン耐性酵母又はロイシンアナログ耐性酵母のように片方の薬剤のみに耐性を有する酵母を選択するだけでは不十分であって、双方の薬剤に耐性を有する酵母を選択することが必要である。
【0018】
これら2種類の変異について、例えばセルレニン耐性をつけた酵母にさらに変異処理を行ない、例えば5,5,5−トリフルオロ−DL−ロイシン耐性をさらに付与してもよく、また、逆に例えば5,5,5−トリフルオロ−DL−ロイシン耐性をつけた酵母にさらに変異処理を行い、例えばセルレニン耐性を付与してもよい。もちろん、変異酵母に対して、5,5,5−トリフルオロ−DL−ロイシンとセルレニンを両方含有する培地で培養し、両薬剤耐性を有する酵母を選択することもできる。
【0019】
また、別の方法として、5,5,5−トリフルオロ−DL−ロイシン耐性変異株と、セルレニン耐性変異株を得た後に、それぞれの薬剤耐性変異株について四分子分離を行い、それぞれの薬剤に対する耐性を持った胞子を得て、それらを接合させて両耐性を持つ二倍体を得るという方法もある。もちろん、それぞれの薬剤耐性変異株を取得する時に、それぞれ接合型の異なった一倍体を用いてそれぞれの薬剤に耐性を持つ変異株を取得し、後に接合して二倍体を作成するという方法も可能である。
【0020】
その他最終的にセルレニン等の薬剤耐性と5,5,5−トリフルオロ−DL−ロイシン等の薬剤耐性を併せ持つ変異株が取得できれば、その方法に限定はない。醸造特性などを考慮すると、取得する変異株は二倍体の方が好ましいと考えられるが、一倍体でも構わない。
【0021】
処理酵母としては、サッカロマイセス(Saccharomyces)属に属する酵母であればすべての酵母が使用可能であり、例えば、清酒酵母(協会7号酵母、協会9号酵母、協会10号酵母等)、焼酎酵母(日本醸造協会焼酎用2号酵母等)、ワイン酵母(ブドウ酒1号酵母(日本醸造協会ブドウ酒1号酵母)、ブドウ酒3号酵母、ブドウ酒4号酵母等)、ビール酵母、パン酵母等の実用酵母、その他アルコール発酵に常用される酵母を含めサッカロマイセス(Saccharomyces)属に属する酵母であればすべての酵母が使用でき、いずれの酵母でも目的とする耐性を得ることができる。
【0022】
このようにして目的としたカプロン酸エチル及び酢酸イソアミルの双方を高生成する酵母を取得することができ、その内のひとつをK1001−350と命名して、これを産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所にFERM P−18066として寄託した。
【0023】
本発明により育種、分離された香気成分高生成変異株を使用することによって、カプロン酸エチル、酢酸イソアミルその他の香気成分が多く、高品質のアルコール飲料、パンを製造することができる。本発明において、アルコール飲料としては、清酒、焼酎、ブランデー、ビール、発泡酒、ブドウ酒その他のアルコールを含有した飲料がすべて包含される。
【0024】
本発明に係る新規変異酵母は、香気成分生成能が高く、香気成分中でも特に、カプロン酸エチルと酢酸イソアミルの双方を同時に高めた製品を得ることができ、清酒もろみの場合、カプロン酸エチルを2.5ppm以上、好ましくは3.5ppm以上、それと同時に、酢酸イソアミルを4ppm以上、好ましくは7ppm以上、更に好ましくは9ppm以上含有する製品を得ることができる。
【0025】
【実施例1】
5,5,5−トリフルオロ−DL−ロイシン及びセルレニン耐性株
日本醸造協会10号泡無し酵母(以下K−1001と略記する)をYM培地(酵母エキス0.3%、麦芽エキス0.3%、ポリペプトン0.5%、グルコース5%)5mlに植菌し、一日振盪培養した後、これを遠心分離し、2%グルコース0.2Mリン酸緩衝液で洗浄し、遠心分離した。この洗浄菌体に0.2Mリン酸バッファー(pH8.0)4.5ml、40%グルコース0.25ml、エチルメタンスルホネート0.25mlを加え、30℃で30分から45分ゆっくりと撹拌しながら変異処理を行い、2%グルコース0.2Mリン酸緩衝液で洗浄した菌体を5,5,5−トリフルオロ−DL−ロイシン190ppm、セルレニン1ppmを含む0.67%Difco yeast nitrogen base W/O amino acids、2%グルコース、2%寒天培地で30℃、4〜10日培養後、生育してきたコロニーを選抜した。
【0026】
これらの株について総米150g(アルコール脱水麹35g、アルコール脱水α米115g、汲水270g)の一段仕込み15℃一定の条件で小仕込試験を行い、目的株を選抜した。このようにして得た変異株のうち、好適なものの一つであるK1001−350株を産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所にFERM P−18066として寄託した。
【0027】
【実施例2】
実地での仕込み試験
得られたK1001−350株を用いて実地での仕込み試験を行った。総米500kg、麹歩合20%、汲水歩合123%の三段仕込みで酒母歩合は6%、酒母は高温糖化もとを用いた。使用した米は60%精白の五百万石で、吟醸仕込みを行った。対照株としてK−1001を用いた。
【0028】
その結果、K1001−350の醗酵経過は対照のK−1001号酵母と遜色なく推移した。また、アミノ酸度、滴定酸度は対照もろみと比較してほとんど変わらなかった(表1)。香気成分としては、イソアミルアルコール及び酢酸イソアミルが対照の2〜3倍、カプロン酸エチルは約2倍で、両成分とも有意に高く、付与されたトリフルオロロイシン耐性とセルレニン耐性が吟醸仕込みにおいても期待通りの役割を果たしていることが判明した(表2)。
【0029】
【0030】
【0031】
【実施例3】
パンの製造
市販パン酵母及びK1001−350株を使用して、表3に示す配合でパンを製造した。表3の配合に、培養酵母を、湿菌体重量として2g加え、30℃で4時間醗酵させた後、このパン生地を、180℃のオーブンで25分間焼き、パンを製造した。
【0032】
本発明に係る香気高生産性酵母をイーストとして製造した食パンは、市販酵母を用いて製造した食パンに比べ、特に香気が増強され、官能的に明らかな相違が認められた。そこで市販の食パンとの官能検査を20名のパネラーによって行い、下記のような結果を得た(表4)。
【0033】
【0034】
【0035】
上記の結果から明らかなように、本発明の酵母を用いた食パンの方が好まれ、本発明の酵母使用による効果がパンにおいても奏されていることが確認された。
【0036】
【発明の効果】
5,5,5−トリフルオロ−DL−ロイシン耐性とセルレニン耐性の両方を持つ株を取得することにより、清酒の吟醸香の主成分であるカプロン酸エチル、酢酸イソアミルが共に親株より顕著に高い株を取得することが出来た。また、醸造試験により、カプロン酸エチル、酢酸イソアミルが共に親株より顕著に高い清酒を製造することができた。パンの製造においても市販のパンに比べて香味の増加したパンを製造することができた。
Claims (2)
- 清酒酵母、焼酎酵母、ビール酵母、ワイン酵母、パン酵母に属する少なくともひとつの二倍体酵母を1回変異処理した後、セルレニン1ppm及び5,5,5−トリフルオロ−DL−ロイシン190ppmを含有する培地を用いて30℃で培養し、香気成分のうちカプロン酸エチルと酢酸イソアミルの双方を多く生成する二倍体酵母を1回の操作で選択すること、を特徴とする香気成分高生産性酵母の育種方法。
- 請求項1に記載の方法によって育種、分離された、カプロン酸エチルと酢酸イソアミルの双方を高生産する香気成分高生産性酵母K1001−350(FERM P−18066)。
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