JPH0889236A - 新規低・中温発酵性酵母及び当該酵母を使用するワインの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 化学分類法に基づいてサッカロミセス・バイ
ヤナスに分類される酵母とサッカロミセス・セレヴィシ
エに分類される酵母を異種間で有性交雑して得られ、３
〜３５℃の発酵温度域において優れた生育・発酵能を有
し、かつ第１世代において遺伝的に安定であるサッカロ
ミセス属に属する新規低・中温発酵性酵母並びに当該酵
母を使用し、３〜１０℃の温度で発酵を行うことを特徴
とするワインの製造法。 【効果】 本発明によれば、低温及び中温の幅広い温度
域において良好な生育・発酵能を有し、かつ遺伝的に安
定な低・中温発酵性酵母が得られる。この新規低・中温
発酵性酵母を用いた低温下におけるワインの製造では、
安定的に、かつ短期間に発酵を終了することができ、得
られるワインは香りに富むものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規低・中温発酵性酵
母及び当該酵母を使用するワインの製造法に関し、詳し
くは低温から中温（３〜３５℃）の幅広い温度域におい
て優れた生育・発酵能を有し、かつ遺伝的に安定である
新規低・中温発酵性酵母とその創製方法並びに当該酵母
を使用するワインの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】一般に、ワインの製造においては、清澄
果汁を低温下で緩やかに発酵させることにより、原料ブ
ドウ由来の果実香と酵母の代謝産物（高級アルコール類
やエステル類等）による豊かな芳香の酒質が得られる。
したがって、ワインの製造には、酒質を損ねる野生酵母
や細菌類による汚染と酸化を防止する早い初期発酵（湧
きつき）を促し、さらには発酵期間の長期化や発酵の停
滞を防ぐために、優良な低温発酵性酵母の使用が望まれ
る。

【０００３】現在、代表的なワイン酵母、サッカロミセ
ス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)ＫＷ３や
ＫＷ４（Ｗ３（ＲＩＦＹ １００１）、日本醸造協会）
は、２０〜３０℃では勿論のこと、１３〜１５℃の低温
においても良好な生育・発酵能を有する菌株として選抜
され、広く一般に用いられている。他方、有性交雑法に
よる低温発酵性ワイン酵母の育種例（S. Hara et al.:A
gric.Biol.Chem.,vol.45,p.1327(1981) についても報告
されている。しかしながら、これらの酵母菌株の使用の
みでは酒質の多様化に限界がある。また、これら酵母菌
株が１３〜１５℃程度の発酵温度を対象とすることか
ら、より一層の品質向上を目指した３〜１０℃という極
めて低い温度での発酵やブドウ果汁の清澄化後の発酵等
においては、湧き遅れ、発酵期間の長期化を余儀なくさ
れるばかりでなく、時には発酵の停滞を起こし、ワイン
の香味を損なう場合がある。

【０００４】従来、ワイン酵母は清酒酵母やビール酵母
と異なり、高い子嚢胞子形成能を有する菌株が多いこと
から、有性交雑がその育種において有効な手法の一つと
されている。しかしながら、有性交雑法を用いた場合、
創製した菌株の遺伝的安定性が課題となり、単胞子培養
株の中から目的とする性質を有する菌株の選抜など煩雑
な操作が必要である。

【０００５】ところで、酵母の分類学に関する成書とし
て"The Yeasts, a taxonomic study, 3rd ed."(Kreger-
van Rij, Elsevier Science Publishers(1984)) が知ら
れているが、本書に従えば、ワイン酵母はサッカロミセ
ス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)に分類さ
れる。しかし、このサッカロミセス・セレヴィシエ酵母
群は化学分類法（ＤＮＡ類似度及びＤＮＡのＧ＋Ｃ含量
に基づく）において、従来の生理・生化学的特徴に基づ
く分類法とは対応関係のない独立した４種に分類される
ことが明らかにされている(A.Vaughan Martini et al.:
Int.J.Syst.Bacteriol., vol. 35, p.508(1985)、山田
より子ら: 微生物保存連盟会誌，９巻，p.95(1993),
他) 。このＤＮＡ類似度等に基づく分類によれば、低温
発酵性酵母はサッカロミセス・バイヤナス(Saccharomyc
es bayanus) に、中温発酵性酵母はサッカロミセス・セ
レヴィシエに分類される酵母群であり、両種は生育・発
酵特性において大きく異なってる(M.Kishimoto et al.:
J.Gen.Appl.Microbiol., vol.40, p.83(1994)) 。

【０００６】本発明において低温発酵性酵母とは、例え
ばＰＹＧ−Ｆ培地（ブドウ糖１８％，ポリペプトン０．
７５％，酵母エキス０．４５％、ｐＨ４．５）において
７℃の低温で比増殖速度が０．０３０以上、発酵速度が
サッカロミセス・セレヴィシエに比して約２倍以上と良
好な生育・発酵能を示すが、２８℃の中温では発酵が途
中で停止し、エタノール生成量が７％以下と少なくなる
酵母群と定義する。また、中温発酵性酵母とは、例えば
同様の培地において７℃の低温で比増殖速度が０．０３
０以下、発酵速度がサッカロミセス・バイヤナスに比し
て約１／２以下と生育・発酵が緩慢であるが、２８℃の
中温において発酵終了時のエタノール生成量が１０％程
度あるいはそれ以上となる酵母群と定義する。

【０００７】また、低温発酵性酵母であるサッカロミセ
ス・バイヤナスＹＭ−８４（ＲＩＦＹ １１１４）及び
ＹＭ−１２６（ＲＩＦＹ １２１８）を用いて低温下で
製造したワインは、ワインの香りの主要構成成分である
高級アルコール類やエステル類及びリンゴ酸を著量に含
有するとともに、ワインの風味を損なう酢酸含量が極め
て少なく、発酵フレーバーに富む酒質であることは既に
公知である（岸本宗和ら: 日本醸造協会誌, 88巻, p.70
8(1993))。しかしながら、本菌株をそのままワイン酵母
として用いるには、中温の発酵不良において難がある。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、低温
から中温（３〜３５℃）の幅広い発酵温度域において優
れた生育・発酵能を有する酵母菌株とそのの創製方法並
びに該酵母菌株を用いて３〜１０℃という極めて低い発
酵温度で、発酵工程を安定的、かつ短期間に終了し、香
味に特徴のあるワインを製造する方法を提供することで
ある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、第１に化学分
類法に基づいてサッカロミセス・バイヤナスに分類され
る酵母とサッカロミセス・セレヴィシエに分類される酵
母を異種間で有性交雑して得られ、３〜３５℃の発酵温
度域において優れた生育・発酵能を有し、かつ第１世代
において遺伝的に安定であるサッカロミセス属に属する
新規低・中温発酵性酵母に関し、第２に化学分類法に基
づいてサッカロミセス・バイヤナスに分類される酵母と
サッカロミセス・セレヴィシエに分類される酵母を異種
間で有性交雑することを特徴とする上記の新規低・中温
発酵性酵母の創製方法であり、第３に当該低・中温発酵
性酵母を使用し、３〜１０℃の温度で発酵を行うことを
特徴とするワインの製造法である。

【００１０】本発明の新規低・中温発酵性酵母の創製に
用いられるサッカロミセス・バイヤナスに分類される酵
母は低温発酵性酵母であり、具体的にはサッカロミセス
・バイヤナスＹＭ−８４（ＲＩＦＹ １１１４），同Ｙ
Ｍ−１２６（ＲＩＦＹ １２１６），同ＹＭ−８２（Ｒ
ＩＦＹ １１１２），同ＩＦＯ １９４８等がある。ま
た、サッカロミセス・セレヴィシエに分類される酵母は
中温発酵性酵母であり、具体的にはサッカロミセス・セ
レヴィシエＯＣ−２（ＩＡＭ ４２７４），同Ｗ３（Ｒ
ＩＦＹ １００１）等がある。これらの酵母菌株は、優
性交雑時に交雑株の選抜を容易にするためにアミノ酸等
の栄養要求性を付与することが適当である。栄養要求性
変異株の取得には、紫外線照射等の物理的方法あるいは
エチルメタンサルフォネート溶液への懸濁等の化学的方
法（石川辰夫編、遺伝学実験法講座、微生物遺伝学実
験法、ｐ１９３、共立出版（１９８２）参照）があり、
既知の方法が適宜使用できる。

【００１１】本発明の新規低・ 中温発酵性酵母は、上述
の低温発酵性酵母と中温発酵性酵母の生育・発酵特性を
併せ持つ酵母菌株である。すなわち、例えばＰＹＧ−Ｆ
培地において７℃の低温で比増殖速度が０．０３０以
上、発酵速度がサッカロミセス・セレヴィシエに比して
約２倍以上と良好な生育・発酵能を示し、かつ２８℃の
発酵において発酵終了時のエタノール生成量が１０％程
度あるいはそれ以上となる酵母群と定義されるものであ
る。

【００１２】サッカロミセス属に属する新規低・ 中温発
酵性酵母の創製は有性交雑により行うが、化学分類法に
基づいて分類される異種酵母菌株を対象とし、交雑株の
形成する子嚢胞子に生存能が認められないことから、雑
種第一世代において遺伝的に安定な菌株が容易に得られ
る。本発明において交雑株を得るためには、優性交雑法
として集団接合法あるいは直接接合法が挙げられるが、
用いる菌株の生活環の型及び倍数性により適宜行われる
ものである。すなわち、集団接合法は、ヘテロタリズム
単相株間の交雑に効果的であり、両（ａ，α）接合型細
胞の混合培養により行われる。また、直接接合法は、顕
微鏡下でミクロマニピュレーターを用いて、例えばホモ
タリズム株間では胞子−胞子、ホモタリズムとヘテロタ
リズム株間では胞子−栄養細胞の直接接触により行われ
る。

【００１３】本発明の新規低・中温発酵性酵母の創製に
用いられる前記酵母菌株はいずれもホモタリック、２倍
体であるので、有性交雑は、例えば次のようにして行う
ことができる。McClary らの斜面培地（酢酸ナトリウム
０．８２％，ブドウ糖０．１％，酵母エキス０．２５
％，塩化カリウム０．１８％，寒天２％）で両菌株の子
嚢胞子の形成を誘導させ、ザイモリエース２５０ｐｐｍ
を含むリン酸緩衝液中で子嚢壁を溶解した後に、顕微鏡
下でミクロマニピュレーターを用いて胞子−胞子間で行
う。次いで、接合子が観察された菌株をコロニー形成の
後に交雑株として選抜し、最少培地にレプリカして生育
可能であることを確認すればよい。

【００１４】本発明において低温発酵性酵母サッカロミ
セス・バイヤナスＹＭ−８４と中温発酵性のワイン酵母
サッカロミセス・セレヴィシエＯＣ−２の交雑から創製
された新規低・ 中温発酵性のサッカロミセス属酵母の具
体例としては、後記実施例に示すように、サッカロミセ
ス・バイヤナスＹＭ−８４Ｍ株とサッカロミセス・セレ
ヴィシエＯＣ−２Ｍ株の交雑株であるＨｙ−００２，Ｈ
ｙ−０１１，Ｈｙ−０１４の３菌株、サッカロミセス・
バイヤナスＹＭ−１２６Ｍ株とサッカロミセス・セレヴ
ィシエＯＣ−２Ｍ株の交雑株であるＨｙ−１０１，Ｈｙ
−１０３，Ｈｙ−１０５の３菌株等がある。これらのう
ちの１菌株であるＨｙ−００２株は次のような菌学的性
質を示す。

【００１５】１．各培地における生育状態 ａ）ＹＭ液体培地（２５℃、３日間培養) 栄養細胞の形：球、卵形 大きさ：５．０〜１０．０μ×５．０〜１２．０μ 栄養増殖：多極出芽 ｂ）ＹＭ寒天培地（２５℃、３０日間培養) コロニーの状態：半レンズ上にやや隆起し、周縁は平
滑。表面は平滑、鈍光。淡いクリーム色。 コロニーの性状：バター質 ｃ）ポテト・グルコース寒天培地、コーンミール寒天培
地 擬菌糸を形成する。真菌糸は形成しない。同胎、異胎接
合はしない。

【００１６】２．子嚢胞子形成 １〜４個の球形あるいは卵円形の子嚢胞子を形成する。 ３．各種生理的試験 最適生育条件：温度２０〜３０℃、ｐＨ３．０〜７．０ 硝酸塩の資化性：資化しない エチルアミンの資化性：資化しない ウレアーゼ：陰性 ゼラチンの液化：液化しない カロチノイドの生成：生成しない デンプン類似物の生成：生成しない ３７℃での増殖：増殖する シクロヘキシミド１００ｐｐｍ存在下での生育：生育し
ない ５０％（ｗ／ｗ）のグルコース含有酵母エキス寒天培地
での生育：生育する ビタミン要求性：要求する（微弱） 産膜性：なし

【００１７】４．炭素源の発酵性及び資化性 ａ）発酵性 Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−ガラクトース ＋ マルトース ＋ シュークロース ＋ ラクトース − メリビオース ＋ ラフィノース ＋ イノシトール − ｂ）資化性 Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−ガラクトース ＋ マルトース ＋ シュークロース ＋ ラクトース − メリビオース ＋ ラフィノース ＋ イノシトール − Ｄ−フラクトース ＋ Ｌ−アラビノース − Ｄ−リボース − Ｄ−キシロース − Ｌ−ラムノース − セロビオース − 可溶性デンプン − エリスリトール − グリセリン ＋ コハク酸塩 − クエン酸塩 −

【００１８】さらには、このようにして創製されたサッ
カロミセス属酵母菌株は、その両親株の特徴的な生育・
発酵特性を併せ持つ。すなわち、３℃程度の低温から３
５℃程度の中温までの幅広い温度域において優れた生育
・発酵能有する。

【００１９】次に、本発明の新規低・ 中温発酵性酵母を
使用するワインの製造法について説明する。本発明のワ
インの製造方法は、当該新規低・ 中温発酵性酵母を、例
えば糖度１５〜２５％の葡萄果汁に加えて、３〜１０℃
の極めて低い温度、好ましくは７〜１０℃の温度で発酵
を行うが、このような低温でも従来のワイン酵母（中温
発酵性酵母であるサッカロミセス・セレヴィシエ）に比
して安定的である。そのため、短期間に発酵を終えるこ
とができ、通常は２０〜８０日間、好ましくは２０〜５
０日間で発酵を終了する。

【００２０】本発明の新規低・ 中温発酵性酵母菌株を用
いて製造したワインは、香りの主要構成成分である高級
アルコール類やエステル類を著量に含有するとともに、
ワインの風味を損なう酢酸含量が極めて少なく、香りに
富む特徴的な酒質である。これら香気成分の高生成と酢
酸の低生成は、その親株である低温発酵性酵母に認めら
れる性質であり、創製した酵母菌株が本性質を併せ持つ
ことによるものである。

【００２１】

【実施例】以下に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。 実施例１ 有性交雑においては、交雑株の選抜は交雑時の接合子形
成の観察において容易に行えるが、今回は、選択マーカ
ーとして利用できるアミノ酸要求性を付与した菌株を用
いた。すなわち、低温発酵性酵母にはサッカロミセス・
バイヤナスＹＭ−８４（ＲＩＦＹ １１１４）（本菌株
は山梨大学工学部付属発酵化学研究施設に保存されてお
り、請求により分譲される。）から取得したアルギニン
要求性変異株ＹＭ−８４Ｍあるいはサッカロミセス・バ
イヤナスＹＭ−１２６（ＲＩＦＹ１２１６）（本菌株は
山梨大学工学部付属発酵化学研究施設に保存されてお
り、請求により分譲される。）から取得したヒスチジン
要求性変異株ＹＭ−１２６Ｍを、中温発酵性のワイン酵
母にはサッカロミセス・セレヴィシエＯＣ−２（ＩＡＭ
４２７４）から取得したリジン要求性変異株ＯＣ−２
Ｍを用いた。

【００２２】交雑は、本酵母菌株がいずれもホモタリッ
ク、2 倍体であることから、McClary らの斜面培地（酢
酸ナトリウム０．８２％，ブドウ糖０．１％，酵母エキ
ス０．２５％，塩化カリウム０．１８％，寒天２％）で
子嚢胞子の形成を誘導させ、ザイモリエース２５０ｐｐ
ｍを含むリン酸緩衝液中で子嚢壁を溶解した後に、顕微
鏡下でミクロマニピュレーターを用いて胞子−胞子間で
行った。接合子が観察された菌株を交雑株として選抜
し、最少培地（ブドウ糖２％，バクトイーストナイトロ
ゲンベース０．６７％，寒天２％）において生育可能で
あることを確認した。

【００２３】このようにして、上記ＹＭ−８４Ｍ株とＯ
Ｃ−２Ｍ株の交雑から２０菌株、ＹＭ−１２６Ｍ株とＯ
Ｃ−２Ｍ株の交雑から１３菌株の交雑株を得た。得られ
た交雑株について、ＰＹＧ−Ｆ培地にて７℃、９６時間
培養した時の菌株の生育状況を調べ、ＹＭ−８４Ｍ株と
ＯＣ−２Ｍ株の交雑株の中からＨｙ−００２，Ｈｙ−０
１１，Ｈｙ−０１４の３菌株を、ＹＭ−１２６Ｍ株とＯ
Ｃ−２Ｍ株の交雑株の中からＨｙ−１０１，Ｈｙ−１０
３，Ｈｙ−１０５の３菌株をそれぞれ良好な生育能を有
する菌株として選抜した。

【００２４】これらの６菌株をＹＭ斜面培地で２年間に
わたり２０代継代培養の後に、４分子解析およびパルス
フィールド電気泳動に供してその安定性を試験した。そ
れぞれの交雑株の５０子嚢ずつについて子嚢解剖を行
い、その出芽能を調べた結果、いずれの菌株においても
生存胞子は得られなかった。また、パルスフィールド電
気泳動において、その核型は両親株の核型の総和で示さ
れ、継代培養後のＤＮＡバンドの本数及び移動度には変
化は認められなかった。したがって、サッカロミセス・
バイヤナスとサッカロミセス・セレヴィシエの異種間で
創製した交雑株は、雑種第一世代において２０代の継代
の後にも極めて安定であることが確認された。

【００２５】このようにして、安定性試験を行った交雑
株のＰＴＧ−Ｆ培地における生育・発酵能について検討
し、第１表及び第２表に示した結果を得た。これらの結
果から明らかなように、交雑株の７℃における比増殖速
度及び発酵速度は、サッカロミセス・バイヤナスＹＭ−
８４（ＲＩＦＹ １１１４），同ＹＭ−１２６（ＲＩＦ
Ｙ １２１６）と同様にサッカロミセス・セレヴィシエ
ＯＣ−２（ＩＡＭ ４２７４），同Ｗ３（ＲＩＦＹ １
００１）に比して大であった。他方、２８℃及び３５℃
では、これら菌株の比増殖速度、発酵速度及びエタノー
ル生成量はサッカロミセス・セレヴィシエＯＣ−２（Ｉ
ＡＭ ４２７４）に近似した値であり、創製した酵母菌
株が低温から中温までの幅広い発酵温度域において良好
な生育・発酵能を有することが判明した。

【００２６】

【表１】

【００２７】

【表２】

【００２８】実施例２ 創製された交雑株の６菌株及びこれらの親株であるサッ
カロミセス・バイヤナスＹＭ−８４（ＲＩＦＹ １１１
４），同ＹＭ−１２６（ＲＩＦＹ １２１６）並びにサ
ッカロミセス・セレヴィシエＯＣ−２（ＩＡＭ ４２７
４）を使用し、ブドウ糖にて糖度を２３度に調整した甲
州種葡萄果汁５リットルを原料としてワインを製造し
た。なお、発酵は同一果汁で２５℃、３日間培養した培
養液を２．５％量添加して１０℃の温度で所定期間行っ
た。得られたワインの分析結果を第３表に示す。

【００２９】

【表３】

【００３０】表から明らかなように、交雑株の６菌株の
発酵は親株である低温発酵性酵母のサッカロミセス・バ
イヤナスＹＭ−８４（ＲＩＦＹ １１１４）株や同ＹＭ
−１２６（ＲＩＦＹ １２１６）株と同様に極めて良好
であり、中温発酵性酵母のサッカロミセス・セレヴィシ
エＯＣ−２（ＩＡＭ ４２７４）株に比して、その発酵
日数は１５〜２０日間程度短縮された。また、交雑株６
菌株により製造したワインの成分について検討すると、
β−フェニルエチルアルコール，酢酸イソアミル，酢酸
−β−フェネチル及び脂肪酸エチルエステルの香気成分
が著量であり、サッカロミセス・セレヴィシエＯＣ−２
（ＩＡＭ ４２７４）株に比し、これら香気成分の生成
量は約２〜９倍であった。さらに、サッカロミセス・セ
レヴィシエＯＣ−２（ＩＡＭ ４２７４）株に比べてリ
ンゴ酸含量は約１．１〜１．２倍であり、酢酸含量は１
／３以下と少量であった。しかも、官能検査において
も、これら交雑株により製造したワインは香りに富む特
徴的な酒質であることが認められた。

【００３１】

【発明の効果】本発明によれば、低温及び中温の幅広い
温度域において良好な生育・発酵能を有し、かつ遺伝的
に安定な低・中温発酵性酵母が得られる。この新規低・
中温発酵性酵母を用いた低温下におけるワインの製造で
は、安定的に、かつ短期間に発酵を終了することがで
き、得られるワインは香りに富むものである。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成６年１１月４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２９】

【表３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 後藤 昭二 山梨県甲府市千塚４−５−13

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 化学分類法に基づいてサッカロミセス・
   バイヤナスに分類される酵母とサッカロミセス・セレヴ
   ィシエに分類される酵母を異種間で有性交雑して得ら
   れ、３〜３５℃の発酵温度域において優れた生育・発酵
   能を有し、かつ第１世代において遺伝的に安定であるサ
   ッカロミセス属に属する新規低・中温発酵性酵母。
2. 【請求項２】 サッカロミセス・バイヤナスに分類され
   る酵母がＹＭ−８４（ＲＩＦＹ １１１４）株，ＹＭ−
   １２６（ＲＩＦＹ １２１６）株，ＹＭ−８２（ＲＩＦ
   Ｙ １１１２）株およびＩＦＯ １９４８株のいずれか
   である請求項１記載の新規低・中温発酵性酵母。
3. 【請求項３】 サッカロミセス・セレヴィシエに分類さ
   れる酵母がＯＣ−２（ＩＡＭ ４２７４）株またはＷ３
   （ＲＩＦＹ １００１）株である請求項１記載の新規低
   ・中温発酵性酵母。
4. 【請求項４】 化学分類法に基づいてサッカロミセス・
   バイヤナスに分類される酵母とサッカロミセス・セレヴ
   ィシエに分類される酵母を異種間で有性交雑することを
   特徴とする請求項１記載の新規低・中温発酵性酵母の創
   製方法。
5. 【請求項５】 請求項１記載の新規低・中温発酵性酵母
   を使用し、３〜１０℃の温度で発酵を行うことを特徴と
   するワインの製造法。