JP3094107B1 - 高アルコール耐性酵母の育種法 - Google Patents

Abstract

【要約】 【解決手段】 ２−フロオロエタノール含有培地を用
い、耐性酵母を分離、育種する。 【効果】 （高アルコール耐性）高アルコール生産酵母
が得られるが、更にイソアミルアルコール含有培地によ
る選択法を併用することによって高アルコール耐性を有
し高アルコール生産性を有する酵母を短期間に且つ正確
に分離することができ、この分離株を使用することによ
り各種タイプの高アルコール酒類を製造することができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酵母の育種に関
し、さらに詳細には、アルコールの量が多い酒類、つま
り高アルコール濃度の酒類を製造することができる酵母
の育種に関するものである。また本発明は、このような
酵母の育種のほか、それによって分離した酵母及び当該
酵母を使用することによる酒類の製造期間の短縮、アル
コール生産量の増加を目的とした酒類の製造工程に関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】従来より高アルコールとなる酵母菌の分
離を目的として、アルコールもしくはその類似物に対す
る順応や薬剤耐性に付随した耐性酵母の育種が試行され
てきたが、前者の方法では順応選択による育種期間が長
くなり、後者においては高価な薬剤を使用する必要があ
り、さらに薬剤に対する特定箇所もしくは特定の形質を
有する変異が生ずる可能性が高い。一方、２−フルオロ
エタノールはエタノールの類似物として知られる安価な
薬剤であり、アルコールの代謝系に影響を与えることが
知られている（Mol. CellBiochem., 1 178(1998))が、
これを高アルコール生産酵母の選択培地に使用し、満足
すべき高濃度アルコールの酒類の製造に成功した例は従
来より全く報告されていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】酒類の製造等におい
て、より多くのアルコールの取得は従来より重要な課題
であり、高アルコール生産酵母について、種々の選択法
が開発されてきた。その中でも実用に供されているもの
としては、原らの２０％エタノール中での生存株の濃縮
による選択法（醸協、７１、３０１（１９７６））、秋
田らのイソアミルアルコール添加培地による選択法（発
酵工学、６８、９５（１９９０））がある。

【０００４】しかしながら、既知の方法は、選択に要す
る期間が数ケ月以上必要であるだけでなく、使用する薬
剤が高価であったり、すべての酵母に広く応用できると
いうものではなく、例えば、協会清酒１０号系酵母等に
対しては応用することができない等、未だ改良すべき点
を残している。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記したよ
うに、従来の選択法は、その選択に非常に長期間を要し
て実用的とはいえないだけでなく、特定の酵母にしか適
用できない等という現状に鑑み、従来より迅速にかつ広
範な菌株に対して、より効率的なアルコール生産という
目的を達成するための酵母育種の開発のためになされた
ものである。

【０００６】そこで本発明者らは、アルコール生産量の
増加等を目的とし、各方面から検討した結果、従来のア
ルコール順応法を改良することにより、高アルコール生
産及び耐性酵母の育種という技術的課題を設定した。す
なわち、本発明者らは新たに醸造用酵母からより多くの
アルコールを生産し、発酵後期においても死滅しにくい
酵母の分離を目指したものであり、実験の結果、２−フ
ルオロエタノールを用いた選択圧をかけることにより従
来の方法より広範な酵母に対し、かつ迅速に分離できる
方法を開発し、この方法によりサッカロマイセス（Sacc
haromyces）属セレビシエ（cerevisiae）を育種するの
に成功したものである。

【０００７】すなわち、本発明は、選択培地を用いて、
サッカロマイセス（Saccharomyces）属セレビシエ（cer
evisiae）に属する酵母の中から、多くのアルコールを
生産し、かつもろみ後期になっても死滅しにくい酵母を
分離、育種する点を基本的技術思想とするものである。
選択培地としては高アルコール生産酵母を分離、育種で
きる培地であれば全ての培地で使用可能であるが、例え
ば、２−フルオロエタノール含有培地は好適な培地の一
つである。以下、本発明を具体的に説明する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明を実施するには、サッカロ
マイセス（Saccharomyces）属セレビシエ（cerevisia
e）に属する酵母を用い、２−フルオロエタノール含有
選択培地で、２−フルオロエタノール耐性酵母を分離す
る。親株としてはサッカロマイセス（Saccharomyces）
属セレビシエ（cerevisiae）に属する酵母であればすべ
ての酵母が使用可能であり、実験室酵母ＤＢＹ７４６の
他、協会７号、協会９号、協会１０号、明利小川酵母
（協会１０号系酵母の源株）の清酒用、焼酎用、果実酒
用酵母等の実用酵母にも有利に使用することができる。

【０００９】本育種法では、親株として用いる酵母は、
変異処理をせず使用しても目的の酵母は分離可能である
が、通常の変異処理をした後に分離を行っても何ら支障
はない。本発明において変異酵母を得るには、変異方法
としてはいかなる方法でも良い。変異の物理的方法とし
ては、紫外線照射、放射線照射等があり、化学的方法と
しては、エチルメタンサルホネート、アクリジン系色素
等の変異剤に懸濁させる方法等があり、適宜利用可能で
ある。

【００１０】本発明においては、これらの変異方法が適
宜使用できるが、変異酵母の選択に特徴を有するもので
ある。すなわち、変異株の生育培地に２−フルオロエタ
ノールを含有させるものであるが、２−フルオロエタノ
ールが、酒類製造用酵母の選択培地に利用されたという
報告はない。本発明においては、目的とする変異酵母
は、２−フルオロエタノール含有培地で生育する株から
分離すればよいので（ポジティブセレクション）、分離
作業がきわめて容易であり、この点においても本発明の
育種法は優れている。

【００１１】本発明においては、このようにして２−フ
ルオロエタノール（以下、２−ＦＥということもある）
を含有する選択培地を用いることにより、目的とする高
アルコール耐性を有する高アルコール生産酵母を育種す
ることができるが、この２−ＦＥによる選択を第１段階
とし、これに秋田らによるイソアミルアルコール含有培
地による選択を第２段階として組み合わせることによ
り、更に効率的に目的とする酵母を分離、育種すること
ができ、その際２−ＦＥによる選択（第１段階）を２回
以上くり返すことにより、更に効率化が図られる。

【００１２】すなわち本発明は、この２段階選択法も包
含するものであって、今回開発した選択方法は２段階に
分かれる。まず、第１段階として、２−ＦＥによる選
択。第２段階として、秋田らのイソアミルアルコール含
有培地での選択である。

【００１３】なお、秋田らの方法では５％のエタノール
と０．６％から０．０５％増加したイソアミルアルコー
ル添加ＹＭ培地（以下、イソアミルアルコール培地と言
う）での選択を繰り返す。そのたびに、選択酵母が生育
するまで１〜２週間の期間がかかり、１．０％含有培地
で生育する株を取得するまで数ケ月以上の効間が必要で
ある。特に、協会１０号系酵母ではこの標準的な０．６
％での生育が思わしくなく、０．５％程度から始める必
要があった。

【００１４】この選択方法に今回開発した第１段階を加
えることにより、第２段階の０．６％含有培地での生育
が促されることが解った。０．８％増殖可能株を選択す
るまでに約１ケ月で完了することが解った。なお、０．
８％以上の増殖には１週間以上の生育期間が必要であっ
たのであるが、本発明は、２−ＦＥ法によって分離した
２−ＦＥ耐性酵母を用い、形質を安定させるために、イ
ソアミルアルコー含有培地での順応試験を行い、選択株
を用いて発酵試験を行いアルコールの多いものを短期間
に効率よく分離するものである。

【００１５】本発明は、また、高アルコール発酵にも関
するものであって、このようにして分離した２−ＦＥ耐
性株を用いる以外は、常法に従って処理すればよく、従
来の設備、装置をそのまま使用することができ、この点
も非常に優れている。

【００１６】本発明に係る育種法は、サッカロマイセス
・セレビシエに属する酵母であればすべての酵母に適用
することができる。例えば、実験室酵母、清酒酵母等を
高アルコール性に変異させることができ、これらの酵母
を使用することによって、それぞれ対応する高アルコー
ル発酵物を製造することができる。また、本法を醸造酢
製造用もろみや醸造アルコール製造用のもろみに用いる
酵母に適用して、アルコール生産性を向上させることも
可能である。

【００１７】更にまた、本発明は、２−ＦＥ耐性酵母は
アルコール生産性が高いことから、２−ＦＥ耐性を示す
ことを特徴とする高アルコール生産酵母、及びその利用
にも関するものである。

【００１８】２−ＦＥ耐性高アルコール生産酵母は従来
全く知られておらず、今回本発明者らによって初めて発
見されたものであり、高アルコール生産性と高アルコー
ル耐性を併有する点で極めて特徴的な酵母であるので、
本菌を工業技術院生命工学工業研究所にＦＥＲＭ Ｐ−
１７５７２として寄託した。

【００１９】本発明は、２−ＦＥ耐性と高アルコール生
産性が密接に関連している点を初めて明らかにし、この
現象を工業的に利用したものであって、画期的なもので
ある。

【００２０】本発明に係る２−ＦＥ耐性高アルコール生
産酵母は、親株を人工変異させあるいはさせることなく
（自然変異）、２−ＦＥ含有選択培地で選択し、高アル
コール生産株を分離する事にあり、分離、育種の方法に
は格別限定されない。本発明によればこのようにして高
アルコール生産性及び／又は高アルコール耐性を有する
酵母を分離、選択することができ、全体としてすぐれた
高アルコール生産株を分離することができる。

【００２１】そのうえ本発明によれば、更にイソアミル
アルコール選択法によってアルコール耐性酵母を選択す
る工程を有機的に結合することにより、更にすぐれた高
アルコール耐性及び／又は高アルコール生産性を有する
酵母を短時間に効率的に分離、選択することができ、全
体として更にすぐれた高アルコール生産株を分離するこ
とができる。また、遺伝子操作によって目的とする耐性
形質を付与し、高アルコール生産酵母を直接造成しても
よい。

【００２２】このように分離した２−ＦＥ耐性高アルコ
ール生産酷母を用いる酒類の製造ないしアルコール発酵
は、先に述べた場合と同様に行えばよい。以下、本発明
の実施例について述べる。

【００２３】

【実施例１：２−ＦＥ耐性酵母の分離法】サッカロマイ
セス（Saccharomyces）属セレビシエ（cerevisiae）に
属する協会９０１号、協会１００１号清酒酵母（以下、
それぞれＫ−９０１，Ｋ−１００１と略す）及び泡なし
明利小川酵母（以下、ＭＮＦと略す）を、ＹＭ培地（イ
ーストエキス０．３％、モルトエキス０．３％、ペプト
ン０．５％、ブドウ糖１％）に接種し、３０℃、２４時
間振とう（１２０ｒｐｍ）で増殖させた。

【００２４】この酵母懸濁液２％（終濃度で１０⁵ｃｅ
ｌｌｓ／ｍｌ）をブドウ糖をグリセロール１％に変えた
ＹＭ培地に２−ＦＥ１０％を含む培地に添加し、３０
℃、２〜３日間静置増殖させた（２−ＦＥ処理）。この
培養液を適宜希釈し、ＹＭ寒天培地（ＹＭ培地に２％寒
天を添加）に植菌し、生育の良い単一コロニーを選択し
た。この株について再度２−ＦＥ処理を繰り返し、ＹＭ
寒天培地での生育の良い単一コロニーを分離株とした。

【００２５】

【実施例２：２−ＦＥ耐性株からのアルコール耐性株の
分離】供試酵母について、２−ＦＥ処理によるイソアミ
ルアルコール耐性試験を行った。得られた結果を下記表
１に示すが、その結果から供試酵母について２−ＦＥ処
理により表１のようにイソアミルアルコールに対する耐
性が向上していることが解った。なお、耐性試験は０．
６〜１．０％のイソアミルアルコールと５％エタノール
を含むＹＭ寒天培地に白金針で１０株ずつ植菌し、３０
℃２日間の培養後、生育可能・やや生育・生育不可の判
定を行った。生育可能なものの割合を表中に示した。

【００２６】 （表１） ２−ＦＥ処理によるイソアミルアルコール耐性試験結果 イソアミルアルコール(％) ０.６ ０.７ ０.８ ０.９ １.０ （無処理） Ｋ−９０１ 0 0 0 0 0 Ｋ−１００１ 0 0 0 0 0 ＭＮＦ 0 0 0 0 0 （１回処理） Ｋ−９０１ 100 20 0 0 0 Ｋ−１００１ 70 10 10 0 0 ＭＮＦ 90 0 0 0 0 （２回処理） Ｋ−９０１ 100 80 60 40 40 Ｋ−１００１ 100 70 30 30 20 ＭＮＦ 100 90 20 10 0

【００２７】このように２−ＦＥ処理を繰り返すことに
より、高濃度のイソアミルアルコール含有培地での生育
可能な株の割合が向上していることが解った。生育の良
かった株について、秋田らの方法（発酵工学 ６８ ９
５（１９９０））に基づき０．６％イソアミルアルコー
ルを含むＹＭ培地でアルコール耐性株の選択を行った。
イソアミル含有培地においても選択株の生育は良好で、
秋田らの方法では１ステップの増殖に要する時間が１〜
２週間かかるところを２−ＦＥ耐性株では２〜３日とな
った。さらに、０．１％ずつイソアミルアルコール濃度
を上げ、０．８％に達した時点でアルコール耐性株とし
て、９０１Ｒ、１００１Ｒ、ＭＮＦＲと命名し、以下の
実施例に使用した。なお、１００１Ｒを生命研に寄託し
た（Saccharomyces cerevisiae K-1001R: FERM P-1757
2）。

【００２８】

【実施例３：分離株の特性】分離株の増殖性を確認する
ため、前培養菌体を１０⁶／ｍｌになるように、ＹＭ培
地及び０．５％イソアミルアルコール・５％エタノール
添加ＹＭ培地に接種し、２５℃で静置培養し、経時的に
吸光度６６０ｎｍで増殖を測定した。図１、図２に示す
とおり、取得株のＹＭ培地での増殖性はほぼ同じで、
０．５％イソアミルアルコール・５％エタノール添加Ｙ
Ｍ培地での増殖性は親株より優れていた。なお、図中、
各記号はそれぞれ次の供試株を表わす（以下同じ）。 記号：○：Ｋ−９０１ △：Ｋ−１００１ □：ＭＮＦ ●：ｋ−９０１Ｒ ▲：Ｋ−１００１Ｒ ■：ＭＮＦＲ

【００２９】また、５０ｇ総米の一段仕込みの小仕込み
で２０日目のもろみに３０％エタノールを添加し、もろ
み濃度を２０％にそろえ、経時的にメチレンブルー染色
法により死滅率（国税庁所定分析法注解）を測定した結
果を図３に示した。添加後１０日目の死滅率を親株と比
較すると、それぞれ１５〜２０％程度低いものとなり、
高アルコール中での生存性が向上していた。以上の結果
より、発酵もろみ中でも初期の順調な発酵経過ともろみ
末期の酵母死滅による弊害が回避できることが確認され
た。

【００３０】また、その他の性質としては、細胞壁溶解
酵素に対する耐性（原らの方法に基づき測定した（醸
協、７１、３０１（１９７６））を親株に比べると獲得
していることが認められた。

【００３１】すなわち、今まで知られている多くのアル
コール耐性株が細胞壁溶解酵素に対する耐性も同時に獲
得していることが報告されている。そこで、溶菌耐性を
細胞壁溶解酵素Zymolyase100Tに対する溶解率を見た。
なお、溶解率は、（処理前の濁度−処理後の濁度）／処
理前の濁度をＡとすると、 溶解率（Ｔ．Ｒ．Ｒ．％）＝Ａ×１００ で表わされ、測定の結果、親株に比べ耐性株は、処理し
て２時間後の溶菌率でそれぞれ５０〜７０％前後でそれ
ぞれ溶菌しにくくなっていることが確認され、溶菌耐性
を獲得していることが確認された。なお、抗生物質等に
対する多剤薬剤耐性の獲得については、現時点では確認
できなかった。

【００３２】

【実施例３：清酒小仕込み試験】９０１Ｒ及び１００１
Ｒを用い、難波らの方法（醸協 ７３ ２９５（１９７
８））に基づき総米２００ｇ、汲み水歩合１３０％の三
段仕込みの小仕込み試験を行った。留め後の品温は１５
℃一定とし、炭酸ガス減量により経過を測定した。発酵
経過を図４に示す。予測どおりもろみ初期の立ち上がり
も順調で、末期の経過も順調に推移した（１９日目以降
は分割したもろみ量を補正した炭酸ガス減量を記載し
た）。留め後１９日目にもろみを２分割し、最終２２日
目まで発酵経過を見、それぞれのもろみの分析を行った
結果を表２及び表３に示した。なお、分析は国税庁所定
分析法注解に基づいて行った。なお、ブドウ糖（％）
は、ＡＢＬＥ社製Ｇｌｕｃｏ Ｊｒ．（ＤＴ−１０Ｇ
２）を使用し、酵母純度がＴＴＣ染色法により求めた。

【００３３】 （表２） 小仕込み試験結果１ （留め後１９日目） ９０１ １００１ ９０１Ｒ １００１Ｒ ＡＬＣ（％） 19.4 19.6 20.0 20.2 日本酒度 0.0 0.0 +3.0 +3.0 酸 度 2.0 1.7 1.8 2.2 アミノ酸度 1.9 1.9 1.8 1.6 ブドウ糖（％） 0.8 0.9 0.6 0.5 酵母密度（10⁸/g-モロミ） 3.5 3.9 4.1 3.4 死滅率（％） 10.7 16.1 4.7 9.6 酵母純度（％） 98.9 100.0 99.1 100.0 ＯＤ４３０ｎｍ 0.003 0.004 0.002 0.001 ＯＤ２６０ｎｍ 16.6 19.3 18.9 18.1

【００３４】 （表３） 小仕込み試験結果２ （留め後２２日目） ９０１ １００１ ９０１Ｒ １００１Ｒ ＡＬＣ（％） 19.6 19.8 20.4 20.6 日本酒度 0.0 +0.5 +5.0 +5.0 酸 度 2.0 1.7 2.0 2.1 アミノ酸度 2.4 2.3 2.0 2.0 ブドウ糖（％） 1.0 0.9 0.7 0.6 酵母密度（10⁸/g-モロミ） 3.4 3.7 4.1 3.4 死滅率（％） 23.7 21.7 13.2 15.5 酵母純度（％） 99.1 99.5 100.0 100.0 ＯＤ４３０ｎｍ 0.005 0.004 0.003 0.004 ＯＤ２６０ｎｍ 22.1 22.7 19.9 20.3

【００３５】上記結果から明らかなように、もろみ中の
死滅率は、親株に比べ、１９日目で６％前後、２２日目
で６〜１０％前後低く押さえられ、その影響として考え
られる、アミノ酸度、紫外部吸収（ＯＤ２６０ｎｍ）も
低い値で推移した。また、もろみ末期のアルコール生成
も１９〜２２日目の変化が親株で０．２％の増加に留ま
っているのに比べ、０．４％程度増加しており、アルコ
ール耐性株使用の効果が認められた。

【００３６】

【発明の効果】実用酵母からその優れた醸造特性を損な
うことなく新規に有用な形質を付与することは多くの時
間と労力を要するものである。本発明は２−フロオロエ
タノール存在下で生育する株を選択するポジティブセレ
クションを基本としており、目的とするアルコール耐性
株のみを短期かつ確実に分離できる。本分離法は実用酵
母の育種において極めて有効である。そして、分離、育
種した酵母を使用することにより、アルコール含量の高
い酒類をもろみ末期の酵母の死滅による弊害を少なくし
製造することができる。

【００３７】また、この２−ＦＥによる選択法にイソア
ミルアルコール含有培地による選択法を併用することに
より、目的とする（高アルコール耐性）高アルコール生
産性を有する酵母を短期間、確実、且つ効率的に分離す
ることができる

【図面の簡単な説明】

【図１】ＹＭ培地での増殖試験を示す。

【図２】０．５％イソアミルアルコール・５％エタノー
ル添加培地中での増殖試験を示す。

【図３】アルコール２０％もろみ中でのアルコール耐性
試験を示す。

【図４】総米２００ｇの小仕込み試験（発酵経過）を示
す。

フロントページの続き (72)発明者 秋田 修 広島県東広島市鏡山３丁目７番１号 国 税庁醸造研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 1/16 C12N 1/38

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 サッカロマイセス・セレビシエ（Saccha
   romyces cerevisiae）に属する醸造用酵母を、変異処理
   することなく又は変異処理した後、２−フルオロエタノ
   ールを含有する選択培地を用いて高アルコール生産酵母
   を選択分離すること、を特徴とする高アルコール生産酵
   母の育種方法。
2. 【請求項２】 更に、イソアミルアルコールを含有する
   選択培地を用いて高アルコール生産酵母を選択分離する
   こと、を特徴とする請求項１に記載の育種方法。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載の方法によって育
   種、分離された高アルコール生産酵母。
4. 【請求項４】 該高アルコール生産酵母が高アルコール
   耐性を有するものであること、を特徴とする請求項３に
   記載の高アルコール生産酵母。
5. 【請求項５】 サッカロマイセス・セレビシエ（Saccha
   romyces cerevisiae） K-1001R (FERM P-17572)。
6. 【請求項６】 請求項３〜５のいずれか１項に記載した
   酵母を使用すること、を特徴とする高アルコール酒類の
   製造方法。
7. 【請求項７】 請求項６に記載した方法によって製造し
   てなる、アルコール含量の高い酒類。