JP3026200B2 - 高濃度アルコール含有もろみを製造する酵母の育種法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酵母の育種に関
し、さらに詳細には高濃度のアルコールを含有するもろ
みを製造する酵母の育種に関するものである。また本発
明は、このような酵母の育種の他、それによって分離し
た酵母及び当該酵母を使用することにより酒類に関する
アルコール生産量の増加等を目的とした、酒類の効率的
製造工程に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】これまでに、高濃度のアルコールで生存
する酵母を分離することによって、高濃度のアルコール
を含有するもろみを製造する酵母菌の分離を目的とした
育種例はある。しかし、これ以外の方法で目的とする酵
母を迅速且つ確実に選択することのできる、満足できる
育種方法は未だ確立されていない。

【０００３】一方において、オリゴマイシンは、抗生物
質として有用であることは知られているが、これが高濃
度のアルコールを含有するもろみを製造する酵母の選択
培地に使用され満足すべき酒類の製造に成功した例は従
来全く報告されていない。

【０００４】また、ピルビン酸に着目し、ピルビン酸を
培養液中に多量に含む酵母を育種することによりアルコ
ール収得量の増加に成功した例は従来全く報告されてい
ない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】酒類製造において、ア
ルコール収得量の増加は従来より重要な課題である。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は上記したよう
に、従来より高濃度のアルコールを含有するもろみを製
造することによりアルコールの収得量の増加を達成する
ためになされたものである。

【０００７】そこで発明者らは、より高濃度のアルコー
ルを含有するもろみを製造することによりアルコールの
収得量の増加を目的とし、その目的達成のために高濃度
のアルコールを含有するもろみを製造する酵母の育種と
いう新規な技術的課題を設定した。すなわち、本発明者
らは、新たに醸造酵母から高濃度のアルコールを含有す
るもろみを製造する酵母育種を目指したものであり、実
験の結果、選択培地を利用することにより、従来の酵母
に比較して高濃度のアルコールを含有するもろみを製造
する酵母の分離方法を開発し、この方法によりサッカロ
マイセス（Saccharomyces）属セレビシエ（cerevisia
e）を育種するのに成功したものである。

【０００８】すなわち、本発明は、選択培地を用いて、
サッカロマイセス（Saccharomyces）属セレビシエ（cer
evisiae）に属する酵母の中から、高濃度のアルコール
を含有するもろみを製造する酵母を分離、育種する点を
基本的技術思想とするものである。選択培地としては、
高濃度のアルコールを含有するもろみを製造する酵母を
分離、育種できる培地であればすべての培地が使用可能
であるが、例えばオリゴマイシン含有培地は好適な培地
の一つである。

【０００９】また、上記に従って高濃度のアルコールを
含有するもろみを製造する酵母として分離したオリゴマ
イシン耐性酵母について研究をすすめ、改めてその耐性
に着目し、検討した結果、オリゴマイシン耐性酵母がオ
リゴマイシン耐性を有することはもちろんのこと、オリ
ゴマイシンとは構造的に相違するシクロヘキシミド等の
抗生物質その他の薬剤に対しても耐性を有するという全
く新規な性質を有することをはじめて発見した。

【００１０】すなわち本発明は、また、多数の薬剤に対
して耐性を示すという現象が発酵能力及びアルコール耐
性の増加に大きく寄与していることを更に発見し、これ
ら有用な新知見に基づき、更に検討の結果完成されたも
のであって、２以上の薬剤に対して耐性を示す多剤薬剤
耐性を有する酵母が発酵能力及びアルコール耐性の増加
を示すという新規な性質を利用して、高濃度のアルコー
ルを含有するもろみを製造する酵母の効率的選択、同酵
母の創製を包含する酒類を創製するトータルシステムに
も関与するものである。

【００１１】また本発明者らは、もろみ中のアルコール
濃度を高める方法として、アルコール生産性の高い酵母
を育種してこれを利用する、いわば直接的な方法のほ
か、全く発想を転換して、酵母活性を高め、アルコール
発酵期間を長期間化することにより、高濃度のアルコー
ルを含有するもろみを製造し、結果としてアルコール収
得量を増加する、いわば間接的な方法にはじめて着目し
た。

【００１２】そこで本発明者らは、上記したもろみを製
造することのできる酵母を選択、分離する方法について
各方面から研究した結果、ピルビン酸、しかも培養液中
のピルビン酸濃度にはじめて注目した。本発明者らは、
そこで、ピルビン酸を培養液中に多く含む酵母を選択す
ることにより、アルコール発酵において、酵母活性を高
くし、アルコール発酵期間を長期化することにより、高
濃度のアルコールを含有するもろみを製造し、結果とし
てアルコール収得量の増加が達成できるとの新規着想を
得た。

【００１３】そして、上記のようにして選択培地等を用
いて分離、選択した高濃度アルコール生産性酵母につい
て、これをグルコース含有培地で培養したところ、培養
中のピルビン酸含量が増加していることを確認し、上記
した新規着想の技術的裏付けを得た。従来、このように
ピルビン酸を培養液中に多量に含む酵母を育種すること
によりアルコール収得量の増加に成功した例は全く知ら
れていない。

【００１４】すなわち本発明は、このように、ピルビン
酸を多く培地中に含有する現象が発酵能力及びアルコー
ル耐性の増加に大きく寄与していることを更に発見し、
これら有用な新知見に基づき、更に検討の結果完成され
たものであって、ピルビン酸を多く培地中に含有する酵
母が発酵能力及びアルコール耐性の増加を示すという新
規な性質を利用して、高濃度のアルコールを含有するも
ろみを製造する酵母の効率的選択、同酵母の創製を包含
する酒類を創製するトータルシステムにも関与するもの
である。以下、本発明を具体的に説明する。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明を実施するには、サッカロ
マイセス（Saccharomyces）属セレビシエ（cerevisia
e）に属する酵母を用い、オリゴマイシン含有培地等の
選択培地を用いてそれぞれオリゴマイシン耐性酵母を分
離する。あるいは、２種以上の薬剤に対して耐性を示す
多剤薬剤耐性酵母を選択、分離する。あるいは、グルコ
ース含有培地で酵母を培養し、培養した培養液を分析し
て、ピルビン酸が多くなっている酵母を分離すればよ
い。

【００１６】本発明においては、上記した方法を単用し
ただけでも目的とする酵母の分離、育種が充分に可能で
あるが、これらの方法を１又はそれ以上適宜組み合わせ
て行うことも可能であって、更にすぐれた酵母の分離、
育種やその効率化等を達成することができる。例えば、
選択培地でオリゴマイシン耐性酵母を分離した後、及び
／又は、多剤薬剤耐性酵母を分離した後、これ（ら）の
酵母をグルコース含有培地で培養し、培養液中にピルビ
ン酸含量の多い酵母を選択することにより、更にすぐれ
た酵母を効率的に分離、育種することができる。

【００１７】親株としてはサッカロマイセス（Saccharo
myces）属セレビシエ（cerevisiae）に属する酵母であ
ればすべての酵母が使用可能であり、清酒酵母、ワイン
酵母、ビール酵母の実用酵母にも有利に使用することが
できる。例えば、清酒酵母（協会７号酵母、協会９号酵
母等）、ワイン酵母（ブドウ酒１号酵母（日本醸造協会
ブドウ酒１号酵母）、ブドウ酒３号酵母、ブドウ酒４号
酵母等）、ビール酵母、パン酵母等の実用酵母、その他
アルコール発酵に常用される酵母を含めサッカロマイセ
ス（Saccharomyces）属セレビシエ（cerevisiae）に属
する酵母であればすべての酵母が有利に使用できる。

【００１８】本育種法では親株として用いる酵母は変異
処理をせずに使用しても目的の酵母は分離可能である
が、通常の変異処理をしたあとに分離を行ってもなんら
支障はない。本発明において変異酵母を得るには、変異
方法としては、いかなる方法でもよい。変異の物理的方
法としては、紫外線照射、放射線照射などがあり、化学
的方法としては、変異剤、例えば、エチルメタンサルホ
ネート、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝
酸、アクリジン系色素などの溶液に懸濁させる方法があ
り、これらの方法が適宜利用可能である。

【００１９】本発明においては、これらの変異方法が適
宜使用できるが、変異酵母の選抜に特徴を有するもので
ある。すなわち変異株の生育培地にオリゴマイシンを含
有するものである。オリゴマイシンは、抗生物質として
は知られているが、酒類製造用酵母の選択培地に利用さ
れたという報告はない。本発明においては、目的とする
変異酵母は、オリゴマイシン含有培地で生育するコロニ
ーから分離すればよいので（ポジティブセレクショ
ン）、分離作業が容易かつシンプルであり、この点にお
いても本発明の育種法は優れている。

【００２０】このように分離したオリゴマイシン耐性酵
母をグルコースを含有する培地に培養し、培養した培養
液を分析し、ピルビン酸が多くなっている酵母を分離す
る。この酵母を用い発酵試験を行い、アルコール濃度が
増大したものを分離する。

【００２１】

【実施例１：オリゴマイシン耐性酵母の分離法】サッカ
ロマイセス（Saccharomyces）属セレビシエ（cerevisia
e）に属する協会９号清酒酵母（以下Ｋ−９と略す）、
ＹＰＤ培地（イーストエクストラクト１％、ポリペプト
ン２％、グルコース２％）に接種し、増殖させた後、無
菌的に集菌洗浄し、その０．１ｍｌをオリゴマイシン
（０．００１ｍｇ／ｍｌ）を含むＹＮＢ寒天培地（イー
ストニロゲンベース０．６７％、グリセロール３％）に
塗布し、３０℃で培養し、生育したコロニーをオリゴマ
イシン（０．００１ｍｇ／ｍｌ）を含むＹＮＢ寒天培地
に更に植え継いだ。

【００２２】

【実施例２：オリゴマイシン耐性酵母からのピルビン酸
を培地中に多く含む酵母の分離】実施例１で分離したオ
リゴマイシン耐性酵母株について、ＹＰＤ培地（グルコ
ース濃度は３０％）で、発酵試験を行い、３０℃、７日
間培養後、培地中のピルビン酸含量が多い株を選択し、
これをＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ ＯｌｉＲと命名し、工業技術院生命工学工業技術
研究所にＦＥＲＭＰ−１６８８９として寄託した。

【００２３】

【実施例３：オリゴマイシン耐性酵母からの高濃度のア
ルコールを含有するもろみを製造する酵母の分離】実施
例２で分離したオリゴマイシン耐性酵母株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１６８８９）について、７０％精米の白米を使用し
て、下記の表１に示す仕込配合で三段仕込を行った。酵
母には酵母懸濁液を用い（仕込水１ｍｌ当たり５×１０
⁶個）、添えは１５℃、仲は１２℃、留は９℃で行い、
翌日より１５℃になるまで１℃／日で品温を上げ、その
後は１５℃一定で発酵させた。発酵液中にエタノール
は、アルコメイト（ウッドソン（株））を用いて測定
し、酸度は０．１Ｎ ＮａＯＨで、アミノ酸度は０．１
Ｎ ＮａＯＨ、ホルマリン溶液（５０％水溶液）を用い
て国税庁所定分析法にのっとり分析を行った。

【００２４】

【表１】

【００２５】ＹＰＤ培地（３０％グルコース）での培養
試験結果を表２に示すが、その結果明らかなように、親
株のＫ−９に対して、分離したオリゴマイシン耐性酵母
の中からピルビン酸を多く培地中に含有するものが得ら
れ、高濃度のアルコールを含有するもろみを製造する株
が得られた。

【００２６】

【表２】

【００２７】選択培地におけるオリゴマイシンの濃度と
しては０．０００５ｍｇ／ｍｌ〜０．０１５ｍｇ／ｍｌ
の範囲が一応の目安になるが、毒性の悪影響がなければ
上記濃度より高濃度としてもよいし、有効性が認められ
るのであれば上記範囲より低濃度としてもよい。

【００２８】オリゴマイシン耐性酵母の仕込中の炭酸ガ
ス減量経過を下記表３に示すが、その結果から明らかな
ように、親株のＫ−９に対して、分離したオリゴマイシ
ン耐性酵母の中から、より高濃度のアルコールを含有す
るもろみを製造する株が得られた。

【００２９】

【表３】

【００３０】上記したようにオリゴマイシン耐性酵母を
用いて醸造した醸造酒について、その上槽時のアルコー
ル分、酸度、アミノ酸度を測定した。得られた結果を表
４に示す。

【００３１】

【表４】

【００３２】上記したところから明らかなように、本方
法によって分離、育種した酵母は、より高濃度のアルコ
ールを含有するもろみを製造するという特徴を有し、本
酵母を使用することにより、アルコール収得量が増加す
ると同時に、醸造酒においては、アミノ酸が少ないもの
を製造することができる。なお本実施例においては一例
としてＫ−９を親株として用いたが、他の酵母からも同
様の方法でオリゴマイシン耐性酵母を簡便且つ迅速に分
離することができる。

【００３３】このようにして選択分離した酵母菌株は、
通常の酵母と同様に使用することにより、すぐれた醸造
酒を製造できる。また本法を醸造酢製造用のもろみや醸
造アルコール製造用のもろみに用いる酵母に適用してア
ルコール生産性を向上させることも可能である。

【００３４】更にまた、本発明は、多剤薬剤耐性酵母
は、より高濃度のアルコールを含有するもろみを製造す
ることから、２以上の薬剤に対して耐性を示す多剤薬剤
耐性を示すことを特徴とする高アルコール生産酵母、及
び、その利用にも関するものである。

【００３５】例えば、後述するように、本法によって分
離育種した、より高濃度のアルコールを含有するもろみ
を製造する酵母（例えば、Saccharomyces cerevisiae O
liR：FERM P-16889）は、オリゴマイシンに対して耐性
を有することはもちろんのこと、シクロヘキシミド、フ
ルフェナジン、セルレニン、クロラムフェニコール等に
も耐性を示している。（表５）

【００３６】

【表５】

【００３７】薬剤としては、上記薬剤のみに限定される
ものではなく、要は、２以上の多数の薬剤に対して抵抗
性を示すことが重要であって、本発明は、多剤薬剤耐性
とアルコール収得量が密接に関連している点をはじめて
明らかにし、この現象を工業的に利用した点に特徴を有
するものである。

【００３８】本発明に係る多剤薬剤耐性による、より高
濃度のアルコールを含有するもろみを製造する酵母は、
親株を人工変異させあるいは人工変異させることなく
（自然変異）、１又はそれ以上の薬剤含有選択培地で選
択し、より高濃度のアルコールを含有するもろみを製造
する株を分離したり、その他耐性菌の分離に用いられる
常法にしたがって目的変異株をスクリーニングしてもよ
く、分離、育種の方法には格別制限されない。また、遺
伝子操作によって目的とする多様薬剤耐性を付与し、よ
り高濃度のアルコールを含有するもろみを製造する酵母
を直接的に創製してもよい。

【００３９】本発明方法によって分離したＫ−９ Ｏｌ
ｉＲ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６８８９）は、グルコース含
有培地で培養すると、培地中のピルビン酸濃度が高く、
また親株より高濃度のアルコールを含有するもろみを製
造することが確認された。

【００４０】

【発明の効果】実用酵母からその優れた醸造特性を失う
ことなく新規にして有用な形質を獲得した変異株を分離
することは、一般に多くの労力を要する困難な作業であ
る。本発明は、抗生物質耐性酵母を分離するポジティブ
セレクションし、目的とする変異株を効率的に分離でき
る点を基本としており、本分離法の活用は、実用酵母の
育種において有効である。

【００４１】また、２以上の多くの薬剤に対して耐性を
示す多剤薬剤耐性現象が、ピルビン酸代謝に関与し、更
にもろみ中のアルコール濃度の向上に寄与しているとい
う新規知見により、多剤薬剤耐性を利用する新規な、よ
り高濃度のアルコールを含有するもろみを製造する酵母
の効率的スクリーニングシステムも確立された。

【００４２】また本発明は、酵母活性を高め、アルコー
ル発酵期間を長期間化することにより、高濃度のアルコ
ールを含有するもろみを製造し、結果としてアルコール
収得量を増加するという新たな技術課題を設定し、この
技術課題を解決することのできる酵母を、培養液中のピ
ルビン酸濃度を指標にして分離、育種することによって
はじめて成功した点でもきわめて特徴的である。

【００４３】そして、上記したピルビン酸による方法
は、これ単独でも高濃度のアルコールを含有するもろみ
を製造する酵母を充分に選択分離できることはもちろん
のこと、選択培地を使用する方法や多剤薬剤耐性酵母を
選択する方法と組み合わせて用いると、更にすぐれた酵
母を効率的に選択分離することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平10−215860（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−45876（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−65679（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−47376（ＪＰ，Ａ) 生物工学会誌，Ｖｏｌ．76（５）, ｐ．194−199（1998) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 1/16 C12G 3/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 サッカロマイセス（Saccharomyces）属
   セレビシエ（cerevisiae）に属する酵母より変異処理す
   ることなく又は変異処理した後、オリゴマイシン、クロ
   ラムフェニコール、フルフェナジンの少なくともひとつ
   を含有する選択培地を用いて多剤薬剤耐性酵母を選択分
   離し、得られた分離酵母をグルコース含有培地で培養
   し、ピルビン酸濃度が高い酵母を選択分離すること、を
   特徴とする高濃度のアルコールを含有するもろみを製造
   する酵母の育種方法。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法によって育種、分
   離された高濃度のアルコールを含有するもろみを製造す
   る酵母。
3. 【請求項３】 Saccharomyces cerevisiae OliR(FERM P
   -16889)。
4. 【請求項４】 請求項２又は３に記載した酵母を使用す
   ること、を特徴とする酒類の製造方法。
5. 【請求項５】 請求項４に記載した方法によって製造し
   てなる酒類。