CN1247230A

CN1247230A - 醋酸杆菌的木糖醇脱氢酶及其基因

Info

Publication number: CN1247230A
Application number: CN99119628A
Authority: CN
Inventors: 杉山雅一; 外内尚人; 铃木俊一; 横关健三
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1998-07-30
Filing date: 1999-07-30
Publication date: 2000-03-15
Also published as: EP0976827A1; KR20000012078A; EP0976827B1; PE20001023A1; US20010034049A1; US20030077797A1; DE69912893D1; BR9903253A; US6242228B1; US6924131B2

Abstract

通过木糖醇脱氢酶或被导入编码木糖醇脱氢酶的DNA的细胞产生木糖醇,木糖醇脱氢酶是一种作用于D－木酮糖的(A)或(B)蛋白质,并收集产生的木糖醇:(A)具有序列表中SEQIDNO:4氨基酸序列的蛋白质;(B)具有序列表中SEQIDNO:4氨基酸序列,其中有一个或几个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加或倒位,且有木糖醇脱氢酶活性的蛋白质。

Description

醋酸杆菌的木糖醇脱氢酶及其基因

本发明涉及醋酸杆菌的一种新的木糖醇脱氢酶、编码此酶的基因以及生产木糖醇脱氢酶和木糖醇的方法。木糖醇在食品工业、医药工业等领域是很有用的。

木糖醇是一种天然糖醇，因为其含有较低的热量却具有与蔗糖相当的甜度，所以是一种有广阔应用前景的低热量甜料。此外，因为有抗龋齿的特性，其可以作为一种预防龋齿的甜料。另外，因为木醇糖并不升高葡萄糖的水平，因此被利用于糖尿病的流体疗法。由于这些原因，可以预计将来木糖醇的需求会增加。

目前木糖醇的工业化生产主要利用如美国专利4008285中公开的方法即D-木糖的脱氢来进行。D-木糖作为原料通常由植物材料如树木、稻草、玉米穗轴、燕麦壳和其它富含木聚糖的材料的水解作用而获得。

然而，这种由植物材料水解而获得的D-木糖因为成本高所以有价格较高的缺点。例如，植物材料水解处理的低产率导致了D-木糖醇的低纯度。因此，水解处理后必须通过离子交换除去用于水解的酸和染料，并且合成的D-木糖必须进一步的结晶以除去其它的半纤维素糖类。为了获得适于作为食品的D-木糖，还要求进一步的纯化。这些离子交换处理和结晶处理导致了生产成本的增加。

因此，人们改进一些生产木糖醇的方法，利用易得到的原料并只产生了很小的浪费。例如，一些改进的方法利用其它的戊糖醇作为初始原料。其中一种易得到的戊糖醇是D-阿拉伯糖醇，并且D-阿拉伯糖醇可由酵母产生(加拿大微生物学杂志，31.，1985，467-471；和普通微生物学杂志，139，1993，1047-54)。

因而，一些利用D-阿拉伯糖醇为原料生产木糖醇的方法得到了发展。在应用微生物学，18，1969，1031-1035，上报道了一种方法，其中D-阿拉伯糖醇是由葡萄糖通过汉逊氏德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii)ATCC 20121菌株发酵获得，然后利用弱氧化醋杆菌(Acetobacter suboxydans)转化为D-木糖，再在季也蒙氏假丝酵母(Candida guilliermondii)var.soya的作用下将D-木糖转化为木糖醇。

EP 403 392A和EP 421 882A公开的方法通过利用耐渗透压的酵母发酵产生D-阿拉伯糖醇，然后利用醋酸杆菌属、葡糖杆菌或克雷白氏杆菌属的杆菌将D-阿拉伯糖醇转化为D-木酮糖，通过葡萄糖(木糖)异构酶的作用由D-木酮糖形成木糖和D-木酮糖的混合物，再通过氢化作用将木糖和D-木酮糖的混合物转化为D-木糖醇。同时，也公开了木糖醇的产生包括木糖和D-木酮糖的混合物中的木糖的预浓缩以及通过氢化作用将浓缩的木糖转化为木糖醇。

尽管上述利用D-阿拉伯糖醇作为原材料产生木糖醇的方法有比较高的产量，然而，存在着一个缺点即要求多个反应步骤，因此生产过程变得复杂。所以，在经济上是不可能被接受的。

另一方面，人们试图通过基因操作技术来繁殖木糖醇发酵微生物。国际公开的WO94/10325公开了使用重组微生物由葡萄糖发酵产生木糖醇的方法，所述重组微生物是通过将来自克雷白氏杆菌属杆菌的阿拉伯糖醇脱氢酶基因和来自毕赤氏酵母(Pichia)属杆菌的木糖醇脱氢酶基因导入阿拉伯糖醇发酵微生物(属于念珠菌属、球拟酵母属或接合糖酵母属的酵母)而获得的。

然而，上面所述的通过基因操作技术来繁殖木糖醇发酵微生物作为一种实用方法是不完善的。

另外，木糖醇脱氢酶是一种催化由木糖生成木糖醇反应的酶，已知其存在于各种微生物中。例如，酵母具柄毕赤氏酵母(Pichia stipiti)(发酵生物工程杂志，67.25(1989))，Pachysolen tannophilus(发酵技术杂志，64.219(1986))，休哈塔假丝酵母(应用生物化学生物技术，26.197(1990))，近平滑假丝酵母(生物技术生物工程，58，440(1998))，汉逊氏德巴利氏酵母(应用生物化学生物技术，56，79(1996))和出芽茁霉(Pullularia pullulans)(An.Acad.Brasil.Cienc.，53，183(1981))，丝状杆菌如黑色曲霉(微生物学，140，1679(1994))和粗糙链孢霉(FEMS Microbiol.lett.，146，79(1997))，藻类如Galdieria sulphuraria(植物，202，487(1997))，细菌如Morgannelamorganii(细菌学杂志，162，845(1985))，等等。

关于木糖醇脱氢酶基因，已有具柄毕赤氏酵母(FEBS Lett，324，9(1993))和Morgannela morganii(DDBJ/GenBank/EMBL登记号L34345)的该基因核苷酸序列的报道。

然而，迄今为止人们对于来自醋酸杆菌的木糖醇脱氢酶及其基因甚而其存在一无所知。

本发明的目的是提供一种与有较强木糖醇生产能力微生物的木糖醇生物合成有关的酶，及其基因，并且利用这些酶和基因以期建立一种技术用于有效地生产木糖醇或木糖醇发酵菌的繁殖。

为了达到上述目的，发明人寻找到一些有将D-阿拉伯醇直接转化为木糖醇能力的微生物。结果，发现葡糖杆菌属或醋酸杆菌属的细菌有这种能力。此外，成功地纯化了两种得自氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)的木糖醇脱氢酶，并且成功地分离出编码这些酶和决定其结构的基因。因而，本发明已经完成。

即本发明提供了：

(1)在如下(A)或(B)中定义的蛋白质：

(A)具有序列表中SEQ ID NO：4氨基酸序列的蛋白质；

(B)具有序列表中SEQ ID NO：4氨基酸序列，其中有一个或几个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加或倒位，且具有木糖醇脱氢酶活性的蛋白质；

和

(2)在如下(C)或(D)中定义的蛋白质：

(C)具有序列表中SEQ ID NO：6氨基酸序列的蛋白质；

(D)具有序列表中SEQ ID NO：6氨基酸序列，其中有一个或几个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加或倒位，且具有木糖醇脱氢酶活性的蛋白质。

本发明也提供了：

(3)编码在(A)或(B)中定义的蛋白质的DNA；

(A)具有序列表中SEQ ID NO：4氨基酸序列的蛋白质；

(4)编码(C)或(D)中定义的蛋白质的DNA：

(C)具有序列表中SEQ ID NO：6氨基酸序列的蛋白质；

(D)具有序列表中SEQ ID NO：6氨基酸序列，其中有一个或几个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加或倒位，且具有木糖醇脱氢酶活性的蛋白质；

(5)上述(3)中的DNA，其定义于如下(a)或(b)：

(a)至少含有一段对应于序列表中SEQ ID NO：3第25到1053位的核苷酸序列的DNA；

(b)在严紧条件下可与具有对应于序列表中SEQ ID NO：3第25到1053位的核苷酸序列的DNA或由此段核苷酸制备的探针进行杂交，并且能编码有木糖醇脱氢酶活性的蛋白质的DNA；

(6)上述(5)中的DNA，严紧条件是在60℃下，盐浓度相当于1x SSC和0.1％SDS时进行洗涤。

(7)上述(4)中的DNA，其定义于如下(c)或(d)：

(c)至少含有一段对应于序列表中SEQ ID NO：5第1063到1848位的核苷酸序列的DNA；

(d)在严紧条件下可与具有对应于序列表中SEQ ID NO：5第1063到1848位的核苷酸序列的DNA或由此段核苷酸制备的探针进行杂交，并且能编码有木糖醇脱氢酶活性的蛋白质的DNA；和

(8)上述(4)中的DNA，严紧条件是在60℃下，盐浓度相当于1x SSC和0.1％SDS时进行洗涤。

本发明还提供了：

(9)以由上述(3)至(8)中任一DNA编码的木糖醇脱氢酶可被表达的方式被导入所述DNA的细胞。

本发明进一步提供了：

(10)生产木糖醇脱氢酶的方法，其中包括在培养基中培养上述(9)的细胞以便木糖醇脱氢酶可以在培养基中产生和积累，并且从培养基中收集木糖醇脱氢酶。

本发明更进一步提供了：

(11)生产木糖醇的方法，其中包括用上述(1)或(2)的木糖醇脱氢酶作用于D-木酮糖，并收集产生的木糖醇；和

(12)生产木糖醇的方法，其中包括用上述(9)的细胞作用于D-木酮糖，并收集产生的木糖醇。

尽管本发明的木糖醇脱氢酶有催化还原D-木酮糖产生木糖醇和催化氧化木糖醇产生D-木酮糖的活性，“有木糖醇脱氢酶活性”在这里是指至少有催化由D-木酮糖产生木糖醇的反应的活性。

依照本发明，提供了新的木糖醇脱氢酶和编码此酶的DNA，并且木糖醇脱氢酶可以通过使用该DNA来产生。

此外，木糖醇可以通过使用被导入木糖醇脱氢酶或编码此酶的DNA的细胞来产生。

而且，本发明的DNA可用于繁殖生产木糖醇的微生物。

附图1是纯化XDH的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱；a)SDS-PAGE凝胶电泳后CBB染色，b)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后CBB染色，和c)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后活性染色。

附图2是描绘XDH2酶活对pH依赖性图谱。

本发明将在下文进行具体地说明。<1>本发明的木糖醇脱氢酶

本发明的木糖醇脱氢酶是一类由氧化葡糖杆菌产生的酶。已经发现了两种这样的酶，一种称为XDH1，另一种是XDH2。XDH1有SEQ ID NO：4的氨基酸序列，XDH2在序列表中有SEQ ID NO：6的氨基酸序列。通过SDS-PAGE凝胶电泳测得XDH1和XDH2的分子量分别为大约36000到40000，和大约27000到30000。这两种木糖醇脱氢酶，XDH1和/或XDH2，在下边可被统称为“XDH”。

正如在后面实施例5所涉及的，还原反应中(由D-木酮糖产生木糖醇的反应)的XDH2的最适pH为5左右。已知木糖醇脱氢酶，例如得自黑色曲霉的木糖醇脱氢酶的还原反应，其最适pH严格地为6.5(Cor F.B.Witteveen，et al，微生物学，140，1679-1685，1994)，因此与本发明得自葡糖杆菌属杆菌的XDH2在最适反应pH上有明显的不同。

关于产生本发明的XDH的方法及分离和纯化由氧化葡糖杆菌产生的XDH的方法的实施例将在下面说明。

首先，用如超声波处理的机械方法或使用细胞壁消化酶等的酶方法对氧化葡糖杆菌例如ATCC621菌株的细胞进行破裂，然后通过离心或类似方法除去不溶解成分以制备细胞提取物。

可通过常规的例如阴离子交换层析、亲和层析、疏水层析、凝胶过滤层析等蛋白质纯化方法的联合来分级分离如上述所获得的细胞提取物以纯化XDH。

作为阴离子交换层析的载体，可使用Q-琼脂糖凝胶FF(Pharmacia生产)，Mono-Q(Pharmacia生产)等。含有XDH的提取物流过充满此载体的柱以便酶被吸附到柱上，并且洗涤柱后，酶被高盐浓度的缓冲液洗脱。在这种情况下，盐浓度可以逐步增加，或应用一个浓度梯度。例如，当使用Q-琼脂糖凝胶FF时，可用200到350mM KCl洗脱被吸附到柱上的XDH。当使用Mono-Q时，可用150到250mMKCl洗脱。

作为亲和层析的载体，可使用HiTrap Blue(Pharmacia生产)。本发明的XDH是利用NAD或NADH作为辅酶，因此对这些物质有亲和力。被吸附到载体上的XDH可用含有大约5mM的NAD的缓冲液洗脱。

作为疏水层析的载体，可使用苯基琼脂糖HP(Pharmacia生产)，吸附到低盐浓度载体上的XDH可用200到300mM硫酸铵洗脱。

按上述纯化的XDH可通过凝胶过滤层析、SDS-PAGE凝胶电泳等方法进一步纯化并分离为XDH1和XDH2。作为凝胶过滤层析的载体，可使用交联葡聚糖200HP(Pharmacia生产)。

在上面所述的纯化步骤中，级分中是否含有XDH可以通过用例如在后面实施例中所述的方法测量级分的XDH活性来证实。

如上所述已纯化的XDH1和XDH2的N-端氨基酸序列分别示于序列表的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

尽管本发明的XDH可以如上所述通过分离和纯化从氧化葡糖杆菌的细胞获得，也可以通过将后面所述的编码XDH的DNA导入合适的宿主从而使DNA得以表达再通过用常规方法发酵获得异源的蛋白质。

下面所述的不同的基因重组技术描述在“分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)”。

作为用于获得XDH基因表达的宿主，可使用多种原核细胞，包括埃希氏杆菌如大肠杆菌，葡糖杆菌如氧化葡糖杆菌，和枯草芽胞杆菌，多种真核细胞如酿酒酵母，具柄毕赤氏酵母和米曲霉。

用于将XDH基因导入宿主的重组DNA可通过将编码XDH的DNA插入视宿主种类而定的载体中来获得，在宿主中用这种方式可表达由DNA编码的XDH。如果XDH基因的特定启动子在宿主细胞中具有活性时，此启动子可用作XDH基因表达的启动子。此外，如果需要，另外一个在宿主细胞中有活性的启动子可和编码XDH的DNA连结在一起，在该启动子的控制下获得表达。当埃希氏杆菌属作为宿主时，可使用lac启动子，trp启动子，trc启动子，tac启动子，P_R启动子，λ噬菌体的P_L启动子等。作为埃希氏杆菌的载体，pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pMW219，pMW218等也可以被使用。噬菌体DNA载体也可以使用。此外，含有启动子且能表达插入DNA序列的表达载体也可被使用。

根据例如D.A.Morrison的方法(酶学方法，68，326(1979))或其中受体细胞用氯化钙处理以增加DNA的透过性(Mandel，M.and Higa，A.，分子生物学杂志，53，159(1970))的方法，通过导入质粒大肠杆菌可以被转化。<2>编码XDH的DNA

通过PCR(聚合酶链反应，见White，T.J.et.al；Trends Genet.，5，185(1989))或杂交可以从氧化葡糖杆菌的cDNA文库或染色体DNA文库获得编码XDH的DNA。用于PCR反应引物的设计基于所测定的纯化的XDH1和XDH2氨基端的氨基酸序列。此外，由于本发明已阐明XDH1基因(SEQ ID NO：3)和XDH2基因(SEQ ID NO：5)的核苷酸序列，所以引物或用于杂交的探针可以以这些核苷酸序列为基础来设计。通过使用含与5’非翻译区和3’非翻译区相对应之序列的引物用于PCR，XDH编码区的全长序列可以被扩增。

具体地，对于XDH2而言，含有SEQ ID NO：5中第1063位核苷酸上游区域之核苷酸序列的引物可用作5’引物，含有第1851位核苷酸下游区域之核苷酸序列的引物可以用作3’引物。至于XDH1，含有SEQ ID NO：3中第25位核苷酸上游区域之核苷酸序列的引物可以用作5’引物。

引物的合成可通过常用的方法，例如磷酰胺化方法(见Tetrahedron Letters，22，1859(1981))，使用商购的DNA合成仪来进行(例如，380B型DNA合成仪，由Appied Biosystems生产)。此外，按照供应商指定的方法，使用例如，PERKIN ELMER生产的Gene Amp PCR系统和TaKaRa LA PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.提供)可进行PCR。

本发明的DNA可编码包括一个或几个氨基酸在一个或多个位置发生替换、缺失、插入、增加、倒位的XDH1或XDH2，只要所编码的XDH1或XDH2将D-木酮糖转化为木糖醇的活性不变即可。尽管“几个”氨基酸的数目的不同取决于蛋白质的三维结构中的氨基酸残基的位置和类型，其可为2到100，优选为2到50，更优选为2到10。

例如，通过XDH1基因或XDH2基因的核苷酸序列的修饰，例如，通过定点诱变法以使基因特定位点处的一个或多个氨基酸残基发生替换、缺失、插入、增加或倒位，即可获得编码与上述XDH1或XDH2基本上相同的蛋白质的DNA。上述的DNA修饰可通过已知的常规突变处理来得到。突变处理包括在体外用例如羟胺，处理编码XDH的DNA的方法，和用紫外线照射或用通常用于突变处理的突变剂如N-甲基N`-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸处理微生物的方法，所述微生物如埃希氏杆菌属携有编码XDH的DNA的细菌。

上述核苷酸的替换、缺失、插入、增加、倒位也包括自然发生的突变(突变体或变体)，例如，微生物的菌株、种或属的差异。

通过在适当的细胞中表达上述具有突变的DNA并目检测表达产物的XDH1或XDH2的活性可获得编码与XDH1或XDH2基本上相同的蛋白质的DNA。也可以通过从编码具有突变的XDH1或XDH2的DNA中或从携有所述DNA的细胞中分离DNA来获得编码与XDH1或XDH2基本上相同的蛋白质的DNA，所述DNA可在严紧条件下与例如含有SEQ ID NO：3的第25到1053位核苷酸序列的DNA或由此DNA制备的探针杂交，或与含有SEQ IDNO：5的第1063到1848位核苷酸序列的DNA或由此DNA制备的探针杂交，并且该DNA编码有XDH1或XDH2活性的蛋白质。这里所述的“严紧条件”是指在此条件下形成所谓的特异性杂合体，而不形成非特异性杂合体。使用任何数值都难以清楚地表述这种条件。然而，例如，严紧条件包括这样一种条件，在此条件下，DNA有很高的同源性，例如，至少有50％同源性的DNA会相互杂交，DNA同源性低于上述值彼此则不杂交。可选择地，严紧条件例示于这样一种条件，在此条件下，DNA之间的杂交在与Southern杂交的一般洗涤条件一致的盐浓度下进行，即60℃，1x SSC，0.1％SDS，优选为0.1x SSC，0.1％SDS。

在上述条件下可杂交的基因，包括那些有终止密码子产生的基因，和那些由于活性中心的突变而无活性的基因。然而，通过将基因与可商购的活性表达载体连接，根据下面阐述的方法测定XDH1或XDH2活性，可很容易地去除这些突变基因。

本发明中编码XDH的DNA除可用于上述XDH的生产方法和下述木糖醇的生产方法之外，还可用于生产木糖醇之微生物的繁殖。例如，通过增强具有将D-阿拉伯糖转化为木糖醇的能力的如葡糖杆菌的微生物中的XDH基因，微生物将D-阿拉伯糖转化为木糖醇的能力可得到提高。

<3>.生产木糖醇的方法

通过将本发明的XDH或导入一段编码XDH的DNA并表达XDH的细胞作用于D-木酮糖，并且收集产生的木糖醇，可以生产木糖醇。

XDH可以是提取自葡糖杆菌属的酶，或利用可编码XDH的DNA通过基因重组技术来生产的酶。此外，XDH可以是XDH1或XDH2，且可以是它们任意比例的混合物。

由D-木酮糖生产木糖醇的反应在20-60℃，更优选在30-40℃，且pH为4-10，更优选pH为4-8下进行时通常会得到理想的结果。至于反应，静置培养或摇床培养均可以采用。反应时间可以根据所用XDH的浓度、细胞的数量、底物浓度进行变化，较理想地为1-100小时。

从完成反应的混合物中收集和分离产生的木糖醇，包括使用合成的吸附剂、沉淀剂等的任何常规的方法均可使用。

本发明将引用以下的实施例进一步明确地阐述。然而，本发明并不局限于实施例的描述。

实施例1：通过氧化葡糖杆菌产生XDH和XDH的纯化

<1>氧化葡糖杆菌ATCC621的培养

培养氧化葡糖杆菌ATCC621菌株以获得有足够XDH活性的细胞。30℃下，以PD培养基作为肉汤培养基振荡培养。PD培养基的组成为：24g/L的马铃薯葡萄糖(Difco)，30g/L的酵母抽提物(Difco)，5g/L肉汁提取物(Difco)，15g/L甘油，10g/L D-阿拉伯糖醇，10g/L D-木糖，10g/L木糖醇，20g/L碳酸钙(Kanto Chemical)，pH7.0。

首先，作为种子培养物，ATCC621菌株被接种至含有40ml PD培养基的坂口氏瓶，30℃下振荡培养过夜。将得到的浓度相当于1％的培养液接种至各含40ml PD培养基的坂口氏瓶，并且于30℃下振荡培养3天(主培养物)。通过离心去除碳酸钙后，离心收集到细胞。上述所获细胞用于XDH的提纯材料。

通过下面的酶活测定法测得XDH的活性。将30μl的酶液加至含有100mM的(终浓度)木糖醇、2mMNAD和100mM CAPS(PH10.0)的570μl的反应液中，30℃下进行酶解反应，利用分光光度计(BECKMAN生产的DU640分光计)测量340nm处的吸收来测定反应进程中NADH的增加。每分钟产生1μmol NADH的活性被定义为一个单位(U)。利用NADH在340nm下的分子吸收系数ε为6.3×10³进行计算。<2>XDH的纯化

(1)细胞提取物的制备

将如上所获的细胞悬浮于50mM磷酸钾缓冲液中(pH7)，且5000xg下离心10分钟重新收集沉淀部分，此过程中这些细胞的悬浮和离心均重复两次以洗涤细胞。

将大约10g的已洗涤的细胞悬浮于50ml的缓冲液1中(20mM Tris-HCl(pH7.6)，0.5mM EDTA，1mMMgCl₂，1mMDTT)，在4℃下用超声波破碎20分钟。将破碎细胞的悬浮液离心(8000rpm，10分钟)以除去细胞碎片，进一涉超速离心(56000rpm，30分钟)以除去不溶解的部分。因而，就获得了可溶的部分。

(2)阴离子交换层析

将上述所获的可溶部分上样于用缓冲液1平衡过的阴离子交换层析柱Q-琼脂糖凝胶FF(Pharmacia生产)。通过此操作，XDH被吸附到载体上。

用缓冲液1洗去没有被吸附到载体上的蛋白质(非吸附蛋白质)，用含有KCl的缓冲液作为洗脱液洗脱被吸附的蛋白质。在此洗脱过程中，缓冲液中KCl的浓度是从0M到0.5M线性变化的。测得洗脱过程中得到的每一个洗脱级分的XDH活性。在对应于大约200到350 mMKCl的浓度时发现洗脱级分中XDH的活性。

(3)NAD亲和层析

合并上面获得的含XDH活性的部分，对缓冲液1进行透析。用0.45μm的滤器过滤经透析后的溶液。将滤液上样于用缓冲液1平衡过的5ml NAD亲和柱HiTrap Blue(Pharmacia生产的)。通过此操作，XDH被吸收到载体上。

用缓冲液1洗去没有被吸附到载体上的蛋白质(非吸附蛋白质)，然后用含NAD的缓冲液2(20mM Tris-HCl(pH7.6)，0.5mM EDTA，1mM MgCl₂，1mMDTT，5mM NAD)作为洗脱剂洗脱被吸附的蛋白质。结果，在被洗脱的级分中测到XDH。

(4)阴离子交换层析

通过0.45μm的滤器过滤上述含有XDH活性的洗脱级分。将获得的滤液上样于用缓冲液1平衡过的阴离子交换层析柱Mono-Q(Pharmacia生产的)。通过此操作，XDH被吸附到载体上。

用缓冲液1洗去没有被吸附到载体上的蛋白质，然后用含有KCl的缓冲液作为洗脱剂洗脱被吸附的蛋白质，在此洗脱过程中，洗脱液中KCl的浓度是从0mM到500mM线性变化的。测得洗脱过程中得到的每一个洗脱级分的XDH活性。在对应于大约150到250mMKCl的浓度时发现洗脱级分中的XDH活性。

(5)疏水层析

对着缓冲液3(50mM磷酸钾缓冲液，1M硫酸铵，pH7.0)透析需检测活性的洗脱级分。通过0.45μm的滤器过滤透析后的溶液。将得到的滤液上样于用缓冲液3平衡过的疏水层析柱苯基琼脂糖凝胶HP(Pharmacia生产)。通过此操作，XDH被吸附到载体上。

用缓冲液3洗去没有被吸附到载体上的蛋白质，然后用缓冲液4(50mM磷酸钾缓冲液，pH7.0)作为洗脱剂洗脱被吸附的蛋白质，此洗脱过程中，缓冲液中硫酸铵浓度呈从1M到0M的线性变化。测得洗脱过程中得到的每一个洗脱级分的XDH活性。在对应于大约200到300mM硫酸铵的浓度时发现洗脱级分中的XDH活性。

(6)纯化级分的分析

对通过上述纯化获得的XDH活性组分进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色。结果，确认XDH被纯化到可被检测到两条带的水平，所述带的分子量估计分别为大约27000到30000和大约37000到40000(见图1)。自此以后，与分子量大约为36000到40000的带相对应的蛋白质被称为XDH1，与分子量大约为27000到30000的带相对应的蛋白质被称为XDH2。

此外，对获得的活性组分进行Native-PAGE电泳(非变性PAGE)和考马斯亮蓝染色。结果，两条对应于大于100kDa的分子量的带被证实。当经Native-PAGE电泳后的凝胶被活性染色液(25mM甘氨酸缓冲液，2.5mMNAD，50mM木糖醇，0.2nM吩嗪硫酸甲酯，0.2mM四硝基蓝四氮唑氯化物)活性染色时，在两个对应的带里测到XDH的活性，已证实与在SDS-PAGE电泳中检测到的两个带对应的蛋白质都有XDH活性(图1)。含有这些XDH1和XDH2的已纯化组分有时在后面被简称为XDH。

已测得作为上述纯化的结果的XDH比活的增加。已测到上述细胞提取物和通过纯化获得的活性组分的XDH活性。结果，发现通过一系列纯化过程，每单位蛋白质重量的比活增加550倍。通过用于这种测量的活性测定方法，纯化的XDH的比活估计大约为130U/mg(30℃，pH10)。

(7)XDH氨基端氨基酸序列的测定

按下述测定上述纯化XDH氨基端的氨基酸序列。即，在SDS的存在下，在聚丙烯酰胺凝胶中电泳已纯化的大约10μg XDH蛋白质，然后将凝胶中的XDH印迹至滤膜上，通过蛋白质测序仪从N端分析氨基酸序列。具体地，利用Milliblot(Millipore)将经半干法电泳后的凝胶中的目的酶印迹至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Tanpakushitu Kozo Kaiseki[蛋白质结构的分析]，H.Hirano，Tokyo Kagaku Dojin)。然后，通过蛋白质测序仪(ABI生产的476A型)分析PVDF胶片上的目的酶(XDH1或XDH2)以进行N端氨基酸序列分析。

结果，测得XDH1 N端27个残基的氨基酸序列，和XDH2N端25个残基的氨基酸序列。测得的XDH1 N端氨基酸序列示于序列表中的SEQ IDNO：1，XDH2 N端氨基酸序列示于序列表中的SEQ ID NO：2。

实施例2：利用XDH将D-木酮糖转化为木糖醇

使用实施例1获得的纯化的XDH(XDH1和XDH2)将D-木酮糖转化为木糖醇。将0.2U的纯化的XDH加至含21mM D-木酮糖、20mM NADH、100mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)的0.25ml反应液中，30℃保温1小时使其反应。反应完的溶液在下面的条件下经过高效液相层析(HPLC)分析产物木糖醇。

柱：Shodex SC1211 (Show Denko Co.，Ltd.生产)

流动相：50％乙腈/50％50ppm含水的Ca-EDTA

流速：0.8ml/分钟

温度：60℃

检测：RI检测器

结果，反应后在溶液中发现产生了18mM的木糖醇，且显示了使用纯化的XDH可由D-木酮糖产生木糖醇。

实施例3：得自葡糖杆菌的XDH基因的分离

<1>通过PCR扩增XDH基因

(1)制备以XDH的N端氨基酸序列作为基础的PCR引物

以来自上述氧化葡糖杆菌ATCC621的每个XDH(XDH1，XDH2)的N端氨基酸序列(SEQ ID NO：1和2)为基础，分别制得具有如SEQ ID NO：7-10所示核苷酸序列的混合引物。

(2)制备氧化葡糖杆菌ATCC621的染色体DNA

在如下条件下培养氧化葡糖杆菌ATCC621菌株。首先，在20ml的YPG培养基(3％葡萄糖，0.5％的Bacto酵母抽提物，0.3％Bacto蛋白胨，pH6.5)中将ATCC621菌株培养过夜作为种子培养物。使用5ml此培养物作为接种菌，使用100ml YPG培养基进行主培养，在30℃下振荡培养。

细菌在上述的条件下培养到对数生长后期后，离心100ml的培养物肉汤(12000xg，4℃，15分钟)以收集细胞，将细胞悬浮于10ml的50∶20TE(50mM Tris-HCl，pH8.0，20mM EDTA)中，洗涤细胞并离心回收之。将细胞再悬浮于10ml的50∶20TE中。将0.5ml的20mg/ml的溶菌酶溶液和1ml的10％的SDS溶液加至此悬浮液中，55℃保温20分钟。保温后，加入等体积的10∶1的TE-饱和的苯酚进行脱蛋白质作用。通过将等体积的2-丙醇加至已分离的水层得到DNA沉淀，然后收集之。沉淀DNA溶解于加入了5μl 10mg/ml的核糖核酸酶和5μl 10mg/ml的蛋白酶K的0.5ml的50∶20 TE中，55℃反应2小时。反应后，通过加入等体积的10∶1的TE-饱和的苯酚进行脱蛋白质作用。在分离的水层中再加入等量的24∶1的氯仿/异戊醇，搅拌，并收集水层。此步骤重复两次后，在得到的水层中加入3M的醋酸钠溶液(pH5.2)以获得0.4M的终浓度，再加入两倍体积的乙醇。产物DNA作为沉淀被收集，用70％的乙醇洗涤，干燥，溶解于1ml的10∶1的TE中。

(3)通过PCR制备DNA片段

通过使用TaKaRa LA PCR体外克隆试剂盒(TaKaRa Shuzo公司提供)进行PCR以扩增和分离含有来自葡糖杆菌属的编码XDH的基因的DNA分子。除非另有说明实验是按照试剂盒附带的说明书进行的。

将上述(2)得到的5μg染色体DNA用限制性酶PstI或HindIII进行降解。然后，将一个PstI盒或HindIII盒与用乙醇沉淀收集得到DNA片段连接。此外，乙醇沉淀后，使用引物C1和下述引物的联合对收集的DNA进行首次PCR。即将与一个PstI盒连接的DNA作为基于XDH1氨基酸序列的引物XDH1-S1的模板DNA，将与一个HindIII盒连接的DNA作为基于XDH2氨基酸序列的引物XDH2-S1的模板DNA。引物C1、引物XDH1-S1、引物XDH2-S1的核苷酸序列分别示于序列表的SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9。引物C1包含在TaKaRaLAPCR体外克隆试剂盒中，且对应于PstI盒和HindIII盒的序列。PCR反应是通过基因扩增PCR系统9600(由PERKIN ELMER生产)进行的，反应在如下条件下重复30个循环。

94℃ 30秒

55℃ 2分钟

72℃ 1分钟

然后，将反应的混合物稀释100倍，并新加入引物C2和引物XDH1-S2或引物XDH2-S2，进行第二次PCR扩增。反应条件与第一次的相同。引物C2、引物XDH1-S2、引物XDH2-S2的核苷酸序列分别示于序列表的SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10。引物C2包含于TaKaRaLAPCR体外克隆试剂盒中，且具有对应于PstI盒和HindIII盒之序列的序列。按已知的氨基酸序列设计的引物XDH1-S2和XDH2-S2分别含有一个序列，该序列对应于EcoRI和EcoRI位点。

反应结束后，对3μl的反应混合物进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳。结果，证实当使用XDH1-S2为引物时，大约1kb的DNA被扩增，使用XDH2-S2为引物时，大约1.7kb的DNA被扩增。

(4)将经PCR扩增的DNA片段克隆到pUC19中

通过将PCR扩增得到的大约1kbp(XDH1)和大约1.7kbp(XDH2)的DNA片段与pUC19连接而进行克隆。连接反应是通过使用DNA连接试剂盒Ver.2(TaKaRa Shuzo公司提供)进行的。除非另有说明，实验是按照试剂盒附带的说明书进行的。

用PstI和EcoRI消化使用引物XDH1-S2扩增得到的400ng大约1kb的DNA片段，然后纯化之，与经PstI和EcoRI消化的pUC19连接。使用这种连接反应混合物转化大肠杆菌JM109。

另外，用HindIII和EcoRI消化使用引物XDH2-S2扩增得到的400ng大约1.7kb的DNA片段，然后纯化之，与经HindIII和EcoRI消化的pUC19连接。使用这种连接反应混合物转化大肠杆菌JM109。

每次从获得的转化细胞中，选择用pUC19转化的含有大约1kbp(XDH1)或大约1.7kbp(XDH2)目的DNA片段的几个JM109菌株。选择的方法描述于“分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)”。

(5)XDH2基因片段核苷酸序列的测定

制备被pUC19转化的JM109携带的质粒，其中pUC19含有大约1.7kbp(XDH2)的DNA片段，制备方法描述于“分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)”，测定插入的DNA片段的核苷酸序列。测序反应是通过使用DyeTerminator Cycle测序试剂盒(ABI生产)，按照试剂盒附带的说明书进行的。使用DNA测序仪373(ABI生产)进行电泳。

结果，发现PCR扩增的DNA片段中具有从序列表中SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的第1160位胸苷残基到第2774位胸苷残基的序列。

(6)通过PCR制备XDH2基因上游区域的DNA片段

使用如上测定的核苷酸序列通过PCR扩增和分离XDH2基因和XDH2基因上游区域的DNA片段。PCR反应是使用TaKaRa LAPCR体外克隆试剂盒(TaKaRa Shuzo公司提供)进行的。除非另有说明，实验是按照试剂盒附带的说明书进行的。

将(2)中制备的5μg染色体DNA用限制性酶SalI消化。然后，将SalI盒与用乙醇沉淀收集的DNA片段连接。再用乙醇沉淀，通过使用引物C1和引物XDH2UP-S1对收集的DNA进行首次PCR。引物C1、引物XDH2UP-S1的核苷酸序列分别示于序列表的SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13。引物XDH2UP-S1是和SEQ ID NO：5所示的编码葡糖杆菌属XDH2的基因簇核苷酸序列的第1317位胞嘧啶残基到第1283位胞嘧啶残基区域互补的序列。

PCR反应是通过基因扩增PCR9600系统(由PERKINELMER生产)进行的，反应在如下条件下重复30个循环。

94℃ 30秒

55℃ 2分钟

72℃ 1分钟

然后，将反应的混合物稀释100倍，并新加入引物C2和引物XIDH2UP-S2，进行第二次PCR扩增。反应条件与第一次的相同。引物C2、引物XDH2UP-S2的序列分别示于序列表的SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14。引物XDH2UP-S2是由与SEQ ID NO：5所示的编码葡糖杆菌属XDH2的基因的核苷酸序列中的第1255位鸟嘌呤残基到1225位鸟嘌呤残基区域互补的一段序列组成。反应完成后，将3μl的反应混合物用于0.8％琼脂糖凝胶电泳。结果证实大约1.3kb的DNA片段被扩增。

(7)XDH2基因的核苷酸序列和含有其上游序列的DNA片段的检测

将上述PCR扩增得到的大约1.3kbp DNA片段进行纯化，并且测定其核苷酸序列。通过使用Dye Terminator循环测序试剂盒(ABI生产)，按照试剂盒附带的说明书进行测序。通过使用DNA373测序仪(ABI生产)进行电泳。

结果发现(6)中扩增的DNA片段中具有序列表中SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的从第1位鸟嘌呤残基到第1224位鸟嘌呤残基的一段序列。示于SEQ ID NO：5的核苷酸序列包括与(5)中测定的核苷酸序列结合的这段核苷酸序列。可能由该段核苷酸序列编码的氨基酸序列可由通用密码子来推导，该氨基酸序列一起示于SEQ ID NO：5，也显示于SEQ ID NO：6。从第2到26位氨基酸残基的序列完全对应于SEQ ID NO：2所示XDH2的N端氨基酸序列的从第1到25位氨基酸残基的序列。自此证实了PCR扩增得到的DNA片段为来源于葡糖杆菌属的靶XDH2基因及其上游区域。

(8)含有全长XDH2基因编码区的DNA片段的克隆

通过PCR扩增含有全长XDH2基因编码区的DNA片段，并将其连接到pUC18上以进行克隆。该PCR反应利用TaKaRa LAPCR试剂盒(由TakaraShuzo Co.，Ltd.提供)进行。除非另有说明，实验是按照试剂盒附带的说明书进行的。

PCR是通过将使用与(2)中相同的方法生产的氧化葡糖杆菌ATCC621菌株的1μg染色体DNA用作模板，并且利用引物XDH2-5’和引物XDH2-3’来进行的。引物XDH2-5’的核苷酸序列示于序列表的SEQ ID NO：15，引物XDH2-3’的核苷酸序列示于序列表的SEQ ID NO：16。引物XDH2-5’含有一个序列，此序列对应于含有SEQ ID NO：5所示XDH2基因的核苷酸序列的从第1043位胞嘧啶残基到第1063位胞嘧啶残基区域，引物XDH2-3’含有互补于上述核苷酸序列的第1957位胞嘧啶残基到1978位胞嘧啶残基区域的一段核苷酸序列。

该PCR反应是通过基因扩增PCR9600系统(由PERKIN ELMER生产)进行的，反应在如下条件下重复30个循环。

94℃ 30秒

55℃ 2分钟

72℃ 1分钟

反应完成后，将3μl的反应混合物用于0.8％的琼脂糖凝胶电泳。结果证实大约1kbp的DNA片段被扩增。

将通过上述PCR扩增得到的大约1kbp的DNA片段连接到pUC18上进行克隆，此克隆利用DNA连接试剂盒Ver.2(由Takara Shuzo Co.，Ltd.提供)进行。除非另有说明，实验是按照试剂盒附带的说明书进行的。用BamHI和EcoRI消化400ng大约1kb的扩增DNA片段，然后纯化之，与用BamHI和EcoRI消化的pUC18连接。利用这种连接反应混合物转化大肠杆菌JM109。

从获得的转化子中，选择用pUC18转化的含有大约1kbp目的DNA片段的几个JM109菌株。选择的方法描述于“分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)”。

来源于氧化葡糖杆菌的XDH2基因可由上述方法克隆。通过上述方法获得的含有XDH2目的基因片段的质粒被称作pUCXDH2。

(9)测定XDH1基因片段的核苷酸序列

提取从(4)中选择的被含大约1kbp(XDH1)DNA片段的pUC18转化的JM109菌株所携带的质粒，提取方法描述于“分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)”，测定插入的DNA片段的核苷酸序列。测序反应是通过使用DyeTerminator循环测序试剂盒(ABI生产)，按照试剂盒附带的说明书进行的。使用DNA测序仪373(ABI生产)进行电泳。

结果，发现PCR扩增的DNA片段含有序列表的SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的第52位的鸟嘌呤残基到1011位鸟嘌呤残基的序列。

(10)从染色体DNA文库克隆XDH1基因

i)染色体DNA文库的构建

用HindIII完全消化上文(2)中制备的1μg染色体DNA。用乙醇沉淀收集DNA，然后溶解于10μl的10∶1的TE中。将5μg的此溶液和1ng用HindIII消化过并经BAP(细菌的碱性磷酸酶)脱磷酸化的pUC19(Takara ShuzoCo.，Ltd.提供)混合，连接反应是通过使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara ShuzoCo.，Ltd.提供)进行的。将3μl的此连接反应混合物与100μl的大肠杆菌JM109菌株(Takara Shuzo Co.，Ltd.提供)的感受态细胞混合以转化大肠杆菌JM109。将此涂布于适当的固体培养基从而构建染色体DNA文库。

ii)探针的制备

用(3)中得到的XDH1基因的一部分作为探针。将(3)中得到的使用引物C2和引物XDH1-S2扩增的大约1kbDNA片段在1％琼脂糖凝胶上电泳进行分离。切下靶带，用Gene CleanII试剂盒(Funakoshi生产)纯化DNA。最终获得16μl的50ng/μlDNA溶液。根据产品说明书用DIG High Prime(Boehringer Mannheim生产)和此DNA片段制得地高辛标记的探针。

iii)通过菌落杂交进行筛选

为了得到全长的XDH1基因，利用上述的探针通过菌落杂交进行染色体DNA文库的筛选。菌落杂交的方法见“分子克隆，第2版，冷泉港出版社(1989)”。

将染色体DNA文库的菌落印迹至尼龙滤膜上(Amershm生产的Hybond-N)，碱变性，中和，固定。用EASYHYB(Boehringer Mannheim生产)进行杂交。将滤膜浸入缓冲液(EASYHYB)，且于42℃预杂交1小时。然后，加入上述标记的探针，42℃杂交16小时。接着，在室温下用含有0.1％SDS的2x SSC冲洗滤膜20分钟。而后，65℃用含有0.1％SDS的0.1x SSC冲洗滤膜15分钟两次。

根据试剂盒的说明书用DIG核苷酸检测试剂盒(Boehringer Mannheim生产)检测可与上述探针杂交的菌落。结果，检测得到四株可与探针杂交的菌落。

(11)XDH1基因的DNA序列

用与(5)中相同方法，检测到插入pUC19的DNA片段的核苷酸序列，结果示于序列表的SEQ ID NO：3。通过通用密码子推导出的由核苷酸序列编码的氨基酸序列连同核苷酸序列示于SEQ ID NO：3，也示于SEQ ID NO：4。从第2到第28位氨基酸残基的氨基酸序列完全对应于SEQ ID NO：1所示的由第1到第27位的27个氨基酸残基组成的序列。自此证实获得的DNA片段是来源于葡糖杆菌属的靶XDH1基因及其侧翼区。

实施例4：来源于葡糖杆菌属细菌的XDH1基因在大肠杆菌中的表达及产物的纯化

<1>携有重组XDH2基因的大肠杆菌的培养与表达的诱导

实施例3所获的pUCXDH2中，来源于葡糖杆菌属细菌的编码XDH2基因的DNA与lacZ启动子的下游区域相连，因此其表达是在lacZ启动子的控制下进行的。

于37℃，在50ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中振荡培养用pUCXDH2转化的大肠杆菌JM109和用pUC18转化的大肠杆菌JM109(对照)过夜，以作为种子培养物。将1％量的用pUCXDH2转化的大肠杆菌JM109种子培养物接种在含新鲜培养基的烧瓶中作为平行实验1。另一方面，将1％量的用pUC18转化的大肠杆菌JM109种子培养物接种在含新鲜培养基的烧瓶中作为平行实验2(对照)。培养每一个实验组，当培养物在610nm处的光吸收变为0.7时，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖)至1mM的终浓度。然后，4小时后，培养结束。

<2>验证由诱导表达获得的蛋白质

培养结束后，通过离心(12000xg，15分钟)10ml的肉汤培养基收集细胞。将细胞悬浮在2ml的10mM Tris-HCl，pH7.5溶液中，洗涤后离心回收。将细胞悬浮于1ml相同的缓冲液中，使用多珠粒震荡仪(Yasui Kikai)通过用0.1mm氧化锆珠粒摇荡3分钟破裂细胞。将破碎后的细胞悬浮液经过SDS-PAGE，并用CBB(考马斯亮蓝)染色。结果证实一条对应于分子量大约27000到30000的带，仅仅能在实验1中观察到(用pUCXDH2转化的大肠杆菌JM109)。从分子量可推导出已表达了所需的XDH2蛋白质。

<3>XDH活性的证实

表达蛋白质的XDH活性已被测得。根据实验1的方法，使用上述破碎细胞悬浮液检测XDH活性。结果，在用pUCXDH2转化的大肠杆菌JM109中检测到XDH的活性为14U/mg，然而作为对照的用pUC18转化的大肠杆菌JM109中没有检测到XDH活性。从此结果可确认用pUCXDH2转化的大肠杆菌JM109显示了XDH的活性。

<4>从重组的大肠杆菌JM109中纯化XDH2

离心收集上述<2>中培养的用pUCXDH2转化的大肠杆菌JM109细胞。获得的细胞用作纯化XDH的材料。通过实施例1所述的方法测得XDH活性。

(1)细胞提取物的制备

将上述的细菌细胞悬浮于50mM的磷酸钾缓冲液(pH7)中，通过5000xg离心10分钟再收集所获得的沉淀部分。进行包括悬浮和离心的步骤的目的是洗涤细胞。重复两次洗涤细胞的过程。

将3g已洗涤的细胞悬浮于20ml的缓冲液1(20mM Tris-HCl(pH7.6)，0.5mM EDTA，1mM MgCl₂，1mM DTT)，4℃时用超声波破碎20分钟。离心(8000rpm，10分钟)破碎细胞的悬浮液以去除细胞残渣，并超速离心(56000rpm，30分钟)以去除不可溶部分。

(2)阴离子交换层析

将所获的可溶部分上样于用缓冲液1平衡过的Q-琼脂糖FF阴离子交换层析柱(Pharmacia生产)。通过此操作，XDH被吸附到载体上。

用缓冲液1洗去没有被吸附到载体上的蛋白质(非吸附蛋白质)，用含有KCl的缓冲液作为洗脱液洗脱被吸附的蛋白质。在此洗脱过程中，洗脱液中KCl的浓度是从0M到0.5M线性变化的。测定洗脱过程中得到的每一个洗脱组分的XDH活性，且发现对应于大约200到350mM KCl浓度的洗脱组分中有XDH活性。

(3)NAD亲和层析

合并上面获得的含XDH活性的成份，对缓冲液1进行透析。用0.45μm的过滤器过滤经透析后的溶液。将滤液上样于用缓冲液1平衡过的5ml NAD亲和柱HiTrap Blue(Pharmacia生产)。通过此操作，XDH被吸附到载体上。

用缓冲液1洗去没有被吸附到载体上的蛋白质(非吸附蛋白质)，然后用含NAD的缓冲液2(20mM Tris-HCl(pH7.6)，0.5mM EDTA，1mM MgCl₂，1mMDTT，5mM NAD)作为洗脱剂洗脱被吸附的蛋白质。结果，在被洗脱的成分中测到XDH。

(4)疏水层析

对纯化获得的XDH活性成分进行SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色。结果，确认XDH2被纯化到仅能检测出一条带的水平，分子量估计大约为27000到30000。也就是说，在大肠杆菌JM109中表达的XDH2能够被纯化为单酶。

实施例5：XDH最适pH的测定

通过使用实施例4获得的XDH2酶，如下测定依赖于反应pH的酶活的差异以确定最适pH。

醋酸钠缓冲液(pH3.3，4，4.5，5和6，)，Tris-HCl(pH7和8)，甘氨酸-氢氧化钠(pH9)，和CAPS-NaOH(pH10)缓冲液被用作酶反应缓冲液。XDH还原反应活性测定如下：30℃时将30μl的酶液加至570μl含有100mM(终浓变)D-木酮糖，0.2mM NADH，和100mM缓冲液的反应液中进行酶反应，通过使用分光光度计(BECKMAN生产的DU 640分光计)测定340nm处的光吸收来测定反应进程中NADH的减少。每分钟减少1μmol NADH的活性定义为1U。利用NADH在340nm下的分子消光系数ε为6.3×10³进行计算。加入每一种缓冲液使反应溶液有100mM的浓度。用上面纯化的XDH组分作酶源，且反应在30℃下进行。测定结果被表示为相对于各个反应溶液实际测定的pH值的酶活值。为了方便起见，将pH5时的氧化反应活性定义为100。测量的结果示于图2。

本发明的XDH2的还原反应(从D木酮糖到木糖醇的反应)的最适pH大约为5(见图2)。由于据Cor.F.B.Witteveen，et al(微生物学，140，1679-1685，1994)报道，得自黑色曲霉的XDH的还原反应的最适pH严格为6.5，因此本发明得自葡糖杆菌属的XDH2在反应的最适pH上与已知的XDH明显不同。也就是说，已证明通过本发明发现了得自葡糖杆菌属的XDH，至少XDH2的特征在于在还原反应中有较低的最适pH。

序列表<110>Ajinomoto Co.，Inc.<120>(醋酸杆菌的木糖醇脱氢酶及其基因)<130>OP880<141>1999-07-<160>16<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>27<212>PRT<213>氧化葡糖杆菌<400>1Ala Asp Thr Met Leu Ala Ala Val Val Arg Glu Phe Gly Lys Pro Leu1 5 10 15Ser Ile Glu Arg Leu Pro Ile Pro Asp Ile Lys

20 25<210>2<211>25<212>PRT<213>氧化葡糖杆菌<400>2Ser Lys Lys Phe Asn Gly Lys Val Cys Leu Val Thr Gly Ala Gly Gly1 5 10 15Asn Ile Gly Leu Ala Thr Ala Leu Arg

20 25<210>3<211>1056<212>DNA<213>氧化葡糖杆菌<220><221>CDS<222>(25)..(1053)<400>3cacccgccag aaggagtctt ttcc atg gct gat aca atg ctc gcc gcc gtc 51

Met Ala Asp Thr Met Leu Ala Ala Val

1 5

gtc cgt gaa ttc ggc aag ccg ctc tcc atc gag cgg cta ccc atc ccg 99Val Arg Glu Phe Gly Lys Pro Leu Ser Ile Glu Arg Leu Pro Ile Pro10 15 20 25

gac atc aag ccc cac cag atc ctc gtg aag gtc gat acc tgt ggc gtc 147Asp Ile Lys Pro His Gln Ile Leu Val Lys Val Asp Thr Cys Gly Val

30 35 40tgc cac act gac ctg cac gcc gcg cgc ggg gac tgg ccg tcc aag ccc 195Cys His Thr Asp Leu His Ala Ala Arg Gly Asp Trp Pro Ser Lys Pro

45 50 55aac ccg ccg ttc att ccc ggg cat gaa ggc gtc gga cac atc gtc gcc 243Asn Pro Pro Phe Ile Pro Gly His Glu Gly Val Gly His Ile Val Ala

60 65 70gtc ggc agt cag gtc ggc gat ttc gtc aag acc ggc gat gtc gtg ggc 291Val Gly Ser Gln Val Gly Asp Phe Val Lys Thr Gly Asp Val Val Gly

75 80 85gtg ccc tgg ctc tac tcc gcc tgc ggt cac tgc gaa cac tgt ctg ggc 339Val Pro Trp Leu Tyr Ser Ala Cys Gly His Cys Glu His Cys Leu Gly90 95 100 105ggc tgg gaa aca ctc tgc gaa aag cag gac gac acc ggc tac acc gtc 387Gly Trp Glu Thr Leu Cys Glu Lys Gln Asp Asp Thr Gly Tyr Thr Val

110 115 120aat ggc tgc ttc gcc gaa tat gtc gtg gca gac ccg aac tac gtc gca 435Asn Gly Cys Phe Ala Glu Tyr Val Val Ala Asp Pro Asn Tyr Val Ala

125 130 135cac ctg ccc tcg acc atc gac ccg ctt cag gcc tcg ccg gtc ctg tgc 483His Leu Pro Ser Thr Ile Asp Pro Leu Gln Ala Ser Pro Val Leu Cys

140 145 150gcg ggg ctg acg gtc tat aag ggc ctg aaa atg acg gag gcc cgc ccc 531Ala Gly Leu Thr Val Tyr Lys Gly Leu Lys Met Thr Glu Ala Arg Pro

155 160 165ggc cag tgg gtc gca gtc tcg ggc gtc ggc ggt ctc ggc cag atg gcc 579Gly Gln Trp Val Ala Val Ser Gly Val Gly Gly Leu Gly Gln Met Ala170 175 180 185gtg cag tac gcc gtc gcc atg ggc atg aat gtc gtc gcg gtg gac atc 627Val Gln Tyr Ala Val Ala Met Gly Met Asn Val Val Ala Val Asp Ile

190 195 200gat gac gaa aaa ctc gcc aca gcc aaa aag ctc ggc gca tcc ctg acc 675Asp Asp Glu Lys Leu Ala Thr Ala Lys Lys Leu Gly Ala Ser Leu Thr

205 210 215gtc aac gcc aag gac acg gac ccg gcc agg ttc atc cag cag cag atc 723Val Asn Ala Lys Asp Thr Asp Pro Ala Arg Phe Ile Gln Gln Gln Ile

220 225 230ggc ggc gca cat ggc gct ctc gtc acc gct gtc gga cgg acg gcg ttt 771Gly Gly Ala His Gly Ala Leu Val Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Phe

235 240 245tcg cag gcc atg ggc tat gcc cgc cgc ggc ggc acc atc gtc ctg aac 819Ser Gln Ala Met Gly Tyr Ala Arg Arg Gly Gly Thr Ile Val Leu Asn250 255 260 265gga ctg ccg ccc ggc gat ttc ccg gtc tcg atc ttc gac atg gtc atg 867Gly Leu Pro Pro Gly Asp Phe Pro Val Ser Ile Phe Asp Met Val Met

270 275 280aac ggc acc acc atc cgt ggc tcc atc gtc gga aca cgg ctg gac atg 915Asn Gly Thr Thr Ile Arg Gly Ser Ile Val Gly Thr Arg Leu Asp Met

285 290 295atc gag gcc atg gat ttc ttc gcc cgc ggc aag gtc aaa tcc gtc gtc 963Ile Glu Ala Met Asp Phe Phe Ala Arg Gly Lys Val Lys Ser Val Val

300 305 310acc ccc gga aaa ctt gaa aac atc aat acg atc ttc gac gat ctg cag 1011Thr Pro Gly Lys Leu Glu Asn Ile Asn Thr Ile Phe Asp Asp Leu Gln

315 320 325aat ggt cgc ctc gaa ggc cgg aca gtg ctc gac ttc cgg tcc tga 1056Asn Gly Arg Leu Glu Gly Arg Thr Val Leu Asp Phe Arg Ser330 335 340<210>4<21l>343<212>PRT<213>氧化葡糖杆菌<400>4Met Ala Asp Thr Met Leu Ala Ala Val Val Arg Glu Phe Gly Lys Pro 1 5 10 15Leu Ser Ile Glu Arg Leu Pro Ile Pro Asp Ile Lys Pro His Gln Ile

20 25 30Leu Val Lys Val Asp Thr Cys Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Ala

35 40 45Ala Arg Gly Asp Trp Pro Ser Lys Pro Asn Pro Pro Phe Ile Pro Gly

50 55 60His Glu Gly Val Gly His Ile Val Ala Val Gly Ser Gln Val Gly Asp65 70 75 80Phe Val Lys Thr Gly Asp Val Val Gly Val Pro Trp Leu Tyr Ser Ala

85 90 95Cys Gly His Cys Glu His Cys Leu Gly Gly Trp Glu Thr Leu Cys Glu

100 105 110Lys Gln Asp Asp Thr Gly Tyr Thr Val Asn Gly Cys Phe Ala Glu Tyr

115 120 125Val Val Ala Asp Pro Asn Tyr Val Ala His Leu Pro Ser Thr Ile Asp

130 135 140Pro Leu Gln Ala Ser Pro Val Leu Cys Ala Gly Leu Thr Val Tyr Lys145 150 155 160Gly Leu Lys Met Thr Glu Ala Arg Pro Gly Gln Trp Val Ala Val Ser

165 170 175Gly Val Gly Gly Leu Gly Gln Met Ala Val Gln Tyr Ala Val Ala Met

180 185 190Gly Met Asn Val Val Ala Val Asp Ile Asp Asp Glu Lys Leu Ala Thr

195 200 205Ala Lys Lys Leu Gly Ala Ser Leu Thr Val Asn Ala Lys Asp Thr Asp

210 215 220Pro Ala Arg Phe Ile Gln Gln Gln Ile Gly Gly Ala His Gly Ala Leu225 230 235 240Val Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Phe Ser Gln Ala Met Gly Tyr Ala

245 250 255Arg Arg Gly Gly Thr Ile Val Leu Asn Gly Leu Pro Pro Gly Asp Phe

260 265 270Pro Val Ser Ile Phe Asp Met Val Met Asn Gly Thr Thr Ile Arg Gly

275 280 285Ser Ile Val Gly Thr Arg Leu Asp Met Ile Glu Ala Met Asp Phe Phe

290 295 300Ala Arg Gly Lys Val Lys Ser Val Val Thr Pro Gly Lys Leu Glu Asn305 310 315 320Ile Asn Thr Ile Phe Asp Asp Leu Gln Asn Gly Arg Leu Glu Gly Arg

325 330 335Thr Val Leu Asp Phe Arg Ser

340<2l0>5<211>2774<212>DNA<213>氧化葡糖杆菌<220><22l>CDS<222>(1063)..(1848)<400>5gcgcaatgat cttgcgaccc gtcaggccgg cgtcgccgtc cggtccgccg atgacgaagt 60taccggtcgg gttcacgtag aactcgtctt ccgggcaggt ccagccttcc ggcaggatgc 120cgttgaccac gtcgcgcagg gtttcgccgg atcgtgttct ggctcatgcc ctcgacatgc 180tgcgtggaaa tcacgacgga cgtgacgcca accggcttgc catcgacata acgcagcgtg 240acctggctct tggcatccgg cagaaggccg acgccacggg cgtcgccgtt cttgcggtag 300tcgcggatgc gctcgaggat cgtctgcgcg taatacagcg gcgcaggcat caggtgttcg 360gtttcgcgcg tggcgtagcc gaacatgatg ccctggtcac cagcgccctc gtccttgtcg 420ctgccgctgt caacgccctg ggcgatgtcg gcggactgtg cgtgcaggta ggaggtgatg 480tcggccttct tccaggagaa accttcctgg tcgtagccga tgtccttgat ggcttcacgg 540gcacggtcga tcagcgtgtc ctcgacctct ttggggccgc ggacttcacc ggccaggatg 600acgcggttgg tggtgaccag cgtctcacag gcaacacgtg cttccggatc ggcctgcaga 660taggcgtcca gaacggtatc ggaaatgcgg tccgccacct tgtcgggatg gccctcggaa 720acggactcgg acgtgaaaag gaaatcgccg tgattgcgca ctcagggacc tcgcagggaa 780tgagtggtga gaagggccac agggtgtctt ggcagacagg ctgtggcatt cagggaggtg 840acggcttggc ggaattggtc gcaagggtca aggggctgca tggggtctga acgcggtttt 900ctgcgggaaa gtcccgaaaa ccgccgtgag atcacaaaaa agagagccgg cgcccccgtt 950tcatttttca acgacaccgt ccatgctgcg ttcgtgttcc cgcgaccctt gttgcccgtc 1020acgggtgcgg tcccgggaaa aacagagttt gaggcattcg ga atg tcg aag aag 1074

Met Ser Lys Lys

1ttt aac ggt aaa gtc tgt ctg gtc acc ggc gcg ggt ggc aat atc ggt 1122Phe Asn Gly Lys Val Cys Leu Val Thr Gly Ala Gly Gly Asn Ile Gly5 10 15 20ctt gcg acc gcc ctc cgt ctg gca gaa gag ggc acg gcc atc gcc ctt 1170Leu Ala Thr Ala Leu Arg Leu Ala Glu Glu Gly Thr Ala Ile Ala Leu

25 30 35ctg gac atg aac cgc gag gcg ctg gaa aag gcg gaa gcc tcc gtc cgt 1218Leu Asp Met Asn Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ala Glu Ala Ser Val Arg

40 45 50gaa aag ggc gtc gaa gcc cgc tcc tat gtc tgt gac gtc acg tcc gaa 1266Glu Lys Gly Val Glu Ala Arg Ser Tyr Val Cys Asp Val Thr Ser Glu

55 60 65gag gcc gtg atc ggg acg gtg gat agc gtg gtc cgg gac ttc ggg aag 1314Glu Ala Val Ile Gly Thr Val Asp Ser Val Val Arg Asp Phe Gly Lys

70 75 80atc gac ttc ctg ttc aac aat gcc ggc tat cag ggc gcc ttc gcc ccc 1362Ile Asp Phe Leu Phe Asn Asn Ala Gly Tyr Gln Gly Ala Phe Ala Pro85 90 95 100gtg cag gac tac ccg tcc gac gat ttc gcg cgc gtg ctg acg atc aac 1410Val Gln Asp Tyr Pro Ser Asp Asp Phe Ala Arg Val Leu Thr Ile Asn

105 110 115gtc acc ggt gcc ttc cac gtc ctc aaa gcc gtt tcg cgc cag atg atc 1458Val Thr Gly Ala Phe His Val Leu Lys Ala Val Ser Arg Gln Met Ile

120 125 130acg cag aac tac ggg cgc atc gtc aac acc gcc agc atg gcc ggt gtg 1506Thr Gln Asn Tyr Gly Arg Ile Val Asn Thr Ala Ser Met Ala Gly Val

135 140 145aag gga ccg cca aac atg gcc gcc tat ggt gcg tcc aag ggc gcc atc 1554Lys Gly Pro Pro Asn Met Ala Ala Tyr Gly Ala Ser Lys Gly Ala Ile

150 155 160atc gcc ctg acc gaa acg gcc gcg ctt gac ctt gcc ccc tac aac atc 1602Ile Ala Leu Thr Glu Thr Ala Ala Leu Asp Leu Ala Pro Tyr Asn Ile165 170 175 180cgt gtg aac gcc atc agc ccc ggt tac atg ggg ccc ggt ttc atg tgg 1650Arg Val Asn Ala Ile Ser Pro Gly Tyr Met Gly Pro Gly Phe Met Trp

185 190 195gag cgt cag gtc gag ctt cag gcc aag gtc gga agc cag tat ttc tcc 1698Glu Arg Gln Val Glu Leu Gln Ala Lys Val Gly Ser Gln Tyr Phe Ser

200 205 210acc gat ccc aag gtc gtg gcc cag cag atg atc ggc agc gtt ccg atg 1746Thr Asp Pro Lys Val Val Ala Gln Gln Met Ile Gly Ser Val Pro Met

215 220 225cgc cgc tat ggc gac atc aac gag atc ccg ggc gta gta gcg ttc ctg 1794Arg Arg Tyr Gly Asp Ile Asn Glu Ile Pro Gly Val Val Ala Phe Leu

230 235 240ctg ggg gat gat tcc agc ttc atg acg ggg gtg aac ctg ccg att gct 1842Leu Gly Asp Asp Ser Ser Phe Met Thr Gly Val Asn Leu Pro Ile Ala245 250 255 260ggc ggt tgatcggggg agtccgggct ctgcccgggc ccggcaggga ttttaatccc 1898Gly Glytgcaccctgt tttaagttag cgttttaagg cgtcggccat tgtgtagagg ccggcggggc 1958gtcctgcgag ccatcttgcg gccagcaggg cgcctcttgc gaagaccctg cggtccagtg 2018cgcggtgcga cagagtgatc tgttcgtctg cggccatcag aacgagatca tgttcgccta 2078cgatctgtcc gccgcgcagg gaggcgaatc cgatcgcgcc atccggacgt cggccgttct 2138ggtcggtccg ggccacgtcc tcgaaactga caccacgtcc ttccgccaca gcccggccga 2198tcgccagtgc cgtgccggac ggcgcgtcca gcttctggcg gtgatgaact tccagaattt 2258ccgcatcata atccggcagc cctgcaccaa gctgacgggc gagctccaga aacagcgtca 2318gcgccggtga gaaattggcg gcctgaagaa cgggaatatg ctgcgccgcc gcgttcacgg 2378catcctgcgc gccctgatcg agccccgtcg tccccagaac ccaggcgcat ccggcctgcg 2438caaaggctgc cgcatgggcc ggaacggtcg aagcatggct gacatcgatc acgacatcgc 2498agtttttcgc gagtgcggcg ggatcggtgg tgatgttgcg ctgggggtct gctgtccggg 2558agaggccgcc gacgagggca gaaccagcct cttcggcaca aagcgttcca agccggcccg 2618taatgccggc gataccaata cggggagcag aaatcagggt catggtcggt ccatcagaac 2678ggaaaaatca ggtgttggcg tcaagccggg catcgaaacg ggcacgggcc gcctcgattt 2738cgggacggtt cgacagcgcc cactgaccga aagctt 2774<210>6<211>262<212>PRT<213>氧化葡糖杆菌<400>6Met Ser Lys Lys Phe Asn Gly Lys Val Cys Leu Val Thr Gly Ala Gly1 5 10 15Gly Asn Ile Gly Leu Ala Thr Ala Leu Arg Leu Ala Glu Glu Gly Thr

20 25 30Ala Ile Ala Leu Leu Asp Met Asn Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ala Glu

35 40 45Ala Ser Val Arg Glu Lys Gly Val Glu Ala Arg Ser Tyr Val Cys Asp

50 55 60Val Thr Ser Glu Glu Ala Val Ile Gly Thr Val Asp Ser Val Val Arg65 70 75 80Asp Phe Gly Lys Ile Asp Phe Leu Phe Asn Asn Ala Gly Tyr Gln Gly

85 90 95Ala Phe Ala Pro Val Gln Asp Tyr Pro Ser Asp Asp Phe Ala Arg Val

100 105 110Leu Thr Ile Asn Val Thr Gly Ala Phe His Val Leu Lys Ala Val Ser

115 120 125Arg Gln Met Ile Thr Gln Asn Tyr Gly Arg Ile Val Asn Thr Ala Ser

130 135 140Met Ala Gly Val Lys Gly Pro Pro Asn Met Ala Ala Tyr Gly Thr Ser145 150 155 160Lys Gly Ala Ile Ile Ala Leu Thr Glu Thr Ala Ala Leu Asp Leu Ala

165 170 175Pro Tyr Asn Ile Arg Val Asn Ala Ile Ser Pro Gly Tyr Met Gly Pro

180 185 190Gly Phe Met Trp Glu Arg Gln Val Glu Leu Gln Ala Lys Val Gly Ser

195 200 205Gln Tyr Phe Ser Thr Asp Pro Lys Val Val Ala Gln Gln Met Ile Gly

210 215 220Ser Val Pro Met Arg Arg Tyr Gly Asp Ile Asa Glu Ile Pro Gly Val225 230 235 240Val Ala Phe Leu Leu Gly Asp Asp Ser Ser Phe Met Thr Gly Val Asn

245 250 255Leu Pro Ile Ala Gly Gly

260<210>7<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><221>不确定<222>(19)<223>n＝a or c or g or t<220><223>人工序列XDH1-S1引物的描述<400>7gcngayacna tgytngcngc ngtngtnmg 29<210>8<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><221>不确定<222>(19)<223>n＝a or c or g or t<220><223>人工序列XDH1-S2引物的描述<400>8cggaattcgc ngcngtngtn mgngarttyg gnaarcc 37<210>9<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><221>不确定<222>(19)<223>n＝a orc or g or t<220><223>人工序列XDH2-S1引物的描述<400>9aaraarttya ayggnaargt ntgyytngtnacngc 35<210>10<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><221>不确定<222>(19)<223>n＝a orc or g or t<220><223>人工序列XDH2-S2引物的描述<400>10cggaattcgt nacnggnggn ggnaayathg gnytngc 37<210>11<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列C1引物的描述<400>11gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actca 35<210>12<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列C2引物的描述<400>12cgttagaacg cgtaatacga ctcactatag ggaga 35<210>13<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列XDH2UP-S1的描述<400>13gatcttccga agtcccggac cacgctatcc g 31<210>14<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列XDH2UP-S2引物的描述<400>14cggaattccg tcacagacat aggagcgggc ttcgacgcc 39<210>15<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列XDH2-5’引物的描述<400>15ccgggattcc agagtttgag gcattcgga 29<210>16<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列XDH2-3’引物的描述<400>16ccgggatccg caagatggct cgcaggacgc 30

Claims

1.在如下(A)或(B)中定义的蛋白质：

(A)具有序列表中SEQ ID NO：4氨基酸序列的蛋白质；

(B)具有序列表中SEQ ID NO：4氨基酸序列，其中有一个或几个氨基酸发生替换、缺失、插入、增加或倒位，且具有木糖醇脱氢酶活性的蛋白质。

2.在如下(C)或(D)中定义的蛋白质：

(C)具有序列表中SEQ ID NO：6氨基酸序列的蛋白质；

(D)具有序列表中SEQ ID NO：6氨基酸序列，其中有一个或几个氨基酸替换、缺失、插入、增加或倒位，且具有木糖醇脱氢酶活性的蛋白质。

3.编码在如下(A)或(B)中定义的蛋白质的DNA：

(A)具有序列表中SEQ ID NO：4氨基酸序列的蛋白质；

4.编码在如下(C)或(D)中定义的蛋白质的DNA：

(C)具有序列表中SEQ ID NO：6氨基酸序列的蛋白质；

5.权利要求3中的DNA，其定义于如下(a)或(b)：

(a)至少含有一段对应于序列表的SEQ ID NO：3中第25到1053位的核苷酸序列的DNA；

(b)在严紧条件下可与具有对应于序列表的SEQ ID NO：3中第25到1053位的核苷酸序列的DNA或由此段核苷酸制备的探针进行杂交，并且能编码有木糖醇脱氢酶活性的蛋白质的DNA。

6.权利要求5中的DNA，严紧条件是在60℃下，盐浓度相当于1x SSC和0.1％SDS时进行洗涤。

7.权利要求4中的DNA，其定义于如下(c)或(d)：

(c)至少含有一段对应于序列表SEQ ID NO：5中第1063到1848位的核苷酸序列的DNA；

(d)在严紧条件下可与具有对应于序列表的SEQ ID NO：5中第1063到1848位的核苷酸序列的DNA或由此段核苷酸制备的探针进行杂交，并且能编码有木糖醇脱氢酶活性的蛋白质的DNA。

8.权利要求7中的DNA，严紧条件是在60℃下，盐浓度相当于1x SSC和0.1％SDS时进行洗涤。

9.以由权利要求3至8中任一DNA编码的木糖醇脱氢酶可被表达的方式被导入所述DNA的细胞。

10.生产木糖醇脱氢酶的方法，所述方法包括在培养基中培养权利要求9的细胞以便木糖醇脱氢酶可以在培养基中产生和积累，并且从培养基中收集木糖醇脱氢酶。

11.生产木糖醇的方法，所述方法包括用权利要求1或2的木糖醇脱氢酶作用于D-木酮糖，并收集产生的木糖醇。

12.生产木糖醇的方法，所述方法包括用权利要求9的细胞作用于D-木酮糖，并收集产生的木糖醇。