Gebiet der Erfindung
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Diese Erfindung betrifft Hefe, insbesondere Bäcker-
oder Bierhefe mit höheren Produktionsraten für Kohlendioxid
und Ethanol. Zum Beispiel führt vermehrte
Kohlendioxidentwicklung bei Bäckerhefe zu einer schnelleren Teigsäuerung
bzw. bei Bierhefe eine erhöhte Produktionsrate für Ethanol
zu verkürzten Brauzeiten. Diese Erfindung betrifft außerdem
ein neues Mittel zur Regulation der Genexpression, das die
regulierte Entfernung eines Transkriptionsblocks mit
einschließt.
Hintergrund der Erfindung
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Hefen stellen eine der ältesten kultivierten Pflanzen
dar. Ihre Verwendung läßt sich bis ungefähr 2000 B.C.
zurückverfolgen. Unter den verschiedenen bekannten
Hefegattungen hat Saccharomyces die größte wirtschaftliche und
praktische Bedeutung, da sie in der Back-, Brau- und
Weinerzeugungsindustrie sowie bei der Herstellung von Biomasse
ausgiebig verwendet wird. Siehe z. B. Reed, G., "Yeasts" in
Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology 24 (1984),
S. 771-806 (John Wiley & Sons, New York).
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Die Haupt-, jedoch nicht einzige Aufgabe von Hefe bei
der Gärung besteht in der Bereitstellung einer Quelle für
Kohlendioxid und Ethanol. Zur Erzielung der gewünschten
Produktionsrate für CO&sub2; und Ethanol muß ausreichend Hefe zu dem
Teig, der Bierwürze oder einem anderen vergärbaren Substrat
gegeben werden. Falls aktivere Hefen zur Verfügung stünden,
könnte mit entsprechender Kostenersparnis weniger Hefe
verwendet werden. Die Verbesserung der Gärleistung von Hefe ist
Gegenstand fortwährender Forschungsbemühungen. Sowohl die
getrockneten als auch die feuchten Hefeformen können zur
Steigerung ihrer Befähigung zur Kohlendioxidproduktion
verbessert
werden, um so (1) die Gärzeit zu verkürzen und/oder
(2) die Verwendung von weniger Hefe zu ermöglichen, ein
beträchtlicher Kostenfaktor sowohl beim Backen als auch beim
Brauen. Verbesserungen der Gärleistung von Hefe verleihen
auch der Herstellung der stabileren, aktiven Trockenhefeform
(ADY) Attraktivität. Im allgemeinen gehen bei der
Herstellung von ADY aus einer frischen Hefekultur etwa 40 % der
Gärfähigkeit verloren. Es wird deshalb fortwährend nach
Verfahren zur Ausschaltung oder zur Reduzierung dieses Problems
gesucht.
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Ein Ansatz zur Verbesserung der Aktivität
getrockneter Hefe beinhaltet eine Modifikation entweder des
Trocknungsprozesses oder der Trocknungseigenschaften des
Hefestamms, um so den während des Trocknens eintretenden
Verlust an Aktivität zu verhindern. Verfahrensverbesserungen
konnten durchgeführt werden und bei diesem Problem wurden
Verfahren der klassischen Genetik angewandt, allerdings mit
bescheidenem Erfolg, siehe z. B. US-Patent 3,993,783.
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Ein weiterer Ansatz zur Lösung des Problems der
geringen Aktivität von Trockenhefe ist im US-Patent 4,420,563
beschrieben. Durch die gesteigerte Zugabe von Salzen zu der
heranwachsenden Hefekultur während der späteren
Vermehrungsstadien wurde Hefe hergestellt, die besonders in Süßteigen
mit hohem Zuckergehalt eine verbesserte Säuerungsaktivität
hatte.
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf genetisch
und chemisch induzierte Modifikationen, die die Aktivität
zur Produktion von CO&sub2; und Ethanol jedes beliebigen
Hefestamms steigert.
Zusammenfassung der Erfindung
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Offenbart werden Verfahren zur Steigerung der
Produktionsrate für CO&sub2;, Ethanol und weiterer von Hefe erzeugte
Gärungsprodukte (z. B. Citronensäure). Im allgemeinen
umfassen die Verfahren die Erniedrigung des ATP-Spiegels in der
Hefezelle, wodurch die Glykolyse stimuliert wird. Bei einem
erfindungsgemäßen Aspekt wird der ATP-Spiegel durch den
Austausch des natürlichen Promotors eines ein Stoffwechselenzym
codierenden Gens gegen einen regulierbaren Promotor im
Hefegenotyp (z. B. über einen in Einzelkopie oder mehreren Kopien
vorliegenden Vektor oder über die Cointegration in das
Hefegenom) erniedrigt. Dadurch wird die regulierbare Expression
des Enzyms gestattet und dadurch wird wiederum gestattet,
daß die von dem Enzym katalysierte Stoffwechselreaktion
gleichzeitig mit der Rückreaktion abläuft, so daß ATP
verbraucht wird. Bei einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt
beinhaltet die Modifikation außerdem die Einfügung eines ein
Stoffwechselenzym codierenden Gens in den Hefegenotyp, in
diesem Fall jedoch unter der Expressionskontrolle eines
Promotors, der die konstitutive Expression des Gens erlaubt,
und es dadurch gestattet, daß die von dem Enzym katalysierte
Stoffwechselreaktion gleichzeitig mit der Rückreaktion
abläuft, so daß ATP verbraucht wird. Weitere erfindungsgemäße
Modifikationen beinhalten die Modifikation des das
Stoffwechselenzym codierenden Gens, um dadurch z. B. eine
allosterische oder sonstige Hemmung oder Inaktivierung des Enzyms
zu verhindern oder zu beseitigen.
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In einer Ausführungsform stellt das Enzym FDPase dar.
Das FDPase-Gen kann außerdem so mutagenisiert werden, daß
das Codon für Ser-12 des Enzyms gegen ein Codon für eine von
Serin verschiedene Aminosäure ausgetauscht wird, oder daß
eine allosterische Hemmung, z. B. durch AMP und/oder
Fructose-2,6-diphosphat erniedrigt oder ausgeschaltet wird. In
einer weiteren Ausführungsform beinhaltet die genetische
Modifikation die Modifizierung eines Gens für eine
extrazelluläre APase, z. B. durch die Entfernung des die Leadersequenz
codierenden Genbereichs, so daß das modifizierte Enzym im
Hefecytoplasma bleibt und die Hydrolyse von intrazellulärem
ATP katalysiert.
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Ein durch diese Erfindung bereitgestellter Vorteil
besteht darin, daß die genetischen Modifikationen nur
während und bevorzugt in einem frühen Stadium der
Säuerungsphase und nicht während der Aufzucht der Hefe im
Produktionsmaßstab angeschaltet werden können. Dies stellt bei
Bäckerhefen einen bedeutenden Vorteil dar. Alternativ können
die genetischen Modifikationen konstitutiv exprimiert
werden, so daß sie zur gesteigerten Erzeugung von
Gärungsprodukten wie Ethanol während der Herstellung der Hefe im
großtechnischen Maßstab, d. h. der Aufzucht der Hefe im
kommerziellen Maßstab, ausgeschaltet sind.
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Die Regulation der genetischen Modifikationen kann
durch die Verwendung eines temperaturempfindlichen Promotors
oder eines Promotors, der durch die Anwesenheit einer
spezifischen Substanz induziert wird, erfolgen, so daß das Enzym
nur bei einer vorgegebenen Temperatur oder in Gegenwart der
Substanz exprimiert wird. Alternativ kann durch das Einfügen
eines, später ausführlicher beschriebenen, FLP-Genkonstrukts
in das Hefegenom eine Expressionskontrolle zur Verfügung
gestellt werden.
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Für diese Verfahren geeignete Vektoren umfassen in
Einzahl vorliegende, Zentromer-enthaltende Plasmide und in
mehreren Kopien vorliegende, den Hefe
2u-Replikationsstartpunkt enthaltende Plasmide, sowie Vektoren, die deren
Cointegration in das Hefegenom gestatten.
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Die Erfindung umfaßt außerdem Verfahren, bei denen
der ATP-Spiegel dadurch erniedrigt wird, daß die Hefe mit
einer Chemikalie gezüchtet oder in Kontakt gebracht wird,
die zur direkten oder indirekten Induktion des
ATP-Verbrauchs befähigt ist. Zu solchen Chemikalien zählen relativ
kleine organische Moleküle sowie Proteine, wie das
Hefekillertoxin.
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Die Erfindung umfaßt außerdem genetisch modifizierte
Hefen, die mit den hierin offenbarten Verfahren hergestellt
wurden.
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Schließlich umfaßt diese Erfindung außerdem ein
Verfahren und ein Vektorsystem zur regulierten Expression von
heterologen Genen in Hefe, Bakterien und Zellen höherer
Eukaryonten wie Pflanzen- und Säugerzellen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Fig. 1 zeigt die Konstruktion eines
Hefe-Integrationsplasmids, das das vom Gal1-Promotor exprimierte FLP-Gen
enthält.
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Fig. 2. zeigt ein Hefeplasmid, das den mit dem β-gal
codierenden Bereich aus E. coli verknüpften Gal1-Promotor
enthält.
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Fig. 3 zeigt die Induktion der
β-Galactosidaseaktivität vom Gal1-Promotor, bei durch Glucose limitiertem
Wachstum.
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Fig. 4 zeigt den Verlust eines heterologen Gens durch
regulierte ortsspezifische Rekombination.
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Fig. 5 zeigt den Verlust eines Transkriptionsblocks
im das Hefe FDPase-Gen exprimierenden GPDH-Promotor.
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Fig. 6 zeigt ein Plasmid, das einen über SalI/BglII-
Restriktionsstellen verknüpften Expressionsblock enthält.
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Fig. 7 zeigt die Konstruktion eines
Replikationsstartpunkte und selektierbare Marker sowohl für Hefe als
auch E. coli enthaltenden Expressionsvektors.
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Fig. 8 zeigt die Nucleotidsequenz des clonierten Hefe
FDPase-Gens.
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Fig. 9A und 9B zeigen die abgeleitete
Aminosäuresequenz des clonierten FDPase-Enzyms bzw. die
Aminosäuresequenz von FDPase vom Schwein.
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Fig. 10 zeigt die Konstruktion einer FDPase-Kassette
zur Expression von einem heterologen Promotor.
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Fig. 11 zeigt die Herstellung eines
Expressionsvektors, bei dem FDPase vom GPDH-Promotor exprimiert wird.
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Fig. 12 zeigt die Herstellung einer aminoterminalen
Deletion der FDPase.
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Fig. 13 zeigt den Austausch des Serinrestes an der
Erkennungsstelle für Proteinkinase gegen Alanin.
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Fig. 14 zeigt die CO&sub2;-Entwicklung während der
Züchtung von Hefekulturen, die Wildtyp-FDPase oder FDPase mit
einer Deletion des Aminoterminus exprimieren.
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Fig. 15 zeigt die CO&sub2;-Entwicklung während der
Züchtung von Hefekulturen, die FDPase exprimieren, der die
Erkennungsstelle für die von cyclischem AMP abhängigen
Proteinkinase fehlt.
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Fig. 16 zeigt das für die Untersuchung der
Gasentwicklung verwendete Gerät.
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Fig. 17 zeigt die Verbesserung der
Gasentwicklungleistung bei einem Hefestamm, der das Gen für das
nicht-phosphorylierte FDPase-Enzym exprimiert. Kreise: Hefestamm ATCC
26675, transformiert mit Plasmid BA 601; X: Hefestamm ATCC
26675, transformiert mit Plasmid BA 802.
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Fig. 18 zeigt die Einfügung des Hefepromotors für
saure Phosphatase in einen Hefeexpressionsvektor.
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Fig. 19 zeigt die DNA-Sequenz des Hefepromotors für
saure Phosphatase und den Anfang des Strukturgens für saure
Phosphatase (PHO 5).
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Fig. 20 zeigt die Einführung einer einmal vorhandenen
BglII-Stelle am 3'-Ende des Promotors für saure Phosphatase.
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Fig. 21 zeigt die Einführung einer Restriktionsstelle
in das Gen für saure Phosphatase zur Expression des reifen
Proteins.
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Fig. 22 zeigt die Herstellung eines
Expressionsvektors, der das Gen für reife saure Phosphatase vom Promotor
für saure Phosphatase exprimiert.
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Fig. 23 zeigt die Einführung eines Hefecentromers in
das das modifizierte Gen für saure Phosphatase enthaltende
Plasmid.
Ausführliche Beschreibung
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Der Glykolyse-Abbauweg bei Hefe wurde viele Jahre
lang ausführlich untersucht. Siehe z. B. Fraenkel,
"Carbohydrate Metabolism" in The Molecular Biology of the Yeast
Saccharomyces; Metabolism and Gene Expression, Cold Spring
Harbor Laboratory, New York. Bei der glykolytischen
Vergärung von Zuckern handelt es sich bei der Betrachtung der
Umwandlung von Energie als auch von Biomasse um einen sehr
ineffizienten Prozeß. Trotzdem können Hefen durch anaerobe
Glykolyse, bei der die Energie aus der
Substratkettenphosphorylierung stammt, schneller wachsen als durch
oxidative Phosphorylierung unter aeroben Bedingungen.
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Im Verlauf der zu dieser Erfindung führenden
Untersuchungen fanden wir heraus, daß bei Hefe die
Glykolysegeschwindigkeit durch den zellulären Spiegel von
Adenosintriphosphat (ATP) reguliert wird. Dieser Befund ist wirklich
überraschend, denn obwohl eine regulatorische Rolle von ATP
bei einigen enzymatischen Schritten beobachtet wurde, wurde
nach unserem Wissen trotz der vorangegangenen umfangreichen
Untersuchungen über Glykolyse eine regulatorische Rolle des
ATPs innerhalb des Gesamt-Glykoseabbauwegs bisher nie
nachgewiesen, geschweige denn vorgeschlagen. Die vorliegende
Erfindung macht sich diese Entdeckung zunutze, indem sie
Modifikationen zur Erniedrigung des zellulären Spiegels von
cytoplasmatischem ATP bereitstellt, was zur Stimulierung der
Glykolyse und dadurch wiederum zur Erhöhung der
Entstehungsrate für CO&sub2; und Ethanol bei Hefe führt.
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Wie vorstehend erwähnt, kann Bäckerhefe dadurch
verbessert werden, daß die Befähigung zur Erzeugung von CO&sub2;
während der Teigsäuerung gesteigert wird. Bierhefe kann
ebenfalls durch die Steigerung der Gärungsrate (d. h. der
Alkoholproduktion) und durch die Reduktion der für das
Brauverfahren erforderlichen Zeit verbessert werden. Die bei der
Verwendung von gemäß dieser Erfindung modifizierten Hefe
erniedrigte Erzeugung von Biomasse während der Gärungsprozesse
führte außerdem zur Verbesserung des Gärungsprozesses zur
Ethanolherstellung. Diese Erfindung stellt Modifikationen
zur Durchführung dieser Verbesserungen dadurch bereit, daß
die Glykolyserate durch eine ungewöhnliche Erniedrigung des
zellulären ATP-Spiegels reguliert wird. Mit "ungewöhnlicher
Erniedrigung des zellulären ATP-Spiegels" meinen wir einfach
eine durch ein erfindungsgemäßes Verfahren induzierte
Erniedrigung.
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Da die an der Glykolyse beteiligten Enzyme
normalerweise im Überschuß vorliegen, kann die Glykolyserate durch
allosterische Hemmung bestimmter glykolytischer Enzyme durch
zelluläre Metaboliten, einschließlich des intrazellulären
Adenosintriphosphat (ATP)-Spiegels begrenzt werden, so wie
dies im Verlauf der nachstehend beschriebenen Untersuchungen
entdeckt wurde. Somit wird durch die erfindungsgemäße
Erniedrigung des zellulären ATP-Spiegels die Glykolyse
stimuliert und dadurch wiederum die Ertragsrate für CO&sub2; und
Ethanol gesteigert und die Erzeugung von Biomasse verringert.
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Im Fall der Bäckerhefe würde jedoch diese bei der
Erzeugung von Biomasse sehr ineffizient sein, falls diese
Veränderung der Hefe während der normalen Vermehrung wirksam
wäre. Daher wäre aufgrund gesteigerter Produktionskosten die
Züchtung der Hefe kommerziell undurchführbar. Es ist daher
wünschenswert, daß die erfindungsgemäßen genetischen
Modifikationen zur Herstellung von Bäckerhefe so reguliert werden,
daß diese nur während des Säuerungs- (oder
Gärungs)-Prozesses, nicht jedoch während der Erzeugung der Hefe selbst
(Vermehrungsphase) wirksam sind. Ein bedeutender Vorteil
dieser Erfindung besteht in der Möglichkeit, die genetische
Modifikation anzuschalten und damit verbunden die
CO&sub2;-Erzeugung so zu steigern, daß die gesteigerte Erzeugung während
des Beginns oder in frühen Stadien des Stadiums des
Teiggehenlassens einsetzt. Diese Einschränkung ist jedoch bei
Hefen zum Brauen oder zur Ethanolproduktion nicht
erforderlich, jedoch dann, wenn die Produktion gleichzeitig während
der Vermehrung erzielt wird.
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Verschiedene Methoden zur Erniedrigung des
cytoplasmatischen ATP-Spiegels und dazu typische Beispiele werden
nachstehend beschrieben. Im allgemeinen beinhalten diese
Methoden (i) die Bildung eines regulierten
Leerlaufstoffwechselcyclus, der ATP verbraucht, (ii) die Einführung bzw. die
Erhöhung der Aktivität der cytoplasmatischen ATPase in
regulierbarer Art und Weise und (iii) die Erniedrigung des
cytoplasmatischen ATP-Spiegels durch die Beeinflussung der
Funktion der Plasmamebran. Wie aus der folgenden Beschreibung
ersichtlich, umfassen die vorstehenden Methoden (i) und (ii)
die Einführung eines veränderten Gens bzw. einer veränderten
Genfunktion über DNA-Rekombinationsverfahren in einen
Hefestamm. Vor der detaillierteren Beschreibung der vorstehend
erwähnten Verfahren dürfte es hilfreich sein, zuerst die
Hilfsmittel zur Durchführung solcher genetischer
Modifikationen zu beschreiben, d. h. geeignete Vektoren, regulierbare
Promotoren und Verfahren zur Einführung dieser Veränderungen
in Bäcker- bzw. Bierhefestämme.
Vektoren
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Das für die Induktion eines Leerlaufcyclus
verantwortliche Gen bzw. das Gen für cytoplasmatische saure
Phosphatase kann in zwei Arten von sich autonom replizierenden
Expressionsvektoren unter der Transkriptionskontrolle eines
Promotors cloniert werden: ein in Einzelkopie vorliegendes,
ein Centromer enthaltendes Plasmid oder ein Plasmid mit
hoher Kopienzahl. Alternativ kann die DNA über Rekombination
in ein Hefechromosom eingeführt werden. Außerdem enthalten
diese Vektoren ein Markergen und 3'-nicht-codierende
Bereiche. Diese sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt.
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Die Vektoren werden in einen Hefestamm transformiert
und die Hefezellen auf solche, die den Vektor enthalten,
durch ein auf dem Fachgebiet allgemein bekanntes
Selektionsverfahren selektioniert. Die selektionierten, den Vektor
enthaltenden Hefezellen, d. h. die transformierten Zellen,
werden in einem geeigneten Wachstumsmedium gezüchtet und der
Promotor zur Einleitung des Verlusts von cytoplasmatischem
ATP induziert.
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Geeignete Markergene sind auf dem Fachgebiet
allgemein bekannt. Bevorzugt handelt es sich bei dem
Selektionsmittel um eines, das das Zellwachstum in Abwesenheit des
Markergens verhindert. Somit enthalten die Zellen, die
während der Aufzucht in großtechnischem Maßstab das Plasmid
verlieren, kein Markergen und können während der Vermehrung
die anderen Zellen nicht überwachsen. Allerdings kann es bei
der kommerziellen Herstellung der gewünschten Produkte
wünschenswert sein, die Verwendung bestimmter Zelltoxine zu
vermeiden, um damit die Reinigungsschritte für das Produkt
zu vereinfachen. Somit handelt es sich bei einem
wünschenswerten Markergen um eines, das es den Transformanten
erlaubt, in einem Medium zu wachsen, dem ein zur Vermehrung
des Elternstammes erforderlicher Nährstoff fehlt.
Zweckmäßige Markergene bei der Ausführung dieser Erfindung
umfassen z. B. URA3, LEU2 etc.
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Zweckmäßige Vektoren können durch dem Fachmann
vertraute Verfahren synthetisiert werden. Die Bestandteile der
Vektoren, z. B. Markergene, Promotoren und ähnliche können
aus natürlichen Quellen erhalten oder wie nachstehend
diskutiert synthetisiert werden. Grundsätzlich können
Bestandteile, die in hohen Ausgangsmengen erhältlich sind (d. h.,
die in natürlichen Plasmiden, z. B. dem 2u-Plasmid von Hefe,
vorhanden sind, oder die leicht synthetisiert werden können)
unter der Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme und T4
DNA-Ligase zusammengesetzt werden. Falls ein Bestandteil
nicht in hoher Ausgangsmenge verfügbar ist, kann er durch
Einfügung in einen bakteriellen Clonierungsvektor, z. B.
einem Plasmid oder einem Phagen, amplifiziert werden, so wie
dies auf dem Fachgebiet allgemein bekannt ist. Danach können
unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme große Mengen
an Vektor durch auf dem Fachgebiet allgemein bekannte
Verfahren dadurch erhalten werden, daß die Bakterien einfach
gezüchtet werden, ihre DNA mit einer geeigneten Endonuclease
gespalten wird, die DNA-Fragmente abgetrennt werden, die den
interessierenden Bestandteil enthaltende DNA bestimmt und
gewonnen wird. Gewöhnlich wird der Transformationsvektor in
geringen Mengen zusammengesetzt und im Anschluß daran zur
Herstellung größerer Mengen an DNA des
Transformationsvektors in einen geeigneten, sich autonom replizierenden
Synthesevektor, z. B. ein Plasmid oder ein Phage, ligiert. In
den meisten Fällen kann z. B. das allgemein bekannte Plasmid
pBR322 verwendet werden.
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Zur Clonierung der ligierten Transformationsvektoren
werden die Synthesevektoren auf übliche Art und Weise
verwendet, z. B. durch Transformation eines permissiven
prokaryontischen Organismus, Replikation des Synthesevektors bis
zu einer hohen Kopienzahl, Gewinnung des Synthesevektors
durch Lyse der Zellen und Abtrennung des Synthesevektors von
Zelltrümmern. Die so erhaltene Ernte an Synthesevektor kann
unmittelbar in Hefezellen transformiert werden. Viele
unterschiedliche Arten von Hefevektoren sind leicht erhältlich
und können, falls erforderlich, gegeneinander ausgetauscht
werden (Parent et al., Yeast 1 (1985) S. 83-138).
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Verschiedene Vektoren, zu denen
Transformationsvektoren und Vektoren gehören, die verschiedene Elemente mit
spezifischen Promotoren, das FLP-Gen und ein FDPase-Gen
enthalten, wurden am 5. November 1986 in E. coli HB101 bei der
American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, MD 20852 (USA) hinterlegt, dazu gehören:
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1. AZ402 Das Plasmid enthält den UPA3-Transkriptionsblock
flankiert von FLP-Erkennungssequenzen innerhalb
einer Bgl II/Sal I-Kassette (ATCC Nr. 67257)
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2. AU125 Das Plasmid enthält ein funktionell mit dem
GPDH-Promotor verknüpftes FDPase-Gen (ATCC Nr.
67256)
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3. AT823 Das Plasmid enthält ein FDPase-Gen (ATCC Nr.
67258)
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4. AR900 Das Plasmid enthält das mit dem Gal I-Promotor
funktionell verknüpfte FLP-Gen mit
Restriktionsstellen zum Austausch des GalI-Promotors gegen
andere Promotoren. Das Plasmid ermöglicht die
regulierte Expression des FLP-Gens (ATCC Nr.
67259)
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5. YOp1 Das Plasmid ist ein Beispiel für ein
selektierbares 2u-Plasmid (ATCC Nr. 67260)
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6. BA601 Das Plasmid enthält das funktionell mit dem
GPDH-Promotor verknüpfte mutagenisierte (ser-12
nach ala) FDPase-Gen (ATCC Nr. 67261)
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7. M138 Ein Plasmid mit hoher Kopienzahl zur Expression
eines cytoplasmatischen (mutagenisierten) APase-
Gens (ATCC Nr. 67262)
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8. N305 Wie M138, außer daß das Plasmid ein
Hefecentromer enthält und daher ein in Einzelkopie
vorliegendes Plasmid darstellt (ATCC Nr. 67263).
Regulierte Promotoren
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Es sind zahlreiche für Hefe-Transformationsvektoren
geeignete Promotoren, die bei der Ausführung dieser
Erfindung verwendet werden können, auf dem Fachgebiet bekannt.
Bei bestimmten Ausführungsformen dieser Erfindung werden,
wie dies noch ausführlicher hier diskutiert wird, regulierte
Promotoren, von denen viele auf dem Fachgebiet bekannt sind,
bevorzugt. Beispiele für regulierte Hefepromotoren sind jene
des Galactose-, Maltose-, Phosphat- oder
Stickstoffmetabolismus, der Isocytochrome und der Alkoholdehydrogenase II.
Der Promotor des sauren Phosphatasegens der Hefe (PHO5)
stellt ein typisches Beispiel für einen regulierten Promotor
dar. Man weiß, daß dieser Promotor auf den Spiegel an
anorganischem Phosphat im Medium reagiert. Es ist möglich, daß
ein starker Promotor, wie der von saurer Phosphatase (APase)
ein Expressionsniveau ergibt, das für bestimmte
Ausführungsformen dieser Erfindung, z. B. dem
Leerlaufstoffwechselcyclus, über dem Optimum liegt. Der gewünschte regulierte
Promotor kann auf verschiedene Arten angepaßt werden. So
kann z. B. eine clonierte Kopie des Promotors für saure
Phosphatase unter Verwendung des Verfahrens von Shortle (Shortle
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 (1982), S. 1588) in
vitro mutiert oder kleine Deletionen/Substitutionen
innerhalb des Promotors durch Einfügung von Linkern mittels
bekannter Verfahren erzeugt werden (McKnight und Kingsbury,
Science 217 (1982), S. 316, und Heffron und McCarthy, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), S. 6012). Ein Pool an DNA-
Fragmenten, die den mutierten Promotor für saure Phosphatase
enthalten, wurde in ein bifunktionelles Hefe/E. coli-Plasmid
eingefügt, bei dem der Promotor einen nachweisbaren Marker
exprimiert, z. B. das β-Galactosidase- oder β-Lactamase-Gen
aus E. coli (Guarente und Ptashne, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 78 (1981), S. 2199, Rose et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 78 (1981), S. 2460, Martinez und Casadaban, Mol. Cell.
Biol., 3 (1983), S. 580 und Silverman et al., Mol. Cell.
Biol. 2 (1982), S. 1212). Danach wurden die transformierten
Hefekolonien nach der Produktion des nachweisbaren Markers,
z. B. auf 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-Galactosid (X-gal)
enthaltenden Medien abgesucht, wobei der gewünschte Phenotyp
auf Medium mit hohem Phosphatgehalt weiße Kolonien und auf
solchen mit niedrigem Phosphatgehalt blaue Kolonien gibt.
Damit können sowohl starke als auch schwache Promotoren
nachgewiesen werden. Die DNA wird aus Hefezellen, die einen
geeigneten Phenotyp zeigen, gewonnen und unter Verwendung
von standardverfahren in E. coli transformiert. Die
Ampicillin-resistenten Kolonien müssen das Hefeplasmid enthalten.
Aus diesen E. coli-Transformanten wird Plasmid-DNA
hergestellt, und aus diesen Plasmiden der Promotor für saure
Phosphatase zur Expression verwendet.
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Alternativ kann ein temperaturempfindliches
regulatorisches Gen verwendet werden. So zeigte sich, daß z. B. viele
Mutationen in den regulatorischen Genen pho R und pho U des
Stoffwechselwegs für saure Phosphatase bei 36ºC konstitutive
Expression und bei 23ºC normale Regulation aufweisen (Ueda
et al., J. Bact. 122 (1975), S. 911). Das betreffende, den
PHO5-Promotor enthaltende Plasmid wird dann in einen
Hefestamm transformiert, der eine temperaturempfindliche
Mutation für pho R oder pho U enthält, und der Promotor für
saure Phosphatase durch Veränderung der Zuchttemperatur in
einem Medium mit hohem Phosphatgehalt reguliert. Diese Art
der Regulation wird ebenfalls in Verbindung mit einem
schwachen (mutierten) Promotor für saure Phosphatase verwendet.
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Ein weiteres Verfahren zur Regulation der
erfindungsgemäßen Modifikationen besteht in der Verwendung eines
anderen regulierten Promotors, der von Natur aus viel schwächer
als der Promotor für saure Phosphatase ist. Es wurden
verschiedene solche Promotoren nachgewiesen, so z. B. der
Promotor des Hefe-HO-Gens. Die Expression dieses Promotors wird
indirekt durch Mutationen im Sir Locus reguliert (Rine,
"Regulation and Transposition of Cryptic Mating type genes in
Saccharomyces cerevisiae", Doktorarbeit, University of
Oregon at Eugene, 1979). In einer normalen "Wildtyp"-Zelle,
die als Paarungstyp-Locus Mat a, eine α-Kassette HLM und das
HO-Allel am homothallischen Locus besitzt, wäre der
HO-Promotor angeschaltet. Falls der Stamm jedoch eine Sir-Mutation
trägt, werden sowohl Mat a als auch Mat α (von HLM)
exprimiert und der HO-Promotor wäre abgeschaltet. Somit kann ein
Stamm verwendet werden, der eine temperaturempfindliche Sir-
Mutation trägt, wobei bei niedriger Temperatur der
HO-Promotor exprimiert, bei hoher Temperatur jedoch reprimiert wird.
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Der regulierte Promotor ist während der Züchtung der
Bäckerhefe abgeschaltet und am Ende der Vermehrung, bzw.
beim Brotteig durch die Veränderung der Bedingungen für die
Hefekultivierung angeschaltet. Wenn z. B. der APase-Promotor
verwendet wird, wird die Hefe in Gegenwart einer regulierten
Menge an Phosphat so vermehrt, daß die Kultur vor Beendigung
der Vermehrung das gesamte Phosphat verbraucht. Zu diesem
Zeitpunkt wird der APase-Promotor durch den Entzug des
Phosphats aus dem Fermenter induziert. Falls ein
temperaturempfindliches Expressionssystem verwendet wird, wird die
Züchtungstemperatur so eingestellt, daß der Promotor während
der Vermehrung aus- und am Ende der Vermehrung angeschaltet
ist.
Die regulierte ortsspezifische Rekombination als
Mechanismus zur Expression eines Leerlauf-Stoffwechselcyclus
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Ein Problem bei der Optimierung der Expression eines
ATP-erniedrigenden Prozesses in Bäckerhefe besteht in der
Schwierigkeit, einen Promotor zu finden, der so reguliert
werden kann, daß er während der Vermehrung der Hefe aus-,
während der Teigsäuerung jedoch angeschaltet ist. Dies ist
deshalb besonders schwierig, weil Hefe für viele
unterschiedliche Anwendungsarten beim Backen verwendet wird, bei
denen aufgrund unterschiedlicher Bedingungen in der
Handhabung die Beschaffenheit der Hefe nicht kontrollierbar sein
dürfte, was den regulierten Promotor beeinflussen kann.
Falls ein Promotor verwendet wird, der durch die gleichen
Zuchtbedingungen reguliert wird, wie sie normalerweise zur
Erzeugung von CO&sub2;, d. h. Glykolyse, benötigt werden, sollte
die Hefe genau so beschaffen sein wie die
Standard-Bäckerhefe.
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Leider sind glykolytische Gene weder stark
transkriptionell reguliert noch werden sie während der Vermehrung der
Bäckerhefe kontinuierlich supprimiert. Die Auslösung der
Expression eines ATP-erniedrigenden Prozesses am Ende der
Vermehrung durch einen glykolytischen Promotor würde jedoch
dieses Problem lösen.
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Es wurde daher ein neues Verfahren entwickelt, das
die Vermehrung der Hefe ohne Verschwendung von ATP erlaubt,
der ATP-erniedrigende Prozeß jedoch durch die von einem
glykolytischen Promotor während des Säuerungsprozesses
ausgehende Expressionen erfolgt. Dies wird durch die Verwendung
eines regulierten, ortsspezifischen
Rekombinationsereignisses erreicht, durch das der Transkriptionsblock innerhalb
des Promotors, z. B. des GPDH-Promotors, entfernt wird. Im
nachstehenden wird darauf näher eingegangen. Es sollte
besonders erwähnt werden, daß diese ungewöhnliche
Expressionsstrategie zur Regulation der Expression einer großen Anzahl
von Genen verwendet werden kann, zu denen auch jene gehören,
die Enzyme für Leerlaufstoffwechselcyclen oder
cytoplasmatische Phosphatasen codieren, wobei diese Strategie jedoch
nicht auf diese beschränkt ist.
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Es konnte gezeigt werden, daß das 2 Mikron-Plasmid
aus Hefe zwischen zwei "inverted repeats" einer
ortsspezifischen Rekombination unterliegen kann (Hartley und Donelson,
Nature 286 (1980), S. 860-864). Diese Rekombination wird
durch eine spezifische Rekombinase (FLP) katalysiert, deren
Gen auf dem 2 Mikron-Plasmid liegt (Broach und Hicks, Cell
21 (1980) S. 501-508). Der GalI-Promotor wird durch Glucose
supprimiert und durch Galactose induziert (Yocum et al.,
Mol. Cell. Biol. 4 (1984), S. 1985-1998). Falls daher GalI-
Promotor zur Regulation der FLP-Expression in Bäckerhefe
verwendet würde, würde somit das FLP-Gen erst exprimiert
werden, wenn Galactose vorhanden ist, vorausgesetzt, das
natürliche 2 Mikron-Plasmid ist verlorengegangen.
Normalerweise wird der Zuchtfermenter unter Glucoselimitierung
betrieben, um den "Crabtree"-Effekt und die Bildung von
Ethanol zu verhindern, und die Erzeugung von Zellen zu
maximieren. Wir haben herausgefunden, daß der GalI-Promotor unter
diesen Bedingungen nicht Glucose-reprimiert ist. Somit wird
durch die Zugabe von Galactose zum Fermenter der
GalI-Promotor induziert, was zur Expression des FLP-Gens führt. Die
Entfernung des 2 Mikron-Plasmids aus Hefe kann z. B. unter
Verwendung des Verfahrens von Erhart und Hollenberg, J.
-
Bact. 156, S. 625-635 erreicht werden. Das FLP-Gen kann
außerdem, wie vorstehend beschrieben, durch einen anderen
regulierbaren Promotor exprimiert werden.
-
Daher wurde ein Clon mit dem FLP-Gen isoliert und
dieses von dem regulierten GalI-Promotor exprimiert. zu
diesem Zweck wurde das 2 Mikron-Hefeplasmid mit XbaI, danach
mit HindIII gespalten und durch präparative
Gelelektrophorese ein 1450 bp XbaI/HindIII-Fragment isoliert. Danach
wurde das isolierte Fragment in ein gebräuchliches, den
GalI-Promotor zwischen den PvuII/SphI-Stellen enthaltendes
Hefeplasmid so eingefügt, daß das FLP-Fragment vom
GalI-Promotor exprimiert wurde, wobei Plasmid AR900 erhalten wurde
(Fig. 1). Dies erlaubte die Expression des Proteins des FLP-
Gens vom GalI-Promotor.
Die Regulation des GalI-Promotors während
kontinuierlicher Vermehrung unter Glucoselimitierung
-
Um den GalI-Promotor als Mechanismus zur Regulation
des FLP-Gens näher zu untersuchen, wurde ein Plasmid
(PRY171, Fig. 2), das den mit dem β-Galactosidase
codierenden Bereich aus E. coli (Parent et al. siehe oben)
verknüpften Gal-Promotor enthielt, durch Integration in das Genom
eines Hefe-Laborstammes, z. B. KY114, transformiert. Dieser
Stamm wurde in einen Chemostaten überimpft, in dem die
Kultur unter Glucoselimitierung in Hefeminimalmedium gezüchtet
wurde. Das Wachstum der Kultur wurde 48 Stunden lang mit
einer Verdopplungszeit von 3,5 Stunden stabil gehalten. Zu
dem Fermenter wurde Galactose bis zu einer Endkonzentration
von 2 % zugegeben und in regelmäßigen Abständen Proben
entnommen. Die β-Galactosidase-Aktivität und die
Proteinkonzentration wurden unter Verwendung von Standardverfahren
gemessen (Miller (1972), Experiments in Molecular Genetics. Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Rose et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78 (1981), S. 2460-2464). Wie
aus Fig. 3 ersichtlich, induzierte der GalI-Promotor unter
Glucose-limitierten Wachstumsbedingungen in Anwesenheit von
Galactose β-Galactosidase-Aktivität.
-
Um die Verwendbarkeit dieses durch Galactose
induzierbaren FLP-Gens zur Regulation der Rekombination zu
untersuchen, wurde ein Hefestamm mit einem das
Gal/FLP-Fusionsgen enthaltenden Plasmid transformiert, dem das
endogene 2 Mikron-Plasmid fehlte, und der zuvor durch
Integration mit einem Plasmid transformiert worden war, das ein von
"tandem repeats" des 2 Mikron-Hefeplasmids flankiertes
heterologes Gen enthielt (Hartley und Donelson, Nature 286
(1980), S. 860-864, Senecoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 82 (1985), S. 7270-7274 und Andrews et al., Cell 40
(1985), S. 795-803). Falls die Gal/FLP-Fusion funktioniert,
sollte der Stamm bei Vermehrung auf Glucose (die den GalI-
Promotor supprimiert) das heterologe Gen exprimieren. Falls
der Stamm jedoch auf Galactose vermehrt wird, sollte das
heterologe Gen durch Rekombination aus dem Genom exzisiert
werden, was zum Verlust des Gens führt (Fig. 4). Es zeigte
sich, daß dies tatsächlich der Fall war, da auf
Glucosemedium 97 % der Kolonien das heterologe Gen exprimierten,
während auf Galactosemedium 0 % der Kolonien die Aktivität des
heterologen Gens enthielten. Im Anschluß daran wurde in den
Promotor, z. B. den GPDH-Promotor, zwischen die
stromaufwärts gelegene Aktivierungssequenz und die
Translationsstartstelle ein Expressionsblock eingefügt, z. B. eine DNA-
Sequenz, die einen Transkriptionsblock wie das URA3 HindIII-
Fragment enthielt, ein "silencer"-Bereich oder ein
Transkriptionsterminator (Brand et al., Cell 21 (1985), S. 501-508).
Dieses Transkriptionsblock-Element wird von
DNA-Sequenzen (eingefügt als synthetische Oligonucleotide, wie in
Tabelle 1 gezeigt) flankiert, von denen gezeigt werden
konnte, daß sie von dem FLP-Genprodukt als Substrate für die
ortsspezifische Rekombination erkannt werden (Senecoff et
al., a.a.O., und Andrews et al., a.a.O.). Somit verläuft die
Regulation über die Zugabe von Galactose zu einer wachsenden
nicht durch Glucose reprimierten Hefekultur. Galactose
induziert die Synthese des FLP-Proteins, das ein
Rekombinationsereignis zwischen den den Expressionsblock flankierenden
DNA-Sequenzen katalysiert. Das Rekombinationsereignis
entfernt
den Expressionsblock und gestattet dadurch die
Expression des heterologen Gens, z. B. des Gens für FDPase, vom
GPDH-Promotor (Fig. 5).
-
Solch ein von Rekombinationsstellen umgebener (in
Fig. 6 gezeigter) Block wurde hinterlegt. Er kann vom
Fachmann in einen Promotor seiner Wahl dadurch eingefügt werden,
daß zuerst ein BglII/SalI-Linker an einer Stelle, die
Expression gestattet, unter Verwendung ortsspezifischer
Mutagenese (Zoller und Smith NAR 10 (1982), S. 6487-6500,
Methods Enzymol. 100 (1983), S. 468-500, und DNA 3 (1984),
S. 479-488) eingefügt wird und danach der
Transkriptionsblock aus Plasmid AZ402 als BglII/SalI-Fragment eingefügt
wird.
Tabelle 1
Sequenz der Stelle für die FLP-katalysierte ortsspezifische
Rekombination
-
Dieses FLP-Expressionssystem kann zur Regulation der
Expression praktisch jeden Gens in einer Reihe von
Wirtszellen verwendet werden. Im allgemeinen kann die regulierte
Expression einer heterologen DNA-Sequenz in einer Wirtszelle
unter Verwendung eines Systems mit zwei Vektoren erreicht
werden. Der erste Vektor enthält eine funktional mit einem
regulierbaren Promotor verknüpfte DNA-Sequenz, die ein FLP-
Protein codiert (FLP-DNA). AR900, der das FLP-Gen funktional
mit dem GalI-Promotor verknüpft enthält, stellt ein Beispiel
für solch einen Vektor dar. Ähnliche Vektoren, die andere
Promotoren enthalten, können durch das Herausschneiden des
GalI-Promotors aus AR900 mit EcoRI und SphI nach
Standardverfahren
und den Austausch gegen einen beliebigen
gewünschten Promotor, ebenfalls unter Verwendung üblicher Techniken
und, falls nötig, passender Linker konstruiert werden. Der
zweite Vektor enthält die zu exprimierende heterologe DNA-
Sequenz, die funktional mit einem Promotor verknüpft ist,
der darin eingefügt einen Expressionsblock enthält, der von
DNA-Sequenzen (flankierender DNA) flankiert ist, die von dem
FLP-Protein erkannt werden. Solche Vektoren können auf
übliche Weise unter Verwendung der SalI - BglII-Kassette aus
AZ402 zusammen mit leicht erhältlichen und/oder
synthetisierten Bausteinen konstruiert werden. Die SalI - BglII
Kassette aus AZ402 enthält den URA3-Expressionsblock als
HindIII-Fragment flankiert von FLP-erkannten
Rekombinationsstellen. Unter Verwendung üblicher Verfahren und wiederum
üblicher Linker, falls erforderlich, kann URA3 gegen andere
Expressionsblöcke ausgetauscht werden. Der Expressionsblock,
d. h. die SalI - BglII-Kassette aus AZ402, wird dann, falls
nötig mit gebräuchlichen Linkern, in den Promotorbereich
eines Vektors eingefügt, der die heterologe DNA-Sequenz
funktional mit einem Promotor verknüpft enthält, so daß die
Expression blockiert wird. Die geeignete Insertion kann
durch die Beobachtung des Phänotyps der mit dem Vektor
transformierten Zellen und/oder durch die Kontrolle des
Kulturmediums auf Abwesenheit des Expressionsprodukts leicht
empirisch bestätigt werden. Die Transformation einer
Wirtszelle mit sowohl dem ersten als auch dem zweiten vorstehend
beschriebenen Vektor ergibt ein Expressionssystem, bei dem
das durch Expression der FLP-DNA im ersten Vektor
hergestellte FLP-Protein eine Rekombination zwischen der
flankierenden DNA des zweiten Vektors katalysiert, dadurch den
Expressionsblock entfernt und die Expression der heterologen
DNA-Sequenz gestattet. Natürlich sollten bei Verwendung
einer bestimmten Wirtszelle die Vektoren die jeweiligen von
dem betreffenden Wirt benötigten genetischen Elemente
enthalten, so wie dies auf dem Fachgebiet bekannt ist.
-
Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen
Vektoren und regulierten Promotoren haben wir Hefestämme
hergestellt,
die sich durch höhere Raten der CO&sub2;-Erzeugung
auszeichnen. Die Herstellung solcher Stämme erfolgte dadurch,
daß in den Wirtsstamm (i) ein ATP-verbrauchender Leerlauf-
Stoffwechselcyclus und in einer weiteren erfindungsgemäßen
Ausführungsform (ii) eine erhöhte Aktivität der
cytoplasmatischen ATPase eingeführt wurde.
Genetische Modifikation von Bäcker- und
Bierhefestämmen
-
Bäcker- und Bierhefestämme stellen ein schwierigeres
Substrat zur Transformation dar als Laborstämme, da sie
polyploid sind und im allgemeinen keine auxotrophen Marker
enthalten, die für die auf dem Fachgebiet gut bekannten
Selektionsverfahren verwendet werden können.
-
Ein modifiziertes oder ein heterologes Gen/Promotor-
Konstrukt, wie das nachstehend diskutierte, mit dem GPDH-
Promotor verknüpfte FDPase-Gen kann jedoch in einen zum
Backen verwendeten Hefestamm unter Verwendung dominanter
Gene für Resistenz gegenüber Arzneistoffen, wie den
Antipilzmitteln Gentamycin (G418) (Jiminez und Davies, Nature
287 (1980), S. 869) oder Hygromycin B (Gritz und Davies,
Gene 25 (1983), S. 179-188) eingeschleust werden.
Beispielsweise wird ein Aminocyclitolphosphotransferase (ACPT)
codierendes Resistenzgen von dem bakteriellen Transposon TN601
getragen, das Resistenz gegenüber G418 verleiht, dessen
Promotor jedoch schwach und daher für die Verleihung von
Resistenz nur teilweise wirksam ist (Jiminez und Davies,
a.a.O.). Der Promotor wird gegen einen Hefepromotor (z. B.
den Hefe-Glyceraldehydphosphatdehydrogenase-Promotor)
ausgetauscht. Im Anschluß daran wird ein Plasmid konstruiert, das
das gewünschte Gen/Promotorkonstrukt mit seinen natürlichen
chromosomalen flankierenden Bereichen zusammen mit dem
vorstehend beschriebenen TN601 ACPT enthält. Dieses Plasmid
enthält keinen Hefe-Replikationsstartpunkt. Der
Bäckerhefestamm wird mit diesem Plasmid transformiert und
Transformanten auf G418-Platten selektioniert. Das auf dem Plasmid
gelegene ACTP kann nur dann stabil beibehalten werden, falls
das Plasmid in das Hefegenom am natürlichen Genlocus
eingefügt
ist. Dies führt zu einer Tandemduplikation des Gens
(z. B.FDPase), die durch das Plasmid und die ACPT-Sequenzen
getrennt wird. Die Vermehrung dieser Transformanten in
Abwesenheit von G418 erlaubt den Verlust des Plasmids durch
"looping out", wobei entweder der "Wildtyp" oder die
eingefügte Sequenz übrig bleiben. Danach werden diese gegenüber
G418 empfindlichen Clone durch Southern-Hybridisierung der
genomischen DNA unter Verwendung von Oligonucleotidsonden
nach der Anwesenheit des heterologen Konstrukts unter
Verwendung von Standardverfahren abgesucht.
(i) ATP-verbrauchende Leerlaufstoffwechselcyclen
-
Eine genetische Modifikation zur Erniedrigung des
zellulären ATP-Spiegels besteht in der Verwendung eines
normalen Stoffwechselwegs in einer anormalen Weise, um so ATP
zu verbrauchen, so daß die Glykolyse angeregt wird.
Vorzugsweise ist der gewählte Stoffwechselweg cyclisch, so daß
seine anormale Verwendung nicht zu einer signifikanten
Netto-Akkumulation oder der Verarmung eines bestimmten
benötigten Stoffwechselintermediats, Substrats oder Produkts
führt. Viele Stoffwechselwege in Hefe können abhängig von
den Zuchtbedingungen und den Bedürfnissen der Zelle in
entgegengesetzten Richtungen ablaufen. Zum Beispiel kann, je
nachdem wie dies für die Zelle erforderlich ist, Metabolit
"A" in Metabolit "B" oder "B" in "A" umgewandelt werden.
Wenn man einen solchen Stoffwechselweg gleichzeitig in
beiden Richtungen ablaufen läßt, führt dies weder zu einer
Netto-Akkumulation noch zum Verlust von Metaboliten, es wird
jedoch die rum Ablaufen der Stoffwechselwege erforderliche
Energie verbraucht, und somit stellt dies einen "Leerlauf"-
Cyclus dar. Natürlich können auch weitere Leerlaufcyclen,
die zusätzliche Schritte beinhalten, verwendet werden (z. B.
A → B → C → A). Transkriptionelle, translationale und
posttranslationale Regulation kann zum An- oder Abschalten eines
solchen Leerlaufcyclus Anwendung finden, bei dem in jeder
Runde des Cyclus ein Molekül ATP verbraucht wird, ohne daß
dabei irgendeine Nettoakkumulation des Produkts oder der
Verlust des Substrats erzeugt wird. In Bäckerhefe wird
bevorzugt die zur Erniedrigung des ATP-Spiegels und dadurch
zur Anregung der Glykolyse erforderliche
Stoffwechseländerung so reguliert, daß diese nur während der Teigsäuerung
wirksam ist.
-
Ein bevorzugter Leerlaufcyclus zum Verbrauch von ATP
ist: Fructose-6-phosphat → Fructose-1,6-diphosphat →
Fructose-6-phosphat. Die an diesem Stoffwechselweg beteiligten
Enzyme, Phosphofructokinase und Fructose-1,6-diphosphatase
(FDPase oder FBPase) wurden ausführlich charakterisiert
(Bloxham and Lardy, The Enzymes, Band 8 Herausgeber Boyer,
Ph. D., (1973), S. 239-278; Uyeda, Adv. Enzymology 48
(1979), S. 193-244; Foy und Bhattachargee, Arch. Microbiol.
129 (1981), S. 215-220, und Funayama et al., (1979)). Durch
die Clonierung des Gens für FDPase und durch den Austausch
seines Promotors gegen einen regulierten Promotor, kann das
Gen wie gewünscht exprimiert werden. Wir haben
herausgefunden, daß die Expression dieses Gens während der Vermehrung
auf Glucose ausreicht, um einen beträchtlichen Verlust an
ATP und die dadurch bedingte Steigerung der Glykolyserate zu
erreichen. Die Optimierung des FDPase-getriebenen
Leerlaufcyclus setzt ein Verständnis für die natürliche Regulation
von FDPase voraus. Der Klarheit halber wird die
FDPase-Regulation kurz diskutiert.
FDPase-Regulation
-
Die Regulation der FDPase wurde von einer Reihe von
Wissenschaftlern untersucht. Zur Verhinderung eines
Leerlaufcyclus zwischen der Synthese und der Hydrolyse von
Fructose-1,6-diphosphat in Wildtyp-Hefe wird dieses Enzym
schnell inaktiviert, wenn zu Zellen, die auf
nicht-vergärbaren Kohlenstoffquellen wachsen, Glucose zugegeben wird.
Diese Inaktivierung der FDPase scheint in drei Stufen zu
erfolgen. Eine anfängliche Hemmung der Aktivität des Enzyms
wird durch eine allosterische Regulation erreicht (Lenz und
Holzer, F.E.B.S. Lett. 109 (1980), S. 271-274, Wolf und
Holzer, Transport and Utilization of Aminoacids, Peptides and
Proteins by Microorganisms, Herausgeber Payne, J.W., John
Wiley, Chinchester (1980), Tortora et al., Biochem. Biophys.
-
Res. Comm. 100 (1981), S. 688-695). Wenn Glucose zu
Hefezellen gegeben wird, steigt die Konzentration von Fructose-2,6-
diphosphat innerhalb von Sekunden von nicht nachweisbaren
Spiegeln auf Konzentrationen von mehreren 4M an, was
ausreicht, um FDPase partiell zu hemmen. Die Mechanismen, die
die Synthese von Fructose-2,6-diphosphat regulieren, sind
nicht klar (Gancedo et al., J. Biol. Chem. 258 (1983), S.
5998-5999). Nach der anfänglichen schnellen Hemmung tritt
über einen Zeitraum von mehreren Minuten eine zweite Phase
ein, die die Phosphorylierung der FDPase beinhaltet (Müller
und Holzer, Biochem. Biophys. Res. Comm. 103 (1981), S. 926-933,
Tortora et al., a.a.O., Purman et al., Biochem.
Biophys. Res. Comm. 107 (1982), S. 1482-1489). Der
Phosphorylierungsstatus von FDPase wird durch eine spezifische
Kinase und eine spezifische Phosphatase reguliert. Die
Phosphorylierung erfolgt an einem bestimmten Serinrest (Müller
und Holzer, a.a.O, Mazon et al., J. Biol. Chem. 257 (1982),
S. 1128-1130). Die modifizierte FDPase ist weniger aktiv als
das unmodifizierte Enzym. Schließlich scheint das
phosphorylierte Enzym ein Substrat für eine spezifische Protease
darzustellen, die während eines Zeitraums von ungefähr 1 Stunde
eine irreversible Inaktivierung der FDPase katalysiert.
-
Genetische Modifikationen zur Regulation von FDPase
Es gibt verschiedene genetische Verfahren, die zur
Hemmung dieser Inaktivierung von FDPase anwendbar sind.
Mutanten, die kein Fructose-2,6-diphosphat synthetisieren,
bzw. die eine FDPase besitzen, die den Inhibitor nicht
bindet, hemmen am Anfang der Inaktivierungskaskade. Durch
ortsspezifische Mutagenese des Serins, das ansonsten
phosphoryliert wird, erhält man ein Enzym, das gegenüber dem zweiten
und dritten Schritt umempfindlich ist. Etwas Enzymaktivität
ist nach der anfänglichen partiellen Hemmung durch Fructose-
2,6-diphosphat noch vorhanden (Lenz und Holzer, a.a.O., Wolf
und Holzer, a.a.O., Tortora et al., a.a.O.) Diese
Enzymaktivität ist ausreichend, um ein deutliches Ablaufen des
Leerlaufstoffwechselwegs zu bewirken.
-
Wir konnten die Phosphorylierungsstelle (Ser&sub1;&sub2;) in
FDPase bestimmen, da dies die einzige auf dem clonierten
FDPase-Gen vorhandene Konsensus-Erkennungsstelle für cAMP-
abhängige Proteinkinasen ist (Arg&sub9;·Arg&sub1;&sub0;·Asp&sub1;&sub1;·Ser&sub1;&sub2;), und
diese durch übliche ortsspezifische Mutagenese leicht ändern
(Zoller und Smith, a.a.O.). Wir haben herausgefunden, daß
zur Verhinderung der Phosphorylierung ein
Aminosäureaustausch des Serins ausreicht, um genügend Enzymaktivität zu
erzeugen und so ein Durchlaufen des Leerlaufstoffwechselwegs
auf einem beträchtlichen Niveau zu bewirken. Das Enzym wird
jedoch auch durch hohe Konzentrationen von AMP gehemmt
(Taketa und Pogell,. J. Biol. Chem. 240 (1965), S. 651-662).
Zur weiteren Optimierung kann das Enzym (das aufgrund des
Austauschs an Ser&sub1;&sub2; bereits etwas resistent gegenüber AMP-
Hemmung ist) außerdem an seiner AMP-Bindungsstelle zur
Beseitigung dieser Hemmung geändert werden. Die Bindungsstelle
auf dem Enzym für AMP wurde beschrieben. Zur Erzielung einer
erhöhten enzymatischen Aktivität bezüglich des
Leerlaufstoffwechselwegs kann diese Stelle in vitro mutiert, erneut
in Hefe eingeschleust und der Verlust der Hemmung durch AMP
indirekt bestimmt werden. Eine mutierte Form des Enzyms, die
nicht mehr durch AMP gehemmt wird, gestattet eine normale
Vermehrung der Hefe auf Platten mit einer
gluconeogenetischen Kohlenstoffquelle, jedoch nur ein schwaches Wachstum
auf Glucose und erlaubt somit einen einfachen Nachweis solch
einer Modifikation.
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Da die an diesem Leerlaufstoffwechselcyclus
beteiligten Enzyme eigentlich die Hauptproteine in Hefe darstellen,
reicht dieser Stoffwechselweg zum Verbrauch einer
beträchtlichen Menge ah ATP aus. Die Anregung der Glykolyse kann
durch Veränderung der Kopienzahl des veränderten
Fructosediphosphatase-Gens, der Stärke des Promotors oder des in dem
Expressionsvektor mit FDPase bzw. einer FDPase-Variante
verwendeten Promotors wie beschrieben fein abgestimmt werden,
wobei jeder gewünschte Spiegel der CO&sub2;-Ausbeute erhalten
wird.
Alternative Leerlauf-Stoffwechselcyclen
-
Es gibt eine überraschend große Anzahl alternativer
Leerlauf-Stoffwechselcyclen, die zum Verbrauch von ATP
eingesetzt werden können. Die Umwandlung von Phosphoenolpyruvat
zu Pyruvat durch Pyruvatkinase kann z. B. umgekehrt werden
(Katz, J. und Rognstad, R., Cur. Top. Cell. Reg. 10 (1976),
237-289 und Reeves, R.E., Biochem. J. 125 (1971) S. 531).
Alternativ dazu existieren viele weitere
Leerlaufstoffwechselcyclen, die ATP verschwenden, dazu gehören jene, die bei
der Aminosäurebiosynthese und dem -Abbau, der
Polyphosphatsynthese und dem -Abbau, der Fettsäurebiosynthese und
der Pyrimidinbiosynthese anzutreffen sind. Da diese alle
strikt auf dem Transkriptionsniveau reguliert sind, kann ein
Leerlaufstoffwechselzyklus durch die Veränderung der
Regulation der beteiligten Enzyme durch Änderung ihrer Promotoren
induziert werden. Solche Zyklen besitzen jedoch zusätzliche
Regulationsmechanismen. Im allgemeinen beinhaltet die
zusätzliche Regulation eine Rückkopplungs-Hemmung oder eine
allosterische Modulation der Enzymfunktion durch
Zwischenprodukte oder Produkte des Energiestoffwechsels. Falls
erwünscht, können solche allosterischen Bindungsstellen
modifiziert werden, um dadurch eine allosterische Hemmung zu
eliminieren oder zu erniedrigen analog zu den hierin
beschriebenen Verfahren wie in dem zur Veranschaulichung
dienenden Fall von FDPase. Zu weiteren Arten der Regulation
gehören die Absonderung von einem der Enzyme in ein Organell,
in dem die Verfügbarkeit des Substrats reguliert werden
kann, oder im Einfangen eines instabilen Zwischenprodukts in
einem Enzymkomplex, was diesem die schnelle Umwandlung in
ein stabiles Zwischenprodukt erlaubt. All diese
Stoffwechselwege stellen potentielle induzierbare ATP-hydrolysierende
Prozesse dar, und können daher über eine geeignete
genetische Modifikation zum Verbrauch von ATP verwendet werden.
-
Falls erwünscht, kann die Menge des von der
modifizierten Zelle verbrauchten ATP zur Maximierung der CO&sub2;- und
Ethanolerzeugung reguliert werden. Dies kann durch die
Verwendung eines stärkeren oder schwächeren Promotors oder
durch die Modulation von dessen Aktivität erreicht werden,
oder durch die Verwendung eines temperaturempfindlichen
Regulationsgens, bei dem das Ausmaß der Regulation, wie
vorstehend beschrieben, von der Temperatur der Kultur abhängt.
(ii) Einführung einer cytoplasmatischen sauren
Phosphatase mit gesteigerter Aktivität
-
Eine alternative Modifikation zur Regulation der
Glykolyserate beinhaltet die Erzeugung einer cytoplasmatischen
sauren Phosphatase, um so organische Phosphate
einschließlich ATP zu hydrolysieren. Die normalerweise extrazelluläre
saure Phosphatase der Hefe Saccharomyces cerevisiae stellt
eine induzierbare, unspezifische, im Periplasma lokalisierte
Phosphatase dar. Das Gen für dieses Enzym wurde kürzlich
cloniert und charakterisiert (siehe Rogers et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., U.S.A. 79 (1982), S. 2157-2161). Die
Vermeidung der Sezernierung von Phosphatase in das Periplasma
der Zelle (z. B. durch genetische Modifikation, bei der der
sekretorische Leader des Enzyms entfernt wird), führt zu
einer Dephosphorylierung organischer Phosphate im Cytoplasma
einschließlich ATP. Diese unspezifische Phosphatase
dephosphoryliert jedoch auch andere wichtige organische Phosphate,
wodurch schwere Schäden im Stoffwechsel der Zelle
hervorgerufen werden. Das Niveau an "gefangener" cytoplasmatischer
Phosphatase muß daher strikt reguliert werden. Es stellte
sich z. B. heraus, daß der natürliche Promotor für die saure
Phosphatase der Hefe (PHO5), falls dieser zur Erzielung
einer Steigerung der Glykolyserate voll induziert ist, zu
viel ATPase-Aktivität exprimiert. Zur Erzielung eines
regulierten Verfahrens zur ATP-Hydrolyse durch eine
cytoplasmatische saure Phosphatase wird bevorzugt ein schwächerer
Promotor verwendet, so daß die gewünschte Wirkung bei voller
Induktion eintritt, oder es wird der Grundspiegel eines
induzierbaren Promotors wie nachstehend beschrieben,
angewandt. Dies kann auf verschiedene Arten erreicht werden,
Beispiele dafür wurden vorstehend beschrieben.
(iii) Modifikation der Funktion der Plasmamembran
-
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform
betrifft die ATPase der Plasmamembran, die mehr als ein
Drittel des durch Gärung erzeugten ATP zur Regulation der
Ionenkonzentration im Cytoplasma verwendet. Dies stellt den
Hauptstoffwechselweg zur ATP-Hydrolyse in der Zelle dar, die
Anregung dieses Stoffwechselwegs kann somit zur Erniedrigung
des zellulären ATP-Spiegels und dadurch zur Anregung der
Gärung (d. h. der Ethanol- und Kohlendioxiderzeugung) verwendet
werden.
-
Es deutet einiges darauf hin, daß einige
Arzneistoffe, die auf die Plasmamembran-Protonenpumpe einwirken,
die Zelle zur Anregung der Gärung induzieren (Serrano, Eur.
J. Biochem. 105 (1980), S. 419). Die nachgewiesene Anregung
ist sehr gering. Es scheint, daß die Bedeutung dieses
Befunds übergangen und einfach als innerhalb der
experimentellen Fehlergrenze liegend abgetan wurde. Die Gründe für diese
Anregung sind nicht vollständig klar, da weitere
Arzneistoffe (d. h. Dicyclohexylcarbodiimid und
Diethylstilbestrol), die ebenfalls den Plasmamembran-Protonengradienten
unterbrechen, keine Anregung der Gärung bewirken. Eine durch
diese Arbeit gestützte Erklärung wäre, daß
Dicyclohexylcarbodiimid und Diethylstilbestrol die Plasmamembran-ATPase
hemmen und daher die zellulären ATP-Spiegel nicht
erniedrigen. Eine beträchtliche Schädigung des allgemeinen
Zellstoffwechsels kann außerdem durch die Störung weiterer ATP-
abhängiger Membranfunktionen bewirkt werden. Die Wirkung von
Dinitrophenol scheint auf einer direkten Unterbrechung des
Protonengradienten durch die Plasmamembran zu beruhen. Dies
regt die Plasmemembran-ATPase an und kann dadurch die
Spiegel an zellulärem ATP erniedrigen.
-
Ein alternatives Verfahren zur Anregung der
Plasmamembran-ATPase wäre die Verwendung kleiner Proteine, wie
Ribonuclease (Alper et al., J. Bact. 93 (1967), S. 759-765,
Yphantis et al., J. Bact. 94 (1967), S. 1509-1515) oder
Hefekillertoxin (Bussey und Sherman, Biochimica et Biophysica
Acta 298 (1973), S. 868-875).
-
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, die
lediglich exemplarisch sind, näher veranschaulicht. Dies
sollte nicht als Einschränkung des wirklichen Schutzumfangs
der Erfindung, der in den Ansprüchen wiedergeben ist,
aufgefaßt werden.
Experimentelle Beispiele
Materialien
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Alle DNA-Restriktions- und Stoffwechselenzyme wurden
von New England Biolabs bezogen. Diese Enzyme wurden außer
Mungbean-Exonuclease, die von PL Biochemicals bezogen und
wie beschrieben verwendet wurde, unter den von New England
Biolabs beschriebenen Bedingungen und Puffern angewandt. ATP
und die Desoxynucleosidtriphosphate (dNTP's), d. h. dATP,
dGTP, dCTP und dTTP wurden von PL Biochemicals und 32 P) von
New England Nuclear Corporation bezogen.
-
Die Ligierungsreaktionen wurden, wie von Maniatis et
al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982))
beschrieben, auf dessen Offenbarungsgehalt hiermit Bezug
genommen wird, unter der Verwendung der dort auf Seite 246
beschriebenen Puffer und unter Verwendung einer
DNA-Konzentration von 1-100 ug/ml bei einer Temperatur von 23ºC für DNA
mit glatten Enden und 16ºC für DNA mit überstehenden Enden
durchgeführt. Die Elektrophorese wurde in 90 mM Tris-Borat,
10 mM EDTA enthaltenden 0,5 bis 1,5 % Agarosegelen
durchgeführt.
-
Nach der DNA-Spaltung wurden die Restriktionsenzyme
durch 10-minütiges Erhitzen auf 65ºC inaktiviert. Bei der
Durchführung aufeinanderfolgender Reaktionen wurde nach
jedem Schritt die DNA mit 70 % Ethanol präzipitiert. Nach dem
Auffüllen einer Restriktionsstelle durch die Reaktion mit
dem großen Fragment der DNA-Polymerase (Klenow) und den vier
dNTP's wurde das Reaktionsgemisch auf 10 mM Magnesiumchlorid
eingestellt und das gleiche Volumen an 5 M Ammoniumacetat
zugegeben. Die DNA wurde mit 2 Volumina Ethanol bei -20ºC
gefällt und die DNA durch 10minütige Zentrifugation in einer
Eppendorf-Microfuge bei 4ºC pelletiert. Ethanol wurde
abgegossen
und das Pellet in 10 ul 0,2 M Natriumacetat/ug DNA
gelöst. Die DNI wurde mit 2 Volumina Ethanol erneut gefällt
und wie vorstehend beschrieben, zentrifugiert. Bevor mit dem
nächsten Herstellungsschritt weitergemacht wurde, wurde das
DNA-Pellet unter Vakuum getrocknet. Synthetische
Oligonucleotide wurden wie in Maniatis et al., a.a.O.,
beschrieben kinasiert, durch Erhitzen auf 65ºC aneinandergelagert
und vor ihrer Verwendung langsam auf 4ºC abgekühlt.
DNA-Herstellung und Transformation
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Die Reinigung von "super coiled"-Plasmid-DNA aus E.
coli und die Transformation von E. coli erfolgte wie in
Maniatis et al., 1982, a.a.O., beschrieben. Die
Transformation von Hefe erfolgte wie von Hinnen et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 75 (1978), S. 1929-1933 beschrieben, außer
daß anstelle von 1,0 M 1,2 M Sorbit verwendet wurde. Die
Plasmidherstellung im kleinen Maßstab zum Screening
transformierter Bakterien erfolgte im wesentlichen nach Maniatis
et al., (1982), a.a.O., und Holmes und Quigley, Anal.
Biochem. 14 (1981), S. 193, außer daß nach der
Restriktionsenzymspaltung durch die Zugabe von 1 ul einer Lösung von 1
mg/ml RNAse (Boehringer Mannheim) in die Kammer des
Agarosegels kurz vor der Elektrophorese eine RNAse-Spaltung
durchgeführt wurde.
Stämme und Medien
-
Für alle bakteriellen Transformationen wurde der E.
coli-Stamm HB101 verwendet. Die Hefestämme DB745 (Botstein
et al., Gene 8 (1979), S. 17-24), KYII4 oder ATCC 26675
wurden verwendet. E. coli wurde in LB-Medien mit oder ohne
Ampicillin (49 ug/ml) wie beschrieben (Maniatis et al.,
(1982), a.a.O.) gezüchtet. Vor der Transformation wurde Hefe
bei 30ºC in 1 % Hefeextrakt (Difco), 1 % Bacto-Peptone
(Difco) und 2 % Glucose enthaltenden Medien gezüchtet.
Hefeminimalmedium enthielt 5 g Ammoniumsulfat, 10 g Glucose, 40
mg Adenin, 60 mg Leucin, 2 ug Biotin, 400 ug
Calciumpentothenat, 2 ug Folsäure, 2 ug Inosit, 400 ug Niacin, 100 ug p-
Aminobenzoesäure, 400 ug Pyridoxin-Hydrochlorid, 500 ug
Borsäure, 40 ug Kupfersulfat, 100 ug Kaliumjodid, 200 ug
Natriummolybdat,
400 ug Zinksulfat, 500 mg Magnesiumsulfat, 100
mg Natriumchlorid, 100 mg Calciumchlorid und 1 g
(Hochphosphatmedium)- oder 10 mg (Niedrigphosphatmedium)
-Kaliumphosphat (monobasisch) pro Liter. Zur Induktion des Promotors
für saure Phosphatase wurden die Zellen bei 30ºC auf
Hochphosphat-Hefeminimalmedium vorgezüchtet, durch Waschen das
Phosphat entfernt und diese dann in
Niedrigphosphat-Hefeminimalmedium überführt, um dann die Vermehrung bei 30ºC
wieder aufzunehmen. Maximale Induktion trat 8 bis 12 Stunden
nach Überführung ein.
-
Bei dem für die Dinitrophenolexperimente verwendeten
Hefestamm handelte es sich bei dieser Untersuchung um
"Fleischman's active dry yeast". Die Hefe wurde in 1 %
Hefeextrakt (Difco), 1 % Bactopepton (Difco), 0,05 M
Di-Kaliumphosphat enthaltendem und mit Citronensäure auf pH 5,6
titriertem CO gezüchtet. Die Medien wurden in 15
Liter-Flaschen in jeweils 10 Liter-Chargen hergestellt und 2 Stunden
bei 121ºC autoklaviert. Nach dem Abkühlen wurde sterile
Glucose bis zu 2 Gew. -% zugegeben. Zur Vermeidung von
Schaumbildung wurde alle 24 Stunden Antischaummittel zugegeben.
Kurz vor dem Anschließen der Medienzuführung an den
Chemostaten und das Kulturgefäß wurde Dinitrophenol direkt zu der
15 Liter-Flasche mit dem Medium gegeben, um so in der
Medienzuführung dieselbe Konzentration herzustellen.
Dinitrophenol wurde als Stammlösung in Ethanol zubereitet. Vor
Inoculation des Chemostaten wurden die Zellen über Nacht in CO
gezüchtet. Die Chemostatkultur wurde in einem New Brunswick
Scientific Modell F-2000 gezüchtet. Das Kulturgefäß wurde
durch die Anbringung eines Seitenarms so angepaßt, daß sich
ein Arbeitsvolumen von 1 Liter ergab. Die verbrauchte Kultur
ließ man mit Hilfe einer untergetauchten offenen Röhre aus
dem Gefäß herausfließen, um so den Verlust von
Antischaummittel, das dazu neigte, an der Oberfläche der Kultur zu
bleiben, zu verhindern.
-
Der Fermenter wurde bei 30ºC und einer
Rühreinstellung von 4 betrieben. Stickstoff wurde mit einer
Geschwindigkeit von 500 cc/min kontinuierlich durch das Gefäß
geleitet.
Das abgeleitete Gas wurde durch eine Feuchtigkeitsfalle
von Dry-Rite und zur Messung des Kohlendioxids in ein
Massenspektrometer-Gasanalysegerät von Perkin Elmer geleitet.
-
In der kontinuierlichen Kultur wurden die Medien
unter Verwendung einer Pharmacia-Pumpe Modell M3 mit einer
Geschwindigkeit von 250 ml/h zugegeben. Bei der Durchführung
der Kohlendioxidmessungen wurden alle Einstellungen,
Volumina und Temperaturen überprüft und, falls erforderlich,
nachgestellt. Es zeigte sich, daß die Medienzugabe, die
Temperatur und die Rührgeschwindigkeit ziemlich stabil waren,
die Stickstoffgaszugabe jedoch innerhalb eines Zeitraums von
4 Stunden in einem Bereich von 10 % schwankte. Deshalb wurde
der Abfluß aus dem Gasanalysegerät in einen
Diagrammschreiber geleitet und die Durchflußrate des Stickstoffs von Hand
während eines Zeitraums von 2 Stunden eingestellt. Bevor
Messungen der Zelldichte in der Kultur durchgeführt wurden,
wurden während dieses Zeitraums die Durchflußgeschwindigkeit
des Stickstoffs und das Kohlendioxidniveau in dem
abgeleiteten Gas auf Stabilität überprüft. Somit konnte gezeigt
werden, daß die Kultur vor der Durchführung von Messungen
innerhalb der Nachweisgrenzen stabil war. Dies bestätigte sich
auch durch die Reproduzierbarkeit der Daten. Die
Kulturdichte wurde nach 10-facher Verdünnung der Kultur in Wasser
in einem Bausch and Lomb-Modell Spectronic 20 bei 600 nm
bestimmt.
Vektorkonstruktion
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Um die Größe des Expressionsplasmids möglichst gering
zu halten und die Anzahl der Restriktionsstellen zu
reduzieren, wurde ein Plasmid konstruiert, das das Uracil 3-Gen
(URA3) als Markergen und den 2 u Replikationsstartpunkt
enthielt. Alternativ können auch andere Hefeplasmide, wie
YEP24, YEP13 oder ähnliche verwendet werden (Parent et al.,
siehe oben). Unser Plasmid stammte von YIp5 (Botstein et
al., siehe oben), dem ein den Replikationsstartpunkt des 2 u
Hefeplasmids enthaltendes HaeIII/HpaI-Fragment zugefügt
worden war. Das Plasmid YOp1 (Fig. 7) wurde durch die Einfügung
des 2 u Replikationsstartpunkts in die EcoRI-Stelle von YIp5
konstruiert. Plasmid DNA aus YEp24 (Botstein et al., a.a.O.)
wurde mit den Restriktionsenzymen HaeIII und HpaI gespalten
und die DNA ,auf einem präparativen 1,0 % Agarosegel laufen
gelassen. Das den 2 u Replikationsstartpunkt enthaltende 1,4
kb-Fragment wurde durch Vergleich mit dem Laufmuster von
Nolekulargewichtsmarkerfragmenten bestimmt und in eine in die
Agarose geschnittene Kammer elektroeluiert. Zur Reinigung
des DNA-Fragments wurde der Puffer aus der Kammer über eine
DEAE-Sephacelsäule laufen gelassen (Maniatis et al, a.a.O.).
Plasmid YIp5 wurde mit EcoRI gespalten und die überstehenden
Enden unter Verwendung des Klenow-Fragments der
DNA-Polymerase 1 und aller vier dNTP's aufgefüllt. Das HaeIII/HpaI-
Fragment aus YEp24 wurde in die aufgefüllte EcoRI-Stelle von
YIp5 ligiert (Fig. 7). Das Ligierungsgemisch wurde in HB101
transformiert und die so erhaltenen Ampicillin-resistenten
Kolonien auf die Anwesenheit des 2u-Replikationsstartpunkt-
Fragmentes abgesucht. Da eine mit einer HaeIII-Stelle
ligierte aufgefüllte EcoRI-Stelle wieder eine EcoRI-Stelle
ergibt, konnte die Orientierung des Fragments durch Kartierung
der erhaltenen EcoRI-Stelle gegenüber Restriktionsstellen
auf dem Plasmid bestimmt werden. Ein Plasmid mit der EcoRI-
Stelle proximal zur PstI-Stelle innerhalb des Gens für
Ampicillinresistenz (YOp1) wurde für die nachfolgenden
Konstruktionen verwendet.
Beispiel 1
Durch Leerlaufstoffwechsel bewirkter Verlust von ATP
Isolierung des Gens für Fructose-1,6-diphosphatase
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Das Gen für FDPase wurde durch Komplementierung einer
Deletionsmutante für FDPase in E. coli (Stamm DF657, CGSC
Nr. 6695) isoliert. Eine Plasmidgenbank von genomischer
Wildtyp-Hefe-DNA in einem pBR322-Plasmidvektor wurde in
DF657 transformiert und auf Antibiotikaresistenz
selektioniert. Ein das Hefe-FDPase-Gen tragendes Plasmid wurde
aufgrund seiner Eigenschaft, den Bakterien Wachstum auf einer
durch Gluconeogenese abbaubaren Kohlenstoffquelle zu
gestatten, bestimmt. Der Hefe-FDPase-Clon wurde unter Verwendung
des Didesoxynucleotid-Sequenzierungsverfahrens von Sanger et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), S. 5463-5467
seguenziert (Fig. 8). Der Vergleich der von der DNA-Sequenz
abgeleiteten Aminosäuresequenz von Hefe-FDPase ergab mehr
als 50 % Homologie mit der Aminosäuresequenz der gereinigten
Schweine-FDPase (Marcus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
79 (1982), S. 7161-7165, (Fig. 9) und bestätigte so die
Identifizierung des richtigen Hefeclons.
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Da zur Vermeidung einer vorzeitigen Vergeudung von
ATP ein Leerlaufstoffwechselzyklus sorgfältig reguliert
werden muß, bestand die erste Anpassung des natürlichen FDPase-
Gens im Austausch seines Promotors gegen eine Sequenz, die
während der Gärung reguliert werden konnte. Durch die
Bestimmung der Restriktionsstellen der DNA-Sequenzen von Hefe-
FDPase konnte eine NdeI-Stelle sehr nahe am Beginn des
codierenden Bereichs bestimmt werden (Fig. 10). Über in-vitro-
Mutagenese wurde das 5'-Ende des Clons durch die Umwandlung
der NdeI-Stelle zu einer SphI-Stelle für die Expression von
einem heterologen Hefepromotor angepaßt. Das FDPase-Gen
wurde zuerst in pBR322 subcloniert, wobei Plasmid AR705
(Fig. 10) erzeugt wurde. Plasmid AR705 wurde mit NdeI
gespalten und mit Mungbean-Exonuclease behandelt. Ein Adapter,
der vier von sechs Basenpaaren einer SphI-Stelle an einem
Ende und einen XhoI-Überhang am anderen Ende enthielt, wurde
in das Plasmid ligiert, mit XhoI gespalten und das Plasmid
unter Verwendung von T4 DNA-Ligase geschlossen, wobei
Plasmid AT823 (Fig. 10) erzeugt wurde. Das Ligierungsgemisch
wurde in Bakterien transformiert und Ampicillin-resistente
Kolonien auf die Anwesenheit von SphI- und XhoI-Stellen
abgesucht.
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Das FDPase-Gen im Plasmid AT823 wurde mit dem
Promotor des Gens für Glyceraldehydphosphatdehydrogenase (GAP491)
[Holland und Holland, J. Biol. Chem. 255 (1980), S. 2596-2605]
wie folgt ligiert. Das von Plasmid M903 abstammende
Plasmid 0605 (Fig. 13) wurde mit KpnI gespalten, mit dem
Klenow-Fragment der DNA PolI behandelt und mit HindIII
gespalten. Plasmid AT823 wurde mit SphI gespalten, mit dem
Klenow-Fragment der DNA Poll behandelt und mit HindIII
gespalten.
Das 3,8 kb SphI/HindIII-Fragment wurde isoliert und
in HindIII/KpnI-gespaltenes O605 ligiert, wobei Plasmid
AU125 erzeugt wurde. Die Expression des FDPase-Gens im
Plasmid AU125 wird nun vom GPDH-Promotor reguliert.
FDPase-Nutagenese
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Das Plasmid, das die FDPase mit dem heterologen
Promotor enthält, wurde in Hefe transformiert und die
Transformanten auf Expression des FDPase-Clons getestet. Die FDPaSe-
Aktivität war bei Aufzucht der Zellen unter induzierenden
Bedingungen auf einer durch Gluconeogenese oder Glykolyse
abbaubaren Kohlenstoffquelle nachweisbar. Man kann davon
ausgehen, daß bei der Vermehrung mittels Gärung
allosterische Inhibitoren und Enzyminaktivierung die Enzymaktivität
erniedrigen.
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Da die Inaktivierung durch die Phosphorylierung eines
serinrestes vermittelt wird, besteht eine erfindungsgemäße
Änderung des Strukturgens in der Eliminierung dieser
Phosphorylierungsstelle. Der phosphorylierte Serinrest wurde als
Rest 12 bestimmt (die einzige cAMP-abhängige
Erkennungsstelle für Proteinkinase in der Sequenz, und durch
Peptidkartierung des gereinigten phosphorylierten Enzyms und
Aminoäuresequenzierung des phosphorylierten Peptids
(Rittenhouse et al., J. Biol. Chem. 261 (1986), S. 3939-3943).
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Es konnte kürzlich gezeigt werden, daß durch die
Durchführung einer milden Trypsinspaltung bei Leber-FDPase
eine aminoterminale Deletion erzeugt werden konnte, die ihre
Aktivität beibehielt (Chatterjee et al., 1985). FDPasen aus
Säugern und Hefe zeigen einen hohen Konservierungsgrad. Es
wurde eine aminoterminale Deletion des Hefeenzyms
hergestellt und die Aktivität getestet.
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Fructose-1,6-diphosphatase (FDPase) wurde von der auf
der DNA-Sequenz innerhalb des Aminoterminus des Gens
vorhandenen EcoRV-Restriktionsstelle an den Hefe-GPDH-Promotor
angefügt (Fig. 12, AX4). Dies ergab eine aminoterminale
Deletion bis zu Rest 19, der die Erkennungsstelle für
Proteinkinase fehlte.
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Außerdem wurde Serin (Rest 12) unter Verwendung
ortsspezifischer Mutagenese in ein Alanin umgewandelt (Zoller
und Smith, a.a.O.). Dabei handelt es sich um einen
konservativen Austausch, bei dem man davon ausgeht, daß er zwar die
Aktivität des nicht-phosphorylierten Proteins nicht
beeinflußt, jedoch die Phosphorylierung des Enzyms verhindert.
Das Serin hätte außerdem unter Verwendung ortsgerichteter
Mutagenese in Threonin, Valin, Cystein oder eine andere
Aminosäure umgewandelt werden können (Fig. 13). Dies wurde
durch Clonierung des um diesen Rest gelegenen Teils der
Sequenz in M13, ein einzelsträngiges DNA-Virus, erreicht. Es
wurde ein synthetisches Oligonucleotid hergestellt, das mit
diesem Bereich der DNA hybridisierte, jedoch an dem
Serinrest eine solche Fehlpaarung aufwies, daß die Sequenz ein
verändertes Codon enthielt. Von diesem Hybrid wurde unter
Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase PolI ein
doppelsträngiges Molekül erzeugt. Die Reaktion wurde in
Gegenwart aller vier Desoxynucleotidtriphosphate und
DNA-Ligase durchgeführt. Danach wurde diese hybride
doppelsträngige DNA in Bakterien cloniert, repliziert, erneut gereinigt
und erneut in Bakterien transformiert, um so die beiden
Stränge zu trennen. Die eine Hälfte der Nachkommenschaft
enthält die Sequenz für Serin, die andere Hälfte enthält die
gegen Alanin oder ein anderes Codon nach Wahl ausgetauschte
Sequenz. Diese konnten durch Hybridisierung mit einem kurzen
Oligonucleotid (17 bp), das komplementär zu der ersetzten
Sequenz war, unterschieden werden. Danach wurde dieses
substituierte Gen wie vorstehend beschrieben wieder in einen
GPDH-Expressionsvektor mit hoher Kopienzahl eingesetzt und
in einen Hefelaborstamm, z. B. KY114, transformiert.
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Um die Glykolyserate zu messen, wurden Hefekulturen,
die FDPase-Clone vom Glyceraldehydphosphatdehydrogenase
(GPDH)-Promotor exprimierten, in kleinen 1 Liter-Fermentern
untersucht. Es wurden Batch-Kulturen gezüchtet und
Stickstoff bei 110 ml/min. durch die Kultur durchgeblasen.
Kohlendioxid und die Zelldichte wurden in regelmäßigen
Abständen gemessen.
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Zu Beginn wurden Hefekulturen, die das Wildtyp-Enzym
(Plasmid AU125) und die aminoterminale Deletion (Plasmid
AX4) exprimierten mit einem Kontrollplasmid verglichen, das
eine nicht-exprimierte FDPase enthielt (Plasmid AU110) (Fig.
14). Der von den Kulturen zu Beginn des Wachstumscyclus
erzeugte Kohlendtoxidspiegel ist sehr ähnlich. Gegen Ende des
Wachstumscyclus wurden jedoch bedeutend höhere CO&sub2;-Spiegel
erzeugt. Die Steigerung der Kohlendioxidausbeute ist bei dem
Stamm, der die aminoterminale FDPase-Deletion trägt,
geringer als bei jenem, der das Wildtyp-Enzym exprimiert. FDPase
scheint jedoch in diesem Hefestamm nicht inaktiviert zu sein
und die aminoterminale Deletion besitzt eine deutlich
geringere spezifische Aktivität als das "Wildtyp"-Enzym. Man
hätte somit erwartet, daß das Wildtypenzym zu einer größeren
Anregung der Glykolyse als das die Deletion enthaltende
Enzym geführt hätte. Interessanterweise steigt die
Kohlendioxidausbeute lediglich gegen Ende des Wachstumscyclus an.
Dies deutet darauf hin, daß während der exponentiellen
Wachstumsphase FDPase allosterisch reguliert wird. Die
wahrscheinlichsten Kandidaten für diese Regulation sind
Fructose-2,6-diphosphat oder AMP.
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Nachdem spezifische Punktmutanten an der
Phosphorylierungsstelle der FDPase erzeugt worden waren, wurden die
Gärungsexperimente wiederholt. In diesen Experimenten wurden
der Stamm ATCC 26675 untersucht, der FDPase, die eine
Mutation von Serin nach Alanin enthält, vom GPDH-Promotor
exprimiert (Plasmid BA601) bzw. ein Kontrollplasmid, bei dem
FDPase nicht exprimiert wird (Plasmid BA802). Es zeigte
sich, daß unter den vielen untersuchten Hefestämmen der
Stamm ATCC 26675 den höchsten Inaktivierungsgrad ergab.
Diese Kulturen sollten somit eine vorsichtige Schätzung der
möglichen Steigerung bei der Gasentwicklung erlauben.
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Die Gärungen wurden wie zuvor durchgeführt und
Kohlendioxid und Zelldichte gemessen. Die Kohlendioxidausbeute
stieg in dem FDPase exprimierenden Stamm gegen Ende des
Wachstumscyclus wieder an (Fig. 16). Das Gärungsexperiment
wurde wiederholt und ergab gute Reproduzierbarkeit. Die
Kulturen
wurden gegen Ende des Wachstumscyclus geerntet,
zentrifugiert und unter Verwendung des nachstehend
beschriebenen Gasentwicklungstests untersucht.
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Gasentwicklungstests wurden in dem in Fig. 16
gezeigten Gerät durchgeführt. Der Kolben enthielt 1 g Zellen, 1 g
Glucose und 10 ml Medium (Hefe-Stickstoffbase, Difco) und
hatte einen End-OD-Wert bei 600 nm von 12. Alle Lösungen
wurden bei 32ºC gehalten. Das Wasserbad hatte ebenfalls
32ºC. Das Rohr a war-während der ersten 10 Minuten, nachdem
der Kolben in das Wasserbad gestellt worden war, offen. Die
Messungen der CO&sub2;-Entwicklung erfolgten in regelmäßigen
Zeitabständen durch Verschließen des Rohrs a und das Messen
der Menge an CO&sub2;, die sich in der Bürette X entwickelte,
nachdem der Flüssigkeitsspiegel in Bürette Y auf den von
Bürette X eingestellt war, um so das Gas in Bürette X auf
Atmosphärendruck zu bringen. Die Messungen wurden solange
durchgeführt bis 100 ml CO&sub2; erzeugt worden waren. Die Rate
der CO&sub2;-Erzeugung in dem die vorstehend beschriebenen
Plasmide enthaltenden Stamm ist in Fig. 17 gezeigt. Bei dieser
Untersuchung ergaben die Stämme, die die mutierte FDPase
exprimierten, eine Steigerung der Fähigkeit zur Gasentwicklung
von 25 %.
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Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen
Modifikationen betrifft diese Erfindung weiterhin die Änderung der
allosterischen Regulation der FDPase durch
Fructose-2,6-diphosphat oder AMP.
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Fructose-2,6-phosphat wird über einen enzymatischen
Stoffwechselweg aus Fructose-6-phosphat durch das Enzym
Fructose-6-phosphat-2-kinase synthetisiert (Clifton und
Fraenkel, J. Biol. Chem. 258 (1983), S. 9245, und Pilkis et
al., J. Biol. Chem. 259 (1949), S. 949).
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Ein Verfahren zur Erniedrigung der Hemmung der
Enzymaktivität beruht auf der Mutation der clonierten Kopie
von FDPase in vitro (siehe z. B. Shortle et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. 79 (1982), S. 1588) und diese auf einem
selbstreplizierenden selektierbaren Hefeplasmid in die Zelle
zurückzubringen und im Anschluß daran den Verlust des
hemmenden
Effekts vom Fructose-2,6-diphosphat und AMP zu
überprüfen. In der Regel handelt es sich bei dem Verlust einer
Bindungsstelle für einen allosterischen Inhibitor oft um eine
ziemlich konservative Änderung in der Enzymstruktur, da man
davon ausgeht, daß selbst eine leichte Modifikation der
Bindungsstelle deren Affinität für Fructose-2,6-diphosphat
stark ändert. Dieses Vorgehen erfordert einen guten Test für
das veränderte Enzym. Da die FDPase unter der Kontrolle
eines induzierbaren Promotors steht, sind unter
induzierenden Bedingungen, wenn der Leerlaufstoffwechselcyclus
effizient abläuft, auf einer vergärbaren Kohlenstoffquelle
wachsende Mutantenkolonien sehr klein, unter nicht induzierenden
Bedingungen besitzen die Kolonien jedoch normale Größe. Die
vermuteten Mutantenkolonien werden außerdem auf einer durch
Gluconeogenese abbaubaren Kohlenstoffquelle ausplattiert, wo
sie unter induzierenden Bedingungen normal wachsen. Solche
Methoden zum Absuchen der Kolonien können daher zum Nachweis
des veränderten Enzyms verwendet werden.
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Schließlich wurde die veränderte FDPase in einen zum
Backen verwendeten Hefestamm nach den vorstehend
beschriebenen Methoden eingeschleust. Es stellte sich heraus, daß die
veränderte FDPase enthaltenden Bäckerhefen eine wesentlich
gesteigerte Befähigung zur Teigsäuerung besitzen.
Beispiel 2
Expression cytoplasmatischer saurer Phosphatase
Herstellung des APase-Promotorfragments
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Das eine vollständige Kopie der großen Untereinheit
des sauren Phosphatase-Enzyms, P60 (PHO5), enthaltende
Plasmid YIpAPII (Rogers et al., (1982), a.a.O.) wurde mit
verschiedenen Restriktionsenzymen kartiert. Dabei zeigte sich,
daß HpaII ein 700 bp-Restriktionsfragment ergab, das 600 bp
der DNA-Sequenz stromaufwärts des Initiator- (oder
Start-)codons für das Strukturgen enthält, dessen Position auf dem
Fragment anhand der Orientierung zu der ClaI-Stelle bekannt
ist, (Thill et al., Molecular Cell Biology 3, (1983), S.
570-9). Plasmid JYpAPII wurde mit HpaII gespalten und die
DNA auf einem präparativen 1,5 % Agarosegel laufengelassen.
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Die den Promotor enthaltende 700 bp-Bande wurde wie
vorstehend in eine in das Gel geschnittene Kammer elektroeluiert
und über eine DEAE-Sephacelsäule gereinigt. Das Fragment
wurde mit YOp1, gespalten mit ClaI, gemischt und die DNA mit
T4 DNA-Ligase ligiert. Da HpaII und ClaI zueinander
komplementäre überstehende Enden besitzen, können diese DNAs
miteinander ligiert werden. Das Ligierungsgemisch wurde in
HB101 transformiert und die ampicillinresistenten Kolonien
auf die Anwesenheit des Promotorfragments abgesucht. Eines
dieser Plasmide (920, siehe Fig. 18) wurde für die weiteren
Konstruktionen verwendet.
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Aus der DNA-Sequenz des Fragments des Gens für Saure
Phosphatase (PHO 5), (Fig. 3), (Thill et al., 1983, a.a.O.,
und Arima et al., NAR 11 (1983), S. 1657-72) wurde 5 bp
stromaufwärts des Initiator-ATG ein Bereich gefunden, der
vier der sechs Basen einer BglII-Restriktionsendonuclease-
Erkennungsstelle besaß. Dieser Bereich wurde zur Erzeugung
einer BglII-Stelle an diesem Punkt in der
APase-Promotorsequenz verwendet, wobei ein synthetischer
Oligonucleotidlinker mit der zu sich selbst komplementären Sequenz
CTAGCATGCTAG verwendet wurde.
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Plasmid 920 wurde mit KpnI gespalten (siehe Fig. 20)
und die DNA mit der Doppelstrang-Exonuclease Bal31 (Legerski
et al., NAR 5 (1978), S. 1145-1463) gespalten. Nach
bestimmten Zeitabständen wurde die Reaktion durch Zugabe von
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bis zu 0,05 M (Legerski et
al., (1978), a.a.O.) beendet. Von jedem Zeitintervall wurde
ein Aliquot des Plasmids mit ClaI gespalten und auf einem
12%igem Polyacrylamidgel laufen gelassen. Der Zeitpunkt, bei
dem das 300 bp ClaI/KpnI-Fragment zu etwa 270 bp abgespalten
worden war, wurde vermerkt. Der Rest des Bal31-behandelten
Plasmids aus diesem Zeitintervall wurde mit dem
Klenow-Fragment der DNA-Polymerase 1 und den vier dNTP's behandelt. Ein
Linker mit der zu sich selbst komplementären Sequenz
CTAGCATGCTAG wurde kinasiert, aneinandergelagert und mit
dieser Plasmid-DNA ligiert. Im Anschluß daran wurde die DNA
mit T4 DNA-Ligase zirkularisiert und in HB101 transformiert.
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Ungefähr 2000 ampicillinresistente Kolonien wurden von den
Platten abgewaschen und aus diesen E. coli-Zellen
"supercoiled"-Plasmid DNA hergestellt (Maniatis et al.,
1982, a.a.O.). Diese gesammelte Plasmid-DNA wurde mit dem
Restriktionsenzym BglII gespalten und die DNA auf einem
präparativen Agarosegel laufengelassen. Die als eine gespaltene
lineare Bande laufende DNA wurde in eine in die Agarose
geschnittene Kammer eluiert und über eine DEAE-Sephacel-Säule
gereinigt. Diese gereinigte DNA wurde mit T4 DNA-Ligase
wieder zirkularisiert und in HB101 transformiert.
Ampicillinresistente Kolonien wurden auf die Anwesenheit einer BglII-
Stelle abgesucht. Das Plasmid konnte nur über einen Weg eine
BglII-Stelle erhalten, nämlich an der durch die Verbindung
der Bal31 gespaltenen DNA mit dem Linker erzeugten Stelle.
Die einzige zur Verfügung stehende Sequenz, in der dies
innerhalb der mehreren 100 bp stromaufwärts der KpnI-Stelle
eintreten konnte, befindet sich 5b vor dem
ATG-Initiationscodon. Eines der eine BglII-Stelle enthaltenden Plasmide,
D718 (Fig. 20), wurde überprüft und durch das
Didesoxynucleotid-Sequenzierungsverfahren nach Sanger (Sanger et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (1977), S. 5463-67) konnte
gezeigt werden, daß es den Erwartungen entsprach.
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Plasmid YIpAP11 wurde bei der American Type Culture
Collection in E. coli HB101 wie folgt hinterlegt:
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E. coli HB101 (YIpAP11) - ATCC Nr. 39570
Erzeugung einer Restriktionsstelle an der Verbindung
zwischen Leader und nativem Protein
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Aus der Sequenz des Gens für saure Phosphatase ist
ersichtlich (Fig. 18), daß sich nahe des Beginns der reifen
Sequenz eine KpnI-Stelle befindet. Dies ermöglichte es uns,
an der Verbindungsstelle von der Leadersequenz zur Sequenz
des reifen Proteins unter Verwendung eines synthetischen
Oligonucleotids mit der Sequenz
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eine Restriktionsstelle einzuführen.
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Da es im Gen für saure Phosphatase verschiedene KpnI-
Stellen gibt, wurde ein Fragment vom 5'-Ende des Gens
subcloniert.
Plasmid YIpAP11 wurde mit BamHI und SalI gespalten
und das den Promotor enthaltende Fragment in die BamHI/SalI-
Stellen von YOp1 subcloniert (Fig. 21). Die transformierten
Bakterien wurden abgesucht und es stellte sich heraus, daß
Plasmid 801 die korrekte Sequenz besaß. Zur Einführung einer
Restriktionsstelle am 5'-Ende der reifen Sequenz wurde
Plasmid 801 mit KpnI gespalten und der vorstehend beschriebene
Adapter in die KpnI-Stelle ligiert (Fig. 21). Danach wurde
das Plasmid mit BamHI gespalten, die Stelle mit dem Klenow-
Fragment der DNA-Polymerase 1 aufgefüllt und das Plasmid
rezirkularisiert. Die transformierten bakteriellen Kolonien
wurden auf die Anwesenheit des Adapters abgesucht. Eines
dieser Plasmide (J401) wurde für weitere Konstruktionen
verwendet. Wie aus Fig. 21 ersichtlich, erzeugt der Adapter
eine XhoI-Stelle an der Verbindung zwischen Leader und der
reifen sauren Phosphatase, so daß bei Spaltung des Plasmids
mit XhoI und Spaltung der überstehenden Enden mit Mungbean-
Exonuclease eine Stelle mit glatten Enden an der richtigen
Position in der Sequenz am Beginn des Bereichs erzeugt wird,
der das reife Protein codiert.
Synthese eines Clons für saure Phosphatase ohne
Leader
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Zuerst wurde aus Plasmid J401 eine Kopie von saurer
Phosphatase mit vollständiger Länge hergestellt. Plasmid
YIpAP11 wurde mit BamHI gespalten, der 5'-Überhang mit dem
Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aufgefüllt, danach mit
SalI gespalten und das das APase-Gen enthaltende BamHI/SalI-
Fragment über präparative Gelelektrophorese isoliert. Dieses
Fragment wurde dann in die SalI/NaruI-Stellen des Plasmids
J401 ligiert (Fig. 22). Eine mit einer NruI-Stelle ligierte
aufgefüllte BamHI-Stelle erzeugt wiederum die BamHI-Stelle.
Als nächstes wurde der Promotor für saure Phosphatase erneut
an das Strukturgen angeknüpft. Plasmid D718 wurde mit BglII
gespalten und in die BglII-Stelle ein Adapter mit der
Sequenz
-
ligiert, der die Promotorsequenz für
saure Phosphatase am Initiator-Methionincodon wieder
herstellt. Danach wurde das Plasmid mit EcoRI gespalten und das
EcoRI-BglII-Adapter-Fragment (Fig. 22) in das Plasmid K219
cloniert, das mit XhoI gespalten, mit Mungbean-Exonuclease
zur Erzeugung glatter DNA-Enden behandelt und danach mit
EcoRI gespalten worden war. Die Transformanten wurden
abgesucht und die die richtigen Restriktionsfragmente
enthaltenden Plasmide unter Verwendung des
Didesoxynucleotid-Sequenzierungsverfahrens sequenziert. Es zeigte sich, daß Plasmid
M138 die richtige Sequenz an der Verbindung zwischen
Promotor und dem reifen Gen besaß.
Hinzufügung eines Hefecentromers zum Plasmid
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Der Promotor für saure Phospohatase ist etwa 1000-
fach induzierbar. Die Kopienzahl eines Hefeplasmids kann
durch Verwendung unterschiedlicher Replikationsstartpunkte
oder eines Hefecentromers verändert werden (Clark & Carbon,
(1980), und Tschumper & Carbon, 1983). Ein Hefecentromer
erniedrigt die Kopienzahl eines Plasmids mit einem
2u-Replikationsstartpunkt auf ungefähr 1 Kopie pro Zelle.
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Plasmid M138 wurde mit EcoRI gespalten und mit dem
Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I glatte Enden erzeugt.
Als nächstes wurde Plasmid YCP19 (Fig. 23), das das
Centromer von Chromosom 4 der Hefe enthält, (Parent et al, a.a.O.)
mit HindIII gespalten und mit dem Klenow-Fragment
DNA-Polymerase I glatte Enden erzeugt. Das das Centromer enthaltende
Fragment wurde dann in die EcoRI-Stelle von M138 ligiert,
wobei Plasmid N305 erzeugt wurde (Fig. 22).
Expression cytoplasmatischer saurer Phosphatase
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Die Plasmide M138 und N305 wurden zusammen mit dem
Kontrollplasmid M721 in Hefe transformiert.
Uracil-Prototrophe wurden selektioniert und in Hochphosphat-MO-Medium, das
einen Überschuß an Glucose (4 %) enthielt, in einem 1 Liter-
Fermenter von New Brunswick Scientific Modell F-200
gezüchtet. Während der Aufzucht wurde die Zelldichte unter
Verwendung eines Bausch und Lomb Modell-Spectronic 20 bei 600 nm
gemessen. Die Ergebnissen sind nachstehend in den Tabellen 1
und 2 gezeigt. Der Fermenter wurde bei 30ºC und einer
Rühreinstellung von 4 betrieben. Stickstoff wurde mit einer
Rate von 430 cc/min kontinuierlich durch das Gefäß geblasen
und das abgeleitete Gas durch eine Feuchtigkeitsfalle von
Dry-Rite und zur Bestimmung von CO&sub2; in ein Perkin
Elmer-Massenspektrometer Gasanalysegerät geleitet.
Tabelle 2 Kohlendioxidentwickluna in nicht-induzierten Kulturen Kontrollplasmid M721
Zeit in Minuten Anzahl der Zellen (x10&sup6;) % Kohlendioxid
Tabelle 2, Fortsetzung Plasmid N305
Zeit in Minuten Anzahl der Zellen (x10&sup6;) % Kohlendioxid
Tabelle 2 Fortsetzung Plasmid M138
Zeit in Minuten Anzahl der Zellen (x10&sup6;) % Kohlendioxid
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Es zeigte sich, daß während des Wachstums auf
Hochphosphatmedien der Spiegel des von den die drei
unterschiedlichen Plasmide tragenden Stämmen erzeugten Kohlendioxids
schwankte (Tabelle 1). Danach reicht der Grundspiegel der
Promotoraktivität in Hochphosphatmedien aus, um eine Wirkung
auf die Glykolyserate auszuüben. Nachdem die Daten
zusammengestellt und auf die gleiche Phase innerhalb des
Wachstumscyclus standardisiert worden waren, zeigte sich, daß der
Spiegel des von den in Hochphosphatmedium wachsenden
Kulturen erzeugten Kohlendioxids mit der Kopienzahl des
Plasmids anstieg. Der das Plasmid mit hoher Kopienzahl tragende
Stamm erzeugte doppelt soviel Kohlendioxid wie die Kontrolle
und der das Plasmid in Einzelkopie tragende Stamm erzeugte
einen dazwischen liegenden Spiegel. Somit kann gemäß dieser
Erfindung der Spiegel der sauren Phosphatase reguliert und
dadurch der Spiegel von cytoplasmatischem ATP reguliert und
die Syntheserate für Kohlendioxid gesteigert werden.
Beispiel 3
Die Wirkung von Plasmamembranentkopplern auf die
Glykolyserate
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Bei der Zugabe von ansteigenden Mengen an
2,4-Dinitrophenol zu stabilen Chemostatkulturen von Fleishman's
Bäckerhefe wird eine beträchtliche Anregung der
Kohlendioxiderzeugung beobachtet.
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Zur Bestimmung des Grundspiegels an Kohlendioxid pro
Zelle unter den durch den Chemostaten definierten
Aufzuchtbedingungen und der Stabilität der Kultur wurden einleitende
Experimente durchgeführt. Der Chemostat wurde mit einer
Übernachtkultur beimpft und diese 24 Stunden als
Batch-Kultur gezüchtet. Mit der Medienzufuhr wurde begonnen und vor
der Durchführung von Messungen ließ man die Kultur sich
weitere 24 Stunden stabilisieren. Die Kohlendioxiderzeugung und
die Zellzahl wurden über einen Zeitraum von 48 Stunden
beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Die Zeit
ist in Stunden nach Beginn der Medienzugabe angegeben. Der
Kohlendioxidgehalt in der Gasströmung ist in % angegeben.
Tabelle 3 Chemostatstabilität
Zeit nach Beginn Stunden Kulturdichte O. D. 600 nm Zellzahl Zellen/ml · 10&supmin;&sup8; Kohlendioxid im abgeleiteten Gas %
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Die Kultur schien relativ stabil zu sein.
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Zu der Medienzugabe wurde Dinitrophenol bis zu 5 uM
gegeben. Wie unter "Experimentellen Verfahren" gezeigt,
wurde außerdem Dinitrophenol bis zu 5 uM in das Kulturgefäß
gegeben. Man ließ die Kultur sich 48 Stunden stabilisieren.
Wie aus Tabelle 4 ersichtlich ist, zeigte 5 uM Dinitrophenol
kaum Auswirkungen auf die Kohlendioxiderzeugung.
Tabelle 4 Die Auswirkung von Dinitrophenol auf die Gärungsrate
Konzentration von Dinitrophenol, um Kulturdichte Zellen/ml · 10&supmin;&sup8; Kohlendioxid im abgeleiteten Gas, % Relative Kohlendioxiderzeugung pro Zelle
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Die Dinitrophenolkonzentration in der Kultur wurde
langsam schrittweise auf 200 um erhöht. Nach jedem
Zugabeschritt von Dinitrophenol ließ man vor der Messung der
Zelldichte und der Kohlendioxidkonzentration die Kultur sich 36
bis 48 Stunden stabilisieren. Wie in der vorstehenden
Tabelle 4 gezeigt, ergab sich mit ansteigender
Dinitrophenolkonzentration ein Ansteigen des Spiegels des pro Zelle
erzeugten Kohlendioxids.
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Falls die Auswirkung des Dinitrophenol auf den
zellulären Stoffwechsel in der Entkopplung der Plasmamembran-
ATPase bestand, so hätte man ein Ansteigen der
Kohlendioxidausbeute und ein entsprechendes Abnehmen der Zelldichte
erwartet. Es sollte daran erinnert werden, daß die Auflösung
des Ionengradienten der Plasmamembran außerdem weitere von
diesem Ionengradienten abhängige zelluläre Prozesse, d. h.
Transport, betreffen kann. Die Beobachtung, daß die
Stoffwechseleffizienz der Zelle durch diese Behandlung reduziert
worden ist, wäre somit nicht überraschend. Man wäre somit
davon ausgegangen, daß dieser Grad der Anregung der
Glykolyse ein Minimum ist.
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Die Experimente haben gezeigt, daß die
Kohlendioxiderzeugung in einer dosisabhängigen Weise durch
Dinitrophenol angeregt werden kann. Es zeigte sich, daß der Grad
der Anregung hochreproduzierbar ist, und sich bei der
höchsten verwendeten Konzentration eine mehr als 2-fache
Steigerung der Kohlendioxiderzeugung ergab.