DE3688743T2 - Hefestaemme. - Google Patents

Hefestaemme.

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Description

    Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft Hefe, insbesondere Bäcker- oder Bierhefe mit höheren Produktionsraten für Kohlendioxid und Ethanol. Zum Beispiel führt vermehrte Kohlendioxidentwicklung bei Bäckerhefe zu einer schnelleren Teigsäuerung bzw. bei Bierhefe eine erhöhte Produktionsrate für Ethanol zu verkürzten Brauzeiten. Diese Erfindung betrifft außerdem ein neues Mittel zur Regulation der Genexpression, das die regulierte Entfernung eines Transkriptionsblocks mit einschließt.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Hefen stellen eine der ältesten kultivierten Pflanzen dar. Ihre Verwendung läßt sich bis ungefähr 2000 B.C. zurückverfolgen. Unter den verschiedenen bekannten Hefegattungen hat Saccharomyces die größte wirtschaftliche und praktische Bedeutung, da sie in der Back-, Brau- und Weinerzeugungsindustrie sowie bei der Herstellung von Biomasse ausgiebig verwendet wird. Siehe z. B. Reed, G., "Yeasts" in Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology 24 (1984), S. 771-806 (John Wiley & Sons, New York).
  • Die Haupt-, jedoch nicht einzige Aufgabe von Hefe bei der Gärung besteht in der Bereitstellung einer Quelle für Kohlendioxid und Ethanol. Zur Erzielung der gewünschten Produktionsrate für CO&sub2; und Ethanol muß ausreichend Hefe zu dem Teig, der Bierwürze oder einem anderen vergärbaren Substrat gegeben werden. Falls aktivere Hefen zur Verfügung stünden, könnte mit entsprechender Kostenersparnis weniger Hefe verwendet werden. Die Verbesserung der Gärleistung von Hefe ist Gegenstand fortwährender Forschungsbemühungen. Sowohl die getrockneten als auch die feuchten Hefeformen können zur Steigerung ihrer Befähigung zur Kohlendioxidproduktion verbessert werden, um so (1) die Gärzeit zu verkürzen und/oder (2) die Verwendung von weniger Hefe zu ermöglichen, ein beträchtlicher Kostenfaktor sowohl beim Backen als auch beim Brauen. Verbesserungen der Gärleistung von Hefe verleihen auch der Herstellung der stabileren, aktiven Trockenhefeform (ADY) Attraktivität. Im allgemeinen gehen bei der Herstellung von ADY aus einer frischen Hefekultur etwa 40 % der Gärfähigkeit verloren. Es wird deshalb fortwährend nach Verfahren zur Ausschaltung oder zur Reduzierung dieses Problems gesucht.
  • Ein Ansatz zur Verbesserung der Aktivität getrockneter Hefe beinhaltet eine Modifikation entweder des Trocknungsprozesses oder der Trocknungseigenschaften des Hefestamms, um so den während des Trocknens eintretenden Verlust an Aktivität zu verhindern. Verfahrensverbesserungen konnten durchgeführt werden und bei diesem Problem wurden Verfahren der klassischen Genetik angewandt, allerdings mit bescheidenem Erfolg, siehe z. B. US-Patent 3,993,783.
  • Ein weiterer Ansatz zur Lösung des Problems der geringen Aktivität von Trockenhefe ist im US-Patent 4,420,563 beschrieben. Durch die gesteigerte Zugabe von Salzen zu der heranwachsenden Hefekultur während der späteren Vermehrungsstadien wurde Hefe hergestellt, die besonders in Süßteigen mit hohem Zuckergehalt eine verbesserte Säuerungsaktivität hatte.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf genetisch und chemisch induzierte Modifikationen, die die Aktivität zur Produktion von CO&sub2; und Ethanol jedes beliebigen Hefestamms steigert.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Offenbart werden Verfahren zur Steigerung der Produktionsrate für CO&sub2;, Ethanol und weiterer von Hefe erzeugte Gärungsprodukte (z. B. Citronensäure). Im allgemeinen umfassen die Verfahren die Erniedrigung des ATP-Spiegels in der Hefezelle, wodurch die Glykolyse stimuliert wird. Bei einem erfindungsgemäßen Aspekt wird der ATP-Spiegel durch den Austausch des natürlichen Promotors eines ein Stoffwechselenzym codierenden Gens gegen einen regulierbaren Promotor im Hefegenotyp (z. B. über einen in Einzelkopie oder mehreren Kopien vorliegenden Vektor oder über die Cointegration in das Hefegenom) erniedrigt. Dadurch wird die regulierbare Expression des Enzyms gestattet und dadurch wird wiederum gestattet, daß die von dem Enzym katalysierte Stoffwechselreaktion gleichzeitig mit der Rückreaktion abläuft, so daß ATP verbraucht wird. Bei einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt beinhaltet die Modifikation außerdem die Einfügung eines ein Stoffwechselenzym codierenden Gens in den Hefegenotyp, in diesem Fall jedoch unter der Expressionskontrolle eines Promotors, der die konstitutive Expression des Gens erlaubt, und es dadurch gestattet, daß die von dem Enzym katalysierte Stoffwechselreaktion gleichzeitig mit der Rückreaktion abläuft, so daß ATP verbraucht wird. Weitere erfindungsgemäße Modifikationen beinhalten die Modifikation des das Stoffwechselenzym codierenden Gens, um dadurch z. B. eine allosterische oder sonstige Hemmung oder Inaktivierung des Enzyms zu verhindern oder zu beseitigen.
  • In einer Ausführungsform stellt das Enzym FDPase dar. Das FDPase-Gen kann außerdem so mutagenisiert werden, daß das Codon für Ser-12 des Enzyms gegen ein Codon für eine von Serin verschiedene Aminosäure ausgetauscht wird, oder daß eine allosterische Hemmung, z. B. durch AMP und/oder Fructose-2,6-diphosphat erniedrigt oder ausgeschaltet wird. In einer weiteren Ausführungsform beinhaltet die genetische Modifikation die Modifizierung eines Gens für eine extrazelluläre APase, z. B. durch die Entfernung des die Leadersequenz codierenden Genbereichs, so daß das modifizierte Enzym im Hefecytoplasma bleibt und die Hydrolyse von intrazellulärem ATP katalysiert.
  • Ein durch diese Erfindung bereitgestellter Vorteil besteht darin, daß die genetischen Modifikationen nur während und bevorzugt in einem frühen Stadium der Säuerungsphase und nicht während der Aufzucht der Hefe im Produktionsmaßstab angeschaltet werden können. Dies stellt bei Bäckerhefen einen bedeutenden Vorteil dar. Alternativ können die genetischen Modifikationen konstitutiv exprimiert werden, so daß sie zur gesteigerten Erzeugung von Gärungsprodukten wie Ethanol während der Herstellung der Hefe im großtechnischen Maßstab, d. h. der Aufzucht der Hefe im kommerziellen Maßstab, ausgeschaltet sind.
  • Die Regulation der genetischen Modifikationen kann durch die Verwendung eines temperaturempfindlichen Promotors oder eines Promotors, der durch die Anwesenheit einer spezifischen Substanz induziert wird, erfolgen, so daß das Enzym nur bei einer vorgegebenen Temperatur oder in Gegenwart der Substanz exprimiert wird. Alternativ kann durch das Einfügen eines, später ausführlicher beschriebenen, FLP-Genkonstrukts in das Hefegenom eine Expressionskontrolle zur Verfügung gestellt werden.
  • Für diese Verfahren geeignete Vektoren umfassen in Einzahl vorliegende, Zentromer-enthaltende Plasmide und in mehreren Kopien vorliegende, den Hefe 2u-Replikationsstartpunkt enthaltende Plasmide, sowie Vektoren, die deren Cointegration in das Hefegenom gestatten.
  • Die Erfindung umfaßt außerdem Verfahren, bei denen der ATP-Spiegel dadurch erniedrigt wird, daß die Hefe mit einer Chemikalie gezüchtet oder in Kontakt gebracht wird, die zur direkten oder indirekten Induktion des ATP-Verbrauchs befähigt ist. Zu solchen Chemikalien zählen relativ kleine organische Moleküle sowie Proteine, wie das Hefekillertoxin.
  • Die Erfindung umfaßt außerdem genetisch modifizierte Hefen, die mit den hierin offenbarten Verfahren hergestellt wurden.
  • Schließlich umfaßt diese Erfindung außerdem ein Verfahren und ein Vektorsystem zur regulierten Expression von heterologen Genen in Hefe, Bakterien und Zellen höherer Eukaryonten wie Pflanzen- und Säugerzellen.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 zeigt die Konstruktion eines Hefe-Integrationsplasmids, das das vom Gal1-Promotor exprimierte FLP-Gen enthält.
  • Fig. 2. zeigt ein Hefeplasmid, das den mit dem β-gal codierenden Bereich aus E. coli verknüpften Gal1-Promotor enthält.
  • Fig. 3 zeigt die Induktion der β-Galactosidaseaktivität vom Gal1-Promotor, bei durch Glucose limitiertem Wachstum.
  • Fig. 4 zeigt den Verlust eines heterologen Gens durch regulierte ortsspezifische Rekombination.
  • Fig. 5 zeigt den Verlust eines Transkriptionsblocks im das Hefe FDPase-Gen exprimierenden GPDH-Promotor.
  • Fig. 6 zeigt ein Plasmid, das einen über SalI/BglII- Restriktionsstellen verknüpften Expressionsblock enthält.
  • Fig. 7 zeigt die Konstruktion eines Replikationsstartpunkte und selektierbare Marker sowohl für Hefe als auch E. coli enthaltenden Expressionsvektors.
  • Fig. 8 zeigt die Nucleotidsequenz des clonierten Hefe FDPase-Gens.
  • Fig. 9A und 9B zeigen die abgeleitete Aminosäuresequenz des clonierten FDPase-Enzyms bzw. die Aminosäuresequenz von FDPase vom Schwein.
  • Fig. 10 zeigt die Konstruktion einer FDPase-Kassette zur Expression von einem heterologen Promotor.
  • Fig. 11 zeigt die Herstellung eines Expressionsvektors, bei dem FDPase vom GPDH-Promotor exprimiert wird.
  • Fig. 12 zeigt die Herstellung einer aminoterminalen Deletion der FDPase.
  • Fig. 13 zeigt den Austausch des Serinrestes an der Erkennungsstelle für Proteinkinase gegen Alanin.
  • Fig. 14 zeigt die CO&sub2;-Entwicklung während der Züchtung von Hefekulturen, die Wildtyp-FDPase oder FDPase mit einer Deletion des Aminoterminus exprimieren.
  • Fig. 15 zeigt die CO&sub2;-Entwicklung während der Züchtung von Hefekulturen, die FDPase exprimieren, der die Erkennungsstelle für die von cyclischem AMP abhängigen Proteinkinase fehlt.
  • Fig. 16 zeigt das für die Untersuchung der Gasentwicklung verwendete Gerät.
  • Fig. 17 zeigt die Verbesserung der Gasentwicklungleistung bei einem Hefestamm, der das Gen für das nicht-phosphorylierte FDPase-Enzym exprimiert. Kreise: Hefestamm ATCC 26675, transformiert mit Plasmid BA 601; X: Hefestamm ATCC 26675, transformiert mit Plasmid BA 802.
  • Fig. 18 zeigt die Einfügung des Hefepromotors für saure Phosphatase in einen Hefeexpressionsvektor.
  • Fig. 19 zeigt die DNA-Sequenz des Hefepromotors für saure Phosphatase und den Anfang des Strukturgens für saure Phosphatase (PHO 5).
  • Fig. 20 zeigt die Einführung einer einmal vorhandenen BglII-Stelle am 3'-Ende des Promotors für saure Phosphatase.
  • Fig. 21 zeigt die Einführung einer Restriktionsstelle in das Gen für saure Phosphatase zur Expression des reifen Proteins.
  • Fig. 22 zeigt die Herstellung eines Expressionsvektors, der das Gen für reife saure Phosphatase vom Promotor für saure Phosphatase exprimiert.
  • Fig. 23 zeigt die Einführung eines Hefecentromers in das das modifizierte Gen für saure Phosphatase enthaltende Plasmid.
    • Ausführliche Beschreibung
  • Der Glykolyse-Abbauweg bei Hefe wurde viele Jahre lang ausführlich untersucht. Siehe z. B. Fraenkel, "Carbohydrate Metabolism" in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces; Metabolism and Gene Expression, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Bei der glykolytischen Vergärung von Zuckern handelt es sich bei der Betrachtung der Umwandlung von Energie als auch von Biomasse um einen sehr ineffizienten Prozeß. Trotzdem können Hefen durch anaerobe Glykolyse, bei der die Energie aus der Substratkettenphosphorylierung stammt, schneller wachsen als durch oxidative Phosphorylierung unter aeroben Bedingungen.
  • Im Verlauf der zu dieser Erfindung führenden Untersuchungen fanden wir heraus, daß bei Hefe die Glykolysegeschwindigkeit durch den zellulären Spiegel von Adenosintriphosphat (ATP) reguliert wird. Dieser Befund ist wirklich überraschend, denn obwohl eine regulatorische Rolle von ATP bei einigen enzymatischen Schritten beobachtet wurde, wurde nach unserem Wissen trotz der vorangegangenen umfangreichen Untersuchungen über Glykolyse eine regulatorische Rolle des ATPs innerhalb des Gesamt-Glykoseabbauwegs bisher nie nachgewiesen, geschweige denn vorgeschlagen. Die vorliegende Erfindung macht sich diese Entdeckung zunutze, indem sie Modifikationen zur Erniedrigung des zellulären Spiegels von cytoplasmatischem ATP bereitstellt, was zur Stimulierung der Glykolyse und dadurch wiederum zur Erhöhung der Entstehungsrate für CO&sub2; und Ethanol bei Hefe führt.
  • Wie vorstehend erwähnt, kann Bäckerhefe dadurch verbessert werden, daß die Befähigung zur Erzeugung von CO&sub2; während der Teigsäuerung gesteigert wird. Bierhefe kann ebenfalls durch die Steigerung der Gärungsrate (d. h. der Alkoholproduktion) und durch die Reduktion der für das Brauverfahren erforderlichen Zeit verbessert werden. Die bei der Verwendung von gemäß dieser Erfindung modifizierten Hefe erniedrigte Erzeugung von Biomasse während der Gärungsprozesse führte außerdem zur Verbesserung des Gärungsprozesses zur Ethanolherstellung. Diese Erfindung stellt Modifikationen zur Durchführung dieser Verbesserungen dadurch bereit, daß die Glykolyserate durch eine ungewöhnliche Erniedrigung des zellulären ATP-Spiegels reguliert wird. Mit "ungewöhnlicher Erniedrigung des zellulären ATP-Spiegels" meinen wir einfach eine durch ein erfindungsgemäßes Verfahren induzierte Erniedrigung.
  • Da die an der Glykolyse beteiligten Enzyme normalerweise im Überschuß vorliegen, kann die Glykolyserate durch allosterische Hemmung bestimmter glykolytischer Enzyme durch zelluläre Metaboliten, einschließlich des intrazellulären Adenosintriphosphat (ATP)-Spiegels begrenzt werden, so wie dies im Verlauf der nachstehend beschriebenen Untersuchungen entdeckt wurde. Somit wird durch die erfindungsgemäße Erniedrigung des zellulären ATP-Spiegels die Glykolyse stimuliert und dadurch wiederum die Ertragsrate für CO&sub2; und Ethanol gesteigert und die Erzeugung von Biomasse verringert.
  • Im Fall der Bäckerhefe würde jedoch diese bei der Erzeugung von Biomasse sehr ineffizient sein, falls diese Veränderung der Hefe während der normalen Vermehrung wirksam wäre. Daher wäre aufgrund gesteigerter Produktionskosten die Züchtung der Hefe kommerziell undurchführbar. Es ist daher wünschenswert, daß die erfindungsgemäßen genetischen Modifikationen zur Herstellung von Bäckerhefe so reguliert werden, daß diese nur während des Säuerungs- (oder Gärungs)-Prozesses, nicht jedoch während der Erzeugung der Hefe selbst (Vermehrungsphase) wirksam sind. Ein bedeutender Vorteil dieser Erfindung besteht in der Möglichkeit, die genetische Modifikation anzuschalten und damit verbunden die CO&sub2;-Erzeugung so zu steigern, daß die gesteigerte Erzeugung während des Beginns oder in frühen Stadien des Stadiums des Teiggehenlassens einsetzt. Diese Einschränkung ist jedoch bei Hefen zum Brauen oder zur Ethanolproduktion nicht erforderlich, jedoch dann, wenn die Produktion gleichzeitig während der Vermehrung erzielt wird.
  • Verschiedene Methoden zur Erniedrigung des cytoplasmatischen ATP-Spiegels und dazu typische Beispiele werden nachstehend beschrieben. Im allgemeinen beinhalten diese Methoden (i) die Bildung eines regulierten Leerlaufstoffwechselcyclus, der ATP verbraucht, (ii) die Einführung bzw. die Erhöhung der Aktivität der cytoplasmatischen ATPase in regulierbarer Art und Weise und (iii) die Erniedrigung des cytoplasmatischen ATP-Spiegels durch die Beeinflussung der Funktion der Plasmamebran. Wie aus der folgenden Beschreibung ersichtlich, umfassen die vorstehenden Methoden (i) und (ii) die Einführung eines veränderten Gens bzw. einer veränderten Genfunktion über DNA-Rekombinationsverfahren in einen Hefestamm. Vor der detaillierteren Beschreibung der vorstehend erwähnten Verfahren dürfte es hilfreich sein, zuerst die Hilfsmittel zur Durchführung solcher genetischer Modifikationen zu beschreiben, d. h. geeignete Vektoren, regulierbare Promotoren und Verfahren zur Einführung dieser Veränderungen in Bäcker- bzw. Bierhefestämme.
    • Vektoren
  • Das für die Induktion eines Leerlaufcyclus verantwortliche Gen bzw. das Gen für cytoplasmatische saure Phosphatase kann in zwei Arten von sich autonom replizierenden Expressionsvektoren unter der Transkriptionskontrolle eines Promotors cloniert werden: ein in Einzelkopie vorliegendes, ein Centromer enthaltendes Plasmid oder ein Plasmid mit hoher Kopienzahl. Alternativ kann die DNA über Rekombination in ein Hefechromosom eingeführt werden. Außerdem enthalten diese Vektoren ein Markergen und 3'-nicht-codierende Bereiche. Diese sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt.
  • Die Vektoren werden in einen Hefestamm transformiert und die Hefezellen auf solche, die den Vektor enthalten, durch ein auf dem Fachgebiet allgemein bekanntes Selektionsverfahren selektioniert. Die selektionierten, den Vektor enthaltenden Hefezellen, d. h. die transformierten Zellen, werden in einem geeigneten Wachstumsmedium gezüchtet und der Promotor zur Einleitung des Verlusts von cytoplasmatischem ATP induziert.
  • Geeignete Markergene sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Bevorzugt handelt es sich bei dem Selektionsmittel um eines, das das Zellwachstum in Abwesenheit des Markergens verhindert. Somit enthalten die Zellen, die während der Aufzucht in großtechnischem Maßstab das Plasmid verlieren, kein Markergen und können während der Vermehrung die anderen Zellen nicht überwachsen. Allerdings kann es bei der kommerziellen Herstellung der gewünschten Produkte wünschenswert sein, die Verwendung bestimmter Zelltoxine zu vermeiden, um damit die Reinigungsschritte für das Produkt zu vereinfachen. Somit handelt es sich bei einem wünschenswerten Markergen um eines, das es den Transformanten erlaubt, in einem Medium zu wachsen, dem ein zur Vermehrung des Elternstammes erforderlicher Nährstoff fehlt. Zweckmäßige Markergene bei der Ausführung dieser Erfindung umfassen z. B. URA3, LEU2 etc.
  • Zweckmäßige Vektoren können durch dem Fachmann vertraute Verfahren synthetisiert werden. Die Bestandteile der Vektoren, z. B. Markergene, Promotoren und ähnliche können aus natürlichen Quellen erhalten oder wie nachstehend diskutiert synthetisiert werden. Grundsätzlich können Bestandteile, die in hohen Ausgangsmengen erhältlich sind (d. h., die in natürlichen Plasmiden, z. B. dem 2u-Plasmid von Hefe, vorhanden sind, oder die leicht synthetisiert werden können) unter der Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme und T4 DNA-Ligase zusammengesetzt werden. Falls ein Bestandteil nicht in hoher Ausgangsmenge verfügbar ist, kann er durch Einfügung in einen bakteriellen Clonierungsvektor, z. B. einem Plasmid oder einem Phagen, amplifiziert werden, so wie dies auf dem Fachgebiet allgemein bekannt ist. Danach können unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme große Mengen an Vektor durch auf dem Fachgebiet allgemein bekannte Verfahren dadurch erhalten werden, daß die Bakterien einfach gezüchtet werden, ihre DNA mit einer geeigneten Endonuclease gespalten wird, die DNA-Fragmente abgetrennt werden, die den interessierenden Bestandteil enthaltende DNA bestimmt und gewonnen wird. Gewöhnlich wird der Transformationsvektor in geringen Mengen zusammengesetzt und im Anschluß daran zur Herstellung größerer Mengen an DNA des Transformationsvektors in einen geeigneten, sich autonom replizierenden Synthesevektor, z. B. ein Plasmid oder ein Phage, ligiert. In den meisten Fällen kann z. B. das allgemein bekannte Plasmid pBR322 verwendet werden.
  • Zur Clonierung der ligierten Transformationsvektoren werden die Synthesevektoren auf übliche Art und Weise verwendet, z. B. durch Transformation eines permissiven prokaryontischen Organismus, Replikation des Synthesevektors bis zu einer hohen Kopienzahl, Gewinnung des Synthesevektors durch Lyse der Zellen und Abtrennung des Synthesevektors von Zelltrümmern. Die so erhaltene Ernte an Synthesevektor kann unmittelbar in Hefezellen transformiert werden. Viele unterschiedliche Arten von Hefevektoren sind leicht erhältlich und können, falls erforderlich, gegeneinander ausgetauscht werden (Parent et al., Yeast 1 (1985) S. 83-138).
  • Verschiedene Vektoren, zu denen Transformationsvektoren und Vektoren gehören, die verschiedene Elemente mit spezifischen Promotoren, das FLP-Gen und ein FDPase-Gen enthalten, wurden am 5. November 1986 in E. coli HB101 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 (USA) hinterlegt, dazu gehören:
  • 1. AZ402 Das Plasmid enthält den UPA3-Transkriptionsblock flankiert von FLP-Erkennungssequenzen innerhalb einer Bgl II/Sal I-Kassette (ATCC Nr. 67257)
  • 2. AU125 Das Plasmid enthält ein funktionell mit dem GPDH-Promotor verknüpftes FDPase-Gen (ATCC Nr. 67256)
  • 3. AT823 Das Plasmid enthält ein FDPase-Gen (ATCC Nr. 67258)
  • 4. AR900 Das Plasmid enthält das mit dem Gal I-Promotor funktionell verknüpfte FLP-Gen mit Restriktionsstellen zum Austausch des GalI-Promotors gegen andere Promotoren. Das Plasmid ermöglicht die regulierte Expression des FLP-Gens (ATCC Nr. 67259)
  • 5. YOp1 Das Plasmid ist ein Beispiel für ein selektierbares 2u-Plasmid (ATCC Nr. 67260)
  • 6. BA601 Das Plasmid enthält das funktionell mit dem GPDH-Promotor verknüpfte mutagenisierte (ser-12 nach ala) FDPase-Gen (ATCC Nr. 67261)
  • 7. M138 Ein Plasmid mit hoher Kopienzahl zur Expression eines cytoplasmatischen (mutagenisierten) APase- Gens (ATCC Nr. 67262)
  • 8. N305 Wie M138, außer daß das Plasmid ein Hefecentromer enthält und daher ein in Einzelkopie vorliegendes Plasmid darstellt (ATCC Nr. 67263).
    • Regulierte Promotoren
  • Es sind zahlreiche für Hefe-Transformationsvektoren geeignete Promotoren, die bei der Ausführung dieser Erfindung verwendet werden können, auf dem Fachgebiet bekannt. Bei bestimmten Ausführungsformen dieser Erfindung werden, wie dies noch ausführlicher hier diskutiert wird, regulierte Promotoren, von denen viele auf dem Fachgebiet bekannt sind, bevorzugt. Beispiele für regulierte Hefepromotoren sind jene des Galactose-, Maltose-, Phosphat- oder Stickstoffmetabolismus, der Isocytochrome und der Alkoholdehydrogenase II. Der Promotor des sauren Phosphatasegens der Hefe (PHO5) stellt ein typisches Beispiel für einen regulierten Promotor dar. Man weiß, daß dieser Promotor auf den Spiegel an anorganischem Phosphat im Medium reagiert. Es ist möglich, daß ein starker Promotor, wie der von saurer Phosphatase (APase) ein Expressionsniveau ergibt, das für bestimmte Ausführungsformen dieser Erfindung, z. B. dem Leerlaufstoffwechselcyclus, über dem Optimum liegt. Der gewünschte regulierte Promotor kann auf verschiedene Arten angepaßt werden. So kann z. B. eine clonierte Kopie des Promotors für saure Phosphatase unter Verwendung des Verfahrens von Shortle (Shortle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 (1982), S. 1588) in vitro mutiert oder kleine Deletionen/Substitutionen innerhalb des Promotors durch Einfügung von Linkern mittels bekannter Verfahren erzeugt werden (McKnight und Kingsbury, Science 217 (1982), S. 316, und Heffron und McCarthy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), S. 6012). Ein Pool an DNA- Fragmenten, die den mutierten Promotor für saure Phosphatase enthalten, wurde in ein bifunktionelles Hefe/E. coli-Plasmid eingefügt, bei dem der Promotor einen nachweisbaren Marker exprimiert, z. B. das β-Galactosidase- oder β-Lactamase-Gen aus E. coli (Guarente und Ptashne, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 (1981), S. 2199, Rose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), S. 2460, Martinez und Casadaban, Mol. Cell. Biol., 3 (1983), S. 580 und Silverman et al., Mol. Cell. Biol. 2 (1982), S. 1212). Danach wurden die transformierten Hefekolonien nach der Produktion des nachweisbaren Markers, z. B. auf 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-Galactosid (X-gal) enthaltenden Medien abgesucht, wobei der gewünschte Phenotyp auf Medium mit hohem Phosphatgehalt weiße Kolonien und auf solchen mit niedrigem Phosphatgehalt blaue Kolonien gibt. Damit können sowohl starke als auch schwache Promotoren nachgewiesen werden. Die DNA wird aus Hefezellen, die einen geeigneten Phenotyp zeigen, gewonnen und unter Verwendung von standardverfahren in E. coli transformiert. Die Ampicillin-resistenten Kolonien müssen das Hefeplasmid enthalten. Aus diesen E. coli-Transformanten wird Plasmid-DNA hergestellt, und aus diesen Plasmiden der Promotor für saure Phosphatase zur Expression verwendet.
  • Alternativ kann ein temperaturempfindliches regulatorisches Gen verwendet werden. So zeigte sich, daß z. B. viele Mutationen in den regulatorischen Genen pho R und pho U des Stoffwechselwegs für saure Phosphatase bei 36ºC konstitutive Expression und bei 23ºC normale Regulation aufweisen (Ueda et al., J. Bact. 122 (1975), S. 911). Das betreffende, den PHO5-Promotor enthaltende Plasmid wird dann in einen Hefestamm transformiert, der eine temperaturempfindliche Mutation für pho R oder pho U enthält, und der Promotor für saure Phosphatase durch Veränderung der Zuchttemperatur in einem Medium mit hohem Phosphatgehalt reguliert. Diese Art der Regulation wird ebenfalls in Verbindung mit einem schwachen (mutierten) Promotor für saure Phosphatase verwendet.
  • Ein weiteres Verfahren zur Regulation der erfindungsgemäßen Modifikationen besteht in der Verwendung eines anderen regulierten Promotors, der von Natur aus viel schwächer als der Promotor für saure Phosphatase ist. Es wurden verschiedene solche Promotoren nachgewiesen, so z. B. der Promotor des Hefe-HO-Gens. Die Expression dieses Promotors wird indirekt durch Mutationen im Sir Locus reguliert (Rine, "Regulation and Transposition of Cryptic Mating type genes in Saccharomyces cerevisiae", Doktorarbeit, University of Oregon at Eugene, 1979). In einer normalen "Wildtyp"-Zelle, die als Paarungstyp-Locus Mat a, eine α-Kassette HLM und das HO-Allel am homothallischen Locus besitzt, wäre der HO-Promotor angeschaltet. Falls der Stamm jedoch eine Sir-Mutation trägt, werden sowohl Mat a als auch Mat α (von HLM) exprimiert und der HO-Promotor wäre abgeschaltet. Somit kann ein Stamm verwendet werden, der eine temperaturempfindliche Sir- Mutation trägt, wobei bei niedriger Temperatur der HO-Promotor exprimiert, bei hoher Temperatur jedoch reprimiert wird.
  • Der regulierte Promotor ist während der Züchtung der Bäckerhefe abgeschaltet und am Ende der Vermehrung, bzw. beim Brotteig durch die Veränderung der Bedingungen für die Hefekultivierung angeschaltet. Wenn z. B. der APase-Promotor verwendet wird, wird die Hefe in Gegenwart einer regulierten Menge an Phosphat so vermehrt, daß die Kultur vor Beendigung der Vermehrung das gesamte Phosphat verbraucht. Zu diesem Zeitpunkt wird der APase-Promotor durch den Entzug des Phosphats aus dem Fermenter induziert. Falls ein temperaturempfindliches Expressionssystem verwendet wird, wird die Züchtungstemperatur so eingestellt, daß der Promotor während der Vermehrung aus- und am Ende der Vermehrung angeschaltet ist.
    • Die regulierte ortsspezifische Rekombination als Mechanismus zur Expression eines Leerlauf-Stoffwechselcyclus
  • Ein Problem bei der Optimierung der Expression eines ATP-erniedrigenden Prozesses in Bäckerhefe besteht in der Schwierigkeit, einen Promotor zu finden, der so reguliert werden kann, daß er während der Vermehrung der Hefe aus-, während der Teigsäuerung jedoch angeschaltet ist. Dies ist deshalb besonders schwierig, weil Hefe für viele unterschiedliche Anwendungsarten beim Backen verwendet wird, bei denen aufgrund unterschiedlicher Bedingungen in der Handhabung die Beschaffenheit der Hefe nicht kontrollierbar sein dürfte, was den regulierten Promotor beeinflussen kann. Falls ein Promotor verwendet wird, der durch die gleichen Zuchtbedingungen reguliert wird, wie sie normalerweise zur Erzeugung von CO&sub2;, d. h. Glykolyse, benötigt werden, sollte die Hefe genau so beschaffen sein wie die Standard-Bäckerhefe.
  • Leider sind glykolytische Gene weder stark transkriptionell reguliert noch werden sie während der Vermehrung der Bäckerhefe kontinuierlich supprimiert. Die Auslösung der Expression eines ATP-erniedrigenden Prozesses am Ende der Vermehrung durch einen glykolytischen Promotor würde jedoch dieses Problem lösen.
  • Es wurde daher ein neues Verfahren entwickelt, das die Vermehrung der Hefe ohne Verschwendung von ATP erlaubt, der ATP-erniedrigende Prozeß jedoch durch die von einem glykolytischen Promotor während des Säuerungsprozesses ausgehende Expressionen erfolgt. Dies wird durch die Verwendung eines regulierten, ortsspezifischen Rekombinationsereignisses erreicht, durch das der Transkriptionsblock innerhalb des Promotors, z. B. des GPDH-Promotors, entfernt wird. Im nachstehenden wird darauf näher eingegangen. Es sollte besonders erwähnt werden, daß diese ungewöhnliche Expressionsstrategie zur Regulation der Expression einer großen Anzahl von Genen verwendet werden kann, zu denen auch jene gehören, die Enzyme für Leerlaufstoffwechselcyclen oder cytoplasmatische Phosphatasen codieren, wobei diese Strategie jedoch nicht auf diese beschränkt ist.
  • Es konnte gezeigt werden, daß das 2 Mikron-Plasmid aus Hefe zwischen zwei "inverted repeats" einer ortsspezifischen Rekombination unterliegen kann (Hartley und Donelson, Nature 286 (1980), S. 860-864). Diese Rekombination wird durch eine spezifische Rekombinase (FLP) katalysiert, deren Gen auf dem 2 Mikron-Plasmid liegt (Broach und Hicks, Cell 21 (1980) S. 501-508). Der GalI-Promotor wird durch Glucose supprimiert und durch Galactose induziert (Yocum et al., Mol. Cell. Biol. 4 (1984), S. 1985-1998). Falls daher GalI- Promotor zur Regulation der FLP-Expression in Bäckerhefe verwendet würde, würde somit das FLP-Gen erst exprimiert werden, wenn Galactose vorhanden ist, vorausgesetzt, das natürliche 2 Mikron-Plasmid ist verlorengegangen. Normalerweise wird der Zuchtfermenter unter Glucoselimitierung betrieben, um den "Crabtree"-Effekt und die Bildung von Ethanol zu verhindern, und die Erzeugung von Zellen zu maximieren. Wir haben herausgefunden, daß der GalI-Promotor unter diesen Bedingungen nicht Glucose-reprimiert ist. Somit wird durch die Zugabe von Galactose zum Fermenter der GalI-Promotor induziert, was zur Expression des FLP-Gens führt. Die Entfernung des 2 Mikron-Plasmids aus Hefe kann z. B. unter Verwendung des Verfahrens von Erhart und Hollenberg, J.
  • Bact. 156, S. 625-635 erreicht werden. Das FLP-Gen kann außerdem, wie vorstehend beschrieben, durch einen anderen regulierbaren Promotor exprimiert werden.
  • Daher wurde ein Clon mit dem FLP-Gen isoliert und dieses von dem regulierten GalI-Promotor exprimiert. zu diesem Zweck wurde das 2 Mikron-Hefeplasmid mit XbaI, danach mit HindIII gespalten und durch präparative Gelelektrophorese ein 1450 bp XbaI/HindIII-Fragment isoliert. Danach wurde das isolierte Fragment in ein gebräuchliches, den GalI-Promotor zwischen den PvuII/SphI-Stellen enthaltendes Hefeplasmid so eingefügt, daß das FLP-Fragment vom GalI-Promotor exprimiert wurde, wobei Plasmid AR900 erhalten wurde (Fig. 1). Dies erlaubte die Expression des Proteins des FLP- Gens vom GalI-Promotor.
    • Die Regulation des GalI-Promotors während kontinuierlicher Vermehrung unter Glucoselimitierung
  • Um den GalI-Promotor als Mechanismus zur Regulation des FLP-Gens näher zu untersuchen, wurde ein Plasmid (PRY171, Fig. 2), das den mit dem β-Galactosidase codierenden Bereich aus E. coli (Parent et al. siehe oben) verknüpften Gal-Promotor enthielt, durch Integration in das Genom eines Hefe-Laborstammes, z. B. KY114, transformiert. Dieser Stamm wurde in einen Chemostaten überimpft, in dem die Kultur unter Glucoselimitierung in Hefeminimalmedium gezüchtet wurde. Das Wachstum der Kultur wurde 48 Stunden lang mit einer Verdopplungszeit von 3,5 Stunden stabil gehalten. Zu dem Fermenter wurde Galactose bis zu einer Endkonzentration von 2 % zugegeben und in regelmäßigen Abständen Proben entnommen. Die β-Galactosidase-Aktivität und die Proteinkonzentration wurden unter Verwendung von Standardverfahren gemessen (Miller (1972), Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Rose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78 (1981), S. 2460-2464). Wie aus Fig. 3 ersichtlich, induzierte der GalI-Promotor unter Glucose-limitierten Wachstumsbedingungen in Anwesenheit von Galactose β-Galactosidase-Aktivität.
  • Um die Verwendbarkeit dieses durch Galactose induzierbaren FLP-Gens zur Regulation der Rekombination zu untersuchen, wurde ein Hefestamm mit einem das Gal/FLP-Fusionsgen enthaltenden Plasmid transformiert, dem das endogene 2 Mikron-Plasmid fehlte, und der zuvor durch Integration mit einem Plasmid transformiert worden war, das ein von "tandem repeats" des 2 Mikron-Hefeplasmids flankiertes heterologes Gen enthielt (Hartley und Donelson, Nature 286 (1980), S. 860-864, Senecoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), S. 7270-7274 und Andrews et al., Cell 40 (1985), S. 795-803). Falls die Gal/FLP-Fusion funktioniert, sollte der Stamm bei Vermehrung auf Glucose (die den GalI- Promotor supprimiert) das heterologe Gen exprimieren. Falls der Stamm jedoch auf Galactose vermehrt wird, sollte das heterologe Gen durch Rekombination aus dem Genom exzisiert werden, was zum Verlust des Gens führt (Fig. 4). Es zeigte sich, daß dies tatsächlich der Fall war, da auf Glucosemedium 97 % der Kolonien das heterologe Gen exprimierten, während auf Galactosemedium 0 % der Kolonien die Aktivität des heterologen Gens enthielten. Im Anschluß daran wurde in den Promotor, z. B. den GPDH-Promotor, zwischen die stromaufwärts gelegene Aktivierungssequenz und die Translationsstartstelle ein Expressionsblock eingefügt, z. B. eine DNA- Sequenz, die einen Transkriptionsblock wie das URA3 HindIII- Fragment enthielt, ein "silencer"-Bereich oder ein Transkriptionsterminator (Brand et al., Cell 21 (1985), S. 501-508). Dieses Transkriptionsblock-Element wird von DNA-Sequenzen (eingefügt als synthetische Oligonucleotide, wie in Tabelle 1 gezeigt) flankiert, von denen gezeigt werden konnte, daß sie von dem FLP-Genprodukt als Substrate für die ortsspezifische Rekombination erkannt werden (Senecoff et al., a.a.O., und Andrews et al., a.a.O.). Somit verläuft die Regulation über die Zugabe von Galactose zu einer wachsenden nicht durch Glucose reprimierten Hefekultur. Galactose induziert die Synthese des FLP-Proteins, das ein Rekombinationsereignis zwischen den den Expressionsblock flankierenden DNA-Sequenzen katalysiert. Das Rekombinationsereignis entfernt den Expressionsblock und gestattet dadurch die Expression des heterologen Gens, z. B. des Gens für FDPase, vom GPDH-Promotor (Fig. 5).
  • Solch ein von Rekombinationsstellen umgebener (in Fig. 6 gezeigter) Block wurde hinterlegt. Er kann vom Fachmann in einen Promotor seiner Wahl dadurch eingefügt werden, daß zuerst ein BglII/SalI-Linker an einer Stelle, die Expression gestattet, unter Verwendung ortsspezifischer Mutagenese (Zoller und Smith NAR 10 (1982), S. 6487-6500, Methods Enzymol. 100 (1983), S. 468-500, und DNA 3 (1984), S. 479-488) eingefügt wird und danach der Transkriptionsblock aus Plasmid AZ402 als BglII/SalI-Fragment eingefügt wird.
    • Tabelle 1 Sequenz der Stelle für die FLP-katalysierte ortsspezifische Rekombination
  • Dieses FLP-Expressionssystem kann zur Regulation der Expression praktisch jeden Gens in einer Reihe von Wirtszellen verwendet werden. Im allgemeinen kann die regulierte Expression einer heterologen DNA-Sequenz in einer Wirtszelle unter Verwendung eines Systems mit zwei Vektoren erreicht werden. Der erste Vektor enthält eine funktional mit einem regulierbaren Promotor verknüpfte DNA-Sequenz, die ein FLP- Protein codiert (FLP-DNA). AR900, der das FLP-Gen funktional mit dem GalI-Promotor verknüpft enthält, stellt ein Beispiel für solch einen Vektor dar. Ähnliche Vektoren, die andere Promotoren enthalten, können durch das Herausschneiden des GalI-Promotors aus AR900 mit EcoRI und SphI nach Standardverfahren und den Austausch gegen einen beliebigen gewünschten Promotor, ebenfalls unter Verwendung üblicher Techniken und, falls nötig, passender Linker konstruiert werden. Der zweite Vektor enthält die zu exprimierende heterologe DNA- Sequenz, die funktional mit einem Promotor verknüpft ist, der darin eingefügt einen Expressionsblock enthält, der von DNA-Sequenzen (flankierender DNA) flankiert ist, die von dem FLP-Protein erkannt werden. Solche Vektoren können auf übliche Weise unter Verwendung der SalI - BglII-Kassette aus AZ402 zusammen mit leicht erhältlichen und/oder synthetisierten Bausteinen konstruiert werden. Die SalI - BglII Kassette aus AZ402 enthält den URA3-Expressionsblock als HindIII-Fragment flankiert von FLP-erkannten Rekombinationsstellen. Unter Verwendung üblicher Verfahren und wiederum üblicher Linker, falls erforderlich, kann URA3 gegen andere Expressionsblöcke ausgetauscht werden. Der Expressionsblock, d. h. die SalI - BglII-Kassette aus AZ402, wird dann, falls nötig mit gebräuchlichen Linkern, in den Promotorbereich eines Vektors eingefügt, der die heterologe DNA-Sequenz funktional mit einem Promotor verknüpft enthält, so daß die Expression blockiert wird. Die geeignete Insertion kann durch die Beobachtung des Phänotyps der mit dem Vektor transformierten Zellen und/oder durch die Kontrolle des Kulturmediums auf Abwesenheit des Expressionsprodukts leicht empirisch bestätigt werden. Die Transformation einer Wirtszelle mit sowohl dem ersten als auch dem zweiten vorstehend beschriebenen Vektor ergibt ein Expressionssystem, bei dem das durch Expression der FLP-DNA im ersten Vektor hergestellte FLP-Protein eine Rekombination zwischen der flankierenden DNA des zweiten Vektors katalysiert, dadurch den Expressionsblock entfernt und die Expression der heterologen DNA-Sequenz gestattet. Natürlich sollten bei Verwendung einer bestimmten Wirtszelle die Vektoren die jeweiligen von dem betreffenden Wirt benötigten genetischen Elemente enthalten, so wie dies auf dem Fachgebiet bekannt ist.
  • Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren und regulierten Promotoren haben wir Hefestämme hergestellt, die sich durch höhere Raten der CO&sub2;-Erzeugung auszeichnen. Die Herstellung solcher Stämme erfolgte dadurch, daß in den Wirtsstamm (i) ein ATP-verbrauchender Leerlauf- Stoffwechselcyclus und in einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform (ii) eine erhöhte Aktivität der cytoplasmatischen ATPase eingeführt wurde.
    • Genetische Modifikation von Bäcker- und Bierhefestämmen
  • Bäcker- und Bierhefestämme stellen ein schwierigeres Substrat zur Transformation dar als Laborstämme, da sie polyploid sind und im allgemeinen keine auxotrophen Marker enthalten, die für die auf dem Fachgebiet gut bekannten Selektionsverfahren verwendet werden können.
  • Ein modifiziertes oder ein heterologes Gen/Promotor- Konstrukt, wie das nachstehend diskutierte, mit dem GPDH- Promotor verknüpfte FDPase-Gen kann jedoch in einen zum Backen verwendeten Hefestamm unter Verwendung dominanter Gene für Resistenz gegenüber Arzneistoffen, wie den Antipilzmitteln Gentamycin (G418) (Jiminez und Davies, Nature 287 (1980), S. 869) oder Hygromycin B (Gritz und Davies, Gene 25 (1983), S. 179-188) eingeschleust werden. Beispielsweise wird ein Aminocyclitolphosphotransferase (ACPT) codierendes Resistenzgen von dem bakteriellen Transposon TN601 getragen, das Resistenz gegenüber G418 verleiht, dessen Promotor jedoch schwach und daher für die Verleihung von Resistenz nur teilweise wirksam ist (Jiminez und Davies, a.a.O.). Der Promotor wird gegen einen Hefepromotor (z. B. den Hefe-Glyceraldehydphosphatdehydrogenase-Promotor) ausgetauscht. Im Anschluß daran wird ein Plasmid konstruiert, das das gewünschte Gen/Promotorkonstrukt mit seinen natürlichen chromosomalen flankierenden Bereichen zusammen mit dem vorstehend beschriebenen TN601 ACPT enthält. Dieses Plasmid enthält keinen Hefe-Replikationsstartpunkt. Der Bäckerhefestamm wird mit diesem Plasmid transformiert und Transformanten auf G418-Platten selektioniert. Das auf dem Plasmid gelegene ACTP kann nur dann stabil beibehalten werden, falls das Plasmid in das Hefegenom am natürlichen Genlocus eingefügt ist. Dies führt zu einer Tandemduplikation des Gens (z. B.FDPase), die durch das Plasmid und die ACPT-Sequenzen getrennt wird. Die Vermehrung dieser Transformanten in Abwesenheit von G418 erlaubt den Verlust des Plasmids durch "looping out", wobei entweder der "Wildtyp" oder die eingefügte Sequenz übrig bleiben. Danach werden diese gegenüber G418 empfindlichen Clone durch Southern-Hybridisierung der genomischen DNA unter Verwendung von Oligonucleotidsonden nach der Anwesenheit des heterologen Konstrukts unter Verwendung von Standardverfahren abgesucht.
    • (i) ATP-verbrauchende Leerlaufstoffwechselcyclen
  • Eine genetische Modifikation zur Erniedrigung des zellulären ATP-Spiegels besteht in der Verwendung eines normalen Stoffwechselwegs in einer anormalen Weise, um so ATP zu verbrauchen, so daß die Glykolyse angeregt wird. Vorzugsweise ist der gewählte Stoffwechselweg cyclisch, so daß seine anormale Verwendung nicht zu einer signifikanten Netto-Akkumulation oder der Verarmung eines bestimmten benötigten Stoffwechselintermediats, Substrats oder Produkts führt. Viele Stoffwechselwege in Hefe können abhängig von den Zuchtbedingungen und den Bedürfnissen der Zelle in entgegengesetzten Richtungen ablaufen. Zum Beispiel kann, je nachdem wie dies für die Zelle erforderlich ist, Metabolit "A" in Metabolit "B" oder "B" in "A" umgewandelt werden. Wenn man einen solchen Stoffwechselweg gleichzeitig in beiden Richtungen ablaufen läßt, führt dies weder zu einer Netto-Akkumulation noch zum Verlust von Metaboliten, es wird jedoch die rum Ablaufen der Stoffwechselwege erforderliche Energie verbraucht, und somit stellt dies einen "Leerlauf"- Cyclus dar. Natürlich können auch weitere Leerlaufcyclen, die zusätzliche Schritte beinhalten, verwendet werden (z. B. A → B → C → A). Transkriptionelle, translationale und posttranslationale Regulation kann zum An- oder Abschalten eines solchen Leerlaufcyclus Anwendung finden, bei dem in jeder Runde des Cyclus ein Molekül ATP verbraucht wird, ohne daß dabei irgendeine Nettoakkumulation des Produkts oder der Verlust des Substrats erzeugt wird. In Bäckerhefe wird bevorzugt die zur Erniedrigung des ATP-Spiegels und dadurch zur Anregung der Glykolyse erforderliche Stoffwechseländerung so reguliert, daß diese nur während der Teigsäuerung wirksam ist.
  • Ein bevorzugter Leerlaufcyclus zum Verbrauch von ATP ist: Fructose-6-phosphat → Fructose-1,6-diphosphat → Fructose-6-phosphat. Die an diesem Stoffwechselweg beteiligten Enzyme, Phosphofructokinase und Fructose-1,6-diphosphatase (FDPase oder FBPase) wurden ausführlich charakterisiert (Bloxham and Lardy, The Enzymes, Band 8 Herausgeber Boyer, Ph. D., (1973), S. 239-278; Uyeda, Adv. Enzymology 48 (1979), S. 193-244; Foy und Bhattachargee, Arch. Microbiol. 129 (1981), S. 215-220, und Funayama et al., (1979)). Durch die Clonierung des Gens für FDPase und durch den Austausch seines Promotors gegen einen regulierten Promotor, kann das Gen wie gewünscht exprimiert werden. Wir haben herausgefunden, daß die Expression dieses Gens während der Vermehrung auf Glucose ausreicht, um einen beträchtlichen Verlust an ATP und die dadurch bedingte Steigerung der Glykolyserate zu erreichen. Die Optimierung des FDPase-getriebenen Leerlaufcyclus setzt ein Verständnis für die natürliche Regulation von FDPase voraus. Der Klarheit halber wird die FDPase-Regulation kurz diskutiert.
    • FDPase-Regulation
  • Die Regulation der FDPase wurde von einer Reihe von Wissenschaftlern untersucht. Zur Verhinderung eines Leerlaufcyclus zwischen der Synthese und der Hydrolyse von Fructose-1,6-diphosphat in Wildtyp-Hefe wird dieses Enzym schnell inaktiviert, wenn zu Zellen, die auf nicht-vergärbaren Kohlenstoffquellen wachsen, Glucose zugegeben wird. Diese Inaktivierung der FDPase scheint in drei Stufen zu erfolgen. Eine anfängliche Hemmung der Aktivität des Enzyms wird durch eine allosterische Regulation erreicht (Lenz und Holzer, F.E.B.S. Lett. 109 (1980), S. 271-274, Wolf und Holzer, Transport and Utilization of Aminoacids, Peptides and Proteins by Microorganisms, Herausgeber Payne, J.W., John Wiley, Chinchester (1980), Tortora et al., Biochem. Biophys.
  • Res. Comm. 100 (1981), S. 688-695). Wenn Glucose zu Hefezellen gegeben wird, steigt die Konzentration von Fructose-2,6- diphosphat innerhalb von Sekunden von nicht nachweisbaren Spiegeln auf Konzentrationen von mehreren 4M an, was ausreicht, um FDPase partiell zu hemmen. Die Mechanismen, die die Synthese von Fructose-2,6-diphosphat regulieren, sind nicht klar (Gancedo et al., J. Biol. Chem. 258 (1983), S. 5998-5999). Nach der anfänglichen schnellen Hemmung tritt über einen Zeitraum von mehreren Minuten eine zweite Phase ein, die die Phosphorylierung der FDPase beinhaltet (Müller und Holzer, Biochem. Biophys. Res. Comm. 103 (1981), S. 926-933, Tortora et al., a.a.O., Purman et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 107 (1982), S. 1482-1489). Der Phosphorylierungsstatus von FDPase wird durch eine spezifische Kinase und eine spezifische Phosphatase reguliert. Die Phosphorylierung erfolgt an einem bestimmten Serinrest (Müller und Holzer, a.a.O, Mazon et al., J. Biol. Chem. 257 (1982), S. 1128-1130). Die modifizierte FDPase ist weniger aktiv als das unmodifizierte Enzym. Schließlich scheint das phosphorylierte Enzym ein Substrat für eine spezifische Protease darzustellen, die während eines Zeitraums von ungefähr 1 Stunde eine irreversible Inaktivierung der FDPase katalysiert.
  • Genetische Modifikationen zur Regulation von FDPase Es gibt verschiedene genetische Verfahren, die zur Hemmung dieser Inaktivierung von FDPase anwendbar sind. Mutanten, die kein Fructose-2,6-diphosphat synthetisieren, bzw. die eine FDPase besitzen, die den Inhibitor nicht bindet, hemmen am Anfang der Inaktivierungskaskade. Durch ortsspezifische Mutagenese des Serins, das ansonsten phosphoryliert wird, erhält man ein Enzym, das gegenüber dem zweiten und dritten Schritt umempfindlich ist. Etwas Enzymaktivität ist nach der anfänglichen partiellen Hemmung durch Fructose- 2,6-diphosphat noch vorhanden (Lenz und Holzer, a.a.O., Wolf und Holzer, a.a.O., Tortora et al., a.a.O.) Diese Enzymaktivität ist ausreichend, um ein deutliches Ablaufen des Leerlaufstoffwechselwegs zu bewirken.
  • Wir konnten die Phosphorylierungsstelle (Ser&sub1;&sub2;) in FDPase bestimmen, da dies die einzige auf dem clonierten FDPase-Gen vorhandene Konsensus-Erkennungsstelle für cAMP- abhängige Proteinkinasen ist (Arg&sub9;·Arg&sub1;&sub0;·Asp&sub1;&sub1;·Ser&sub1;&sub2;), und diese durch übliche ortsspezifische Mutagenese leicht ändern (Zoller und Smith, a.a.O.). Wir haben herausgefunden, daß zur Verhinderung der Phosphorylierung ein Aminosäureaustausch des Serins ausreicht, um genügend Enzymaktivität zu erzeugen und so ein Durchlaufen des Leerlaufstoffwechselwegs auf einem beträchtlichen Niveau zu bewirken. Das Enzym wird jedoch auch durch hohe Konzentrationen von AMP gehemmt (Taketa und Pogell,. J. Biol. Chem. 240 (1965), S. 651-662). Zur weiteren Optimierung kann das Enzym (das aufgrund des Austauschs an Ser&sub1;&sub2; bereits etwas resistent gegenüber AMP- Hemmung ist) außerdem an seiner AMP-Bindungsstelle zur Beseitigung dieser Hemmung geändert werden. Die Bindungsstelle auf dem Enzym für AMP wurde beschrieben. Zur Erzielung einer erhöhten enzymatischen Aktivität bezüglich des Leerlaufstoffwechselwegs kann diese Stelle in vitro mutiert, erneut in Hefe eingeschleust und der Verlust der Hemmung durch AMP indirekt bestimmt werden. Eine mutierte Form des Enzyms, die nicht mehr durch AMP gehemmt wird, gestattet eine normale Vermehrung der Hefe auf Platten mit einer gluconeogenetischen Kohlenstoffquelle, jedoch nur ein schwaches Wachstum auf Glucose und erlaubt somit einen einfachen Nachweis solch einer Modifikation.
  • Da die an diesem Leerlaufstoffwechselcyclus beteiligten Enzyme eigentlich die Hauptproteine in Hefe darstellen, reicht dieser Stoffwechselweg zum Verbrauch einer beträchtlichen Menge ah ATP aus. Die Anregung der Glykolyse kann durch Veränderung der Kopienzahl des veränderten Fructosediphosphatase-Gens, der Stärke des Promotors oder des in dem Expressionsvektor mit FDPase bzw. einer FDPase-Variante verwendeten Promotors wie beschrieben fein abgestimmt werden, wobei jeder gewünschte Spiegel der CO&sub2;-Ausbeute erhalten wird.
    • Alternative Leerlauf-Stoffwechselcyclen
  • Es gibt eine überraschend große Anzahl alternativer Leerlauf-Stoffwechselcyclen, die zum Verbrauch von ATP eingesetzt werden können. Die Umwandlung von Phosphoenolpyruvat zu Pyruvat durch Pyruvatkinase kann z. B. umgekehrt werden (Katz, J. und Rognstad, R., Cur. Top. Cell. Reg. 10 (1976), 237-289 und Reeves, R.E., Biochem. J. 125 (1971) S. 531). Alternativ dazu existieren viele weitere Leerlaufstoffwechselcyclen, die ATP verschwenden, dazu gehören jene, die bei der Aminosäurebiosynthese und dem -Abbau, der Polyphosphatsynthese und dem -Abbau, der Fettsäurebiosynthese und der Pyrimidinbiosynthese anzutreffen sind. Da diese alle strikt auf dem Transkriptionsniveau reguliert sind, kann ein Leerlaufstoffwechselzyklus durch die Veränderung der Regulation der beteiligten Enzyme durch Änderung ihrer Promotoren induziert werden. Solche Zyklen besitzen jedoch zusätzliche Regulationsmechanismen. Im allgemeinen beinhaltet die zusätzliche Regulation eine Rückkopplungs-Hemmung oder eine allosterische Modulation der Enzymfunktion durch Zwischenprodukte oder Produkte des Energiestoffwechsels. Falls erwünscht, können solche allosterischen Bindungsstellen modifiziert werden, um dadurch eine allosterische Hemmung zu eliminieren oder zu erniedrigen analog zu den hierin beschriebenen Verfahren wie in dem zur Veranschaulichung dienenden Fall von FDPase. Zu weiteren Arten der Regulation gehören die Absonderung von einem der Enzyme in ein Organell, in dem die Verfügbarkeit des Substrats reguliert werden kann, oder im Einfangen eines instabilen Zwischenprodukts in einem Enzymkomplex, was diesem die schnelle Umwandlung in ein stabiles Zwischenprodukt erlaubt. All diese Stoffwechselwege stellen potentielle induzierbare ATP-hydrolysierende Prozesse dar, und können daher über eine geeignete genetische Modifikation zum Verbrauch von ATP verwendet werden.
  • Falls erwünscht, kann die Menge des von der modifizierten Zelle verbrauchten ATP zur Maximierung der CO&sub2;- und Ethanolerzeugung reguliert werden. Dies kann durch die Verwendung eines stärkeren oder schwächeren Promotors oder durch die Modulation von dessen Aktivität erreicht werden, oder durch die Verwendung eines temperaturempfindlichen Regulationsgens, bei dem das Ausmaß der Regulation, wie vorstehend beschrieben, von der Temperatur der Kultur abhängt.
    • (ii) Einführung einer cytoplasmatischen sauren Phosphatase mit gesteigerter Aktivität
  • Eine alternative Modifikation zur Regulation der Glykolyserate beinhaltet die Erzeugung einer cytoplasmatischen sauren Phosphatase, um so organische Phosphate einschließlich ATP zu hydrolysieren. Die normalerweise extrazelluläre saure Phosphatase der Hefe Saccharomyces cerevisiae stellt eine induzierbare, unspezifische, im Periplasma lokalisierte Phosphatase dar. Das Gen für dieses Enzym wurde kürzlich cloniert und charakterisiert (siehe Rogers et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 79 (1982), S. 2157-2161). Die Vermeidung der Sezernierung von Phosphatase in das Periplasma der Zelle (z. B. durch genetische Modifikation, bei der der sekretorische Leader des Enzyms entfernt wird), führt zu einer Dephosphorylierung organischer Phosphate im Cytoplasma einschließlich ATP. Diese unspezifische Phosphatase dephosphoryliert jedoch auch andere wichtige organische Phosphate, wodurch schwere Schäden im Stoffwechsel der Zelle hervorgerufen werden. Das Niveau an "gefangener" cytoplasmatischer Phosphatase muß daher strikt reguliert werden. Es stellte sich z. B. heraus, daß der natürliche Promotor für die saure Phosphatase der Hefe (PHO5), falls dieser zur Erzielung einer Steigerung der Glykolyserate voll induziert ist, zu viel ATPase-Aktivität exprimiert. Zur Erzielung eines regulierten Verfahrens zur ATP-Hydrolyse durch eine cytoplasmatische saure Phosphatase wird bevorzugt ein schwächerer Promotor verwendet, so daß die gewünschte Wirkung bei voller Induktion eintritt, oder es wird der Grundspiegel eines induzierbaren Promotors wie nachstehend beschrieben, angewandt. Dies kann auf verschiedene Arten erreicht werden, Beispiele dafür wurden vorstehend beschrieben.
    • (iii) Modifikation der Funktion der Plasmamembran
  • Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft die ATPase der Plasmamembran, die mehr als ein Drittel des durch Gärung erzeugten ATP zur Regulation der Ionenkonzentration im Cytoplasma verwendet. Dies stellt den Hauptstoffwechselweg zur ATP-Hydrolyse in der Zelle dar, die Anregung dieses Stoffwechselwegs kann somit zur Erniedrigung des zellulären ATP-Spiegels und dadurch zur Anregung der Gärung (d. h. der Ethanol- und Kohlendioxiderzeugung) verwendet werden.
  • Es deutet einiges darauf hin, daß einige Arzneistoffe, die auf die Plasmamembran-Protonenpumpe einwirken, die Zelle zur Anregung der Gärung induzieren (Serrano, Eur. J. Biochem. 105 (1980), S. 419). Die nachgewiesene Anregung ist sehr gering. Es scheint, daß die Bedeutung dieses Befunds übergangen und einfach als innerhalb der experimentellen Fehlergrenze liegend abgetan wurde. Die Gründe für diese Anregung sind nicht vollständig klar, da weitere Arzneistoffe (d. h. Dicyclohexylcarbodiimid und Diethylstilbestrol), die ebenfalls den Plasmamembran-Protonengradienten unterbrechen, keine Anregung der Gärung bewirken. Eine durch diese Arbeit gestützte Erklärung wäre, daß Dicyclohexylcarbodiimid und Diethylstilbestrol die Plasmamembran-ATPase hemmen und daher die zellulären ATP-Spiegel nicht erniedrigen. Eine beträchtliche Schädigung des allgemeinen Zellstoffwechsels kann außerdem durch die Störung weiterer ATP- abhängiger Membranfunktionen bewirkt werden. Die Wirkung von Dinitrophenol scheint auf einer direkten Unterbrechung des Protonengradienten durch die Plasmamembran zu beruhen. Dies regt die Plasmemembran-ATPase an und kann dadurch die Spiegel an zellulärem ATP erniedrigen.
  • Ein alternatives Verfahren zur Anregung der Plasmamembran-ATPase wäre die Verwendung kleiner Proteine, wie Ribonuclease (Alper et al., J. Bact. 93 (1967), S. 759-765, Yphantis et al., J. Bact. 94 (1967), S. 1509-1515) oder Hefekillertoxin (Bussey und Sherman, Biochimica et Biophysica Acta 298 (1973), S. 868-875).
  • Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, die lediglich exemplarisch sind, näher veranschaulicht. Dies sollte nicht als Einschränkung des wirklichen Schutzumfangs der Erfindung, der in den Ansprüchen wiedergeben ist, aufgefaßt werden.
    • Experimentelle Beispiele Materialien
  • Alle DNA-Restriktions- und Stoffwechselenzyme wurden von New England Biolabs bezogen. Diese Enzyme wurden außer Mungbean-Exonuclease, die von PL Biochemicals bezogen und wie beschrieben verwendet wurde, unter den von New England Biolabs beschriebenen Bedingungen und Puffern angewandt. ATP und die Desoxynucleosidtriphosphate (dNTP's), d. h. dATP, dGTP, dCTP und dTTP wurden von PL Biochemicals und 32 P) von New England Nuclear Corporation bezogen.
  • Die Ligierungsreaktionen wurden, wie von Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)) beschrieben, auf dessen Offenbarungsgehalt hiermit Bezug genommen wird, unter der Verwendung der dort auf Seite 246 beschriebenen Puffer und unter Verwendung einer DNA-Konzentration von 1-100 ug/ml bei einer Temperatur von 23ºC für DNA mit glatten Enden und 16ºC für DNA mit überstehenden Enden durchgeführt. Die Elektrophorese wurde in 90 mM Tris-Borat, 10 mM EDTA enthaltenden 0,5 bis 1,5 % Agarosegelen durchgeführt.
  • Nach der DNA-Spaltung wurden die Restriktionsenzyme durch 10-minütiges Erhitzen auf 65ºC inaktiviert. Bei der Durchführung aufeinanderfolgender Reaktionen wurde nach jedem Schritt die DNA mit 70 % Ethanol präzipitiert. Nach dem Auffüllen einer Restriktionsstelle durch die Reaktion mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase (Klenow) und den vier dNTP's wurde das Reaktionsgemisch auf 10 mM Magnesiumchlorid eingestellt und das gleiche Volumen an 5 M Ammoniumacetat zugegeben. Die DNA wurde mit 2 Volumina Ethanol bei -20ºC gefällt und die DNA durch 10minütige Zentrifugation in einer Eppendorf-Microfuge bei 4ºC pelletiert. Ethanol wurde abgegossen und das Pellet in 10 ul 0,2 M Natriumacetat/ug DNA gelöst. Die DNI wurde mit 2 Volumina Ethanol erneut gefällt und wie vorstehend beschrieben, zentrifugiert. Bevor mit dem nächsten Herstellungsschritt weitergemacht wurde, wurde das DNA-Pellet unter Vakuum getrocknet. Synthetische Oligonucleotide wurden wie in Maniatis et al., a.a.O., beschrieben kinasiert, durch Erhitzen auf 65ºC aneinandergelagert und vor ihrer Verwendung langsam auf 4ºC abgekühlt.
    • DNA-Herstellung und Transformation
  • Die Reinigung von "super coiled"-Plasmid-DNA aus E. coli und die Transformation von E. coli erfolgte wie in Maniatis et al., 1982, a.a.O., beschrieben. Die Transformation von Hefe erfolgte wie von Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75 (1978), S. 1929-1933 beschrieben, außer daß anstelle von 1,0 M 1,2 M Sorbit verwendet wurde. Die Plasmidherstellung im kleinen Maßstab zum Screening transformierter Bakterien erfolgte im wesentlichen nach Maniatis et al., (1982), a.a.O., und Holmes und Quigley, Anal. Biochem. 14 (1981), S. 193, außer daß nach der Restriktionsenzymspaltung durch die Zugabe von 1 ul einer Lösung von 1 mg/ml RNAse (Boehringer Mannheim) in die Kammer des Agarosegels kurz vor der Elektrophorese eine RNAse-Spaltung durchgeführt wurde.
    • Stämme und Medien
  • Für alle bakteriellen Transformationen wurde der E. coli-Stamm HB101 verwendet. Die Hefestämme DB745 (Botstein et al., Gene 8 (1979), S. 17-24), KYII4 oder ATCC 26675 wurden verwendet. E. coli wurde in LB-Medien mit oder ohne Ampicillin (49 ug/ml) wie beschrieben (Maniatis et al., (1982), a.a.O.) gezüchtet. Vor der Transformation wurde Hefe bei 30ºC in 1 % Hefeextrakt (Difco), 1 % Bacto-Peptone (Difco) und 2 % Glucose enthaltenden Medien gezüchtet. Hefeminimalmedium enthielt 5 g Ammoniumsulfat, 10 g Glucose, 40 mg Adenin, 60 mg Leucin, 2 ug Biotin, 400 ug Calciumpentothenat, 2 ug Folsäure, 2 ug Inosit, 400 ug Niacin, 100 ug p- Aminobenzoesäure, 400 ug Pyridoxin-Hydrochlorid, 500 ug Borsäure, 40 ug Kupfersulfat, 100 ug Kaliumjodid, 200 ug Natriummolybdat, 400 ug Zinksulfat, 500 mg Magnesiumsulfat, 100 mg Natriumchlorid, 100 mg Calciumchlorid und 1 g (Hochphosphatmedium)- oder 10 mg (Niedrigphosphatmedium) -Kaliumphosphat (monobasisch) pro Liter. Zur Induktion des Promotors für saure Phosphatase wurden die Zellen bei 30ºC auf Hochphosphat-Hefeminimalmedium vorgezüchtet, durch Waschen das Phosphat entfernt und diese dann in Niedrigphosphat-Hefeminimalmedium überführt, um dann die Vermehrung bei 30ºC wieder aufzunehmen. Maximale Induktion trat 8 bis 12 Stunden nach Überführung ein.
  • Bei dem für die Dinitrophenolexperimente verwendeten Hefestamm handelte es sich bei dieser Untersuchung um "Fleischman's active dry yeast". Die Hefe wurde in 1 % Hefeextrakt (Difco), 1 % Bactopepton (Difco), 0,05 M Di-Kaliumphosphat enthaltendem und mit Citronensäure auf pH 5,6 titriertem CO gezüchtet. Die Medien wurden in 15 Liter-Flaschen in jeweils 10 Liter-Chargen hergestellt und 2 Stunden bei 121ºC autoklaviert. Nach dem Abkühlen wurde sterile Glucose bis zu 2 Gew. -% zugegeben. Zur Vermeidung von Schaumbildung wurde alle 24 Stunden Antischaummittel zugegeben. Kurz vor dem Anschließen der Medienzuführung an den Chemostaten und das Kulturgefäß wurde Dinitrophenol direkt zu der 15 Liter-Flasche mit dem Medium gegeben, um so in der Medienzuführung dieselbe Konzentration herzustellen. Dinitrophenol wurde als Stammlösung in Ethanol zubereitet. Vor Inoculation des Chemostaten wurden die Zellen über Nacht in CO gezüchtet. Die Chemostatkultur wurde in einem New Brunswick Scientific Modell F-2000 gezüchtet. Das Kulturgefäß wurde durch die Anbringung eines Seitenarms so angepaßt, daß sich ein Arbeitsvolumen von 1 Liter ergab. Die verbrauchte Kultur ließ man mit Hilfe einer untergetauchten offenen Röhre aus dem Gefäß herausfließen, um so den Verlust von Antischaummittel, das dazu neigte, an der Oberfläche der Kultur zu bleiben, zu verhindern.
  • Der Fermenter wurde bei 30ºC und einer Rühreinstellung von 4 betrieben. Stickstoff wurde mit einer Geschwindigkeit von 500 cc/min kontinuierlich durch das Gefäß geleitet. Das abgeleitete Gas wurde durch eine Feuchtigkeitsfalle von Dry-Rite und zur Messung des Kohlendioxids in ein Massenspektrometer-Gasanalysegerät von Perkin Elmer geleitet.
  • In der kontinuierlichen Kultur wurden die Medien unter Verwendung einer Pharmacia-Pumpe Modell M3 mit einer Geschwindigkeit von 250 ml/h zugegeben. Bei der Durchführung der Kohlendioxidmessungen wurden alle Einstellungen, Volumina und Temperaturen überprüft und, falls erforderlich, nachgestellt. Es zeigte sich, daß die Medienzugabe, die Temperatur und die Rührgeschwindigkeit ziemlich stabil waren, die Stickstoffgaszugabe jedoch innerhalb eines Zeitraums von 4 Stunden in einem Bereich von 10 % schwankte. Deshalb wurde der Abfluß aus dem Gasanalysegerät in einen Diagrammschreiber geleitet und die Durchflußrate des Stickstoffs von Hand während eines Zeitraums von 2 Stunden eingestellt. Bevor Messungen der Zelldichte in der Kultur durchgeführt wurden, wurden während dieses Zeitraums die Durchflußgeschwindigkeit des Stickstoffs und das Kohlendioxidniveau in dem abgeleiteten Gas auf Stabilität überprüft. Somit konnte gezeigt werden, daß die Kultur vor der Durchführung von Messungen innerhalb der Nachweisgrenzen stabil war. Dies bestätigte sich auch durch die Reproduzierbarkeit der Daten. Die Kulturdichte wurde nach 10-facher Verdünnung der Kultur in Wasser in einem Bausch and Lomb-Modell Spectronic 20 bei 600 nm bestimmt.
    • Vektorkonstruktion
  • Um die Größe des Expressionsplasmids möglichst gering zu halten und die Anzahl der Restriktionsstellen zu reduzieren, wurde ein Plasmid konstruiert, das das Uracil 3-Gen (URA3) als Markergen und den 2 u Replikationsstartpunkt enthielt. Alternativ können auch andere Hefeplasmide, wie YEP24, YEP13 oder ähnliche verwendet werden (Parent et al., siehe oben). Unser Plasmid stammte von YIp5 (Botstein et al., siehe oben), dem ein den Replikationsstartpunkt des 2 u Hefeplasmids enthaltendes HaeIII/HpaI-Fragment zugefügt worden war. Das Plasmid YOp1 (Fig. 7) wurde durch die Einfügung des 2 u Replikationsstartpunkts in die EcoRI-Stelle von YIp5 konstruiert. Plasmid DNA aus YEp24 (Botstein et al., a.a.O.) wurde mit den Restriktionsenzymen HaeIII und HpaI gespalten und die DNA ,auf einem präparativen 1,0 % Agarosegel laufen gelassen. Das den 2 u Replikationsstartpunkt enthaltende 1,4 kb-Fragment wurde durch Vergleich mit dem Laufmuster von Nolekulargewichtsmarkerfragmenten bestimmt und in eine in die Agarose geschnittene Kammer elektroeluiert. Zur Reinigung des DNA-Fragments wurde der Puffer aus der Kammer über eine DEAE-Sephacelsäule laufen gelassen (Maniatis et al, a.a.O.). Plasmid YIp5 wurde mit EcoRI gespalten und die überstehenden Enden unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase 1 und aller vier dNTP's aufgefüllt. Das HaeIII/HpaI- Fragment aus YEp24 wurde in die aufgefüllte EcoRI-Stelle von YIp5 ligiert (Fig. 7). Das Ligierungsgemisch wurde in HB101 transformiert und die so erhaltenen Ampicillin-resistenten Kolonien auf die Anwesenheit des 2u-Replikationsstartpunkt- Fragmentes abgesucht. Da eine mit einer HaeIII-Stelle ligierte aufgefüllte EcoRI-Stelle wieder eine EcoRI-Stelle ergibt, konnte die Orientierung des Fragments durch Kartierung der erhaltenen EcoRI-Stelle gegenüber Restriktionsstellen auf dem Plasmid bestimmt werden. Ein Plasmid mit der EcoRI- Stelle proximal zur PstI-Stelle innerhalb des Gens für Ampicillinresistenz (YOp1) wurde für die nachfolgenden Konstruktionen verwendet.
    • Beispiel 1 Durch Leerlaufstoffwechsel bewirkter Verlust von ATP Isolierung des Gens für Fructose-1,6-diphosphatase
  • Das Gen für FDPase wurde durch Komplementierung einer Deletionsmutante für FDPase in E. coli (Stamm DF657, CGSC Nr. 6695) isoliert. Eine Plasmidgenbank von genomischer Wildtyp-Hefe-DNA in einem pBR322-Plasmidvektor wurde in DF657 transformiert und auf Antibiotikaresistenz selektioniert. Ein das Hefe-FDPase-Gen tragendes Plasmid wurde aufgrund seiner Eigenschaft, den Bakterien Wachstum auf einer durch Gluconeogenese abbaubaren Kohlenstoffquelle zu gestatten, bestimmt. Der Hefe-FDPase-Clon wurde unter Verwendung des Didesoxynucleotid-Sequenzierungsverfahrens von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), S. 5463-5467 seguenziert (Fig. 8). Der Vergleich der von der DNA-Sequenz abgeleiteten Aminosäuresequenz von Hefe-FDPase ergab mehr als 50 % Homologie mit der Aminosäuresequenz der gereinigten Schweine-FDPase (Marcus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), S. 7161-7165, (Fig. 9) und bestätigte so die Identifizierung des richtigen Hefeclons.
  • Da zur Vermeidung einer vorzeitigen Vergeudung von ATP ein Leerlaufstoffwechselzyklus sorgfältig reguliert werden muß, bestand die erste Anpassung des natürlichen FDPase- Gens im Austausch seines Promotors gegen eine Sequenz, die während der Gärung reguliert werden konnte. Durch die Bestimmung der Restriktionsstellen der DNA-Sequenzen von Hefe- FDPase konnte eine NdeI-Stelle sehr nahe am Beginn des codierenden Bereichs bestimmt werden (Fig. 10). Über in-vitro- Mutagenese wurde das 5'-Ende des Clons durch die Umwandlung der NdeI-Stelle zu einer SphI-Stelle für die Expression von einem heterologen Hefepromotor angepaßt. Das FDPase-Gen wurde zuerst in pBR322 subcloniert, wobei Plasmid AR705 (Fig. 10) erzeugt wurde. Plasmid AR705 wurde mit NdeI gespalten und mit Mungbean-Exonuclease behandelt. Ein Adapter, der vier von sechs Basenpaaren einer SphI-Stelle an einem Ende und einen XhoI-Überhang am anderen Ende enthielt, wurde in das Plasmid ligiert, mit XhoI gespalten und das Plasmid unter Verwendung von T4 DNA-Ligase geschlossen, wobei Plasmid AT823 (Fig. 10) erzeugt wurde. Das Ligierungsgemisch wurde in Bakterien transformiert und Ampicillin-resistente Kolonien auf die Anwesenheit von SphI- und XhoI-Stellen abgesucht.
  • Das FDPase-Gen im Plasmid AT823 wurde mit dem Promotor des Gens für Glyceraldehydphosphatdehydrogenase (GAP491) [Holland und Holland, J. Biol. Chem. 255 (1980), S. 2596-2605] wie folgt ligiert. Das von Plasmid M903 abstammende Plasmid 0605 (Fig. 13) wurde mit KpnI gespalten, mit dem Klenow-Fragment der DNA PolI behandelt und mit HindIII gespalten. Plasmid AT823 wurde mit SphI gespalten, mit dem Klenow-Fragment der DNA Poll behandelt und mit HindIII gespalten. Das 3,8 kb SphI/HindIII-Fragment wurde isoliert und in HindIII/KpnI-gespaltenes O605 ligiert, wobei Plasmid AU125 erzeugt wurde. Die Expression des FDPase-Gens im Plasmid AU125 wird nun vom GPDH-Promotor reguliert.
    • FDPase-Nutagenese
  • Das Plasmid, das die FDPase mit dem heterologen Promotor enthält, wurde in Hefe transformiert und die Transformanten auf Expression des FDPase-Clons getestet. Die FDPaSe- Aktivität war bei Aufzucht der Zellen unter induzierenden Bedingungen auf einer durch Gluconeogenese oder Glykolyse abbaubaren Kohlenstoffquelle nachweisbar. Man kann davon ausgehen, daß bei der Vermehrung mittels Gärung allosterische Inhibitoren und Enzyminaktivierung die Enzymaktivität erniedrigen.
  • Da die Inaktivierung durch die Phosphorylierung eines serinrestes vermittelt wird, besteht eine erfindungsgemäße Änderung des Strukturgens in der Eliminierung dieser Phosphorylierungsstelle. Der phosphorylierte Serinrest wurde als Rest 12 bestimmt (die einzige cAMP-abhängige Erkennungsstelle für Proteinkinase in der Sequenz, und durch Peptidkartierung des gereinigten phosphorylierten Enzyms und Aminoäuresequenzierung des phosphorylierten Peptids (Rittenhouse et al., J. Biol. Chem. 261 (1986), S. 3939-3943).
  • Es konnte kürzlich gezeigt werden, daß durch die Durchführung einer milden Trypsinspaltung bei Leber-FDPase eine aminoterminale Deletion erzeugt werden konnte, die ihre Aktivität beibehielt (Chatterjee et al., 1985). FDPasen aus Säugern und Hefe zeigen einen hohen Konservierungsgrad. Es wurde eine aminoterminale Deletion des Hefeenzyms hergestellt und die Aktivität getestet.
  • Fructose-1,6-diphosphatase (FDPase) wurde von der auf der DNA-Sequenz innerhalb des Aminoterminus des Gens vorhandenen EcoRV-Restriktionsstelle an den Hefe-GPDH-Promotor angefügt (Fig. 12, AX4). Dies ergab eine aminoterminale Deletion bis zu Rest 19, der die Erkennungsstelle für Proteinkinase fehlte.
  • Außerdem wurde Serin (Rest 12) unter Verwendung ortsspezifischer Mutagenese in ein Alanin umgewandelt (Zoller und Smith, a.a.O.). Dabei handelt es sich um einen konservativen Austausch, bei dem man davon ausgeht, daß er zwar die Aktivität des nicht-phosphorylierten Proteins nicht beeinflußt, jedoch die Phosphorylierung des Enzyms verhindert. Das Serin hätte außerdem unter Verwendung ortsgerichteter Mutagenese in Threonin, Valin, Cystein oder eine andere Aminosäure umgewandelt werden können (Fig. 13). Dies wurde durch Clonierung des um diesen Rest gelegenen Teils der Sequenz in M13, ein einzelsträngiges DNA-Virus, erreicht. Es wurde ein synthetisches Oligonucleotid hergestellt, das mit diesem Bereich der DNA hybridisierte, jedoch an dem Serinrest eine solche Fehlpaarung aufwies, daß die Sequenz ein verändertes Codon enthielt. Von diesem Hybrid wurde unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase PolI ein doppelsträngiges Molekül erzeugt. Die Reaktion wurde in Gegenwart aller vier Desoxynucleotidtriphosphate und DNA-Ligase durchgeführt. Danach wurde diese hybride doppelsträngige DNA in Bakterien cloniert, repliziert, erneut gereinigt und erneut in Bakterien transformiert, um so die beiden Stränge zu trennen. Die eine Hälfte der Nachkommenschaft enthält die Sequenz für Serin, die andere Hälfte enthält die gegen Alanin oder ein anderes Codon nach Wahl ausgetauschte Sequenz. Diese konnten durch Hybridisierung mit einem kurzen Oligonucleotid (17 bp), das komplementär zu der ersetzten Sequenz war, unterschieden werden. Danach wurde dieses substituierte Gen wie vorstehend beschrieben wieder in einen GPDH-Expressionsvektor mit hoher Kopienzahl eingesetzt und in einen Hefelaborstamm, z. B. KY114, transformiert.
  • Um die Glykolyserate zu messen, wurden Hefekulturen, die FDPase-Clone vom Glyceraldehydphosphatdehydrogenase (GPDH)-Promotor exprimierten, in kleinen 1 Liter-Fermentern untersucht. Es wurden Batch-Kulturen gezüchtet und Stickstoff bei 110 ml/min. durch die Kultur durchgeblasen. Kohlendioxid und die Zelldichte wurden in regelmäßigen Abständen gemessen.
  • Zu Beginn wurden Hefekulturen, die das Wildtyp-Enzym (Plasmid AU125) und die aminoterminale Deletion (Plasmid AX4) exprimierten mit einem Kontrollplasmid verglichen, das eine nicht-exprimierte FDPase enthielt (Plasmid AU110) (Fig. 14). Der von den Kulturen zu Beginn des Wachstumscyclus erzeugte Kohlendtoxidspiegel ist sehr ähnlich. Gegen Ende des Wachstumscyclus wurden jedoch bedeutend höhere CO&sub2;-Spiegel erzeugt. Die Steigerung der Kohlendioxidausbeute ist bei dem Stamm, der die aminoterminale FDPase-Deletion trägt, geringer als bei jenem, der das Wildtyp-Enzym exprimiert. FDPase scheint jedoch in diesem Hefestamm nicht inaktiviert zu sein und die aminoterminale Deletion besitzt eine deutlich geringere spezifische Aktivität als das "Wildtyp"-Enzym. Man hätte somit erwartet, daß das Wildtypenzym zu einer größeren Anregung der Glykolyse als das die Deletion enthaltende Enzym geführt hätte. Interessanterweise steigt die Kohlendioxidausbeute lediglich gegen Ende des Wachstumscyclus an. Dies deutet darauf hin, daß während der exponentiellen Wachstumsphase FDPase allosterisch reguliert wird. Die wahrscheinlichsten Kandidaten für diese Regulation sind Fructose-2,6-diphosphat oder AMP.
  • Nachdem spezifische Punktmutanten an der Phosphorylierungsstelle der FDPase erzeugt worden waren, wurden die Gärungsexperimente wiederholt. In diesen Experimenten wurden der Stamm ATCC 26675 untersucht, der FDPase, die eine Mutation von Serin nach Alanin enthält, vom GPDH-Promotor exprimiert (Plasmid BA601) bzw. ein Kontrollplasmid, bei dem FDPase nicht exprimiert wird (Plasmid BA802). Es zeigte sich, daß unter den vielen untersuchten Hefestämmen der Stamm ATCC 26675 den höchsten Inaktivierungsgrad ergab. Diese Kulturen sollten somit eine vorsichtige Schätzung der möglichen Steigerung bei der Gasentwicklung erlauben.
  • Die Gärungen wurden wie zuvor durchgeführt und Kohlendioxid und Zelldichte gemessen. Die Kohlendioxidausbeute stieg in dem FDPase exprimierenden Stamm gegen Ende des Wachstumscyclus wieder an (Fig. 16). Das Gärungsexperiment wurde wiederholt und ergab gute Reproduzierbarkeit. Die Kulturen wurden gegen Ende des Wachstumscyclus geerntet, zentrifugiert und unter Verwendung des nachstehend beschriebenen Gasentwicklungstests untersucht.
  • Gasentwicklungstests wurden in dem in Fig. 16 gezeigten Gerät durchgeführt. Der Kolben enthielt 1 g Zellen, 1 g Glucose und 10 ml Medium (Hefe-Stickstoffbase, Difco) und hatte einen End-OD-Wert bei 600 nm von 12. Alle Lösungen wurden bei 32ºC gehalten. Das Wasserbad hatte ebenfalls 32ºC. Das Rohr a war-während der ersten 10 Minuten, nachdem der Kolben in das Wasserbad gestellt worden war, offen. Die Messungen der CO&sub2;-Entwicklung erfolgten in regelmäßigen Zeitabständen durch Verschließen des Rohrs a und das Messen der Menge an CO&sub2;, die sich in der Bürette X entwickelte, nachdem der Flüssigkeitsspiegel in Bürette Y auf den von Bürette X eingestellt war, um so das Gas in Bürette X auf Atmosphärendruck zu bringen. Die Messungen wurden solange durchgeführt bis 100 ml CO&sub2; erzeugt worden waren. Die Rate der CO&sub2;-Erzeugung in dem die vorstehend beschriebenen Plasmide enthaltenden Stamm ist in Fig. 17 gezeigt. Bei dieser Untersuchung ergaben die Stämme, die die mutierte FDPase exprimierten, eine Steigerung der Fähigkeit zur Gasentwicklung von 25 %.
  • Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Modifikationen betrifft diese Erfindung weiterhin die Änderung der allosterischen Regulation der FDPase durch Fructose-2,6-diphosphat oder AMP.
  • Fructose-2,6-phosphat wird über einen enzymatischen Stoffwechselweg aus Fructose-6-phosphat durch das Enzym Fructose-6-phosphat-2-kinase synthetisiert (Clifton und Fraenkel, J. Biol. Chem. 258 (1983), S. 9245, und Pilkis et al., J. Biol. Chem. 259 (1949), S. 949).
  • Ein Verfahren zur Erniedrigung der Hemmung der Enzymaktivität beruht auf der Mutation der clonierten Kopie von FDPase in vitro (siehe z. B. Shortle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (1982), S. 1588) und diese auf einem selbstreplizierenden selektierbaren Hefeplasmid in die Zelle zurückzubringen und im Anschluß daran den Verlust des hemmenden Effekts vom Fructose-2,6-diphosphat und AMP zu überprüfen. In der Regel handelt es sich bei dem Verlust einer Bindungsstelle für einen allosterischen Inhibitor oft um eine ziemlich konservative Änderung in der Enzymstruktur, da man davon ausgeht, daß selbst eine leichte Modifikation der Bindungsstelle deren Affinität für Fructose-2,6-diphosphat stark ändert. Dieses Vorgehen erfordert einen guten Test für das veränderte Enzym. Da die FDPase unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors steht, sind unter induzierenden Bedingungen, wenn der Leerlaufstoffwechselcyclus effizient abläuft, auf einer vergärbaren Kohlenstoffquelle wachsende Mutantenkolonien sehr klein, unter nicht induzierenden Bedingungen besitzen die Kolonien jedoch normale Größe. Die vermuteten Mutantenkolonien werden außerdem auf einer durch Gluconeogenese abbaubaren Kohlenstoffquelle ausplattiert, wo sie unter induzierenden Bedingungen normal wachsen. Solche Methoden zum Absuchen der Kolonien können daher zum Nachweis des veränderten Enzyms verwendet werden.
  • Schließlich wurde die veränderte FDPase in einen zum Backen verwendeten Hefestamm nach den vorstehend beschriebenen Methoden eingeschleust. Es stellte sich heraus, daß die veränderte FDPase enthaltenden Bäckerhefen eine wesentlich gesteigerte Befähigung zur Teigsäuerung besitzen.
    • Beispiel 2 Expression cytoplasmatischer saurer Phosphatase Herstellung des APase-Promotorfragments
  • Das eine vollständige Kopie der großen Untereinheit des sauren Phosphatase-Enzyms, P60 (PHO5), enthaltende Plasmid YIpAPII (Rogers et al., (1982), a.a.O.) wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen kartiert. Dabei zeigte sich, daß HpaII ein 700 bp-Restriktionsfragment ergab, das 600 bp der DNA-Sequenz stromaufwärts des Initiator- (oder Start-)codons für das Strukturgen enthält, dessen Position auf dem Fragment anhand der Orientierung zu der ClaI-Stelle bekannt ist, (Thill et al., Molecular Cell Biology 3, (1983), S. 570-9). Plasmid JYpAPII wurde mit HpaII gespalten und die DNA auf einem präparativen 1,5 % Agarosegel laufengelassen.
  • Die den Promotor enthaltende 700 bp-Bande wurde wie vorstehend in eine in das Gel geschnittene Kammer elektroeluiert und über eine DEAE-Sephacelsäule gereinigt. Das Fragment wurde mit YOp1, gespalten mit ClaI, gemischt und die DNA mit T4 DNA-Ligase ligiert. Da HpaII und ClaI zueinander komplementäre überstehende Enden besitzen, können diese DNAs miteinander ligiert werden. Das Ligierungsgemisch wurde in HB101 transformiert und die ampicillinresistenten Kolonien auf die Anwesenheit des Promotorfragments abgesucht. Eines dieser Plasmide (920, siehe Fig. 18) wurde für die weiteren Konstruktionen verwendet.
  • Aus der DNA-Sequenz des Fragments des Gens für Saure Phosphatase (PHO 5), (Fig. 3), (Thill et al., 1983, a.a.O., und Arima et al., NAR 11 (1983), S. 1657-72) wurde 5 bp stromaufwärts des Initiator-ATG ein Bereich gefunden, der vier der sechs Basen einer BglII-Restriktionsendonuclease- Erkennungsstelle besaß. Dieser Bereich wurde zur Erzeugung einer BglII-Stelle an diesem Punkt in der APase-Promotorsequenz verwendet, wobei ein synthetischer Oligonucleotidlinker mit der zu sich selbst komplementären Sequenz CTAGCATGCTAG verwendet wurde.
  • Plasmid 920 wurde mit KpnI gespalten (siehe Fig. 20) und die DNA mit der Doppelstrang-Exonuclease Bal31 (Legerski et al., NAR 5 (1978), S. 1145-1463) gespalten. Nach bestimmten Zeitabständen wurde die Reaktion durch Zugabe von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bis zu 0,05 M (Legerski et al., (1978), a.a.O.) beendet. Von jedem Zeitintervall wurde ein Aliquot des Plasmids mit ClaI gespalten und auf einem 12%igem Polyacrylamidgel laufen gelassen. Der Zeitpunkt, bei dem das 300 bp ClaI/KpnI-Fragment zu etwa 270 bp abgespalten worden war, wurde vermerkt. Der Rest des Bal31-behandelten Plasmids aus diesem Zeitintervall wurde mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase 1 und den vier dNTP's behandelt. Ein Linker mit der zu sich selbst komplementären Sequenz CTAGCATGCTAG wurde kinasiert, aneinandergelagert und mit dieser Plasmid-DNA ligiert. Im Anschluß daran wurde die DNA mit T4 DNA-Ligase zirkularisiert und in HB101 transformiert.
  • Ungefähr 2000 ampicillinresistente Kolonien wurden von den Platten abgewaschen und aus diesen E. coli-Zellen "supercoiled"-Plasmid DNA hergestellt (Maniatis et al., 1982, a.a.O.). Diese gesammelte Plasmid-DNA wurde mit dem Restriktionsenzym BglII gespalten und die DNA auf einem präparativen Agarosegel laufengelassen. Die als eine gespaltene lineare Bande laufende DNA wurde in eine in die Agarose geschnittene Kammer eluiert und über eine DEAE-Sephacel-Säule gereinigt. Diese gereinigte DNA wurde mit T4 DNA-Ligase wieder zirkularisiert und in HB101 transformiert. Ampicillinresistente Kolonien wurden auf die Anwesenheit einer BglII- Stelle abgesucht. Das Plasmid konnte nur über einen Weg eine BglII-Stelle erhalten, nämlich an der durch die Verbindung der Bal31 gespaltenen DNA mit dem Linker erzeugten Stelle. Die einzige zur Verfügung stehende Sequenz, in der dies innerhalb der mehreren 100 bp stromaufwärts der KpnI-Stelle eintreten konnte, befindet sich 5b vor dem ATG-Initiationscodon. Eines der eine BglII-Stelle enthaltenden Plasmide, D718 (Fig. 20), wurde überprüft und durch das Didesoxynucleotid-Sequenzierungsverfahren nach Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (1977), S. 5463-67) konnte gezeigt werden, daß es den Erwartungen entsprach.
  • Plasmid YIpAP11 wurde bei der American Type Culture Collection in E. coli HB101 wie folgt hinterlegt:
  • E. coli HB101 (YIpAP11) - ATCC Nr. 39570
    • Erzeugung einer Restriktionsstelle an der Verbindung zwischen Leader und nativem Protein
  • Aus der Sequenz des Gens für saure Phosphatase ist ersichtlich (Fig. 18), daß sich nahe des Beginns der reifen Sequenz eine KpnI-Stelle befindet. Dies ermöglichte es uns, an der Verbindungsstelle von der Leadersequenz zur Sequenz des reifen Proteins unter Verwendung eines synthetischen Oligonucleotids mit der Sequenz
  • eine Restriktionsstelle einzuführen.
  • Da es im Gen für saure Phosphatase verschiedene KpnI- Stellen gibt, wurde ein Fragment vom 5'-Ende des Gens subcloniert. Plasmid YIpAP11 wurde mit BamHI und SalI gespalten und das den Promotor enthaltende Fragment in die BamHI/SalI- Stellen von YOp1 subcloniert (Fig. 21). Die transformierten Bakterien wurden abgesucht und es stellte sich heraus, daß Plasmid 801 die korrekte Sequenz besaß. Zur Einführung einer Restriktionsstelle am 5'-Ende der reifen Sequenz wurde Plasmid 801 mit KpnI gespalten und der vorstehend beschriebene Adapter in die KpnI-Stelle ligiert (Fig. 21). Danach wurde das Plasmid mit BamHI gespalten, die Stelle mit dem Klenow- Fragment der DNA-Polymerase 1 aufgefüllt und das Plasmid rezirkularisiert. Die transformierten bakteriellen Kolonien wurden auf die Anwesenheit des Adapters abgesucht. Eines dieser Plasmide (J401) wurde für weitere Konstruktionen verwendet. Wie aus Fig. 21 ersichtlich, erzeugt der Adapter eine XhoI-Stelle an der Verbindung zwischen Leader und der reifen sauren Phosphatase, so daß bei Spaltung des Plasmids mit XhoI und Spaltung der überstehenden Enden mit Mungbean- Exonuclease eine Stelle mit glatten Enden an der richtigen Position in der Sequenz am Beginn des Bereichs erzeugt wird, der das reife Protein codiert.
    • Synthese eines Clons für saure Phosphatase ohne Leader
  • Zuerst wurde aus Plasmid J401 eine Kopie von saurer Phosphatase mit vollständiger Länge hergestellt. Plasmid YIpAP11 wurde mit BamHI gespalten, der 5'-Überhang mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aufgefüllt, danach mit SalI gespalten und das das APase-Gen enthaltende BamHI/SalI- Fragment über präparative Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde dann in die SalI/NaruI-Stellen des Plasmids J401 ligiert (Fig. 22). Eine mit einer NruI-Stelle ligierte aufgefüllte BamHI-Stelle erzeugt wiederum die BamHI-Stelle. Als nächstes wurde der Promotor für saure Phosphatase erneut an das Strukturgen angeknüpft. Plasmid D718 wurde mit BglII gespalten und in die BglII-Stelle ein Adapter mit der Sequenz
  • ligiert, der die Promotorsequenz für saure Phosphatase am Initiator-Methionincodon wieder herstellt. Danach wurde das Plasmid mit EcoRI gespalten und das EcoRI-BglII-Adapter-Fragment (Fig. 22) in das Plasmid K219 cloniert, das mit XhoI gespalten, mit Mungbean-Exonuclease zur Erzeugung glatter DNA-Enden behandelt und danach mit EcoRI gespalten worden war. Die Transformanten wurden abgesucht und die die richtigen Restriktionsfragmente enthaltenden Plasmide unter Verwendung des Didesoxynucleotid-Sequenzierungsverfahrens sequenziert. Es zeigte sich, daß Plasmid M138 die richtige Sequenz an der Verbindung zwischen Promotor und dem reifen Gen besaß.
    • Hinzufügung eines Hefecentromers zum Plasmid
  • Der Promotor für saure Phospohatase ist etwa 1000- fach induzierbar. Die Kopienzahl eines Hefeplasmids kann durch Verwendung unterschiedlicher Replikationsstartpunkte oder eines Hefecentromers verändert werden (Clark & Carbon, (1980), und Tschumper & Carbon, 1983). Ein Hefecentromer erniedrigt die Kopienzahl eines Plasmids mit einem 2u-Replikationsstartpunkt auf ungefähr 1 Kopie pro Zelle.
  • Plasmid M138 wurde mit EcoRI gespalten und mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I glatte Enden erzeugt. Als nächstes wurde Plasmid YCP19 (Fig. 23), das das Centromer von Chromosom 4 der Hefe enthält, (Parent et al, a.a.O.) mit HindIII gespalten und mit dem Klenow-Fragment DNA-Polymerase I glatte Enden erzeugt. Das das Centromer enthaltende Fragment wurde dann in die EcoRI-Stelle von M138 ligiert, wobei Plasmid N305 erzeugt wurde (Fig. 22).
    • Expression cytoplasmatischer saurer Phosphatase
  • Die Plasmide M138 und N305 wurden zusammen mit dem Kontrollplasmid M721 in Hefe transformiert. Uracil-Prototrophe wurden selektioniert und in Hochphosphat-MO-Medium, das einen Überschuß an Glucose (4 %) enthielt, in einem 1 Liter- Fermenter von New Brunswick Scientific Modell F-200 gezüchtet. Während der Aufzucht wurde die Zelldichte unter Verwendung eines Bausch und Lomb Modell-Spectronic 20 bei 600 nm gemessen. Die Ergebnissen sind nachstehend in den Tabellen 1 und 2 gezeigt. Der Fermenter wurde bei 30ºC und einer Rühreinstellung von 4 betrieben. Stickstoff wurde mit einer Rate von 430 cc/min kontinuierlich durch das Gefäß geblasen und das abgeleitete Gas durch eine Feuchtigkeitsfalle von Dry-Rite und zur Bestimmung von CO&sub2; in ein Perkin Elmer-Massenspektrometer Gasanalysegerät geleitet. Tabelle 2 Kohlendioxidentwickluna in nicht-induzierten Kulturen Kontrollplasmid M721 Zeit in Minuten Anzahl der Zellen (x10&sup6;) % Kohlendioxid Tabelle 2, Fortsetzung Plasmid N305 Zeit in Minuten Anzahl der Zellen (x10&sup6;) % Kohlendioxid Tabelle 2 Fortsetzung Plasmid M138 Zeit in Minuten Anzahl der Zellen (x10&sup6;) % Kohlendioxid
  • Es zeigte sich, daß während des Wachstums auf Hochphosphatmedien der Spiegel des von den die drei unterschiedlichen Plasmide tragenden Stämmen erzeugten Kohlendioxids schwankte (Tabelle 1). Danach reicht der Grundspiegel der Promotoraktivität in Hochphosphatmedien aus, um eine Wirkung auf die Glykolyserate auszuüben. Nachdem die Daten zusammengestellt und auf die gleiche Phase innerhalb des Wachstumscyclus standardisiert worden waren, zeigte sich, daß der Spiegel des von den in Hochphosphatmedium wachsenden Kulturen erzeugten Kohlendioxids mit der Kopienzahl des Plasmids anstieg. Der das Plasmid mit hoher Kopienzahl tragende Stamm erzeugte doppelt soviel Kohlendioxid wie die Kontrolle und der das Plasmid in Einzelkopie tragende Stamm erzeugte einen dazwischen liegenden Spiegel. Somit kann gemäß dieser Erfindung der Spiegel der sauren Phosphatase reguliert und dadurch der Spiegel von cytoplasmatischem ATP reguliert und die Syntheserate für Kohlendioxid gesteigert werden.
    • Beispiel 3 Die Wirkung von Plasmamembranentkopplern auf die Glykolyserate
  • Bei der Zugabe von ansteigenden Mengen an 2,4-Dinitrophenol zu stabilen Chemostatkulturen von Fleishman's Bäckerhefe wird eine beträchtliche Anregung der Kohlendioxiderzeugung beobachtet.
  • Zur Bestimmung des Grundspiegels an Kohlendioxid pro Zelle unter den durch den Chemostaten definierten Aufzuchtbedingungen und der Stabilität der Kultur wurden einleitende Experimente durchgeführt. Der Chemostat wurde mit einer Übernachtkultur beimpft und diese 24 Stunden als Batch-Kultur gezüchtet. Mit der Medienzufuhr wurde begonnen und vor der Durchführung von Messungen ließ man die Kultur sich weitere 24 Stunden stabilisieren. Die Kohlendioxiderzeugung und die Zellzahl wurden über einen Zeitraum von 48 Stunden beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Die Zeit ist in Stunden nach Beginn der Medienzugabe angegeben. Der Kohlendioxidgehalt in der Gasströmung ist in % angegeben. Tabelle 3 Chemostatstabilität Zeit nach Beginn Stunden Kulturdichte O. D. 600 nm Zellzahl Zellen/ml · 10&supmin;&sup8; Kohlendioxid im abgeleiteten Gas %
  • Die Kultur schien relativ stabil zu sein.
  • Zu der Medienzugabe wurde Dinitrophenol bis zu 5 uM gegeben. Wie unter "Experimentellen Verfahren" gezeigt, wurde außerdem Dinitrophenol bis zu 5 uM in das Kulturgefäß gegeben. Man ließ die Kultur sich 48 Stunden stabilisieren. Wie aus Tabelle 4 ersichtlich ist, zeigte 5 uM Dinitrophenol kaum Auswirkungen auf die Kohlendioxiderzeugung. Tabelle 4 Die Auswirkung von Dinitrophenol auf die Gärungsrate Konzentration von Dinitrophenol, um Kulturdichte Zellen/ml · 10&supmin;&sup8; Kohlendioxid im abgeleiteten Gas, % Relative Kohlendioxiderzeugung pro Zelle
  • Die Dinitrophenolkonzentration in der Kultur wurde langsam schrittweise auf 200 um erhöht. Nach jedem Zugabeschritt von Dinitrophenol ließ man vor der Messung der Zelldichte und der Kohlendioxidkonzentration die Kultur sich 36 bis 48 Stunden stabilisieren. Wie in der vorstehenden Tabelle 4 gezeigt, ergab sich mit ansteigender Dinitrophenolkonzentration ein Ansteigen des Spiegels des pro Zelle erzeugten Kohlendioxids.
  • Falls die Auswirkung des Dinitrophenol auf den zellulären Stoffwechsel in der Entkopplung der Plasmamembran- ATPase bestand, so hätte man ein Ansteigen der Kohlendioxidausbeute und ein entsprechendes Abnehmen der Zelldichte erwartet. Es sollte daran erinnert werden, daß die Auflösung des Ionengradienten der Plasmamembran außerdem weitere von diesem Ionengradienten abhängige zelluläre Prozesse, d. h. Transport, betreffen kann. Die Beobachtung, daß die Stoffwechseleffizienz der Zelle durch diese Behandlung reduziert worden ist, wäre somit nicht überraschend. Man wäre somit davon ausgegangen, daß dieser Grad der Anregung der Glykolyse ein Minimum ist.
  • Die Experimente haben gezeigt, daß die Kohlendioxiderzeugung in einer dosisabhängigen Weise durch Dinitrophenol angeregt werden kann. Es zeigte sich, daß der Grad der Anregung hochreproduzierbar ist, und sich bei der höchsten verwendeten Konzentration eine mehr als 2-fache Steigerung der Kohlendioxiderzeugung ergab.

Claims (7)

1. Vektor-DNA, enthaltend-ein Gen, das ein Enzym unter der Expressionskontrolle eines Promotors codiert, wobei das Gen das Enzym Fructose-1,6-diphosphatase codiert, das in Gegenwart von Glucose durch die Aktivierung des Promotors induzierbar ist.
2. Vektor-DNA nach Anspruch 1, wobei das das Enzym Fructose-1,6-diphosphatase codierende Gen genetisch so modifiziert ist, daß dessen Codon 12 Alanin, Threonin, Valin oder Cystein codiert und/oder eine Bindungsstelle für eine allosterische Hemmung des Enzyms entfernt ist.
3. Vektor-DNA nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Promotor ein regulierbarer oder ein konstitutiver Promotor ist.
4. Vektor-DNA nach Anspruch 3, wobei der regulierbare Promotor der Galactose-Promotor, der Maltose-Promotor, der Phosphat-Metabolismus-Promotor, der Stickstoff-Metabolismus-Promotor, der Isocytochrom-Promotor, der Alkohol- Dehydrogenase-Promotor oder ein temperaturempfindlicher Promotor ist.
5. Verfahren zur Steigerung der Herstellungsrate für Kohlendioxid und Ethanol in Hefe durch Transformation der Hefe mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
6. Hefezelle enthaltend einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
7. Verwendung einer Hefe nach Anspruch 6 zur Teigsäuerung, zum Brauen oder zur Gärung.
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