DE69012141T2

DE69012141T2 - Ortsspezifische modifikation des candida tropicalis genomes.

Info

Publication number: DE69012141T2
Application number: DE69012141T
Authority: DE
Inventors: Kristine Deanda; L Eirich; Stephen Picataggio
Original assignee: Henkel Research Corp
Current assignee: Cognis IP Management GmbH
Priority date: 1989-11-06
Filing date: 1990-11-06
Publication date: 1995-04-06
Anticipated expiration: 2010-11-07
Also published as: JPH05501501A; EP0499622A1; JP3023984B2; AU6741490A; US5254466A; DE69012141D1; ZA908653B; CA2072977A1; EP0499622B1; WO1991006660A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur hochspezifischen Modifizierung des Genoms der Hefe Candida tropicalis. Diese Erfindung bezieht sich ferner auf C. tropicalis-Stämme mit mehrfachen POX4- und POX5-Genzertrennungen und auf ein Verfahren zum Verwenden dieser Stämme zur Herstellung von Dicarbonsäuren.

2. Beschreibung verwandter Technik

Aliphatische Disäuren sind vielseitige chemische Zwischenprodukte, die als Rohmaterialien zur Herstellung von Duftstoffen, Polymeren, Klebstoffen und Makrolid-Antibiotika brauchbar sind. Während mehrere chemische Wege zur Synthese langkettiger alpha, omega-Dicarbonsäuren verfügbar sind, ist die Synthese nicht leicht und die meisten Verfahren führen zu Gemischen, die kürzere Kettenlängen enthalten. Als Ergebnis sind ausgedehnte Reinigungsschritte nötig. Während es bekannt ist, daß langkettige Disäuren auch durch mikrobielle Umwandlung von Alkanen, Fettsäuren oder -estern hergestellt werden können, ist die chemische Synthese aufgrund der Einschränkungen bei den gegenwärtigen biologischen Wegen der bevorzugte Weg geblieben.
Mehrere Hefestämme sind bekannt, daß sie alpha, omega-Dicarbonsäuren als Nebenprodukte ausscheiden, wenn sie auf Alkanen oder Fettsäuren als Kohlenstoffquelle kultiviert werden. Insbesondere ist von Hefe, die der Gattung Candida angehört, wie etwa C. albicans, C. cloacae, C. guillermondii, C. intermedia, C. lipolytica, C. maltosa, C. parapsilosis und C. zeylenoides bekannt, daß sie derartige Dicarbonsäuren produziert (Agr. Biol. Chem. 35; 2033-2042 (1971)). Ferner ist von verschiedenen C. tropicalis-Stämmen bekannt, daß sie Dicarbonsäuren produzieren, deren Kettenlänge von C&sub1;&sub1; bis C&sub1;&sub8; reicht (Okino et al., in BM Lawrence, BD Mookherjee und BJ Willis (Hrsg.) "Flavors and Fragrances: A World Perspective. Proceedings of the 10th International Conference of Essential Oils, Flavors and Fragrances", Elsevier Science Publishers BV Amsterdam (1988)) und sind die Grundlage mehrerer, von Bühler und Schindler in "Aliphatic Hydrocarbons in Biotechnology", H. J. Rehm und G. Reed (Hrsg.), Bd. 169, Verlag Chemie, Weinheim (1984) rezensierter Patente.
Es ist festgestellt worden, daß Kohlenwasserstoffsubstrate in den Hefemikrosomen enzymatisch oxidiert werden. Auf den Transport in die Zelle folgend werden n-Alkansubstrate zum Beispiel durch ein spezielles Cytochrom P450-System zu Fettalkoholen hydroxyliert (Appl. Microbiol. Biotechnol., 28, 589-597 (1988)). Zwei weitere, durch Alkoholoxidase (Kemp et al., Appl. Microbiol. and Biotechnol., 28, S. 370-374 (1988)) und Aldehyddehydrogenase katalysierte Oxidationsschritte führen zur entsprechenden Fettsäure. Die Fettsäuren können über denselben Weg weiter zu der entsprechenden Dicarbonsäure oxidiert werden. Die omega-Oxidation von Fettsäuren verläuft über die omega-Hydroxyfettsäure und ihr Aldehydderivat zur entsprechenden Dicarbonsäure ohne die Erfordernis einer CoA-Aktivierung. Sowohl Fettsäuren als auch Dicarbonsäuren können jedoch nach Aktivierung zum entsprechenden Acyl-CoA-Ester über den β-Oxidationsweg in den Peroxisomen abgebaut werden, was zu einer Kettenverkürzung führt. In Säugersystemen werden sowohl Fettsäure- als auch Dicarbonsäureprodukte der omega-Oxidation mit gleichen Geschwindigkeiten zu ihren CoA-Estern aktiviert und sind Substrate sowohl für die mitochondriale als auch peroxisomale β-Oxidation (J. Biochem., 102, 225-234 (1987)). In Hefe findet die β-Oxidation allein in den Peroxisomen statt (Agr. Biol. Chem., 49, 1821-1828 (1985)).
Die durch Fermentierung durch die meisten Hefen einschließlich C. tropicalis erzeugten Dicarbonsäuren sind meistens um ein oder mehrere Kohlenstoffpaare kürzer als die ursprünglichen Substrate und Gemische sind üblich (Ogino et al., 1965; Shio und Uchio, 1971; Rehm und Reiff, 1980; Hill et al., 1986). Dies ist auf den Abbau des Substrats und Produkts auf dem peroxisomalen β-Oxidationsweg zurückzuführen. Diese Reihe enzymatischer Reaktionen führt zur fortschreitenden Verkürzung der aktivierten Acyl-CoA über die Spaltung von 2-Kohlenstoff-Acetyl-CoA-Struktureinheiten auf zyklische Weise. Der Anfangsschritt auf diesem Weg, der die Oxidation der Acyl-CoA zu ihrem Enoyl-CoA-Derivat einschließt, wird durch Acyl-CoA-Oxidase katalysiert. Die Enoyl-CoA wird durch die Einwirkung von Enoyl-CoA-Hydratase und 3-Hydroxyacyl- CoA-Dehydrogenase als Vorausetzung für die Spaltung zwischen den alpha- und beta-Kohlenstoffen durch 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase weiter zu der β-Ketosäure metabolisiert. Mutationen, die eine teilweise Blockierung dieser letzten Reaktionen bewirken, führen zur Bildung ungesättigter oder von 3-Hydroxymonocarbon- oder 3- Hydroxydicarbonsäuren (Meussdoeffer, 1988). Diese unerwünschten Nebenprodukte sind oft mit der biologischen Herstellung von Dicarbonsäuren verbunden. Es ist ebenfalls bekannt, daß die Bildung von Disäuren durch die Verwendung geeigneter Mutanten wesentlich erhöht werden kann (Shiio und Uchio, 1971; Furukawa et al., 1986; Hill et al., 1986; Okino et al., 1986). Die Hefen vom Wildtyp produzieren, wenn überhaupt, wenig Dicarbonsäure. Oft zeigen Mutanten, die in ihrer Fähigkeit, auf Alkan-, Fettsäure- oder Dicarbonsäuresubstraten zu wachsen, teilweise geschädigt sind, erhöhte Dicarbonsäureausbeuten. Diese Mutanten sind jedoch über ihre verringerte Fähigkeit hinaus, diese Verbindungen als Kohlenstoffquellen zum Wachstum zu gebrauchen, nicht charakterisiert worden. Aller Wahrscheinlichkeit mach ist ihre Fähigkeit zum Produzieren von Dicarbonsäuren durch eine teilweise Blockierung des β-Oxidationswegs verstärkt. Weiterhin führen Verbindungen, von denen bekannt ist, daß sie die β-Oxidation hemmen (z.B. Acrylat), ebenfalls zu erhöhten Dicarbonsäureausbeuten (Zhou und Juishen, 1988).
Es wäre daher wünschenswert, eine wirksame Blockade des β-Oxidationswegs bei seiner ersten, durch Acyl-CoA-Oxidase katalysierten Reaktion zu besitzen. Eine vollständige Blockade sollte hier durch Umlenken des Substrats auf den omega-Oxidationsweg zu erhöhten Dicarbonsäureausbeuten führen, während die Wiederverwendung der Dicarbonsäureprodukte auf dem β-Oxidationsweg verhindert wird. Außerdem sollte die Verwendung einer derartigen Mutante die unerwünschten Kettenmodifizierungen, die mit dem Durchlaufen der β-Oxidation verbunden sind, wie etwa Ungesättigtheit, Hydroxylierung oder Kettenverkürzung, verhindern. Es stehen noch keine, durch zufällige Mutagenese erhaltene Mutanten zu Verfügung, bei denen dieses Enzym vollständig inaktiviert worden ist. Während die C. tropicalis-Acyl-CoA-Oxidasegene kloniert und sequenziert worden sind (Okazaki et al., 1986), hat das Fehlen eines Verfahrens zur gezielten Mutagenese des C. tropicalis-Genoms die spezifische Inaktivierung der chromosomalen Acyl-CoA-Oxidasegene verhindert. Ein Verfahren zur gezielten Genzertrennung in Hefe der Gattung Pichia ist in der europäischen Patentanmeldung 0 226 752 offenbart worden. Weiter ist die genetische Manipulation käuflicher Hefen (unter besonderem Hinweis auf Braustämme) aus Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, Bd. 4, September 1986, S. 1-37, bekannt. Die vorliegende Erfindung ist jedoch die erste Beschreibung einer gezielten Mutagenese in C. tropicalis.
Die Herstellung von Dicarbonsäuren durch Fermentation ungesättigter C&sub1;&sub4;-C&sub1;&sub6;-Monocarbonsäuren mittels eines Stammes der Art C. tropicalis wird im US-Patent 4 474 882 offenbart. Die ungesättigten Dicarbonsäuren entsprechen den Ausgangsmaterialien in der Zahl und Stellung der Doppelbindungen. Ahnliche Verfahren, bei denen andere besondere Mikroorganismen verwendet werden, werden in den US-Patenten 3 975 234 und 4 339 536, im britischen Patent 1 405 026 und in den deutschen Patentveröffentlichungen 21 64 626, 28 53 847, 29 37 292, 29 51 177 und 21 40 133 beschrieben.
Keines dieser vorstehend angeführten Verfahren ergibt die gewünschten Dicarbonsäuren in Mengen, die ausreichend sind, um gewerblich bestehen zu können.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur ortsspezifischen Modifizierung des C. tropicalis-Genoms bereit, umfassend das Transformieren einer C. tropicalis-Wirtszelle mit einem linearen DNA-Fragment, bestehend aus einem selektierbaren Markergen, wobei das selektierbare Markergen auf beiden Seiten durch DNA-Sequenzen flankiert wird, die Homologie zu einem chromosomalen Zielgen oder Homologie zu den ein chromosomales Zielgen flankierenden DNA-Sequenzen haben.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zum Wiederherstellen eines auxotrophen Phänotyps von Zellen bereit, die zuvor mit einem selektierbaren Marker zu Prototrophie transformiert wurden, umfassend die Schritte: (a) des Selektierens oder Durchmusterns auf spontane Mutationen, die den selektierbaren Marker inaktivieren, um die aus dem zuvor transformierten Stamm stammenden auxotrophen Mutanten zu identifizieren und zu isolieren, (b) des Bestätigens des auxotrophen Phänotyps der Mutanten, (c) des Bestätigens des parentalen Genotyps der Mutanten durch Southern-Hybridisierung mit geeigneten Gensonden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein alternatives Verfahren zum Wiederherstellen eines auxotrophen Phänotyps von Zellen bereit, die zuvor mit einem selektierbaren Marker zu Prototrophie transformiert wurden, umfassend die Schritte: (a) des Transformierens prototropher Wirtszellen mit einem nicht-funktionellen selektierbaren Markergen, das durch eine in-vitro-Deletion der zentralen Kodierungssequenz des Gens nicht-funktionell gemacht worden ist, um auxotrophe Mutanten zu erzeugen, (b) des Bestätigens des auxotrophen Phänotyps der Mutanten, (c) des Bestätigens des Stamm-Genotyps der Mutanten.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur vollständigen Blockierung des β-Oxidationswegs in C. tropicalis in dessen erster Reaktion bereit, welches das Zertrennen der Chromosomen POX4A-, POX4B- und beider POX5-Gene eines C. tropicalis-Wirtsstammes umfaßt.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zum Herstellen im wesentlichen reiner omega-Dicarbonsäuren in im wesentlichen quantitativer Ausbeute bereit, umfassend das Kultivieren von C. tropicalis Stamm H5343 in einem eine Stickstoffquelle, ein organisches Substrat und ein Cosubstrat enthaltenden Kulturmedium.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1A ist eine schematische Darstellung der räumlichen Beziehung der POX4-Zertrennungskassette.
Figur 1B ist eine schematische Darstellung der räumlichen Beziehung der POX5-Zertrennungskassette.
Figur 2 ist eine schematische Darstellung des sequentiellen Zertrennungsvorgangs des POX-Gens
Figur 3 ist eine Darstellung einer Southern-Hybridisierung EcoR1-verdauter, genomischer DNA aus verschiedenen Transformanten mit POX4- und POX5-Sonden.
Figur 4 ist ein Diagramm der Abstammung der Stämme mit blockierten POX-Genen und der Angabe der POX-Gene, die in jedem Stamm blockiert sind.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein allgemeines Verfahren zur ortsspezifischen Modifizierung des C. tropicalis- Genoms bereit. Das Verfahren gründet sich auf die Verwendung einer Genzertrennungskassette als Ersatz für ein chromosomales Zielgen. Das Ersatzgen ist aufgrund einer Insertionsinaktivierung mit dem selektierbaren Markergen nicht-funktionell. Die Zertrennungskassette ist ein hintereinander angeordnetes, lineares DNA-Fragment, das erstens aus einem DNA-Fragment, das Homologie zum natürlichen C. tropicalis-Genom besitzt, zweitens einem selektierbaren Markergen und drittens einem DNA-Fragment besteht, das Homologie zu dem natürlichen C. tropicalis-Genom besitzt. Der selektierbare Marker wird daher auf beiden Seiten durch DNA-Sequenzen flankiert, die zu dem natürlichen C. tropicalis-Genom homolog sind. Die beiden flankierenden Sequenzen sind bevorzugt, aber nicht notwendigerweise benachbarte DNA-Sequenzen in dem unzertrennten Hefegenom und steuern den Ort des Einbaus der Zertrennungskassette in das Hefegenom.
Eine Zertrennungskassette kann durch Subklonieren eines selektierbaren Markers in ein isoliertes Zielgen aufgebaut werden. Jeder Typ eines selektierbaren Markers, der dem Zielgen nicht angehört, kann zum Zertrennen des Zielgens verwendet werden. Vorzugsweise ist der selektierbare Marker einer, welcher der Zelle, in welche die Zertrennungskassette transformiert wird, einen besonderen Phänotyp verleiht. Am bevorzugtesten verleiht der selektierbare Marker transformierten Zellen einen prototrophen Phänotyp, der umkehrbar in Auxotrophie verändert werden kann, so daß derselbe selektierbare Marker darauffolgend in mehrfachen Genzertrennungen in demselben Stamm verwendet werden kann.
Zum Beispiel wird ein C. tropicalis-Transformationswirt, der für ein bestimmtes Pyrimidin auxotroph ist, durch eine Zertrennungskassette, die ein zur Synthese des besonderen Pyrimidins erforderliches, selektierbares Markergen enthält, zu Prototrophie transformiert. Die sich daraus ergebenden Transformanten, welche für das besondere Pyrimidin prototroph gemacht worden sind, werden durch ihre Fähigkeit, in einem Medium mit einem Mangel an dem Pyrimidin zu wachsen, selektiert. Diese Transformanten enthalten eine gezielte Genzertrennung als Ergebnis des Ersatzes eines funktionellen Zielgens durch ein nicht-funktionelles Zielgen.
Dieses Verfahren wird vorzugsweise zum Zertrennen der POX4- und POX5-Gene von C. tropicalis verwendet, so daß der sich daraus ergebende Stamm zum Herstellen von alpha, omega-Dicarbonsäuren verwendet werden kann. Die POX4- und POX5-Gene kodieren getrennte Untereinheiten der Langketten-Acyl-CoA-Oxidase, welches die als PXP-4 und PXP-5 bezeichneten peroxisomalen Polypeptide (PXP) sind. Diese PXP werden in den Peroxisomen gefunden, welches in C. tropicalis vorhandene intrazelluläre Organellen sind, die verschiedene verwandte Enzyme enthalten, welche beim Abbau von Alkan- und Fettsäuresubstraten wirksam sind. Deshalb blockiert die Zertrennung der diese PXP kodierenden POX4- und POX5-Gene wirksam die β-Oxidation von Fettsäuren, wodurch das Substrat wieder auf den omega-Oxidationsweg gelenkt wird, während die Wiederverwendung der Dicarbonsäureprodukte des omega-Oxidationswegs verhindert wird.
In dem bevorzugten Verfahren wird ein auf Uracil (Ura&supmin;) auxotropher C. tropicalis-Transformationswirt mit einer Zertrennungskassette, die entweder ein URA3A-funktionelles Gen, das an einer Seite durch eine 1,2 Kb-5'-POX5-Sequenz und an der anderen Seite durch eine 2,7 Kb-3'-POX5-Sequenz flankiert wird, oder ein URA3A-funktionelles Gen, das an einer Seite durch eine 2,1 Kb- 5'-POX4-Sequenz und an der anderen Seite durch eine 4,5 Kb-3'- POX4-Sequenz flankiert wird, enthält, zu Uracil Prototrophie transformiert. Die transformierten Zellen werden für Uracil prototroph gemacht und werden durch ihre Fähigkeit, in Abwesenheit von Uracil zu wachsen, selektiert. Im ersten Fall wird eines der POX5-Gene von C. tropicalis zertrennt und es kann nicht mehr PXP-5, ein für Acyl-CoA-Oxidase charakteristisches Isozym, kodieren, während im letzten Fall eines der POX4-Gene zertrennt wird und nicht länger PXP-4, ein weiteres, für Acyl- CoA-Oxidase charakteristisches Isozym, kodieren kann.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zum Wiederherstellen eines auxotrophen Phänotyps von Zellen bereit, die zuvor mit einem selektierbaren Marker zu Prototrophie transformiert wurden, umfassend: erstens Selektieren oder Durchmustern auf spontane Mutationen, die den selektierbaren Marker inaktivieren und dadurch zur Isolierung auxotropher Mutanten führen, zweitens Bestätigen des auxotrophen Phänotyps der Mutanten und drittens Bestätigen des parentalen Genotyps der Mutanten durch Southern-Hybridisierung mit den geeigneten Gensonden. Bei diesem Verfahren stellen spontane Punktmutationen, die innerhalb des selektierbaren Markergens auftreten, den auxotrophen Phänotyp bei den zertrennten Mutanten wieder her.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Ura&supmin;-auxotrophe Phänotyp bei Zellen wiederhergestellt, die zuvor zu Ura&spplus;-Prototrophie transformiert wurden, indem zuerst auf spontan gebildete Ura&supmin;-Mutanten durch ihre Fähigkeit, in einem 5-Fluororotsäure (5- FOA), ein Analogon eines Uracilweg-Zwischenprodukts, das für Ura&spplus;-Zellen toxisch ist, enthaltenden Medium zu wachsen, selektiert wird. Die Selektion in Anwesenheit von 5-FOA gestattet die Identifizierung von Isolaten, die einen nicht-funktionellen URA3A-selektierbaren Marker besitzen. Der Ura&supmin;-Phänotyp dieser Zellen wird durch Feststellen der Tatsache bestätigt, daß sie in Abwesenheit von Uracil nicht wachsen. Der parentale Genotyp der Zellen wird durch Southern-Hybridisierung mit der geeigneten Gensonde bestätigt.
Ein weiteres Verfahren zum Wiederherstellen eines auxotrophen Phänotyps bei Zellen, die zuvor mit einem selektierbaren Marker zu Prototrophie transformiert wurden, verwendet ein direktes Deletionsverfahren. Bei diesem Verfahren werden die prototrophen Zellen mit einem nicht-funktionellen, selektierbaren Markergen transformiert, das durch eine in-vitro-Deletion mindestens eines Teils der zentralen Kodierungssequenz nicht-funktionell gemacht worden ist. Die in-vitro-Deletion kann durch Aufbauen eines Plasmids, welches das selektierbare Markergen enthält, und Linearisieren des Plasmids mit einer Restriktionsendonuklease bewerkstelligt werden, die das selektierbare Markergen an einer einzelnen Spaltungsstelle in der zentralen Kodierungssequenz schneidet. Das sich daraus ergebende Fragment, das Teile des gespaltenen selektierbaren Markergens an jedem Ende enthält, wird anschließend einer prozessiven Exonuklease ausgesetzt, die Nukleotide (bp) aus den Enden der Fragmente unter Bilden eines neuen, kürzeren Deletionsfragments herausschneidet. Dieses neue Fragment wird anschließend durch Ligation unter Bilden eines neuen Plasmids, das eine Deletion des selektierbaren Markers oder eines Teils desselben enthält, rezirkularisiert. Das Plasmid enthält nicht die einzelne Restriktionsstelle, die das ursprüngliche Plasmid enthielt, da diese Stelle durch die Wirkung der prozessiven Exonuklease entfernt wurde. Das deletierte Gen wird aus dem Plasmid mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen freigesetzt, welche das Plasmid an den Enden des modifizierten selektierbaren Markergens schneiden und wird in Zellen transformiert, die zuvor mit einem funktionellen, selektierbaren Markergen prototroph gemacht wurden. Die transformierten Zellen werden dadurch als Ergebnis des Ersatzes eines funktionellen, selektierbaren Markergens durch ein nicht-funktionelles auxotroph gemacht. Die Auxotrophie dieser Mutanten kann durch ihr Testen auf die Unfähigkeit, in Abwesenheit des besonderen Nährstoffs zu wachsen, bestätigt werden. Der Stammgenotyp dieser Mutanten kann durch Durchmustern auf die Abwesenheit der einzigen Restriktionsendonukleasestelle bestätigt werden, die zuvor in dem innerhalb des Genoms der Wirtszelle enthaltenen, selektierbaren Markergen vorhanden war.
In einer bevorzugten Ausführungsform des vorstehend offenbarten Verfahrens wird der Ura&supmin;-auxotrophe Phänotyp bei Zellen wiederhergestellt, die zuvor mit einem URA3-selektierbaren Marker durch Spalten eines ein Wildtyp-URA3-Gen enthaltenden Plasmids mit KpnI zu Ura&spplus;-Prototrophie transformiert wurden. Das auf diese Weise erhaltene lineare DNA-Fragment wird anschließend mit Bal31 verdaut und erneut unter Bilden eines Plasmids ligiert, das eine 50 bp-URA3A-Deletion mit 2,4 Kb flankierender URA3A-Homologie enthält. Das deletierte URA3-Gen wird zuerst als lineares DNA- Fragment durch Verdauung des Plasmids mit EcoR1 und PstI freigesetzt und anschließend in Ura&spplus;-prototrophe Wirtszellen (Stamm H51) transformiert. Die Ura&supmin;-Transformanten werden isoliert und ihre Auxotrophie wird durch die Unfähigkeit der Transformanten bestätigt, in einem Medium mit einem Mangel an Uracil zu wachsen. Der Genotyp der Ura&supmin;-auxotrophen Mutanten wird durch Demonstrieren der chromosomalen 50 bp-Deletion im Stamm-H51dKpn- Chromosom durch Southern-Hybridisierung mit einer URA3A-Gensonde bestätigt. Von den 7,1 Kb- und 1,4 Kb-KpnI-Fragmenten des Stamms H51 wird dadurch gezeigt, daß sie durch ein 8,5 Kb-KpnI-Fragment im Stamm H51dKpn ersetzt wurden.
Die vorhergehenden Verfahren können auf jedes selektierbare Markersystem angewandt werden, das eine Anderung des Phänotyps im Wirtsstamm liefert. Andere geeignete selektierbare Marker schließen die HIS4-, POX4A-, POX4B oder POX5-Gene ein, sind aber nicht darauf beschränkt. In dem Fall, wo der selektierbare Marker ein HIS4-Gen ist, ist eine Wirtszelle für Histidin auxotroph oder in dem Fall, wo alle vier chromosomalen POX-Gene durch Genzertrennung inaktiviert sind, kann der selektierbare Marker eines der vier POX-Gene sein. In diesem Fall werden mit einem POX-Gen transformierte Mutanten durch ihre Fähigkeit selektiert, in Medium zu wachsen, das Alkane oder Fettsäureester als einzige Kohlenstoffquelle enthält.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zum vollständigen Blockieren des β-Oxidationswegs in C. tropicalis bei seiner ersten Reaktion durch Zertrennen der POX4A-, POX4B- und beider POX5-Gene eines C. tropicalis- Wirtsstamms bereit. Die Reihenfolge, in der die vier Gene zertrennt werden ist unerheblich. Es ist nur notwendig, daß alle POX-Gene zertrennt werden. Wenn alle diese POX-Gene von C. tropicalis zertrennt sind, kodieren sie die funktionellen Acyl-CoA-Oxidase- Isozyme, die für den β-Oxidationsweg notwendig sind, nicht mehr. Deshalb kann der Organismus keine Fettsäuren mehr an dem β- Kohlenstoffatom oxidieren, weil die für diesen Weg notwendigen Enzyme nicht synthetisiert werden. Das Substrat wird deshalb wieder auf den omega-Oxidationsweg gelenkt, während ferner der Abbau der Dicarbonsäureprodukte über den β-Oxidationsweg verhindert wird. Deshalb synthetisiert ein C. tropicalis-Stamm, in dem alle vier POX-Gene zerschnitten sind, im wesentlichen reine alpha, omega-Dicarbonsäuren in im wesentlichen quantitativer Ausbeute, weil der biosynthetische Weg, der unerwünschte Nebenprodukte wie etwa β-Hydroxysäuren, ungesättigte Säuren oder kürzerkettige Säuren erzeugt, nicht länger wirksam ist.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zum Herstellen im wesentlichen reiner alpha, omega- Dicarbonsäure in im wesentlichen quantitativer Ausbeute bereit, welches das Kultivieren des C. tropicalis-Stammes H5343 in einem Kulturmedium umfaßt, das eine Stickstoffquelle, ein organisches Substrat und ein Cosubstrat enthält. Das Kulturmedium kann irgendeine anorganische oder organische Stickstoffquelle enthalten, die normalerweise in Verfahren zum Kultivieren von Mikroorganismen verwendet wird. Anorganische Stickstoffquellen schließen Alkalimetallnitrate, wie etwa Natrium- oder Kaliumnitrat, Ammoniumsalze, wie etwa Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat usw., ein. Organische Stickstoffquellen schließen Harnstoff, Maisquellwasser, Hefeextrakte und andere organische Stickstoffquellen ein, die dem Fachmann bekannt sind. Das organische Substrat kann jede aliphatische Verbindung sein, bei der wenigstens einer der terminalen Kohlenstoffe eine Methylgruppe ist und die etwa 4 bis etwa 22 Kohlenstoffatome besitzt. Derartige Verbindungen schließen Alkane, Alkene, Alkine, Carbonsäuren und ihre Ester und Arene ein. Bevorzugte Substrate sind Alkane mit etwa 4 bis etwa 22 Kohlenstoffatomen und Fettsäuren und ihre Methyl- oder Ethylester, worin der Acylteil etwa 4 bis etwa 22 Kohlenstoffatome enthält. Die bevorzugtesten Substrate sind Dodecan, Tridecan, Tetradecan, Ölsäure, Methyloleat, Methylpalmitat, Methylpalmitoleat und Methylmyristat.
Das Cosubstrat wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus Glucose, Fructose, Maltose, Glycerin und Natriumacetat besteht. Das bevorzugte Cosubstrat ist Glucose. Ein Cosubstrat ist notwendig, da der beta-Oxidationsweg von C. tropicalis H5343 völlig blokkiert ist und Energie aus der Oxidation des Substrats nicht zur Verfügung steht. In einem definierten Verhältnis zusammen mit dem Substrat zugefügte Glucose stellt ein Gleichgewicht zwischen dem Liefern einer Energiequelle für die Zellen und dem Erlauben der teilweisen Oxidation des Substrats zu einer alpha, omega- Dicarbonsäure her.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Fermentationsmedium hergestellt, das 3 g/l Pepton, 6 g/l Hefeextrakt, 6,7 g/l Hefe-Stickstoffgrundlage (Difco), 3 g/l Natriumacetat und 75 g/l Glucose umfaßt, und durch Erhitzen auf 121ºC bei 15 psi sterilisiert. Das Medium wird anschließend mit 2 ml einer 15% Glycerin- Vorratskultur angeimpft und der Stamm H5343 wird bei 30ºC über eine zum Erzeugen einer maximalen Zelldichte ausreichende Zeit gezüchtet. Die maximale Zelldichte wird durch Messen der Trübung des Mediums bestimmt, wie sie durch einen Absorptionswert von etwa 60 bis etwa 70 bei einer Wellenlänge von 625 nm angezeigt wird. Die maximale Zelldichte entspricht einer Zahl lebensfähiger Zellen von etwa 1,5 x 10&sup9;.
Nach Erreichen der maximalen Zelldichte wird der pH des Mediums anschließend von etwa 7,5 bis etwa 9,5 erhöht, wobei der bevorzugte Wert im Bereich von 8,3 bis 8,8 liegt. Das Cosubstrat wird in einer Menge von etwa 0,5 bis etwa 2,5 Gramm je Stunde und Liter Fermentationsbrühe zugefügt. Die bevorzugte Zugabemenge an Glucose beträgt etwa 1,5 bis etwa 1,75 Gramm je Stunde und Liter Fermentationsbrühe. Das Substrat wird gleichzeitig mit dem Cosubstrat (Glucose) in einer solchen Menge zugefügt, um die Substratkonzentration bei etwa 4 bis etwa 40 Gramm je Liter Fermentationsbrühe zu halten. Die bevorzugte Zugabemenge des Substrats beträgt etwa 10 bis etwa 20 Gramm je Liter Fermentationsbrühe. Die Fermentation kann wie vorstehend beschrieben im Fall eines kontinuierlichen Verfahrens unendlich oder bis das Arbeitsvolumen des Fermentationsgefäßes im Fall eines absatzweisen Verfahrens erreicht ist, fortgesetzt werden.
Wie vorstehend offenbart erfolgt das bevorzugte Verfahren zum Herstellen von alpha, omega-Dicarbonsäuren durch Verwenden des Stamms H5343, dem Stamm, in dem alle vier POX-Gene blockiert sind. Tatsächlich kann jeder der anderen 9, in Figur 4 aufgeführten Stämme, in denen einige der POX-Gene blockiert sind, ebenfalls in dem vorstehend beschriebenen Verfahren verwendet werden.
Die folgenden Beispiele dienen zum Veranschaulichen aber nicht zum Einschränken der Erfindung.

Beispiel 1

Aufbau einer POX5-Zertrennungskassette

Zur Vorbereitung auf das Zertrennen der chromosomalen POX5-Gene von C. tropicalis wurde der URA3A-selektive Marker in das auf dem Plasmid pKD1dBamHI enthaltene, isolierte POX5-Gen subkloniert (siehe Beispiel 22). Das POX5-Gen ist früher kloniert worden und seine DNA-Sequenz ist bestimmt worden (Okasaki, K. et al. (1988) PNAS, USA 83; 1232-1236). Zur Entwicklung eines POX5- Zertrennungsvektors, wurden 12 ug Plasmid pCU2dSacI (siehe Beispiel 21), welches das C. tropicalis-URA3A-Gen enthielt, durch Verdauung mit der NruI-Restriktionsendonuklease linearisiert. BamHI-Linker wurden mit diesen DNA-Fragmenten durch Standardverfahren (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982) und auf die Verdauung mit der BamHI-Restriktionsendonuklease folgend wurde das URA3A-Gen auf einem 2,2 Kb-BamHI-Restriktionsfragment freigesetzt. Das URA3A-Gen wurde anschließend mit 1,25 ug BamHI-linearisiertem, entphosphoryliertem pKD1dBamHI-Plasmid (siehe Beispiel 22) ligiert. Dieses Plasmid enthält das C. tropicalis-POX5-Gen, das auf ein 3,9 Kb-EcoR1-Restriktionsfragment in die einzige EcoR1- Stelle von pBR322 kloniert war. Um das URA3A-Subklonieren in die einzige POX5-BamHI-Stelle zu erleichtern, wurde die BamHI-Stelle innerhalb des Tetracyclinresistenzgens von pBR322 zuvor durch Auffüllen mit Klenow-Polymerase gefolgt von teilweiser BamHI- Verdauung zerstört. Das Ligationsgemisch wurde zum Transformieren von E. coli DH5alpha (BRL, Bethesda Maryland, USA) zu Ampicillinresistenz verwendet. Die Restriktionsanalyse der Plasmid- DNA aus 95 ampicillinresistenten Transformanten zeigte, daß eine den erwarteten Aufbau enthielt. Dieses als pKD1URA3A bezeichnete Plasmid enthält das URA3A-Gen, das auf ein 2,2 Kb-BamHI-Fragment in die einzige POX5-BamHI-Restriktionsstelle (Position #1178) kloniert ist und durch 1,2 Kb der 5'-POX5-Sequenz und 2,7 Kb der 3'-POX5-Sequenz flankiert ist. Die Verdauung des Plasmids mit der EcoR1-Restriktionsendonuklease setzt die 5'-poxs-URA3A-pox5- 3'-Kassette frei, die zur Zertrennung des chromosomalen C. tropicalis-POX5-Gens (Figur 1B) geeignet ist.

Beispiel 2

Aufbau einer POX4-Zertrennungskassette

Zur Vorbereitung auf das Zertrennen der chromosomalen POX4-Gene wurde der URA3A-selektierbare Marker zuerst in das auf dem Plasmid pKD3dBamHI enthaltene, isolierte POX4-Gen subkloniert (siehe Beispiel 23). Das POX4-Gen ist früher kloniert worden und seine DNA-Sequenz ist bestimmt worden (Okasaki, K. et al. (1986) PNAS, USA 83; 1232-1236). Zur Entwicklung eines POX4-Zertrennungsvektors, wurden 12 ug Plasmid pCU2dSacI (siehe Beispiel 21), durch Verdauung mit der NruI-Restriktionsendonuklease linearisiert. BamHI-Linker wurden mit diesen DNA-Fragmenten durch Standardverfahren (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982) ligiert und auf die Verdauung mit BamHI-Restriktionsendonuklease folgend wurde das URA3A-Gen auf einem 2,2 Kb-BamHI-Restriktionsfragment freigesetzt. Das URA3A- Gen wurde anschließend mit 0,75 ug BamHI-linearisiertem, entphosphoryliertem pKD3dBamHI-Plasmid ligiert. Dieses Plasmid enthält das auf ein 6,6 Kb-HindIII-Fragment in die einzige HindIII- Restriktionsstelle von pBR322 klonierte POX4-Gen. Um das URA3A- Subklonieren in die einzige BamHI-Stelle des POX4-Gens zu erleichtern, wurde die BamHI-Restriktionsstelle innerhalb des Tetracyclinresistenzgens von pBR322 zuvor durch Auffüllen mit Klenow-Polymerase gefolgt von teilweiser BamHI-Verdauung zerstört. Das Ligationsgemisch wurde zum Transformieren von E. coli DH5alpha (BRL, Bethesda Maryland, USA) zu Ampicillinresistenz verwendet. Die Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA aus 92 Transformanten zeigte, daß eine den erwarteten Aufbau enthielt. Dieses als pKD3-URA3A bezeichnete Plasmid enthält das URA3A-Gen, das auf ein 2,2 Kb-BamHI-Fragment in die einzige POX4-BamHI- Stelle (Position #2101) kloniert ist und durch 2,1 Kb der 5'- POX4-Sequenz und 4,5 Kb der 3'-POX4-Sequenz flankiert ist. Die Verdauung dieses Plasmids mit der EcoR1-Restriktionsendonuklease setzt die 5'-pox4-URA3-pox4-3'-Kassette frei, die zur Zertrennung des chromosomalen C. tropicalis-POX4-Gens (Figur 1A) geeignet ist.

Beispiel 3

Zertrennung des chromosomalen C. tropicalis-POX5-Gens

Sphäroplasten des C. tropicalis-Stamms SU-2 (ATCC 20913) wurden mit EcoR1-verdautem pKD1-URA3A zu Uracil-Prototrophie transformiert. In diesem und den folgenden Beispielen wurde C. tropicalis durch das folgende Verfahren transformiert: Eine C. tropicalis-Kolonie wurde in etwa 10 ml YEPD-Medium eingeimpft und die Kultur wurde über Nacht bei 30ºC geschüttelt. Die Zellen wurden auf eine etwa 0,01 - 0,1 entsprechende Absorption (A&sub6;&sub0;&sub0;) verdünnt und die Zellen wurden in YEPD-Medium bei 30ºC in der log-Wachstumsphase gehalten. Anschließend wurden 0,03 ml der Kultur mit einer A&sub6;&sub0;&sub0; von 0,01 in 100 ml YEPD-Medium eingeimpft und die Kultur wurde über Nacht bei 30ºC geschüttelt. Nach dem Ernten der Kultur bei A&sub6;&sub0;&sub0; 0,2 - 0,3 durch 5 min Zentrifugieren bei 1500 x g wurden die Zellen mit 1 x 10 ml sterilem Wasser, 1 x 10 ml frisch hergestelltem SED (SED = 1M Sorbit, 25 mM EDTA, 50 mM DTT, filtersterilisiert), 1 x 10 ml 1M Sorbit gewaschen und die Zellen wurden anschließend erneut in 5 ml SCE- Puffer (SCE = 1,0M Sorbit, 100 mM Natriumcitrat, pH 5,8, 10 mM EDTA) suspendiert. Dem Gemisch wurden 20 ul 4 mg/ml Zymolase 20000 zugesetzt und das Medium wurde bei 30ºC inkubiert. Die Sphäroplastenbildung wurde wie folgt überwacht: aliquote Mengen von 100 ul Zellen wurden entweder 900 ul 0,2% SDS oder 900 ul 1M Sorbit zugefügt. Die Inkubation mit der Zymolase wurde an dem Punkt beendet, an dem Zellen in SDS, aber nicht in Sorbit lysierten (üblicherweise 15-30 min Inkubation). Die Sphäroplastenbildung war wirkungsvoll, wobei geschätzte 99% der Zellen osmotisch zerbrechlich wurden. Bei Beendigung der Inkubation wurden die Sphäroplasten mit 1 x 10 ml 1M Sorbit durch 10 min Zentrifugieren bei 1000 x g, 1 x 10 ml sterilem CaS (CaS = 1M Sorbit, 10 mM Calciumchlorid, filtersterilisiert) gewaschen und die Zellen wurden anschließend erneut in insgesamt 0,6 ml CaS suspendiert. Die Transformation wurde durch Zufügen von DNA-Proben (bis zu 20 zu sterilen Polypropylenröhrchen von 12 x 75 mm erreicht; die DNA befand sich in Wasser oder TE-Puffer. Jeder DNA-Probe wurden 100 ul Sphäroplasten zugesetzt und das Gemisch wurde 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Diesem Gemisch wurde anschließend 1 ml PEG-Lösung (PEG-Lösung = 20% Polyethylenglykol - 3350, 10 mM Calciumchlorid, 10 mM Tris.HCl, pH 7,4, filtersterilisiert) zugefügt und es wurde 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 10 min Zentrifugieren der Proben bei 1000 x g wurde die PEG-Lösung dekantiert, die Proben wurden erneut in 150 ul SOS (SOS = 1M Sorbit), 30% YEPD-Medium, 10 mM Calciumchlorid, filtersterilisiert) suspendiert und die wieder suspendierten Proben wurden 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Der Probe wurden anschließend 850 ul steriler 1M Sorbit zugefügt. Zur Zellregeneration wurden aliquote Mengen von 10 ul und 990 ul jeder Probe aliquoten Mengen von 10 ml geschmolzenem, bei. 50ºC gehaltenem Regenerationsagar zugesetzt und das Gemisch wurde auf Platten gegossen, die 10 ml feste Agarbodenschicht aus Regenerationsagar enthielten. (Zum Herstellen von Regenerationsagar werden 9 g Bacto-Agar und 13,5 g KCl in 240 ml Wasser autoklaviert, nach dem Autoklavieren werden 30 ml 20%ige sterile Dextrose und 30 ml steriles 10X YNB zugefügt und das Gemisch wird anschließend bei 55ºC gehalten.) 10 ml Agarbodenschicht wurden 30 Minuten bevor die Transformationsproben fertig waren auf Platten gegossen. Die von Sphäroplastenregeneration war wirkungsvoll und war größer als 10%. Die Transformation von C. tropicalis-ura3-Stämmen, zum Beispiel der Stamm SU-2, erfolgte mit großer Häufigkeit auf. Die Transformationshäufigkeit betrug etwa 5000 - 20000 Ura&spplus;-Kolonien je Mikrogramm DNA. Sowohl geschlossene als auch lineare Plasmid-DNA ergaben eine hohe Transformationshäufigkeit. Die Wirksamkeit unter Anwenden des LiCl-Transformationsverfahrens war etwa 10- bis 100mal geringer.
Auf die Transformation mit 5 ug EcoR1-verdauter pKD1-URA3A folgend wurden ungefähr 200 mitotisch stabile Ura&spplus;-Transformanten isoliert. Elf Transformanten wurden nachfolgend auf Wachstum auf Dodecan und durch Southern-Hybridisierung EcoR1-verdauter genomischer DNA mit POX5- und URA3A-Sonden durch Standardverfahren (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982) durchmustert. Alle elf Transformanten zeigten auf Dodecan ein dem Wildtyp vergleichbares Wachstum. Die Hybridisierung EcoR1-verdauter genomischer DNA aus diesen Transformanten mit einer POX5-Sonde offenbarte die Anwesenheit eines nicht im Wildtyp vorhandenen 6,1 Kb-EcoR1-Fragments (ein als Stamm H51 bezeichneter Vertreter dieser Transformanten wird in Figur 3 gezeigt). Dieses Fragment ist etwa 2,2 Kb größer als das POX5-EcoR1-Fragment vom Wildtyp (3,9 Kb) (in Figur 3 als Stamm SU-2 veranschaulicht) und entspricht dem Ersatz des POX5-Genorts des Wildtyps durch die POX5-URA3A-Zertrennungskassette. Dieses 6,1 Kb-EcoR1-Fragment wurde auch bei einer URA3A-Sonde entdeckt. Die Hybridisierung mit der POX5-Sonde deckte auch die Anwesenheit einer zusätzlichen Wildtyp-Kopie des POX5-Gens (3,9 Kb) in jeder dieser Transformanten auf. Dieses EcoR1-Hybridisierungsmuster könnte entweder einen Tandemeinbau der Zertrennungskassette in ein haploides POX5-Gen oder eine Zertrennung eines einzelnen POX5-Gens an einem diploiden Genort widerspiegeln. Die stärkere Hybridisierung der POX5-Sonde mit dem 3,9 Kb-POX5- EcoR1-Fragment in dem Wildtyp legt nahe, daß es normalerweise zwei Kopien des POX5-Gens gibt. Zum Unterscheiden dieser Möglichkeiten wurde genomische DNA aus den Transformanten mit NcoI verdaut und durch Southern-Hybridisierung wie vorstehend beschrieben analysiert. Da es keine internen NcoI-Stellen innerhalb der POX5-URA3A-Zertrennungskassette gibt, hängen die durch die NcoI-Verdauung erzeugten Fragmentgrößen von der chromosomalen Lage der zur Einbaustelle nächsten NcoI-Stellen ab. Auf diese Weise würden Tandem-Wiederholungen, die sich aus einem Einzelüberkreuzeinbau ergeben, als ein einzelnes großes Fragment erscheinen, während eine POX5-Genzertrennung an einem diploiden Genort zwei Fragmente lieferte. Die Hybridisierung mit einer POX5-Gensonde zeigte die Anwesenheit zweier NcoI-Fragmente in jeder Transformanten, während im Wildtyp nur eine mit größerer Hybridisierungsintensität nachgewiesen wurde. Nur das größere der beiden Fragmente in jeder Transformanten wurde durch Hybridisierung mit einer URA3A-Gensonde nachgewiesen und entspricht in der Größe der für den Ersatz des chromosomalen POX5-Gens durch die POX5-URA3A-Zertrennungskassette erwarteten Größe. Dies stellt die erste Demonstration eines Genzertrennungsvorgangs in C. tropicalis dar. Außerdem ist dies die erste unzweideutige Demonstration, daß C. tropicalis eine diploide Hefe ist und zwei Kopien jedes Gens enthält. Weiterhin demonstrieren die Ergebnisse die Brauchbarkeit des URA3A-Transformationssystems durch die Fähigkeit des subklonierten Genfragments, den SU-2 Uracildefekt auszugleichen, wenn es an einer anderen Stelle als dem chromosomalen URA3A-Gen eingebaut ist. Somit weist das NcoI- Hybridisierungsmuster klar die Zertrennung in diesen als H51 (pox5:URA3A/POX5/POX4A/POX4B) bezeichneten Transformanten einer einzelnen Kopie des POX5-Gens an einem normalerweise diploiden Genort nach. Nur eine der beiden POX5-Gene ist als Ergebnis der Genzertrennung funktionell inaktiviert worden. Eine selektive Zertrennung des restlichen POX5-Gens ist zum funktionellen Inaktivieren der POX5-Aktivität notwendig. Alle 11 analysierten Transformanten enthielten die erwartete POX5-Genzertrennung am chromosomalen POX5-Genort. Keine der Ura&spplus;-Transformanten wurde als Ergebnis des Einbaus am chromosomalen URA3A-Genort isoliert.

Beispiel 4

Zertrennung des chromosomalen C. tropicalis-POX4-Gens

Sphäroplasten des C. tropicalis-Stamms SU-2 (ATCC 20913) wurden mit 10 ug EcoR1-verdautem pKD3-URA3A wie in Beispiel 3 beschrieben zu Uracil-Prototrophie transformiert. Ungefähr 160 mitotisch stabile Ura&spplus;-Transformanten wurden isoliert. Alle zeigten die Fähigkeit zum Verwenden entweder von Dodecan oder Methyllaurat zum Wachstum. Neun Ura&spplus;-Transformanten wurden durch Southern- Hybridisierung wie zuvor beschrieben auf eine ortsspezifische Genzertrennung durchmustert. Die Hybridisierung EcoR1-verdauter, genomischer DNA aus sechs dieser Transformanten mit einer POX4- Sonde offenbarte die Anwesenheit eines im Wildtyp nicht vorhandenen 13 Kb-EcoR1-Fragments (ein Vertreter dieser Transformanten wird als Stamm H41 bezeichnet - Figur 3). Dieses Fragment ist etwa 2,2 Kb größer als das POX4-EcoR1-Fragment des Wildtyps (9,8 Kb) (in Figur 3 als Stamm SU-2 veranschaulicht) und entspricht dem Ersatz des POX4-Genorts des Wildtyps durch die POX4- URA3A-Zertrennungskassette. Dieses 13 Kb-EcoR1-Fragment wurde auch mit einer URA3A-Sonde in Stamm H41, aber nicht in Stamm SU- 2 nachgewiesen. Die Hybridisierung mit der POX4-Sonde deckte jedoch auch die Anwesenheit einer zusätzlichen Wildtyp-Kopie des POX4-Gens in jeder dieser Transformanten auf und zeigte auf diese Weise, daß C. tropicalis auch am POX4-Genort diploid ist. Die Hybridisierung HpaI-verdauter, genomischer DNA mit einer POX4-Sonde zeigte, daß die beiden Chromosomen an dieser Restriktionsstelle heterozygot sind und auf diese Weise das Chromosom unterscheiden, in das die transformierende DNA eingebaut wurde. Durch Vergleichen der EcoR1- und HpaI-Hybridisierungsmuster wurde bestimmt, daß von den neun analysierten Ura&spplus;-Transformanten zwei eine genaue Genzertrennung eines POX4-Gens enthielten, drei einen Einzelüberkreuzeinbau in ein POX4-Gen (von denen einer ein Tandemmehrfacheinbau war) enthielten und vier sowohl einen Einzelüberkreuzeinbau als auch eine Genzertrennung in ein oder beide Chromosomen enthielten. Die Stämme, die nur eine genaue Zertrennung eines der beiden POX4-Gene enthielten wurden als H41 (POX5/POX5/pox4A:URA3A/POX4B) bezeichnet (Figur 3).

Beispiel 5

Regeneration des URA3-selektierbaren Markersystems

(A) Selektion Uracil-Auxotropher, die sich aus der spontanen Mutation innerhalb des URA3A-selektierbaren Markers ergeben

C. tropicalis SU-2 (Ura&supmin;) und H51 (Ura&spplus;) wurden auf Wachstum in Medium getestet, das verschiedene Konzentrationen an 5-Fluororotsäure (5-FOA) enthielt, ein Analogon eines Uracilweg-Zwischenprodukts, das für Ura&spplus;-Zellen toxisch ist. Beide Stämme wurden in YEPD-Medium (2% Bacto-Pepton, 2% Glukose, 1% Bacto- Hefeextrakt) zur mittleren log-Phase gezüchtet und wurden in verschiedenen Verdünnungen auf FOA-Medium (Boeke et al., [1984] Molec. Gen. Genet. 197, S. 345-346) oder YEPD-Medium plattiert.
C. tropicalis SU-2 zeigte 71,6%, 50,3% und 14,8% Überleben in Anwesenheit von 500, 750 und 1000 ug/ml 5-FOA. Unter vergleichbaren Bedingungen zeigten die Ura&spplus;-Transformanten (H51) Überlebensraten von weniger als 3,6 x 10&supmin;&sup6;. Von Konzentrationen von weniger als 500 ug/ml wurde gefunden, daß sie das Wachstum spontaner 5-FOA-resistenter Mutanten erlaubten, die den Ura&spplus;- Phänotyp behielten. Auf diese Weise gestattet die Selektion in Anwesenheit von 750 ug/ml 5-FOA die Identifizierung von Isolaten, die einen nicht-funktionellen URA3A-Marker besitzen.

Beispiel 6

Regenerierung des URA3-selektierbaren Markersystems

(B) Gesteuerte Chromosomen-Deletion

Das Plasmid pCU3dKpnI wurde durch fortschreitende Bal31-Deletion von der einzigen KpnI-Stelle innerhalb des URA3A-Gens aufgebaut. Für diese Aufbauten wurden aliquote Mengen von 10 ug Plasmid pCU3 durch Verdauung mit KpnI-Restriktionsendonuklease linearisiert und darauffolgend mit Bal31-Nuklease (0,05 E/ug während 5, 10, 20 oder 30 min bei 30ºC) teilweise verdaut. Auf die Behandlung mit DNA-Polymerase-Klenow-Fragment folgend wurden die Plasmide durch Ligation bei niedriger DNA-Konzentration (0,05 ug/ul) rezirkularisiert. Die Ligationsgemische wurden zum Transformieren von E. coli HB101 zu Ampicillinresistenz verwendet oder wurden mit EcoR1 und PstI zur direkten Transformierung von C. tropicalis H51 verdaut. Drei Plasmide, die eine Deletion der KpnI-Stelle enthielten und sich zu den BglII-Stellen erstreckten, wurden aus den ampicillinresistenten E. coli-Transformanten isoliert. Die von diesen Plasmiden abgeleiteten Deletionskassetten können zum Erzeugen verhältnismäßig kleiner URA3A-Deletionen (bp) verwendet werden, während große Strecken URA3A-Homologie (Kb) erhalten wurden und werden durch Verdauung der Plasmide mit EcoR1 und PstI freigesetzt. Stamm H51 wurde entweder durch das LiCl-Verfahren (Ito et al., [1983], J. Bacteriol. 153; 163-168) oder das Sphäroplast-Verfahren mit 20 ug EcoR1/PstI-verdautem pCU3dKpnI transformiert, das zuvor gereinigt und als eine 50 bp- Deletion enthaltend charakterisiert wurde, welche sich über die URA3A-KpnI-Stelle erstreckte. Die Sphäroplastentransformation wurde wie zuvor beschrieben ausgeführt, außer daß die Sphäroplasten auf der Oberfläche des Regenerationsmediums regeneriert wurden, um ihre Isolierung für das nachfolgende Durchmustern zu erleichtern. Die Ura&supmin;-Isolate wurden phänotypisch identifiziert, was von der Nystatin-Anreicherung (nachstehend beschrieben) und in einigen Fällen der Selektion auf 5-FOA-Resistenz gefolgt wurde. Die Zellen von der Oberfläche der Transformationsplatten wurden durch Waschen mit sterilem YEPD zusammengefaßt und wurden zu einer Anfangs-A&sub6;&sub0;&sub0; von 0,1 in YEPD eingeimpft und bei 30ºC kultiviert, bis eine A&sub6;&sub0;&sub0; von 0,4 erreicht war. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren (5000 x g, 5 min) geerntet und in 100 ml Hefe-Kohlenstoffgrundlage (YCB; 11 g/l; Difco) in einem sterilen 500 ml-Kolben eingeimpft. Die Kultur wurde bei 200 Upm 21 Stunden bei 30 ºC geschüttelt. Die Zellen wurden anschließend zentrifugiert (5000 x g, 5 min), einmal mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen und erneut in 100 ml Minimalmedium (Hefestickstoffgrundlage 6,7 g/l, Dextrose 20 g/l) in 500 ml-Kolben suspendiert. Die Zellen wurden unter Schütteln (200 Upm) 7 Stunden bei 30ºC inkubiert. Anschließend wurde Nystatin (50000 Einheiten/ml Vorratslösung in Methanol; Sigma #N3503) in einer Endkonzentration von 35 Einheiten/ml zugefügt und die Zellen wurden 35 Minuten bei 30ºC unter Schütteln (200 Upm) inkubiert. Die Kultur wurde zwei Mal mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen und erneut in 10 ml sterilem destilliertem Wasser suspendiert. Nystatin-behandelte Zellen (aliquote Mengen von 0,1 ml) wurden auf Selektionsplatten plattiert (YNB 6,7 g/l, Dextrose 20 g/l, Agar 20 g/l, Uracil 50 mg/l, Uridin 150 mg/l, Uridin-5-phosphat 150 mg/l, 5-Fluororotsäure 750 mg/l). Die Platten wurden bis zu zwei Wochen bei 30ºC inkubiert, zu welchem Zeitpunkt die Kolonien, welche auf den Platten wuchsen, mit sterilen Zahnstochern aufgenommen und auf einen zweiten Satz wie zuvor hergestellter Selektionsplatten plattiert wurden. Die Inkubation betrug vier Tage bei 30ºC. Die Isolate wurden anschließend auf Minimalmediumplatten mit oder ohne zugesetztes Uracil überführt. Kolonien, die in Abwesenheit von Uracil nicht wachsen konnten, wurden zur weiteren Analyse hergenommen. Die Charakterisierung von 25 Ura- Isolaten, die aus der Transformation von H51 Sphäroplasten mit pCU3dKpnI (das eine 50 bp-URA3A-Deletion mit 2,4 Kb flankierender URA3A-Homologie enthielt) durch Southern-Hybridisierung von EcoR1-verdauter genomischer DNA mit einer POX5-Sonde gewonnen wurde, zeigte, daß 13 Isolate die erwartete Deletion innerhalb des zertrennten POX5-Gens enthielten. Diese Stämme wurden als H51dKpn (pox5:dura3A/POX5/POX4A/POX4B) bezeichnet. Die übrigen Isolate waren Vertreter mitotischer Rekombinanten. Die chromosomale 50 bp-Deletion, welche die URA3A-KpnI-Stelle in H51dKpn flankierte, wurde weiter durch Southern-Hybridisierung von KpnI- verdauter, genomischer DNA mit POX5- und URA3A-Gensonden bestätigt. Wie erwartet, wurden die mit der URA3A-Sonde nachgewiesenen 7,1 Kb- und 1,4 Kb-KpnI-Fragmente durch ein 8,5 Kb-KpnI- Fragment in H51dKpn ersetzt. Die Umkehrhäufigkeiten mehrerer unabhängiger H51dKpn-Isolate betrugen alle < 1 x 10&supmin;&sup8;.

Beispiel 7

Regeneration des URA3-selektierbaren Markersystems

C. Spontane Mutation innerhalb des URA3A-selektierbaren Markers:

Aufbau des Stamms H53-(pox5:ura3A/pox5:URA3A/POX4A/POX4B)

Der Stamm H53 (pox5:ura3A/pox5:URA3A/POX4A/POX4B) wurde auf die Transformation eines Ura&supmin;-Derivats von H51 (H51Ura&supmin;) mit der POX5-URA3A-Zertrennungskassette aus pKD1-URA3A mit Ura&spplus; folgend wie folgt isoliert: von mehreren spontanen, aus H51 in Abwesenheit transformierender DNA isolierten, 5-FOA-resistenten Isolaten wurde gefunden, daß sie in ihrem POX5-EcoR1-Hybridisierungs muster mit H51 identisch, phänotypisch aber Ural waren. Die Stämme wurden H51Ura-(pox5:ura3A/pox5/POX4A/POX4B) bezeichnet. Es wurde gefolgert, daß diese Derivate spontane Punktmutationen innerhalb des URA3A-Gens an dem zertrennten POX5-Genort darstellten und somit mit dem URA3A-selektierbaren Marker oder insbesondere mit der POX5-URA3A-Zertrennungskassette retransformiert werden könnten, um das restliche funktionelle POX5-Gen wirksam zu inaktivieren. Deshalb wurden 20 Isolate mit einem Ura&supmin; -Phänotyp und einem H51-Hybridisierungsmuster getrennt mit 10 ug EcoR1-verdautem pKD1-URA3A zu Ura&spplus; transformiert. Drei Stämme besaßen Umkehrhäufigkeiten (zu einem Ura&spplus;-Phänotyp), die niedrig genug waren, um die leichte Identifizierung von Ura&spplus;-Transformanten zu gestatten. Die Charakterisierung von 28 Ura&spplus;-Transformanten aus diesen drei Stämmen durch Southern-Hybridisierung von EcoR1-verdauter, genomischer DNA mit einer POX5-Sonde identifizierte 9 Transformanten, welche die alleinige Anwesenheit eines 6,1 Kb-EcoR1-Fragments mit der zweifachen Hybridisierungsintensität von H51 zeigten. Diese Transformanten, die H53 (pox5 :ura3A/pox5:URA3A/POX4A/POX4B) bezeichnet wurden, stellen Zertrennungen beider Kopien des POX5-Gens dar und werden in Figur 3 veranschaulicht. Diese Stämme sind zum Wachstum auf Dodecan als der alleinigen Kohlenstoffquelle befähigt. Die restlichen Transformanten waren mit H51 identisch und können sich entweder aus der Umkehrung, Genumwandlung oder durch Genersatz am ursprünglichen, zertrennten POX5-Gen ergeben haben.

Beispiel 8

Entwicklung des Stamms H534-(pox5:ura3A/pox5:ura3A/pox4A:URA3A/POX4B)

Dieser Stamm, bei dem beide Kopien von POX5 und eine Kopie von POX4 zertrennt sind, wurde durch die vorstehend beschriebenen Verfahren entwickelt. Ura&supmin;-Derivate von H53 (H53Ura&supmin;:pox5: ura3A/pox5:ura3a/POX4A/POX4B) wurden wie vorstehend isoliert und charakterisiert und anschließend mit der POX4-Zertrennungskassette aus pKD3-URA3A transformiert. Fünfzig Prozent der durch Southern-Hybridisierung mit sowohl POX4- als auch POX5-Sonden durchmusterten Ura&spplus;-Transformanten besaßen die erwartete POX4- Zertrennung (H534 - Figur 3). FOAr, URA-Derivate mit niedriger URA&spplus;-Umkehrhäufigkeit wurden aus dieser Mutanten (als H534Ura&supmin; ;pox5:ura3A/pox5:ura3a/pox4a:ura3A/POX4B) bei der Vorbereitung zur Zertrennung des übrigen funktionellen POX4-Gens erhalten.

Beispiel 9

Entwicklung des Stamms H45 (pox5:URA3A/POX5:pox4A:ura3A/POX4B)

Dieser Stamm, bei dem sowohl eine Kopie des POX4- als auch eine Kopie des POX5-Gens zertrennt ist, wurde ebenfalls durch die vorstehend beschriebenen Verfahren entwickelt. Mehrere FOA-resistente Ura&supmin;-Derivate aus Stamm H41, die Ura&spplus;-Umkehrhäufigkeiten < 2 x 10&supmin;&sup7; zeigten, wurden isoliert und durch Southern-Hybridisierung mit einer POX4-Sonde auf ein mit H41 identisches EcoR1- Restriktionsmuster durchmustert. Mehrere Kandidaten, die vermutlich eine Punktmutation innerhalb des URA3A-Gens am zertrennten POX4-Genort enthielten, wurden isoliert und als H41Ura(POX5/POX5/pox4A:ura3A/POX4B) bezeichnet.
Stamm H45 wurde auf die Transformation von H41ura&supmin; mit der POX5- Zertrennungskassette aus pKD1-URA3A folgend isoliert. Alle durch Southern-Hybridisierung mit einer POX5-Sonde analysierten.Ura&spplus;- Transformanten enthielten die erwartete POX5-Zertrennung (H45 - Figur 3).

Beispiel 10

Entwicklung des Stammes H41B (POX5/POX5/POX4A/pox4B:URA3A)

Zum Inaktivieren von POX4B wurde SU-2 mit einer verkürzten POX4A-Zertrennungskassette, der nicht-homologe, flankierende Sequenzen fehlten, hauptsächlich in Abhängigkeit von homologen Sequenzen innerhalb des Strukturgens zum Lenken der Mutagenese zu Ura&spplus; transformiert. Zum Herstellen von POX4A für diese Transformation wurde die übliche 8,3 Kb-EcoR1-Zertrennungskassette aus pKD3URA3 mit Bal31 und SalI verdaut, um Fragmente mit ungefähr 5 Kb zu erzeugen, die hauptsächlich aus den URA3A-selektierbaren Marker flankierenden Strukturgenen bestanden. Diese DNA wurde zum Transformieren von SU-2 in Ura&spplus; verwendet. Eine der 20 SU-2-Transformanten, die durch Southern-Hybridisierung von HpaI-verdauter genomischer DNA mit einer POX4A-Sonde durchmustert wurden, besaß die erwartete POX4B-Zertrennung. Dieser als H41B (POX5/POX5/POX4A/pox4B:URA3A) bezeichnete Stamm wurde durch Southern-Hybridisierung von EcoR1- oder HoaI-verdauter, genomischer DNA mit POX4A-, URA3A- und pBR322-Sonden bestätigt. Das EcoR1-Hybridisierungsprofil dieses Stamms ist mit dem in Figur 3 veranschaulichten von H41 identisch. 5FOA-resistente, Uracil erfordernde Derivate wurden zum Aufbau der Doppel-POX4-Mutanten H43 aus H41B (H41BUra:POX5/POX5/POX4A/pox4B:ura3A) hergestellt.

Beispiel 11

Entwicklung des Stammes H43 (POX5/POX5/POX4A:URA3A/pox4B:ura3A)

Dieser Stamm, der eine Zertrennung beider POX4-Gene besitzt, wurde auf die Transformation von H41BUra mit der POX4A-Zertrennungskassette aus pKD3-URA3A folgend isoliert. Sieben der 20 Ura&spplus;-Transformanten, die durch Southern-Hybridisierung von HpaI- verdauter genomischer DNA mit einer POX4A-Sonde durchmustert wurden, besaßen den erwarteten, in Figur 3 veranschaulichten Aufbau.

Beispiel 12

Entwicklung des Stammes H534B (pox5:ura3A/pox5:ura3A/POX4A/pox4B:URA3A)

Dieser Stamm, der sowohl eine Zertrennung beider POX5-Gene als auch der POX4B-Gene enthält, wurde wie vorstehend beschrieben entwickelt. Dieser Stamm wurde auf die Transformation des Uracil erfordernden Derivats von H53 (H53Ura&supmin;) mit einer Zertrennungskassette auf der Grundlage von verkürztem POX4A folgend isoliert, um auf das POX4B-Gen zu zielen. Zwei der durch Southern- Hybridisierung von SacI-verdauter, genomischer DNA mit einer POX4A-Sonde durchmusterten 23 URA&spplus;-Transformanten besaßen die erwartete POX4B-Genzertrennung. Das EcoR1-Hybridisierungsmuster von H534B ist mit dem in Figur 3 veranschaulichten H534 identisch.

Beispiel 13

Entwicklung des Stammes H435 (pox5:URA3A/POX5/pox4A:ura3A/pox4B:URA3A)

Dieser Stamm, bei dem beide POX4-Gene und ein POX5-Gen zertrennt sind, wurde durch Transformation eines Uracil erfordernden Derivats von H43 (H43Ura&supmin;) mit der POX5-Zertrennungskassette aus EcoR1-verdautem pKD1-URA3A aufgebaut. Acht der durch Southern- Hybridisierung von EcoR1-verdauter, genomischer DNA mit einer POX5-Sonde durchmusterten 10 URA&spplus;-Transformanten besaßen den in Figur 3 veranschaulichten, erwarteten Aufbau.

Beispiel 14

Entwicklung des Stammes H5343 (pox5:ura3A/poxs:ura3A/pox4A:ura3A/pox4B:URA3A)

Dieser Stamm, in dem alle POX4- und POX5-Gene aktiviert waren, wurde auf die Transformation eines Uracil erfordernden Derivats von H534 (H534Ura&supmin;) mit der Zertrennungskassette auf der Grundlage eines verkürzten POX4A aus pKD3-URA3A zu Ura&spplus; folgend isoliert. Drei der durch Southern-Hybridisierung von SacI-verdauter, genomischer DNA mit einer POX4B-Sonde durchmusterten 100 Transformanten enthielten eine Zertrennung des POX4B-Gens (Figur 3). Die weitere Untersuchung von H5343 durch Southern-Hybridisierung mit einer POX5-Sonde bestätigte den Erhalt aller voriger Zertrennungen. Anders als die vorherigen Mutanten in dem Stammbaum kann H5343 Dodecan oder Methyllaurat nicht mehr als alleinige Kohlenstoffquelle zum Wachstum verwenden.

Beispiel 15

Herstellung von 1,12-Dodecandisäure durch Fermentation von Dodecan mit Stamm H53

Die Fermentation von Dodecan mit Stamm H53 unter den Standardfermentationsbedingungen (Beispiel 20) erzeugte innerhalb 232 h ungefähr 138 g/l 1,12-Dodecandisäure mit einem Substratumwandlungsgrad von 34%. Die Produktionsendrate betrug 0,55 g/l/h. Das Produkt war 85,7% Dodecandisäure. Das restliche Produkt war vorwiegend Adipinsäure.

Beispiel 16

Herstellung von 1,12-Dodecandisäure durch Fermentation von Dodecan oder Methyllaurat mit Stamm H534

Die Fermentation von Dodecan mit Stamm H534 unter den Standardfermentationsbedingungen (Beispiel 20) erzeugte innerhalb 233 h ungefähr 139 g/l mit einem Substratumwandlungsgrad von 32,1%. Die Produktionsendrate betrug 0,58 g/l/h. Das Produkt war 82,7% Dodecandisäure. Das restliche Produkt war vorwiegend Adipinsäure. Mit Methyllaurat als Substrat produzierte H534 innerhalb 223 h 115,3 g/l Dicarbonsäure mit einem Substratumwandlungsgrad von 34,6%. Die Produktionsrate betrug 0,49 g/l/h. Das Produkt war 89,1% Dodecandisäure. Das restliche Produkt war vorwiegend Adipinsäure.

Beispiel 17

Herstellung von Dicarbonsäuren durch Fermentation mit Stamm H5343

Die H5343-Fermentationen wurden gemäß den Standardfermentationsbedingungen (Beispiel 20) durchgeführt, mit Ausnahme, daß während der Herstellungsphase ein Cosubstrat aus 30%iger (Vol./Vol.) Glucose mit Werten von 6 g/h bis 15 g/h zugesetzt wurde. Dodecan-, Tridecan-, Tetradecan- oder Methylmyristatsubstrate wurden während der Herstellungsphase gemäß dem Standardfermentationsverfahren zugesetzt.
Mit Dodecan (99,0% Reinheit) als Substrat produzierte dieser Stamm innerhalb 232 h 127 g/l Dicarbonsäure mit einem Substratumwandlungsgrad von 80%. Die höchste Produktivität während der Fermentation betrug 0,9 g/l/h. Das Produkt war 98,4% Dodecandisäure.
Mit Tridecan (99,0% Reinheit) als Substrat produzierte dieser Stamm innerhalb 114 h 101,8 g/l Dicarbonsäure mit einer Substratumwandlungsrate von 92%. Die höchste Produktivität während der Fermentation betrug 1,2 g/l/h. Das Produkt war 98,6% Brassylsäure.
Mit Tetradecan (99,0% Reinheit) als Substrat produzierte dieser Stamm innerhalb 160 h 103 g/l Dicarbonsäure mit einer Substratumwandlungsrate von 96%. Die höchste Produktivität während der Fermentation betrug 0,85 g/l/h. Das Produkt war 98,0% Tetradecandisäure.
Mit Methylmyristat (95% Reinheit) als Substrat produzierte dieser Stamm innerhalb 213 h 213 g/l Dicarbonsäure mit einer Substratumwandlungsrate von 99,5%. Die höchste Produktivität während der Fermentation betrug 1,33 g/l/h. Das Produkt war 94 ,5% Tetradecandisäure.

ALLGEMEINE EXPERIMENTELLE VERFAHREN

Beispiel 18

Stammbewertung

A. Mitotische Stabilität von Stamm H5343

Zum Bestimmen der mitotischen Stabilität der POX-Genzertrennungen wurde Stamm H5343 durch aufeinanderfolgende Überführung in YEPD-Medium (2% Glucose, 2% Pepton, 1% Hefeextrakt) kultiviert und täglich über einen Zeitraum von 10 Tagen auf "Umkehr" zu einem Alkan-verwendenden Phänotyp getestet, indem sowohl aliquote Mengen von 0,1 ml auf Hefe-Stickstoffgrundlage-Agar (Difco) plattiert wurden, welche Dodecan als alleinige Kohlenstoffquellen enthielten, als auch durch serielle Verdünnungen auf YEPD- Medium (um die Zahl lebensfähiger Zellen zur Bestimmung der Gesamtzahl der Generationen zu erhalten). Nach 91 Generationen wurden keine Alkan-verwendenden Isolate gewonnen, wodurch die Stabilität dieser Mutanten bestätigt wurde.

Beispiel 19

B. Enzymatischer Test auf Acyl-CoA-Oxidase-Aktivität

Eine biochemische Bewertung der Stämme durch Test auf Acyl-CoA- Oxidase-Aktivität wurde abgeschlossen. Bei jedem Stamm wurde Impfmaterial 30 h in einem Medium auf Glucosegrundlage (YEPD) gezüchtet, gefolgt von einem Induktionszeitraum von 40 h in Hefe-Stickstoffgrundlage-Medium (Difco), das Hefeextrakt (0,3%) und entweder Glucose (1,5%), Dodecan (1,5%) oder Methyllaurat (1,5%) enthielt. Extrakte wurden durch wiederholten Durchgang gewaschener Zellsuspensionen durch eine French-Druckzelle (1260 psi) hergestellt und Zelltrümmer wurden durch Zentrifugieren (13000 x g) entfernt. Die Aktivität wurde gemäß den von Shimuzu et al., 1979, Biochem. Biophys. Res. Commun. 91, 108-113, beschriebenen Verfahren gemessen. Die Aktivität wurde unabhängig an C6-CoA-, C10-CoA- und C12CoA-Substraten gemessen und auf die Proteinkonzentration normalisiert. Einige, eine teilweise β- Oxidationsblockierung enthaltende Mutanten, glichen anscheinend den Verlust eines POX-Genprodukts durch Überexpression der restlichen funktionellen POX-Gene aus, was zu größeren Acyl-CoA- Oxidaseaktivitäten als der Kontrollstamm SU-2 führte. Trotz des erhöhten Acyl-CoA-Oxidasewerts in diesen Mutanten wird jedoch ein bedeutender Teil des Substrats auf den omega-Oxidationsweg zurückgeleitet (siehe nachstehend). Dies zeigt an, daß die POX- Genprodukte weder funktionell identisch noch physiologisch selbständig sind.
Stamm H43 erlaubt die Bewertung der POX5-Isozymfunktion. Extrakte aus diesem Stamm zeigten weniger Aktivität als SU-2 bei allen drei Substraten in Methyllaurat-induzierten Zellen und bei C6-CoA in Dodecan-induzierten Zellen. Die spezifischen Aktivitäten waren bei C12-CoA größer als entweder bei C10-CoA oder C6- CoA. Somit besaß das POX5-Isozym eine "Langkettenaktivität"- Funktion. Im Gegensatz dazu hat die Analyse von H53 gezeigt, daß das POX4-Isozym über einen breiteren Substratbereich mit den höchsten spezifischen Aktivitäten bei den kürzerkettigen Substraten wirksam ist. Die spezifischen Aktivitäten bei C6-CoA- oder C10-CoA-Substraten waren größer als bei C12-CoA. Diese Ergebnisse zeigten an, daß die POX4- und POX5-Isozyme sich in der Kettenlängenspezifität unterscheiden. Nur POX4-Isozym enthaltende Mutanten zeigten eine funktionelle Acyl-CoA-Oxidaseaktivität, wenn sie mit Glucose induziert wurden. Dies zeigt an, daß das POX4-Protein das alleinige, konstitutiv exprimierte Acyl-CoA-Oxidase-Isozym ist. Der Aktivitätswert wird nur bei Mutanten, die POX4-Zertrennungen enthalten und denen-somit ein Teil des POX4-Protein fehlt, unter Wildtypwerte verringert. Wenig oder keine Aktivität wurde bei auf Glucose gewachsenem H43 nachgewiesen, wodurch nahegelegt wurde, daß POX5 unter diesen Bedingungen nicht exprimiert wird.
Keine Acyl-CoA-Oxidaseaktivität wurde bei H5343 (bei von C4-CoA bis C18-CoA reichenden Substraten) nachgewiesen, wodurch bestätigt wurde, daß alle funktionellen Acyl-CoA-Oxidase kodierenden Gene inaktiviert worden sind. Da diese Mutante nicht mehr auf Alkan- oder Fettsäuresubstraten als alleinige Kohlenstoffquelle wachsen kann, haben die hierin beschriebenen mehrfachen Genzertrennungen zu einer vollständigen Blockierung des β-Oxidationswegs geführt.

Beispiel 20

Standardfermentationsverfahren

Fermentationen wurden in einem 15 l-Fermentergefäß (Biostat E, B. Braun, Inc.) in weniger als 10 l Kultur und unter den Vorsichtsmaßnahmen für BL1-Bereiche und gemäß der in den NIH-Richtlinien für die rekombinante DNA-Moleküle umfassende Forschung aufgeführten guten Laboratoriumspraxis durchgeführt.
Das Fermentationsmedium enthielt 3 g/l Pepton, 6 g/l Hefeextrakt, 6,7 g/l Hefe-Stickstoffgrundlage (Difco), 3 g/l Natriumacetat und 75 g/l Glucose. Das Medium wurde durch Erhitzen auf 121ºC bei 15 psi sterilisiert. Die in 2 ml 15% Glycerin-Vorratskultur eingeimpfte Anzuchtkultur wurde während 24 h in 500 ml dieses Mediums bei 30 ºC, 250 Upm vor der Einimpfung in das Fermentergefäß hergestellt. Auf die Einimpfung folgend wurde die Kultur vor der Zugabe des organischen Substrats bei pH 8,3 (durch kontrollierte Zugabe von 6N KOH), 80% gelöstem Sauerstoff (2 vvm Begasungsrate und 500-1200 Upm) bei 30 ºC gehalten, bis eine Absorption bei 625 nm von etwa 60 bis etwa 70 erreicht wurde (etwa 24 h). Während der Anfangsphase der Fermentation wurde die Glucose durch die Kultur aufgebraucht. Substrat und Cosubstrat wurden anschließend auf täglicher Grundlage zugesetzt, um eine Konzentration aufrechtzuerhalten, die von 4-60 g/l organisches Substrat reichte. Das Cosubstrat wurde in einer Menge von etwa 1,5 bis etwa 1,75 g je Stunde je Liter Fermentationsbrühe zugesetzt. Ein handelsübliches Antischaummittel wurde dem Fermenter nötigenfalls auch zugesetzt. Proben wurden auf täglicher Grundlage entnommen, um die Werte für das Produkt und das restliche Substrat durch Gaschromatographie zu bestimmen.

Beispiel 21

Aufbau des Plasmids pCU2dSacI

Ein das URA3A-Gen enthaltendes 5,8 Kb-DNA-Fragment wurde aus dem Plasmid pCU1 (ATCC 67867) der C. tropicalis-Genbank auf YEp13- Grundlage erhalten. Um das Restriktionsenzymkartieren dieses Fragments zu erleichtern, wurden der größte Teil des Fragments in pUC19 subkloniert, welches ein kleiner (2686 Basenpaare) Klonierungsvektor auf pBR322- und M13mp19-Grundlage ist, der eine Mehrfachklonierungsstelle oder einen Polylinker enthält (Yanisch-Perron, C. et al., Gene (1985) 33:103-119). Zum Aufbauen dieses Plasmids wurde ein hauptsächlich C. tropicalis-DNA enthaltendes 6,2 Kb-EcoR1-Fragment aus pCU1 in die EcoR1-Stelle von pUC19 unter Erzeugen des Plasmids pCU2 inseriert. Ein Ende des subklonierten Fragments enthielt 377 Basenpaare YEp13 und das andere endete an der ungefähr 50 Basenpaare vom rechten BamHI-Sau3AI-Anschluß gelegenen EcoR1-Stelle. Zum Aufbauen von pCU2dSacI wurde das 2,8 Kb-EcoR1/SacI-Restriktionsfragment aus pCU2 in die EcoR1/SacI-Stellen in den Polylinkersequenzen von puC19 subkloniert

Beispiel 22

Aufbau des Plasmids pKD1dBamH1

Das C. tropicalis-POX5-Gen wurde zuerst durch Standardverfahren (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982) auf ein 3,9 Kb-EcoR1-Restriktionsfragment aus dem Plasmid pC50 (von Prof. T. Kamiryo, Hiroshima Universität, Hiroshima, Japan, erhalten) in die einzige EcoR1-Stelle von pBR322 subkloniert, um das als pKD1 bezeichnete Plasmid zu erzeugen. Zum Erleichtern der in vitro-Zertrennung des subklonierten POX5-Gens wurde durch Insertionsaktivierung mit einem selektierbaren Markergen, wie etwa das C. tropicalis-URA3A-Gen, durch Subklonieren in die einzige POX5-BamH1-Stelle (Position #1178) eine im Tetracyclinresistenzgen von pBR322 gelegene, störende BamH1-Stelle durch teilweise Verdauung von pKD1 mit BamH1-Restriktionsendonuklease zerstört, gefolgt vom Auffüllen der kohäsiven Enden mit DNA-Polymerase und intramolekularer Ligation der stumpfen Enden. Die ligierte DNA wurde zum Transformieren von E. coli HB101 zu Ampicillinresistenz verwendet und eine Analyse des Plasmids aus 5 ampicillinresistenten, tetracyclinempfindlichen Transformanten zeigte, daß zwei von ihnen den erwarteten Aufbau enthielten. Die BamH1-Verdauung des pKD1dBamH1 bezeichneten Plasmids liefert ein einziges lineares Restriktionsfragment, das zum Subklonieren des C. tropicalis-URA3A-Gens in die einzige POX5-BamH1-Stelle geeignet ist.

Beispiel 23

Aufbau des Plasmids pKD3dBamH1

Das C. tropicalis-POX4-Gen wurde zuerst durch Standardverfahren (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982) auf ein 6,6 Kb-HindIII-Restriktionsfragment aus dem Plasmid pC1 (von Prof. T. Kamiryo, Hiroshima Universität, Hiroshima, Japan, erhalten) in die einzige HindIII-Stelle von pBR322 subkloniert, um das als pKD3 bezeichnete Plasmid zu erzeugen. Zum Erleichtern der in vitro-Zertrennung des subklonierten POX4-Gens wurde durch Insertionsaktivierung mit einem selektierbaren Markergen, wie etwa das C. tropicalis-URA3A-Gen, durch Subklonieren in die einzige POX4-BamH1-Stelle (Position #2101) eine im Tetracyclinresistenzgen von pBR322 gelegene, störende BamH1-Stelle durch teilweise Verdauung von pKD3 mit BamH1-Restriktionsendonuklease zerstört, gefolgt vom Auffüllen der kohäsiven Enden mit DNA-Polymerase (Klenow) und intramolekularer Ligation der stumpfen Enden. Die ligierte DNA wurde zum Transformieren von E. coli HB101 zu Ampicillinresistenz verwendet und eine Analyse des Plasmids aus ampicillinresistenten, tetracyclinempfindlichen Transformanten ergab, den erwarteten Aufbau. Die BamH1-Verdauung des pKD3dBamH1 bezeichneten Plasmids liefert ein einziges lineares Restriktionsfragment, das zum Subklonieren des C. tropicalis-URA3A-Gens in die einzige POX4- Gen geeignet ist.

HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN

Lebende Kulturen des Stamms SU-2 (ATCC 20913), Plasmid pCU1 (ATCC 67867) enthaltende E. coli (HB101) und der Stamm H5343 (ATCC 20962) sind bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, unter dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für Zwecke des Patentverfahrens hinterlegt worden.

Claims

1. Verfahren zur ortsspezifischen Modifizierung des Candida tropicalis-Genoms, umfassend das Transformieren einer C. tropicalis-Wirtszelle mit einem linearen DNA-Fragment, bestehend aus einem selektierbaren Marker-Gen, welches auf beiden Seiten durch DNA-Sequenzen flankiert wird, die Homologie zu dem Ziel-Gen oder Homologie zu den das Ziel- Gen flankierenden DNA-Sequenzen haben, wobei der Ursprung des selektierbaren Marker-Gens und der das selektierbare Marker-Gen flankierenden DNA-Sequenzen genomische Candida tropicalis-DNA ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das selektierbare Marker- Gen ein URA3A-, URA3B-, HIS4-, POX4A-, POX4B- oder POX5- Gen, vorzugsweise ein URA3A oder URA3B-Gen ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das lineare DNA-Fragment aus einem URA3A-Gen, das an einem ersten Ende von einer 1,2 Kb 5'POX5-Sequenz und an einem zweiten Ende durch eine 2,7 Kb 3'POX5-Sequenz flankiert ist, und aus einem URA3A- Gen, das an einem ersten Ende von einer 2,1 Kb 5'POX4- Sequenz und an einem zweiten Ende durch eine 4,5 Kb 3'POX4-Squenz flankiert ist, ausgewählt ist.

4. Verfahren zur Wiederherstellung eines auxotrophen Phänotyps von C. tropicalis-Zellen, die zuvor mit einem selektierbaren Marker zu Prototrophie transformiert wurden, umfassend die Schritte

(a) des Selektierens oder Durchmusterns auf spontane Mutationen, die den selektierbaren Marker inaktivieren, um die aus dem zuvor transformierten Stamm stammenden auxotrophen Mutanten zu identifizieren und zu isolieren,

(b) des Bestätigens des auxotrophen Phänotyps der Mutanten,

(c) des Bestätigens des parentalen Genotyps der Mutanten durch Southern-Hybridisierung mit geeigneten Gen- Sonden,

wobei der Ursprung des selektierbaren Markers genomische Candida tropicalis-DNA ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die Mutanten auxotroph in Uracil oder auxotroph in Histidin sind.

6. Verfahren zur Wiederherstellung eines auxotrophen Phänotyps von C. tropicalis-Zellen, die zuvor mit einem selektierbaren Marker zu Prototrophie transformiert wurden, umfassend die Schritte

(a) des Transformierens prototropher Wirtszellen mit einem nicht-funktionellen selektierbaren Marker-Gen, das durch eine in-vitro-Zerstörung der zentralen Codierungs-Sequenz des Gens nicht-funktionell gemacht worden ist, um auxotrophe Mutanten zu erzeugen,

(b) des Bestätigens des auxotrophen Phänotyps der Mutanten,

(c) des Bestätigens des Stamm-Genotyps der Mutanten, wobei der Ursprung des selektierbaren Markers genomische Candida tropicalis-DNA ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die prototrophen Zellen nach einer Transformation eines ura3-Auxotrophs von C. tropicalis mit einem URA3A- oder URA3B-selektierbaren Marker-Gen erhalten werden und worin das nicht-funktionelle selektierbare Marker-Gen von den C. tropicalis- Genen URA3A oder URA3B abgeleitet ist.

8. Verfahren zur vollständigen Blockierung des Weges der β-Oxidation in C. tropicalis in dessen erster festgelegter Reaktion, die das konsekutive Zertrennen der POX4A-, POX4B- und beider POX5-Gene eines C. tropicalis-Wirtsstammes umfaßt, wobei jeder Cyclus die Schritte

(a) des Transformierens einer C. tropicalis Wirtszelle auf Autotrophie mit einem selektierbaren Marker-Gen und

(b) des Wiederherstellens des auxotrophen Phänotyps der zuvor auf Prototrophie transformierten Zellen durch Durchmustern auf spontane Mutationen oder durch Transformieren mit einem nicht-funktionellen selektierbaren Marker-Gen

umfaßt.

9. Verfahren zur Erzeugung einer im wesentlichen reinen α,ω-Dicarbonsäure in im wesentlichen quantitativer Ausbeute, umfassend das Kultivieren von C. tropicalis Stamm ATCC 20962 in einem eine Stickstoff-Quelle, ein organisches Substrat und ein Cosubstrat enthaltenden Kulturmedium.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin der Anfangs-pH des Kulturmediums 6,5 ist und nach Erreichen der maximalen Zelldichte bei 8,3 bis 8,8 gehalten wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9, worin die Konzentration des Substrats in dem Kulturmedium 10 bis 20 g/l beträgt und das Substrat aus

einem Alkan mit 4 bis 22 Kohlenstoff-Atomen;

einem Ester, worin der Acyl-Teil des Esters 4 bis 22 Kohlenstoff-Atome hat; und

einer Carbonsäure mit 4 bis 22 Kohlenstoff-Atomen ausgewählt ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin das Alkan Dodecan, Tridecan oder Tetradecan, vorzugsweise Dodecan, ist.

13. Verfahren nach Anspruch 11, worin der Ester ein Methyl- oder Ethylester einer Fettsäure, worin der Acyl-Teil des Esters 12 bis 18 Kohlenstoff-Atome hat, und vorzugsweise Methylmyristat, Methylpalmitat, Methylpalmitoleat oder Methyloleat ist.

14. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Fettsäure 12 bis 18 Kohlenstoff-Atome hat und vorzugsweise Ölsäure ist.

15. Verfahren nach Anspruch 9, worin das Cosubstrat mit einer Rate von 1,5 bis 1,75 g/h pro Liter des alkalischen Mediums zugesetzt wird.

16. Candida tropicalis-Zelle, worin eines oder mehrere chromosomale Gene, ausgewählt aus dem POX4A-Gen; dem POX4B-Gen; einem der POX5-Gene; dem POX4A-Gen und einem der POX5- Gene; dem POX4A-Gen und dem POX4B-Gen; beiden POX5-Genen und dem POX4A-Gen; beiden POX5-Genen und dem POX4B-Gen; beiden POX5-Genen und dem pCX4A-Gen und dem POX4E-Gen; und einem der POX5-Gene und dem POX4A- und POX4B-Gen; in der C. tropicalis-Zelle durch einen selektierbaren URA3A-, URA3B- oder HIS4-Marker zertrennt ist (sind).