DE68918745T2

DE68918745T2 - Für alpha-Acetolactat-Decarboxylase kodierender DNS-Strang und damit transformierte Hefe.

Info

Publication number: DE68918745T2
Application number: DE68918745T
Authority: DE
Inventors: Takashi C O Kirin Beer K Inoue; Junichi C O Kirin Beer Tanaka; Shigeyuki C O Kirin Bee Yamano
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 1988-04-22
Filing date: 1989-04-22
Publication date: 1995-05-11
Anticipated expiration: 2009-04-23
Also published as: AU610719B2; US5043276A; EP0339532B1; EP0339532A1; ES2065351T3; DE68918745D1; AU3333389A; CA1302322C

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet des Standes der Technik

Die Erfindung betrifft einen DNS-Strang mit der Fähigkeit der biotechnologischen Herstellung von α-Acetolactatdecarboxylase (im folgenden als α-ALDCase bezeichnet), wie sie durch Acetobacter aceti subspecies xylinum IFO 3288 hergestellt wird, ferner eine Hefe, die zu Saccharomyces cerevisiae gehört und die mit dem DNS- Strang transformiert ist, so daß sie die Fähigkeit besitzt, α-ALDCase herzustellen, sowie ferner die Herstellung von alkoholischen Getränken mit Hilfe der transformierten Hefe.

Stand der Technik

Alkoholische Getränke, wie Bier, Sake, Wein usw., werden allgemein dadurch hergestellt, daß man eine Ausgangsflüssigkeit zur Vergärung, wie beispielsweise Würze, Fruchtsaft usw., mit einer Hefe, die zu Saccharomyces cerevisiae gehört, versetzt und das Gemisch der alkoholischen Gärung unterwirft. Bei dem Gärungsprozeß erzeugt die Hefe α-Acetolactat (im folgenden als α-AL bezeichnet) als Zwischenverbindung für die Biosynthese von Valin und Leucin, die für das Wachstum von ihr selbst erforderliche Aminosäuren sind, und läßt es unvermeidlicherweise aus der Zelle austreten, und zwar in die vergorene Flüssigkeit. Das α-AL, das auf diese Weise in der vergorenen Flüssigkeit zu existieren begonnen hat, wandelt sich spontan in einer nicht enzymatischen Umsetzung in der vergorenen Flüssigkeit in Diacetyl (im folgenden als DA bezeichnet) um.
DA ist eine Substanz, die einen äußerst unangenehmen Geruch besitzt, der allgemein als "gekochter Geruch" oder "DA-Geruch" bezeichnet wird, und zur Erzeugung eines alkoholischen Getränkes mit einem ausgezeichneten Aroma (nämlich ohne DA-Geruch) plus der Gehalt an α-AL und DA in der vergorenen Flüssigkeit auf einen niedrigen Wert gesenkt werden, so daß der gesamte DA-Gehalt schließlich die Wahrnehmungsschwelle für DA-Geruch in dem alkoholischen Getränk (beispielsweise 0,05 bis 0,1 mg/Liter im Falle von Bier) nicht überschreitet, selbst wenn sämtliches α-AL in DA umgewandelt würde.
Während DA in der vergorenen Flüssigkeit in Gegenwart von Hefe verhältnismäßig rasch in Acetoin umgewandelt wird, das geschmack- und geruchlos ißt, wird das α-AL in der vergorenen Flüssigkeit durch Hefe nicht verändert, sondern es wird mit Hefe lediglich dann zersetzbar, nachdem es durch nichtenzymatische chemische Umsetzung in DA umgewandelt worden ist. Da jedoch die Umwandlung von α-AL in DA in der vergorenen Flüssigkeit verhältnismäßig langsam erfolgt, wird diese Umsetzung der geschwindigkeitsbestimmende Schritt, wodurch die vergorene Flüssigkeit in Gegenwart von Hefe lange Zeit gealtert werden muß, um ein alkoholisches Getränk zu erhalten, das einen niedrigen Gehalt an α-AL und DA (nämlich ohne DA-Geruch) aufweist. α-ALDCase ist ein Enzym, das die Eigenschaft besitzt, α-AL in Acetoin umzuwandeln, und wird bekanntermaßen von verschiedenen Bakterien erzeugt, bei der Voges- Proskauer-Reaktion positiv sind, wie beispielsweise Enterobacter aerogenes, Bacillus licheniformis, Lactobacillus casei, Bacillus brevis, Enterobacter cloacae sowie Acetobacter-Bacterien (wie A. rancens, A. aceti (Carlsberg Res. Communication 48, 1983, 239-247 i) usw.usw.
Aus EP-A-0 228 009 ist eine Hefe bekannt, die mit einem DNS-Strang transformiert ist, der von Enterobacter aerogenes abgeleitete α-ALDCase codiert. Die Hefe ist dadurch gekennzeichnet, daß ihre α-Acetolactat erzeugende Eigenschaft verringert ist, und erzeugt somit eine alkoholische Flüssigkeit, wie beispielsweise Bier, die kein oder nur wenig Diacetyl enthält.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung stellt einen DNS-Strang bereit, der die Fähigkeit zur biotechnologischen Herstellung von α-ALDCase aufweist, die für die Herstellung von alkoholischen Getränken ohne DA-Geruch innerhalb wesentlich kürzerer Zeit als im Vergleich zu bisher bekannten Verfahren geeignet ist, sowie eine Hefe, der durch Transformation mit dem DNS-Strang die Fähigkeit zur Erzeugung von α-ALDCase verliehen worden ist.
Insbesondere ist die α-ALDCase codierende DNS-Sequenz gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Nucleotidsequenz aufweist, die ein Polypeptid mit α- ALDCase-Aktivität codiert, dessen Aminosäuresequenz, d. h. die Aminosäuresequenz des Polypeptids, praktisch der in Fig. 1 von A bis B dargestellten Aminosäuresequenz entspricht.
Andererseits ist die Hefe, die zu Saccharomyces cerevisiae gehört, gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Hefe ist, die mit einer DNS-Sequenz transformiert worden ist, die ein Polypeptid mit α-ALDCase- Aktivität codiert, dessen Aminosäuresequenz praktisch die in Fig. 1 von A bis B dargestellte Aminosäuresequenz ist.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der DNS- Sequenz oder des DNS-Stranges und der Hefe.
Demzufolge ist das Verfahren zur Herstellung eines alkoholischen Getränks gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß man ein Material zur alkoholischen Gärung mit einer Hefe gären läßt, die mit einer DNS-Sequenz transformiert worden ist, die ein Polypeptid mit α-ALDCase- Aktivität codiert, dessen Aminosäuresequenz im wesentlichen die in Fig. 1 von A bis B dargestellte Aminosäuresequenz ist.
Der DNS-Strang gemäß der Erfindung kann verschiedenen Mikroorganismen, beispielsweise Saccharomyces cerevisiae. die Fähigkeit verleihen, α-ALDCase zu erzeugen, um die Fähigkeit, α-AL zu erzeugen, zu verringern, oder er kann wirksam dazu verwendet werden, biotechnologisch α-ALDCase zu erzeugen.
Da die Hefe gemäß der Erfindung die Eigenschaft aufweist, daß ihre Fähigkeit, α-AL zu erzeugen (genauer: α-AL aus der Zelle austreten zu lassen), verringert ist, wenn die als Ausgangsmaterial verwendete Gärflüssigkeit mit dieser Hefe vergoren wird, wird auch die Konzentration an α-AL in der vergorenen Flüssigkeit sehr gering, so daß das Ergebnis erzielt wird, daß die Alterungsdauer, die zur Behandlung von α-AL in der vergorenen Flüssigkeit erforderlich ist, und demzufolge die Herstellungsdauer des alkoholischen Getränks merklich verkürzt werden kann. In der Hefe gemäß der Erfindung ist die α-AL erzeugende Fähigkeit wahrscheinlich deswegen verringert, weil das α-AL, selbst wenn es innerhalb der Zelle bei dem Gärungsverfahren erzeugt worden ist, durch die ebenfalls in der Zelle erzeugte α-ALDCase zu Acetoin umgewandelt wird.
Unerwünschte Gerüche stellen auch bei der Herstellung von Gärungsprodukten, die nicht alkoholische Getränke sind, wie beispielsweise Essig, Probleme dar. Der unerwünschte Geruch bei der Herstellung von Essigen kann ebenfalls ihren Gehalt an beispielsweise DA zugeschrieben werden.
Dementsprechend kann die α-ALDCase codierende DNS- Sequenz gemäß der Erfindung auch dazu verwendet werden, daß Essigsäurebakterien mit der DNS-Sequenz transformiert werden und daß Transformationsprodukt bei der Herstellung von Essigen eingesetzt wird, die durch verminderte unerwünschte Gerüche verbessert sind.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 erläutert die Nucleotidsequenz des DNS- Stranges gemäß der Erfindung und die Aminosäuresequenz, die sich von der Nucleotidsequenz ableitet;
Fig. 2 erläutert die Struktur von pAX43;
Fig. 3 ist ein Fließschema für das Subclonieren des α-ALDCase-Gens:
Fig. 4 ist ein Fließschema für die Gewinnung des GPD-Promotors (SalI-BglII);
Fig. 5 ist ein Fließschema zur Gewinnung des PGK- Terminators (SacI-SalI);
Fig. 6 ist ein Fließschema zum Bau von pAX43;
Fig. 7 erläutert die gezielte Mutation;
Fig. 8 ist ein Fließschema für die Gewinnung des GPD-Promotors (BamHI-HindIII);
Fig. 9 ist ein Fließschema zur Gewinnung des PGK- Terminators (HindIII-SalI);
Fig. 10 ist ein Fließschema zur Gewinnung von pAX50A bis E;
Fig. 11 ist ein Fließschema zum Bau von pAX43KL;
Fig. 12 erläutert die Struktur von pAX43KL;
Fig. 13 erläutert die Struktur eines DNS-Bruchstücks mit einem Gehalt von GPD-Promotor + α-ALDCase-Gen +PGK-Terminator;
Fig. 14 erläutert die Struktur von pAS5;
Fig. 15 ist ein Fließschema zum Bau von pAX60G2; und
Fig. 16 ist ein Fließschema zum Bau von pAS5.

Einzelbeschreibung der Erfindung

α-ALDCase-Gen

Definition

Die DNS-Sequenz oder der DNS-Strang gemäß der Erfindung mit der Fähigkeit zur biotechnologischen Herstellung von α-ALDCase, im folgenden gelegentlich einfach als "DNS-Strang" bezeichnet, nämlich das α-ALDCase-Gen, ist ein solches, das eine Nucleotidsequenz aufweist, die ein Polypeptid mit α-ALDCase-Aktivität codiert, dessen Aminosäuresequenz im wesentlichen die in Fig. 1 von A bis B dargestellte Aminosäuresequenz ist.
In diesem Zusammenhang bedeutet "DNS-Strang" einen komplementären Doppelstrang aus Polydesoxyribonucleinsäure mit einer bestimmten Länge. Da der "DNS-Strang" durch die Aminosäuresequenz des Polypeptids gekennzeichnet ist, das durch ihn codiert wird, und das Polypeptid eine genau definierte Längs aufweist, wie oben erwähnt, besitzt der DNS-Strang ebenfalls eine genau definierte Länge. Während jedoch der DNS-Strank ein Gen enthält, das die α-ALDCase codiert und für die biotechnologische Herstellung des Polypeptids nützlich ist, kann eine derartige biotechnologische Herstellung nicht allein durch den DNS- Strang bewirkt werden, der eine genau definierte Länge aufweist, sondern die biotechnologische Herstellung des Polypeptids wird in dem Zustand ermöglicht, in dem ein DNS- Strang einer geeigneten Länge oberhalb seines 5'-Endes und bzw. oder unterhalb seines 3'-Endes verknüpft ist.
Demzufolge bedeutet "DNS-Strang" im Falle der vorliegenden Erfindung zusätzlich zu dem DNS-Strang einer spezifischen Länge (der Länge von A bis B gemäß der in Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenz) weiter die Form eines linearen oder eines ringförmigen DNS-Stranges, der den DNS-Strang der spezifischen Länge enthält. Deswegen wird die DNS-Sequenz gemäß der Erfindung als DNS-Sequenz "mit einer Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert", definiert.
Von den existierenden Formen des DNS-Stranges gemäß der Erfindung sind die Plasmidform, die den DNS-Strang als einen Teil ihrer Bestandteile enthält, und die Form, die in einem Mikroorganismus, insbesondere E.coli, Hefe und Essigsäurebakterien, als Plasmidform oder in das Genom integrierte Form existiert, typisch.
Die vorzugsweise existierende Form des DNS-Stranges gemäß der Erfindung umfaßt den DNS-Strang gemäß der Erfindung als Fremdgen, das mit einem Promotor und einem Terminator verknüpft ist, so daß das α-ALDCase-Gen in einem Mikroorganismus stabil exprimiert werden kann, wobei es in dem Mikroorganismus in Plasmidform oder in einer in das Genom integrierten Form existiert. Als Promotor und Terminator können bekannte Promotoren und Terminatoren in geeigneter Kombination verwendet werden.

Polypeptide, die durch das Gen codiert werden

Wie oben erwähnt, ist der DNS-Strang gemäß der Erfindung durch die Aminosäuresequenz des von ihm codierten Polypeptids gekennzeichnet. Das Polypeptid besitzt α-ALDCase-Aktivität und weist eine Aminosäuresequenz auf, die im wesentlichen die in Fig. 1 von A bis B dargestellte Aminosäuresequenz ist. Im vorliegenden Fall bedeutet "Aminosäuresequenz, die im wesentlichen die in Fig. 1 von A bis B dargestellte Aminosäuresequenz ist", daß einige der Aminosäuren deletiert oder substituiert sein oder einige Aminosäuren zugefügt sein können, usw., solange wie das Polypeptid α-ALDCase-Aktivität aufweist.
Ein typisches Polypeptid mit α-ALDCase-Aktivität gemäß der Erfindung ist dasjenige der Aminosäuresequenz von A bis B in Fig. 1, das aus 235 Aminosäuren besteht, wobei die Aminosäuresequenz bisher nicht bekannt war.
Wie oben gezeigt, bedeutet "Aminosäuresequenz, die im wesentlichen die in Fig. 1 von A bis B dargestellte Aminosäuresequenz ist", daß Modifikationen der Aminosäuresequenz vorgenommen werden können. Ein Beispiel für ein Polypeptid, das eine derartige modifizierte Aminosäuresequenz aufweist, ist eines, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die die in Fig. 1 von A&sub1; bis 3 dargestellte Aminosäuresequenz ist, die 69 Aminosäuren oberhalb des Endes A der Aminosäuresequenz von A bis B in Fig. 1 aufweist, nämlich Aminosäuren zusätzlich enthält, die der Nucleotidsequenz von Nr. 212 bis Nr. 418 entsprechen, da dieses Polypeptid immer noch eine α-ALDCase-Aktivität aufweist, selbst obgleich die Aktivität etwa 10% derjenigen des Polypeptids ist, das die Aminosäuresequenz von A bis B in Fig. 1 aufweist. Analog fallen auch die Polypeptide mit den Aminosäuresequenzen von A&sub2; bis B, A&sub3; bis B, A&sub4; bis B, A&sub5; bis B und A&sub6; bis B, von denen diejenigen mit den Aminosäuresequenzen von A&sub3; bis B, A&sub5; bis B und A&sub6; bis B an ihrem N-terminalen Ende Val statt Met aufweisen, in den Bereich der Polypeptide gemäß der Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft grundsätzlich DNS-Stränge, jedoch besagt die obige Umschreibung der Erfindung, nämlich, daß Polypeptide, die zusätzliche Aminosäuren außerhalb der Aminosäuresequenz von A bis B in Fig. 1 aufweisen, in den Bereich der Polypeptide gemäß der Erfindung fallen, daß umgekehrt auch die DNS-Stränge, die derartige im Vergleich zu den Polypeptiden mit der Aminosequenz von A bis B in Fig. 1 "längere" Polypeptide codieren, in den Bereich der DNS-Stränge gemäß der Erfindung fallen, da die Nucleotidsequenz, die derartige im Vergleich zu den Polypeptiden mit der Aminosequenz von A bis 3 in Fig. 1 längeren Polypeptide codiert, auf jeden Fall die Nucleotidsequenz aufweist, die das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von A bis B aufweist.

Nucleotidsequenz des DNS-Stranges

Der DNS-Strang, der α-ALDCase codiert, ist einer mit der Nucleotidsequenz von A bis B in Fig. 1 oder einer der eine derartige Nucleotidsequenz aufweist, wie sie den Veränderungen in der Aminosäuresequenz von α-ALDCase entspricht, die oben erwähnt sind, oder ein Degenerationsisomeres davon. In diesem Zusammenhang bedeutet "Degenerationsisomeres" einen DNS-Strang, der sich lediglich in einem degenerierten Codon unterscheidet und trotzdem dasselbe Polypeptid codieren kann. Beispielsweise wird bei dem DNS- Strang mit der Nucleotidsequenz von A bis B gemäß Fig. 1 ein DNS-Strang mit einem Codon für eine der Aminosäuren, das beispielsweise für Gly am Carboxy-Ende von GGC in GGT, das in degenerativer Beziehung dazu steht, verändert worden ist, ein Degenerationsisomeres gemäß der Erfindung genannt.
Ein bevorzugtes spezifisches Beispiel für den DNS- Strang gemäß der Erfindung besitzt mindestens ein Stoppcodon (beispielsweise TGA) in Verbindung mit dem 3'-Ende.
Weiter kann stromaufwärts vom 5'-Ende und bzw. oder stromabwärts vom 3'-Ende des DNS-Stranges gemäß der Erfindung ein DNS-Strang mit einer bestimmten Länge als Fortsetzung in Form eines nicht für die Translation verwendeten Bereichs vorliegen (der Anfangsabschnitt stromabwärts vom 3'-Ende ist normalerweise ein Stoppcodon, wie TGA).
Die Nucleotidsequenz des DNS-Stranges, der in Fig. 1 dargestellt ist, wurde für das Gen bestimmt, das die α-ALDCase codiert, die aus Acetobacter aceti subspecies xylinum IFO 3288 nach der Dideoxy-Methode cloniert worden ist.

GEWINNUNG DES DNS-STRANGES

Ein Mittel zur Gewinnung des DNS-Stranges mit der Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz der obigen α-ALDCase codiert, besteht darin, mindestens einen Teil des DNS-Stranges gemäß dem Verfahren zur Synthese von Polynucleotiden chemisch zu synthetisieren.
Es würde jedoch vorteilhaft sein, den DNS-Strang aus der genomischen Bibliothek von Acetobacter aceti subspecies xylinum IFO 3288 nach der herkömmlicherweise auf dem Gebiet der Gentechnik angewandten Methode zu erhalten, beispielsweise der Hybridisierungsmethode unter Verwendung einer geeigneten Sonde.
Bei der vorliegenden Erfindung clonierten die Erfinder den DNS-Strang gemäß der Erfindung aus der oben genannten genomischen Bibliothek unter Anwendung der Schrotschußmethode, weil die Nucleotidsequenz, die die α-ALDCase von Acetobacter aceti subspecies xylinum IFO 3288 codiert, und die Aminosäuresequenz von α-ALDCase unbekannt waren (wegen Einzelheiten siehe die unten angegebenen Beispiele).

Hefe mit der Fähigkeit, -ALDCase zu produzieren

Der DNS-Strang gemäß der Erfindung, der, wie oben beschrieben, cloniert wurde, enthält die genetische Information zur Herstellung von α-ALDCase, und daher kann dies in die Hefe eingeführt werden, die normalerweise als Hefe für die Gärung alkoholischer Getränke verwendet wird (Saccharomyces cerevisiae), um die Hefe zu transformieren, wodurch eine Hefe zur Gärung mit der Fähigkeit, α-ALDCase zu erzeugen, nämlich der Fähigkeit, weniger α-AL zu erzeugen, erhalten werden kann.

Hefe

Die zu transformierende Hefe gemäß der Erfindung kann eine Hefe sein, die zu Saccharomyces cerevisiae gehört, wie in "The Yeasts, a Taxonomic Study", 3. Auflage, (Yarrow, D., herausgegeben von N.J.W. Kreger-Van R&ijlig;. Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam (1984), Seite 379) beschrieben, und ihr Synonym oder eine Mutante sein, jedoch für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden Hefen zur Erzeugung von alkoholischen Getränken, die zu Saccharomyces cerevisiae gehören, bevorzugt, insbesondere Bierhefe, Weinhefe, Sakehefe usw. Spezifische Beispiele sind die Weinhefen ATCC 38637, ATCC 38638, IFO 2260 (Weinhefe OC2); die Bierhefen ATCC 26292, ATCC 2704. ATCC 32634 sowie die Sakehefen ATCC 4134, ATCC 26421, IFO 2347 usw. (Sakehefe Kyokai Nr. 7) usw.
Um die Eigenschaften dieser Gärungshefen weiter zu erläutern, sei erwähnt, daß sie zufolge von Selektion und Reinzüchtung über viele Jahre hinweg auf für die Vergärung geeignete Eigenschaften hin, nämlich wirksame Vergärung der als Ausgangsmaterial zur Vergärung verwendeten Flüssigkeit, Erzeugung von alkoholischen Getränken mit gutem Aroma und stabile genetische Eigenschaften usw., sie Polyploide geworden sind, die nur unter äußerster Schwierigkeit genetisch eine Kreuzsegregation durchmachen und die die Fähigkeit, Sporen zu bilden, praktisch vollständig verloren haben. Beispielsweise hat die praktisch verwendete Bierhefe, während ihre Fähigkeit, Maltose und Maltotriose, die Zuckerkomponenten in der Würze sind, zu assimilieren, erhöht wurde, ihre Wildnatur verloren, z. B. ist empfindlich gegenüber Kristallviolett usw.

Transformation

Es wurde zum erstenmal von den Erfindern bestätigt, daß die Transformation einer Hefe mit dem DNS-Strang gemäß der Erfindung zu einer Verringerung der Fähigkeit, α-AL zu erzeugen, führt. Jedoch kann das Verfahren oder die Methode selbst zur Herstellung des Transformationsproduktes eines bzw. eine sein, das bzw. die auf dem Gebiet der Molekularbiologie, der Biotechnik oder Gentechnik üblicherweise angewandt wird, sein, und daher kann die vorliegende Erfindung mit Ausnahme der weiter unten beschriebenen Techniken nach diesen herkömmlichen Techniken ausgeführt werden.
Zur Expression des Gens des DNA-Stranges gemäß der Erfindung in einer Hefe ist es zunächst erforderlich, daß das Gen auf einen Plasmidvektor übertragen wird, der in der Hefe stabil ist. Als bei diesem Schritt verwendbare Plasmidvektoren können alle Vektoren der unterschiedlichen Arten verwendet werden, wie sie bisher bekannt sind, wie beispielsweise YRp, YEp, YCp, YIp usw. Diese Plasmidvektoren sind nicht nur aus der Literatur bekannt, sondern lassen sich auch leicht konstruieren.
Um andererseits das Gen des DNS-Stranges gemäß der Erfindung in einer Hefe zu exprimieren, muß die von dem Gen besessene genetische Information transkribiert und translatiert werden. Zu diesem Zweck können als Einheit zum Steuern der Transkription und Translation ein Promotor und ein Terminator stromaufwärts des 5'-Endes bzw. stromabwärts des 3'-Endes des DNS-Stranges gemäß der Erfindung angeknüpft werden. Als derartige Promotoren und Terminatoren sind bereits verschiedene Arten, wie ADH, GAPDH oder GPD, PHO, GAL, PGK, ENO, TRP, HIP usw., bekannt, und jeder dieser Arten kann auch erfindungsgemäß verwendet werden. Sie sind nicht nur aus der Literatur bekannt, sondern können auch mit Leichtigkeit hergestellt werden.
Als Marker zur Selektion des erfindungsgemäß zu erhaltenem transformierten Produktes kann ein gegenüber G418 Hygromycin B, einer Kombination aus Methotrexat und Sulfonylamid, Tunicamycin, Ethionin, Compactin, dem Kupferion usw. resistentes Gen verwendet werden.
Um den DNS-Strang gemäß der Erfindung in einer Hefe stabiler zu halten, kann der DNS-Strang in das Genom der Hefe integriert werden. In diesem Fall ist es zur Erleichterung der Integrierung des DNS-Stranges gemäß der Erfindung, der von dem Plasmidvektor getragen wird, in das Genom zweckmäßig, eine DNS mit hoher Homologie mit der Genom-DNS in den Plasmidvektor einzubauen, und Beispiele für DNS für diesen Zweck sind etwa das rRNS-Gen, das HO-Gen usw.
In bezug auf diese war es bekannt, daß das rRNS-Gen im haploiden Hefegenom etwa 140 mal in Tandemform wiederholt ist. (Journal of Molecular Biology 40, 161-277 (1969). Zufolge dieses spezifischen Merkmals lassen sich bei Verwendung dieser Sequenz als Zielsequenz für die Rekombination die folgenden Vorteile im Vergleich zu dem Fall, bei dem andere Gensequenzen verwendet werden, erzielen:
1. Es wird erwartet, daß die Transformationsfrequenz erhöht werden kann.
2. Die Veränderung in dem entsprechenden Merkmal der Zielsequenz durch Rekombination kann als vernachlässigbar betrachtet werden.
3. Es wird möglich, mehrere Fremdgene in das Genom zu integrieren, indem man eine Reihe von Operationen von Plasmidintegration und Ausschneiden der Vektorsequenz wiederholt.
Ferner kann der DNS-Strang, der erfindungsgemäß zur Transformation einer Hefe verwendet werden kann, auch ein Polypeptid codieren, das von dem in Fig. 1 von A bis B dargestellten Polypeptid verschieden ist, solange es α- ALDCase-Aktivität aufweist, wie oben erwähnt.
Die Transformation einer Hefe mit dem auf diese Weise hergestellten Plasmid kann gemäß einer beliebigen Methode durchgeführt werden, die sich für den Zweck eignet und herkömmlicherweise auf dem Gebiet der Gentechnik oder Biotechnologie angewandt wird, beispielsweise die Spheroplastenmethode (Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America (Proc. Natl. Sci. USA), 75, 1929 (1978), die Lithiumacetat-Methode (Journal of Bacteriology (J. Bacteriol.) 153, 163 (1983)) usw.
Die so erhaltene Hefe gemäß der Erfindung ist die gleiche im Hinblick auf ihren Genotyp oder Phenotyp wie die Hefe vor der Transformation mit Ausnahme des neuen Merkmals gemäß der genetischen Information, die durch den DNS-Strang gemäß der Erfindung eingeführt worden ist (d. h., ihr ist die Fähigkeit zur Produktion von α-ALDCase verliehen worden, um demzufolge α-AL innerhalb der Zelle zu zersetzen und dadurch die Menge an aus der Zelle herausgelassenem α-AL zu vermindern), mit der weiteren Ausnahme des Merkmals das sich von dem verwendeten Vektor ableitet und dem entsprechenden Defektmerkmal zufolge des Defekts eines Teils der genetischen Information während der Rekombination des Gens, der eventuell aufgetreten ist. Weiter besitzt die Bierhefe, die durch Integrieren des DNS-Stranges gemäß der Erfindung in das Hefegenom unter Verwendung des Plasmids vom YIp-Typ und nachfolgender Excision von unnötiger Vektorsequenz erhalten worden ist, kein Merkmal, das dem verwendeten Vektor angehört. Demzufolge kann die Hefe gemäß der Erfindung unter praktisch denselben Gärungsbedingungen für Hefe zur Vergärung gemäß dem Stand der Technik verwendet werden. Es ist andererseits möglich, die Erzeugung von α-AL in der vergorenen Flüssigkeit zu verringern, und daher ist der α-AL-Gehalt in der vergorenen Flüssigkeit niedrig, wodurch die Alterungsdauer der vergorenen Flüssigkeit, die zu ihrer Behandlung erforderlich ist, merklich verkürzt werden kann.

Herstellung von alkoholischen Getränken

Die Verwendung der Hefe gemäß der Erfindung bei der Vergärung von Materialien zur Vergärung führt zu der Herstellung von alkoholischen Getränken mit den oben angegebenen Vorteilen.
Die Arten von Materialien zur Vergärung hängen natürlich von der Art der zu erzeugenden alkoholischen Getränke ab, wobei Würze für die Bierherstellung und Fruchtsaft, insbesondere Traubensaft, zur Herstellung von Wein verwendet werden.
Die Hefe kann in einer Aufschlämmung, im immobilisierten Zustand oder in jedem geeigneten Zustand oder jeder geeigneten Form vorliegen. Auch können die Gärungsbedingungen die gleichen sein, wie sie herkömmlicherweise mit herkömmlicher Hefe angewandt werden.
Die hergestellten alkoholischen Getränke besitzen einen niedrigeren Gehalt an α-AL dank der Verwendung der Hefe gemäß der Erfindung, der die Fähigkeit, α-ALDCase zu erzeugen verliehen worden ist, und die Zeit, die zur Erzeugung von alkoholischen Getränken mit niedrigerem DA- Geruch durch Altern erforderlich ist, wird, wie oben beschrieben, signifikant verkürzt.

EXPERIMENTELLE BEISPIELE

(1) Clonierung des α-ALDCase-Gens

(i) Reinigung von chromosomaler DNS eines α-ALDCase erzeugenden Stammes:
Durch Kultivierung von Acetobacter aceti subspecies xylinum IFO 3288 (hergestellt von Institute for Fermentation, Osaka, Japan) in 100 ml YPD-Medium mit einem Gehalt von 1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 2% Glucose über Nacht unter Belüften wurden 0,7 g feuchte Mikroorganismus-Zellen erhalten.
Diese wurden in 30 ml einer Pufferlösung [50 mM Tris- HCl (pH 8,0) und 50 mM EDTA] erneut suspendiert. Danach wurden sie mit 400 ug/ml Lysozym (hergestellt von Seikagaku Kogyo) und 10 ug/ml Ribonuclease A (hergestellt von Sigma Co.) 15 min bei 37ºC behandelt, und dem Ganzen wurden danach 70 ml einer Pufferlösung (50 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 50 mM EDTA) zugesetzt. Danach wurde das Ganze mit 0,5% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 50 ug/ml Proteinase K (hergestellt von Sigma Co.) 30 min lang bei 65ºC behandelt.
Das Produkt wurde anschließend zweimal mit Phenol und einmal mit Phenol/Chloroform (1 : 1) extrahiert. Die DNS wurde mit Ethanol ausgefällt und anschließend in 5 ml TE- Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA) gelöst. Die Lösung wurde mit 100 ug Ribonuclease A eine Stunde lang bei 37ºC behandelt und anschließend einmal mit Phenol und Phenol/Chloroform (1 : 1) extrahiert. Die DNS wurde mit Ethanol ausgefällt und anschließend in 2 ml TE-Puffer gelöst. Die Lösung wurde danach gegen 1 Liter TE-Puffer dialysiert. 360 ug chromosomaler DNS wurden erhalten.
(ii) Anlegen einer Cosmid-Bibliothek:
Die chromosomale DNS (11 ug), die gemäß (i) erhalten worden war, wurde mit dem Restriktionsenzym Sau3AI bis zu etwa 40 kb teilweise gespalten. Die erhaltenen DNS-Fragmente wurden mit 4,2 ug des mit BamHI gespaltenen Cosmids pJB 8 arm (Amersham) durch eine T4-Ligase verknüpft. Die DNS wurde mittels einer in-vitro-Verpackungsausrüstung (Amersham) in-vitro in λ-Teilchen verpackt und dazu verwendet, E. coli DHI (F&supmin;, gyr A96, rec Al, rel Al?, end Al, thi-l, hsd R17, sup E44, λ&supmin;) zu transfizieren [J.Mol., Biol. 166, 557-580 (1983)], und man erhielt eine Cosmid- Bibliothek.
(iii) Screening eines das α-ALDCase-Gen tragenden Stammes:
Ein das α-ALDCase-Gen tragender Stamm wurde durch Selektieren von Stämmen mit α-ALDCase-Aktivität aus der Cosmid-Bibliothek erhalten, die gemäß (ii) angelegt worden war.
Im einzelnen wurde eine L-Brühe mit einem Gehalt von 50 ug/ml Ampicillin und 0,5% Glucose mit 600 Stämmen aus der Cosmid-Bibliothek beimpft und über Nacht bei 37ºC aerob kultiviert, und die α-ALDCase-Aktivität wurde für jede Kultur gemessen. Mit anderen Worten die gesammelten Zellen wurden in einem Puffer mit 30 mM Kaliumphosphat (pH 6,2) suspendiert und mit 10 ul Toluol versetzt, wonach die Suspension 30 s lang durch Verwirbeln kräftig durchgemischt wurde. Die α-ALDCase-Aktivität der Zellsuspension wurde gemäß der Methode von Godfredsen et al. [Carlsberg Res. Commun. 47, 93 (1982)] ermittelt. Es wurden zwei Stämme erhalten, die α-ALDCase-Aktivität aufwiesen. Die Plasmide der erhaltenen Clone wurden als pAX1 bzw. pAX2 bezeichnet.
(iv) Bestimmung der DNS-Basensequenz in einem α-ALDCase-Gen:
Subclonieren des α-ALDCase-Gens wurde nach der schematisch in Fig. 3 erläuterten Methode durchgeführt. Zunächst wurde das DNS-Fragment, das durch die Teilspaltung von pAX1 mit Sau3AI erhalten worden war, in die BamHI-Stelle von pUC12 (Pharmacia) eingesetzt. Eines der auf diese Weise erhaltenen Plasmide zeigte in E. coli α-ALDCase- Aktivität und enthielt ein chromosomales DNS-Fragment von 3,6 kb. Das Plasmid wurde als pAX11 bezeichnet. Ein Fragment von etwa 1260 bp, das aus pAX11 mit KpnI und SacI ausgeschnitten worden war, wurde zwischen die KpnI- und die SacI-Schnittstelle von pUC19 (Takara Shuzo) eingesetzt, und man erhielt ein Plasmid (pAX6). Die E. coli-Zellen, die das pAX6 trugen, wiesen α-ALDCase-Aktivität auf.
Die DNS-Basensequenz (von der Base in Stellung 1 bis zur Base in Stellung 1252 in Fig. 1) des KpnI-Sau3AI- Fragments, das in pAX6 enthalten war, wurde durch die Dideoxy-Methode [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)] bestimmt.
Als Ergebnis der Analyse der Basensequenz wurde gefunden, daß das Fragment einen offenen Leseraster von 912 bp enthielt, der imstande war, ein Protein mit einem Molekulargewicht von 33747 zu codieren.

(2) Einführung des α-ALDCase-Gens in Hefe (Teil 1)

(i) Gewinnung des GPD-Promotors
Eine chromosomale DNS wurde in üblicher Weise aus Saccharomyces cerevisiae S288C [(α, suc2, ma1, ga12, CUP1): Biochem. Biophys. Res. Commun. 50, 1868 (1973): ATCC26108] hergestellt. Die DNS wurde mit Sau3AI unter derartigen Bedingungen teilweise gespalten, daß in erster Linie Fragmente von etwa 10 kb erzeugt wurden, und anschließend in die Schnittstelle von BamHI des Plasmids pBR322 (Takara Shuzo) cloniert, um eine Bibliothek zu erhalten.
Ein synthetisiertes Oligomeres entsprechend den Basen von Stellung 7 bis Stellung 36 im codierenden Abschnitt des GPD-Gens [J. Biol. Chem. 254, 9839 (1979)], wurde mit ³²P endmarkiert, und das markierte Oligomere wurde als Sonde verwendet, um einen Clon zu erhalten, der das GPD-Gen aus der Bibliothek enthielt. Die Plasmid-DNS, die aus dem Clon erhalten worden war, wurde mit HindIII gespalten, und ein HindIII-Fragment von etwa 2, 1 kb wurde in eine HindIII- Schnittstelle von pUC18 eingesetzt, und man erhielt das Plasmid pGPD181. Danach wurde der GPD-Promotor (SalI- BglII) gemäß der schematisch in Fig. 4 erläuterten Methode erhalten. Zunächst wurde das Plasmid pGPD181 mit den Restriktionsenzymen HindIII und XbaI gespalten, und man erhielt ein HindIII-XbaI-Fragment, das den Promotorabschnitt des GPD-Gens (erläutert durch den schraffierten Kasten in Fig. 4) sowie einen Teil des codierenden Abschnittes enthielt. An das kohäsive Ende von HindIII dieses Fragments wurde synthetische doppelsträngige DNS mit der folgenden Nucleotidsequenz ligiert. Diese synthetische doppelsträngige DNS enthält die PstI und SphI-Schnittstellen sowie die kohäsiven Enden von SalI und HindIII.
Das kohäsive Ende von HindIII wurde durch die Addition der synthetischen, doppelsträngigen DNS erfolgreich in das kohäsive Ende von SalI umgewandelt.
Danach wurde dieses Fragment zwischen die Schnittstelle SalI und die Schnittstelle XbaI von pUC19 eingesetzt. Das Plasmid pGP1, das auf diese Weise erhalten wurde, wurde mit XbaI gespalten und anschließend mit der Ba13 1 Nuclease behandelt, um den codierenden Abschnitt vollständig zu entfernen, und es wurde eine Endauffüllung mit dem Klenow- Fragment (Takara Shuzo) vorgenommen. An dieses erzeugte stumpfe Ende wurde eine synthetische, doppelsträngige DNS der folgenden Nucleotidsequenz ligiert. (Die synthetische, doppelsträngige DNS besitzt an ihrem einen Ende ein kohäsives Ende von BglII.)
Das stumpfe Ende wurde durch die Addition der synthetischen, doppelsträngigen DNS erfolgreich in das SalI-BGlII- Ende umgewandelt. Danach wurde das SalI-BglII-Fragment, das den GPD-Promotor enthielt und durch Spaltung mit SalI erhalten worden war, als GPD-Promotor SalI-BglII bezeichnet.
(ii) Gewinnung des PGK-Terminators
Das PGK-Gen [Nucl. Acids Res. 10, 7791 (1982)] wurde aus der Bibliothek, die gemäß Beispiel (2)-(i) angelegt worden war, in der gleichen Weise cloniert, wie in Beispiel (2)-(i) angegeben. Als Sonde wurde ein synthetisches Oligonucleotid, das den Nucleotiden von Stellung 1 bis Stellung 28 in dem codierenden Abschnitt des PGK-Gens entsprach und an seinem Ende mit ³²P markiert worden war, verwendet. Die Plasmid-DNS, die aus diesem Clon erhalten worden war, wurde mit HindIII gespalten, und man erhielt ein 2,9-kb-langes Fragment, das das PGK-Gen enthielt. Das Fragment wurde weiter mit BglII gespalten, und man erhielt ein 375-bplanges BglII-HindIII Fragment, das den Terminator-Bereich des PGK-Gens und einen Teil des codierenden Abschnittes enthielt. Der PGK-Terminator wurde aus diesem Fragment gemäß der schematisch in Fig. 5 erläuterten Methode hergestellt. Zunächst wurde an das kohäsive Ende von BglII des Fragments eine synthetische, doppelsträngige DNS der folgenden Sequenz ligiert. Diese synthetische, doppelsträngige DNS enthält die SmaI-Schnittstelle und die kohäsiven Enden von SacI und BglII.
Danach wurde das auf diese Weise erhaltene SacI-HindIII- Fragment, das den PGK-Terminator-Abschnitt enthielt, zwischen die Schnittstelle HindIII und die Schnittstelle SacI von pUC12 eingesetzt, um das Plasmid pPC1 zu konstruieren. Das pPG1 wurde danach mit HindIII gespalten und mit einem Klenow-Fragment behandelt, um ein stumpfes Ende herzustellen. An dieses stumpfe Ende wurde eine synthetische, doppelsträngige DNS der folgenden Nucleotidsequenz ligiert, wobei die synthetische, doppelsträngige DNS das kohäsive Ende von SalI enthielt.
Das Plasmid pPG2 wurde durch Religierung nach Addition der synthetischen DNS konstruiert. Ein SacI-SalI-Fragment, das einen Terminatorteil enthält, kann aus pPG2 durch Spaltung mit SacI und SalI hergestellt werden. Dieses Fragment wurde als PGK-Terminator (SacI-SalI) benannt.
(iii) Konstruktion eines Expressionsplasmids und seine Einführung in Hefe:
Das Plasmid pAX43, das ein α-ALDCase-Gen in Hefe exprimiert, wurde gemäß der schematisch in Fig. 6 erläuterten Methode konstruiert. Zunächst wurde das Plasmid pAX6, das gemäß Beispiel (1)-(iv) konstruiert worden war, mit KpnI und SacI gespalten, um ein das α-ALDCase-Gen enthaltendes, etwa 1260 bp langes KpnI-SacI-Fragment zu erhalten. Dieses Fragment wurde teilweise mit RsaI gespalten, um ein 1,02 kb langes RsaI-SacI-Fragment zu erhalten, das das in Fig. 1 dargestellte α-ALDCase-Gen enthielt. Dieses Fragment wurde zwischen die Schnittstellen SmaI und SacI eingesetzt, um das Plasmid paX31 zu konstruieren. Dieses Plasmid wurde mit BamHI und SacI gespalten, und man erhielt ein das α-ALDCase- Gen enthaltende BamHI-SacI-Fragment, das die Nucleotidsequenz von Stellung 243 bis Stellung 1252 der in Fig. 1 erläuterten Nucleotidsequenz und eine partielle Nucleotidsequenz des Vektors enthält. Drei Fragmente, d. h. dieses Fragment, der GPD-Promotor (SalI-BglII), erhalten nach (2)-(i), und der PGK-Terminator (SacI-SalI), erhalten nach (2)-(ii), wurden zwischen die Schnittstellen XhoI und SalI des Plasmids YEpl3K (im einzelnen weiter unten beschrieben) eingesetzt, um das Expressionsplasmid pAX43 (Fig. 2) zu konstruieren. Dieses Plasmid pAX43 wurde in einen Hefestamm [einen TD4-(a, his, ura, leu, trp)-Stamm, der eine Mutante von Saccharomyces cerevisiae S288C ist, nach der Lithiumacetat- Methode [J. Bacteriol. 153, 163 (1983)] eingeführt. Der so erhaltene TD4-Stamm, der pAX43 enthielt, wird als YAL2 bezeichnet.
Das Plasmid YEp13K wurde auf folgende Weise hergestellt, indem man grundsätzlich das in Hefe replizierbare Plasmid YEp13 verwendete [Gene 8, 121 (1979)].
Zunächst wurden das SalI-SacI-Fragment und das Xhol- SmaI-Fragment, die jedes an einem Ende des LEU2 des Plasmids YEp13 vorhanden waren, entfernt. Durch dieses Verfahren besaß das erhaltene Plasmid keine Schnittstellen für die Restriktionsenzyme XhoI, SacI, SmaI und BglII, sondern nur eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym SalI. Danach wurde in das Plasmid das synthetische Oligonucleotid 41mer zwischen die Schnittstellen des vom pBR322 stammenden Restriktionsenzyms HindIII und des von 2 um DNA stammenden Restriktionsenzyms HindIII eingesetzt. Dieses synthetische Oligonucleotid besaß Spaltstellen der Restriktionsenzyme SacI, SmaI, BglII und XhoI sowie auch die folgende Basensequenz, und das erhaltene Plasmid wurde als YEp13K bezeichnet.
(iv) Expression des α-ALDCase-Gens in Hefe Der TD4-Stamm, der YEp13K enthielt, und ein YAL2-Stamm (TD4-Stamm, enthaltend pAX43) wurden über Nacht in dem Selektionsmedium [0,7% aminosäurefreie Hefestickstoffbase (hergestellt von DIFCO CO.), 2% Glucose, 20 mg/l Histidin, 20 mg/l Triptophan, 20 mg/l Uracil] kultiviert, und anschließend wurden ihre α-ALDCase-Aktivitäten gemessen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt.
Die α-ALDCase-Aktivität von Hefe wurde nach der Methode gemessen, wie sie von Godfredsen et al. beschrieben ist, bei der Bakterienzellen, die mittels Glasperlen vermahlen worden waren, als Enzymlösung verwendet wurden. Eine Einheit der Aktivität bedeutet die Menge an einem Enzym, das 1 umol Acetoin in 1 h erzeugt. Die Proteinmenge der Enzymlösung wurde mit einer Proteinbestimmungspackung (hergestellt von Bio-Rad Co.) bestimmt.
Die α-ALDCase wird als Einheit je Proteinmenge in der Enzymlösung (Einheiten/mg Protein) ausgedrückt. α-ALDCase-Aktivität von YAL2 Stamm α-ALDCase-Aktivität (Einheiten/mg Protein) Mittel

(3) Einführung des α-ALDCase-Gens in Hefe (Teil 2)

(i) Gewinnung des ADH1-Promotors:
Ein Clon, der das ADH1-Gen enthielt, wurde aus der gemäß Beispiel (2)-(i) angelegten Bibliothek erhalten, indem man als Sonde ein am Ende mit ³²P markiertes synthetisches Oligonucleotid verwendete, das den Basen von Stellung 7 bis Stellung 36 in dem codierenden Abschnitt des ADH1-Gens entsprach. [J.B.C, 257, 3018 (1982)]. Das DNS- Fragment, das aus diesem Clon erhalten worden war, wurde teilweise mit einem Restriktionsenzym Sau3AI gespalten, und man erhielt das 1,5 kb lange DNS-Fragment, das einen Teil des codierenden Abschnittes und den Promotor des ADH1- Gens enthielt.
Dieses Fragment wurde in die BamHI-Schnittstelle des Plasmids pUC18 (Pharmacia) eingesetzt, und das erhaltene Plasmid wurde als pADHS1 bezeichnet. Die BamHI-Schnittstelle von pUC18 ist zwischen den Schnittstellen XbaI und SmaI von pUC18 angeordnet, und daher kann das in die BamHI-Schnittstelle eingesetzte DNS-Fragment durch Spaltung mit XbaI und SmaI herausgeschnitten werden.
Nachdem das Plasmid pADHS1 mit XbaI gespalten worden war, wurde es mit einer Endonuclease Ba131 behandelt, um den codierenden Abschnitt des ADH1-Gens vollständig zu entfernen, und HindIII-Linker (Takara Shuzo) wurden an das Fragment ligiert. Danach wurden nach Spaltung mit SmaI, BamHI-Linker an das Fragment ligiert. Das erhaltene BamHI-HindIII-Fragment wurde als ADH1-Promotor verwendet.
Der ADH1-Promotor wurde zwischen die Schnittstellen BmaHI und HindIII in YEp13K eingesetzt, um das Plasmid pYADH zu erhalten.
(ii) Expression des α-ALDCase-Gens:
Nachdem pAX6 mit dem Restriktionsenzym XbaI gespalten worden war, wurde es mit einem Klenow-Fragment gehandelt, um ein stumpfes Ende herzustellen, und das Plasmid pAX6Bg wurde durch Verknüpfen mit BglII-Linkern (Takara Shuzo) und Religierung hergestellt. Von diesem pAX6Bg wurde das (eine Basensequenz von Stellung 180 bis Stellung 1252 der in Fig. 1 dargestellten Basensequenz und einen Teil des Vektors enthaltende) HaeIII-BGlII-Fragment, das das ALDCase-Gen enthielt, erhalten (im folgenden als Fragment 1 bezeichnet).
Nachdem das SacI-Ende des RsaI-SacI-Fragmentes, das gemäß Beispiel (2)-(iii) erhalten worden war, mit einem Klenow-Fragment zur Herstellung eines stumpfen Endes behandelt worden war, wurden BglII-Linker daran anligiert. Dieses RsaI-BglII-Fragment, (das eine Basensequenz von Stellung 243 bis Stellung 1252 der in Fig. 1 dargestellten Basensequenz und einen Teil des Vektors enthielt,) wurde als Fragment 2 bezeichnet. Von dem pAX6Bg wurde auch das (eine Basensequenz von Stellung 345 bis Stellung 1252 der in Fig. 1 angegebenen Basensequenz und einen Teil des Vektors enthaltende) HindIII-BglII-Fragment erhalten, das einen Teil des α-ALDCase-Gens enthält (im folgenden als Fragment 3 bezeichnet).
Das Plasmid pYADH wurde mit HindIII gespalten und mit Klenow-Fragment behandelt, um ein stumpfes Ende herzustellen, und es wurde weiter mit BglII gespalten. Dieses Fragment wurde an das oben erwähnte Fragment 1 oder 2 ligiert, um Plasmide pAX39 (im Falle von Fragment 1) bzw. pAX40 (im Falle von Fragment 2) herzustellen. Das Fragment 3 wurde zwischen die Schnittstellen HindIII und BglII von pYADH eingesetzt, um ein Plasmid pAX41 herzustellen.
Die Plasmide pAX39, pAX40 und pAX41 können Polypeptide erzeugen, die durch die Fragmente 1, 2 bzw. 3 codiert werden, wobei der ADH1-Promotor verwendet wird. Diese Plasmide pAX39, pAX40 und pAX41 wurden dazu verwendet, um TD4 zu transformieren, und die α-ALDCase-Aktivitäten der erhaltenen Transformationsprodukte wurden gemessen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt.

Vergleich von α-ALDCase-Aktivitäten

Stamm Verhältnis der α-ALDCase-Aktivitäten TD4 + YEp13K 0
TD4 + pAX39 69
TD4 + pAX40 100
TD4 + pAX41 0
Das vom Fragment 2 codierte Polypeptid ist das Polypeptid, das als der Teil von A&sub2; bis B in Fig. 1 dargestellt ist. Das durch Fragment 1 codierte Polypeptid ist ein Polypeptid, das als der Teil von A&sub1; bis B in Fig. 1 erläutert ist.
Das Polypeptid, das durch die Expression des Fragments 3 erhalten wurde, wies keine α-ALDCase-Aktivität auf. Dies ist vermutlich dadurch begründet, daß vermutlich nur ein kurzes Peptid, das die Aminosäuren entsprechend der Basensequenz von Stellung 352 bis 372 in Fig. 1 enthält,hergestellt wird (man nimmt an, daß die Sequenz ATG von Stellung 352 bis Stellung 354 ein Initiierungscodon für die Translation und die Sequenz TGA von Stellung 373 bis Stellung 375 ein Terminierungscodon ist), und dieses Peptid war von α- ALDCase stark unterschiedlich, so daß es keine α-ALDCase- Aktivität aufwies.

(4) Einführung des α-ALDCase-Gens in Hefe (Teil 3)

Expression der DNS-Sequenz, die α-ALDCase codiert und eine Aminosäuresequenz eines Teils der Sequenz von A bis B in Fig. 1 aufweist, an die mehrere Aminosäuren addiert worden sind.
(i) Einführung:
Bezüglich der in Fig. 1 angegebenen Basensequenz im einzelnen, so befinden sich einige ATG- oder GTG-Sequenzen stromaufwärts von der Nucleotidsequenz, die die α-ALDCase codiert, und in demselben Leseraster wie diese Nucleotidsequenz. Diese ATG- und GTG-Codes sind mögliche Initiierungspunkte für die Translation. Sie sind unterstrichen und mit den Ziffern 1 bis 7 numeriert. Jeder dieser Codes kann zur Verwendung als Initiierungspunkt für die Translation ausgewählt werden. Die Translation beginnt an dem ausgewählten Punkt, so daß ein Protein in der Hefe erzeugt wird, das eine Aminosäuresequenz aufweist, wie sie durch die Sequenz von A bis B in Fig. 1 wiedergegeben ist, wobei an das N-Ende der Sequenz mehrere Aminosäuren addiert worden sind. Die genaue Anzahl der zusätzlichen Aminosäuren hängt davon ab, welche Sequenz ATG als Anfangspunkt für die Translation gewählt wird. Wenn das GTG-Codon gewählt wird, ist es erforderlich, es in ATG umzuwandeln, da GTG in der Hefe nicht als Initiierungscodon erkannt wird. Die Anzahl an Aminosäuren, die zusätzlich anzufügen sind, hängt davon ab, welches ATG oder GTG als Initiierungspunkt für die Translation ausgewählt wird. α-ALDCase-Polypeptide mit zusätzlichen Aminosäuren wurden nach Verfahren hergestellt, wie sie in Abschnitt (ii) bis (v) weiter unten erläutert sind, und es wurde bewiesen, daß diese Polypeptide α-ALDCase- Aktivität aufweisen.
(ii) Einführung einer neuen Schnittstelle in pAX6 durch das Verfahren der gezielten Mutagenese (zu der Konstruktion von fünf Plasmiden führend, die mit pALDCl-5 bezeichnet sind):
Oligonucleotide A bis E, wie sie in Tabelle 1 dargestellt sind, wurden synthetisiert. TABELLE 1 Oligonucleotid Nucleotidsequenz Mutagenisiertes Plasmid Expressionsplasmid TABELLE 1 (Fortsetzung) Oligonucleotid Nucleotidsequenz Mutagenisiertes Plasmid Expressionsplasmid
Fünf (5) Paare der Nucleotidsequenzen sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Nucleotidsequenzen der synthetisierten Oligonucleotide, die für die gezielte Mutagenese verwendet werden sollen, sind bei jedem Paar in der unteren Zeile dargestellt. Die Nucleotidsequenzen von pAX6, die mit diesen Oleonucleotiden mutagenisiert werden sollen, sind in den oberen eilen dargestellt. Die zu mutagenisierenden Nucleotidsequenzen enthalten einige der möglichen Anfangspunkte für die Translation, die in Fig. 1 unterstrichen und mit den Ziffern 1 bis 5 numeriert sind. Die Nucleotidsequenzen in den unteren Zeilen sind dieselben wie die modifizierten Nucleotidsequenzen, die nach der Mutation erhalten werden, und die modifizierten Nucleotide sind mit einem zugesetzten Punkt (.) gekennzeichnet. Die Mutation verursacht eine DraI-Schnittstelle unmittelbar stromaufwärts von den Codes, die in Fig. 1 unterstrichen und mit 1 bis 5 numeriert sind. Wenn das unterstrichene Codon GTG ist, wurde es außerdem in ATG umgewandelt. Das Plasmid pAX6 wurde mittels dieser Oligonucleotide, die in Tabelle 1 dargestellt sind, durch gerichtete Mutagenese mutagenisiert (Morinaga, Y. et al., Bio/Technology 2, 636-639 (1984), wie in Fig. 7 dargestellt. Die Namen der mutierten Plasmide und Expressionsplasmide, die daraus konstruiert worden sind, sind in Tabelle 1 angegeben. Die Konstruktion der Expressionsplasmide ist im einzelnen in Beispiel (iv) beschrieben. Ein Fragment, das das α-ALDCase-Gen enthält, wurde aus dem mutierten Plasmid mit DraI+SacI ausgeschnitten.
(iii) Erzeugung neuer Schnittstellen in pAX6 mit Hilfe einer synthetisierten, doppelsträngigen DNS (Konstruktion von pALDC6 und 7):
Zwei doppelsträngige DNS, F und G, wie sie in Tabelle 2 dargestellt sind, wurden synthetisiert. TABELLE 2 DNS Nucleotidsequenz Konstruierte Plasmide
Diese synthetisierten DNS besitzen Nucleotidsequenzen von jeder der unterstrichenen Sequenzen 6 oder 7 in Fig. 1 bis zur NcoI-Schnittstelle und besitzen eine DraI- Schnittstelle unmittelbar stromaufwärts der unterstrichenen Sequenzen 6 oder 7. Diese DNS besitzen außerdem kohäsive Enden von HindIII und NcoI. Das DNS-Fragment von der HindIII-Schnittstelle, die aus pUC19 stammt, bis zu der NcoI-Schnittstelle in dem α-ALDCase-Gen wurde aus pAX6 entfernt. Danach wurde die synthetisierte DNS,F oder G an den verbliebenen Teil von pAX6 ligiert. Die erhaltenen Plasmide wurden als pALDC6 bzw. pALDC7 bezeichnet. Die Fragmente, die das α-ALDCase-Gen enthielten, wurden mit DraI+SacI aus pALDC6 und pALDC7 ausgeschnitten.
(iv) Gewinnung des GPD-Promotors:
Nach dem Verfahren, das in Fig. 8 dargestellt ist, wurde der Promotor (BamHI-HindIII) gewonnen.
Zunächst wurde pGPD181, das gemäß Beispiel (2)-(i) konstruiert worden war, mit XbaI gespalten, wonach eine Spaltung mit Ba131, um den codierenden Abschnitt vollständig zu entfernen, sowie eine Behandlung mit dem Klenow-Fragment erfolgten. An das stumpfe Ende wurde der Linker HindIII (Takara Shuzo, Japan) angeknüpft, und das Produkt wurde danach mit HindIII gespalten, um das Fragment, das den Promotorabschnitt enthielt, auszuschneiden. Das Fragment wurde danach in die HindIII-Schnittstelle von pUC18 eingesetzt. Das auf diese Weise konstruierte Plasmid wird in zwei Arten hinsichtlich der Orientierung des HindIII-Fragments eingesetzt, und das Plasmid, in dem die Mehrfachclonierungsstelle, die aus pUC18 stammt, stromaufwärts des GPD-Promotors angeordnet ist, wurde als pST18 bezeichnet. Das pST18 wurde partiell mit HindIII gespalten, mit Klenow-Fragment behandelt und religiert. Unter den so konstruierten Plasmiden wurde eines, das die HindIII-Spaltstelle stromaufwärts von dem GPD-Promotor zerstört enthielt, als Plasmid pST18H bezeichnet. Das Fragment, das den GPD-Promotor enthielt, der mit BamHI und HindIII aus pST18 ausgeschnitten wurde, wurde als GPD-Promotor (BamHI-HindIII) bezeichnet.
(v) Gewinnung des PGK-Terminators:
Der PGK-Terminator (HindIII-SalI) wurde nach der in Fig. 9 dargestellten Methode erhalten.
Zunächst wurde die synthetisierte, doppelsträngige DNS der folgenden Nucleotidsequenz zwischen den Schnittstellen EcoRI und SacI von pPG3, das gemäß Beispiel (2)-(ii) konstruiert worden war, eingesetzt, um das Plasmid pPG3 zu konstruieren, wobei die synthetisierte, doppelsträngige DNS Spaltstellen HindIII und SphI sowie kohäsive Enden von EcoRI und SacI aufwies.
Die Spaltung von pPG3 mit HindIII und SalI ergab das HindIII-SalI-Fragment, das den pGK-Terminatorabschnitt enthielt, der als PGK-Terminator (HindIII-SalI) bezeichnet wurde.
(vi) Konstruktion des Expressionsplasmids:
Das angewandte Verfahren ist in Fig. 10 dargestellt.
Zunächst wird der GPD-Promotor (BamHI-HindIII), der gemäß Beispiel (4)-(iv) erhalten wurde, und der PGK-Terminator (HindIII-SalI), der gemäß Beispiel (4)-(v) erhalten worden war, zwischen die Schnittstellen BglII und SalI in das Plasmid YEP13K eingesetzt, um das Plasmid pSY114P zu konstruieren.
Das Plasmid pSY114P ist in der Lage,mit Hilfe des GPD- Promotors und des PGK-Terminators in Hefe ein Gen zu exprimieren, das in es in spezifischer Orientierung zwischen der HindII- und der SacI-Spaltstelle in spezifischer Orientierung eingesetzt worden ist. Von jedem der Plasmide pALDC1, pALDC2, pALDC3, pALDC4 und pALDC5 wurden fünf DraI-SacI-Fragmente, die das α-ALDCase-Gen enthielten, ausgeschnitten. pSY114P wurde mit HindIII gespalten und anschließend mit Mungobohnennuclease (Takara Shuzo, Japan) behandelt, um dadurch die kohäsiven Enden zu entfernen. Das erhaltene Fragment wurde danach mit dem Klenow-Fragment behandelt und anschließend mit SacI gespalten. Das auf diese Weise erhaltene Fragment wurde danach an jedes der fünf DraI-SacI-Fragmente, die das α-ALDCase-Gen enthielten, wie oben erwähnt, ligiert, um fünf Plasmide pAX50A, pAX50B, pAX50C, pAX50D und pAX50E zu konstruieren. Diese Plasmide enthalten das α-ALDCase-Gen, das aus pALDC1, pALDC2, pALDC3, pALDC4 bzw. pALDC5 stammt und in der Lage ist, das α-ALDCase-Gen in Hefe zu exprimieren.
Andererseits wurden die HindIII-SacI-Fragmente, die das α-ALDCase-Gen enthalten, aus pALDC6 bzw. pALDC7 ausgeschnitten und zwischen die Schnittstellen HindIII und Sac1 von pY114P eingesetzt, um die Expressionsplasmide pAX50F2 und pAX50G2 zu konstruieren. Die Plasmide pAX50F2 und pAX50G2 enthalten das α-ALDCase-Gen, das aus pALDC6 bzw. pALDC7 stammt.
Wenn die α-ALDCase-Gene der oben erwähnten Expressionsplasmide in Hefe exprimiert wurden, wird angenommen, daß die Initiierungsstellen für die Translation und die hergestellten Polypeptide wie folgt sind: Initiierungstabelle Expressionsplasmid für die Translation codiertes Polypeptid In Fig. 1 unterstrichene Gruppe
*1 Anmerkung: GTG wurde in ATG umgewandelt
*2:Val in dem N-Ende wird durch Met ersetzt
(vii) Expression in Hefe:
Laboratoriumshefe TD4 wurde mit den sieben Expressionsplasmiden pAX50A bis E, pAX50F2 und pAX50G2, die gemäß Beispiel (4)-(vi) konstruiert worden waren, transformiert.
Die α-ALDCase-Aktivitäten der erhaltenen Transformationsprodukte wurden nach der gleichen Methode bestimmt, wie in Beispiel (2)-(iv) beschrieben.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt, wo gezeigt ist, daß jedes Transformationsprodukt, das das Expressionsplasmid enthielt, eine α-ALDCase-Aktivität aufwies. untersuchter Stamm Codiertes Polypeptid α-ALDCase-Aktivität (Einheiten/mg Protein) Fig.
*: Val am N-Ende ist durch Met ersetzt.

(5) Bestätigung der Verringerung der Diacetyl-Bildung im Gärversuch

(i) Konstruktion des Expressionsvektors für Bierhefe pAX43KL:
Das angewandte Verfahren ist in Fig. 11 dargestellt. Zunächst wurde der ADH1-Promotor und das lacZ-Gen, das in der Lage ist, β-Galactosidase in Hefe zu exprimieren, wie folgt erhalten. Das lacZ-Gen (E. coli β-Galactosidase-Gen) wird als BamHI-Fragment von dem Plasmid pMC1871 (Pharmacia) erhalten. Dieses Fragment (lacZ-Gen) ermangelt des Promotors und des Initiierungspunktes für die Translation. Dieses Fragment wurde in die BGlII-Schnittstelle des Plasmids YEp13K in der durch den Pfeil in Fig. 11 angegebenen Richtung eingesetzt, um das Plasmid placZl zu konstruieren. Das lacZ-Gen in placZ erwarb das neue Anfangscodon (ATG) für die Translation, das in demselben Leseraster wie lacZ zwischen den aus Yp13K stammenden Schnittstellen BglII und HindIII angeordnet ist. Der ADH1-Promotor, der gemäß Beispiel (3)- (i) erhalten worden war, wurde zwischen den Schnittstellen BamHI und HindIII von placZl eingesetzt, um das Plasmid pADHl-lacZ zu konstruieren, indem der ADH1-Promotor dazu verwendet wurde, um lacZ zu exprimieren. Das pADH1-lacZ wurde mit XhoI gespalten und anschließend mit Klenow- Fragment behandelt, woran sich die Addition von SalI- Linker (Takara Shuzo, Japan) anschloß. Aus dem Fragment wurde dann ADH1-Promotor + lacZ-Gen als ein BamHI-SalI- Fragment ausgeschnitten. Auf der anderen Seite wurde ein gegenüber G418 resistentes Gen aus pUC4K (Pharmacia) in Form eines SalI-BamHI-Fragmentes durch Teilspaltung mit SalI ausgeschnitten und vollständig mit BamHI gespalten. Dieses das gegenüber G418 resistente Gen enthaltende Fragment und das BamHI-SalI-Fragment, das, wie oben erwähnt, den ADH1-Promotor + lacZ-Gen enthielt, wurden in die SalI-Schnittstelle von pAX43 eingesetzt, das gemäß Beispiel (2)-(iii) konstruiert worden war, um das Plasmid pAX43KL (Fig. 12) zu konstruieren.
(ii) Einführung von pAX43KL in Bierhefe:
Konventionelle Bierhefe wurde mit dem pAX43KL gemäß der Lithiumacetat-Methode transformiert. Die gegenüber G418 resistenten Kolonien mit β-Galactosidase-Aktivität wurden als die wirklichen Transformationsprodukte ausgelesen. Diese Transformationsprodukte wiesen eine α-ALDCase-Aktivität von 3,2 bis 7,0 Einheiten/mg Protein auf. Zwei unabhängige Stämme unter den Transformationsprodukten wurden als YAL3-1 und YAL3-2 bezeichnet.
(iii) Gärungstest:
YAL3-1 und YAL3-2, die gemäß Beispiel (ii) erhalten worden waren, wurden statisch in 50 ml Würze, die 10 ppm G418 enthielt, drei Tage lang bei 20 ºC kultiviert. Die Gesamtkulturen wurden zu einem Liter Würze gegeben, die 10 ppm G418 enthielt, und das Ganze wurde zehn Tage lang bei 8ºC statisch weiter kultiviert. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren (5000 U/min, 10 min) gesammelt. Die erhaltenen Zellen wurden zum Beimpfen von Würze von 11ºP (Plato) mit einem Beimpfungsgrad von 0,5% (0,5 g nasse Zellen/100 ml Würze) verwendet. Nach hinreichender Belüftung wurde die Gärung während acht Tagen bei 8ºC durchgeführt. Nach Beendigung der Vergärung wurden die Zellen durch Zentrifugieren und Filtrieren mit Filterpapier entfernt. Danach wurden die Menge an TDA (Gesamtdiacetyl) und der Grad der scheinbaren Verdünnung der vergorenen Würze bestimmt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.
Es wurde bestätigt, daß die TDA-Konzentration in der Würze, die durch YAL3-1 oder YAL3-2 vergoren worden war, signifikant niedriger lag als in einer Würze, die durch den Vergleichsstamm vergoren worden war. Untersuchte Hefe Scheinbare Verdünnung TDA Bierhefe Mittel
*1 Die scheinbare Verdünnung ist wie folgt definiert: Scheinbare Verdünnung (%)
= [Ursprünglicher Würzeextrakt (ºP) minus scheinbarer Extrakt der vergorenen Würze (ºP)] · 100 /[Ursprünglicher Würzeextrakt (ºP)]
*2 TDA umfaßt vicinale Diketone und Acetohydroxysäure (hauptsächlich DA und sein Vorläufer, d. h.α-AL).

(6) Einführung des α-ALDCase-Gens in Hefe (Teil 4)

Integration des α-ALDCase-Gens in ein Hefechromosom, Expression und Vergärungstest.
(i) Angabe der Methode der Integration des α-ALDCase- Gens in das Hefechromsom:
Das α-ALDCase-Gen, das zur Expression in Hefe durch Addition des GPD-Promotors und des PGK-Terminators in der Lage war, wurde in das Hefe-rRNA-Gen eingesetzt, um ein in Fig. 13 erläutertes Fragment herzustellen. Dieses Fragment wurde zusammen mit einem Plasmid vom YEp-Typ, das das gegenüber G418 resistente Gen trug, in Hefe transformiert, und die gegenüber G418 resistenten Transformationsprodukte wurden ausgelesen. Unter diesen Transformationsprodukten war ein derartiges erfolgreich erhalten worden, bei dem das oben erwähnte α-ALDCase-Gen in das rRNA-Gen des Hefechromosoms durch homologe Rekombination integriert worden war.
(ii) Konstruktion des Plasmids pAX60G2 vom Integrationstyp:
Das Plasmid pAX60G2, das keinen Replikationsursprung in Hefe hatte und auf Hefe lediglich vorkommen kann, wenn es in das Chromosom (der Hefe) integriert ist, wurde nach dem in Fig. 15 schematisch erläuterten Verfahren konstruiert.
Zunächst wurde die EcoRI-Schnittstelle des Plasmids pUC12 (Pharmacia) mit Klenow-Fragment behandelt, und es wurden XhoI-Linker (Takara Shuzo) weiter addiert. Danach wurde das Plasmid erneut der Ligierung unterworfen. Dieses Plasmid besitzt eine neue XhoI-Schnittstelle, und in derselben Zeit regenerierten sich zu beiden Seiten der XhoI- Schnittstelle die EcoRI-Schnittstellen. Dieses Plasmid wurde mit XbaI gespalten, mit einem Klenow-Fragment behandelt und anschließend erneut der Ligierung unterworfen. Das auf diese Weise erhaltene Plasmid pUC12EX enthält keine XbaI-Schnittstelle.
Ein Oligonucleotid wurde hergestellt, das der Nucleotidsequenz von Stellung 4 bis Stellung 32 in dem 5'-terminalen Abschnitt eines 5.8S-rRNA-Gens (J. Biol. Chem. 252, 8118-8125 (1977). Nach Markierung am 5'-Ende mit ³²P wurde dieses als Sonde zur Isolierung von rRNA-Genen aus der gemäß Beispiel (2)-(i) angelegten Bibliothek verwendet.
Ein 3 kb langes EcoRI-Fragment wurde aus den isolierten rRNA-Genen ausgeschnitten. Dieses Fragment enthielt einen Teil des 5.8S-rRNA-Gens und einen Teil des 2.8S-rRNA- Gens. Dieses Fragment wurde mit Klenow-Fragment vor der Addition von XhoI-Linkern behandelt. Das Fragment wurde daraufhin in die XhoI-Schnittstelle des Plasmids pUC12EX eingesetzt.
Darüber hinaus wurde das Plasmid pAX50G2, das gemäß (4)-(vi) konstruiert worden war, mit SalI gespalten, und ein Fragment, das den GPD-Promotor, das α-ALDCase-Gen und den PGK-Promotor enthielt (dieses Fragment ist in Fig. 15 durch den schraffierten Kasten dargestellt), wurde erhalten. Das Fragment wurde mit Klenow-Fragment behandelt und anschließend an den XbaI-Linker (Pharmacia) ligiert. Danach wurde das XbaI-Fragment in die XbaI- Schnittstelle des pIRXho eingesetzt, um das Plasmid pAX60G2 zu konstruieren.
(iii) Konstruktion des Plasmids pAS5 vom YEp-Typ, das das gegenüber G418 resistente Gen enthält:
Das Plasmid pAS5 wurde nach der schematisch in Fig. 16 erläuterten Methode konstruiert.
Zunächst wurde das Fragment, das das gegenüber G418 resistente Gen (G418r) enthielt, mit BamHI aus dem Plasmid pUC4K (Pharmacia) ausgeschnitten und in die BamHI-Schnittstelle von pADHl-lacZ, das gemäß (5)-(i) erhalten worden war, eingesetzt. Unter den auf diese Weise erhaltenen Plasmiden wurde eines, in das zwei gegenüber G418 resistente Gene eingesetzt worden waren, als pAS5 bezeichnet. Das Ausmaß der Resistenz gegenüber G418 war größer, wenn das Plasmid pAS5 zur Transformation verwendet wurde als dann, wenn ein Plasmid, das ein einziges G418r-Gen enthielt, verwendet wurde.
(iv) Integration des α-ALDCase-Gens in eine hefechromosomen- DNS:
Bierhefe IFO 0751 wurde nach der Lithiumacetat- Methode mit dem Fragment, das durch die EcoRI-Spaltung von pAX60G2, erhalten gemäß (ii), (d. h. dem Fragment gemäß Fig. 13), und pAS5, erhalten gemäß (iii) (Fig. 14), kotransformiert. Die Resistenz gegenüber G418 und die β- Galactosidase-Aktivität wurden als Markierungen verwendet, um die Transformationsprodukte auszuwählen. Ein auf diese Weise erhaltenes Transformationsprodukt wurde aerob bei 30ºC über Nacht in YPD-Medium kultiviert, und danach wurden Stämme mit dem α-ALDCase-Gen durch Messen der α-ALDCase- Aktivität erhalten. Diese Stämme wurden über 12 bis 13 Generationen in YPD-Medium nicht selektiv subkultiviert, und danach wurden die geeignet verdünnten Kulturen auf Nährmedien aus Ruby's agar ausgeplattet, die X-gal (5'-Brom-4'-chlor-3'-indolyl-β-D-galactosid) [Method in Enzymology, Vol. 101, 253 (1983)] enthielten. Diese Platten wurden 3 bis 5 Tage bei 30ºC bebrütet, worauf Kolonien, die keine blaue Farbe aufwiesen, d. h., Stämme, die keine β-Galactosidase-Aktivität besaßen, erhalten wurden. Es wird angenommen, daß diese Stämme kein PASS, sondern lediglich die α-ALDCase-Expressionseinheit in die chromosomen DNS integriert haben, die aus dem GPD-Promotor, dem α-ALDCase- Gen und dem PGK-Terminator besteht. Diese Stämme waren in dem YPD-Medium bei 30ºC über Nacht aerob kultiviert worden, wonach die α-ALDCase-Aktivität gemessen wurde. Unter diesen Stämmen wurde einer, der die α-ALDCase-Aktivität von 1,0 Einheiten/mg Protein aufwies, als YAL4 bezeichnet. Wenn YAL4 über 47 Generationen in YPD-Medium subkultiviert wurde, blieb die α-ALDCase-Aktivität bei einem Wert von 75% oder darüber erhalten.
(v) Gärungstest:
Der gemäß (iv) erhaltene Stamm YAL4 wurde statisch in 50 ml Würze drei Tage lang bei 20ºC kultiviert, und die gesamte Kultur wurde dazu verwendet, um ein Liter Würze zu beimpfen, um die statische Kultivierung 10 Tage lang bei 10ºC fortzusetzen. Die Hefezellen, die auf diese Weise gezüchtet wurden, wurden durch Zentrifugieren (5000 U/min, 10 min) gesammelt. Die auf diese Weise erhaltenen Hefezellen wurden dazu verwendet, um Würze von 11ºC bei einem Beimpfungsgrad von 0,6% (Feuchtgewicht/Volumen) zu beimpfen.
Diese Kultur wurde hinreichend durch Rühren belüftet und anschließend 10 Tage lang bei 10ºC der statischen Gärung unterworfen. Nach Vervollständigung der Gärung wurden die Hefezellen durch Zentrifugieren und Filtrieren mit Filterpapier entfernt, und die Menge an TDA (Gesamtdiacetyl) und der scheinbare Verdünnungsgrad der vergorenen Würze wurden gemessen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt. Es wurde gefunden, daß die Menge an TDA bei der Gärung mit der Hefe gemäß der Erfindung niedriger lag als bei einer Vergärung mit einem Vergleichsstamm. Stamm Grad der scheinbaren Verdünnung TDA Mittel

Hinterlegung der Mikroorganismen

Der Stamm YAL2 wurde bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1 chome, Yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibarakiken, 305, Japan am 7. April 1989 unter der Zugangsnummer FERM BP-1844 hinterlegt.
Das Plasmid pAX6, das das DNS-Fragment gemäß der Erfindung erhielt, wurde als E. coli JM109 (enthaltend pAX6), das gleichbedeutend ist mit E. coli JM109 (Takara Shuzo, Japan), das das pAX6 beherbergt, beim Fermentation Research Institute am 14. Dezember 1988 unter der Zugangsnummer FERM-BP-21 87 hinterlegt.
Der Stamm YAL4 wurde beim Fermentation Research Institute am 7. April 1989 unter der Zugangsnummer FERM BP-2374 hinterlegt.
Diese Hinterlegungen erfolgten unter dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren.

Claims

1. DNS-Sequenz mit einer Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid mit einer α-Acetolactat-decarboxylase-Aktivität codiert,dessen Aminosäuresequenz im wesentlichen die in Fig. 1 von A bis B dargestellte Aminosäuresequenz ist.

2. DNS-Sequenz gemäß Anspruch 1, die eine Nucleotidsequenz der von A bis B in Fig. 1 dargestellten Nucleotidsequenz oder ihr Degenerationsisomeres aufweist.

3. Hefe, die zu Saccharomyces cerevisiae mit verringerter Fähigkeit zur Bildung von α-Acetolactat gehört und die mit einer DNS-Sequenz transformiert worden ist, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die ein Polypeptid mit α-Acetolactatdecarboxylase-Aktivität codiert, dessen Aminosäuresequenz im wesentlichen der in Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenz von A bis B entspricht.

4. Hefe gemäß Anspruch 3, wobei die Nucleotidsequenz in Form eines Plasmids vorliegt, das diese enthält.

5. Hefe gemäß Anspruch 3, wobei die DNS-Sequenz die Nucleotidsequenz aufweist, die der in Fig. 1 dargestellten Nucleotidsequenz von A bis B entspricht.

6. Verfahren zur Herstellung einer Hefe mit verringerter Fähigkeit zur Bildung von α-Acetolactat, bei dem man eine Wirtshefe, die zu Saccharomyces cerevisiae gehört, mit einer DNS-Sequenz transformiert, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die ein Polypeptid mit einer α-Acetolactat-decarboxylase-Aktivität codiert, dessen Aminosäuresequenz praktisch der in Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenz von A bis B entspricht.

7. Verfahren zur Herstellung einer Hefe mit verringerter Fähigkeit zur Bildung von α-Acetolactat, wie in Anspruch 6 beansprucht, wobei die Nucleotidsequenz der von A bis B in Fig. 1 dargestellten Nucleotidsequenz oder ihrem Degenerationsisomeren entspricht.

8. Verfahren zur Herstellung einer Hefe mit verringerter Fähigkeit zur Bildung von α-Acetolactat, wie in Anspruch 6 beansprucht, wobei die Nucleotidsequenz in Form eines diese enthaltenden Plasmids vorliegt.

9. Verfahren zur Herstellung einer Hefe mit verringerter Fähigkeit zur Bildung von α-Acetolactat, wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei die DNS-Sequenz die in Fig. 1 von A bis B dargestellte Nucleotidsequenz aufweist.

10. Verfahren zur Herstellung eines alkoholischen Getränks, insbesondere von Bier, wobei eine Hefe dazu veranlaßt wird, auf ihr Substrat einzuwirken, um daraus Ethanol herzustellen, wobei man eine Hefe gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5 verwendet.