JP5710132B2 - カプロン酸エチル生成促進酵母株、その製造方法、および、それを用いた発酵産物の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明のカプロン酸エチル生成促進酵母株は、前述のように、FAS2遺伝子の3748位のGがAに変異したホモ接合型のFAS2変異を有する酵母株であることを特徴とする。
本発明の製造方法は、酵母により発酵産物を製造する方法であって、前記酵母として、前記本発明のカプロン酸エチル生成促進酵母株を使用することを特徴とする。
(1)ホモ接合型変異株の取得
ホモ接合型野生株として、協会9号(財団法人日本醸造協会)の酵母を使用した。前記協会9号から特開平08−23954の方法に従い、セルレニン耐性株であるヘテロ接合型変異株を取得した(以下、「GRI−117−Cerr」という)。具体的には、協会9号を、YPD培地(2% グルコース、2% ポリペプトンおよび1% 酵母エキス)5mLに植菌し、30℃で1日培養した後、菌体を集菌、洗浄した。この洗浄菌体に、0.2mol/L リン酸緩衝液(pH8.0)5mL、40%ブドウ糖溶液0.25mLおよびエチルメタンサルホネート0.25mLを加え、30℃で1時間、ゆっくり攪拌しながら変異処理を行った。処理後、回収した菌体を滅菌水で洗浄し、セルレニン(最終濃度2μg/mL)を含むYPD寒天培地(YPD培地に寒天2%を加えたもの)に塗沫した。この培地に生育したセルレニン耐性株のFAS2遺伝子のシークエンス解析を行い、ヘテロ接合型であることを確認した。このGRI−117−Cerr株をヘテロ接合型変異株として使用した。
前記ホモ接合型変異株、ヘテロ接合型変異株、ホモ接合型野生株を、それぞれ、YPD液体培地(2% グルコース、2% ポリペプトンおよび1% 酵母エキス)を用いて、30℃で50時間、振とう培養を行った。
(3−1) 前記ホモ接合型変異株、ヘテロ接合型変異株およびホモ接合型野生株を、それぞれ、前記YPD液体培地を用いて、30℃で3日間、振とう培養した。培養後の菌体を回収し、滅菌水で洗浄した後、滅菌水で2×104細胞/μLになるように再度懸濁した。この懸濁液を、104倍、103倍、102倍、10倍と段階的に希釈して、0、2、4、6、8および10μg/mLのセルレニンを含む前記SD寒天培地に5μLずつ塗布し、30℃で静置培養した。培養5日後の各プレート(0、2、4、6および8μg/mL)の写真を、図3に示す。図3の各セルレニン濃度のプレートは、左から、前記懸濁液を、10倍、102倍、103倍、104倍希釈した結果である。
前記(3)と同様にして、前記ホモ接合型変異株、ヘテロ接合型変異株およびホモ接合型野生株について、培養菌体の懸濁液を準備し、4μg/mLのセルレニンを含むSD寒天培地に、1×106細胞/プレートになるように塗布し、30℃で静置培養した。培養5日後の各プレートでの生育度合を、前記(3)と同様にして評価した。そして、前記各プレートで生育したコロニーを、再度、前記YPD液体培地を用いて、30℃で3日間、振とう培養し、集菌、洗浄後、4μg/mLのセルレニンを含むSD寒天培地に、1×106細胞/プレートになるように塗布し、30℃で静置培養するという工程を繰り返し行った。これによって、継代による形質の安定性を確認した。下記表3に、継代回数と生育度合を示す。
前記ホモ接合型変異株、ヘテロ接合型変異株、ホモ接合型野生株を、それぞれ、下記組成となるように仕込み、15℃で18日間インキュベートした。そして、各仕込み液について、経時的な炭酸ガス減少量の変化を確認し、アルコメイト(理研計器社製)によって、経時的なアルコール含有率の変化を確認した。また、仕込みを18日間行った後の仕込み液を、12000×gで15分間遠心分離して、その上清をヘッドスペースガスクロマトグラフィーに供し、酢酸エチル、n−プロパノール、イソブチルアルコール、イソアミルアルコール、酢酸イソアミル、カプロン酸エチルなどの香気成分の含有量を確認した。
α化米(精米歩合70%) 200g
乾燥麹 40g
水 365g
乳酸 50μL
(1)ホモ接合型変異株の取得
ヘテロ接合型変異株として、協会1801号(K−1801)株(日本醸造協会)を使用した。
前記ヘテロ接合型変異株(K−1801)、実施例2の前記(1)で取得した5種類のホモ接合型変異株(K−1801−CHR−1、K−1801−CHR−2、K−1801−CHR−3、K−1801−CHR−4、K−1801−CHR−5)を使用した以外は、前記実施例1と同様にして、16日間の仕込みを行い、日本酒度、ならびに、エタノール、グルコースおよびカプロン酸エチル等の各種香気成分の含有量を確認した。グルコースの測定は、ADAMS(登録商標)Glucose(商品名、アークレイ社製)を使用した。日本酒度の測定は、国税庁所定分析法注解(日本醸造協会)に基づいて分析を行った。また、香気成分は、それぞれ、ヘッドスペースガスクロマトグラフィーにより分析した。これらの結果を、下記表5に示す。
前記(2)で得られた、16日間の仕込みを行った仕込み液について、専門パネラー5名によるブラインドでの官能試験を行い、吟醸酒としての評価を行った。この結果を、下記表6に示す。評価点は、1から5の5段階評価とし、1が最も吟醸酒として好評であることを示す。下記表6に示すように、ホモ接合型変異株を使用することで、官能評価に優れた清酒を醸造することができた。
Claims (3)
- カプロン酸エチル生成促進酵母株のスクリーニング方法であって、
候補酵母株であるFAS2遺伝子の3748位のGがAに変異したヘテロ接合型のFAS2変異を有する酵母株を、セルレニン濃度6〜10μg/mLの条件下で培養し、セルレニン耐性を示す酵母株を、FAS2遺伝子の3748位のGがAに変異したホモ接合型のFAS2変異を有するカプロン酸エチル生成促進酵母株として選択する工程を有することを特徴とするカプロン酸エチル生成促進酵母株のスクリーニング方法。 - さらに、前記選択工程で選択された酵母株について、FAS2遺伝子の3748位の塩基のタイピングを行う工程を含む、請求項1記載のカプロン酸エチル生成促進酵母株のスクリーニング方法。
- カプロン酸エチル生成促進酵母株の製造方法であって、
請求項1または2記載のスクリーニング方法によって、候補酵母株から、セルレニン濃度6〜10μg/mLの条件下でセルレニン耐性を示す酵母株を、FAS2遺伝子の3748位のGがAに変異したホモ接合型のFAS2変異を有するカプロン酸エチル生成促進酵母株として選択する工程を有することを特徴とするカプロン酸エチル生成促進酵母株の製造方法。
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