CN1124346C

CN1124346C - 新的酵母基因

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Publication number: CN1124346C
Application number: CN96192213A
Authority: CN
Inventors: 川崎秀纪; 渡海雅也; 菊池泰弘; 大内弘造
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: SYOWA HAKKO KOGYO CO Ltd
Priority date: 1995-12-28
Filing date: 1996-12-27
Publication date: 2003-10-15
Anticipated expiration: 2016-12-27
Also published as: US6172196B1; KR100430638B1; CA2211685A1; CN1176660A; AU706093B2; KR19980702602A; DE69636900D1; AU1152797A; ATE353966T1; EP0818535A1; EP0818535B1; DE69636900T2; JP3795529B2; WO1997024442A1; EP0818535A4

Abstract

本发明涉及由序列号1给出的氨基酸序列组成的蛋白质，或者是由在该序列号1给出的氨基酸序列中添加、缺失、或替换1个或数个氨基酸后的氨基酸序列组成的、而且对发酵能力显示出低温敏感性的变异互补的蛋白质以及编码该蛋白质的基因，还有由序列号1给出的碱基序列组成的DNA，或是由在该序列号1给出的碱基序列中添加、缺失、或替换1个或数个DNA的、而且对发酵能力表现出低温敏感性的变异互补的DNA组成的基因。本发明还涉及属于酵母属的发酵能力显示出低温敏感性的酵母，其特征是染色体上的上述基因被失活；含有该酵母的生面团；以及面包的制作方法，其特征是在面包生面团中加入上述的酵母；还有乙醇的制造方法，其特征是在培养基中培养上述酵母，使乙醇在培养物中蓄积，再从该培养物中获取乙醇。

Description

新的酵母基因

(一)技术领域

本发明涉及用冷藏生面团制作面包的方法和制造乙醇的方法。

(二)背景技术

面包制作业正在普及用冷藏生面团制作面包的万法，其目的是使制作过程省力和满足各种各样消费者的需要。用冷藏生面团制作面包的方法是将使一部分发酵了的生面团放入冷藏库等地方低温贮藏后，经过发酵、烘制、烤制而制作面包的方法。用冷藏生面团制作面包方法中，使用了一种具有生面团于低温贮藏期间发酵被抑制、而在发酵和烘制的温度区正常发酵使生面团膨胀的能力的酵母，即所谓的耐冷藏酵母。

作为耐冷藏酵母的育种方法，已知有对野生型酵母进行突变处理后，赋予该酵母发酵能力表现出低温敏感性的变异的方法〔例如特公平7-71474、特开平7-213277、特开平7-79767、App1.Environ.Microbiol，61,639-642(1995)〕。被赋予了发酵能力显示出低温敏感性的变异的酵母被用作耐冷藏酵母，或被用作进行耐冷藏酵母育种的亲本株。

然而，突变处理中，由于变异是随机发生的，所以实施处理时，不仅赋予了酵母低温敏感性变异，而且也有可能赋予了与面包生面团膨胀能力等发酵的基本特性有关的变异。

另外，已知通过使用基因操作技术可以赋予面包酵母或酿造用酵母以凝集性〔23rd Europran Brewry Conv.，Proc.，297-304(1991)〕、产生香味〔Curr.Genet.，20,453-456(1991)〕等有用的性质。

然而，人们还不知道与发酵能力的低温敏感性有关的基因和使用基因操作技术进行耐冷藏酵母的育种方法。

乙醇是使用作为碳源的废糖密等糖原料或玉米、土豆等淀粉原料通过发酵方法制造的。发酵通常是在30～43℃进行的，但由于发酵温度的上升会引起酵母死亡、增殖不良或发酵能力低下，所以通常将温度维持在30-35℃。然而在夏季等气温上升时期，冷却不充分，乙醇发酵过程中有时培养温度会上升至35～38℃。为了抑制发酵热引起的温度上升通常要在乙醇发酵中进行冷却，而为了削减冷却上的花费，人们在寻找具有耐温度性的酵母。

作为具有耐温度性的酵母的育种方法有导入与耐温有关的线粒体的方法(Juan Jimenez等人；Curr.Genet.，13,461-469(1988))、有使热休克蛋白HSP104高效表达的方法(Susan Lindquist等人：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，5301-5306(1996)，但有关在乙醇发酵中的应用还没有研究。人们还已知若是在酵母不致死温度下对酵母进行热处理会使它的耐热性提高(B.G.Hall：J.Bacteriol.，156，1363(1983))，但其效果短暂，在乙醇发酵的应用上是困难的。

发明内容

本发明涉及由序列号1给出的氨基酸序列组成的蛋白质、或在序列号1给出的氨基酸序列中添加、缺失或替换1个或数个氨基酸后的氨基酸序列组成的、而且对表现出发酵能力的低温敏感性的变异互补的蛋白质以及编码该蛋白质的基因，还涉及由序列号1给出的碱基序列组成的DNA、或是由在序列号1给出的碱基序列中添加、缺失或替换1个或数个DNA的、而且对表现出发酵能力的低温敏感性的变异互补的DNA组成的基因。本发明还涉及属于酵母(Saccharomyces)属的发酵能力显示出低温敏感性的酵母，其特征是染色体上的上述基因被失活；以及含有该酵母的生面团；面包的制作方法，其特征是将该酵母添加到生面团中；以及乙醇的制作方法，其特征是将该酵母在培养基中培养，使乙醇在培养物中蓄积，然后从该培养物中荻取乙醇。

本发明中，所谓的发酵能力显示出低温敏感性是指在低温贮藏的温度区没有实质性的发酵能力，而在低温贮藏后，在发酵或烘制的温度区内又表现出正常发酵能力的性质。例如，在面包酵母的情况下，是指在5℃下不具有使面团膨胀的能力，并且在5℃下冷藏贮藏1-7天后，在20-40℃下具有正常的膨胀能力；在乙醇酵母的情况下，是指在5℃下不具有乙醇发酵能力，并且在5℃下冷藏贮藏1-7天后，在20-40℃下具有正常的乙醇发酵能力。

而有关分离对发酵能力显示出低温敏感性的变异互补的基因，确定该基因序列，使该基因失活所用的基因工程或生物工程的基本操作可以按着以下市售的实验书记载的方法进行。例如，《基因手册》(讲谈社、高木康敬编)、“基因操作实验方法”(讲谈社)、Molecular Cloning(Cold spring Harbor Laboratory(1982))、Molecular Cloning，第二版(Cold spring Harbor Laboratory，1989)、Methods in Enzymology，(194(1991))、实验医学别册。酵母的基因实验方法(羊土社(1994))等记载的方法。

本发明的对发酵的能力显示出低温敏感性的变异互补的基因(以下称为低温敏感性互补基因)例如可以作为特开平5-336872号公报记载的啤酒酵母RZT-3(FERM BP-3871)株(以下称RZT-3株)具有的发酵能力显示低温敏感性的基因分离出来。即，用带有低温敏感性互补基因的酵母DNA文库转化RZT-3株，通过从对发酵能力显示出低温敏感性变异的互补的菌株中获得DNA，可以分离出低温敏感性互补基因。

带有低温敏感性互补基因的酵母DNA文库可以通过用限制酶切带有野生型基因的酵母、例如啤酒酵母X2180-1B株(以下称X2180-1B株)的染色体DNA，将得到的DNA片段与酵母中能够容纳的载体连接后制得。

用作切染色体DNA的限制酶只要是能切染色体DNA的无论哪种都可以用，但理想的是使用使20Kbp以下DNA片段生成的限制酶。而染色体DNA无论是被限制酶完全切断，还是部分切断都没关系。

作为酵母中能够容纳的载体，可使用YCp型载体、YEp型载体、YRp型载体、YIp型载体和YAC(酵母人工染色体)载体等。

DNA文库向RZT-3株的转化按照基因工程乃至生物工程领域内惯用的方法进行，如原生质体法〔如Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929-1933(1978)〕、乙酸锂法〔如J.Bacteriol，153,163-168(1983)〕、电穿孔法〔例如Methods in Enzymology，194,182-187(1991)〕等方法。

对发酵能力显示出低温敏感性变异已经互补可以通过调查使转化的酵母于低温下增殖或低温下的发酵整能力来确认〔Appl.Euviron.Microbiol.，61,639-642(1995)〕。为了调查低温下的发酵能力，可以使用如下所示的色素琼脂叠层法。将想要评价的菌株于YPG琼脂培养基(1％酵母提取液、2％蛋白胨、3％甘油、2％琼脂)于30℃下培养后使其形成菌落；然后再于培养基上铺上色素琼脂(0.5％酵母提取液、1％量的胨、10％蔗糖、0.02％溴用酚紫、1％琼脂、PH7.5)，保持在低温下如5℃。溴甲酚紫是PH指示剂，刚铺上时显示紫色，但若一发酵，菌落周围的培养基的PH降低，菌落周围的颜色变黄。因此叠层琼脂的板保持在低温期间，可以选择在这期间菌落周围颜色变成黄色菌株作为低温下表现出发酵性的菌株。

从酵母中回收质粒以及用回收质粒转化大肠杆菌的方法可以使用基因工程领域内惯用的方法。从酵母中回收质粒的方法有例如“实验医学例册·来自酵母的基因的实验方法”(羊土社(1994))中记载的方法，而用回收质粒转化大肠杆菌的方法例如有Molecular Cloning第二版(Cold Spring Harbor laboratory(1989))中记载的方法。

低温敏感性互补基因的碱基序列可以通过Maxam-Gilbert法、双脱氧法等基因工程领域内惯用的方法来确定。

低温敏感性互补基因编码的多肽若利用现代分子遗传学知识可以很容易地找出。如有必要，使用各种计算机的解析也是可能的〔如细胞工学，14,577-588(1995)〕。低温敏感性互补基因所编码的多肽作为在发酵能力显示出低温敏感性的酵母中抑制发酵能力的低温敏感性的物质来利用是有可能的。

本发明中通过弄清低温敏感性互补碱基序列和该基因编码的多肽的氨基酸序列，可以利用Methods in Enzymology，194,594-597(1991)记载的方法进行低温敏感性互补基因的破坏，由于启动子改变而引起的低温敏感性互补表达调控或表达量的改变，以及利用低温敏感性互补基因的启动子的各种基因的表达，和低温敏感性互补基因与各种基因融合后的基因以及融合多肽的制作等工作。

有关在酵母内使低温敏感性互补基因失活的方法以下予以说明。

本发明中所谓基因的失活是指基因的破坏〔例如Methods inEnzymology，194,281-301(1991)〕，向基因中导入转移因子〔例如，Methods in Enzymology，194,342-361(1991)〕、基因的反意义基因的导入和表达〔如特公平7-40943、23rd European BreweryConv.Proe.，297-304(1991)〕，向基因附近导入与沉默有关的DNA〔如Cell，75,531-541(1993)〕，对基因编码的多肽的抗体的处理〔如EuropeanJ.Biochem.，231,329-336(1995)〕等，使用基因工程的手法或生物工程的手法使基因或基因编码的多肽本来具有的功能降低或使其失活。

在低温敏感性互补基因的失活中使用的酵母只要是属于酵母属的酵母即可，理想的是属于啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母，无论用面包酵母、清酒酵母、葡萄酒酵母、啤酒酵母、豆酱。酱油酵母、乙醇生产酵母等哪种都可以。

所谓的低温敏感性互补基因的破坏是指虽然具有与低温敏感性互补基因相同的碱基序列，但在发生添加、缺失、替换等变异之后将作为低温敏感性互补基因不起作用的DNA导入到酵母细胞中使其发生同样的重组，使这一变异引入到基因组上的基因中。

基因破坏中采用的DNA制作方法可以使用例如利用限制酶将低温敏感性互补基因切割后，再进行DNA的添加、缺失、替换等方法或者是使用使低温敏感性互补基因在细胞外变异(体外变异)等方法。作为添加、替换DNA的方法使用插入标记基因等方法也可以。

要破坏低温敏感性互补基因，可以破坏它的启动子部分、操纵子的前导框架部分、终端部分等任一部位，也可以将各部位一块破坏掉。还可通过使基因的整体缺失来破坏该基因。

要破坏低温敏感性互补基因，例如可以将能使该基因破坏的质粒或质粒片段转化入酵母中，含有转化的质粒或质粒片段的DNA与酵母的基因组上的基因发生同源重组来进行。作为引起同源重组的DNA片段只要是该质粒或该质粒片段与酵母基因组上的低温敏感性互补基因在引起同源重组的程度上具有相同性就可以。是否是引起同源重组的DNA片段可以通过将该DNA片段导入酵母里，看看能否分离出引起同源重组的菌株，即能否分离出发酵能力表现出低温敏感性的菌株来检查。

制作破坏低温敏感性互补基因的质粒所用的载体除了可以使用在酵母中能容纳的载体外，也可以使用能容纳在大肠杆菌的载体，如pUC19、pBR322、BluscriptII SK⁺等任一种。

作为标记基因，只要在酵母中可以使用的标记基因，例如URA3、TRP1、LEU2、HIS3等带有营养缺陷性变异互补的基因。对G418、匀霉素B、媒染培酸绿、仲氯苯丙氨酸等化学物质有抗性的基因〔例如，J.Ferment.Bioeng.，76，60-63(1993)、Enzyme and Microb.Technol.，15,874-876(1993)〕等中的任一种。

酵母基因组上的低温敏感性互补基因的破坏可以通过用破坏该基因用的质粒转化酵母来进行。

酵母的转化可以通过基因工程乃至生物工程领域内惯用的方法，例如原生质体法、乙酸锂法、电穿孔法进行。

通过予先向破坏低温敏感性互补基因用的质粒中导入标记基因，以该标记作为指标，可以很容易分离转化体。低温敏感性互补基因被破坏的菌株的低温敏感性的确认可以通过研究该酵母在低温下的增殖或发酵能力来进行。

利用上述方法制备的低温敏感性互补基因被失活的、发酵能力显示出低温敏感性的酵母，例如有啤酒酵母YHK1243株(以下称YHK1243株)。该菌株根据布达佩斯条约于平成7年12月7日以FERM BP-5327保藏于通产省工业技术院生命工学技术研究所(茨城县筑波市1丁目1番3号)。

以下给出了YHK1243株表现出发酵能力的低温敏感性降低的试验例。

试验例1发酵能力的低温敏感性试验

向装有5mlYPD培养基(1％酵母提取液、2％蛋白胨、2％葡萄糖)的试管中接种1铂制小勺的YHK1243菌株，于30℃下培养16小时。培养后，再将1ml该培养液接种于装有50ml的YPD的300ml三角烧瓶中，30℃培养24小时。培养结束后，通过离心分离收集菌体，用去离子水洗2次后，将得到的湿菌体0.61g悬浮于装有50ml发酵试验培养基〔Yeast nitrogen base W/O氨基酸(Difco社制)0.67％、蔗糖2％、琥珀酸钠1％(用浓盐酸调PH为4.5)〕的内径为22mm、高为200mm的试管内，然后用带有硅胶管的栓封住试管口，于5℃培养24小时。培养中产生的气体通过硅胶管收集在饱和食盐水中，测定气体的体积，算出每1g菌体的二氧化碳的生成量。对于YOY655株也用与YHK1243株同样的方法算出每1g菌体的二氧化碳的生成量。

结果如表1所示。

表1

菌株	CO₂生成量(ml/g菌体^*)
菌株	CO₂生成量(ml/g菌体^*)	YOY655株YHK1243株	13315

^*：以含27％干重的菌体换算得到。

可以看出YHK1243株在5℃下的CO₂生成量约为YOY655株的CO₂生成量的1/9。

试验例2发酵能力的低温敏感性试验(2)

将1铂制小勺YHK1243菌株接种于装有30ml的YPD培养基的300ml的三角烧瓶中，于30℃培养24小时。培养后，将该培养液全部加入到装了270ml的糖蜜培养基(糖蜜3％、尿素0.193％、磷酸二氢钾0.046％、消泡剂2滴)的2升的带有折流板的三角烧瓶里，30℃培养24小时。培养结束后，通过离心收集菌体，用去离子水洗2次后，除去吸收板上的水分，获得菌体。对于YOY655菌株也使用与YHK1243株同样的方法获得菌体。

使用这些菌体，按着以下给出的原料组成和过程制备分别含有YOY655株和YHK1243株的面团。面团组成： (重量：g)强力粉 100砂糖 5食盐 2酵母菌体(YHK1243株或YOY655株) 3水 62

过程：

搅拌(使用松下完全搅拌器(National Complete Mixer)100rpm搅拌2分钟)

↓

分割(每块为总生面团重量的1/5；34.4g)

↓

冷藏保存(5℃的冷藏库中7天)

↓

解冷(30℃相对湿度85％下进行30分钟)

↓

使用Pharmograph(Atto社制)测定30℃下2小时内CO₂的生成量

得到的生面团冷藏保存后，测定于30℃下的CO₂生成量，进行耐冷藏特性的评价。

结果表示在表2内。

表2

菌株	CO₂生成量(ml)
	CO₂生成量(ml)	冷藏保存前冷藏保存后
	YOY655株YHK1243株	冷藏保存前冷藏保存后	124 68120 101

含有YHK1243株的面团与含有YOY655株的相比，冷藏后，30℃下的CO₂生成量变高了。同时在冷藏保存期间，虽然能观察到含有YOY655株的面团的膨胀，但在含有YHK1243株的生面团中却没有实质性地观察到膨胀现象。

以下就含有属于酵母属以低温敏感性互补基因被失活为特征的表现出发酵能力的低温敏感性的酵母(以下称为本发明酵母)的生面团进行说明。

所谓含有本发明的酵母的生面团是指在小麦粉、黑麦粉中加入本发明酵母、食盐、水、根据需要再加上油脂、砂糖、油酥、黄油、脱脂乳粉、酵母菌营养源、鸡蛋等副原料后揉好的生面团。

作为冷藏含有本发明酵母的生面团的条件，为-5～10℃、理想的是0-5℃，保存1-10天，理想的是1～7天。

以下就含有本发明酵母的生面团的制作方法以及面包的制作方法进行说明，其特征是将本发明酵母添加到生面团中。

通过将本发明酵母于含有碳源、氮源、无机物、氨基酸、维生素等通常的培养基中，好氧条件下，温度调节在27～32℃进行培养，回收菌体，洗净后可以获得适于面包制作的酵母菌体。

作为培养基中的碳源可以使用葡萄糖、蔗糖、淀粉水解产物、糖蜜等，但废糖蜜最适合。

作为氮源使用氨、氯化铵、硫酸铵、碳酸铵、醋酸铵、尿素、酵母提取物、玉米浆等。

作为无机物可以使用磷酸镁、磷酸钾等，而作为氨基酸可以使用谷氨酸等，作为维生素可以使用硫酸、硫胺素等。

培养方式以流加培养为好。

培养结束后，离心分离回收本发明酵母菌体，将它与食盐、水，根据需要，还有油脂、砂糖、起酥油、黄油、脱脂乳粉、乳酵母培养营养源、鸡蛋一起加到小麦粉、黑麦粉里，再通过混合得到含有本发明酵母的面团。

使用得到的生面团，按照通常的制作面包的方法，就可以制作面包。代表性的不加甜味的面包和点心面包等面包制作方法中有直揉法和中种法，前者是从一开始就将所有原料混在一块的方法，后者是首先将一部分小麦粉中加上酵母和水制造中种，发酵后再将剩下的原料加入的方法。

直揉法中，在将所有原料混揉后，于25～30℃发酵，然后进行分块、揉面、成型。经过烘制(35-42℃)后、再烤制(200-240℃)。而中种法中，向整个小麦粉的大约70％、酵母、酵母培养营养液等加入水混揉，于25～35℃使其发酵3-5小时后，再加入其余的原料(小麦粉、食盐、水等)，混揉(本揉)、分块、揉面、进行成型、造型。经烘制(35～42℃)后，再进行烤制(200-240℃)。

在制作丹麦面制膏饼、羊角面包等面包时，例如可如下制作。

将小麦粉、食盐、本发明酵母、砂糖、起酥油、鸡蛋、脱脂乳粉、和水混匀后制成生面团。然后将黄油和人造黄油等油脂混在生面团里，重复擀压、折叠，制作成多层的生面团和油脂。在制备生面团时，将油脂叠入的作业称之为作层。作层有2种方法，即将原料温度降到15℃后揉和，直至需要的层数为止不进行冷却制作的方法以及叠入作业中在冷藏库或冷冻库内进行数次冷却的方法，所谓的延缓制作法。

将得到的生面团擀压延展、分块、成型后进行造型。经烘制(30-39℃)后进行烤制(190-210℃)。

以下就乙醇的制造方法予以说明，其特征是将本发明酵母于培养基上培养，使乙醇在培养物中蓄积，再从该培养物中取得乙醇。

通过本发明酵母制造乙醇是利用通常酵母培养常用的方法进行的。现在，也可以将本发明中使用的微生物固定于凝胶状载体、例如琼脂、藻酸钠、聚丙烯酰胺或角叉菜胶上再使用。

本发明中制造乙醇用的培养基只要是含有碳源、氮源、无机物和根据需要含有其它的营养素的培养基，无论是合成培养基还是天然的，哪种都可以。

作为碳源要用至少含有蔗糖的发酵原料，除此之外也可以用本发明所用微生物能利用的碳源、例如葡萄糖、果糖、半乳糖或甘露糖等任一种糖类。作为含有蔗糖的发酵原料，只要是含有蔗糖，无论是合成的还是天然的都可以，例如可以使用甘蔗的榨汁、甜菜的榨汁，或使用在制糖过程中用这些榨汗使砂糖析出后得到的废糖蜜。

作为氮源可以使用尿素、氨、硫酸铵、硝酸铵等有机或天然的氮源，以及玉米浆、蛋白胨、肉提取物、酵母提取物等天然的氮源。

作为无机盐，可以使用磷酸钾、磷酸钠、硫酸镁、硫酸锰、硫酸亚铁、氯化钾、氯化钠等盐类。

作为其它营养素，可以使用维生素B1盐酸盐、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素、肌醇等维生素等。

培养是在通常的振荡培养或通气搅拌培养等好氧条件下进行的。温度为25-50℃，理想的是30-43℃，培养的PH为3～7，理想的是保持在4～6，通常培养1～10天结束。

培养结束后，通过从培养液中蒸馏等常用方法回收乙醇。

(四)附图说明

图1是含有CSF1基因的DNA片段的限制酶切位点图，以及表示与为了CSF1基因功能区限定所进行的亚克隆和互补性试验的结果图。

图2表示破坏CSF1基因用的质粒的构建过程。

(五)具体实施方式

实施例1低温敏感性互补基因的克隆

①赋予RZT-3株的ura3变异

作为向发酵能力显示出低温敏感性的酵母RZT-3株导入质粒的标记，按照Boeke等人的方法〔Mol，Gen.Genet.，197,345-346(1984)〕，赋予了ura3变异。即，将1铂制小勺的RZT-3株接种于YPD培养基，于30℃振荡培养一夜。将得到的培养液100ml涂布于FOA板〔0.67％yeast nitrogen baseW/O氨基酸(Difco社制)、0.1％5-氟乳清酸、0.005％尿嘧啶、2％葡萄糖、2％琼脂〕，30℃培养3天。培养结束后，生成菌落中虽然是尿嘧啶缺陷性的，但用URA3作为标记的质粒YCp50转化时，尿嘧啶缺陷性被互补了，选择表现出发酵能力的低温敏感性的1个菌株，作为啤酒酵母RZT3u株(以下称为RZT-3u株)。

②克隆

将用Sau3AI部分分解的X2180-1B株(从Yeast Genetic StockCenter得到)的染色体DNA的DNA片段插入到质粒YCp50的BamH1部位，制作基因文库。用基因文库转化RZT-3u株，根据尿嘧啶非缺陷性选择转化体。将得到的转化体于YPG琼脂培养基上30℃培养，形成菌落后，铺上色素琼脂，5℃培养1-3天。5℃培养期间，将菌落周围的颜色变成黄色的菌株，即在5℃时能观察到发酵的菌株作为表现出发酵能力的低温敏感性的变异被互补了的菌株分离，从该菌株提取重组的质粒pHK162。

另外，将质粒pHK162导入E.Coli JM109株，制备E.Coli EHK162株。本菌株按照布达佩斯条约于平成7年12月7日以FERMBP-5328保藏于通产省工业技术院生命工学工业技术研究所。

③互补性实验

向质粒pHK162插入Sau3AI/BamHI～BamHI的大约12Kbp的DNA片段。用各种限制酶切质粒pHK162，通过电泳分离得到的DNA片段，测定其分子量，象图1给出的那样，制作限制酶酶切图。按着这个图，用sphI、BamHI、MluI和ClaI切Sau3AI/BamHI～BamHI的大约12Kbp，将得到的DNA片段插入质粒YCp50制备重组质粒。用各种各样的重组质粒转化RZT-3u株。

研究得到的转化体是否表现出发酵能力的低温敏感性的变异已互补。其结果如图1所示那样，用质粒pHK162转化RZT-3u株时，显示发酵能力的低温敏感性的变异被互补了。但用其它的重组质粒转化RZT-3u株时，这种变异却没有被互补。

从以上事实表明，为了互补使RZT-3u株显示出发酵能力的低温敏感性的变异需要在图1的BamHI(A)(序列号1的碱基序列的第1291～1296)～SphI(B)(序列号1的碱基序列的第7675～7680)的大约6.5Kbp的DNA片段的5′末端的上游区和3′末端的下游区带上更长的序列的DNA片段。

④碱基序列的确定

利用双脱氧法和DNA序列仪(Pharmacia LKB社制，ALF DNA序列仪II)确定插入质粒pHK162的12Kbp的DNA片段的碱基序列。其结果可以看到如图1所示的包含在操纵子前导框架内的BamHI(A)和SphI(B)切后的大约6.5Kbp的基因。该基因被命名为CSF1基因。就象序列号1给出的氨基酸序列那样，从已确定的碱基序列推测出的CSF1基因编码的多肽有2958个氨基的碱基，分子量为338kDa。与其它基因的DNA同源性调查结果表明，含有CSF1基因的操纵子前导框架的N末端的大约140氨基酸的CSF1基因的上游一侧与以啤酒酵母的GAA1基因〔Hamburger，etal.，J.Cell.Biol.，129,629-639(1995)〕的碱基序列报道的序列的上游一侧(GAA1基因编码的区域的外侧)一致。然而Hamburger等人的报道是有关GAA1基因的内容，有关在GAA1基因的上游一侧存在其它基因(CSF1基因)的描述还未看到。另外，他们报道的碱基序列是在序列号1的碱基序列的第198号T和199号的G之间插入了一个碱基，CSF1基因编码的多肽不能从他们报道的序列推断出。

实施例2显示发酵能力的低温敏感性的酵母的制备

①破坏基因用的质粒的制备

将大约5μg质粒pHK162溶解于20μlH编冲液〔50mMTris盐酸缓冲液(PH7.5)，10mMMgCl₂，lmM二硫苏糖醇、100mMNaCl₂〕，加入10单位的限制内切酶BamHI，于30℃反应3小时。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离反应生成物，切出图1中的BamHI(A)～BamHI(C)的大约8kb的DNA片段，用GENCLEAN II试剂盒(Bio101社制)提取取化。另外除了将大约5μg的pHK162换成大约5μg的质粒pUC19以外，使用同样的方法提取纯化大约2.8Kb的DNA片段。将来自质粒pHK162的大约8kb的DNA片段1μg与取自质粒pUC的大约2.8kb的DNA片段0.1μg用Ligation Kit(日本基因社制)于16℃下连接一夜。反应结束后，用2μl反应液转化感受态细胞E·ColiJM109株(东洋纺社制)。将得到的转化体涂布于5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(以下称X-gal)氨苄青霉素LB琼脂培养基，于37℃下进行20小时的培养。而X-gal氨苄青霉素LB琼脂培养基是向含有50μg/ml的氨苄青霉素LB琼脂培养基(1％Bactotripton(Difco社制)、0.5％酵母提取液、1％NaCl₂、1.5％琼脂〕上滴入50μl的4％X-gal和25μl的异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷，用涂胶器铺开，使其稍干燥后制备的。培养结束后，分离生成的白色菌落，培养，提取纯化得到的质粒DNA，制备出质粒pHK179。

将大约5μg的质粒pHK179溶解于20μl的H缓冲液里，加入10单位的限制内切酶MluI和10单位的SpeI，于37℃反应3小时。使用DNA平端化试剂盒(宝酒造社制)对反应生成物进行平滑末端处理。利用0.8％琼脂糖凝胶电泳分离处理物后，切出除去图1中MluI(序列号1的碱基序列的第4388～4393)～SpeI(序列号1的碱基序列的第5029～5032)的大约0.6kb的DNA片段后的大约10Kbp片段，使用GENCLEANII试剂盒提取纯化。另外将在HindIII-HindIII内含有的尿嘧啶需求变异的标记基因URA3的载体-质粒YEp24大约5μg溶解于20μl的M缓冲液〔10mMTris盐酸缓冲液(PH7.5)、10mMMgCl₂、1mM二硫苏糖醇、50mMNaCl〕，加入10单位的限制内切酶HindIII，于37℃反应3小时。反应生成物用DNA平端化试剂盒(宝洒造社制)进行平滑末端处理。利用琼脂糖凝胶电解分离处理物，切出含有URA3的大约1.1kb的片段，用GENCLEANII试剂盒提取纯化。将取自质粒pHK179的大约10kb的DNA片段0.5μg和来自YEp24的大约1.1kb的DNA片段0.5μg用Ligation Pack于16℃连接一夜。反应结束后，用2μl反应液转化感受态细胞E.ColiJM109株。将得到的转化体涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，于37℃培养20小时。培养结束后，分离出生成的白色菌落，进行培养，提取纯化出质粒DNA，制备破坏CSF1基因用的质粒pHK188。质粒pHK188是目的质粒的确认是通过将用限制酶切的或未切的质粒通过0.8％琼脂糖电泳分离，测定其分子量来进行的。

破坏CSF1基因用的质粒的构建过程的梗概如图2所示。

②CSF1基因的破坏

使用质粒pHK188进行作为啤酒酵母单倍体株YOY655u株带有的CSF基因的破坏。YOY655u株是在啤酒酵母单倍体株YOY655株导入了尿嘧啶(ura3)需求性变异的菌株，其发酵能力等性质与YOY655株相同。将YOY655u接种于装了100mlYPD培养基的三角烧瓶中，于30℃振荡培养至2～4×10⁷。培养结束后，通过离心分离(2500rpm，5分钟)收集菌体，使得到的菌体通过醋酸锂法接触pHK188。为了促进CSF1基因与质粒pHK188的同源重组，在转化前就用BamHI将质粒pHK188完全切开使其呈线性化后再用。将接触于质粒pHK188的YOY655u株接种于SG1u琼脂培养基上(0.67％yeast nitrogen base W/O氨基酸、2％葡萄糖、2％琼脂)，30℃培养2-5天。培养结束后，从生成的菌落中选一个作为YOY655u株的尿嘧啶缺陷性被互补的转化株，就得到了YHK1243株。

将YHK1243株、YOY655u株和RZT-3株接种于YPG琼脂培养基上，于30℃下培养1-2天，形成菌落后，再在培养基上铺上色素琼脂，于5℃下培养3天。YHK1243株和RZT-3株的菌落的周围的颜色在培养期间，没有看到变化，但YOY655u株其菌落周围的颜色在培养的第一天就变成了黄色。

实施例3用冷藏生面团制作面包的方法

①面包酵母的培养

将YOY655株和YHK1243株各一铂制小勺分别接种于装有30mlYPD培养基的300ml的三角烧瓶里，于30℃培养24小时。培养后，将所有的培养液移入装了270ml糖蜜的培养基(糖蜜3％、尿素0.193％、磷酸二氢钾0.046％、消泡剂2滴)的2升的带有栓的三角烧瓶里，于30℃培养24小时。培养结束后，经离心分离，收集菌体，用去离子水洗2次后在素烧瓷板上除去水分得到菌体。该菌体用于制作面包。

②制作面包

利用以下给出的原料和制作过程可作成面包。原料组成： (重量：g)强力粉 100砂糖 5食盐 2酵母菌体 2水 62过程：混合(100rpm、2分钟)分块(34.4g)贮藏(5℃、7天)烘制(40℃、90％RH、75分钟)烤制(220℃、25分钟)

结果，使用YHK1243株作为酵母菌体制得的面包与用YOY655株制得的面包相比，其体积更大。

实施例4乙醇发酵

酵母的培养和乙醇发酵

将1铂制小勺的YOY655株和YHK1243株分别接种于装了5mlYPD培养基的试管内。于30℃培养24小时。培养结束后，将培养液2ml移入加有20ml糖蜜培养基(糖蜜25％、硫酸铵0.28％)的粗试管里，于37℃下培养。在培养16小时和40小时后各取0.5ml培养液，测定培养液中的乙醇浓度。

结果如表3所示。

表3

培养时间	乙醇产量(％)
	乙醇产量(％)		YOY655株	YHK1243株
	16小时40小时	4.92^10.8^	YOY655株	YHK1243株	5.37^11.2^

^*可能有5％的人为误差

就象表3给出的那样，用YHK1243时比用YOY655株时在37℃下乙醇产量高。

本发明可以提供对发酵能力显示出低温敏感性的变异互补的蛋白质或基因，使该基因失活后得到的耐冷藏酵母，并可提供使用该酵母制造面包和乙醇的方法。

【序列表】序列号：1序列长度：8874序列类型：核酸链数：二条链拓扑型：直链序列种类：Genomic DNA起源生物名：啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)株名：X2180-1B序列特征表示特征的记号：CDS存在位置：1..8874确定特征的方法：E序列特征表示特征的记号：cleavage-site存在位置：1291..1296确定特征的方法：S序列特征表示特征的记号：cleavage-site存在位置：4388..4393确定特征的方法：S序列特征表示特征的记号：cleavage-site存在位置：5027..5032确定特征的方法：S序列特征表示特征的记号：cleavage-site存在位置：7675..7680确定特征的方法：S序列ATG GAA GCT ATT TCA CAA TTA CGT GGT GTT CCA TTG ACA CAC CAA AAG 48Met Glu Ala Ile Ser Gln Leu Arg Gly Val Pro Leu Thr His Gln Lys1 5 10 15GAC TTT AGC TGG GTC TTT TTA GTA GAT TGG ATT CTC ACG GTA GTA GTA 96Asp Phe Ser Trp Val Phe Leu Val Asp Trp Ile Leu Thr Val Val Val

20 25 30TGT TTG ACA ATG ATA TTC TAC ATG GGA AGA ATC TAT GCA TAC CTT GTA 144Cys Leu Thr Met Ile Phe Tyr Met Gly Arg Ile Tyr Ala Tyr Leu Val

35 40 45AGT TTT ATA TTA GAA TGG CTA CTA TGG AAA CGA GCG AAA ATC AAG ATA 192Ser Phe Ile Leu Glu Trp Leu Leu Trp Lys Arg Ala Lys Ile Lys Ile

50 55 60AAT GTT GAG ACA CTT CGT GTC TCC TTA CTA GGT GGT CGA ATA CAT TTT 240Asn Val Glu Thr Leu Arg Val Ser Leu Leu Gly Gly Arg Ile His Phe65 70 75 80AAA AAC CTT TCC GTA ATA CAC AAA GAT TAT ACA ATT TCG GTA TTA GAG 288Lys Asn Leu Ser Val Ile His Lys Asp Tyr Thr Ile Ser Val Leu Glu

85 90 95GGT AGT TTA ACA TGG AAA TAC TGG CTT TTA AAT TGC AGA AAA GCA GAA 336Gly Ser Leu Thr Trp Lys Tyr Trp Leu Leu Asn Cys Arg Lys Ala Glu

100 105 110TTG ATA GAG AAT AAC AAG TCT TCT TCT GGC AAA AAA GCA AAG CTT CCC 384Leu Ile Glu Asn Asn Lys Ser Ser Ser Gly Lys Lys Ala Lys Leu Pro

115 120 125TGT AAA ATT TCC GTA GAA TGT GAA GGT CTA GAA ATT TTT ATT TAC AAC 432Cys Lys Ile Ser Val Glu Cys Glu Gly Leu Glu Ile Phe Ile Tyr Asn

130 135 140AGA ACA GTG GCG TAC GAT AAT GTT ATA AAC TTA CTA TCA AAA GAT GAA 480Arg Thr Val Ala Tyr Asp Asn Val Ile Asn Leu Leu Ser Lys Asp Glu145 150 155 160CGC GAT AAA TTT GAA AAA TAC CTT AAT GAG CAT TCT TTT CCT GAA CCT 528Arg Asp Lys Phe Glu Lys Tyr Leu Asn Glu His Ser Phe Pro Glu Pro

165 170 175TTT AGC GAT GGA AGT AGT GCT GAT AAA TTA GAT GAA GAT CTA AGC GAA 576Phe Ser Asp Gly Ser Ser Ala Asp Lys Leu Asp Glu Asp Leu Ser Glu

180 185 190TCT GCA TAC ACA ACG AAC TCT GAT GCA TCA ATT GTT AAT GAC AGG GAC 624Ser Ala Tyr Thr Thr Asn Ser Asp Ala Ser Ile Val Asn Asp Arg Asp

195 200 205TAC CAA GAA ACA GAT ATC GGC AAA CAT CCA AAG CTA CTG ATG TTT TTA 672Tyr Gln Glu Thr Asp Ile Gly Lys His Pro Lys Leu Leu Met Phe Leu

210 215 220CCA ATT GAG CTT AAA TTT AGC CGC GGT TCC CTA CTG TTA GGA AAC AAA 720Pro Ile Glu Leu Lys Phe Ser Arg Gly Ser Leu Leu Leu Gly Asn Lys225 230 235 240TTC ACG CCA TCT GTT ATG ATT CTA AGT TAT GAA AGT GGA AAA GGC ATA 768Phe Thr Pro Ser Val Met Ile Leu Ser Tyr Glu Ser Gly Lys Gly Ile

245 250 255ATA GAT GTT TTA CCT CCA AAA GAG CGA TTA GAT TTA TAC AGA AAT AAA 816Ile Asp Val Leu Pro Pro Lys Glu Arg Leu Asp Leu Tyr Arg Asn Lys

260 265 270ACA CAG ATG GAA TTC AAA AAC TTC GTT ATT TCT ATC AAA CAA AAT ATT 864Thr Gln Met Glu Phe Lys Asn Phe Glu Ile Ser Ile Lys Gln Asn Ile

275 280 285GGT TAC GAT GAT GCT ATT GGA TTG AAG TTT AAA ATA GAT AGA GGG AAA 912Gly Tyr Asp Asp Ala Ile Gly Leu Lys Phe Lys Ile Asp Arg Gly Lys

290 295 300GTG TCA AAG TTA TGG AAA ACG TTT GTA CGA GTC TTT CAG ATA GTA ACC 960Val Ser Lys Leu Trp Lys Thr Phe Val Arg Val Phe Gln Ile Val Thr305 310 315 320AAG CCT GTT GTA CCG AAA AAG ACT AAA AAA AGC GCA GGC ACA TCA GAT 1008Lys Pro Val Val Pro Lys Lys Thr Lys Lys Ser Ala Gly Thr Ser Asp

325 330 335GAC AAT TTC TAT CAT AAA TGG AAA GGT TTA TCT CTT TAT AAG GCT TCT 1056Asp Asn Phe Tyr His Lys Trp Lys Gly Leu Ser Leu Tyr Lys Ala Ser

340 345 350GCG GGC GAC GCT AAA GCA AGT GAT TTA GAT GAT GTT GAG TTC GAT TTG 1104Ala Gly Asp Ala Lys Ala Ser Asp Leu Asp Asp Val Glu Phe Asp Leu

355 360 365ACG AAC CAT GAA TAT GCT AAA TTT ACA TCA ATT TTA AAA TGC CCA AAG 1152Thr Asn His Glu Tyr Ala Lys Phe Thr Ser Ile Leu Lys Cys Pro Lys

370 375 380GTC ACA ATT GCA TAT GAC GTG GAT GTT CCG GGC GTT GTG CCA CAT GGT 1200Val Thr Ile Ala Tyr Asp Val Asp Val Pro Gly Val Val Pro His Gly385 390 395 400GCA CAT CCG ACA ATA CCT GAT ATT GAT GGA CCA GAT GTG GGC AAT AAC 1248Ala His Pro Thr Ile Pro Asp Ile Asp Gly Pro Asp Val Gly Asn Asn

405 410 415GGA GCA CCT CCA GAT TTT GCT TTA GAT GTT CAA ATT CAC GGA GGA TCC 1296Gly Ala Pro Pro Asp Phe Ala Leu Asp Val Gln Ile His Gly Gly Ser

420 425 430ATC TGT TAC GGA CCT TGG GCT CAA AGA CAA GTC AGT CAT CTA CAA AGA 1344Ile Cys Tyr Gly Pro Trp Ala Gln Arg Gln Val Ser His Leu Gln Arg

435 440 445GTT CTA TCA CCG GTA GTT TCA AGG ACA GCC AAA CCT ATA AAA AAA CTC 1392Val Leu Ser Pro Val Val Ser Arg Thr Ala Lys Pro Ile Lys Lys Leu

450 455 460CCG CCA GGT TCT AGA AGA ATA TAT ACA CTT TTC AGG ATG AAT ATA TCA 1440Pro Pro Gly Ser Arg Arg Ile Tyr Thr Leu Phe Arg Met Asn Ile Ser465 470 475 480ATA ATG GAA GAT ACT ACT TGG CGT ATA CCG ACG AGG GAA AGT AGC AAA 1488Ile Met Glu Asp Thr Thr Trp Arg Ile Pro Thr Arg Glu Ser Ser Lys

485 490 495GAC CCC GAA TTT TTG AAA CAC TAC AAA GAA ACT AAT GAA GAA TAT AGG 1536Asp Pro Glu Phe Leu Lys His Tyr Lys Glu Thr Asn Glu Glu Tyr Arg

500 505 510CCA TTT GGA TGG ATG GAT CTC CGA TTT TGT AAG GAC ACC TAT GCA AAT 1584Pro Phe Gly Trp Met Asp Leu Arg Phe Cys Lys Asp Thr Tyr Ala Asn

515 520 525TTC AAT ATA AGT GTT TGT CCT ACA GTG CAA GGT TTT CAG AAT AAT TTC 1632Phe Asn Ile Ser Val Cys Pro Thr Val Gln Gly Phe Gln Asn Asn Phe

530 535 540CAT GTT CAT TTC CTG GAA ACC GAA ATT AGG TCA AGT GTT AAT CAC GAT 1680His Val His Phe Leu Glu Thr Glu Ile Arg Ser Ser Val Asn His Asp545 550 555 560ATT TTG TTA AAA AGC AAG GTA TTC GAT ATT GAT GGG GAT ATT GGA TAT 1728Ile Leu Leu Lys Ser Lys Val Phe Asp Ile Asp Gly Asp Ile Gly Tyr

565 570 575CCA TTG GGT TGG AAT AGC AAA GCT ATA TGG ATA ATT AAC ATG AAG TCA 1776Pro Leu Gly Trp Asn Ser Lys Ala Ile Trp Ile Ile Asn Met Lys Ser

580 585 590GAA CAA TTA GAG GCG TTT CTG CTA CGT GAG CAT ATA ACT TTA GTT GCA 1824Glu Gln Leu Glu Ala Phe Leu Leu Arg Glu His Ile Thr Leu Val Ala

595 600 605GAT ACG CTT TCA GAC TTT TCC GCT GGT GAT CCT ACG CCT TAC GAA CTT 1872Asp Thr Leu Ser Asp Phe Ser Ala Gly Asp Pro Thr Pro Tyr Glu Leu

610 615 620TTT AGA CCA TTC GTA TAC AAA GTC AAT TGG GAA ATG GAA GGA TAT TCC 1920Phe Arg Pro Phe Val Tyr Lys Val Asn Trp Glu Met Glu Gly Tyr Ser625 630 635 640ATT TAC TTA AAC GTC AAT GAT CAC AAT ATT GTT AAC AAT CCG TTA GAT 1968Ile Tyr Leu Asn Val Asn Asp His Asn Ile Val Asn Asn Pro Leu Asp

645 650 655TTT AAC GAA AAC TGT TAT TTA TCC CTT CAT GGT GAT AAG CTT TCA ATT 2016Phe Asn Glu Asn Cys Tyr Leu Ser Leu His Gly Asp Lys Leu Ser Ile

660 665 670GAT GTC ACG GTA CCC CGT GAG AGT ATT TTG GGG ACA TAC ACA GAT ATG 2064Asp Val Thr Val Pro Arg Glu Ser Ile Leu Gly Thr Tyr Thr Asp Met

675 680 685TCC TAC GAG ATC TCA ACT CCA ATG TTC AGA ATG ATG TTA AAT ACC CCC 2112Ser Tyr Glu Ile Ser Thr Pro Met Phe Arg Met Met Leu Asn Thr Pro

690 695 700CCT TGG AAT ACA TTG AAC GAA TTC ATG AAA CAT AAA GAA GTG GGG AGA 2160Pro Trp Asn Thr Leu Asn Glu Phe Met Lys His Lys Glu Val Gly Arg705 710 715 720GCA TAC GAC TTT ACA ATT AAA GGT TCT TAC CTT CTC TAT TCC GAG TTA 2208Ala Tyr Asp Phe Thr Ile Lys Gly Ser Tyr Leu Leu Tyr Ser Glu Leu

725 730 735GAT ATT GAT AAT GTC GAT ACG CTA GTC ATA GAG TGT AAC AGC AAG AGT 2256Asp Ile Asp Asn Val Asp Thr Leu Val Ile Glu Cys Asn Ser Lys Ser

740 745 750ACA GTA CTT CAC TGC TAT GGG TTT GTC ATG AGG TAT TTA ACA AAC GTA 2304Thr Val Leu His Cys Tyr Gly Phe Val Met Arg Tyr Leu Thr Asn Val

755 760 765AAG ATG AAT TAC TTC GGT GAA TTT TTT AAT TTT GTG ACG TCA GAA GAG 2352Lys Met Asn Tyr Phe Gly Glu Phe Phe Asn Phe Val Thr Ser Glu Glu

770 775 780TAC ACA GGT GTC CTT GGC GCT AGG GAA GTC GGA GAT GTC ACT ACG AAA 2400Tyr Thr Gly Val Leu Gly Ala Arg Glu Val Gly Asp Val Thr Thr Lys785 790 795 800AGC TCG GTG GCA GAT TTG GCA TCT ACT GTA GAT TCA GGG TAC CAA AAT 2448Ser Ser Val Ala Asp Leu Ala Ser Thr Val Asp Ser Gly Tyr Gln Asn

805 810 815AGC AGT CTA AAG AAC GAA TCT GAG GAT AAA GGT CCT ATG AAA AGG TCA 2496Ser Ser Leu Lys Asn Glu Ser Glu Asp Lys Gly Pro Met Lys Arg Ser

820 825 830GAT TTG AAA AGG ACT ACC AAC GAA ACT GAT ATT TGG TTC ACA TTT TCG 2544Asp Leu Lys Arg Thr Thr Asn Glu Thr Asp Ile Trp Phe Thr Phe Ser

835 840 845GTT TGG GAT GGT GCT CTG ATA TTA CCA GAA ACG ATT TAC AGT TTT GAT 2592Val Trp Asp Gly Ala Leu Ile Leu Pro Glu Thr Ile Tyr Ser Phe Asp

850 855 860CCA TGC ATT GCA CTA CAT TTT GCC GAA CTT GTA GTG GAT TTC AGA AGT 2640Pro Cys Ile Ala Leu His Phe Ala Glu Leu Val Val Asp Phe Arg Ser865 870 875 880TGT AAT TAT TAT ATG GAC ATA ATG GCG GTT CTC AAC GGG ACT TCA ATA 2688Cys Asn Tyr Tyr Met Asp Ile Met Ala Val Leu Asn Gly Thr Ser Ile

885 890 895AAG CGG CAC GTT TCA AAA CAA ATA AAT GAA GTA TTT GAT TTT ATA CGT 2736Lys Arg His Val Ser Lys Gln Ile Asn Glu Val Phe Asp Phe Ile Arg

900 905 910CGT AAT AAC GGA GCT GAT GAG CAA GAG CAC GGA TTG CTT TCG GAC CTC 2784Arg Asn Asn Gly Ala Asp Glu Gln Clu His Gly Leu Leu Ser Asp Leu

915 920 925ACC ATT CAT GGA CAT AGA ATG TAT GGA TTA CCA CCC ACA GAA CCT ACC 2832Thr Ile His Gly His Arg Met Tyr Gly Leu Pro Pro Thr Glu Pro Thr

930 935 940TAC TTT TGT CAA TGG CAT ATC AAT CTC GGA GAT TTA TGC ATT GAT TCA 2880Tyr Phe Cys Gln Trp Asp Ile Asn Leu Gly Asp Leu Cys Ile Asp Ser945 950 955 960GAT ATT GAA TTT ATA AAG GGA TTC TTT AAT TCC TTT TAT AAG ATA GGT 2928Asp Ile Glu Phe Ile Lys Gly Phe Phe Asn Ser Phe Tyr Lys Ile Gly

965 970 975TTT GGC TAC AAT GAC TTG GAA AAT ATA TTA TTA TAT GAC ACT GAG ACC 2976Phe Gly Tyr Asn Asp Leu Glu Asn Ile Leu Leu Tyr Asp Thr Glu Thr

980 985 990ATT AAT GAT ATG ACC TCG CTA ACC GTG CAC GTT GAA AAA ATA AGA ATA 3024Ile Asn Asp Met Thr Ser Leu Thr Val His Val Glu Lys Ile Arg Ile

995 1000 1005GGC CTT AAA GAT CCG GTG ATG AAA TCT CAA TCA GTT ATT AGT GCT GAA 3072Gly Leu Lys Asp Pro Val Met Lys Ser Gln Ser Val Ile Ser Ala Glu

1010 1015 1020TCG ATA TTG TTT ACT TTG ATC GAC TTT GAA AAC GAA AAA TAT TCA CAA 3120Ser Ile Leu Phe Thr Leu Ile Asp Phe Glu Asn Glu Lys Tyr Ser Gln1025 1030 1035 1040AGA ATA GAC GTG AAA ATT CCA AAA TTG ACA ATT TCG TTA AAT TGC GTG 3168Arg Ile Asp Val Lys Ile Pro Lys Leu Thr Ile Ser Leu Asn Cys Val

1045 1050 1055ATG GGC GAT GGC GTA GAC ACA TCA TTT CTC AAA TTC GAA ACA AAA TTA 3216Met Gly Asp Gly Val Asp Thr Ser Phe Leu Lys Phe Glu Thr Lys Leu

1060 l065 1070AGA TTT ACA AAC TTT GAG CAA TAC AAG GAT ATC GAT AAA AAA AGA TCA 3264Arg Phe Thr Asn Phe Glu Gln Tyr Lys Asp Ile Asp Lys Lys Arg Ser

1075 1080 1085GAA CAA CGC AGA TAT ATA ACA ATA CAC GAT TCA CCC TAT CAT AGG TGT 3312Glu Gln Arg Arg Tyr Ile Thr Ile His Asp Ser Pro Tyr His Arg Cys1090 1095 1100CCT TTT CTT CTT CCG CTG TTC TAT CAG GAT TCG GAT ACA TAC CAA AAC 3360Pro Phe Leu Leu Pro Leu Phe Tyr Gln Asp Ser Asp Thr Tyr Gln Asn1105 1110 1115 1120CTG TAC GGG GCT ATA GCA CCA TCT TCG TCT ATC CCA ACT TTA CCT CTT 3408Leu Tyr Gly Ala Ile Ala Pro Ser Ser Ser Ile Pro Thr Leu Pro Leu

1125 1130 1135CCC ACT TTG CCT GAT ACT ATA GAT TAT ATC ATT GAA GAT ATT GTG GGC 3456Pro Thr Leu Pro Asp Thr Ile Asp Tyr Ile Ile Glu Asp Ile Val Gly

1140 1145 1150GAG TAT GCT ACC CTT CTG GAG ACC ACA AAT CCA TTC AAG AAC ATA TTC 3504Glu Tyr Ala Thr Leu Leu Glu Thr Thr Asn Pro Phe Lys Asn Ile Phe

1155 1160 1165GCA GAA ACT CCA TCA ACT ATG GAG CCT TCA AGA GCC AGC TTC AGT GAA 3552Ala Glu Thr Pro Ser Thr Met Glu Pro Ser Arg Ala Ser Phe Ser Glu

1170 1175 1180GAT GAT AAT GAC GAA GAA GCG GAC CCT TCA AGC TTC AAA CCT GTC GCT 3600Asp Asp Asn Asp Glu Glu Ala Asp Pro Ser Ser Phe Lys Pro Val Ala1185 1190 1195 1200TTT ACA GAC GAC AGA AAC CAC GAA AGG GAT AAC TAT GTT GTT GAT GTT 3648Phe Thr Glu Asp Arg Asn His Glu Arg Asp Asn Tyr Val Val Asp Val

1205 1210 1215TCA TAT ATT CTG TTG GAT GTC GAC CCG TTG CTT TTT ATT TTC GCT AAG 3696Ser Tyr Ile Leu Leu Asp Val Asp Pro Leu Leu Phe Ile Phe Ala Lys

1220 1225 1230AGT TTA TTA GAA CAG CTT TAC TCT GAA AAC ATG GTA CAA GTC TTA GAC 3744Ser Leu Leu Glu Gln Leu Tyr Ser Glu Asn Met Val Gln Val Leu Asp

1235 1240 1245GAT ATT GAA ATT GGG ATT GTG AAA CGA TTA AGC CTT CTT CAA GAA GGG 3792Asp Ile Glu Ile Gly Ile Val Lys Arg Leu Ser Asn Leu Gln Glu Gly1250 1255 1260ATC ACT TCT ATT TCA AAC ATT GAT ATC CAT ATT GCT TAT CTA AAT TTA 3840Ile Thr Ser Ile Ser Asn Ile Asp Ile His Ile Ala Tyr Leu Asn Leu1265 1270 1275 1280ATC TGG CAA GAG ACA GGT GAG GAA GGT TTT GAG CTC TAT TTA GAT CGT 3888Ile Trp Gln Glu Thr Gly Glu Glu Gly Phe Glu Leu Tyr Leu Asp Arg

1285 1290 1295ATT GAT TAT CAA ATG AGT GAA AAG TCT CTA GAG AAG AAC CGA ACA AAT 3936Ile Asp Tyr Gln Met Ser Glu Lys Ser Leu Glu Lys Asn Arg Thr Asn

1300 1305 13l0AAA TTA TTA GAA GTA GCA GCT TTA GCA AAG GTA AAA ACT GTC AGA GTG 3984Lys Leu Leu Glu Val Ala Ala Leu Ala Lys Val Lys Thr Val Arg Val

1315 1320 1325ACT GTT AAC CAG AAG AAA AAT CCA GAC TTG TCT GAA GAT CGT CCC CCT 4032Thr Val Asn Gln Lys Lys Asn Pro Asp Leu Ser Glu Asp Arg Pro Pro

1330 1335 1340GCA CTG TCG CTA GGG ATT GAG GGT TTC GAA GTA TGG TCT TCT ACA GAA 4080Ala Leu Ser Leu Gly Ile Glu Gly Phe Glu Val Trp Ser Ser Thr Glu1345 1350 1355 1360GAT AGA CAA GTT AAC TCA TTA AAC TTA ACG TCA TCA GAT ATT ACC ATA 4128Asp Arg Gln Val Asn Ser Leu Asn Leu Thr Ser Ser Asp Ile Thr Ile

1365 1370 1375GAC GAA TCT CAA ATG GAA TGG CTG TTT GAG TAC TGT AGT GAC CAG GGA 4176Asp Glu Ser Gln Met Glu Trp Leu Phe Glu Tyr Cys Ser Asp Gln Gly

1380 1385 1390AAT CTT ATT CAA GAG GTT TGC ACT TCT TTT AAT TCT ATT CAG AAC ACC 4224Asn Leu Ile Gln Glu Val Cys Thr Ser Phe Asn Ser Ile Gln Asn Thr

1395 1400 1405AGA AGT AAT TCA AAG ACA GAA CTC ATT TCA AAG CTC ACA GCC GCA AGC 4272Arg Ser Asn Ser Lys Thr Glu Leu Ile Ser Lys Leu Thr Ala Ala Ser1410 1415 1420GAA TAT TAT CAA ATT AGT CAT GAT CCT TAC GTC ATA ACA AAA CCT GCT 4320Glu Tyr Tyr Gln Ile Ser His Asp Pro Tyr Val Ile Thr Lys Pro Ala1425 1430 1435 1440TTT ATT ATG AGA CTT TCC AAA GGG CAT GTG CGT GAG AAT CGT AGT TGG 4368Phe Ile Met Arg Leu Ser Lys Gly His Val Arg Glu Asn Arg Ser Trp

1445 1450 1455AAA ATT ATT ACG CGT CTG AGA CAC ATT TTA ACG TAC CTT CCT GAT GAT 4416Lys Ile Ile Thr Arg Leu Arg His Ile Leu Thr Tyr Leu Pro Asp Asp

1460 1465 1470TGG CAA AGC AAC ATC GAC GAA GTG CTA AAA GAA AAG AAA TAT ACC TCT 4464Trp Gln Ser Asn Ile Asp Glu Val Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Thr Ser

1475 1480 1485GCT AAA GAT GCA AAA AAT ATC TTC ATG TCT GTG TTT TCG ACT TGG AGA 4512Ala Lys Asp Ala Lys Asn Ile Phe Met Ser Val Phe Ser Thr Trp Arg1490 1495 1500AAT TGG GAG TTC TCA GAT GTT GCA AGG TCG TAT ATA TAC GGC AAA TTA 4560Asn Trp Glu Phe Ser Asp Val Ala Arg Ser Tyr Ile Tyr Gly Lys Leu1505 1510 1515 1520TTC ACG GCA GAA AAT GAG AAA CAT AAA CAA AAT TTG ATT AAA AAA TTG 4608Phe Thr Ala Glu Asn Glu Lys His Lys Gln Asn Leu Ile Lys Lys Leu

1525 1530 1535TTG AAG TGT ACC ATG GGA TCA TTT TAC CTT ACT GTT TAT GGT GAG GGA 4656Leu Lys Cys Thr Met Gly Ser Phe Tyr Leu Thr Val Tyr Gly Glu Gly

1540 1545 1550TAT GAG GTT GAG CAT AAT TTT GTT GTT GCG GAT GCC AAT CTG GTA GTG 4704Tyr Glu Val Glu His Asn Phe Val Val Ala Asp Ala Asn Leu Val Val

1555 1560 1565GAT TTG ACG CCT CCG GTG ACA AGC TTA CCT TCA AAT CGA GAA GAA ACT 4752Asp Leu Thr Pro Pro Val Thr Ser Leu Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr

1570 1575 1580ATT GAA ATT ACG GGA AGA GTA GGC TCA GTA AAA GGA AAA TTC AGT GAT 4800Ile Glu Ile Thr Gly Arg Val Gly Ser Val Lys Gly Lys Phe Ser Asp1585 1590 1595 1600AGG TTA CTT AAA TTG CAA GAT CTT ATT CCA CTC ATT GCA GCA GTG GGC 4848Arg Leu Leu Lys Leu Gln Asp Leu Ile Pro Leu Ile Ala Ala Val Gly

1605 1610 1615GAA GAT GAC AAA AGT GAT CCA AAA AAG GAG TTA TCA AAG CAA TTC AAA 4896Glu Asp Asp Lys Ser Asp Pro Lys Lys Glu Leu Ser Lys Gln Phe Lys

1620 1625 1630ATG AAC ACC GTT TTA TTA GTG GAT AAA AGT GAA CTG CAA CTG GTC ATG 4944Met Asn Thr Val Leu Leu Val Asp Lys Ser Glu Leu Gln Leu Val Met

1635 1640 1645GAC CAA ACG AAG CTG ATG AGT AGA ACA GTT GGG GGT AGA GTT AGT TTA 4992Asp Gln Thr Lys Leu Met Ser Arg Thr Val Gly Gly Arg Val Ser Leu

1650 1655 1660CTA TGG GAA AAT CTA AAA GAT TCA ACT AGT CAA GCG GGT TCA TTG GTT 5040Leu Trp Glu Asn Leu Lys Asp Ser Thr Ser Gln Ala Gly Ser Leu Val1665 1670 1675 1680ATA TTT TCC CAG AAA TCG GAA GTG TGG TTA AAA CAC ACA TCT GTC ATT 5088Ile Phe Ser Gln Lys Ser Glu Val Trp Leu Lys His Thr Ser Val Ile

1685 1690 1695TTG GGA GAA GCT CAA CTG CGC GAC TTT TCA GTT TTA GCG ACT ACT GAG 5136Leu Gly Glu Ala Gln Leu Arg Asp Phe Ser Val Leu Ala Thr Thr Glu

1700 1705 1710GCA TGG TCA CAC AAG CCT ACG ATT CTG ATA AAC AAC CAG TGC GCA GAT 5184Ala Trp Ser His Lys Pro Thr Ile Leu Ile Asn Asn Gln Cys Ala Asp

1715 1720 1725CTT CAT TTT AGA GCA ATG AGT TCA ACT GAG CAA TTA GTA ACC GCT ATT 5232Leu His Phe Arg Ala Met Ser Ser Thr Glu Gln Leu Val Thr Ala Ile

1730 1735 1740ACT GAA ATT AGG GAA AGT CTG ATG ATG ATT AAA GAG CGC ATA AAG TTT 5280Thr Glu Ile Arg Glu Ser Leu Met Met Ile Lys Glu Arg Ile Lys Phe1745 1750 1755 1760AAA CCT AAA TCA AAG AAA AAG TCC CAA TTT GTC GAC CAG AAA ATT AAT 5328Lys Pro Lys Ser Lys Lys Lys Ser Gln Phe Val Asp Gln Lys Ile Asn

1765 1770 1775ACA GTC TTG TCA TGT TAT TTT TCA AAC GTT AGT TCT GAA GTT ATG CCG 5376Thr Val Leu Ser Cys Tyr Phe Ser Asn Val Ser Ser Glu Val Met Pro

1780 1785 1790CTC TCG CCA TTT TAT ATT CGT CAC GAA GCC AAG CAG CTT GAT ATA TAT 5424Leu Ser Pro Phe Tyr Ile Arg His Glu Ala Lys Gln Leu Asp Ile Tyr

1795 1800 1805TTT AAC AAA TTC GGT TCA AAT GAG ATT TTG TTA AGC ATA TGG GAT ACT 5472Phe Asn Lys Phe Gly Ser Asn Glu Ile Leu Leu Ser Ile Trp Asp Thr

1810 1815 1820GAT TTT TTC ATG ACA TCG CAC CAG ACA AAG GAG CAA TAC CTA AGG TTT 5520Asp Phe Phe Met Thr Ser His Gln Thr Lys Glu Gln Tyr Leu Arg Phe1825 1830 1835 1840TCA TTT GGC GAT ATT GAA ATT AAA GGA GGA ATT TCT AGA GAA GGC TAT 5568Ser Phe Gly Asp Ile Glu Ile Lys Gly Gly Ile Ser Arg Glu Gly Tyr

1845 1850 1855TCG TTG ATA AAC GTT GAC ATC TCA ATA TCT ATG ATT AAG TTA ACC TTT 5616Ser Leu Ile Asn Val Asp Ile Ser Ile Ser Met Ile Lys Leu Thr Phe

1860 1865 1870TCG GAG CCG CGC CGT ATT GTA AAC AGT TTT TTA CAA GAT GAA AAG CTT 5664Ser Glu Pro Arg Arg Ile Val Asn Ser Phe Leu Gln Asp Glu Lys Leu

1875 1880 1885GCT TCT CAG GGT ATC AAT CTG TTA TAT TCC CTG AAG CCT TTA TTC TTT 5712Ala Ser Gln Gly Ile Asn Leu Leu Tyr Ser Leu Lys Pro Leu Phe Phe

1890 1895 1900AGT TCA AAT CTA CCA AAA AAA GAG AAG CAG GCA CCC TCG ATA ATG ATA 5760Ser Ser Asn Leu Pro Lys Lys Glu Lys Gln Ala Pro Ser Ile Met Ile1905 1910 1915 1920AAT TGG ACA TTA GAT ACT AGC ATT ACT TAT TTT GGT GTT CTT GTG CCA 5808Asn Trp Thr Leu Asp Thr Ser Ile Thr Tyr Phe Gly Val Leu Val Pro

1925 1930 1935GTG GCT TCC ACG TAT TTC GTG TTT GAA TTA CAT ATG CTG CTA CTT TCT 5856Val Ala Ser Thr Tyr Phe Val Phe Glu Leu His Met Leu Leu Leu Ser

1940 1945 1950CTG ACC AAT ACG AAT AAC GGT ATG TTA CCA GAA GAA ACC AAG GTG ACG 5904Leu Thr Asn Thr Asn Asn Gly Met Leu Pro Glu Glu Thr Lys Val Thr

1955 1960 1965GGA CAG TTT TCC ATC GAA AAC ATC CTA TTT CTA ATA AAG GAG CGG TCA 5952Gly Gln Phe Ser Ile Glu Asn Ile Leu Phe Leu Ile Lys Glu Arg Ser

1970 1975 1980CTA CCC ATT GGT CTT TCC AAA TTA CTC GAC TTT TCC ATA AAA GTA TCA 6000Leu Pro Ile Gly Leu Ser Lys Leu Leu Asp Phe Ser Ile Lys Val Ser1985 1990 1995 2000ACC CTA CAA AGA ACG GTT GAT ACG GAG CAG TCA TTC CAA GTG GAA AGT 6048Thr Leu Gln Arg Thr Val Asp Thr Glu Gln Ser Phe Gln Val Glu Ser

2005 2010 2015TCT CAT TTC AGG GTC TGC TTA TCT CCT GAT TCT CTA TTA AGA TTA ATG 6096Ser His Phe Arg Val Cys Leu Ser Pro Asp Ser Leu Leu Arg Leu Met

2020 2025 2030TGG GGC GCG CAT AAA TTG CTA GAC TTG AGC CAT TAC TAT TCA AGA CGC 6144Trp Gly Ala His Lys Leu Leu Asp Leu Ser His Tyr Tyr Ser Arg Arg

2035 2040 2045CAT GCC CCT AAT ATT TGG AAC ACT AAG ATG TTC ACC GGT AAA AGT GAT 6192His Ala Pro Asn Ile Trp Asn Thr Lys Met Phe Thr Gly Lys Ser Asp

2050 2055 2060AAG TCA AAA GAA ATG CCC ATA AAT TTC CGT TCA ATA CAC ATC CTG TCC 6240Lys Ser Lys Glu Met Pro Ile Asn Phe Arg Ser Ile His Ile Leu Ser2065 2070 2075 2080TAT AAA TTT TGT ATT GGG TGG ATA TTC CAG TAT GGA GCA GGC TCC AAT 6288Tyr Lys Phe Cys Ile Gly Trp Ile Phe Gln Tyr Gly Ala Gly Ser Asn

2085 2090 2095CCT GGG TTA ATG TTA GGT TAT AAC AGA TTG TTT TCA GCA TAT GAA AAG 6336Pro Gly Leu Met Leu Gly Tyr Asn Arg Leu Phe Ser Ala Tyr Glu Lys

2100 2105 2110GAT TTT GGG AAA TTC ACA GTT GTG GAC GCT TTT TTC TCT GTT GCG AAT 6384Asp Phe Gly Lys Phe Thr Val Val Asp Ala Phe Phe Ser Val Ala Asn

2115 2120 2125GGT AAT ACC TCA AGC ACT TTT TTC TCT GAA GGA AAC GAG AAA GAC AAA 6432Gly Asn Thr Ser Ser Thr Phe Phe Ser Glu Gly Asn Glu Lys Asp Lys

2130 2135 2140TAT AAT AGA AGT TTC TTG CCA AAC ATG CAA ATA TCC TAC TGG TTC AAA 6480Tyr Asn Arg Ser Phe Leu Pro Asn Met Gln Ile Ser Tyr Trp Phe Lys2145 2150 2155 2160AGA TGT GGT GAG TTG AAA GAT TGG TTT TTT AGA TTT CAT GGT GAA GCA 6528Arg Cys Gly Glu Leu Lys Asp Trp Phe Phe Arg Phe His Gly Glu Ala

2165 2170 2175CTG GAT GTA AAC TTT GTC CCG TCA TTC ATG GAT GTC ATT GAG TCT ACT 6576Leu Asp Val Asn Phe Val Pro Ser Phe Met Asp Val Ile Glu Ser Thr

2180 2185 2190TTA CAA TCC ATG CGA GCA TTT CAA GAG CTG AAA AAG AAC ATT CTG GAT 6624Leu Gln Ser Met Arg Ala Phe Gln Glu Leu Lys Lys Asn Ile Leu Asp

2195 2200 2205GTG TCC GAG AGT TTG CGT GCG GAA AAT GAT AAT TCT TAT GCT AGT ACC 6672Val Ser Glu Ser Leu Arg Ala Glu Asn Asp Asn Ser Tyr Ala Ser Thr

2210 2215 2220AGT GTC GAA AGT GCT TCG AGT AGT TTG GCT CCC TTT CTC GAT AAC ATT 6720Ser Val Glu Ser Ala Ser Ser Ser Leu Ala Pro Phe Leu Asp Asn Ile2225 2230 2235 2240AGA TCT GTT AAC TCA AAT TTC AAG TAT GAC GGT GGT GTA TTT AGG GTT 6768Arg Ser Val Asn Ser Asn Phe Lys Tyr Asp Gly Gly Val Phe Arg Val

2245 2250 2255TAC ACG TAC GAA GAT ATT GAA ACC AAG AGT GAG CCA TCT TTT GAA ATA 6816Tyr Thr Tyr Glu Asp Ile Glu Thr Lys Ser Glu Pro Ser Phe Glu Ile

2260 2265 2270AAA AGT CCA GTA GTC ACT ATA AAC TGT ACA TAT AAA CAT GAT GAA GAT 6864Lys Ser Pro Val Val Thr Ile Asn Cys Thr Tyr Lys His Asp Glu Asp

2275 2280 2285AAA GTT AAG CCA CAT AAA TTC AGA ACA TTA ATC ACT GTC GAC CCA ACG 6912Lys Val Lys Pro His Lys Phe Arg Thr Leu Ile Thr Val Asp Pro Thr

2290 2295 2300CAT AAT ACT TTG TAT GCG GGA TGT GCT CCT TTA TTA ATG GAA TTT TCT 6960His Asn Thr Leu Tyr Ala Gly Cys Ala Pro Leu Leu Met Glu Phe Ser2305 2310 2315 2320GAA AGT CTG CAA AAG ATG ATA AAG AAA CAT AGC ACC GAC GAA AAA CCA 7008Glu Ser Leu Gln Lys Met Ile Lys Lys His Ser Thr Asp Glu Lys Pro

2325 2330 2335AAC TTT ACA AAA CCT TCT TCA CAG AAT GTT GAT TAT AAG CGA CTT TTG 7056Asn Phe Thr Lys Pro Ser Ser Gln Asn Val Asp Tyr Lys Arg Leu Leu

2340 2345 2350GAT CAA TTT GAT GTG GCT GTA AAA CTA ACA TCA GCC AAG CAA CAG CTA 7104Asp Gln Phe Asp Val Ala Val Lys Leu Thr Ser Ala Lys Gln Gln Leu

2355 2360 2365AGT TTG AGC TGT GAA CCA AAA CCT AAG GTT CAG GCA GAT GTT GGA TTT 7152Ser Leu Ser Cys Glu Pro Lys Ala Lys Val Gln Ala Asp Val Gly Phe

2370 2375 2380GAA TCG TTT TTG TTC AGT ATG GCT ACC AAT GAG TTC GAC TCT GAA CAG 7200Glu Ser Phe Leu Phe Ser Met Ala Thr Asn Glu Phe Asp Ser Glu Gln2385 2390 2395 2400CCT TTG GAG TTT TCT TTA ACT CTA GAA CAC ACA AAA GCG TCC ATT AAG 7248Pro Leu Glu Phe Ser Leu Thr Leu Glu His Thr Lys Ala Ser Ile Lys

2405 2410 2415CAC ATA TTT TCA AGA GAA GTA AGT ACG TCC TTT GAA GTT GGT TTC ATG 7296His Ile Phe Ser Arg Glu Val Ser Thr Ser Phe Glu Val Gly Phe Met

2420 2425 2430GAC TTG ACG CTT TTA TTT ACA CAT CCT GAT GTA ATC AGT ATG TAT GGA 7344Asp Leu Thr Leu Leu Phe Thr His Pro Asp Val Ile Ser Met Tyr Gly

2435 2440 2445ACG GGG TTG GTT TCT GAT CTA AGC GTC TTC TTC AAT GTA AAG CAG CTC 7392Thr Gly Leu Val Ser Asp Leu Ser Val Phe Phe Asn Val Lys Gln Leu

2450 2455 2460CAG AAC CTG TAT TTA TTC TTG GAG ATA TGG AGG TTC AGT AGC ATT TTA 7440Gln Asn Leu Tyr Leu Phe Leu Asp Ile Trp Arg Phe Ser Ser Ile Leu2465 2470 2475 2480CAC ACA CGG CCA GTG CAA AGA ACT GTT AAT AAG GTT ATT GAA ATG AGT 7488His Thr Arg Pro Val Gln Arg Thr Val Asn Lys Glu Ile Glu Met Ser

2485 2490 2495TCA TTA ACA TCA ACC AAC TAT GCC GAT GCA GGT ACG GAA ATA CCC TGG 7536Ser Leu Thr Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ala Gly Thr Glu Ile Pro Trp

2500 2505 2510TGC TTT ACA TTA ATT TTT ACA AAT GTT AGC GGA GAC GTT GAT TTG GGT 7584Cys Phe Thr Leu Ile Phe Thr Asn Val Ser Gly Asp Val Asp Leu Gly

2515 2520 2525CCT TCT CTC GGT ATG ATT TCA TTA AGG ACA CAA AGA ACA TGG CTG GCC 7632Pro Ser Leu Gly Met Ile Ser Leu Arg Thr Gln Arg Thr Trp Leu Ala2530 2535 2540ACA GAT CAT TAT AAC GAG AAG CGG CAG TTA CTG CAT GCT TTC ACT GAC 7680Thr Asp His Tyr Asn Glu Lys Arg Gln Leu Leu His Ala Phe Thr Asp2545 2550 2555 2560GGT ATT AGC TTG ACA TCA GAA GGT AGA CTG AGT GGT TTA TTT GAA GTT 7728Gly Ile Ser Leu Thr Ser Glu Gly Arg Leu Ser Gly Leu Phe Glu Val

2565 2570 2575GCG AAT GCA AGT TGG TTA TCA GAA GTA AAA TGG CCA CCT GAA AAA AGC 7776Ala Asn Ala Ser Trp Leu Ser Glu Val Lys Trp Pro Pro Glu Lys Ser

2580 2585 2590AAA AAT ACT CAT CCA TTA GTT TCC ACC TCC CTG AAT ATT GAT GAT ATA 7824Lys Asn Thr His Pro Leu Val Ser Thr Ser Leu Asn Ile Asp Asp Ile

2595 2600 2605GCG GTA AAG GCT GCT TTT GAT TAT CAT ATG TTC TTA ATC GGC ACT ATA 7872Ala Val Lys Ala Ala Phe Asp Tyr His Met Phe Leu Ile Gly Thr Ile

2610 2615 2620AGT AAC ATA CAC TTC CAT CTT CAT AAT GAA AAG GAT GCC AAG GGG GTT 7920Ser Asn Ile His Phe His Leu His Asn Glu Lys Asp Ala Lys Gly Val2625 2630 2635 2640CTA CCT GAT TTG CTG CAG GTC TCT TTT TCA TCA GAT GAA ATT ATC CTC 7968Leu Pro Asp Leu Leu Gln Val Ser Phe Ser Ser Asp Glu Ile Ile Leu

2645 2650 2655AGC TCT ACT GCA TTA GTT GTA GCA AAT ATA CTG GAT ATC TAC AAC ACC 8016Ser Ser Thr Ala Leu Val Val Ala Asn Ile Leu Asp Ile Tyr Asn Thr

2660 2665 2670ATT GTA CGT ATG AGG CAG GAT AAT AAA ATA TCG TAT ATG GAG ACG TTG 8064Ile Val Arg Met Arg Gln Asp Asn Lys Ile Ser Tyr Met Glu Thr Leu

2675 2680 2685AGA GAT TCC AAT CCT GGT GAA TCT AGG CAA CCA ATA TTA TAC AAA GAC 8112Arg Asp Ser Asn Pro Gly Glu Ser Arg Gln Pro Ile Leu Tyr Lys Asp

2690 2695 2700ATT TTA AGA TCG CTG AAA TTA CTC AGA ACT GAT CTC TCG GTG AAT ATC 8160Ile Leu Arg Ser Leu Lys Leu Leu Arg Thr Asp Leu Ser Val Asn Ile2705 2710 2715 2720TCC TCT TCA AAG GTC CAG ATT TCG CCA ATA TCT TTA TTC GAT GTG GAA 8208Ser Ser Ser Lys Val Gln Ile Ser Pro Ile Ser Leu Phe Asp Val Glu

2725 2730 2735GTG TTA GTA ATA AGA ATT GAC AAA GTC TCT ATA CGT TCC GAA ACA CAT 8256Val Leu Val Ile Arg Ile Asp Lys Val Ser Ile Arg Ser Glu Thr His

2740 2745 2750TCG GGG AAA AAA TTA AAG ACA GAT TTG CAA CTA CAA GTT TTA GAT GTT 8304Ser Gly Lys Lys Leu Lys Thr Asp Leu Gln Leu Gln Val Leu Asp Val

2755 2760 2765TCT GCA GCG CTT TCT ACT TCC AAA GAA GAA TTA GAT GAG GAA GTT GGA 8352Ser Ala Ala Leu Ser Thr Ser Lys Glu Glu Leu Asp Glu Glu Val Gly

2770 2775 2780GCT TCC ATT GCT ATT GAT GAT TAC ATG CAT TAT GCT TCC AAG ATT GTC 8400Ala Ser Ile Ala Ile Asp Asp Tyr Met His Tyr Ala Ser Lys Ile Val2785 2790 2795 2800GGT GGT ACT ATC ATT GAT ATT CCA AAA CTT GCT GTT CAT ATG ACA ACT 8448Gly Gly Thr Ile Ile Asp Ile Pro Lys Leu Ala Val His Met Thr Thr

2805 2810 2815TTA CAA GAA GAA AAG ACA AAT AAT TTA GAA TAT CTA TTT GCT TGC TCT 8496Leu Gln Glu Glu Lys Thr Asn Asn Leu Glu Tyr Leu Phe Ala Cys Ser

2820 2825 2830TTT TCA GAC AAA ATA TCT GTA AGG TGG AAT CTA GGG CCT GTA GAC TTC 8544Phe Ser Asp Lys Ile Ser Val Arg Trp Asn Leu Gly Pro Val Asp Phe

2835 2840 2845ATA AAG GAA ATG TGG ACT ACA CAT GTC AAA GCA CTG GCA GTT CGT CGA 8592Ile Lys Glu Met Trp Thr Thr His Val Lys Ala Leu Ala Val Arg Arg

2850 2855 2860TCC CAG GTA GCA AAT ATT TCC TTT GGA CAA ACT GAG GAA GAA CTT GAA 8640Ser Gln Val Ala Asn Ile Ser Phe Gly Gln Thr Glu Glu Glu Leu Glu2865 2870 2875 2880GAA TCA ATT AAA AAG GAA GAA GCC GCT TCA AAG TTT AAT TAT ATT GCA 8688Glu Ser Ile Lys Lys Glu Glu Ala Ala Ser Lys Phe Asn Tyr Ile Ala

2885 2890 2895CTA GAA GAA CCG CAG ATC GAA GTG CCT CAG ATA AGA GAT CTG GGA GAC 8736Leu Glu Glu Pro Gln Ile Glu Val Pro Gln Ile Arg Asp Leu Gly Asp

2900 2905 2910GCC ACT CCA CCT ATG GAA TGG TTT GGT GTC AAT AGA AAA AAA TTT CCG 8784Ala Thr Pro Pro Met Glu Trp Phe Gly Val Asn Arg Lys Lys Phe Pro

2915 2920 2925AAA TTC ACT CAC CAA ACC GCA GTT ATC CCC GTC CAA AAG CTT GTT TAT 8832Lys Phe Thr His Gln Thr Ala Val Ile Pro Val Gln Lys Leu Val Tyr

2930 2935 2940CTT GCA GAA AAG CAG TAT GTC AAG ATA CTA GAT GAT ACG CAT 8874Leu Ala Glu Lys Gln Tyr Val Lys Ile Leu Asp Asp Thr His2945 2950 2955

Claims

1.一种编码由序列号1给出的氨基酸序列组成的蛋白质、或者编码由在序列号1给出的氨基酸序列中添加、缺失或替换1个或数个氨基酸后的氨基酸序列组成的、而且对发酵能力显示出低温敏感性的变异互补的蛋白质的基因。

2.一种由序列号1给出的碱基序列组成的DNA、或是由在序列号1给出的氨基酸序列中添加、缺失或替换1个或数个DNA、而且对发酵能力显示出低温敏感性的变异互补的DNA组成的基因。

3.一种由序列号1给出的氨基酸序列组成的蛋白质、或是由在序列号1给出的氨基酸序列中添加、缺失、或替换1个或数个氨基酸后的氨基酸序列组成的、而且对发酵能力显示出低温敏感性的变异互补的蛋白质。

4.属于酵母属的发酵能力显示出低温敏感性的酵母，其特征是包含在染色体中的权利要求1或2记载的基因被失活。

5.权利要求4记载的酵母，属于啤酒酵母。

6.权利要求4或5记载的酵母，其特征是序列号1给出的碱基序列的4388～7885基因被破坏。

7.作为FERM BP-5327保藏的啤酒酵母YHK1243株。

8.含有权利要求4记载的酵母的生面团。

9.权利要求4记载的酵母在面包制作中的应用。

10.权利要求4记载的酵母在制造乙醇中的应用。