JPH0956374A - 新規サッカロミセス・セレビシエおよびその分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 清酒酵母より各種呈味性成分の生産性が改変
された変異株を分離し、従来製品と異なる呈味成分バラ
ンスを有する清酒を製造する。 【構成】 酵母サッカロミセス・セレビシエに属し、多
剤耐性を示す清酒醸造用酵母を選抜し、さらにその中か
ら有機酸、グリセロール等の呈味成分生産性に変異を有
する株を選別し、これらを用いて従来製品と異なる酒質
の清酒を安定的に製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、サッカロミセス・
セレビシエに属し、多剤耐性を示す清酒醸造用酵母の優
良株、その分離方法、および該酵母を用いて製造される
香味良好な清酒に関する。

【０００２】

【従来の技術】清酒の品質は香りと並び、その味によっ
て大きく左右される。そのことからこれまでにその呈味
の改変は種々試みられてきた。清酒における呈味成分と
しては、糖、有機酸、アミノ酸、ペプチド、その他種々
の成分がこれまでに同定、確認されている。特にその製
品の品質を大きく左右する甘味、酸味の改変は代表的な
開発目標として注力して研究されてきた。清酒中の酸味
は、清酒の濃淡と密接に関わっており、また、清酒醪中
の有機酸は主に酵母によって生産されることや、税法
上、添加物などが厳しく制限されている清酒醸造法を大
きく変えることなく製品酒の酒質を改変できることか
ら、その方法として有機酸生産性変異酵母を用いて清酒
醸造を行う方法が最有力な方法としてこれまでに試みら
れた。一方、甘味成分はその製品の「コク」とも密接に
関わっていると言われ、その「コク」は近年、一つの開
発目標となっている「低アルコール清酒」開発の点から
も注目されている。

【０００３】各種有機酸は同じ酸味でもそれぞれ微妙に
異なる呈味を持つ。例えばリンゴ酸は有機酸の中でも官
能的に「すっきりとした」、「後味の軽い」と評価さ
れ、コハク酸は「苦い」、「くどい」などと評価されて
いる（醸協 ７２巻 ８０１頁１９７７年）。このよう
に、リンゴ酸が良好な評価を受けていたことから、これ
までにリンゴ酸高生産酵母の分離が積極的に行われた。
これまでにリンゴ酸含量の高い清酒を得る方法として、
メチルアミン耐性株を用いる方法（特開昭６３−２２６
２７４号公報）、ジメチルコハク酸感受性株を用いる方
法（特開平３−１７５９７５号公報）、あるいはシクロ
ヘキシミド耐性株を用いる方法（醸協 ８８巻 ６４５
頁 １９９３年，醸協 ８９巻 ６４７頁 １９９４
年）、テノイルトリフルオロアセトンまたはオキシカル
ボキシン耐性株を用いる方法（特開平６−１２１６７０
号公報）などが知られている。

【０００４】また、清酒醸造上、アルコール添加をしな
いか、もしくは添加量を制限されている特定名称酒（純
米酒や本醸造酒）において淡麗な酒質を設計するため
に、有機酸生産性の低下した酵母を用いて清酒醸造を行
う方法も開発されてきた。有機酸含量の低減した清酒を
得る方法としては、Ｄ−アラニン耐性株を用いる方法
（特開平３−１５３７６号公報）、２，４−ジニトロフ
ェノール耐性株を用いる方法（特開平６−１７８６８２
号公報）、自然分離で得られた株を用いる方法（醸協
８８巻 ５６５頁 １９９３年）などが知られている。

【０００５】一方、清酒中に含まれる甘味成分の一つで
あるグリセロールは、市販酒では、ほぼ０．２〜０．３
５％の範囲に分布しており、添加試験により０．４〜
１．６％の範囲では官能的評価が高まるといわれている
（発酵工学 ６９巻 ２０３頁１９９１年）。このこと
から、グリセロールを高生産する酵母を用いて清酒醸造
を行う方法も開発されてきた。グリセロール含量の高い
清酒を得る方法として、アリルアルコールまたはピラゾ
ールに耐性を持つ株を用いる方法（特開平４ー３５６１
８０号公報）が知られている。このように、従来は、清
酒中の種々の呈味成分を増減させる目的で醸造用優良株
を分離する場合、目的とする呈味成分に応じてその株の
分離法が異なるのが一般的であった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】これまでに開発されて
きた有機酸生成変異株およびグリセロール高生産株の分
離法は、その目的に応じて全く別個に独立して開発され
てきたものであり、しかも、そのほとんどが有機酸生成
系路（ＴＣＡサイクルなど）や糖代謝系路（カタボライ
トレプレッションなど）など、有機酸およびグリセロー
ルを生成する細胞内機能が直接変異を受けた株をそれぞ
れの選抜方法で選抜していた。また、いずれの分離法も
最終スクリーニングの段階で、清酒製造を小規模化した
いわゆる「小仕込試験」をいくつかの候補菌株を用いて
行って製成酒の酒質を判断した後、優良株を選抜してい
る。

【０００７】したがって、各種呈味成分生成能の改変さ
れた酵母を分離する場合、その作業効率の面から、それ
ぞれを個々の方法により分離するよりも、一つの方法に
よって種々の呈味成分生成能の改変された酵母菌株を広
範囲かつ複合的に分離し、その後に小仕込試験を行い、
その製成酒の各種分析を行って優良株を選抜した方が効
率的な場合がある。特にその分離法が薬剤耐性に代表的
な、いわゆるポジティブセレクションであれば、より効
率的である。さらに、清酒醸造において不利益な影響を
与えると考えられる栄養要求性、呼吸欠損性などの形質
を有する酵母菌株をスクリーニング初期において除去で
きれば、清酒醸造用優良酵母を分離、選択する上で有利
である。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは呈味成分含
有量のバランスを改変することで味の良好な清酒を製造
することを目的に検討を開始した。増減目標となる酵母
菌体内で生成される多くの呈味成分は細胞膜を透過して
菌体外に排出される物質であることに着目し検討を重ね
たところ、サッカロミセス属に属する酵母の中から、多
剤耐性を示す株を分離し、これらの酵母の中に官能的に
優れた性質を持つ清酒を醸造する酵母が多種、複合的に
含まれることを見出し、本発明をなすに至った。即ち、
本発明は、多剤耐性を示し、かつ、呈味成分生産能の改
変されたサッカロミセス・セレビシエに属する清酒醸造
用酵母およびその分離方法を提供するものである。

【０００９】本発明における清酒醸造用酵母は、サッカ
ロミセス・セレビシエに属し、機能的、構造的に全く異
なる薬剤に対して同時に耐性を示す表現型を持つ、いわ
ゆる多剤耐性を有し、かつ、呈味成分生産能が改変され
ていれば、特に限定されない。本発明において、呈味成
分生産能が改変されているとは、親株の示す呈味成分生
産能と異なる能力を示すことであり、香気成分の生産能
が変化することも含まれる。呈味成分とは、たとえば、
糖類、有機酸、アミノ酸などを挙げることができる。よ
り具体的に、酵母が生産しうる糖類としては、グリセロ
ールなど、有機酸としては、リンゴ酸、コハク酸、酢酸
など、アミノ酸としては、アルギニン、グルタミン酸な
どを挙げることができる。香気成分とは、たとえば、エ
ステル類、高級アルコールなどを挙げることができる。
より具体的に、酵母が生産しうるエステル類としては、
カプロン酸エチル、酢酸イソアミル、酢酸βーフェネチ
ルなど、高級アルコールとしては、イソアミルアルコー
ル、βーフェネチルアルコール、イソブチルアルコール
などが挙げられる。

【００１０】本発明の上記の性質を有する菌株として
は、具体的な例として、サッカロミセス・セレビシエＫ
９０１−ＰＤＲ１０２（以下、ＰＤＲ１０２と略称す
る）、同Ｋ９０１−ＰＤＲ１０４（以下、ＰＤＲ１０４
と略称する）、同Ｋ９０１−ＰＤＲ１１４（以下、ＰＤ
Ｒ１１４と略称する）が挙げられる。これらの株の一般
的な諸性質（資化性、発酵性、皮膜の形成および薬剤耐
性）を表１に示す。

【００１１】ＰＤＲ１０２、ＰＤＲ１０４、ＰＤＲ１１
４の三株は、いずれも多剤耐性、原栄養性ならびにグリ
セロールの資化性を有し、かつ清酒醪においてアルコー
ルを１５％以上生産できる性質を有する。それぞれをサ
ッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisia
e）Ｋ９０１−ＰＤＲ１０２（ＦＥＲＭ Ｐ−１５１１
６）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces ce
revisiae）Ｋ９０１−ＰＤＲ１０４（ＦＥＲＭ Ｐ−１
５１１７）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomy
ces cerevisiae）Ｋ９０１−ＰＤＲ１１４（ＦＥＲＭ
Ｐ−１５１１８）として工業技術院生命工学工業技術研
究所へ寄託してある。

【００１２】ＰＤＲ１０２株は、親株と比較して、リン
ゴ酸を約１．３倍量生産し、コハク酸を約０．８倍量生
産する。ＰＤＲ１０４株は、親株に比較して、各種有機
酸を低生産する寡酸性を示し、特にリンゴ酸は０．６倍
以下である。また、ＰＤＲ１１４株は、親株に比較し
て、グリセロールを約２倍量高生産する。これらの菌株
は、以下の通り、従来の変異株とは異なるものである。
特開昭６３−３０９１７５号公報には、カプロン酸エチ
ル高生産を目的として、酵母の脂肪酸合成系に変異を起
こさせたセルレニン耐性変異酵母が記載されている。こ
の変異株の選抜方法は、本発明のものとは原理が全く異
なり、本発明の酵母による製成酒中のカプロン酸エチル
濃度も、ＰＤＲ１０２株およびＰＤＲ１０４株では親株
と大差は認められず、ＰＤＲ１０４株では親株よりも含
有濃度が低い。

【００１３】また、これまでに開発されたリンゴ酸高生
産株、寡酸性株、グリセロール高生産株の選抜方法に
は、しばしば特定の薬剤に対する感受性もしくは耐性表
現型を利用したものが少なくない。そこで、これまでに
リンゴ酸高生産株、寡酸性株、グリセロール高生産株の
選抜に用いられた主な薬剤に対する本発明の酵母の感受
性および耐性を表２に示す。上記三菌株は、いずれもメ
チルアミンに耐性を示し、ＰＤＲ１１４株は２，４−ジ
ニトロフェノールに対して耐性を示す。特開昭６３−２
２６２７４号公報には、尿素濃度の低い清酒製造のため
に開発され、それに付随して製成酒のリンゴ酸濃度が親
株で製造した場合よりも高濃度となったメチルアミン耐
性株が開示されている。上記三菌株は、メチルアミンに
耐性を示すが、本発明の酵母の中にはリンゴ酸含量が親
株よりも低い株（ＰＤＲ１０４株）も存在し、その原理
上、本発明とは異なる。特開平６−１７８６８２号公報
には、有機酸含量の低い清酒製造のために開発された
２，４−ジニトロフェノール耐性株が開示されている
が、同薬剤に耐性を持つＰＤＲ１１４株は寡酸性を示さ
ないので、本発明とは異なる。

【００１４】本発明の清酒醸造用酵母は、人為的変異処
理株または自然発生的変異株として、以下の選択方法で
天然の酵母中から選択することにより得ることができ
る。まず、目的とする多剤耐性株の選抜工程に入る前
に、清酒醸造用酵母菌株を他の雑菌から分離することが
好ましく、例えば、適宜の寒天培地において培養してコ
ロニーを形成させる方法が一般的である。ここで用いる
培地は、酵母が生育できる培地であれば限定されず、炭
素源としてグルコース、シュクロース、ガラクトース、
マルトース、グリセロールなどを用い、窒素源としては
硫酸アンモニウム、尿素、リン酸第二水素アンモニウ
ム、アミノ酸などを用い、それに無機塩類およびビタミ
ンを添加したものが挙げられ、具体的には、イーストエ
キス１％、ペプトン２％、グルコース２％からなる培地
（以下、ＹＰＤ培地と略称する）が例示される。ＹＰＤ
培地にアンピシリンやクロラムフェニコールのようにバ
クテリアは死滅させるが酵母を死滅させない薬剤を添加
して酵母菌株の分離に用いれば、バクテリアの混入を防
ぐことができ効率的である。

【００１５】この酵母菌株の分離工程は、後述する多剤
耐性株の選抜工程を兼ねて行うことも可能である。例え
ば、炭素源をグリセロールとし、抗生物質セルレニンを
４ｐｐｍ含む培地および抗生物質シクロヘキシミドを２
ｐｐｍ含む培地をそれぞれ用いて分離・選択する方法は
特に簡便で好ましい方法として挙げられる。なお、通常
サッカロミセス・セレビシエはグリセロールを資化でき
る性質を有する。

【００１６】次に、分離した酵母菌株の中から、機能
的、構造的に全く異なる二種類以上の薬剤に対して耐性
を持つ多剤耐性株を選抜する。使用する薬剤としては、
サッカロミセス・セレビシエの生育を阻害し、死滅させ
る薬剤ならば限定されない。そのような薬剤としてセル
レニン、シクロヘキシミド、アンチマイシン、オリゴマ
イシン、クロトリマゾールなどを用いることができる。
その薬剤の対象酵母に対する最少生育阻止濃度（以下、
ＭＩＣと略称する）以上の濃度を加えた培地を用いて分
離すればよい。たとえば、脂肪酸合成系の阻害剤である
セルレニンと、タンパク質合成系を阻害するシクロヘキ
シミドを使用すると、通常サッカロミセス・セレビシエ
は、ＹＰＤ寒天培地上において、セルレニン濃度３ｐｐ
ｍ以上もしくはシクロヘキシミド濃度１ｐｐｍ以上の存
在下では生育することは出来ない。したがって、本発明
における多剤耐性株は、セルレニンを３ｐｐｍ以上含む
ＹＰＤ寒天培地に生育でき、かつシクロヘキシミドを１
ｐｐｍ以上含有するＹＰＤ寒天培地にも同時に生育でき
る株として分離できる。なお、セルレニンおよびシクロ
ヘキシミドなどの薬剤は高熱により分解する性質を持つ
場合が多いので、培地に加える場合は、培地をオートク
レーブによる滅菌操作後４０℃前後に冷ましてから、薬
剤を適当な溶媒に溶解した溶液にて加える。

【００１７】培地は、通常は寒天培地が好ましいが、既
に酵母菌株が分離されており雑菌混入の恐れがない場合
には液体培地であってもよい。菌株分離時の培養は通常
酵母に用いられる条件でよく、培養温度は一般に２０〜
３５℃、好ましくは３０℃前後、培養日数は１〜７日
間、３日間程度を目安とすると好ましい。この工程で生
育可能である酵母菌株を本発明における多剤耐性株とす
る。薬剤を含み、各種アミノ酸を含まず、かつグリセロ
ールを唯一の炭素源とする培地を用いると、多剤耐性株
の中から醸造上好ましくない栄養要求性株および呼吸欠
損株を同時に取り除くことになり、さらに好ましい。す
なわち、イーストナイトロジェンベース（脱アミノ酸）
（ディフコ社製）０．６７％を窒素源とし、グリセロー
ル４％を唯一の炭素源とする最少培地を寒天２％で固化
したＳＧ寒天培地を薬剤添加用基本培地として用いれ
ば、都合がよい。その際は、上述のセルレニンおよびシ
クロヘキシミドを用いる場合には、栄養条件の違いによ
り、セルレニンおよびシクロヘキシミドの酵母に対する
ＭＩＣが０．４ｐｐｍおよび０．１ｐｐｍにそれぞれ変
化するので、それ以上の量をＳＧ寒天培地に加えて、多
剤耐性株分離用培地とする。

【００１８】上述の順序で選抜工程を行うのが簡便で好
ましいが、先の酵母菌株の分離工程と多剤耐性株の選抜
工程の順序、組み合わせは必ずしも限定されない。要
は、結果として表現型的に、機能、構造が全く異なる二
種類以上の薬剤に対して耐性を持つ、多剤耐性を示す酵
母菌株が単離できればよい、同時に栄養要求性株および
呼吸欠損株が除去できればさらに好ましい。

【００１９】上記の選択手法の具体的一例を以下に示
す。多剤耐性株を含む清酒醸造用酵母の懸濁液をセルレ
ニン０．５ｐｐｍを含むグリセロールを単一炭素源とし
た最少寒天培地である、セルレニン（シグマ社製）０．
５ｐｐｍ、イーストナイトロジェンベース（脱アミノ
酸）（ディフコ社製）０．６７％、グリセロール４％、
寒天２％からなる培地（以下ＳＧ−ＣＥＲ寒天培地と略
称する。）、およびシクロヘキシミド０．２ｐｐｍを含
むグリセロールを単一炭素源とした最少寒天培地であ
る、シクロヘキシミド（シグマ社製）０．２ｐｐｍ、イ
ーストナイトロジェンベース（脱アミノ酸）（ディフコ
社製）０．６７％、グリセロール４％、寒天２％からな
る培地（以下ＳＧ−ＣＹＨ寒天培地と略称する。）にそ
れぞれ塗沫、３０℃で３〜７日間培養してコロニーを生
成させる。それぞれの寒天培地からセルレニン耐性株お
よびシクロヘキシミド耐性株の単一コロニーを分離し、
そうして得られたセルレニン耐性株をＳＧ−ＣＹＨ寒天
培地に、シクロヘキシミド耐性株をＳＧ−ＣＥＲ寒天培
地にそれぞれ植菌、３〜７日間培養し、それらの中から
両薬剤に同時に耐性を示す株を多剤耐性株として選抜す
る。この工程により、呼吸能および原栄養性を保有し、
かつ多剤耐性変異の付与された酵母を効率的に単離でき
た。

【００２０】本発明の清酒醸造用酵母は、清酒を製造す
るために用いられることから、特に清酒醪でアルコール
を１５％以上生産する能力を有することが好ましく、こ
の性質を選択する工程を更に加えると特に好ましい。本
発明の多剤耐性株の選抜工程に処する変異株を含む清酒
醸造用酵母としては、上述の方法により自然界から分離
したサッカロミセス・セレビシエの他に、清酒製造用に
分離された株を用いれば、アルコール生産能や製造され
た清酒の香味の点で優れており好ましい。例えば、清酒
醸造用として日本醸造協会から市販されている協会７
号、８号、９号、１０号等協会系の酵母（泡無し酵母も
含む）が好ましい。これらの清酒醸造用酵母中に自然発
生的に生じる変異株の中からを上記選抜工程により多剤
耐性株を選抜するが、この変異株を効率的に得るために
は、人為的な変異処理を行うことがより好ましく、例え
ば、エチルメタンスルフォネート、Ｎ−メチル−Ｎ’−
ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、アクリジン
系色素などの変異剤を使用した化学的な変異誘発でも良
く、紫外線、放射線などを使用した物理的な変異誘発で
も良い。また、本発明における変異株のスクリーニング
法は多剤耐性というポジティブ・セレクションであるの
で、特に変異処理をしなくても非常に低い確率ではある
が、目的の株を自然誘発で得ることも可能である。

【００２１】以上の工程にて得られた多剤耐性株の中か
ら呈味成分生産能により、目的とする性質の付与された
清酒醸造用酵母を選別する。この呈味成分生産能の改変
された株の選別は、最終的には「小仕込試験」を行って
清酒を製造し、その清酒を機器分析や官能検査によって
解析し、目的の酒質を有する清酒を製造した酵母菌株を
選別することで行う。本発明の酵母が多剤耐性を示すと
いうことは、細胞膜における薬剤の細胞外排出もしくは
細胞内への取り込みに関わる何らかの変異が生じている
ことが推測される。その何らかの細胞膜変異によって、
膜の流動性や細胞内生成物の細胞外への膜透過性などに
も変化が生じ、呈味成分生産能の変異した株が多剤耐性
株中に含まれることが考えられる。これらの株の中に
は、種々の呈味成分の生成能が変異した株が多種、複合
的に存在することが推察され、後述の実施例において
は、リンゴ酸を高生産し、かつコハク酸を低生産する酵
母、各種有機酸、特にリンゴ酸を低生産する酵母、およ
びグリセロールを高生産する酵母が得られた。したがっ
て、更に多剤耐性株の検索を継続することで、他の呈味
成分の生成能が変異した株が得られることも考えられ
る。

【００２２】本発明の清酒醸造用酵母の培養に際し、培
地には酵母培養における一般的な炭素源であるグルコー
ス、グリセロール、シュクロース、ガラクトース、マル
トース等を用いることができ、窒素源としては硫酸アン
モニウム、尿素、リン酸第二水素アンモニウム、アミノ
酸等を用い、その他に無機塩類およびビタミンを必要に
応じて用いることができる。培養ｐＨは通常４〜９程度
が望ましい。具体的には、ＹＰＤ培地（ｐＨ４〜９）が
例示される。培養法としては、静置培養、振盪培養のい
ずれでもよく、また寒天等を入れた固体培地でも、液体
培地でもよいが、酵母を大量製造したい場合には、液体
培地を用いタンク中で培養することが望ましい。通常、
タンク培養する場合には無菌の空気を溶存酸素濃度、例
えば約５〜１０ｐｐｍ程度を通気することが好ましい。
培養期間は、培養方法等の条件により異なるが、通常は
静置培養では３〜７日間程度、振盪培養においては１〜
２日間程度が好ましい例として挙げられる。上記の方法
で培養して得た菌体を公知の方法により集菌すれば本発
明の酵母を取得することができる。

【００２３】本発明は、この清酒醸造用酵母を用いるこ
とを特徴とする清酒の製造法、およびそれにより製造さ
れた清酒を提供するものである。本発明の酵母を用いて
清酒を醸造するに当たっては、従来の本醸造酒や普通酒
の製造法に従うことができる。例えば、本醸造酒の製造
法では、原料である米は山田錦、五百万石、日本晴など
を一般には精米歩合５０〜７０％、好ましくは精米歩合
６０〜７０％として用いる。麹は、精米した米を蒸した
後に、約３０℃に冷却し、種麹を蒔き麹室にて２〜３日
間製造する方法が例示される。また、普通酒の製造法で
は、上記の原料米を精米歩合６０〜７５％、好ましくは
精米歩合７０％として用いればよい。

【００２４】精米した米を蒸米、米麹、水と、本発明の
酵母を用いて醸造させる場合に、特に醸造の方法は限定
されるものではないが、例えば３段仕込みでは１２〜２
４日間、１０〜２０℃好ましくは１５℃以下で発酵させ
ればよい。仕込み方法は、酵母仕込みでも酒母仕込みで
もよい。酵母の添加量は、酵母仕込みの場合には、通常
白米１ｔ当たり１００ｇ（湿重量）程度が例示される。
発酵後、得られた醪を常法に従い清酒と粕に分離するこ
とにより、目的とする清酒を得ることができる。醸造ア
ルコールを添加してもしなくても良いが、醸造アルコー
ルを添加する場合には上槽前に添加し、白米１ｔ当たり
１５０ｌをアルコール添加の上限とする。なお、醸造ア
ルコールの添加量は１００％アルコールの換算値であ
る。

【００２５】このようにして得られた清酒は、その味に
大きな特徴を有するが、本発明者等はこの特徴がこの清
酒の持つ成分組成と密接に関わっていることを見出し
た。すなわち、ＰＤＲ１０２株を用いて得られた清酒
は、リンゴ酸のコハク酸に対する重量比が、親株を用い
て得られた清酒のそれと比較して１．５倍以上であり、
その有機酸バランスにより官能的に白ワイン様、さっぱ
り感等の優れた特徴を有する。ＰＤＲ１０４株を用いて
得られた清酒は、親株を用いた清酒に比較して、各種有
機酸を低含有であり、特にリンゴ酸は０．６倍以下、コ
ハク酸は０．９倍以下であることにより、淡麗、クリア
な味わいを有する。また、ＰＤＲ１１４株を用いて得ら
れた清酒は、親株を用いた清酒に比較して、グリセロー
ルを約２倍量含有することから、官能的に濃厚、コクの
ある味わいを有している。

【００２６】

【発明の実施の形態】以下に本発明の実施例を詳細に述
べるが、本発明はこれによって何ら限定されるものでは
ない。

【００２７】

【実施例１】 （清酒醸造用協会酵母からの多剤耐性株の分離およびそ
れらの醸造特性の確認）日本醸造協会が頒布している清
酒醸造用酵母である協会９０１号（以下Ｋ９０１と略称
する）を、ＹＰＤ培地に植菌し、３０℃、２４時間培養
した。これを集菌洗浄し、２％グルコースと０．３％エ
チルメタンスルフォネートを含む０．２Ｍ／ｌリン酸緩
衝液（ｐＨ ８．０）に懸濁後、３０℃で１時間振盪し
て変異処理を行った。変異処理した酵母の懸濁液をＳＧ
−ＣＥＲ寒天培地、およびＳＧ−ＣＹＨ寒天培地にそれ
ぞれ塗沫、培養してコロニーを生成させ、セルレニン耐
性株およびシクロヘキシミド耐性株をそれぞれ分離し
た。ついで、セルレニン耐性株はＳＧ−ＣＹＨ寒天培地
に、シクロヘキシミド耐性株はＳＧ−ＣＥＲ寒天培地に
それぞれ植菌し、両薬剤に耐性を持つ株を多剤耐性株と
して選抜した。

【００２８】次に、上記の方法で選抜した多剤耐性株の
発酵性および醸造特性を確認するために、ＹＰＤ培地で
グルコース濃度を１０％に調整した液体培地（以下ＹＰ
Ｄ−１０培地と略称する）に植菌し、３０℃で７日間培
養して、培地をＨＰＬＣによる有機酸分析およびグリセ
ロール分析に供した。その結果を表３に示す。表３に示
した結果より、ＹＰＤ−１０培地中で有機酸生成上、親
株に対して著しい変化が見られ、かつ、増殖及びアルコ
ール発酵が堅調に行われた株として、ＰＤＲ１０２、Ｐ
ＤＲ１０４、ＰＤＲ１１４の３株を分離した。さらに、
同３株を用いて、表４に示した清酒の仕込み配合の小仕
込試験を行った。１５℃で１５日間発酵させた結果、い
ずれの株も清酒醪中でアルコールを１５％以上生産し、
清酒醸造に適した株であることが確認された。

【００２９】

【実施例２】 （多剤耐性株を用いた純米酒製造および製成酒の分析）
実施例１で選別したＰＤＲ１０２、ＰＤＲ１０４、ＰＤ
Ｒ１１４の３株および親株であるＫ９０１株の各酵母を
用いて、表４に示した仕込み配合で純米酒を試験的に製
造した。原料米は「あけぼの」（平成６年度産）を精米
歩合７０％で精米したものを使用した。麹米は精米した
米を蒸した後に、３０℃に冷却後、種麹を蒔き、２日間
麹室にて製麹した。精米した米は１時間蒸して仕込みに
用いた。仕込みは３回に分け初日を初添え、１日置いて
３日目に仲添え、４日目に留添えとして、１３〜１５℃
で留添え後１６日間発酵させた後、粕を分離し、清酒を
得た。酵母と乳酸は初添え時に添加し、酵母は湿菌体重
量で１ｇ添加した。なお、ここで用いた酵母はＹＰＤ−
１０培地で３０℃、３日間培養し、集菌洗浄したもので
ある。ここで得られた清酒の成分分析値を表５に示す。

【００３０】清酒の成分は、実施例１の表３に示した結
果と同様の傾向にあり、Ｋ９０１株と各酵母の製成酒の
特徴を比較すると、ＰＤＲ１０２製成酒はリンゴ酸を
１．３２倍、コハク酸を０．８５倍含有し、リンゴ酸／
コハク酸比では、Ｋ９０１製成酒の０．９２に対して
１．４３と１．５倍以上の高い値を示した。ＰＤＲ１０
４製成酒はリンゴ酸を０．５２倍、コハク酸を０．９０
倍含有し、リンゴ酸／コハク酸比は０．５４と低い値を
示した。ＰＤＲ１１４製成酒はリンゴ酸を１．３９倍、
コハク酸を１．０８倍含有していたが、リンゴ酸／コハ
ク酸比は１．１９とＫ９０１の値と顕著な差ではなかっ
た。しかしながら、ＰＤＲ１１４製成酒はグリセロール
を１．８９倍含有する特徴を有していた。

【００３１】さらに、各製成酒を官能により評価した。
その際のコメントで代表的なものを表６に示した。Ｋ９
０１株で製成された清酒は「キレがよい」、「清酒らし
い香り」、「バランスがよい」など、従来の清酒の範疇
にある指摘が代表的であった。それに対して、本発明で
得られた清酒に対しては、白ワインを連想させる指摘
や、従来の清酒では特に指摘を受けない成分に対して指
摘が多かった。すなわち、ＰＤＲ１０２製成酒において
は、「白ワイン様」であり、ＰＤＲ１０４製成酒におい
ては、「クリア」や「苦味」に関する指摘であり、ＰＤ
Ｒ１１４製成酒においては「コク」、「濃厚」と「吟醸
香」という指摘が重なった点で顕著である。

【００３２】

【実施例３】 （多剤耐性株を用いた本醸造酒製造および製成酒の分
析）ＰＤＲ１０２、ＰＤＲ１０４、ＰＤＲ１１４の３株
およびＫ９０１株の各酵母を用いて、表７に示した仕込
み配合で純米酒を試験的に製造した。原料米は「あけぼ
の」（平成６年度産）を精米歩合７０％で精米したもの
を使用した。麹米は精米した米を蒸した後に、３０℃に
冷却後、種麹を蒔き、２日間麹室にて製麹した。精米し
た米は１時間蒸して仕込みに用いた。初日に麹米、汲
水、乳酸、酵母を水麹として仕込み、２日目に蒸米を投
入して初添えとした。１日置いて４日目に仲添え、５日
目に留添えとして、１３〜１５℃で留添え後１８日間発
酵させた後、蒸米、麹米、酵素剤、汲水を投入し、四段
掛けを行い、３０％アルコールを添加した。１９日目に
粕を分離し、清酒を得た。酵母は湿菌体重量で１ｇ添加
した。なお、ここで用いた酵母はＹＰＤ培地で３０℃、
２日間培養し、集菌洗浄したものである。ここで得られ
た清酒の成分分析値を表８に示す。

【００３３】ＰＤＲ１０２、ＰＤＲ１０４、ＰＤＲ１１
４の３株により得られた清酒の成分は、実施例２の表５
に示した結果とほぼ同様の傾向にあって、Ｋ９０１株と
各酵母の製成酒の特徴を比較すると、ＰＤＲ１０２製成
酒はリンゴ酸を１．５６倍、コハク酸を０．９４倍含有
し、リンゴ酸／コハク酸比では、Ｋ９０１製成酒の０．
７０に対して１．１５と１．６倍以上の高い値を示し
た。ＰＤＲ１０４製成酒はリンゴ酸を０．５９倍、コハ
ク酸を０．８６倍含有し、リンゴ酸／コハク酸比は０．
４７と低い値を示した。ＰＤＲ１１４製成酒はリンゴ酸
を２．１２倍、コハク酸を１．２０倍含有しており、リ
ンゴ酸／コハク酸比も１．２３とＰＤＲ１０２製成酒で
の値とほぼ同様の値を示した。しかしながら、ＰＤＲ１
１４製成酒はグリセロールを２．００倍含有する特徴を
有していた。この結果より本発明酵母が本醸造仕込みに
おいても、ほぼ純米仕込みと同様の優良な醸造特性を示
すことが確認された。

【００３４】

【表１】

【００３５】

【表２】

【００３６】

【表３】

【００３７】

【表４】

【００３８】

【表５】

【００３９】

【表６】

【００４０】

【表７】

【００４１】

【表８】

【００４２】

【発明の効果】酵母サッカロミセス・セレビシエの多剤
耐性株を分離することで、そこから種々の呈味成分が増
強もしくは減少された清酒醸造用優良株を複合的に選別
することが可能となった。本発明の分離方法より得られ
た酵母は、親株とは異なった呈味成分生産能を示し、清
酒醸造用として有効に用いることができる。また、本発
明の酵母を用いることで、新規に醸造設備を設置するこ
となく、従来の設備・醸造法を用いて香味に優れた清酒
を醸造することが可能となった。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 多剤耐性を示し、かつ、呈味成分生産能
   の改変されたサッカロミセス・セレビシエに属する清酒
   醸造用酵母。
2. 【請求項２】 酵母がサッカロミセス・セレビシエＫ９
   ０１−ＰＤＲ１０２（ＦＥＲＭ Ｐ−１５１１６）、Ｋ
   ９０１−ＰＤＲ１０４（ＦＥＲＭ Ｐー１５１１７）、
   およびＫ９０１−ＰＤＲ１１４（ＦＥＲＭ Ｐ−１５１
   １８）である請求項１記載の酵母。
3. 【請求項３】 二種以上の薬剤を用いて、サッカロミセ
   ス・セレビシエから多剤耐性を示す株を選抜する工程を
   含むことを特徴とする清酒醸造用酵母の分離方法。
4. 【請求項４】 さらに、呈味成分の生産性により、呈味
   成分生産性の改変された株を選別する工程を含むことを
   特徴とする請求項３の清酒醸造用酵母の分離方法。
5. 【請求項５】 請求項１記載の清酒醸造用酵母を用いて
   清酒を製造することを特徴とする清酒製造法。
6. 【請求項６】 請求項１記載の清酒醸造用酵母を用いて
   製造された清酒。