JP3506280B2 - 新規酵母及びその用途 - Google Patents

新規酵母及びその用途

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JP3506280B2 JP33664694A JP33664694A JP3506280B2 JP 3506280 B2 JP3506280 B2 JP 3506280B2 JP 33664694 A JP33664694 A JP 33664694A JP 33664694 A JP33664694 A JP 33664694A JP 3506280 B2 JP3506280 B2 JP 3506280B2
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直孝 黒瀬
忠男 浅野
由紀子 斧田
信次 平岡
忠樹 茂野
忠▲徳▼ 矢野
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宝ホールディングス株式会社
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  • Alcoholic Beverages (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、カプロン酸エチル高生
産酵母の発酵性能及びアルコール耐性の改善された酵母
及び該酵母を用いた香気成分の豊かな酒類、食品の製造
方法に関する。更に詳細には、本発明は、カプロン酸感
受性で、香気成分のうちカプロン酸エチルを多く生成す
る酵母の中から、発酵性能及びアルコール耐性の改善さ
れた新菌株を容易に選択し、該酵母を用いて、香気成分
の豊かな酒類、食品を製造する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】酒類、特に清酒の製造において、フルー
ティな吟醸香成分の含量の高い清酒を製造するには、低
精白米を使用し、15℃前後で発酵させる普通酒仕込で
は困難である。従来、吟醸香に富んだ清酒を得るために
は高度精白米を使用し、低温発酵を行ってきた。しかし
ながら、この方法では時間とコストがかかる。現状で
は、低精白米の加圧蒸しやリパーゼ処理等が行われるよ
うになったが、低精白米の普通酒仕込から吟醸香に富ん
だ清酒を製造することは、困難であることより、酵母の
育種という観点からの技術開発に依存する方法が進めら
れ、これまでに、5′,5′,5′−トリフルオロ−
D,L−ロイシン耐性を用いる方法(特開昭62−66
69号)、セルレニン耐性を用いる方法(特開昭63−
309175号)、4−アザ−DL−ロイシン耐性を用
いる方法(特開平1−257423号)、及び固形色素
平板培地上で異なる色調を示す株を選択する方法(特開
平2−13368号)が公開されている。吟醸香は単一
の香気成分によって成り立っていないことは、多くの専
門家によって指摘されるところであり、したがって、吟
醸香を構成するより多くの成分を、官能的にバランスを
保った形で高生産する酵母の育種が持たれていた。先
に、本発明者らは、清酒用酵母の変異処理株又は交雑株
について、一定濃度のカプロン酸を含む最少培地での生
育試験を行い、当該培地で生育できないカプロン酸感受
性株を分離し、カプロン酸エチル高生産株を取得した
(特願平5−253630号)が、変異処理によりカプ
ロン酸エチルを多く生成する酵母ほど発酵性能及びアル
コール耐性が低下する傾向が認められ、カプロン酸エチ
ル及び酢酸イソアミルがバランスよく高生成され、かつ
発酵性能及びアルコール耐性の改善された酵母の提供が
望まれていた。また、清酒以外の酒類では、焼酎の製造
においても、香りの良い焼酎を製造するためには、同様
の問題点を有し、更には食品の製造においても、同様で
あった。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】香気成分の豊かな吟醸
酒の場合、原料コストが高く、また製造日数も長くかか
ることから、安定に大量の吟醸酒を製造することは困難
であった。また、低精白米を用いる普通酒仕込では、吟
醸香に富んだ清酒を製造することは更に困難であった。
本発明の目的は、前記の従来技術の問題点を解決すべ
く、普通酒仕込で吟醸香が高く、かつ生成エタノール濃
度の高い清酒の原酒を製造することにあり、そのために
カプロン酸エチル及び酢酸イソアミルがバランスよく高
生成し、発酵力の強い新規酵母菌を提供すること、及び
該酵母を用いて低精白米から、安定にかつ大量に、吟醸
香の豊かな酒類を製造する方法、更には該酵母を用いて
吟醸香の豊かな食品を製造する方法を提供することにあ
る。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、第
1の発明は、カプロン酸感受性でない親株よりもカプロ
ン酸エチル高生産能をもつサッカロミセス・セレビシエ
(Saccharomyces cerevisiae)に属する酵母であって、
カプロン酸感受性である親株よりも、醪末期における発
酵力が強くなる発酵性能の改善、及び醪末期における高
濃度のエタノール存在下で死滅しにくく、醪末期でも速
やかに発酵を行えるようになるアルコール耐性の改善が
なされ、かつ、カプロン酸感受性が保持されたサッカロ
ミセス・セレビシエに属する新規酵母に関し、第2の発
明は、本発明の第1の発明の当該酵母を用いることを特
徴とする香気成分の豊かな酒類、食品の製造方法に関す
る。
【0005】本発明者らは、先に清酒用酵母の変異処理
株又は交雑株を、一定濃度のカプロン酸を含む最少培地
で生育させ、当該培地で生育できないカプロン酸感受性
株を分離し、清酒小仕込試験を重ねて生成清酒の官能試
験、機器分析により、カプロン酸エチルの高生産株を選
別した。次に、前記カプロン酸エチルの高生産酵母菌株
の発酵性能及びアルコール耐性がカプロン酸エチルの生
成濃度に反比例する現象を見出し、カプロン酸エチル高
生産酵母から、(1)18v/v%エタノール中で長く
生存する株、(2)0.5M酢酸リチウムに対する耐性
度の高くなった株、(3)0.01w/v%ラウリル硫
酸ナトリウムに対する耐性度の高くなった株、(4)日
本醸造協会701号のハプロイド株と交雑させた株を
得、清酒小仕込試験によりそれらの中から選択すること
で、カプロン酸エチル高生産株の発酵性能及びアルコー
ル耐性が改善され、更にはカプロン酸エチルと酢酸イソ
アミルをバランスよく高生成するサッカロミセス・セレ
ビシエを得ることができることを見出し、本発明を完成
させた。
【0006】本発明で得られるカプロン酸エチル高生産
株の発酵性能及びアルコール耐性が改善された酵母は、
カプロン酸感受性がそのまま保持されたものと保持され
ないものとがあるが、カプロン酸感受性がそのまま保持
されたものが性能上好ましい。
【0007】本発明において発酵性能の改善とは、醪末
期における生成エタノール濃度が高くなることや日本酒
度の切れがよくなる、すなわち発酵力が強くなることを
いい、また、アルコール耐性の改善とは、醪末期におけ
る高濃度のエタノール存在下で死滅しにくく、醪末期で
も速やかに発酵を行えるようになることをいう。
【0008】本発明におけるカプロン酸エチル高生産株
とは、その基質となるカプロン酸、又はカプロン酸及び
カプリル酸の高生産株も含む。更には、4−ヒドロキシ
酪酸エチルの生成が多くなった株をも含む。
【0009】選択される酵母細胞の母集団は、変異処理
株、交雑株、馴養株、細胞融合株及びプラスミド等によ
る形質転換株等の人工変異株のほかに野生株を含む。
【0010】本発明における変異処理としては、酵母に
公知の変異誘導法、例えば、紫外線、放射線等を照射さ
せる方法、又はN−メチル−N′−ニトロ−N−ニトロ
ソグアニジン、エチルメタンスルホネート等の薬剤を接
触させる方法を適宜用いることにより行えばよい。有効
な変異処理としてはエチルメタンスルホネート処理が好
ましい。
【0011】ここに得られるカプロン酸エチル高生産株
の発酵性能及びアルコール耐性の改善された酵母は、清
酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ビール酵母、ウイスキ
ー酵母、アルコール酵母、及びパン酵母のいずれでもよ
く、これらの酵母を用いて清酒、焼酎、ワイン、ビー
ル、ウイスキー等の酒類、又はパン等の食品を製造すれ
ば、香気の豊かな製品を製造することができる。更に、
これらの酵母を用いて芳香性の香気液を製造することも
可能である。清酒、焼酎、ワイン、ビール、ウイスキ
ー、香気液、パン等の製造方法は特に限定するものでは
なく、一般的な方法に従って製造することができる。
【0012】以下に本発明の酵母の取得方法の1例を示
す。 (酵母の変異処理方法)清酒用泡なし酵母、日本醸造協
会901号(以下、K−901と略称する)株のカプロ
ン酸エチル高生産株を取得するために、以下の工程で変
異処理を行った。YPD液体培地(酵母エキス1w/v
%、ポリペプトン2w/v%、グルコース2w/v%)
5mlで30℃にて一夜振とう培養した。遠心分離で菌
体を集菌した後、0.2Mリン酸バッファー(pH8.
0)で菌体を洗浄した。洗浄菌体を4.6mlの0.2
Mリン酸バッファー(pH8.0)に懸濁し、40w/
v%グルコース溶液を0.25ml添加してよくかくは
んした後、0.15mlの3w/v%エチルメタンスル
ホネート(EMS)水溶液を添加し、30℃にて1時間
おだやかに振とうした。その0.2mlを9.8mlの
6w/v%チオ硫酸ナトリウム溶液に加えて、室温で1
0〜15分維持し、そのうちの0.2mlを19.8m
lの滅菌水に添加し、0.1mlずつ100枚のSD培
地〔イーストニトロゲンベース(アミノ酸不含)0.6
7w/v%、グルコース2w/v%〕の平板寒天培地に
塗布し、30℃で3日間培養した。
【0013】(カプロン酸エチル高生産株の選択方法)
シャーレ1枚の平板寒天培地に約200個のコロニーを
形成させたもの合計100枚について、0.03v/v
%のカプロン酸を含むSD培地(選択培地)の平板寒天
培地にレプリカし、30℃で5日間培養した。後者の選
択培地に生育できない変異株1株(13−e)をカプロ
ン酸感受性株として選択した。該菌株はSaccharomyces
cerevisiae 13−eと命名、表示され、工業技術院生
命工学工業技術研究所にFERM P−13843とし
て寄託されている。カプロン酸感受性の変異株(13−
e)について、表1に示す仕込配合で清酒の小仕込試験
を行った。
【0014】
【表1】
【0015】掛米は精米歩合77%(w/w)のα米
〔セブンライス工業(株)製〕を使用した。麹は、精米
歩合72%(w/w)の白米を用いて製造した。酵母は
5ml中に1×109 個含むものを添加した。発酵温度
は15℃一定で行った。留後13日目の醪のろ液につい
て、ガスクロマトグラフィーでカプロン酸エチルの定量
を行った結果、変異株13−e株は親株(K−901)
の約10倍のカプロン酸エチルを生成することを認め
た。また、変異株13−e株の醪のろ液について、ポー
ラパック樹脂を用いた方法(坂本宏司ら:日本農芸化学
会誌、第67巻、第685〜692頁、1993年)に
従って、中高沸点香気成分を分析した結果、K−901
株に比べて、約4倍のカプリル酸エチル及び約2倍の4
−ヒドロキシ酪酸エチルを生成していることを認めた。
以上のカプロン酸エチル高生産、あるいはカプロン酸エ
チル、カプリル酸エチル及び4−ヒドロキシ酪酸エチル
高生産という形質は、当該変異株がK−901株とは異
なる新規酵母菌であることを示すものである。しかしな
がら、変異株13−e株は最終生成エタノール濃度がK
−901株に比べて低く、また上槽前の酵母細胞のメチ
レンブルー染色による死滅率が極めて高くなっていた。
【0016】(カプロン酸エチル高生産酵母の発酵性能
及びアルコール耐性の改善方法) (1)エタノール馴養法 13−e株を用いて製造した清酒醪(最終アルコール濃
度17.4v/v%)にエタノールを添加して18v/
v%に調整した。この醪を15℃で2日間静置し、生存
する細胞をYPD寒天平板培地上でコロニーとして生育
させ、清酒の小仕込試験により選択し、そのうちの1株
を18Al株とした。 (2)酢酸リチウム耐性法 13−e株を前記の方法でEMS変異処理し、この菌懸
濁液を適当に希釈して0.5M酢酸リチウムを含むSD
培地の寒天平板培地に塗布し、コロニーとして生育さ
せ、清酒の小仕込試験により選択し、そのうちの1株を
13L3株とした。 (3)ラウリル硫酸ナトリウム耐性法 0.008w/v%のラウリル硫酸ナトリウム(以下、
SDSと略称する)を含むSD培地の液体培地に13−
e株を接種し、30℃で振とう培養した。十分生育した
後、SDS濃度を少し上げたSD培地に移植し、同様に
培養した。最終的に、0.01w/v%SDSを含む培
地で生育した細胞をYPD培地の寒天平板上でコロニー
として生育させ、清酒の小仕込試験により選択し、その
うちの2株を13S5株、13S12株とした。13S
5株は0.03v/v%のカプロン酸に対して耐性を示
し、親株の13−e株とは異なる菌学的性質を示した。 (4)交雑法 13−e株の一倍体株(接合型:α型)と日本醸造協会
701号(以下、K−701と略述する)の一倍体株
(接合型:a型)のYPD培地での培養液それぞれ0.
1mlを、1mlのYPD培地に加え、30℃で一夜静
置培養した。この菌液をYPD培地の寒天平板培地に接
種し、生育の早い二倍体コロニーを清酒の小仕込試験に
より選択し、そのうちの1株を10−143−2株とし
た。
【0017】上記のように、本発明による菌株{変異・
馴養株:18Al、13L3、13S5、13S12、
交雑株:10−143−2}は、K−901株の変異・
馴養株又はK−701株との交雑株であるが、それらの
菌学的性質を以下に示す。 (菌学的性質) 1.形態学的性質 YPD培地で30℃、2日間培養した後、顕微鏡で観察
した。 a)形:卵円形 b)大きさ:長さ4.7〜7.9μm、幅3.8〜5.
5μm 2.胞子形成:有り 胞子形成用培地(酢酸カリウム2w/v%、グリコース
0.05w/v%、寒天2w/v%)で30℃、5日間
培養し、顕微鏡で観察した。 3.増殖の形態:出芽 4.生化学的観察 a)糖の発酵性 ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地(ディフコ
社製)をダーラム管入り試験管に分注して、当該4菌株
を接種し、30℃で7日間培養して、その炭酸ガス発生
の有無を観察した。 グルコース (+) ガラクトース(+) スクロース (+) マルトース (+) ラクトース (−) メリビオース(−) ラフィノース(+) b)糖の資化性 ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地(ディフコ
社製)を用いて、オキザノグラフ法により、30℃、1
4日後の生育を観察した。 グルコース (+) ガラクトース(+) スクロース (+) マルトース (+) ラクトース (−) c)硝酸塩の同化性:(−) 硝酸塩は硝酸カリウムとし、ウイッカーハムの炭素化合
物同化試験用培地(ディフコ社製)を用いて、オキザノ
グラフ法により生育を観察した。 d)TTC染色性:赤 e)β−アラニン培地、35℃、3日間培養での生育:
【0018】
【表2】
【0019】5.高泡の形成 清酒の小仕込を行ったところ、高泡の形成は観察されな
かった。以上、形態学的、生化学的結果は、本発明酵母
5菌株がサッカロミセス・セレビシエに属する酵母菌で
あることを示すものである。また、清酒の小仕込試験に
おいて高泡の形成も認められないことから、当該4菌株
はK−901株の変異株あるいはK−701株の誘導体
であることを示すものである。 6.薬剤に対する耐性 それぞれの薬剤を含むSD培地を用いて、30℃で3日
間培養した。
【0020】
【表3】
【0021】a)5′,5′,5′−トリフルオロ−
D,L−ロイシン耐性 b)セルレニン耐性 c)4−アザ−DL−ロイシン耐性 d)クロトリマゾール耐性 7.カプロン酸に対する感受性 カプロン酸を含むSD培地を用いて、30℃で3日間培
養した。
【0022】
【表4】
【0023】かくして、本発明により、13−e株を変
異あるいは馴養させ、又はK−701株と交雑させるこ
とによって、カプロン酸エチル及び酢酸イソアミルをバ
ランスよく高生成する、13−e株よりも発酵性能及び
アルコール耐性の改善された、普通酒仕込に使用可能な
香気高生産酵母が提供された。代表的な菌株である18
Al株、13L3株、13S12株、及び10−143
−2株は、それぞれSaccharomyces cerevisiae 18A
l、Saccharomyces cerevisiae 13L3、Saccharomy
ces cerevisiae 13S12、及びSaccharomyces cere
visiae 10−143−2と表示し、工業技術院生命工
学工業技術研究所に、各々FERM P−14606、
FERM P−14612、FERM P−1462
6、FERM P−14605として寄託してある。
【0024】本発明の清酒、焼酎及びその他の酒類の製
造方法は、これらの酵母菌株を用いることを特徴とし、
醸造方法は特に限定するものではない。また、食品の製
造方法においても同様に製造方法は特に限定されるもの
ではない。
【0025】
【実施例】次に、本発明の菌株を用いた酒類製造の具体
例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明
はこれらの実施例に限定されない。
【0026】実施例1 変異・馴養株4株(18Al、13L3、13S5、1
3S12株)及び交雑株1株(10−143−2株)に
ついて、表1に示す仕込配合で清酒の製造を行った。掛
米は精米歩合77%(w/w)のα米〔セブンライス工
業(株)製〕を使用した。麹は、精米歩合72%(w/
w)の白米を用いて製造した。酵母は5ml中に1×1
9 個含むものを添加した。発酵温度は15℃一定で行
った。対照株として親株の13−e株及びK−901株
を用いた。上槽液の分析結果を表5に示す。
【0027】
【表5】
【0028】官能検査は3点法(1:良、2:普通、
3:悪)で行い、パネラー10名の平均値で表した。こ
の結果、18Al株、13L3株、13S5株、13S
12株及び10−143−2株の5株は親株の13−e
株に比べて発酵性能及びアルコール耐性が向上し、かつ
カプロン酸エチル生産能もK−901株の3倍から9倍
を示した。また、18Al株及び10−143−2株は
K−901株の3倍から5倍の酢酸イソアミルを生成し
た。この酢酸イソアミル高生産能は13−e株にはなか
った性能である。得られた5株は官能的にも華やかな香
りが認められ、特にカプロン酸エチルの生成量が13−
e株より増加した13L3株で製造した清酒は、リンゴ
様のフルーティな香りが強く、また酢酸イソアミル生成
量も増加した18Al株及び10−143−2株で製造
した清酒は、軽快で香りのバランスの良い優良な酒質と
なった。
【0029】実施例2 変異株1株(13L3株)及び交雑株1株(10−14
3−2株)について、表6に示す仕込配合で焼酎の製造
を行った。対照株として米焼酎用によく用いられるK−
701株を使用した。
【0030】
【表6】
【0031】掛米は精米歩合70%(w/w)の低品位
米を使用した。麹は、精米歩合72%(w/w)の白米
を用いて製造した。酵母は5ml中に2×108 個含む
ものを添加した。酵素剤はスピターゼM〔ナガセ生化学
工業(株)製〕を使用した。発酵温度は20℃一定で行
った。留後14日目の醪を減圧度−700mmHgで減
圧蒸留し、留出アルコール20v/v%までの垂口をア
ルコール25.0v/v%に割水したものを分析した。
その結果を表7に示す。
【0032】
【表7】
【0033】官能検査は3点法(1:良、2:普通、
3:悪)で行い、パネラー10名の平均値で表した。こ
の結果、13L3株を用いて製造した米焼酎は、吟醸香
であるカプロン酸エチルの含量が対照のK−701株に
比べて極めて多く、官能的にもリンゴ様のフルーティな
香りが強く認められた新しいタイプの焼酎となった。ま
た、10−143−2株を用いて製造した米焼酎は、酢
酸イソアミルの生成量がK−701株の2.5倍、カプ
ロン酸エチルの生成量が約4倍に増加しており、官能的
にも華やかな軽快な香りが認められた。
【0034】以上の結果は、18Al株、13L3株、
13S5株、13S12株、及び10−143−2株が
K−901株にない性質をもつ、すなわち香気エステル
を多く生成し、更には13−e株に比べて発酵性能及び
アルコール耐性の改善された新規酵母菌であることを示
すものである。
【0035】
【発明の効果】本発明による酵母の選択法を用いて得ら
れるカプロン酸エチル高生産酵母の発酵性能及びアルコ
ール耐性の改善された新規酵母菌を使用することによ
り、高精白米、低温長期仕込の吟醸仕込を行わなくと
も、普通酒仕込あるいは低価格米による焼酎仕込におい
てカプロン酸エチル及び酢酸イソアミルを主とする香気
エステルの豊かでバランスの良い、芳香性に富んだ清
酒、焼酎及びその他の酒類の製造が、低コストで、しか
も短期間で安定して行うことが可能となる。また、食品
の製造においても同様に、本発明による新規酵母菌を用
いることにより、香気成分の豊かな食品を製造すること
が可能となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 平岡 信次 滋賀県大津市瀬田3丁目4番1号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 茂野 忠樹 滋賀県大津市瀬田3丁目4番1号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 矢野 忠▲徳▼ 大阪府堺市竹城台3丁19−3 (56)参考文献 特開 平7−147972(JP,A) (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12N 1/16 C12G 3/02 C12G 3/12 BIOSIS/WPI(DIALOG)

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 カプロン酸感受性でない親株よりもカプ
    ロン酸エチル高生産能をもつサッカロミセス・セレビシ
    エに属する酵母であって、カプロン酸感受性である親株
    よりも、醪末期における発酵力が強くなる発酵性能の改
    善、及び醪末期における高濃度のエタノール存在下で死
    滅しにくく、醪末期でも速やかに発酵を行えるようにな
    るアルコール耐性の改善がなされ、かつ、カプロン酸感
    受性が保持されたサッカロミセス・セレビシエに属する
    新規酵母。
  2. 【請求項2】 請求項1に記載の新規酵母が、18v/
    v%エタノールに対する耐性を示すサッカロミセス・セ
    レビシエに属する新規酵母。
  3. 【請求項3】 請求項1に記載の新規酵母が、0.5M
    酢酸リチウムに対する耐性を示すサッカロミセス・セレ
    ビシエに属する新規酵母。
  4. 【請求項4】 請求項1に記載の新規酵母が、0.01
    w/v%のラウリル硫酸ナトリウムに対する耐性を示す
    サッカロミセス・セレビシエに属する新規酵母。
  5. 【請求項5】 請求項1に記載の新規酵母が、Saccharo
    myces cerevisiae13−e(FERM P−1384
    3)と日本醸造協会701号との交雑株であるサッカロ
    ミセス・セレビシエに属する新規酵母。
  6. 【請求項6】 請求項1に記載のサッカロミセス・セレ
    ビシエを用いることを特徴とする酒類、食品の製造方
    法。
JP33664694A 1994-12-26 1994-12-26 新規酵母及びその用途 Expired - Lifetime JP3506280B2 (ja)

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