DE69636900T2

DE69636900T2 - Neue Hefe-Gene

Info

Publication number: DE69636900T2
Application number: DE69636900T
Authority: DE
Inventors: Hideki Tsuchiura-shi KAWASAKI; Masaya Tokai; Yasuhiro Kikuchi; Kozo Ouchi
Original assignee: Kyowa Hakko Foods Specialties Co Ltd
Current assignee: MC Food Specialties Inc
Priority date: 1995-12-28
Filing date: 1996-12-27
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2016-12-28
Also published as: AU706093B2; EP0818535A1; DE69636900D1; US6172196B1; EP0818535B1; WO1997024442A1; JP3795529B2; CA2211685A1; CN1176660A; CN1124346C; AU1152797A; KR100430638B1; EP0818535A4; KR19980702602A; ATE353966T1

Description

Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Brot mit gekühltem Teig und ein Verfahren zur Ethanolherstellung.
Fachlicher Hintergrund
In letzter Zeit wurde in der Brot herstellenden Industrie ein Verfahren zur Brotherstellung mit gekühltem Teig viel benutzt, mit dem Zweck, im Brotherstellungsprozess Arbeit zu sparen und verschiedenen Bedürfnissen der Verbraucher entgegenzukommen. In diesem Verfahren wird teilweise fermentierter Teig bei niedriger Temperatur im Kühlschrank gelagert und dann fermentiert, gehen gelassen und gebacken, um Brot herzustellen. So ein Verfahren wird normalerweise durch die Verwendung von kühlungsresistenter Hefe durchgeführt, das heißt Hefe, die in der Lage ist, eine Fermentation während der Lagerung des Teiges bei niedriger Temperatur zu kontrollieren und die eine normale Fermentation bei Temperaturen für Fermentation und Gehenlassen erlaubt, um den Teig aufgehen zu lassen.
Was die die Züchtung von kühlungsresistenter Hefe betrifft, existieren bekannte Verfahren, in denen Wildtyp-Hefestämmen die niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit zeigende Mutation durch künstliche Mutagenese übertragen wird [z. B. veröffentlichte, geprüfte japanische Patentanmeldung Nr. 71474/95, veröffentlichte, ungeprüfte japanische Patentanmeldung Nr. 213277/95, veröffentlichte, ungeprüfte japanische Patentanmeldung Nr. 76767/95, und Appl. Environ. Microbiol., 61, 639-642 (1995)]. Die die niedrigtemperatursensitive Fermentierbarkeit aufweisende Mutation tragenden Hefestämme, werden als kühlungsresistente Hefen oder als Elternstämme verwendet, um kühlungsresistente Hefe zu züchten.
So eine Mutagenese führt jedoch zufällige Mutationen ein und kann daher der Hefe möglicherweise zusätzlich zu der niedertemperatursensitiven Mutation eine Mutation übertragen, die die Grundeigenschaften der Fermentierung, wie das Teig-Gehen, betrifft.
Es ist auch bekannt, Bäckerhefe oder Brauhefe mit günstigen Eigenschaften, wie Flockenbildung [The 23rd European Brewery Conv. Proc., 297-304 (1991)] und Geschmack [Curr. Genet., 20, 453-456 (1991)] unter der Verwendung von Gen-manipulierenden Verfahren zu übertragen.
Es ist jedoch kein die niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit betreffendes Gen oder ein Verfahren zur Züchtung kühlungsresistenter Hefe durch Genmanipulation bekannt.
Ethanol wird durch Fermentation von Zuckermaterialien (z. B. Melassen) oder Stärkematerialien (z. B. Mais und Kartoffel) als Kohlenstoffquellen hergestellt. Die Fermentierung kann im allgemeinen bei einer Temperatur von 30 °C bis 43 °C durchgeführt werden. Die Fermentierungstemperatur wird üblicherweise durch Kühlung auf 30 bis 35 °C eingestellt, um durch den Temperaturanstieg verursachten Tod, ungenügendes Wachstum oder Abfall in der Fermentierbarkeit der Hefe zu verhindern. Dennoch ist Kühlung in den Sommermonaten oft unzureichend und verursacht dadurch im Verlauf der Alkoholfermentierung einen Anstieg der Kulturtemperatur von 35 auf 38 °C. Deshalb wird Alkoholfermentierung üblicherweise mit weiterer Kühlung durchgeführt, um dem, auf Fermentierungshitze zurückzuführenden Temperaturanstieg vorzubeugen. Es besteht ein Bedarf für Temperaturresistente Hefe, die nützlich ist, um Kosten für das Kühlen in einem solchen Verfahren zu sparen.
Bezüglich der Züchtung von thermotoleranter Hefe hat es Berichte über ein Verfahren gegeben, in dem die Thermotoleranz betreffende Mitochondrien eingeführt werden [Juan Jimenez, et al.: Curr. Genet., 13, 461-469 (1988)] und ein Verfahren, in dem das Hitzeschockprotein HSP104 mit einem hohen Spiegel exprimiert wird [Susan Lindquist, et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 5301-5306 (1996)]. Die Anwendung dieser Verfahren auf die Alkoholfermentierung wurde jedoch nicht untersucht. Außerdem ist bekannt, dass die Hitzeresistenz von Hefe durch Hitzebehandlung bei Temperaturen verbessert wird, die für die Hefe nicht tödlich ist [B.G. Hall: J. Bacteriol., 156, 1363 (1983)], aber dieser Effekt hält nicht an und es ist schwierig, dieses Verfahren auf die Alkoholfermentierung anzuwenden.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein, das die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Aminosäuresequenz besitzt, oder ein Protein, das fähig ist, die niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit aufweisende und die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Aminosäuresequenz besitzende Mutation zu komplementieren; ein Gen, das dieses Protein codiert; und ein Gen, das DNA umfasst, die die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Nucleotidsequenz aufweist, oder DNA umfasst, die in der Lage ist, die niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit zeigende Mutation zu komplementieren' und die die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Nucleotidsequenz besitzt. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Hefe, die zur Gattung Saccharomyces gehört und die eine niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit besitzt, die dadurch gekennzeichnet ist, dass das vorstehend erwähnte Gen auf dem Chromosom inaktiviert ist; Teig, der diese Hefe enthält; ein Verfahren, Brot herzustellen, das den Zusatz dieser Hefe zu Teig umfasst; und ein Verfahren zur Herstellung von Ethanol, umfassend die Züchtung dieser Hefe in einem Medium, das Ermöglichen der Anreicherung von Ethanol in der Kultur und das Gewinnen von Ethanol aus der Kultur.
Der hierin verwendete Ausdruck „niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit besitzend" bedeutet die Eigenschaft, keine wesentliche Fermentierbarkeit bei Temperaturen für eine Lagerung bei niedrigen Temperaturen und eine normale Fermentierbarkeit bei Temperaturen für Fermentierung und Gehenlassen nach der Lagerung bei niedrigen Temperaturen, zu besitzen. Im Fall von Bäckerhefe zum Beispiel bedeutet er die Eigenschaft, im wesentlichen keine Teigaufgehen lassende Fähigkeit bei 5 °C und eine normale Teigaufgehen lassende Fähigkeit bei 20 bis 40 °C nach der Lagerung bei Kühlung auf 5 °C für 1 bis 7 Tage, zu besitzen und im Fall von Brauhefe bedeutet er die Eigenschaft, keine wesentliche Alkoholfermentierbarkeit bei 5 °C und eine normale Alkoholfermentierbarkeit bei 20 bis 40 °C nach der Lagerung bei Kühlung auf 5 °C für 1 bis 7 Tage, zu besitzen.
Die Isolierung eines Gens, das eine niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit zeigende Mutation komplementiert, die Bestimmung der DNA-Sequenz dieses Gens und die Inaktivierung dieses Gens, kann unter Verwendung von Basistechniken der Gentechnik und Biotechnologie nach den Beschreibungen im Handel erhältlicher experimenteller Handbücher, z. B. Gene Manual, Kodasha Co., Ltd.; Methods for Experiments in Gene Manipulation, herausgegeben von Yasutaka Takagi, Kodansha Co., Ltd.; Molekular Cloning, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratorium (1989); Methods in Enzymology, 194 (1991); und Gene Experiments Using Yeasts (eine Sonderausgabe von Experimental Medicine), Yodosha Co., Ltd. (1994), durchgeführt werden.
Das Gen, das die eine niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit zeigende Mutation gemäß der vorliegenden Erfindung komplementiert (nachstehend als Niedertemperatursensitivität komplementierendes Gen bezeichnet), kann zum Beispiel als das Gen, das die niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit von Saccharomyces cerevisiae RZT-3 (FERM BP-3871) (nachstehend als Stamm RZT-3 bezeichnet) komplementiert und beschrieben in der veröffentlichten, ungeprüften japanischen Patentanmeldung Nr. 336872/93, isoliert werden. Das heißt, das eine Niedertemperatursensitivität komplementierende Gen kann durch Transformation des Stammes RZT-3 mit der DNA-Bank der das Niedrigtemperatursensitivität komplementierende Gen tragenden Hefe und Erhalt der DNA des Stammes, von dem die eine niedrigtemperatursensitive Fermentierbarkeit aufweisende Mutation komplementiert wurde, isoliert werden.
Die DNA-Bank der die Niedertemperatursensitivität komplementierenden Hefe kann durch Spaltung der chromosomalen DNA der ein Wild-Typ-Gen tragenden Hefe, z. B. Saccharomyces cerevisiae X2180-1B (nachstehend als Stamm X2180-1B bezeichnet) mit einem Restriktionsenzym und Ligierung jedes der erhaltenen DNA-Fragmente mit einem Vektor, der geeignet ist, in Hefe gehalten zu werden, hergestellt werden.
Für vorstehendes Verfahren kann jedes Restriktionsenzym, das die chromosomale DNA spalten kann, verwendet werden. Es werden vorzugsweise die verwendet, die DNA-Fragmente von 20 kBp oder weniger ergeben. Die chromosomale DNA kann vollständig oder partiell mit dem Restriktionsenzym gespalten werden.
Beispiele für Vektoren, die in Hefe gehalten werden können, sind YCp-Vektoren, YEp-Vektoren, YRp-Vektoren, YIp-Vektoren und YAC (yeast artificial chromosome; artifizielles Hefechromosom).
Die Transformation des Stammes RZT-3 mit der DNA-Bibliothek kann nach den allgemein in der Gentechnik und Biotechnologie verwendeten Methoden, wie dem Sphäroplasten-Verfahren [z. B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929-1933 (1978)], der Lithiumacetat-Methode [z. B. J. Bacteriol., 153, 163-168 (1983)] und der Elektroporations-Methode [z. B. Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991)] durchgeführt werden.
Die Komplementierung der eine niedertemperatursensifive Fermentierbarkeit aufweisenden Mutation kann durch Untersuchung der transformierten Hefe auf das Wachstum bei einer niedrigen Temperatur oder der Fermentierbarkeit bei einer niedrigen Temperatur [Appl. Environ. Microbiol., 61, 639-642 (1995)], bestätigt werden. Die Untersuchung auf Fermentierbarkeit bei einer niedrigen Temperatur kann zum Beispiel durch die nachstehend beschriebene Pigment-Agarschicht-Methode durchgeführt werden. In diesem Verfahren wird der Teststamm bei 30 °C auf YPG Agarmedium (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 3 % Glycerin und 2 % Agar) gezüchtet, um Kolonien zu bilden. Dann wird ein Pigment-Agar (0,5 % Hefeextrakt, 1 % Pepton, 10 % Saccharose, 0,02 Bromcresol-Purpurrot und Agar 1 %, pH 7,5) über das Medium geschichtet und die Platte bei einer niedrigen Temperatur gehalten (z. B. 5 °C). Bromcresol-Purpurrot ist ein pH-Indikator und der Pigment-Agar nimmt eine purpurrote Färbung an, wenn er überschichtet ist. Die Fermentierung der Hefe senkt den pH-Wert des Mediums um die Kolonie und verursacht eine Änderung der Färbung dieses Bereichs von purpurrot zu gelb. Folglich kann ein Stamm, der, während die beschichtete Platte bei einer niedrigen Temperatur gehalten wird, einen Farbwechsel zu gelb um die Kolonie zeigt, als ein Stamm selektiert werden, der eine Fermentierbarkeit bei einer niederen Temperatur besitzt.
Die Gewinnung eines Plasmids aus der Hefe und die Transformation unter Verwendung des Plasmids auf Escherichia coli kann nach allgemein in der Gentechnik verwendeten Methoden durchgeführt werden. Das Plasmid kann zum Beispiel durch die in Gene Experiments Using Yeasts (einer Sonderausgabe von Experimental Medicine), Yodosha Co., Ltd. (1994) beschriebene Methode gewonnen werden und die Transformation kann mit dem in Molecular Cloning, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory (1989) beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
Die Nucleotidsequenz des Niedertemperatursensitivität komplementierenden Gens kann durch die allgemein in der Gentechnik verwendeten Methoden, wie die Maxam-Gilbert-Methode und das Didesoxy-Verfahren, bestimmt werden. Das durch das Niedertemperatursensitivität komplementierende Gen codierte Polypeptid kann leicht unter Verwendung anerkannten molekulargenetischen Wissens erhalten werden. Wenn nötig, können Computeranalysen gemacht werden [z. B. Cell Technology, 14, 577-588 (1995)]. Es ist möglich, das durch das Niedertemperatursensitivität komplementierende Gen codierte Polypeptid als Inhibitor für die niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit in der niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit aufweisenden Hefe zu verwenden.
Die vorliegende Erfindung hat die Nucleotidsequenz des Niedertemperatursensitivität komplementierenden Gens und die Aminosäuresequenz des durch das Gen codierten Polypeptids geklärt und dadurch eine Zerstörung des Niedertemperatursensitivität komplementierenden Gens ermöglicht, eine Regulierung der Expression oder Änderung des Expressionsspiegels des Niedertemperatursensitivität komplementierenden Gens durch Modifikation des Promotors, Expression verschiedener Gene unter Verwendung des Promotors des Niedertemperatursensitivität komplementierenden Gens, Herstellung sowohl eines fusionierten Gens, in dem das Niedertemperatursensitivität komplementierende Gen mit einem anderen Gen fusioniert ist, als auch eines Fusionspolypeptids und ähnliches. Diese Manipulationen können zum Beispiel unter Verwendung der in Enzymology, 194, 594-597 (1991) beschriebenen Methoden durchgeführt werden.
Die Methoden zur Inaktivierung des Niedertemperatursensitivität komplementierenden Gens in Hefe werden nachstehend beschrieben.
Der Begriff Inaktivierung des Gens, wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Verminderung oder den Verlust von dem Gen oder dem durch das Gen codierten Polypeptid eigenen Funktionen durch verschiedene Verfahren für Gentechnik oder Biotechnologie; zum Beispiel Genzerstörung [z. B. Methods in Enzymology, 194, 281-301 (1991)], Einführung eines beweglichen genetischen Elements in das Gen [z. B. Methods in Enzymology, 194, 342-361 (1991)], Einführung und Expression des Antisense-Gens [z. B. veröffentlichte, geprüfte japanische Patentanmeldung Nr. 40943/95, und The 23rd European Brewery Conv. Proc., 297-304 (1991)], Einführung von Silencer betreffender DNA in die Umgebung des Gens [z. B. Cell, 75, 531-541 (1993)] und Behandlung des durch das Gen codierten Polypeptids durch einen Antikörper [z. B. European J. Biochem., 231, 329-336 (1995)].
Für die Inaktivierung des Niedertemperatursensitivität komplementierenden Gens kann jede zur Gattung Saccharomyces gehörende Hefe, bevorzugt Saccharomyces cerevisiae, verwendet werden. Das heißt, es können verschiedene Hefearten, wie Bäckerhefe, Sakehefe, Weinhefe, Bierhefe, Miso- und Sojasaucenhefe und Ethanol produzierende Hefe, die zur Gattung Saccharomyces gehört, verwendet werden.
Die Zerstörung des Niedertemperatursensitivität komplementierenden Gens meint ein Verfahren, das die Einführung von DNA in Hefezellen umfasst, die eine zum Niedertemperatursensitivität komplementierenden Gen homologe Nucleotidsequenz aufweist, aber auf Grund einer Mutation, wie einer Addition, Deletion oder Substitution nicht imstande ist, als das Niedertemperatursensitivität komplementierende Gen zu agieren, um eine homologe Rekombination zu induzieren und dadurch diese Mutation in das Gen auf dem Genom einzubauen.
Die für die Genzerstörung verwendete DNA kann zum Beispiel durch eine Methode hergestellt werden, die die Spaltung des Niedertemperatursensitivität komplementierenden Gens mit Restriktionsenzymen beinhaltet, um DNAs hinzuzufügen, zu deletieren oder zu substituieren, und ein Verfahren, das eine extrazelluläre Mutation (in vitro-Mutagenese) des Niedertemperatursensitivität komplementierenden Gens umfasst. Für die Addition und Substitution von DNAs kann eine Methode verwendet werden, in der das Markergen inseriert wird.
Die Zerstörung des Niedertemperatursensitivität komplementierenden Gens kann durch die Unterbrechung jeder Promotorregion, dem Bereich des offenen Leserahmens und Terminatorregion oder Kombinationen dieser Bereiche, bewirkt werden. Das Niedertemperatursensitivität komplementierenden Gen kann auch durch Deletion des gesamten Gens zerstört werden.
Die Zerstörung des Niedertemperatursensitivität komplementierenden Gens kann zum Beispiel erfolgen durch Transformation der Hefe mit einem Plasmid für die Zerstörung des Niedertemperatursensitivität komplementierenden Gens der Hefe oder einem Fragment des Plasmids, um eine homologe Rekombination eines auf dem transformierenden Plasmid getragenen DNA- Fragments oder seines Fragments mit dem Gen auf dem Genom der Hefe zu induzieren. Das Plasmid für die Zerstörung des Niedertemperatursensitivität komplementierenden Gens oder seines Fragments, muss zum Niedertemperatursensitivität komplementierenden Gen auf dem Genom der Hefe eine Homologie in einem für die Induktion homologer Rekombination ausreichenden Grad besitzen. Ein DNA-Fragment kann auf seine Fähigkeit, homologe Rekombination zu induzieren geprüft werden, indem das DNA-Fragment in Hefe eingeführt und dann untersucht wird, ob ein Stamm eine homologe Rekombination trägt, das heißt, ein Stamm, der eine niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit aufweist, kann isoliert werden. Geeignete Vektoren, die für die Konstruktion des Plasmids für die Zerstörung des Niedertemperatursensitivität komplementierenden Gens verwendet werden, schließen Vektoren ein, die fähig sind, sowohl in Hefe gehalten werden zu können, als auch Vektoren, die geeignet sind, in Escherichia coli gehalten werden zu können, wie pUC19, pBR322 und BluscriptII SK⁺.
Als Markergen kann jedes Markergen, das in Hefe verwendet werden kann, benutzt werden. Beispiele für geeignete Gene sind Gene, die eine auxotrophe Mutation komplementieren, wie URA3, TRP1, LEU2 und HIS3 und Gene, die Bezug haben zur Resistenz gegenüber Chemikalien wie G418, Hygromycin B, Cerulenin und Parafluorphenylalanin [z. B. J. Ferment. Bioeng., 76, 60-63 (1993) und Enzyme und Microb. Technol., 15, 874-876 (1993)].
Das Niedertemperatursensitivität komplementierenden Gen auf dem Hefegenom kann durch Transformation der Hefe mit dem Plasmid für die Zerstörung des Niedertemperatursensitivität komplementierenden Gens zerstört werden.
Die Transformation der Hefe kann nach den im allgemeinen in Gentechnik und Biotechnologie verwendeten Methoden durchgeführt werden, wie der vorstehend genannten Sphäroplasten-Methode, dem Lithiumacetat-Verfahren und der Elektroporations-Methode.
Die Einführung des Markergens in das Plasmid für die Zerstörung des Niedertemperatursensitivität komplementierenden Gens ermöglicht eine leichte Isolierung einer Transformante durch die Verwendung des Markers als Indikator. Die Transformante kann auch basierend auf dem Zeigen von niedertemperatursensitiver Fermentierbarkeit, die ein Anzeichen für die Zerstörung des Niedertemperatursensitivität komplementierenden Gens auf dem Genom der Hefe ist, isoliert werden. Die Niedertemperatursensitivität des Stammes, dessen das Niedertemperatursensitivität komplementierende Gen zerstört wurde, kann durch die Überprüfung der Hefe auf Wachstum oder Fermentierbarkeit bei niedriger Temperatur bestätigt werden.
Durch das vorstehend beschriebene Verfahren kann Hefe erhalten werden, die eine niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit besitzt, die dadurch gekennzeichnet ist, dass das Niedertemperatursensitivität komplementierende Gen inaktiviert ist. Ein Beispiel für so eine Hefe ist Saccharomyces cerevisiae YHK1243 (nachstehend als Stamm YHK1243 bezeichnet). Dieser Stamm wurde bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministery of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken) am 7. Dezember 1995 mit der Zugangsnummer FERM BP-5327 unter dem Budapester Vertrag hinterlegt.
Die folgenden Testbeispiele zeigen, dass die niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit von YHK1243 verbessert ist.
Testbeispiel 1
Test auf Niedertemperatursensitivät der Fermentierbarkeit
5 ml 1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton und 2 % Glucose enthaltendes YPD-Medium, wurden in einem Teströhrchen mit 1 Öse des Stammes YHK1243 beimpft und 16 Stunden bei 30 °C gezüchtet. Die erhaltene Kultur (1 ml) wurde in 50 ml YPD-Medim in einem 300ml-Erlenmeyer-Kolben inokuliert und 24 Stunden bei 30 °C Stunden gezüchtet. Nach Vollendung der Züchtung wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und zweimal mit deionisiertem Wasser gewaschen. Die erhaltenen feuchten Zellen (0,61 g) wurden in einem Teströhrchen (Durchmesser innen: 22 mm, Höhe: 200 mm), in 50 ml eines Fermentations-Testmediums [0,67 % Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acid (Difco Laboratories Inc.), 2 % Saccharose und 1 % Natriumsuccinat (mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt)] suspendiert. Es wurde ein mit einem Silikonröhrchen ausgestatteter Silikonstopfen in das Teströhrchen gesteckt und die Züchtung 24 Stunden bei 5 °C durchgeführt. Das während der Züchtung gebildete Gas wurde durch das Silikonröhrchen in einer gesättigten wässrigen Natriumchlorid-Lösung gesammelt und das Gasvolumen gemessen, um die pro Gramm Hefezellen gebildete Menge Kohlendioxid zu berechnen. Das gleiche Verfahren wie vorstehend beschrieben, wurde auch beim Stamm YOY655 durchgeführt, um die Menge Kohlendioxid pro Gramm Zellen zu berechnen.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

*: angepasst als Hefezellen, die einen Trockensubstanzgehalt von 27 % besitzen

Die Menge an vom Stamm YHK1243 gebildetem Kohlendioxidgas bei 5 °C betrug annähernd 1/9 der des Stammes YOY655.
Testbeispiel 2
Test auf Niedertemperatursensitivität der Fermentierbarkeit (2) 30 ml YPD-Medium wurden mit einer Öse des Stammes YHK1243 in einem 300 ml-Erlenmeyer-Kolben beimpft und 24 Stunden bei 30 °C gezüchtet. Mit der gesamten erhaltenen Kultur wurden 270 ml Melassemedium (3 % Melasse, 0,193 % Harnstoff, 0,046 % Kaliumdihydrogenphosphat und 2 Tropfen Entschäumer) in einem 2 l Erlenmeyer-Kolben mit Ablenkplatten inokuliert und 24 Stunden bei 30 °C gezüchtet. Nach Vollendung der Züchtung wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und zweimal mit deionisiertem Wasser gewaschen, gefolgt von Trocknung auf einer Tonplatte.
Das gleiche Verfahren wie vorstehend beschrieben, wurde auch mit dem Stamm YOY655 durchgeführt, um Zellen zu erhalten.
Die von den Stämmen YKH1243 beziehungsweise YOY655 erhaltenen Zellen wurden zur Teigherstellung nach folgenden Teig-Zusammensetzungen und Schritten, verwendet. Teig-Zusammensetzung:

(Gewicht: g)

Hartes Mehl 100

Zucker 5

Salz 2

Hefezellen (Stamm YHK1243

oder Stamm YOY655) 3

Wasser 62

Schritte:
Messung der Menge an bei 30 °C in 2 Stunden gebildetem Kohlendioxidgas mit einem Fermograph (ATTO Co., Ltd.)
Jeder Teig wurde unter Kühlung gelagert und dann die bei 30 °C gebildete Menge Kohlendioxidgas für die Beurteilung der Kühlungsresistenz des Teigs gemessen.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
Der den Stamm YHK1243 enthaltende Teig bildete große Menge Kohlendioxidgas bei 30 °C nach der Lagerung unter Kühlung, verglichen mit dem den Stamm YOY655 enthaltenden Teig.
Außerdem wurde ein Aufgehen des den Stamm YOY655 enthaltenden Teigs während der Lagerung unter Kühlung beobachtet, während kein wesentliches Aufgehen des den Stamm YHK1243 enthaltenden Teigs beobachtet wurde. Der Teig, der die zur Gattung Saccharomyces gehörende Hefe enthält und niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit besitzt, die dadurch gekennzeichnet ist, dass das Niedertemperatursensitivität komplementierende Gen inaktiviert ist (nachstehend als die Hefe der vorliegenden Erfindung bezeichnet), wird nachstehend beschrieben.
Der die Hefe der vorliegenden Erfindung enthaltende Teig, betrifft den Teig, der durch Mischen von Weizenmehl oder Roggenmehl mit der Hefe der vorliegenden Erfindung, Salz, Wasser und, wenn nötig zusätzlichen Zutaten, wie Fetten und Ölen, Zucker, Backfett, Butter, Magermilch, Hefenahrung und Eier, und Kneten des Gemisches hergestellt wird.
Die Kühlungsbedingungen für die Lagerung des die Hefe der vorliegenden Erfindung enthaltenden Teigs sind die folgenden: bei einer Temperatur von –5 bis 10 °C, vorzugsweise 0 bis 5 °C für 1 bis 10 Tage, vorzugsweise 1 bis 7 Tage.
Das Verfahren zu Herstellung des die Hefe der vorliegenden Erfindung enthaltenden Teigs und das Verfahren zur Brotherstellung, das das Hinzufügen der Hefe der vorliegenden Erfindung zu einem Teig umfasst, werden nachstehend beschrieben.
Hefezellen, die für die Verwendung in der Brotherstellung geeignet sind, können durch die Züchtung der Hefe der vorliegenden Erfindung in einem üblichen, Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Substanzen, Aminosäuren, Vitamine etc. enthaltenden Medium, bei 27 bis 32 °C unter aeroben Bedingungen, Sammeln der gezüchteten Zellen und Waschen der Zellen erhalten werden.
Beispiele für die Kohlenstoffquellen in dem Medium sind Glucose, Saccharose, Stärkehydrolysate und Melassen. Besonders bevorzugt ist Melasse.
Beispiele für die Stickstoffquellen sind Ammoniak, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumacetat, Harnstoff, Hefeextrakt und Maisquellwasser.
Beispiele für anorganische Substanzen sind Magnesiumphosphat und Kaliumphosphat. Ein Beispiel für die Aminosäuren ist Glutaminsäure und Beispiele für die Vitamine sind Pantothensäure und Thiamin.
Eine Fed-Batch-Kultur ist das wünschenswerte Züchtungsverfahren.
Nach Abschluss der Züchtung werden die Hefezellen der vorliegenden Erfindung durch Zentrifugation oder ähnliches gesammelt. Die gesammelten Zellen werden zu Weizenmehl oder Roggenmehl zusammen mit Salz, Wasser und, wenn nötig, Fetten und Ölen, Zucker, Backfett, Butter, Magermilch, Hefenahrung, Eiern etc. gegeben, gefolgt von Mischen, um den die Hefe der vorliegenden Erfindung enthaltenden Teig herzustellen.
Brot kann nach üblichen Methoden unter Verwendung des vorstehend erwähnten Teigs hergestellt werden. Es gibt zwei typische Verfahren, einen Laib Brot, Brötchen etc. herzustellen; das sind das direkte Teigverfahren und das Vorteig-Teig-Verfahren. Das erstgenannte ist ein Verfahren, bei dem die Zutaten gleichzeitig gemischt werden. Die letztere ist ein Verfahren, bei dem zuerst ein Vorteig durch das Verkneten eines Teils des Weizenmehls mit Hefe und Wasser hergestellt wird und dann, nach Fermentierung, die restlichen Zutaten zum Vorteig zugegeben werden.
In dem direkten Teigverfahren werden alle Zutaten gemischt und geknetet und das geknetete Gemisch wird bei 25 bis 30 °C fermentiert. Der fermentierte Teig wird den folgenden Schritten unterworfen: Teilung, Ruhen, Modellieren, Gehenlassen (35 bis 42 °C) und Backen (200 bis 240 °C). Bei den Vorteig-Teig-Verfahren werden circa 70 % des gesamten zu verwendenden Weizenmehls, Hefe und Hefenahrung gemischt und mit Wasser verknetet. Das geknetete Gemisch wird bei 25 bis 35 °C für 3 bis 5 Stunden fermentiert, dann mit den restlichen Zutaten, wie Weizenmehl, Wasser und Salz gemischt und verknetet (Teig mischen). Der erhaltene Teig wird folgenden Schritten unterworfen: Teilung, Ruhen, Modellieren, Gehenlassen (35 bis 42 °C) und Backen (200 bis 240 °C).
Plundergebäck, Croissants usw. werden zum Beispiel auf folgende Weise hergestellt.
Weizenmehl, Salz, die Hefe der vorliegenden Erfindung, Zucker, Backfett, Eier, Magermilch und Wasser werden gemischt und verknetet, um Teig herzustellen. Dann wird Fett, wie Butter oder Margarine in den Teig eingeschlagen und Ausrollen und Einschlagen werden wiederholt, um vielfache Schichten des Teigs und des Fetts herzustellen. Dieser Schritt des Einschlagen des Fetts wird „Einrollen" genannt, das durch zwei Methoden durchgeführt werden kann. Bei einer Methode wird die Temperatur des zu knetenden Teigs auf etwa 15 °C gesenkt und der Teig wird geknetet, bis die beabsichtigte Anzahl an Schichten ohne Kühlung hergestellt ist. Bei der anderen Methode, die die so genannte verzögernde Methode ist, wird eine Abkühlung unter Verwendung eines Kühlschrankes oder Gefrierschranks mehrere Male im Verlauf des Einrollschritts wiederholt.
Der erhaltene Teig wird den folgenden Schritten unterworfen: Ausrollen, Teilen, Modellieren, Gehenlassen (30 bis 42 °C) und Backen (190 bis 210 °C). Das Verfahren zur Herstellung von Ethanol wird nachstehend beschrieben und umfasst die Züchtung der Hefe der vorliegenden Erfindung in einem Medium, das Ermöglichen des sich Anreicherns von Ethanol in der Kultur und die Gewinnung von Ethanol aus der Kultur.
Die Herstellung von Ethanol unter Verwendung der Hefe der vorliegenden Erfindung wird durch eine herkömmliches Verfahren zur Züchtung von Hefe durchgeführt. Der in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Mikroorganismus kann auf einem Gelträger, wie Agar, Natriumalginat, Polyacrylamid oder Carageen, immobilisiert sein. Als Medium zur Herstellung von Ethanol gemäß der vorliegenden Erfindung kann entweder ein synthetisches Medium oder ein natürliches Medium verwendet werden, insofern als es geeignete Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Substanzen und andere Nährstoffe, nach Bedarf, enthält.
Als Kohlenstoffquellen sollten Fermentationsmaterialien, die mindestens Saccharose enthalten, verwendet werden. Andere Kohlenstoffquellen, die durch den verwendeten Mikroorganismus verstoffwechselt werden können, wie Zucker (z. B. Glucose, Fructose, Galactose und Maltose), können ebenso verwendet werden. Als Saccharose enthaltende Fermentationsmaterialien können jegliche synthetische oder natürliche, Saccharose enthaltende Fermentationsmaterialien verwendet werden; Beispiele für geeignete Materialien sind Zuckerrohrsaft, Zuckerrübensaft und Melasse, die nach Kristallisation von Saccharose im Zuckerherstellungsverfahren aus solchen Säften erhalten wird.
Beispiele für Stickstoffquellen schließen organische oder anorganische Stickstoffquellen ein, wie Harnstoff, Ammoniak, Ammoniumsulfat und Ammoniumnitrat, und natürliche Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Pepton, Fleischextrakt und Hefeextrakt.
Beispiele für die anorganischen Salze sind Kaliumphosphat, Natriumphosphat, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Eisensulfat, Kaliumchlorid und Natriumchlorid.
Als andere Nährstoffe können Vitamine, wie Thiaminhydrochlorid, p-Aminobenzoesäure, Folsäure, Riboflavin und Inositol etc. verwendet werden. Die Züchtung wird üblicherweise unter aeroben Bedingungen durchgeführt, z. B. durch eine Schüttelkultur oder belüftete Rührkultur. Die Züchtungstemperatur beträgt 25 bis 50 °C, vorzugsweise 30 bis 43°C und der pH-Wert wird während der Züchtung bei 3 bis 7 gehalten, bevorzugt bei 4 bis 6. Üblicherweise ist die Züchtung in 1 bis 10 Tagen abgeschlossen.
Nach Abschluss der Züchtung kann Ethanol aus der Kultur durch einfache Methoden wie Destillation gewonnen werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Restriktionskarte des das CSF1-Gen enthaltenden DNA-Fragments und die Ergebnisse der Subclonierung und des Komplementationstests, die zur Bestimmung der funktionalen Region des CSF1-Gens durchgeführt wurden. 2 veranschaulicht die Schritte zur Konstruktion des Plasmids für die Zerstörung des CSF1-Gens.
Das günstigste Verfahren zur Ausführung der Erfindung
Beispiel 1

Clonierung des Niedertemperatursensitivität komplementierenden Gens (1) Übertragung der ura3-Mutation auf den Stamm RZT-3

Stamm RZT-3, einem Hefestamm, der niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit besitzt, wurde eine ura3-Mutation als Marker für die Einführung eines Plasmids nach der Methode von Boeke et al. [Mol. Gen. Genet., 197, 345-346 (1984)] übertragen. Das heißt, YPD-Medium wurde mit einer Öse des Stamms RZT-3 beimpft und unter Schütteln über Nacht bei 30 °C gezüchtet. Die erhaltene Kultur (100 μl) wurde auf einer FOA-Platte [0,67 % Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acid (Difco Laboratories Inc.), 0,1% 5-Fluorotsäure, 0,005 % Uracil, 2 % Glucose und 2 % Agar] ausgestrichen und 3 Tage bei 30 °C gezüchtet. Von den durch das Züchten gebildeten Kolonien wurde ein Uracil-Bedarf aufweisender Stamm selektiert, der durch Transformation mit dem URA3 als Marker tragenden und niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit besitzenden Plasmid YCp50 komplementiert wird. Dieser Stamm wurde Saccharomyces cerevisiae RZT-3u genannt (nachstehend als Stamm RZT-3u bezeichnet).
(2) Clonierung
Die chromosomale DNA des Stammes X2180-1B (erhalten vom Yeast Genetic Stock Center) wurde teilweise mit Sau3AI gespalten und die erhaltenen DNA-Fragmente wurden in die BamHI-Stelle des Plasmids YCp50 inseriert, um die Genbank herzustellen. Stamm RZT-3u wurde mit der Genbank transformiert, gefolgt von der Selektion von Transformanten, die kein Uracil benötigen. Die erhaltenen Transformanten wurden auf YPG-Agar-Medium bei 30 °C gezüchtet, um Kolonien zu bilden. Dann wurde ein Pigmentagar über das Medium geschichtet und die Züchtung wurde bei 5 °C für 1 bis 3 Tage durchgeführt. Ein Stamm, der während der Züchtung einen Farbwechsel zu gelb um die Kolonie zeigte, das heißt ein Stamm, bei dem bei 5 °C Fermentation beobachtet wurde, wurde als ein Stamm isoliert, bei dem die niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit aufweisende Mutation komplementiert wurde. Von diesem Stamm wurde das rekombinante Plasmid pHK162 extrahiert.
Das Plasmid pHK162 wurde in den Escherichia coli-Stamm JM109 eingeführt, um den Escherichia coli-Stamm EHK162 herzustellen. Der erhaltenen Stamm wurde bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministery of International Trade and Industry am 7. Dezember 1995 mit der Zugangsnummer FERM BP-5328 unter dem Budapester Vertrag hinterlegt.
(3) Komplementierungstest
Das Plasmid pHK162 trug ein inseriertes SauAI/BamHI-BamHI-Fragment von etwa 12 kBp. Dieses Plasmid wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten und die erhaltenen DNA-Fragmente wurden durch Elektrophorese aufgetrennt, gefolgt von der Messung der Molekulargewichte, um die Restriktionskarte, wie in 1 gezeigt, herzustellen. Auf der Basis dieser Restriktionskarte wurden Plasmide durch Insertion jedes der durch die Spaltung des ca. 12 kBp Sau3AI/BamHI-BamHI-Fragments mit SphI, BamHI, MluI und ClaI erhaltenen DNA-Fragmente in das Plasmid YCp50 konstruiert. Die rekombinanten Plasmide wurden für die Transformation des Stamms RZT-3u verwendet.
Die erhaltenen Transformanten wurden auf Komplementierung der niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit aufweisenden Mutation untersucht. Wie in 1 gezeigt, ergab die Transformation des Stamms RZT-3u mit dem Plasmid pHK162 eine Komplementierung der niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit aufweisenden Mutation, aber die Transformation des Stammes mit den anderen rekombinanten Plasmiden komplementierte die niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit aufweisende Mutation nicht.
Das vorstehende Ergebnis zeigt, dass ein DNA-Fragment, das das in 1 gezeigte DNA-Fragment von etwa 6,5 kBp von BamHI (A) (die Sequenz an den Positionen 1291 bis 1296 in der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1) bis SphI (B) (die Sequenz an den Positionen 7675 bis 7680 in der Nucleotid-Sequenz von SEQ ID NO: 1) und zusätzliche Sequenzen enthält, die sich stromaufwärts vom 5'-Ende und stromabwärts des 3'-Endes des BamHI-Fragments erstrecken, nötig ist, um die niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit aufweisende Mutation der Stamms RZT-3u zu komplementieren.
(4) Bestimmung der Nucleotidsequenz
Die Nucleotidsequenz des in das Plasmid pHK162 inserierten 12 kBp DNA-Fragments, wurde durch das Didesoxy-Verfahren unter Verwendung eines DNA-Sequenziergeräts (Pharmacia LKB, ALF DNA Sequenzer II) bestimmt. Als Ergebnis wurde ein Gen gefunden, das den in 1 gezeigten, bei BamHI (A) und SphI (B) gespaltenen, etwa 6,5 kBp großen Bereich innerhalb des offenen Leserahmens umfasst. Dieses Gen wurde CSF1-Gen genannt. Wie in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 gezeigt, besteht das vom CSF1-Gen codierte Polypeptid, das von der bestimmten Nucleotidsequenz übernommen wurde, aus 2958 Aminosäureresten (Molekulargewicht: 338 kDa). Eine Suche nach DNA-Homologie mit anderen Genen machte deutlich, dass die Sequenz des Bereichs stromaufwärts im CSF1-Gen, der etwa 140 N-terminale Aminosäurereste im offenen Leserahmen des CSF1-Gens umfasst, mit der Sequenz des Bereichs, der stromaufwärts der Sequenz lokalisiert ist, übereinstimmt, der als die Nucleotidsequenz des GAA1-Gens von Saccharomyces cerevisiae [Hamburger, et al.: J. Cell Biol., 129, 629-639 (1995)] (der Bereich außerhalb der GAA1-Gen-codierenden Region) angezeigt wurde. Der Bericht von Hamburger et al. bezieht sich auf das GAA1-Gen und enthält keine Beschreibung des Vorliegens anderer Gene (CSF1-Gen) stromaufwärts vom GAA1-Gen. Außerdem ist in der von ihnen berichteten Nucleotidsequenz eine Base (T) zwischen der Base an Position 198 (T) und der Base an Position 199 (G) in der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 eingefügt. Deshalb kann das vom CSF1-Gen codierte Polypeptid nicht von der von Hamburger et al. berichteten Sequenz vorweggenommen werden.
Beispiel 2
Herstellung von niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit aufweisender Hefe
(1) Konstruktion eines Plasmids für die Genzerstörung
Etwa 5 μg pHK162-Plasmid-DNA wurden in 20 μl H-Puffer [50 mM Trishydrochlorid-Puffer (pH 7,5), 10mM Magnesiumchlorid, 1 mM Dithiothreit und 100 mM Natriumchlorid] gelöst und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms BamHI zugegeben. Die Reaktion wurde bei 30 °C für 3 Stunden durchgeführt, gefolgt von der Auftrennung des Reaktionsprodukts durch eine 0,8 %ige Agarose-Gelelektrophorese. Das Gelsegment, das die Bande des in 1 gezeigten DNA-Fragments von etwa 8 Bp von BamHI (A) bis BamHI (C) enthält, wurde ausgeschnitten und das Fragment wurde unter Verwendung eines GENECLEAN II-Kits (Bio 101 Co., Ltd.) extrahiert und gereinigt. Das gleiche vorstehend beschriebene Verfahren wurde wiederholt, außer, dass etwa 5 μg pUC19-Plasmid-DNA statt etwa 5 μg pHK162-Plasmid-DNA verwendet wurden, wobei ein DNA-Fragment von etwa 2,8 kB extrahiert und gereinigt wurde. Das, vom Plasmid pHK162 stammende DNA-Fragment von etwa 8 kB (1 μg) und das, vom Plasmid pUC19 stammende DNA-Fragment von etwa 2,8 kB (0,1 μg) wurden über Nacht einer Ligierungsreaktion bei 16 °C unter Verwendung von Ligation Pack (Nippon Gene Co., Ltd.) unterworfen. Das Reaktionsgemisch (2 μl) wurde zur Transformation des hoch kompetenten E. coli Stammes JM109 (Toyobo Co., Ltd.) verwendet. Die erhaltene Transformante wurde auf 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid (nachstehend als X-Gal bezeichnet)-Ampicillin-LB-Agarmedium ausgestrichen und bei 37 °C für 20 Stunden gezüchtet. Das X-Gal-Ampicillin-LB-Agar-Medium wurde durch das Tropfen von 50 μl 4 % X-Gal und 25 μl Isopropyl-1-thio-β-galactosid auf 50 μg/ml Ampicillin enthaltendes LB-Agar-Medium [1 Bacto-Trypton (Difco Laboratorien Inc.), 0,5 % Hefe-Extrakt, 1 Natriumchlorid und 1,5 % Agar] und das Verstreichen der Tropfen mit einem Ausstreicher, gefolgt von leichter Trocknung, hergestellt. Nach Abschluss der Züchtung, wurde die gebildete weiße Kolonie isoliert und gezüchtet. Aus der Kultur wurde Plasmid-DNA extrahiert und gereinigt, um das Plasmid pHK179 zu erhalten.
Etwa 5 μg pNK179-Plasmid-DNA wurden in 20 μl H-Puffer gelöst und je 10 Einheiten der Restriktionsenzyme MluI und SpeI zugegeben. Die Reaktion wurde bei 37 °C für 3 Stunden durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde unter Verwendung des DNA Blunting Kits (Takara Shuzo Co., Ltd.) einer Behandlung unterworfen, um glatte Enden herzustellen, gefolgt von der Auftrennung durch 0,8 % Agarose-Gelelektrophorese. Das Gelsegment, das die Bande eines Fragments von etwa 10 kBp unter Ausschluss des in 1 gezeigten Fragments von etwa 0,6 kB von MluI (die Sequenz an den Positionen 4388 bis 4393 in der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1) bis SpeI (die Sequenz an den Positionen 5027 bis 5032 in der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1) enthält, wurde ausgeschnitten und das Fragment wurde unter Verwendung des GENECLEAN II Kits extrahiert und gereinigt. Gesondert wurden etwa 5 μg DNA des Plasmids YEp24, einem Vektor, der eine Mutation zwischen den HindIII-Stellen im Uracil-Bedarf komplementierenden Markergen URA3 trägt, in 20 μl M-Puffer [10 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM Dithiothreit und 50 mM Natriumchlorid] gelöst. 10 Einheiten des Restriktionsenzyms HindIII wurden zu der Lösung gegeben und die Reaktion wurde bei 37 °C für 3 Stunden durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde einer Behandlung zur Überführung in glatte Enden, durch die Verwendung des DNA-Blunting Kits (Takara Shuzo Co., Ltd.) unterworfen, gefolgt von der Auftrennung durch 0,8 % Agarose-Gelelektrophorese. Das die Bande eines Fragments von etwa 1,1 kB enthaltende Gelsegment wurde ausgeschnitten und das Fragment extrahiert und gereinigt unter Verwendung des GENESCLEAN II Kits. Das, vom Plasmid pHK179 stammende DNA-Fragment von etwa 10 kB (0,5 μg) und das vom Plasmid YEp24 stammende DNA-Fragment von etwa 1,1 kB (0,5 μg) wurden über Nacht einer Ligierungsreaktion bei 16 °C unter Verwendung von Ligation Pack unterworfen. Das Reaktionsgemisch (2 μl) wurde für die Transformation des hoch kompetenten E. coli Stammes JM109 verwendet. Die erhaltene Transformante wurde auf 50 μg/ml Ampicillin enthaltendem LB-Agarmedium ausgestrichen und 20 Stunden bei 37 °C gezüchtet. Nach Abschluss der Züchtung wurde die gebildete Kolonie isoliert und gezüchtet. Aus der Kultur wurde Plasmid-DNA extrahiert und gereinigt, um das Plasmid pHK188 für die Zerstörung des CSF1-Gens zu erhalten. Das Plasmid pHK188 wurde als das gewünschte Plasmid bestätigt, indem das Plasmid einer 0,8 Agarose-Gelelektrophorese unterworfen und das Molekulargewicht vor und nach der Spaltung des Plasmids mit BamHI gemessen wurde.
Die Skizze der Konstruktionsschritte für das Plasmid zur Zerstörung des CSF1-Gens wird in 2 gezeigt.
(2) Zerstörung des CSF1-Gens
Die Zerstörung des vom Stamm YOY655u, einem monoploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae, getragenen CFS1-Gens wurde unter Verwendung des Plasmids pHK188 durchgeführt. Stamm YOY655u ist ein Stamm, der durch die Einführung einer Mutation des Uracil-Bedarfs (ura3) in den Stamm YOY655, einem monoploiden Stamm von Saccharomyces cerevisiae, hergestellt wurde. Die Eigenschaften, wie die Fermentierbarkeit des Stamms YOY655u sind die gleichen wie die des Stamms YOY655. 100 ml YPD-Medium wurden in einem Erlenmeyer-Kolben mit Stamm YOY655u beimpft und unter Schütteln bei 30 °C gezüchtet, bis die Zelldichte 2-4 × 10⁷ erreichte. Nach Abschluss der Züchtung wurden die Zellen durch Zentrifugation (2500 UpM, 5 Minuten) gesammelt und dann durch die Lithium-acetat-Methode in Kontakt mit dem Plasmid pHK188 gebracht. Um die homologe Rekombination des CFS1-Gens mit dem Plasmid pHK188 zu beschleunigen, war das Plamid pHK188 durch vollständige Spaltung mit BamHI vor der Transformation linearisiert worden. Stamm YOY655u, in Kontakt mit Plasmid pHK188, wurde auf Sglu-Agarmedium inokuliert (0,67 % Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acid, 2 % Glucose und 2 % Agar) und für 2 bis 5 Tage bei 30 °C gezüchtet. Nach Abschluss der Züchtung wurde Stamm YHK1243 aus einer der gebildeten Kolonien als eine Transformante erhalten, in der der Uracil-Bedarf des Stamms YOY655u komplementiert war.
Stamm YHK1243, Stamm YOY655u und Stamm RZT-3 wurden auf YPG-Agarmedium inokuliert und für 1 bis 2 Tage bei 30 °C gezüchtet, um Kolonien zu bilden. Dann wurde ein Pigment-Agar über das Medium geschichtet, gefolgt von Züchtung bei 5 °C für 3 Tage. Um die Kolonien von Stamm YHK1243 und Stamm RZT-3 wurde während der Kultur keine Farbänderung beobachtet, während sich die Farbe um die Kolonie von Stamm YOY655u am ersten Tag der Kultur zu gelb hin änderte.
Beispiel 3
Verfahren zur Brotherstellung mit gekühltem Teig
(1) Züchtung von Bäckerhefe
Stamm YOY655 beziehungsweise Stamm YHK1243 wurden auf folgende Weise gezüchtet. Das heißt, 30 ml YPD-Medium wurden mit je einer Öse jeden Stammes in einem 300 ml-Erlenmeyer-Kolben inokuliert und für 24 Stunden bei 30 °C gezüchtet. Die gesamte so erhaltene Kultur wurde in 270 ml Melasse-Medium (3 % Melasse, 0,193 % Harnstoff, 0,046 Kaliumdihydrogenphosphat und 2 Tropfen Entschäumer) in einem 2 l Erlenmeyer-Kolben mit Ablenkplatten inokuliert und für 24 Stunden bei 30 °C gezüchtet. Nach Abschluss der Züchtung wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und zweimal mit deionisiertem Wasser gewaschen, gefolgt von Trocknung auf einer Tonplatte. Die erhaltenen Zellen wurden zur Brotherstellung verwendet.
(2) Brotherstellung
Nach folgender Teigzusammensetzung und Schritten wurde Brot hergestellt. Teigzusammensetzung:

(Gewicht: g)

Hartes Mehl 100

Zucker 5

Salz 2

Hefezellen 2

Wasser 62

Schritte:

Mischen (100 UpM, 2 Minuten)

Teilen (34,4 g)

Lagerung (5 °C, 7 Tage)

Gehenlassen (40°C, 90% Raumfeuchte, 75 Minuten)

Backen (220 °C, 25 Minuten)
Das unter Verwendung von Stamm YHK1243 als Hefezellen erhaltene Brot besaß ein großes Volumen, verglichen mit dem unter Verwendung des Stamms YOY655 erhaltenen Brots.
Beispiel 4
Alkohol-Fermentierung
Züchtung von Hefe und Alkoholfermentierung
Stamm YOY655 beziehungsweise Stamm YHK1243 wurden auf folgende Weise gezüchtet. Das heißt, 5 ml YPD-Medium wurden in einem Teströhrchen mit einer Öse jeden Stamms beimpft und für 24 Stunden bei 30 °C gezüchtet.
Nach Abschluss der Züchtung wurden 2 ml der Kultur in 20 ml eines Melasse-Mediums (25 % Melasse und 0,2 % Ammoniumsufat) in einem großen Teströhrchen inokuliert, gefolgt von Züchtung bei 37 °C. 16 und 40 Stunden nach dem Start der Züchtung wurden Proben der Kultur (je 0,5 ml) genommen und auf die Ethanolkonzentration analysiert.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3

*: Der Unterschied war signifikant bei einem 5 %igen Signifikanzniveau.

Wie in Tabelle 3 gezeigt, wurde eine große Menge Ethanol bei 37 °C produziert bei Verwendung von Stamm YHK1243 verglichen mit Stamm YOY655.
Industrielle Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung stellt ein Protein und ein Gen bereit, die die niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit aufweisende Mutation komplementieren, eine Kühlungs-resistente Hefe, die durch Inaktivierung dieses Gens erhalten wird und ein Verfahren zur Herstellung von Brot und Ethanol unter Verwendung dieser Hefe. Sequenzprotokoll

Claims

Gen, das ein Protein codiert, das in der Lage ist, die niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit aufweisende Mutation zu komplementieren, oder die eine DNA umfasst, die ein Protein codiert, das in der Lage ist, die niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit aufweisende Mutation zu komplementieren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Gen, das ein Protein codiert, das die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Aminosäuresequenz hat, (b) einem Gen, das DNA umfasst, die die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Nucleotidsequenz hat.
Vektor umfassend die Nucleinsäuresequenz von Anspruch 1.
Vektor nach Anspruch 2, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus YCp-Vektoren, YEp-Vektoren, YRp-Vektoren, YIp-Vektoren und YAC-Vektoren.
Wirtszelle, transformiert oder transfiziert mit dem Vektor nach Anspruch 2 oder 3.
Wirtszelle nach Anspruch 4, wobei die Zelle Hefe oder E. coli ist.
Polypeptid, das von der Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 1 codiert wird.
Hefe, die zur Gattung Saccharomyces gehört und niedertemperatursensitive Fermentierbarkeit aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen nach Anspruch 1 auf dem Chromosom inaktiviert ist.
Hefe nach Anspruch 7, wobei die Hefe zu Saccharomyces cerevisiae gehört.
Hefe nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Sequenz von Position 4388 bis 7885 in der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nucleotidsequenz unterbrochen ist.
Saccharomyces cerevisiae YHK1243 (FERM BP-5327).
Teig, enthaltend die Hefe nach einem der Ansprüche 7 bis 10.
Verfahren zum Herstellen von Brot, umfassend das Hinzufügen der Hefe nach einem der Ansprüche 7 bis 10 zu Teig.
Verfahren zur Herstellung von Ethanol, umfassend das Züchten der Hefe nach einem der Ansprüche 7 bis 10 in einem Medium, die Ermöglichung der Anreicherung von Ethanol in der Kultur, und das Gewinnen von Ethanol aus der Kultur.