JPS61502939A - 選択圧なしで完全培地において培養することができる、発現ベクタ−により形質転換された菌株、特に酵母、の製造法並びにこのようにして得た菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［相］　活性ＯＭＰ脱カルボキシル酵素を合成できず、活性ＬＪＭＰピロホスホ リラーゼを合成できず、活性ＯＭＰ脱カルボキシル酵素をコードする遺伝子をざ らに担持した特定蛋白発現プラスミドにより形質転換されている、 ことを特徴とするサツカロミセス株。

［株］　特定蛋白がカテコールオキシゲナーゼである請求の範囲第２３項に記載 の菌株。

■　特定蛋白がα１−アンチトリプシンである請求の範囲第２３項記載の菌株。

［相］　特定蛋白がヒルジンでおる請求の範囲第２３項に記載の菌株。

■　請求の範囲第２０〜２６項のいずれかに記載の細胞株を完全培地で培養し、 得られた蛋白を回収することを特徴とする特定蛋白の製造法。

明　細　書 選択圧なしで完全培地において培養することができる、発現ベクターにより形質 転換された菌株、特に酵母、の製造法並びにこのようにして得た菌株 本発明はバイオテクノロジー分野、特に商品価値を有する遺伝子発現用宿主とし ての細胞、特にサツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　 ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）のような酵母の細胞の使用に関する。

ざらに詳しくは、本発明は、非形質転換細胞の発育に適するあらゆる種類の培地 で、ハイブリッドプラスミドを有するが、プラスミド損失乃至関連表現型損失の ない酵母株を培養維持する方法に関する。

サツカロミセス・セレビシアエのような酵母でクローン化された遺伝子（異種で おろうとなかろうと）の最大発現を得るため、該遺伝子につき最大のコピー数を 存在させる努力がなされている。その最も明らかな方法および実際一般に用いら れている方法は、該遺伝子を細胞において多数のコピーに存在するプラスミドに 統合することにより永続ざＵることである。しかしながら、これらハイブリッド プラスミドの世代から世代への伝達は、常【こ確実でおるとは限らず、該プラス ミドを含有する細胞だ［プを増殖させるために種々の選択方法が開発されている 。

これら選択方法のうち最も一般的であり、また培地へいかなる桑物または抗生物 質を添加する必要がないため最も安価である方法は、必る）立仏子の変異に帰因 する栄養要求性を有する菌株を宿主微生物とみなし、その欠損機能に備え１■る ｊ真信子をハイブリッドプラスミドに統合することで必る。

最小培地では、ハイブリッドプラスミド含有細胞のみが発育てき、一方、完全培 地では、プラスミド欠損細胞を含む全細胞が発育可能である。

この選択方法の欠点は、培地に栄養要求性を相補し得るいかなる分子を・も欠損 させねばならないため、該培地の選択に制限を受けることである。実際、最も広 く用いられている培地は合成実験培地でおり、該培地の価格はむ（）ろ高い。

本発明は、培地組成に関係なく、その生存がプラスミドの存在に完全に依存して いる、サツカロミセス・セレビシアエのような酵母株の’ｌＪ造方法に関する。

本発明によれば、強化培地で細胞を発育させることができ、このこと（よ多数の 利点を有する：短い世代時間（約２５％里い発育）、長い指数増殖期、大きな細 胞総量（乾燥重量として）、等。

一方、本発明によれば、実験苗において用いられる培地以外の必らゆる培地、特 に、より安１１１１ｉな発酵前液、：糖蜜等のような工業的に使用される各種の 培地を用いることができる。

工業的に価値のある物質を産生可能なものとするために、菌株を種々の、最小の 費用の、限定のない培地で培養できるように修飾することが可能である。

このため、本発明は、選択圧なしに完全培地で培養し得る、特定蛋白をコードす る遺伝子のクローニングまたは発現用ベクターにより形質転換された菌株の製造 法であって、（ａ）　それが存在しないことは株にとって致命的であり、少なく とも２つの代謝経路により合成される代謝産物が確認され、 （ｂ）　上記代謝経路の最初の経路が該経路に関！ゴする遺伝子の少なくとも１ つを改質させることにより遮断され、（Ｃ）　菌株がさらに改質した遺伝子の機 能的対立遺伝子を含有するベクタ・−により形質転換され、（ｄ＞　他方の代謝 経路が遮断される、ことを特徴とする前記方法に係わる。

本明細書の記載は本質的には酵母株について行われているが、他の菌株、特に細 菌株を使用することもできる。

Ｓ、セレビシアエ（３，ＣｅｒｅＶｉＳｉａｅ）のような酵母は、ウリジン５′ −モノフォスフェート（ＵＭＰ）の合成に導く２つの代謝経路を有している。そ の第１は所謂デ　ノボ（ｄｅ　ｎｏｖａ　）経路であり、リン酸カルバミルの合 成から始まり、中間体がウレイドコハク酸、ジヒドロオロチン酸、オロチン酸お よびオロチジン５′−モノフォスフェート（０Ｍ丁）の順である５段階変換によ りＵＭＰに導かれる（ｌａｃｒｏｕｔｅ、　１９６８；Ｊｕｎｄ　ａｎｄ　１− ａｃｒｏｕｔｅ。

１９７２＞。

この代謝経路の最終段階であるＯＭＰがらＵＭＰへの脱カルボキシル化は、対応 する遺伝子がＳ、セレビシアエではＵＲＡ３として知られているＯＭＰ脱カルボ キシル酵素により触媒される。このＯＭＰ脱カルボキシル酵素の活性を欠＜ｕｒ ａ３−株は、デ　〃経路によってはもはやＵＰＭを合成することができず、第２ 代謝経路によってＵＭＰに変換される外因性のピリミジン源、ウラシルまたはシ トシン、を必要とする。

培地中に存在するウラシルおよび／またはシトシンは、２つの分子各々に特異的 なベルミアーゼによって細胞内に入ることができる。いったん細胞内に入ると、 シトシンは直接ウラシルに変換され、ウラシルはＵＰＭピロホスホリラーゼ（ウ ラシル　ホスホリボシルトランスフェラーゼとしても知られている）によってＵ ＭＰに転換される（　Ｌｕｎｄおよび１−ａｃｒｏｕｔｅ　、　１９７０）。

ＯＭＰまたはウラシルを経ることなくＵＭＰに導くその他の重要な代謝経路はな い。従って、酵素細胞は、前記または図表１に要約した２つの経路の少なくとも １つが機能してはじめて生存することができる゛。

この場合の方法の原則は次の通りで必る：活性ＯＭＰ脱カルボキシル酵素の合成 に関与する遺伝子、即ち一般にはＵＲＡａｍ伝子、を信子することにより、第１ 代謝経路を遮断し、菌株を活性ＯＭＰ脱カルボキシル酵素をコードする遺伝子、 即ち一般にはＵ　ＲＡ　ａ　Ｍ信子、を含有するプラスミドベクターで形質転換 する。

簡単に言えば、ｕｒａ３変異株を適当なプラスミドで形質転換し、ｕｒａ＋形質 転換体を選択する。

図表１　：　酵ｆｌｎｓ、セレビシアエにあけるウリジン５′−モノフォスフェ ート生合成の２つの経路 オロチジン　５′−モノフォスフェート　ｐａｔｈＷａｙ）シトシンーー→　ウ ラシル　ｐａｔｈｖａｙ）続いて、活性ＵＭＰピロホスホリラーゼの合成に関与 する遺伝子、即ちＦＵＲｌ座に位置すΦ遺伝子を改変する。

Ｓ、セレビシアエにおけるＵＭＰピロホスホリラーゼをコードする遺伝子は、Ｆ ＵＲｌとして知られており（Ｊ　ｕｎｄおよび１−ａｃｒｏｕｔｅ　、　１９７ ０）　、これは複金属でおり、そこでのめる種の変異により細胞は、ピリミジン 塩基の、または対応するヌクレオシドおよびヌクレオチドの、轟らゆるフッ素化 アナローブに耐性となる。最も著しい耐性効果は、ＵＭＰピロホスホリラーゼ活 性の欠如によるものであり、対応する表現型は劣性でおる。

ＦＵＲ１３ｉ伝子の改変はｆｕｒｌとして特徴付けられる変異株と交雑させるこ とにより、または以下に示す実施例のいずれかに記載の適当な培地での突然変異 並びに変異株の選択により行なうことができる。

本発明方法は、ベクタープラスミドによりコードされるあらゆる蛋白の製造また はクローニングに、一般に有用であることは明らかでおる。発現の場合、プラス ミドは、ざらに遺伝子の発現に必要な諸要素、特に酵母ＰＧＫ　（ホスホグリセ ラード　キナーゼ）プロモーターのような酵母プロモーター、および、場合によ っては、例えばＰＧＫターミネータ−といったターミネータ−を含有することが できる。

発現プラスミドは、また、前記したように、大腸菌（イー、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ ）のような細菌において構築を生じさせ得る他の要素：即ち複製開始点、選択の ための耐性遺伝子を含有していてもよい。

例えば、シュードモナス・プユチダ（ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａｅ 　）のｘｙｌ　Ｅｍ伝信子発現することができ、明らかに必らゆる遺伝子を発現 することができる。

ざらに、ヒトα１−アンチトリプシンをコードする遺伝子を発現することもでき る。

実施例１ニブラスミドの存在によりｕｒａ＋となったｕｒａ３酵母株のゲノムへ のｆｌＪｒ１変異の導この実施例においては、プラスミドｐＴＧ８０７を用いて 、ｕｒａ３株のＯＭＰ脱カルボキシル酵素活性欠損を補った。プラスミドｐＴＧ ８０７は、ｌ−１ｉｒｌｄＩ［部位に、ＵＲＡ３遺伝子（野生型対立遺伝子、Ｂ ａＣｈ等、１９７９年）を含有するＳ、セレビシアエ染色体ＤＮＡの断片（１， １キロ塩基対）を含有するｐＢＲ３２２由来のプラスミドである。Ｕ　ＲＡ　３ ５Ｗ伝子の末端（３′側）の約８０塩基対下流に、即ち、クローン化された断片 の一端から約１００塩基対と同等の位置に、単一３ｍａＩ部位が存在している。

この部位はＢ型酵母の２ミクロン（２μ）プラスミドの複製開始点の片側のＡＶ ａ■およびｌ−１ｉｎｄ１部位により限られた約１キロ塩基対ＤＮＡ断片をクロ ーンするのに有用でおッた（［３ｒｏａｃｈ　、　１９８１　）　、該ＡＶａＩ Ｉ−＠　ｉ　ｎｄｌＩＩ断片は、ｐＦＬニブラスミドＤＮＡの二重消化（Ｃｈｅ ｖａｌ　ｌ　ｉｅｒ等、１９７９）、アガロースゲル電気泳動による異なる種々 の断片の分離およびギルビッツ（Ｇ　１ｒｖｉｔＺ）らにより記載された方法（ １９８０）により探究された目的断片の溶出により得られた。次にこの断片をｄ 　’Ｎ　Ｔ　Ｐ　ｓの存在下に、大腸菌クレノーＤＮＡポリメラーゼ１、続いて ＡＴＰおよび必らかじめＳｍａ■部位で線状化されたｐＴＧ８０２ＤＮＡの存在 下にファージＴ４ＤＮＡリガーゼで処理した。このようにして、１）ＴＧ８０２ の３ｍａＩ部位での２μのＡＶａＩＩ−Ｈｉ　ｎｄｌ断片の統合に由来し、該断 片の定位においてのみ互いに異なる２種類の新しいプラスミド（ｐＴＧ８０６お よびＩ）ＴＧ８０７）を得ることができた。

従って、プラスミド１ｍ）ＴＧ８０７　（図表２）はニー大腸菌において豊能す る原核性複製開始点、図表２−プラスミドｐ　ＴＧ８０７の構造口：＝コ３．． セレビシアエ染色体ＤＮＡ配列−ｐ　ＢＲ３２２ＤＮＡ配列 −−−−−２μプラスミドＤＮＡ配列 ←■■二　大腸菌内での機能的複製開始点（ｏｒｉＥ）を含む領域１に１） ←−−−−　スケール（大きざ） −８，セレビシアエにおいて機能する真核性複製開始点、−大腸菌での選択およ び旦、セレビシアエ形質転換体の検出を可能ならしめるアンピシリン耐性遺伝子 （ＡＰ”　＞（Ｃｈｅｖａｌ　ｌ　ｉｅｒとＡｉｎｇｌｅの試験、１９７９）、 −〇ＭＰ脱カルボキシル酵素をコードし、Ｓ、セレビシア工（ｕｒａ３変異株） なしでも大腸菌（ｐｙｒＥ変異株）においてもプラスミド選択を可能ならしめる ＵＲＡ３遺伝子（Ｂａｃｈ等、１９７９） シテ（Ｂｒｏａｃｈ　、　’ｌ　９８３　）プラスミドＩ）ＴＧ８０７にクロー ン化されたという事実は、分裂して、ハイブリッドプラスミドをもはや含まない であろう（有糸分裂分離）・細胞を生じる酵母細胞中のこのプラスミドの存在を 極めて不安定にする。選択培地における液体培養においてはプラスミドを含有し −従って固体選択培地上に広げた後コロニーを形成することができる一細胞と、 もはやプラスミドを含有せず一固体選択培地でコロニーを形成し得ない一細胞と の間に、平衡状態が認められる。極めて頻繁な欠損、およびプラスミドを欠失し たばかりの細胞は限られた回数分裂する能力を保持しているという事実が、この 平衡状態の原因であり、選択培地における指数増殖期での培養においてさえ、該 プラスミド欠失した細胞に有利なままである（この場合約６０％）。２μの複製 開始点および２μのＲＥＰ３遺伝子座を共に有する他のハイブリッドプラスミド の場合、この比率は５％以下（ｐＪＤＢ２０７の場合−ＢｅｇｇＳ。

１９８１）〜２５％以上と様々である。この実施例においては、プラスミドの分 裂分離と関連した高い表現不安定性の極端な例を、研究を容易にするのに選んだ 。他の実施例では、分離がさほど重要でない例（プラスミドが工業的価値を有す る異種遺伝子を発現するのに有用なより好ましい例）が示されている。

ｂ）　形質転換株のプラスミド表現型に対するｆｌＪｒＩ変異の影響に関する研 究 Ｓ、セレビシアエＬＪ　ｒａ−ＴＧＹ　１０−１の実験株（Ｍａｔａ　ｕｒａ３ −２５１−２７３−３２８＞を利用できる。ｕｒａ３−遺伝子型の他の株はいず れも使用できる。この株をヒンネン（Ｈｉｎｎｅｎ）等に記載の方法（１９７８ ）に従い、ｐＴＧ８０７ＤＮＡで形質転換することによりｕｒａ＋とした。形質 転換した株ＴＧＹ１０−１／ｐＴＧ８０７を同遺信子型株ＦＥ２５−３　（Ｍａ ｔａｆｕｒ１−８＞と交雑し、二倍体ＴＧＹ７を形成させる（Ｍｏｒｔｉｍｅｒ およびｌ−１ａｗｔｈ１−１ａ、　１９６６参照）。ＹＰＧ完全培地で８時間後 、カンプリング混合物を２４時間前胞子形成培地（０，１％グルコース、１．１ Ｍ酢酸カリウム、ディフコ（［）ｉｆｃ○＞０．２５％酵母エキス、硫酸アンモ ニウム５　’ｊ／Ｑ　、ディフコ２％寒天）で転移させ、次に４８時間胞子形成 培地（１％酢酸カリウム、２％ディフコ寒天）で転移させた。子嚢形成が十分で あると顕微鏡観察を優先的に殺すエーテルでカップリング混合物を処理した。

該エーテル処理は以下のように行なう：カップリング混合物の一白金耳量を水１ ｍＧに再懸濁させる。エーテル１ｍ１２添加後、この懸濁液を５分間激しく撹拌 し、これを半時間の間に２．３回行なう。純粋な水相ｏ、”ｌｍＩ２およびその つと１０倍希釈した０、１ｍｆ２を、完全培地（ＹＰＧ）の皿に置く。交雑体か ら分離する一倍体株をこのようにして選択する。

この様にして得た１７コロニーを集め、固体完全培地で培養し、チェバリー（Ｃ ｈｅｖａｌｌｉｅｒ　）およびエイグル（ＡｉＣｌｌＢ）の方法（１９７９）に より、これらのβ−ラクタマーゼ産生能を調べた。１７コロニー中、４コロニー のみがβ−ラクタマーゼを産生じた。

これら４つの産生株の性記号（ｓｅｘ　ｓｉｇｎ＞を検討し、これら株のうちの １つの記号ａを保存して、研究を続けた。

この株をＴＧＹ７−１１とする。ＴＧＹ７−１１細胞の６−アザウラシルおよび ５−フルオロウラシルのような種々のウラシルアナローブに対する耐性を分析す ることにより、ＴＧＹ７−１１／ｐＴＧ８０７株を、液体完全培地（ＹＰＧ）に て、次のようにして継代培養した：タ方、培地２５ｍＱに細胞１０’個／ｍＱを 接種し、培養物を一晩生育させて約１０７個／ｍＱを得（１０世代）、次にこの 培養物から再び同一接種を開始し、この操作を続けて２回行ない、完全培地で３ ０〜４０細胞世代を得た。続いて細胞を希釈し、完全培地の皿に置き、−ｔｍ当 たり約２００の分離コロニーを得た。

プラスミドの欠損を約３０コロニーについて、チェバリー　（Ｃｈｅｖａｌｌｉ ｅｌ’　）およびエイグル（Ａｉｇｌｅ）の方法（１９７９）により、対照を用 いて検討した。実験は同一条件下で培養したＴＧＹｌｏ−１／ｐＴＧ８０７親株 と平行して行なった。

約３０コロニーを、でんぷん含有培地（ディフコ酵母窒素塩基６．５ＣＪ／Ｑ　 ；グルコース１ｇ／Ｑ：可溶性でんぷん２Ｃ１／９；ウラシル３０ｍｃ＋／Ｑ： 、寒天２０Ｑ／Ｑ、０．０２Ｍリン酸緩衝液でｐＨ６に緩衝）を含むぺ１・り皿 上で、少量の沈澱で二次培養した。３０’Ｃで２４時間培養後、同培地に層を注 ぎこんで過融合させ（４４°Ｃ１寒天１０Ｑ／Ｑ　）　、これに試薬３ｍ！ｊ／ ｍＱ　Ｉ　２　：　１５０ｍ９／ｒｒＥＩＩ　Ｋ　：　３ｍ３／ｍＱアンビシ１ ノン＞１．５ｎ＋Ｑを加えた。皿を一晩冷蔵庫内で、次いで暗所で空温で培養し た。産生株の回りに脱色量が出現する。プレート４α（第４図）にＤＴＧ８０７ により形質転換されたＴＧＹ−１０−１株由来のコロニーの培養物を示す。上の 第１列は２つの対照に関するものである；左側の陰性のものは非形質転換ＴＧＹ １０−１コロニーであり、右側の陽性のもう１つの対照は選択培地に維持された ＴＧＹＩＯ−１／ｐＴＧ８０７を示す。同様にプレート４βに、ＤＴＧ８０７に より形質転換されたＴＧＹ７−１１株（ｕｒａ　３．　ｆｕ　ｒ　１　）由来ノ コロニーノ培養物を示す。４αと同様にして、２つの対照は上の第１列に行なわ れている。

このように培養されたＴＧＹ７−１１株のこれらコロニーは、すべてプラスミド ｐＴＧ８０７を有しており、一方ＴＧＹ１０−１はいずれもこのプラスミドを有 していない。

この２株ＴＧＹＩＯ−１およびＴＧＹ７−１１は同遺伝子型であるため、これら はＴＧＹ７−１１に依存するｆｕｒｌ−Ｂ変異だけが異なっている。従って、こ の変異の存在によりＴＧＹ７−１１はプラスミドなしでは完全培地に生存し得な くなると結論することができる。

第　１　表 ５−フルオロウラシルの毒性作用に対する耐性閾値は、ウラシル（３０μｃ＋／ ｍＱ）およびそのフッ素化アナローブの漸増量（１０−６Ｍ以上）を添加した最 小培地を含有するベトリ皿で測定した。上記最大濃度は細胞がもはや発育しない 最大濃度である。

本実施例ではニ 一完全培地において、ハイブリッドプラスミドにより形質転換されたｕｒａ３ｆ ｕｒ１ｓ、セレビシアエ株を該プラスミドＰＡ連表現型欠損の危険を冒すことな く培養することができる、 −これらの条件下で培養された株は、プラスミドにより担持された異種遺伝子を 発現させることができる、−１−ｕｒ１変異は異種遺伝子の発現レベルを妨げな い、ＯＭＰ脱カルボキシル酵素活性およびＵＭＰピロホスホリラーゼ活性の両者 を欠＜ｕｒａ３ｆｌＪｒ１ｓ、セレビシアエ株は、生育し得ない。従って、これ らを形質転換レセプターとして使用することきはできない。従って、まずプラス ミドを用いてｕｒａ３株をｕｒａ＋に形質転換し、次にこの株を実施例１に記載 の交雑必るいは選択（実施例３）によりｆｕｒｌとすることが必要でおる。これ らの可能性に、まず代る手段としては、ｕｒａ３変異対立遺伝子の場合は、同型 接合性で、ｔ’ｕｒ１の場合は、異型接合性である二倍体を形質転換することで ある。一旦、株がプラスミド形質転換によりｕｒａ十にされると、この株は胞子 形成させることができ、ｆＬｌｒｌ−培体分離体を選択することができるか、ま たは、ｆＵｒｌに同型接合性で必る（遺伝子変換により）二倍体株の誘導体を直 接選択することができ、この二倍体株を発現用宿主として使用することができる 。ｆｕｒに培体変換体を５−フルオロウラシルまたは６−アザウラシル含有培地 上で選択することは、これらの薬物の毒性に対するこれらの株の耐性が増大して いるために、非常に容易である。

Ｓ、ｔレビシアエＴＧＹ７−１１　（Ｍａｔａ　ｕｒａ３ｆｕｒ１−８／ｐＴＧ ８０７）−倍体株（その構築は前記実施例に記載）を、非反応−倍体株、即らＴ ＧＹｌｏｏ−１（Ｍａｔａ、ｈ　ｉ　ｓ３．ｌ　ｅｕ２’）の同遺信子型ｕｒａ ３誘導体と交雑させた。この交雑による二倍体接合体は、その遺伝子型が （ｕｒａ３ｈｉｓ３１ｅｕ２ｆｕｒ１／　）（ｕｒａ３　＋　＋　＋　）ＤＴＧ ８０’７であり、表現型は野生型であり、顕微鏡操作により分離された。この株 を完全培地で培養することにより、プラスミドｐＴＧ８０７を欠損し、従って、 ｕｒａ−となったコロニーを得るのは容易でおった。このようなコロニーを分離 し、ＴＧＹ８として知られる対応する株を形質転換レセプターとして保存した。

このＴＧＹＢ株はパスツール研究所微生物培養物国際奇託所（Ｃｏｌｌｅｃｔｉ ｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅＭｉｃｒｏｏｒｇａ ｎｉｓｍｅｓ　ｄｅ　ｌ’　）ｎｓｔｉｔｕｔ　ｐａｓｔｅｕｒ）に寄託されて おり、その寄託番号はｌ−３２７である。

ｂ）Ｓ、セレビシアエのｕｒａ３ｉ伝子およびシュードモナス・プユチダのＸＹ ＬＥ遺伝子を担持するハイブリッドプラスミドによるＴＧＹ８株の形質転換プラ スミドｐＴＧ８４３は、発現ベクターｐＴＧ８３３の誘導体でおり、その構築は フランス特許出願番号箱８３１０８２９２＠に詳細に説明されている。これを要 約すれば、Ｉ）ＴＧ８４３は、以下の構造を有する二１２配列はＤＢＲ３２２の それである。ＥＣＯＲ工部位の代りにＵＲＡ３ｍ伝子およ信子μプラスミドの複 製開始点を含有する断片が統合されており、その断片の構造はすてにｐＴＧ８０ ７に関して説明されている（実施例２）。

）−１ｉｎｄｌＩｌおよびＰｖｕＩＩ部位間のｐＢＲ３２２配列を、酵母ＰＧＫ 遺伝子のプロモーターとターミネータ−との間に挟まれたシュードモナスのＸＹ ＬＥ　（特許番号筒１６０１６／８３号および第８３１０８２９２＠）で置換す ると、ＰＧＫ遺伝子発現に通常用いられている信号の制御下に′＃母でのＸＹＬ Ｅ発現が起こる（フランス特許出願番号第８４１０２３５０号）。

プラスミドｐＴＧ８４３により形質転換された酵母は、カテコール２，３−オキ シゲナーゼを合成し、これはカテコール（無色生成物）を酸化して黄色生成物を 生じる。このプラスミドで形質転換した酵母のコロニーは、カテコールを吹きか けると黄色になる。

ＴＧＹＢ株を既述の方法（）（１ｎｎｅｎら、１９７８）によにあけるＸＹＬＥ ３犯伝子の発信 子ＧＹ８／ｐＴＧ８４３株を、ＴＧＹ７について実施例１に記載のようにして胞 子形成させた。−培体分離体を前）ホのようにエーテル処理により分離した。之 等の一倍体のうち、５種のｆｕｒｌ−８株を、５−フルオロウラシト（５ｘｌＯ −３Ｍ）の毒性に対する耐性に基づいて選択した。

丁ＧＹ８株は、２つの非同遺伝子型親株に由来するため、その子株は互いに全く 遺伝的に異なる一倍体株からなる。

事実、５つのｆｕｒ−１−Ｆ３分離体はすべてカテコールを吹き付けた後、黄色 を示すが、反応の強さや早さは株によって非常に異なり、このことはこれらの株 の遺伝的多様性を示している。

それぞれＴＧＹ８−２、ＴＧＹ８−３、ＴＧＹ８−７、ＧＹ８−９およびＴＧＹ ８−１０として知られているこれら５株を、ＴＧＹ７−１１について実施例１に 記載されているように、完全培地において３０世代以上にわたり培養した。平行 して、１）ＴＧ８４３により形質転換されたＴＧＹｌｓｐｌ　（ｕｒａ３−ｈｉ ｓ３）実験苗株を、同一条件で培養した。培養物を希釈し、−鼎当り約１００個 の分離コロニーを得るように完全培地にまいた。３日間発育させた後、細胞にカ テコールを吹きつ（づ、カザミノ酸加最−はすべてカテコールと反応して黄色に なり、最小培地子アミノ酸で発育し得ることが明らかとなった。

ＴＧＹｌＳｌ）１株の場合、呈色は観察できなかった；いずれのコロニーも最小 培地＋アミノ酸で発育し得なかった。

これらの結果は、実施例１に記載の結果、即ち、完全培地でさえ、ｆｕｒｌ−Ｂ 変異はプラスミド欠損細胞を逆選択させるという結果を確認している。５つのｕ ｒａ３８４３株を液体培地、即ち前者の５株の場合は完全培地、後者の株の場合 はヒスチジン加最小培地中において一晩培養した。指数増殖期に入った朝に細胞 を集め、粉砕し、カテコール２，３−オキシゲナーゼ含量を調べた。測定結果を 第２表に示す（試験１）。ＴＧＹｌＳり１にあけるカテコール２，３−オキシゲ ナーゼの比活性を１とすると、ＴＧＹ８の分離株の活性は６〜１９で必る。ＴＧ Ｙｌｓｐｌでの発現に対するこの過生産は、株間の遺伝的差異おるいは培養条件 の影響によって説明することができる。この第２の仮説を検討するため、完全培 地および最小培地で平行してＴＧＹ８−３株を培養して実験を繰返した。その結 果を第２表（試験２〉に示すが、カテコール２，３−オキシゲナーゼ活性は、細 胞を完全培地で培養した場合、約８倍はど明らかに浸れていることがわかる。

ＴＧＹ８−３ｐＴＧ８４３株は、パスツール研究所微生物培養物国際寄託所に寄 託されてあり、その寄託番号は■ｕｒａ３株からの突然ｆｕｒ１変異株の選択酵 母でクローン化された遺伝子の発現レベルに関与するパラメーターの１つは、レ セプター株のゲノムと考えられる。市る種の異種遺伝子を極めて高レベルで発現 し得るｕｒａ３株の選択に成功したと仮定して、この株と非同）真信子型ｆｕｒ ’１株を、二倍体又は子株での極めて良好な発現の特徴を失なう危険を冒して交 雑させることは不利でおる。一方、形質転換されたｕｒａ３株から直接に突然従 って、　ｆｕｒ１変異の該株での生理に対する特異的影響を研究することができ る利点がある。

本実施例においては、記）本の、今度はプラスミドｐＴＧ８５６で形質転換され た、ＴＹＧｌｓｐｌ　（Ｍａｔａｕｒａ３　ｈｉｓ３）株を選択した。ｐＴＧ８ ５６の構造は、フランス特許出願番号第８３／１５７１６号に記載されている。

このプラスミドは、ＵＲＡ３遺伝子配列；ハイブリッドプラスミドの分裂分離を 著しく減するＲＥＰ３座を有する２μプラスミドの複製開始点〔ジャラン（Ｊ　 ａｙａｒａｎ）ら、１９８３；キクチ（Ｋ　１ｋｕｃｈｉ　）、１９８３；後者 はこの遺伝子座をＳＴＢと命名している〕；酵母ＰＧＫ遺伝子のプロモーターの 上流およびターミネータ−の下流にある狂犬病糖蛋白遺伝子のコード配列；およ び複製開始点およびアンピシリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２配列を含んでい る。

丁ＧＹ１　Ｓｐｌ　ｐＴＧ８５６株は、ヒスチジン添加最小培地で培養しなけれ ばならないが、細胞が狂犬病糖蛋白産生能を失う傾向を示す完全培地で培養して はならない。株が強化培地で培養され得るように、６−アザウラシル、５−フオ ロウラシル、５−フルオロシトシン等のようなピリミジン塩基アナローブの毒性 作用に対する耐性に基づいてｆｕｒ１変異株を選択することができる。

ＴＧＹｌ　ｓｐｌ　ｐＴＧ８５６株の約１０７個を、５　ｍＭ５−フルオロウラ シル添加完全培地に置いた。３０″Ｃで８日間培養した後、１２個の過コロニー （５ｕｐｅｒ−ｃｏｌｏｎｉｅｓ）を、１ｍＭ５−フルオロウラシル添加完全培 地で二次培養し、サブクローニングを行なった。サブクローニング後、この１２ 株を完全培地（１＋ｎＱ）で培養し、指数増殖期の終わりに集め、完全培地＜１ ｍｆ２）に１０００倍希釈して一晩培養した。翌日、細胞を希釈し、各株の１０ ０〜２００の分離コロニーを得るために完全培地の皿に置いた。これと平行して 、同じ培養を、もとのＴＧＹ　１　！Ｓ　ｏ　１　／ｐＴＧ８５６株について行 なった。ヒスチジン添加最小培地での発育能を保持していたコロニーの割合を、 それらをビロード上で発育させて検討した。この割合はＴＧ−Ｙ１Ｓｐ１ｐＴＧ ８５６および５−Ｆｕ耐性の８種の誘導体の場合にには１００％である。このよ うに、プラスミドの存在と関連した表現型を欠失することなく完全培地で発育す ることができた１２株中の４株を得た。これら４株は対立遺伝子相補性検定によ り、ｆＬＪｒ’ｌ型変異を有し、一方他の８株は旦肛１とは別の座又は他の座に １つ以上の変異を有することが確認できた。

本実施例は、プラスミドにより形質転換されたｕｒａ３株からｆｕｒ’ｌ変異株 を容易に得ることができ、このような変異体は強化培地での培養に使用すること ができることを示している。

第　２　表 種々のＵ母株におけるカテコールオキシゲナーゼの測定（）中の数字は、ヒスチ ジン添加最小培地において培養した王１１株に対する過生成の比率を示す。

実施例４：酵母でのヒトα１−抗トリプシンを効果的に発現させるプラスミドの 構築 α１−抗１−リプシン（α＋　−ＡＴ＞遺伝子を含有するＤＮＡ断片を、大腸菌 エキスでの該蛋白の製造に使用されるプラスミドから分離した（フランス特許第 ２５３９７５８号および２５９４０８２号、および特許ＰＣ”’ｒ／ＦＲ８４１ ０００１４号）。プラスミドρＴＧ９２９は、上記特許に記載されてい′る。こ のプラスミドＤＮＡをＰＳｔ工で消化し、４　ｄＮＴＰｓの存在下にクレノー　 （Ｋ　Ｉｅｎｏｗ　）エキソヌクレアーゼを作用させ、最後に８（１１ＩＩで消 化した。次にα＋　−ＡＴｍ伝子合金有する断片を分離し、プラスミドｐＴＧ８ ３４のＢｇｌＩＩおよびＥ　ＣＯＲ■部位（クレノー酵素で処理）間に挿入した （第１図）。

その構築および性質はフランス特許第８４１０７１２５号に詳細に記載されてい る。得られたプラスミド（０丁０９６４）を大腸菌から分離してその配列を確認 し、次いでＢｇｌＩＩおよびｐｓｔ工で消化した。

α＋ＡＴ遺伝子を含有する断片を、第２図に示すように、ＢＯＩＩＩ−Ｐｓｔ工 断片の置換により別の酵母発現ベクターｐＴＧ８４９に転移させた。ｐＴＧ８４ ９の構築および構造の詳細は、フランス特許第２５５２７７６号に記載されてい る。得られたプラスミドは、ｐＴＧ９６８として知ｐＴＧ９６８ＤＮＡを用いて 上記酵母株ＴＧＹ８を、形質転換してウラシル非要求性とし、形質転換株ＴＧＹ ８１）ＴＧ９６８を胞子形成させ、ｆｔＪｒ１胞子を前述のように５−ＦｔＪの 毒性作用に対する耐性に基づいて選択した。

これらｆｕ　ｒ１胞子の１つに由来する、ＴＧＹ８Ｓｐ３３として知られている 一培体株を以下の研究に用いた。

ＴＧＹ８ｓｐ３３の遺伝子型は： Ｍａｔα／Ｍａｔａ　、　ｕ　ｒａ３−２５１−３７３−３２８／ｕｒａ３−８ ５２．ｆｕｒｌ−８／＋、１ｅｕ２−半連続的（フィードバッチ）培養を、２Ｑ 容ファーメンタ−（バイオラフイー（Ｂｉｏｌａｆｉｔｔｅ　）社）で行なった 。

酵母はＴＧＹ８ｓｐ３３株のＹＰＧ培地中１２時間培醤物（５００ｍＱ　）から なる。培養物５００　ｍＱをファーメンタ−に入れる。濃縮培地溶液〔ビー１へ 糖蜜、１００ｇ／Ｑ；（ＮＨ４）２３０４．２ｇ／Ｑ；ＫＨ２ＰＯａ　、２ｇ／ Ｑ：Ｍ（１３０４・７Ｈ２０，０，６（１／Ｑ　）をファーメンタ−に加え、炭 素含有基質の濃度を低レベル（２００ｍＭ９）に保つ。温度を３０’Ｃに保ら、 ｐＨはアンモニア溶液２０（Ｊ／Ｑを用いてｐＨ５に調整する。通気は培養期間 中、１ＶＶＭ〜３ＶＶＭに変化させる。溶存酸素張力を撹拌速度を代えて２３° Ｃで維持する。

培養中、エタノールを酵素法（ベーリンガーキット）により測定する。グルコー スおよび蔗糖濃度を「Ｔ　ａｃｃｕｓｅｌＰＲＧ−ＧＧＬ［Ｃｊ装置を用いて測 定する。酵母の発育を、次いで６００ｎｍで吸光度を測定（フィリップスＰＹＥ ＵＮＩＣＡＭ　ＰＵ　８６１０分光光度計）し、また乾燥重量を測定することに よりめる。

α＋ＡＴ濃度を測定するため、培養物１０ｍＱを５０ｏ　ｏ　ｒｐｍで５分間遠 心分離（ＪＯＵＡＮ遠心分離機）し、ペレットを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７ ＞１０ｍＱで１回洗う。酵母を適当量の緩衝液（０，４ｍＱ）中に取り出し、ガ ラスピーズ（直径０．４５１１１ｍ＞を用いて１分／サイクルの４回でこわす。

抽出物を１１０００Ｏｒｐで１０分間遠心分離（シグマ２　Ｍ　Ｋ遠心分離機〉 し、上澄みを蛋白あよびα＋−ＡＴｉの測定に利用する。α＋　ＡＴ濃度は、放 射免疫拡散法（ＬＣＰａｒｔｉｇｅｎ−３ｅｈｒｉｎｇ）により測定する。蛋白 濃度はブラッドフォード（３ｒａｄ４ｏｒｄ　）の方法（１９７６）（バイオ− ラドキット）により測定する。

原栄養細胞の割合は、培養物の数種の希釈物を強化培地量培養した後、酵母細胞 をＹＮＢＧ培地＋カザミノ酸（０，５％）含有ペトリ皿で生育させる。

強化培地において発育し、最小培地では発育できない細胞は、ウラシル要求性と なる。

プラスミド（α＋ＡＴ遺伝子）により形質転換されたＵ　ｒ　ａ　３　ｆ　ＩＪ 　ｒ　１株を、ファーメンタ−において培養することにより、 一α＋　ＡＴ生産は該株の発育と関連している（第３図）、−プラスミドは安定 でおる〔第３表：２０世代培養後プラスミド欠損は認められず、ｕ　ｒａ３株（ ＴＧＹ１ｓｐ４）の場合はそうでない〕、 ことが明らかでおる。

子世代でのｆ’ｕｒ＋復帰株の出現を検定するため、種々の二次培養を完全培地 で行なった：即ち、ＹＰＧ培地（１００ｍＱ）を含有するエーレンマイヤーフラ スコに、細胞１０６個を接種し、１０Ｂ個／ｍｆ２になるまで（１２世代）撹拌 する。次いで細胞を新しい培養物１００ｍＱ中に１０’個／ｍＱに希釈する；こ の操作を１１０世代まで繰返す。次に、この細胞を７×１０３個／ｍＱに希釈し 、この希釈液（１００μＱ）の７整除数をペトリ皿にまく。

約５０００コロニーを得、そのすべては最小培地で発育し、５−フルオロウラシ ル（５ｍＭ）に耐性でめった。

また、−ザンブルをα＋ＡＴの測定に用いた。発現レベルの変化は認められなか った（総蛋白の１％）。

これらの結果から、１１０囲代培養後、１．Ｊｒａ３ｆｕｒ１株は、いかなる重 大な再配列もきたさないことが明らかで必る。

記載の実験は、ｕｒａ３ｆｕｒ１１母株が、複合培地、特に酵母生産に使用され る培地での異種蛋白の生産に使用できることを示している。

実施例８：ＵＲＡ３＋遺伝子およびプレプロヒルジンをコードする遺伝子を担持 するプラスミドによるし１ｒａ３酵母株の形質転換 プラスミド１）ＴＧｌ　８１８の説明 フランス特許第８５／○６６７２号に記載のプラスミド１）ＴＧ１８１８は、酵 母でのヒルジンの発現およびその培養培地への分泌をもたらすように設計された Ｅ、コリーＳ。

セレビシアエ（Ｅ、ｃｏｌｉ−３，ｃｅｒｅｖｉｓｉｅ　）シャトルベクターで おる。

このプラスミドは、大腸菌において複製され得、且つアンピシリンを用いる選択 により、維持され得る大腸菌プラスミドＤＢＲ３２２配列を含んでいる。

ざらに、プラスミドｐＴＧ１８１８は、主要ａｒｓおよびそれと結合しているＳ ＴＢ　（またはＲＦＰ３＞座を含有するｎＬａ（Ｂ形）の２μプラスミド断片を 有している。

このプラスミドは、また酵母のＵＲＡ３”ｉｕ伝信子含んでいる。従って、ｐＴ Ｇ１８．１８はＩＪ　ｒ　ａ　３−　ａｌｌイＴ醇母内で維持することができ、 その選択はピリミジン源のない培地での相補性により行なうことができる。

ヒルジン発現に必要な配列は、フェロモン前駆体遺伝子の最初のＨｉｎ６１部位 まで含む約１．２ｋｂＥｃｏＲニ−Ｂｇ１■断片からなり（Ｋ　Ｕｒｊａｎおよ び＠　ｅｒｓｋｏｗｉ　ｔｚ、　１９８２　）、該部位は、上記面駆体ＮＨ２Ｐ ｒｅ−ｐｒｏ−３ｅｌ’−Ｌ　ｅＵ−ＡＳ　ｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−（３１ｕ−Ａ ｌａ−３ｅｒ−１ｅｕ−ＡＳ　ｐ　−ｈｉｒｕｄｉｎ　−ＣＯＯＨ（式中、ｐｒ ｅ−Ｐｒｏは、酵ａ７エローＥンの最初の８０個のＮＨ２末端アミノ酸配列から なり、ｈｉｒｕｄｉｎは成熟ヒルジンの配列を意味する。〕の合成を得るように ヒルジン配列に融合している。

ｐＴＧ１８１８により形質転換されたＴＧＹ１ｓｐ４株（Ｍａｔαｈｉｓ３−１ １−１５　ｕｒａ３−２５１−３７３−３２８）は、ヒルジンに典型的な抗トロ ンビン活性を有する蛋白を分泌する。この蛋白は培養培地（最小培地十０．５％ カザミノＩ：５０ｍＱ容エーレンマイヤーフラスコ中１０舶培養；３０’Ｃ）中 に見出される蛋白のほぼ１０％外囚性ピリミジン源の存在下に培養したＴＧＹ１ ｓｐ４細胞におけるｐＴＧ１８１８の安定性を検討するために、形質転換された ＴＧＹｌ　５ｐ４ｐＴＧ１８１８株を強化培地（ＴＰＧ）１０ｍＱ中で培養し、 約１０細胞世代を得た（１０４細胞／ｍＱ接種、２０時間培養）。細胞を希釈し て、約２００個を固体強化培地に置いた。２日間発育させた後、コロニーを０． ５％カザミノ酸添加最小培地でビロード上に写し取った。コロニーの約１５％は この後者の培地では発育し得ないことが明らかにされ、このことは細胞がプラス ミドを失っていることを示している。

ＴＧＹｌＳＩ）４ｐＴＧ１８１８からの５−ＦＵ耐性誘導体の選択 ＴＧＹ１Ｓｐ４１）Ｔ’Ｇ１８１８からｆｕｒ’１ｇ導体ヲ’ｙＢ択するため、 この株２Ｘ１０”個を５−フルオロウラシルの０．３ｍｇ／ｍＱを含有する完全 培地に置いた。３０’Ｃで一週間培養した後、細胞芝の著しい残余発育にもかか わらず、約１００個の過コロニーが認められた。これら過コロニーの最大のもの のうちの６個を、ＹＰ、Ｇ＋０．９ｍｃ＋、／ｍＱ５−Ｆ　Ｕでサブクローニン グした。６個のうち５個が良好な発育を示したが、第６番目のものは、Ｏ’、　 ９ｍｒ＋／ｍ１２５−ＦＵの毒性作用に対する耐性が弱まった。これらの皿から 各株の細胞を取り、希釈して各株の細胞の約２００個を完全培地の皿に拡げた。

カザミノ酸添加最小培地で写し取ることにより、５つの最も耐性な株は、原栄養 性コロニーの１００％を示し、一方６番目の株は、原栄養性細胞の１０％だけを 示すことが判った。５つの優れた候補株のうち、２つを研究を続けるために保存 した。これらの候補株はＴＧＹ１ｓｐ４ＦＵρＤＴＧ１８１８クローン６および ＴＧＹ１ｓｐ４ＦＵρＩ）ＴＧ１８１８クローン９として知られている。

ＴＧＹｌＳｌ）４株およびそのＦＩＪＲ誘導体におけるプラスミド１）ＴＧ１８ １８の安定性の比較 上記と同じ種類の実験を、ＴＧＹ１ｓｐ４ｐＴＧ１８１８および５−ＦＵ耐性コ ロニー２個を用いて行なった；液体完全培地中で１０細胞世代培養後、各株の細 胞を希釈して旧に約細胞２００個を拡げた。各株当り６皿を用意し、各々約１２ ００コロニーを得た。

３日間発育させた後、コロニーをカザミノ酸０．５％添加最小培地でビロードに 写し取った。結果を、第４表に要約する。この結果から、上記試験により栄養要 求コロニーの約１０％を示したＴＧＹ　１　Ｓ　ｐ４　ｐＴＧｌ　８　”＋　８ 株と、全く示さなかった５−ＦＵ耐性誘導体の間には、明らかな差のめることが 判った。

ＴＧＹｌ　５ｐ４ｐＴＧ１８１８株およびＴＧＹｌＳｌ）４１）選択培地（最小 培地）において、２つのＦＵＲ株は、丁ＧＹ１５ｐ４ｐＴＧ１８１８株と比較し て違った量のヒルジンを分泌するか？ ＴＧＹ１Ｓｐ４１）ＴＧ１８１８株およびＦＵＲクローン６誘導体を、カザミノ １０．５％添加ＹＮＢＧ１０ｍ（Ｈ，：おい平行して培養した。接種は一晩前培 養後（ＯＤｙ。。

０．４〜０．８＞、朝にＯＤｙ　ｏ　ｏ　０．０２０で行なった。培養上澄みに おけるヒルジン（抗トロンビン活性）の測定は、２４．４８および７２時間目に 行なった。この３時点のいずれにおいても２株間に有意差は認められなかった（ 第５表）。このことは、５−ＦＵ耐性のための変異はヒルジン分泌を妨げないこ とを示している。

第５表 −０，５％カザミノ酸酸量最小培地よび完全培地における分泌の効果 ＴＧＹ１Ｓｐ４ｐＴＧ１８１８　５−ＦＵＲクローン６株を０．５％カザミノ酸 酸量最小培地よび完全培地で平行して培養しく培養物１００ｍＱ＞、上澄みの抗 トロンビン活性を２４．４８および７２時時間和測定した。

第６表に示した結果から、ＦＵＲ株は、同一細胞集団の場合、最小培地における よりも完全培地において約５倍ヒルジンを分泌することが明らかでおる。これら の条件下での最大産生は約１０，０ＯＯＵ／９１０Ｄ、つまりヒルジン約１ｍＥ ｌ／Ｑ／○Ｄに達する。

下記の株をパスツール研究所微生物培養物国際寄託所（ＣＮＣＭ）　＜２８ｒｕ ｅ　ｄｕ　［）ｏｃｔｅｕｒ−ＲＯＵＸ　。

７５７２４　ＰＡＲＩＳ　ＣＥＤＥＸ１５）に１９８５年４月３０日に寄託した ： ・ＴＧＹ１ＳｌｐＴＧ１８１８サツカロミセス・セレビ２５１　３７３−３２８ 　ｈｉｓ−３−１１−１５）：寄託番号ニー４４１゜ 参考文献 ｅａｃｈ　、　Ｍ、　Ｌ、　、　Ｌａｃｒｏｕｔｅ　、　Ｆ、　ａｎｄ　Ｂｏｔ ｓｔｅｉｎ　、　Ｄ。

（１９７９）　Ｐｒｏｃ　、　Ｎａｔｌ　、　Ａｃａｄ　、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ ■、　３８６−３９０゜ Ｂｅｇｇｓ、　Ｊ、　Ｄ、　（１９８１）　ｉｎ　ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅ ｅｒｉｎｃ＋　ｖｏｌ、　２．　ｐ　、　１７５−２０３．　Ｅｄ　、　Ｒ。

ＷｉｌｌｉａｍＳＯｎ　、　Ａｃａｄ　、　ｐｒｅｓｓ。

Ｂｏｌｉｖａｒ、　Ｆ、　、　Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、　Ｆ、　Ｌ　、、　Ｇｒｅ ｅｎｅ　、　Ｐ。

Ｊ、　、　Ｂｅｔｌａｃｈ、　Ｍ、　Ｃ，、Ｈｅｙｎｅｃｋｅｒ、　Ｈ，Ｌ　、 　ａｎｄＢｏｙｅｒ、　Ｈ，Ｍ、　（１９７７）Ｇｅｎｅ　２．９５−１１３゜ Ｂｒｏａｃｈ　、　Ｊ、　Ｒ，（１９８１）　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒＢｉＯ１００ｙｏｒ　ｔｈｅ　ｙｅａｓｔ　３ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　Ｅ ｄＳ、Ｊ。

５ｔｒａｔｈｅｒｎ、　Ｅ、　Ｊｏｎｅｓ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｂｒｏａｃｈ　Ｃ， Ｓ。

Ｈ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　。

Ｇｉｒｗｉｔｚ、　Ｓ、　Ｃ，、Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉ、　Ｓ、　、　Ｒａｉｎｂ ｏｗ、　Ａ。

Ｊ、　ａｎｄ　Ｇｒａｈａｍ　、　Ｆ、　Ｌ、　（１９８０）ＡｎｎａｌＢｉｏ ｃｈｅｍ、　１０６．　ｐ、　４９２゜Ｈｉｎｎｅｎ　、　Ａ、、　Ｈｉｃｋｓ 、　Ｊ、　Ｂ、ａｎｄ　Ｆｉｎｃｋ、　Ｇ、　Ｒ。

（１９７８）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ　、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７５゜１ ９２９−１９３３゜ Ｃｈｅｖａｌｌｉｅｒ　、　Ｍ、Ｒ，ａｎｄ　Ａｉｇｌｅ、　Ｍ、（１９７９） ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、１０８，１７９−１８０Ｃｈｅｖａｌｌｉｅｒ　、Ｍ、Ｒ ，、Ｂｌｏｃｈ、Ｊ、Ｃ，ａｎｄｌ−ａｃｒｏｕｔｅ　、Ｆ、（１９８０）　Ｇ ｅｎｅ　１ユ、１１−１９゜Ｊａｙａｒａｎ、　Ｍ、、Ｌｉ　、Ｙ、Ｙ、　ａｎ ｄ　Ｂｒｏａｃｈ、Ｊ、Ｒ。

（１９８３）Ｃｅｌｌ　３４，９５−１０４゜Ｊｕｎｄ　、Ｒ，ａｎｄ　１−ａ ｃｒｏｕｔｅ　、Ｆ、（１９７０）　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１０２．　６０７−６１５゜Ｊｕｎｄ　、Ｒ，ａｎｄ　１ −ａｃｒｏｕｔｅ　、Ｆ、（１９７２）　Ｊ。

Ｍｏｒｔｉｍｅｒ　、Ｒ，Ｋ、ａｎｄ　ｌ−（ａｗｔｈｏｒｎｅ、Ｄ、ｃ。

（１９６６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　５３，１６５−１７３゜Ｋｕｒｊａｎ　、Ｊ、 　ａｎｄ　Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ　、Ｉ　、（１９８２）円’Ｇ９６Ｌ 時開（ｈｒ） 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）選択圧なしで完全培地で培養することができる、特定蛋白をコードする遺 伝子のクローニングまたは発現用ベクターにより形質転換された菌株の製造法で あつて、：（ａ）それが存在しないと前記株にとつて致死的であり、少なくとも ２つの代謝経路により合成される代謝産物が確認され、 （ｂ）前記代謝経路の最初の経路が該代謝経路に関与する遺伝子の少なくとも１ つを改変させることにより遮断され、 （ｃ）該菌株が、さらに、改変した遺伝子の機能的対立遺伝子を含有するベクタ ーを用いて形質転換され、（ｄ）他の代謝経路が遮断される、 ことを特徴とする前記製造法。 （２）代謝産物がウリジン５′−モノフオスフエートである請求の範囲第１項に 記載の方法。 （３）最初の代謝経路に関与する遺伝子が活性ＯＭＰ脱力ルボキシル酵素の合成 に関与する遺伝子であり、ベクターが活性ＯＭＰ脱力ルボキシル酵素をコードす る遺伝子を含んでいる請求の範囲第２項に記載の方法。 （４）最初の代謝経路における改変した遺伝子がＵＲＡ３遺伝子で、菌株が酵母 株であり、ベクターがＵＲＡ３遺伝子の機能的対立遺伝子を含んでいる請求の範 囲第３項に記載の方法。 （５）他の代謝経路を遮断するため、活性ＵＭＰピロホスホリラーゼの合成に関 与する遺伝子を改変させる請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の方法。 （６）活性ＵＭＰピロホスホリラーゼの合成に関与する改変させた遺伝子がＦＵ Ｒ１座に位置する請求の範囲第５項に記載の方法。 （７）ＵＲＡ３遺伝子の機能的対立遺伝子がサツカロミセス属に属する酵母株の ＤＮＡに由来する請求の範囲第４〜６項のいずれかに記載の方法。 （８）ベクターが少なくとも −酵母プロモーターの促進下にある特定蛋白をコードするＤＮＡ断片、 −酵母プロモーター、 −改変させた遺伝子の機能的対立遺伝子、を含有する請求の範囲第１〜７項のい ずれかに記載の方法。 （９）ベクターがさらに酵母の複製開始点を含有する請求の範囲第８項に記載の 方法。 （１０）複製開始点が酵母の２μプラスミドのそれである請求の範囲第９項に記 載の方法。 （１１）ベクターがｐＴＧ８０６およびｐＴＧ８０７から選ばれたプラスミドで ある請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載の方法。 （１２）特定蛋白をコードする遺伝子がｘｙｌＥ遺伝子である請求の範囲第１〜 １１項のいずれかに記載の方法。 （１３）ベクタープラスミドがｐＴＧ８４３である請求の範囲第１２項に記載の 方法。 （１４）ｕｒａ３酵母株を栄養要求性を相補するベクターで形質転換し、ｕｎａ ＋株を選択し、次いでｕｒａ＋株の他の代謝経路を遮断する請求の範囲第１〜１ ３項のいずれかに記載の方法。 （１５）ｕｒａ＋株の他の代謝経路を遮断するため、これらの株をｆｕｒ１変異 株と交雑させ、ｕｎａ＋、ｆｕｎ１交雑物を選択する請求の範囲第１４項に記載 の方法。 （１６）ｕｒａ＋株の他の代謝経路を遮断するため、突然ｕｒａ＋、ｆｕｎ１変 異株を選択する請求の範囲第１４項記載の方法。 （１７）ｕｒａ３に対してホモ接合性であり且つｆｕｒ１に対してヘテロ接合性 である二倍体株を形質転換する請求の範囲第１〜１３項のいずれかに記載の方法 。 （１８）ｆｕｒ１−倍体分離株を、請求の範囲第１７項に記載の二倍体株を胞子 形成させた後に、選択する請求の範囲第１７項に記載の方法。 （１９）ｆｕｒ１に対してホモ接合性である誘導体を、請求の範囲第１７項に記 載の二倍体株を遺伝子変換した後に、選択する請求の範囲第１７項記載の方法。 （２０）請求の範囲第１〜１９項のいずれかに記載の方法により製造された原核 性または真核性細胞。 （２０）酵母である請求の範囲第２０項に記載の真核性細胞。 （２０）サツカロミセス属に属する酵母株、特にサツカロミセス・セレビシアエ である請求の範囲第２０項に記載の真核性細胞。 （２３）活性ＯＭＰ脱カルボキシル酵素を合成できず、活性ＵＭＰピロホスホリ ラーゼを合成できず、活性ＯＭＰ脱力ルボキシル酵素をコードする遺伝子をさら に担持した特定蛋白発現プラスミドにより形質転換されている、 ことを特徴とするサツカロミセス株。 （２４）特定蛋白がカテコールオキシゲナーゼである請求の範囲第２３項に記載 の菌株。 （２５）特定蛋白がα１−アンチトリプシンである請求の範囲第２３項記載の菌 株。 （２６）特定蛋白がヒルジンである請求の範囲第２３項に記載の菌株。 （２７）請求の範囲第２０〜２６項のいずれかに記載の細胞株を完全培地で培養 し、得られた蛋白を回収することを特徴とする特定蛋白の製造法。