CN1275165A

CN1275165A - 通过发酵生产l－谷氨酸的方法

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Publication number: CN1275165A
Application number: CN98810083A
Authority: CN
Inventors: 菅野壮平; 木村英一郎; 松井和彦; 中松亘; 大住刚
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1997-08-12
Filing date: 1998-08-07
Publication date: 2000-11-29
Anticipated expiration: 2018-08-07
Also published as: DE69833200D1; MY123972A; DE69833200T2; EP1004671A4; JP3937726B2; PE105599A1; PL338679A1; CN1179045C; EP1004671B1; WO1999007853A1; ID23892A; BR9811151A; EP1004671A1; AU742609B2; AU8561598A

Abstract

通过在液体培养基中培养具有L－谷氨酸生产能力的棒状杆菌属细菌菌株,其中在这一细菌菌株的细胞中,谷氨酰胺—酮戊二酸氨基转移酶的活性被增强;在该培养基中生产并积累L－谷氨酸;并从该培养基中回收L－谷氨酸这些步骤来生产L－谷氨酸。

Description

通过发酵生产L-谷氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种通过发酵来生产L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸是一种重要的氨基酸，被应用于食品，临床药物及其它方面。

背景技术

传统上，L-谷氨酸主要是通过发酵，用属于短杆菌属、棒状杆菌属或微菌属的所谓的生产L-谷氨酸棒状细菌或其突变体进行生产的(Amino Acid Fermentotios，Gakkai Shuppan Center，195-215(1986))。已知的使用其它细菌菌株来生产L-谷氨基的发酵方法有：使用包括杆菌、链霉菌以及青霉素的微生物的方法(美国专利第3,220,929号)；以及使用包括假单孢菌属、节核细菌属、沙雷氏菌属以及假丝酵母的微生物的方法(美国专利第3,563,857号)。虽然通过使用传统的方法已经可以大大提高L-谷氨酸的生产能力，但是为了满足日益增加的需求，仍需要发展一种更有效、更廉价的生产L-谷氨酸的方法。

L-谷氨酸是由微生物细胞内柠檬酸循环的中间产物α-酮戊二酸通过生物合成而来的。由α-酮戊二酸通过铵离子的同化作用来形成L-谷氨酸的生物合成途径有两条。其中一条途径是在有高浓度的铵离子存在的情况下，通过谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase，下文称“GDH”)的催化来合成L-谷氨酸。另外一条途径(GS/GOGAT途径)是由谷氨酰胺合成酶及谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶来合成L-谷氨酸。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，下文称“GS”)催化L-谷氨酸和铵离子转化为谷氨酰胺的反应；谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶(glutamine-oxoglutaric acid amino transferase，也称“谷氨酸合成酶”(glutamate synthase，下文称“GOGAT”)催化L-谷氨酸合成反应，在该反应中，由已经由GS合成的一分子的谷氨酰胺和一分子的α-酮戊二酸分子合成两分子的L-谷氨酸。迄今为止，利用细菌菌株GDH途径生产L-谷氨酸并通过提高其GDH活性来增强L-谷氨酸生产的方面已有报道，但是利用细菌菌株GS/GOGAT途径生产L-谷氨酸并使其生产得以增强的方法尚不知晓。

本发明的说明

本发明的一个目的是培养能高效生产L-谷氨酸的细菌菌株并提出一种更有效、更廉价的L-谷氨酸生产方法，以满足对L-谷氨酸的日益增长的需求。

本发明的发明者们已经使用其GOGAT活性得到增强的细菌菌株对L-谷氨酸的生产方法进行了研究，上述的GOGAT是参与GS/GOGAT途径的其中一种酶，它催化L-谷氨酸的生成。结果发明者们发现，当能够生产L-谷氨酸的细菌菌株的GOGAT活性被增强时，其生产L-谷氨酸的能力即得以提高，这样即完成了此发明。

也就是说，本发明提供了一种属于棒状杆菌属的细菌菌株，这一菌株具有生产L-谷氨酸的能力，其细胞中的谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的活性被增强。这种谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶活力的增强可以通过增加编码谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶基因的拷贝数来完成。另外，谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶活性的增强也可以通过改变编码该酶基因的表达调控序列来完成。谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶可以得自属于埃希氏杆菌属或棒状杆菌属的微生物。

另外，本发明还提供了一个编码氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的基因，它包含的核苷酸序列至少对应于SEQ ID NO：7中所描述的核苷酸序列的第565-6614位。

而且，本发明还提供了一种通过发酵来生产L-谷氨酸的方法，包括在液体培养基中培养一种属于棒状杆菌属的细菌菌株，该菌株具L-谷氨酸生产能力，其细胞内的谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的活力被增强；在培养基中生产并积累L-谷氨酸；以及从该培养基中回收L-谷氨酸的步骤。

本发明将在下面作详细说明。(1)属于棒状杆菌属的具有生产L-谷氨酸能力的细菌

此处所指的属于棒状杆菌属的细菌是一组在Bergey′s Manual ofDeterminative Bacteriology第8版第599页(1974)中所定义的微生物。这些细菌是好氧、革兰氏阳性、不具有形成芽孢的能力的不耐酸杆菌，同时包括一些曾经被分类为短杆菌属而现在被统一到棒状杆菌属的细菌(见Int.J.Syst.Bacteriol.，41，225(1981))，以及与棒状杆菌属紧密相关的短杆菌属及微菌属中的一些细菌。在上述的属于棒状杆菌属的细菌中，列于下面的已知是L-谷氨酸生产细菌的，是本发明中最优选的。

嗜乙酰棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)

醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)

美棒杆菌(Corynebacterium callunae)

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

Corynebacterium lilium(Corynebacterium glutamicum)

Corynebacterium melassecola

Brevibacterium divaricatum(Corynebacterium glutamicum)

Brevibacterium lactofermentum(Corynebacterium glutamicum)

解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)

Brevibacterium immariophilium

玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)

Brevibacterium flavum(Corynebacterium glutamicum)

生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)

具体地说，这些细菌中的下列菌株被作为例子采用：

嗜乙酰棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC 13870

醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC 15806

美棒杆菌(Corynebacterium callunae) ATCC 15991

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13060

Brevibacterium divaricatum ATCC 14020

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869

Corynebacterium lilium ATCC 15990

Corynebacterium melassecola ATCC 17965

解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolvticum) ATCC 14066

Brevibacterium immariophilium ATCC 14068

玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum) ATCC 13825

黄色短杆菌(Brevibacterium flavum) ATCC 13826

生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis) ATCC 19240

这些菌株可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。每种细菌菌株都指定了一个保藏号。任何人都可以根据保藏号从ATCC中获得相应的细菌菌株。在ATCC的目录中描述了保藏于ATCC中的细菌菌株的保藏号。

当用上述的属于棒状杆菌属的细菌生产L-谷氨酸时，采用下述的任一方法都是可行的。

1.使培养基中生物素的浓度不达到最理想值。参阅S.Okumura，T.Tsugawa，T.Tsunoda及A.Kitai，Nippon Nogeikagaku Kaishi，36，197-203(1962)。

2.如果培养基中含足量的生物素，则向其中加入表面活化剂。参阅I.Shiio，H.Otsuka及N.Atsuya，J.Biochem.，53，333-340(1963)；K.Takinami，H.Okada及T.Tsunoda，Agr.Biol.Chem.，27，853-863(1963)。

3.如果培养基中含足量的生物素，则向其中加入青霉素。参阅美国专利第3,080,297号；日本专利公开第37-1695号(1962)；M.Shibui，T.Kurima，S.Okabe及T.Osawa，Amino Acid and Nucleic Acid，17，61-65(1968)。

另外，还可以通过使用以上所述的属于棒状杆菌属的细菌的突变体的方法来生产L-谷氨酸。值得提及的突变体有：

Brevibacterium lactofermentum AJ 12745(FERM-BP 2922)；见美国专利第5,272,067号。

Brevibacterium lactofermentum AJ 12746(FERM-BP 2923)；见美国专利第5,272,067号。

黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)AJ 12747(FERM-BP2924)；见美国专利第5,272,067号。

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)AJ 12478(FERM-BP 2925)；见美国专利第5,272,067号。

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC 21492。

在本发明中上述的产L-谷氨酸细菌是最优选使用的。(2)GOGAT活性的增强

细菌细胞中GOGAT活性可以这样来增强：连接编码GOGAT的基因片段与在棒状杆菌属细菌中发挥功能的载体以构建重组DNA，把这一重组DNA引入棒状杆菌属细菌的宿主菌株中对其进行转化，从而增强该细菌细胞中GOGAT的活性。GOGAT是由大小亚基组成的异寡聚物，其中大小亚基分别由gltB及gltD基因编码。在转化菌株细胞中编码GOGAT的基因(下文称“gltBD基因”)拷贝数的增加导致了GOGAT活性的增强。

至于gltBD基因，属于棒状杆菌属的细菌的基因以及来源于包括大肠杆菌的其它生物体的基因都可被使用。得自属于棒状杆菌属的细菌的gltBD基因的核苷酸序列尚未知道，但大肠杆菌K-12(Gene，60，1-11(1987))以及酵母(Saccharomyces cerevisiae，GenBank访问号码X89221)的gltBD基因的核苷酸序列早已被阐明。因此，可以根据这些gltBD基因的核苷酸序列合成引物，并通过PCR方法用从例如大肠杆菌K12及Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869中制备的染色体DNA当模板获得这些微生物的gltBD基因。这些引物可以由SEQ IDNos：3-6中所示的引物来举例说明。在随后所述的实施例中所分离的Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869的gltBD基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO：7中。Brevibacterium lactofermentum的gltBD基因是一新颖的基因。

至于用于基因克隆的质粒，任何可以在如大肠杆菌的微生物细胞中复制的质粒都是可用的，而pBR322、pTWV228、pMW119以及pUC19则被具体地举例说明。

此处所指的在棒状杆菌属细菌中发挥功能的载体是，例如，一种可以在棒状杆菌属细菌中自主复制的质粒。下列的是载体的一些具体的例子。

pAM 330，见日本专利申请公开58-67699号(1983)

pHM 1519，见日本专利申请公开58-77895号(1983)

pAJ 655，见日本专利申请公开58-192900号(1983)

pAJ 611，见日本专利申请公开58-192900号(1983)

pAJ 1844，见日本专利申请公开58-192900号(1983)

pCG 1，见日本专利申请公开57-134500号(1982)

pCG 2，见日本专利申请公开58-35197(1983)

pCG 4，见日本专利申请公开57-183799号(1982)

pCG 11，见日本专利申请公开57-183799号(1983)

为了通过连接编码GOGAT的gltBD基因及在棒状杆菌属细菌的细胞中发挥功能的载体来制备重组DNA，用与gltBD基因末端相应的限制性酶对载体进行消化。连接通常是用连接酶，如T4 DNA连接酶来进行的。

当要把如上述所制备的重组DNA导入到棒状杆菌属细菌中时，可以采用任何已知的转化方法。例如，可用的一种方法是用氯化钙对受体细胞进行处理以增加DNA的通透性，这一方法已被报导用于大肠杆菌K-12中(见Mandel，M.及Higa，A.，J.Mol.Bid.，53，159(1970))；可用的另一种方法是用处于生长期的细胞制备感受态细胞随后再把DNA导入其中，这一方法已被报导用于枯草杆菌中(见Duncan，C.H.，Wilson，GA.及Young，F.E.，Gene，1，153(1977))。除此之外，可用的另一种方法是把DNA受体细胞制成原生质体或原生质球形体，它们在重组DNA被导入细胞之后可以容易地吸收重组DNA，这种方法已知可被用于枯草杆菌、放线菌类及酵母中(见Chang，S.及Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.及Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.及Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci.，USA，75，1929(1978))。

在本发明的实施例中所用的转化的方法是电脉冲法(参阅日本专利申请公开2-207291号)。

GOGAT活性的增强也可以通过把多拷贝的gltBD基因导入到上述宿主菌株的染色体DNA中。为了把多拷贝的gltBD基因导入到棒状杆菌属细菌的染色体DNA中，用在染色体DNA中有多拷贝的序列作为目标进行同源重组。可被使用的在染色体DNA上存在多拷贝的序列有重复性DNA、转座元件末端的反向重复序列。而且，如日本专利申请公开2-109985号中所揭示的，可以把gltBD基因整合到转座子中并让转座子转移以把多拷贝的gltBD基因导入到染色体中。通过任何一种方法都可以使经转化的菌株细胞中gltBD基因的拷贝数增加，结果使GOGAT活性增强。

除了上述的基因扩增法之外，GOGAT活性的增强还可以通过把gltBD基因的表达调控序列，如启动子替换成更强的来实现。例如，已知的强有力的启动子有lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、以及λ噬菌体的P_R及P_L启动子。通过把gltBD基因固有的启动子替代成这些启动子即可增强gltBD基因的表达，从而增强GOGAT的活性。(3)使用本发明的细菌菌株生产L-谷氨酸。

通过使用一种具L-谷氨酸生产能力的棒状杆菌属细菌菌株(这一菌株细胞中的GOGAT活性已被增强)即可以普通的方法来生产L-谷氨酸，上述方法使用含有碳源、氮源、无机盐并根据需要含有其它次要有机营养物，如氨基酸及维生素的普通营养培养基。任何可以被用于待培养的细菌菌株的碳源及氮源都可被用于培养基中。

一些糖类，如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、木糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物以及糖蜜被用作碳源。而其它的有机酸如乙醇及柠檬酸也可被单独用作碳源，或与其它的碳源结合使用。

可用作氮源的是氨、铵盐如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵以及乙醇铵或者硝酸盐。

至于次要有机营养物，氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸以及蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物以及大豆蛋白水解物这些含有上述营养成分的物质都可被使用。如果使用的是需要氨基酸或其它物质用于生长的营养突变型的突变体，则应该补充必需的营养物质。

可用作无机盐的有磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等等。

至于培养方法，培养是在有氧条件下进行的，发酵温度被控制在20至45℃之间，而pH值刚被控制于5至9之间。如果pH值在培养的过程中降低了，则加入碳酸钙或用碱性物质如氨气对培养基进行中和。如此培养10小时至4天之后，在培养基中即可积累大量的L-谷氨酸。

至于在培养后从培养基中回收L-谷氨酸的方法，任何已知的回收方法都可被使用。例如，可以在把细胞从培养基中除去之后用浓缩结晶法来收集产物。或者也可以用离子交换层析或其它方法。

附图的简要说明

图1中所示的是质粒pBD35-43的构建过程。

优选实施方案的描述

以下参照实施例对本发明进行更具体的解释。实施例1(1)大肠杆菌K-12gltBD基因的克隆

大肠杆菌K-12的gltBD基因的核苷酸序列是已知的(Gene，60，1-11(1987))。以上述报导的核苷酸序列为基础，合成了如序列表中SEQID NOs：1及2中所示的引物并根据PCR方法用源于大肠杆菌K-12的JM 109菌株的染色体DNA(由Takara Shuzo Co.，Ltd生产)为模板对gltBD基因进行扩增。

在所合成的引物中，SEQ ID NO：1对应于在Gene，60，6(1987)中所描述的gltBD基因核苷酸序列图中的第57至96位核苷酸，但是在引物中，第77及第78位核苷酸被从A替换为G，而且已在其中插入了限制性酶GamHI的识别位点。SEQ ID NO：2对应于在Gene，60，7(1987)中所描述的gltBD基因核苷酸序列图中的第6261至第6290位核苷酸，但是在引物中，第6380位核苷酸被从T替换为G，第6282位核苷酸被从A替换成T，第6284位核苷酸被从A替换成C，这样就插入了限制性酶BamHI的识别位点。而且SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列是在Gene，60，7(1987)中所描述的核苷酸序列图中第6261至6290位核苷酸的互补链，是从5′端开始的。

大肠杆菌K-12染色体DNA的制备是根据通常的方法进行的(Seibutsu-kogaku Jikken-sho，Nihon Seibutsu Kougaku-kai编辑，97-98，Baifu-kan，(1992))。而且，PCR反应也是用PCRTechnology(Henry Enrich编辑，Stockton Press，1989，第8页)中所描述的标准反应条件进行的。

把获得的PCR产物用通常的方法进行纯化，然后用限制性酶BamHI对其进行处理，接着用连接试剂盒把其与已经BamHI消化的pMW219(由Nippon Gene Co.，Ltd.生产)相连接，然后用大肠杆菌JM 109(由Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)的感受态细胞进行转化。然后把细胞涂布在含有10μg/ml IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、40μg/mlX-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)以及25μg/ml卡拉霉素的L培养基(10g/l细菌用胰蛋白胨，5g/l细菌用酵母提取物、15g/l NaCl，15g/l琼脂，pH7.2)上并培养过夜，然后挑出所形成的白色菌落并把其分离为单一菌落以获得转化菌株。

用碱法从转化菌株制备质粒(Seibutsu-kogaku Jikken-sho，NihonSeibutsu Kogaku-kai编辑，105，Baifu-kan，(1992))，然后给已被插入到载体中的DNA片段制作一张限制性位点图谱，然后根据它与已报导的gltBD基因限制性位点图谱的比较，把在其中已经插入了一个其限制性位点图谱与已报导的图谱一致的DNA片段的质粒命名为pMWGOGAT35。

另外，为了证实gltBD基因已被表达，用电穿孔法把pMWGOGAT35导入到缺乏gdh及gltB并有L-谷氨酸需求的大肠杆菌PA340菌株中。结果，导入了pMWGOGAT35的转化菌株的L-谷氨酸需要消失了，这样，gltBD基因的表达即得确证实。(2)构建一个含有大肠杆菌K-12 gltBD基因及一棒状杆菌属细菌复制起始位点的质粒。

图1中示出了构建一个含有大肠杆菌K-12 gltBD基因以及棒状杆菌属细菌复制起始位点的质粒的过程。具体地说，用限制性酶BamHI及KpnI对质粒pHK₄(日本专利申请公开5-7491号)进行消化(这一质粒带有来源于可以在棒状杆菌属细菌中自主复制的质粒pHM 1519(Agric.Biol.Chem.，48，2901-2903(1984)的复制起始位点(日本专利申请公开Hei 5-7491号))以获得包括复制起始位点的基因片段，然后用DNA切齐试剂盒(由Takara Shuzo Co.，Ltd.，Blunting Kit)把所得片段的末端切齐，然后把这一片段导入到质粒pMWGOGAT 35的XbaI位点上，此前在质粒pMWGOGAT中已经用XbaI连接序列(由TakaraCo.，Ltd.生产)插入了被克隆的大肠杆菌K-12菌株的gltBD基因。把这一质粒命名为pBD 35-43。(3)把pBD 35-43导入棒状杆菌属AJ 12036及AJ 13029的野生型细菌株菌中并通过培养来估计所获得的转化子

用电脉冲法(参照日本专利公开公告2-207791号)用质粒pBD35-43对棒状杆菌属AJ 12036(Agric.Giod.Chem.，51，93-100(1987))及AJ 13029的野生型细菌株菌进行转化并获得转化菌株。培养通过在野生型菌株AJ 12036中导入质粒pBD 35-43而获得的转化菌株AJ 12036/pBD 35-43以便在下述的生物素限制条件下生产L-谷氨酸。把培养在含有25μg/ml卡拉霉素的CM2B培养基平板上的AJ12036/pBD35-43菌株的细胞接种在培养基(80g葡萄糖、1g KH₂PO₄、0.4g MgSO₄·7H₂O、30g(NH₄)₂SO₄、0.01g FeSO₄·7H₂O、0.01gMnSO₄·7H₂O、15ml大豆水解物、200μg盐酸硫胺素、60μg生物素、25mg卡拉霉素、50g CaCO₃加入1升纯水中，用KOH调到pH8.0)中，细胞在31.5℃下振荡培养，直到培养基中的糖耗尽为止。把所获得的培养物接种在不加生物素和卡拉霉素的上述培养基(下文称“生物素限制培养基”)中，培养数量为5％，31.5℃振荡培养直到培养基中的糖耗尽为止。在对照实验中，用如上所述的同样的方法培养AJ 12036菌株。培养完成之后，用Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.生产的Biotech Analyzer AS-210测量培养基中所积累的L-谷氨酸的数量。所得结果示于表1中。

表1

细菌菌株	L-谷氨酸的积累(g/L)
细菌菌株	L-谷氨酸的积累(g/L)	AJ 12036	34.3
AJ 12036/pBD 35-43	36.8	AJ 12036	34.3

另外，通过把质粒pBD 35-43导入AJ 13029菌株获得转化菌株AJ13029/pBD 35-43并如下进行培养以生产L-谷氨酸。把培养在含有25μg/ml卡拉霉素的CM2B培养基平板上的AJ 13029/pBD35-43菌株的细胞接种到培养基(30g葡萄糖、1g KH₂PO₄、0.4g MgSO₄·7H₂O、30g(NH₄)₂SO₄、0.01g FeSO₄·7H₂O、0.01g MnSO₄·7H₂O、15ml大豆水解物、200μg盐酸硫胺素、60μg生物素、25mg卡拉霉素以及50g CaCO₃加入到1升纯水中，用KOH调到pH8.0)，在31.5℃进行振荡培养直到培养基中的糖耗尽为止。以5％的量将获得的培养物接种进相同组成的培养基中，然后在37.0℃振动培养直至培养基中的糖耗尽为止。作为对照，用如上所述的同样方法培养AJ 12029菌株。培养完成后，用Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.生产的Biotech AnalyzerAS-210测量培养基中所积累的L-谷氨酸的数量。所得结果示于表2中。AJ 12029菌株是在WO 96/06180中所描述的一种菌株，它对生物素活性抑制物质具温度敏感性。这一菌株被根据布达佩斯条约保藏于National Institute of Bioscience and Human Technology，Agencyof Industrial Science and Technology，Ministry of InternationalTrade and Industry(邮编：305-8566，1-3 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)中。这一菌株的保藏号为FERM BP-5189。

表2

细菌菌株	L-谷氨酸的积累(g/L)
细菌菌株	L-谷氨酸的积累(g/L)	AJ 13029	16.5
AJ 13029/pBD 35-43	17.7	AJ 13029	16.5

基于以上结果，可以清楚地发现属于棒状杆菌属并通过引入gltBD基因而使其GOGAT活性增强的产L-谷氨酸细菌的L-谷氨酸产量提高了。实施例2(1)Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 gltBD基因的克隆

当用属于棒状杆菌属的细菌通过发酵法生产L-谷氨酸时，使用源于该种细菌的gltBD基因是合乎需求的。

SEQ ID NOs：3及4中所示的寡核苷酸是根据由在大肠杆菌和酵母中高度同源的gltB基因产物的选定区域的氨基酸序列推断而得的核苷酸序列合成的。用Bacterial Genomic DNA纯化试剂盒(由Advancedgenetic Technologies Corp.生产)制备Brevibacterium lactofermentumATCC 13869的染色体DNA。以上述的寡核苷酸为引物、以染色体DNA为模板，用“PCR Technology”(Henry Enrich编辑，Stockton Press，1989，第8页)中所描述的标准反应条件进行PCR反应。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果发现扩增出了一个长度大概为1.4Kbp的DNA片段。用SEQ ID NOs：3及4中的寡核苷酸对所得DNA的两端进行测序。测序是用DNA测序试剂盒(由Applied Biosystems Co.，Ltd.生产)根据Sanger的方法(J.Mol.Boil.，143，161(1980))进行的。把所确定的核苷酸序列翻译为氨基酸并把这一氨基酸序列与由大肠杆菌及酵母的gltB基因推断的氨基酸序列进行比较。结果，因为存在高度的同源性，所以可以下结论由PCR扩增的DNA片段是Brevibacteriumlactofermentum ATCC 13869的gltB基因的一部分。然后，用通常的方法用ECoRI、BamHI、HindIII、PstI以及SalI(由Takara Shuzo Co.，Ltd生产)对通过上述方法所制备的Brevibacterium lactofermentumATCC 13869染色体DNA进行消化并用经扩增的DNA片段作为探针以及DIG DNA标记及检测试剂盒(由Boeringer Mannhein生产)进行Southern杂交。结果发现有由HindIII酶切而得的大约14kb的片段与DNA探针发生杂交。这样，用琼脂糖凝胶对用通常方法制备的Brevibacteriumlactofermentum ATCC 13869染色体DNA的HindIII片段进行电泳，并用玻璃粉回收了大约10kb大小或更大的DNA片段。用连接试剂盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)把经回收的DNA片段连接到已经限制性酶HindIII(由Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)酶切的载体pMW219(由Nippon Gene Corporation生产)上。用连接混合物对大肠杆菌JM109(由Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)的感受态细胞进行转化。把转化菌株涂布在含有10μg/ml IPIG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、40μg/ml X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)以及25μg/ml卡拉霉素的L培养基(10g/l细菌用胰蛋白胨，5g/l细菌用酵母提取物，15g/l NaCl，15g/L琼脂糖，pH7.2)，培养过夜。把由此获得的白色菌落挑起来并把其分离为单菌落，获得大约1000个转化菌株。使用所获得的转化菌株，用碱性法(Seibutsu-kogaku Jikken-sho，Nihon Seibutsu-kogaku Gakkai，105，Baifu-kan，(1997))制备质粒。用如上所述的条件，用含有如SEQ ID NOs：5及6中所示的核苷酸序列且是根据DNA序列中被用作探针的被测序的那一部分进行合成的合成寡核苷酸当引物，并且用上述的质粒当模板，进行PCR反应。然后挑选出那些能够扩增出长度大概为1.3kbp的片段的转化菌株，这一扩增片段与用上述引物并用Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869的染色体当模板进行PCR反应所扩增出来的DNA片段大小是相同的。(2)Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 gltBD基因核苷酸序列的测定

从在(1)中通过碱法获得的转化菌株制备的质粒DNA含有来源于Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869染色体的大约为14kbp的DNA片段。用与如上所述同样的方法测定了来源于Brevibacteriumlactofermentum ATCC 13869染色体的长度大约为14kbp的DNA片段中所含的gltBD基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：7中所示的如上所测定的这些核苷酸序列中含有gltBD基因的AatII片段。从核苷酸序列分析可以假定存在有两个开放阅读框。SEQ ID NO：7中还示出了从核苷酸序列推定的翻译产物的氨基酸序列。也就是说，编码两个含有SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列的蛋白质的基因是Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869的gltBD基因。在这一序列中，第565至5094号核苷酸对应于gltBD基因，第5097至6614则对应于gltD基因。SEQ ID NOs：8及9分别示出了由gltB基因及gltD基因所编码的氨基酸序列。顺便提一下，由于位于蛋白质N端的甲硫氨酸残基是源于起始密码ATG的，所以这一残基通常与蛋白质自身的功能并不存在联系，而且公知的是它在翻译后将由肽酶除去。相应地，在上述蛋白质的情形中，甲硫氨酸残基也可能被除去了。

把核苷酸序列及氨基酸序列与已知的序列进行同源性比较。所用的数据库是EMBL及SWISS-PROT。结果发现，SEQ ID NO：7中所示的DNA是棒状杆菌属细菌中一个新的基因，它与已被报导的大肠杆菌、酵母等等的gltBD基因具同源性。(3)制备含有Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869的gltBD基因以及棒状杆菌属细菌的复制启始位点的质粒

为了研究Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869的gltBD基因的扩增效力，构建了一个含有Brevibacterium lactofermentum ATCC13869的gltBD基因以及棒状杆菌属细菌的复制启始位点的质粒。具体地说，用限制性酶AatII剪切质粒DNA，这一DNA含有源于Brevibacteriumlactofermentum ATCC 13869染色体的大约为14kbp的DNA片段，这一片段是从在(1)中获得的转化菌株用碱法制备的。剪切后获得含有Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869的gltBD基因的DNA片段，把所得的这一片段的末端用DNA切平试剂盒(由Takara Shuzo Co.，Ltd生产，Blunting Kit)切平，然后把其插入到质粒pVC 7中限制性酶SmaI的位点中，其中质粒pVC 7含有源于质粒pAM 330的复制起始位点，而质粒pAM 330可以在棒状杆菌属细菌中自主复制(日本专利申请公开Sho 58-67699号)。这一质粒被命名为pVCGOGAT。把pHSG 399(一种大肠杆菌载体，Cmr；Takeshita，S.等人，Gene，61，63-74(1987)与pAM 330(一种Brevibacterium lactofermentum的隐藏质粒)连接在一起以构建质粒pVC 7。pAM 330是用Brevibacteriumlactofermentum ATCC 13869菌株制备的。用仅产生一个剪切位点的限制性酶AvaII(Takara Shuzo生产)对pHSG 399进行酶解，然后用T4DNA聚合酶把末端切平，再把其与已经过HindIII(Takara Shuzo生产)酶解并用T4 DNA聚合酶切平末端的pAM 330相连接。PVC 7在大肠杆菌及Brevibacterium lactofermentum中都可以自主复制并含有源于pHSG 339及lacZ′的多克隆位点。

进而，为了证实gltBD基因已被表达，用电穿孔法把pVCGOGAT导入到缺少gdh及gltB并有L-谷氨酸需求的大肠杆菌PA 340菌株(E.Coli Genetic Stock Center(Yale University，U.S.A.))中。结果发现，含有pVCGOGAT的转化菌株不再对L-谷氨酸有需求，从而由此证实gltBD基因已被表达。(4)把pVCGOGAT导入到棒状杆菌属AJ 12036细菌野生型菌株中并对其估计其培养的情况

通过电脉冲法(日本专利出版公开Hei 2-207791号)用质粒pVCGOGAT对棒状杆菌属AJ 12036细菌(Agric.Biol.Chem.，51，93-100(1987))的野生型菌株进行转化以获得转化菌株。把通过把质粒pVCGOGAT导入到AJ 12036野生型菌株而获得的转化菌株AJ12036/pVCGOGAT在如下的生物素限制条件中进行培养以生产L-谷氨酸。把通过培养于含有5mg/ml氯霉素的CM2B培养基平板而获得的AJ12036/pVCGOGAT菌株的细胞接种在培养基(80g葡萄糖、1gKH₂PO₄、0.4g MgSO₄·7H₂O，30g(NH₄)₂SO₄、0.01gFeSO₄·7H₂O、0.01g MnSO₄·7H₂O、15ml大豆水解液、200μg盐酸硫胺素、60μg生物素、10mg氯霉素、50g CaCO₃，加入到1升的纯水中，用KOH调到pH 8.0)中并在31.5℃振荡培养，直至培养基中的糖耗尽为止。

把所得的培养物以5％的数量接种到不含有生物素及氯霉素的上述培养基(下文称“生物素限制培养基”)中并在31.5℃振荡培养，直至培养基中的糖耗尽为止。作为对照，用如上所述的同样方法培养通过把pVC7用如上所述方法导入到AJ 12036菌株中而制备的细菌菌株。培养之后，用Biotech Analyzer AS-210(Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.生产)测量培养基中所积累的L-谷氨酸的数量。结果示于表3中。

表3

细菌菌株	L-谷氨酸的积累(g/L)
细菌菌株	L-谷氨酸的积累(g/L)	AJ 12036/pVC7	33.6
AJ 12036/pVCGOGAT	37.0	AJ 12036/pVC7	33.6

工业实用性

根据本发明的方法，属于棒状杆菌属的能够生产L-谷氨酸的细菌菌株，当其GOGAT活性被增强时，其L-谷氨酸的生产能力即可被提高，从而使L-谷氨酸的生产变得更加廉价和有效。而且，获得源于棒状杆菌属细菌的gltBD基因并把其有效地用于棒状杆菌属细菌的谷氨酸生产。

序列表<110>AJINOMOTO CO.，INC.<120>通过发酵生产L-谷氨酸的方法<130>OP 778<140>PCT/JP98/03535<141>1998-08-07<150>JP 9-216906<151>1997-08-12<160>9<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>30<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述：用于扩增大肠杆菌gltBD基因的引物<400>1agccttaaag ataggatcca ttttaatttc<210>2<211>30<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述：用于扩增大肠杆菌gltBD基因的引物<400>2attcatggat ccctcgctta aacttccagc<210>3<211>17<212>DNA<213>人造序列<220><221>未确定<222>(3，9，12)<223>n＝a或c或g或t<220><223>人造序列的描述：用于扩增Brevibacterium lactofermentumgltBD基因的引物<400>3ggngarggng gngarga<210>4<211>18<212>DNA<213>人造序列<220><221>未确定<222>(1，4，7)<223>n＝a或c或g或t<220><223>人造序列的描述：用于扩增Brevibacterium lactofermentumgltBD基因的引物<400>4nccnccngtc atrtaytc<210>5<211>32<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述：用于扩增Brevibacterium lactofermentumgltBD基因的引物<400>5aatccacgtg aagctagtgg cagaacaagg cg<210>6<211>30<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述：用于扩增Brevibacterium lactofermentumgltBD基因的引物<400>6acgaatgaac aattcaccac tggttgcgcc<210>7<211>8734<212>DNA<213>Brevibacterium lactofermentum<220><221>CDS<222>(565)..(5094)<220><221>CDS<222>(5097)..(6614)<400>7gacgtcgcgg aggaatgctg ccacgccttc gatttttccg gaatcgtctt tcaggatcgt 60gatggagaat tccagggaca ttttagatcc gtctgcacgc actcccggaa cattgagggg 120ctcggagccg tagcgggttt caccggattc catgacgtga tcccatccgt cccagtgtgc 180cttgcggtgt ttttcgggga tgatgatgtc gagggatttt ccgagtgctt cgccggccgt 240gtatccaaag agtttctcgg agccgccgtt ccagagtctg attattccat cgcgggtggc 300gtagatgatt gcttcttctg tttcggtgac aagtcgggct gcgatggtgt caaaatcgac 360catttttatc ttctttcacg gggtggatag gcgaacatct tctaccatat cctgtgatgt 420gtaacacagg agcgtaatct gacctcccgt tttcctatag attgatcgaa agtaaccctt 480ttgttacttg cgttgcaggt agtgcgcctg attttcttat tatcgaacga ttgatagaaa 540caggattaaa gtgaggtatc ccgc atg aaa cca caa gga ctc tac aac cct 591

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1 5gcg cat gaa cat gac gcc tgc ggt gtg gcg ttt att gcg gat atc cac 639Ala His Glu His Asp Ala Cys Gly Val Ala Phe Ile Ala Asp Ile His10 15 20 25ggt cga ccc agc cgc agc att gtt gat cgt gca ctt gag gcg ctt cgc 687Gly Arg Pro Ser Arg Ser Ile Val Asp Arg Ala Leu Glu Ala Leu Arg

30 35 40aac att gac cac cgt ggc gca gcc ggt gca gag aag aac act ggc gat 735Asn Ile Asp His Arg Gly Ala Ala Gly Ala Glu Lys Asn Thr Gly Asp

45 50 55ggt gcg ggc atc ctc atg cag att ccg gac ggc ttt tat cgt gaa gta 783Gly Ala Gly Ile Leu Met Gln Ile Pro Asp Gly Phe Tyr Arg Glu Val

60 65 70tct ggc att gag ctt cct gag gca ggg gag tat gcc act ggt att gcg 831Ser Gly Ile Glu Leu Pro Glu Ala Gly Glu Tyr Ala Thr Gly Ile Ala

75 80 85ttc ttg cct cgc ggt cgc atg gcg atg atg gat gct cag aag gaa att 879Phe Leu Pro Arg Gly Arg Met Ala Met Met Asp Ala Gln Lys Glu Ile90 95 100 105gag cgc atc gca aag caa gaa ggt gcc gat gtg ctt ggt tgg cgc atg 927Glu Arg Ile Ala Lys Gln Glu Gly Ala Asp Val Leu Gly Trp Arg Met

110 115 120gtt cct ttt gat tcc cgt gag ctg ggt tcc atg gct gag gag gcg atg 975Val Pro Phe Asp Ser Arg Glu Leu Gly Ser Met Ala Glu Glu Ala Met

125 130 135cct agt ttc gcg cag att ttc ctt act gtg cct gga aaa tct ggt gaa 1023Pro Ser Phe Ala Gln Ile Phe Leu Thr Val Pro Gly Lys Ser Gly Glu

140 145 150gat ctt gac cgt gtg atg ttc ttt atc cgt aag cgt tgt gag cgt gag 1071Asp Leu Asp Arg Val Met Phe Phe Ile Arg Lys Arg Cys Glu Arg Glu

155 160 165ctg ggc acc acc aat ggt cgc gat acg gtg tat ttc ccg tcg cta tct 1119Leu Gly Thr Thr Asn Gly Arg Asp Thr Val Tyr Phe Pro Ser Leu Ser170 175 180 185tca cgc acc atc att tac aaa ggc atg ttg acc act ctg cag ctt gag 1167Ser Arg Thr Ile Ile Tyr Lys Gly Met Leu Thr Thr Leu Gln Leu Glu

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205 210 215att gtg cac tcg cgt ttc tcc acg aac act ttc cca agc tgg ccg ctg 1263Ile Val His Ser Arg Phe Ser Thr Asn Thr Phe Pro Ser Trp Pro Leu

220 225 230gcg cac ccg tac cgt ttc gtt gcc cac aac ggt gag atc aac act gtg 1311Ala His Pro Tyr Arg Phe Val Ala His Asn Gly Glu Ile Asn Thr Val

235 240 245cgt ggc aat gaa aac tgg atg cgc gcc cgc gag gcg ctt atc aaa aac 1359Arg Gly Asn Glu Asn Trp Met Arg Ala Arg Glu Ala Leu Ile Lys Asn250 255 260 265gac aag ctg ggc aat ttg agc agc gtg ctg cct atc tgc acc ccg gag 1407Asp Lys Leu Gly Asn Leu Ser Ser Val Leu Pro Ile Cys Thr Pro Glu

270 275 280ggc tcg gat acc gcg cgt ttc gac gag gct ttg gag ctt ttg cac ctg 1455Gly Ser Asp Thr Ala Arg Phe Asp Glu Ala Leu Glu Leu Leu His Leu

285 290 295ggc gga tac tca ctt ccg cat gct gtt gcg atg atg atc cct cag gcg 1503Gly Gly Tyr Ser Leu Pro His Ala Val Ala Met Met Ile Pro Gln Ala

300 305 310tgg gaa cac aac aag acg ctg agc cct gag ctg cgt gat ttc tac gaa 1551Trp Glu His Asn Lys Thr Leu Ser Pro Glu Leu Arg Asp Phe Tyr Glu

315 320 325tac cac tct tgt ctg atg gag cca tgg gat ggt cct gca gcg ctg gca 1599Tyr His Ser Cys Leu Met Glu Pro Trp Asp Gly Pro Ala Ala Leu Ala330 335 340 345ttt act gac ggt cgt ttt gtg ggt gcc gtg ctg gac cgt aat ggc ctg 1647Phe Thr Asp Gly Arg Phe Val Gly Ala Val Leu Asp Arg Asn Gly Leu

350 355 360cga cct ggg cga atc acc att act gat tcg ggt ttg gtt gtg atg gct 1695Arg Pro Gly Arg Ile Thr Ile Thr Asp Ser Gly Leu Val Val Met Ala

365 370 375tct gaa tcg gga gtg ttg gac ttg agg gag gag agc gtc gta aag cgt 1743Ser Glu Ser Gly Val Leu Asp Leu Arg Glu Glu Ser Val Val Lys Arg

380 385 390act cgc gta cag cct gga cgc atg ttc ctt gtt gac acg gcc gag ggt 1791Thr Arg Val Gln Pro Gly Arg Met Phe Leu Val Asp Thr Ala Glu Gly

395 400 405cgc atc gtt gaa gac gag gaa atc aag cag aaa tta agc gaa gcg cag 1839Arg Ile Val Glu Asp Glu Glu Ile Lys Gln Lys Leu Ser Glu Ala Gln410 415 420 425cca tat ggt gag tgg att cgc gat aat ttt gtg cat ctg gat cgt ctg 1887Pro Tyr Gly Glu Trp Ile Arg Asp Asn Phe Val His Leu Asp Arg Leu

430 435 440cct cag aca cgc tac aac tac atg gcg cac tct cgt gct gtg ttg cgt 1935Pro Gln Thr Arg Tyr Asn Tyr Met Ala His Ser Arg Ala Val Leu Arg

445 450 455cag cgt gtt ttc gga atc act gaa gaa gat gtg gat ttg ttg ctg ctg 1983Gln Arg Val Phe Gly Ile Thr Glu Glu Asp Val Asp Leu Leu Leu Leu

460 465 470ccg atg gcc cgc cag ggt gct gag gcg att ggt tcc atg ggt tcg gat 2031Pro Met Ala Arg Gln Gly Ala Glu Ala Ile Gly Ser Met Gly Ser Asp

475 480 485acg cca att gcg gcg cta tcc cag cga cca cgc atg ctt tat gat ttc 2079Thr Pro Ile Ala Ala Leu Ser Gln Arg Pro Arg Met Leu Tyr Asp Phe490 495 500 505ttc gcg cag cgc ttt gct cag gtg aca aac cca ccg ttg gac tct atc 2127Phe Ala Gln Arg Phe Ala Gln Val Thr Asn Pro Pro Leu Asp Ser Ile

510 515 520cgc gaa aag cct gtg acc agc atg ttc act ttg ttg ggt gcg cag tct 2175Arg Glu Lys Pro Val Thr Ser Met Phe Thr Leu Leu Gly Ala Gln Ser

525 530 535gac gtg ctc aat ccg ggt cct gat gcg gcg cga cgt atc cgt ttg gaa 2223Asp Val Leu Asn Pro Gly Pro Asp Ala Ala Arg Arg Ile Arg Leu Glu

540 545 550tcg ccg atc att gat aac cat gag ctg gcc acc ttg atc aat gcc aac 2271Ser Pro Ile Ile Asp Asn His Glu Leu Ala Thr Leu Ile Asn Ala Asn

555 560 565gcg cat ggt gag tgg gat tcc ttt ggt gct gct gta att tct ggt ttg 2319Ala His Gly Glu Trp Asp Ser Phe Gly Ala Ala Val Ile Ser Gly Leu570 575 580 585tac cca gtg gct cac cat ggt gcc ggc atg aag gct gcg att gct cgt 2367Tyr Pro Val Ala His His Gly Ala Gly Met Lys Ala Ala Ile Ala Arg

590 595 600gtg cgc cgc gag gtt tct gaa gca atc cgc aat ggc aag acg ttg atc 2415Val Arg Arg Glu Val Ser Glu Ala Ile Arg Asn Gly Lys Thr Leu Ile

605 610 615gtg ctg tcg gat cgt gaa tct gat gag cgc atg gca cct atc cct gcg 2463Val Leu Ser Asp Arg Glu Ser Asp Glu Arg Met Ala Pro Ile Pro Ala

620 625 630ctg ctg ctg act tcc gct gtg cat cag tac ttg gtg cag caa cgt acc 2511Leu Leu Leu Thr Ser Ala Val His Gln Tyr Leu Val Gln Gln Arg Thr

635 640 645cgt acc cag tgc tcc ctg gtg gtg gaa tcc ggc gat gcc cgc gag gtt 2559Arg Thr Gln Cys Ser Leu Val Val Glu Ser Gly Asp Ala Arg Glu Val650 655 660 665cat cac ctg gcg atg ctc att ggt ttt ggt gcc gat gcg atc aac ccg 2607His His Leu Ala Met Leu Ile Gly Phe Gly Ala Asp Ala Ile Asn Pro

670 675 680tac atg gca ttt gaa acc arc gat gag ctg cgc atg aag ggt cag ttg 2655Tyr Met Ala Phe Glu Thr Ile Asp Glu Leu Arg Met Lys Gly Gln Leu

685 690 695ggt gat ctt tct ttg gat gag gca tcc cga aac tac atc aag gca gcc 2703Gly Asp Leu Ser Leu Asp Glu Ala Ser Arg Asn Tyr Ile Lys Ala Ala

700 705 710acc act ggt gtg ctg aag gtg atg tcc aag atg ggc att gca acg gtg 2751Thr Thr Gly Val Leu Lys Val Met Ser Lys Met Gly Ile Ala Thr Val

715 720 725tct tcg tac cgt ggc gcg cag ctt gct gat gtc acc ggt ctg cat cag 2799Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Gln Leu Ala Asp Val Thr Gly Leu His Gln730 735 740 745gat ctc ctg gac aac tac ttc ggt ggc att gct tca cca att tct ggt 2847Asp Leu Leu Asp Asn Tyr Phe Gly Gly Ile Ala Ser Pro Ile Ser Gly

750 755 760atc ggt ctg gat gag gtt gca gct gat gtg gaa gct cgt cac cgc agc 2895Ile Gly Leu Asp Glu Val Ala Ala Asp Val Glu Ala Arg His Arg Ser

765 770 775gca ttt ttg cca cgc cca gaa gag cac gct cac cgc gaa ttg gat ttg 2943Ala Phe Leu Pro Arg Pro Glu Glu His Ala His Arg Glu Leu Asp Leu

780 785 790ggt ggt gaa tac aag tgg cgc cgc gaa ggt gaa tat cac ctg ttc aac 2991Gly Gly Glu Tyr Lys Trp Arg Arg Glu Gly Glu Tyr His Leu Phe Asn

795 800 805cca gaa acc atc ttc aag ctg cag cat gca act cgt tct ggc agc tac 3039Pro Glu Thr Ile Phe Lys Leu Gln His Ala Thr Arg Ser Gly Ser Tyr810 815 820 825gag att ttc aag gat tac acc cgc aag gtt gat gat caa tcc act cgc 3087Glu Ile Phe Lys Asp Tyr Thr Arg Lys Val Asp Asp Gln Ser Thr Arg

830 835 840ttg ggt act att cgt gga ctg ttt gag ttc agc acg gat cgc aag cca 3135Leu Gly Thr Ile Arg Gly Leu Phe Glu Phe Ser Thr Asp Arg Lys Pro

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860 865 870tcc act ggt gcg atg tct tat ggc tcg att tct gct gaa gcc cat gag 3231Ser Thr Gly Ala Met Ser Tyr Gly Ser Ile Ser Ala Glu Ala His Glu

875 880 885gtc ttg gcc atc gcc atg aac cga ctg ggc ggt atg tcc aac tcc ggc 3279Val Leu Ala Ile Ala Met Asn Arg Leu Gly Gly Met Ser Asn Ser Gly890 895 900 905gaa ggt ggc gag gac gcc cgc cga ttc gat gtg gaa ccc aac ggt gac 3327Glu Gly Gly Glu Asp Ala Arg Arg Phe Asp Val Glu Pro Asn Gly Asp

910 915 920tgg aag cgc tct gcc att aag cag gtg gcc tcg gga cgt ttc ggc gtg 3375Trp Lys Arg Ser Ala Ile Lys Gln Val Ala Ser Gly Arg Phe Gly Val

925 930 935acc agc cac tac ttg aac aac tgc acc gat att cag atc aag atg gca 3423Thr Ser His Tyr Leu Asn Asn Cys Thr Asp Ile Gln Ile Lys Met Ala

940 945 950cag ggc gca aag ccc ggt gaa ggt ggc cag ctg cca cca aac aag gtg 3471Gln Gly Ala Lys Pro Gly Glu Gly Gly Gln Leu Pro Pro Asn Lys Val

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1020 1025 1030tcc aaa gca cac gct gat gtg gtg ctt att tcc ggc cac gac ggc gga 3711Ser Lys Ala His Ala Asp Val Val Leu Ile Ser Gly His Asp Gly Gly

1035 1040 1045act ggc gca tct cct ttg acc tcc ctg aag cat gcc ggt ggt cca tgg 3759Thr Gly Ala Ser Pro Leu Thr Ser Leu Lys His Ala Gly Gly Pro Trp1050 1055 1060 1065gag ttg ggc ttg gct gaa acc cag caa acg ttg ctg ctc aac ggc ctg 3807Glu Leu Gly Leu Ala Glu Thr Gln Gln Thr Leu Leu Leu Asn Gly Leu

1070 1075 1080cgt gat cgt att cgc gtg cag tgc gat ggt cag ctg aaa act ggc cga 3855Arg Asp Arg Ile Arg Val Gln Cys Asp Gly Gln Leu Lys Thr Gly Arg

1085 1090 1095gac gta gtt atc gca gct ctg ctc ggt gcc gaa gaa ttc ggt ttc gcc 3903Asp Val Val Ile Ala Ala Leu Leu Gly Ala Glu Glu Phe Gly Phe Ala

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1115 1120 1125ctg gac acc tgc ccg gtg ggt atc gct acc cag aac ccg gat ttg cgt 3999Leu Asp Thr Cys Pro Val Gly Ile Ala Thr Gln Asn Pro Asp Leu Arg1130 1135 1140 1145tcc aag ttc acc ggc aag gct gaa cac gtg gtc aac ttc ttc acc ttc 4047Ser Lys Phe Thr Gly Lys Ala Glu His Val Val Asn Phe Phe Thr Phe

1150 1155 1160atc gcc cag gaa gtc cgt gag tac ttg gca cag ctt ggt ttc cgc tct 4095Ile Ala Gln Glu Val Arg Glu Tyr Leu Ala Gln Leu Gly Phe Arg Ser

1165 1170 1175att gat gaa gcc gta gga caa gcc cag gtg ctg cgt aag cgt tcc gga 4143Ile Asp Glu Ala Val Gly Gln Ala Gln Val Leu Arg Lys Arg Ser Gly

1180 1185 1190atc cca gct gat tcc cgc gca gca cac ctg gat ttg agc cca att ttc 4191Ile Pro Ala Asp Ser Arg Ala Ala His Leu Asp Leu Ser Pro Ile Phe

1195 1200 1205cat cgc cca gaa act cca cac ttc cca act cag gat gtg cgt tgc acc 4239His Arg Pro Glu Thr Pro His Phe Pro Thr Gln Asp Val Arg Cys Thr1210 1215 1220 1225aag acc cag gaa cac agc cta gaa aaa gcc ctg gac aac gca ttt att 4287Lys Thr Gln Glu His Ser Leu Glu Lys Ala Leu Asp Asn Ala Phe Ile

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1245 1250 1255agc att gtt att gat agc tcc atc agc aac gtc aac cgt tca gtt ggc 4383Ser Ile Val Ile Asp Ser Ser Ile Ser Asn Val Asn Arg Ser Val Gly

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1275 1280 1285cca gac ggc acc atc acc ttg aat ctt caa ggc tgc gcc ggt aac tcc 4479Pro Asp Gly Thr Ile Thr Leu Asn Leu Gln Gly Cys Ala Gly Asn Ser1290 1295 1300 1305ttt ggc gcg ttc atc cca cga ggc atc acc atc aac ctc acc ggc gat 4527Phe Gly Ala Phe Ile Pro Arg Gly Ile Thr Ile Asn Leu Thr Gly Asp

1310 1315 1320gcc aat gac ttt gtg ggc aag gga tta tct ggc gga aag att gtg atc 4575Ala Asn Asp Phe Val Gly Lys Gly Leu Ser Gly Gly Lys Ile Val Ile

1325 1330 1335aag cct tcc gct cag gct ccg aag cag ctg aag aac aat cca aat atc 4623Lys Pro Ser Ala Gln Ala Pro Lys Gln Leu Lys Asn Asn Pro Asn Ile

1340 1345 1350att gcc gga aac gtg ctt gga tac ggc gca acc agt ggt gaa ttg ttc 4671Ile Ala Gly Asn Val Leu Gly Tyr Gly Ala Thr Ser Gly Glu Leu Phe

1355 1360 1365att cgt ggc cag gtc ggc gaa cgt ttc tgc gtc cgt aac tct ggc gcc 4719Ile Arg Gly Gln Val Gly Glu Arg Phe Cys Val Arg Asn Ser Gly Ala1370 1375 1380 1385acc gca gtg gtt gaa ggt atc gga aac cac ggt tgt gag tac atg act 4767Thr Ala Val Val Glu Gly Ile Gly Asn His Gly Cys Glu Tyr Met Thr

1390 1395 1400ggc ggc cga gtc ctg gtt ttg ggc ccg gtt ggt gag aac ttt ggt gcc 4815Gly Gly Arg Val Leu Val Leu Gly Pro Val Gly Glu Asn Phe Gly Ala

1405 1410 1415ggc atg tct ggt ggc att gca tac ctg gct aat tcc ccg gac cta aac 4863Gly Met Ser Gly Gly Ile Ala Tyr Leu Ala Asn Ser Pro Asp Leu Asn

1420 1425 1430cag aag atc aat ggc gaa ttg gtg gat gtt gtt cca ctg agc gct gac 4911Gln Lys Ile Asn Gly Glu Leu Val Asp Val Val Pro Leu Ser Ala Asp

1435 1440 1445gat ctg acg tgg gct gat gag ctc att gct cgc cac cgc gaa ctc acc 4959Asp Leu Thr Trp Ala Asp Glu Leu Ile Ala Arg His Arg Glu Leu Thr1450 1455 1460 1465gga tcc gag acc aag ctg cgt gca caa gat ttg gtg aaa atc atg ccg 5007Gly Ser Glu Thr Lys Leu Arg Ala Gln Asp Leu Val Lys Ile Met Pro

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1500 1505 1510 1gac cca caa gga ttc atc aaa tac tcc cga cgc gag cct gca cac cgc 5150Asp Pro Gln Gly Phe Ile Lys Tyr Ser Arg Arg Glu Pro Ala His Arg

5 10 15ccg gtc ccg ctg cgc ctc atg gac tac tcc gag gtc tac gaa aag gca 5198Pro Val Pro Leu Arg Leu Met Asp Tyr Ser Glu Val Tyr Glu Lys Ala

20 25 30ccg gca ggt cag atc gag gaa cag gct gcc cgc tgc atg gat tgc ggt 5246Pro Ala Gly Gln Ile Glu Glu Gln Ala Ala Arg Cys Met Asp Cys Gly35 40 45 50gtc ccg ttc tgc cac gaa ggc tgc cca ctg ggc aac atc atc cct gag 5294Val Pro Phe Cys His Glu Gly Cys Pro Leu Gly Asn Ile Ile Pro Glu

55 60 65tgg aat gat ctg gta cgc caa ggt cgg tgg aag gaa gcc tac gat cgc 5342Trp Asn Asp Leu Val Arg Gln Gly Arg Trp Lys Glu Ala Tyr Asp Arg

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85 90 95gca ccc tgc gaa ggc gcc tgc gtg ctc ggc atc aac gat gat tct gtc 5438Ala Pro Cys Glu Gly Ala Cys Val Leu Gly Ile Asn Asp Asp Ser Val

100 105 110acc atc aaa aac gtt gag ctg gaa atc gtc gaa aaa gca ttc cgc gaa 5486Thr Ile Lys Asn Val Glu Leu Glu Ile Val Glu Lys Ala Phe Arg Glu115 120 125 130ggc tgg gtt cag cct gtc gtc gca tcc atg tcc acc ggc ctg tcc gta 5534Gly Trp Val Gln Pro Val Val Ala Ser Met Ser Thr Gly Leu Ser Val

135 140 145gcc gtc gtc ggc tcc ggt ccc gct ggc ctt gcc gcc gcg cag cag ctc 5582Ala Val Val Gly Ser Gly Pro Ala Gly Leu Ala Ala Ala Gln Gln Leu

150 155 160acc cgc gca ggt cac agc gtg acc gtc ttc gaa cgc gac gac cgc ctc 5630Thr Arg Ala Gly His Ser Val Thr Val Phe Glu Arg Asp Asp Arg Leu

165 170 175ggc ggc ctc atg cgc tac ggc gtg cca gaa tac aaa atg gaa aac cgc 5678Gly Gly Leu Met Arg Tyr Gly Val Pro Glu Tyr Lys Met Glu Asn Arg

180 185 190tgg atc gac cgc cgc atc gag caa atg gaa gca gag ggc aca act ttc 5726Trp Ile Asp Arg Arg Ile Glu Gln Met Glu Ala Glu Gly Thr Thr Phe195 200 205 210cag gta ggc acc tcg cca cgc gcc gct gaa cta gcg ctt ttc gac gcg 5774Gln Val Gly Thr Ser Pro Arg Ala Ala Glu Leu Ala Leu Phe Asp Ala

215 220 225atc ctc ctc gca acc ggc acc cca gtg gcc cgc gaa ctc tca gtt cca 5822Ile Leu Leu Ala Thr Gly Thr Pro Val Ala Arg Glu Leu Ser Val Pro

230 235 240ggc cac gat ctc aac ggc atc cat gcg gca atg gat tac ctc acc gcc 5870Gly His Asp Leu Asn Gly Ile His Ala Ala Met Asp Tyr Leu Thr Ala

245 250 255caa aac cgc atc aat gaa ggc gac ggt gaa gtc tct cca atc aac gcc 5918Gln Asn Arg Ile Asn Glu Gly Asp Gly Glu Val Ser Pro Ile Asn Ala

260 265 270aaa ggc aag aaa gtt gtc atc atc ggt ggc ggc gac acc ggc acc gac 5966Lys Gly Lys Lys Val Val Ile Ile Gly Gly Gly Asp Thr Gly Thr Asp275 280 285 290tgc ttt ggt aca gcg ctg cgc caa gga gcg gaa tca gtc acc caa ttt 6014Cys Phe Gly Thr Ala Leu Arg Gln Gly Ala Glu Ser Val Thr Gln Phe

295 300 305gat atc cgc ccc cgc gct cct ttc cag cgc gcc gat tcc acc cca tgg 6062Asp Ile Arg Pro Arg Ala Pro Phe Gln Arg Ala Asp Ser Thr Pro Trp

310 315 320ccg atg tac ccc aac ctc ttc cgc acc gca acg gct cac gaa gaa ggc 6110Pro Met Tyr Pro Asn Leu Phe Arg Thr Ala Thr Ala His Glu Glu Gly

325 330 335gaa tac atc atc act ggc gat gaa tca gcc gat gaa atc gca gcc ctg 6158Glu Tyr Ile Ile Thr Gly Asp Glu Ser Ala Asp Glu Ile Ala Ala Leu

340 345 350ggc ctc gcc gaa cgc gcc gca ggc tcc acg ctt ggt gaa cgt aaa ttt 6206Gly Leu Ala Glu Arg Ala Ala Gly Ser Thr Leu Gly Glu Arg Lys Phe355 360 365 370gct gtc aac acc gtg gaa ttc cac ggc aac aac ggc cac gtc acc gga 6254Ala Val Asn Thr Val Glu Phe His Gly Asn Asn Gly His Val Thr Gly

375 380 385ctc acc ggc aac caa atc cga gtt gtc aac ggc aaa cgt gaa cca atc 6302Leu Thr Gly Asn Gln Ile Arg Val Val Asn Gly Lys Arg Glu Pro Ile

390 395 400gaa ggc acc gaa ttt ccc ttc gaa gca gac ctc gtt ctc gtc gca ctc 6350Glu Gly Thr Glu Phe Pro Phe Glu Ala Asp Leu Val Leu Val Ala Leu

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420 425 430ggt ttc gac gac cga gga cgc atc ctc cgc gat tcc gaa tac cgc agc 6446Gly Phe Asp Asp Arg Gly Arg Ile Leu Arg Asp Ser Glu Tyr Arg Ser435 440 445 450ccc acc aac tcc cgc gtt tac atc gca ggc gac aac ggc cgt ggc caa 6494Pro Thr Asn Ser Arg Val Tyr Ile Ala Gly Asp Asn Gly Arg Gly Gln

455 460 465tcc ctg atc gtg tgg gca atc gcc gaa ggc cgc gca tgc gcc gca gct 6542Ser Leu Ile Val Trp Ala Ile Ala Glu Gly Arg Ala Cys Ala Ala Ala

470 475 480atc gac gcc gac ctc atg ggt gaa act gca ctt cca gta gca gtt gca 6590Ile Asp Ala Asp Leu Met Gly Glu Thr Ala Leu Pro Val Ala Val Ala

485 490 495cca cag gac gtg ccg ctg gct gtc taggaggatt ggcgccaaga accactcgaa 6644Pro Gln Asp Val Pro Leu Ala Val

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20 25 30Val Asp Arg Ala Leu Glu Ala Leu Arg Asn Ile Asp His Arg Gly Ala

35 40 45Ala Gly Ala Glu Lys Asn Thr Gly Asp Gly Ala Gly Ile Leu Met Gln

50 55 60Ile Pro Asp Gly Phe Tyr Arg Glu Val Ser Gly Ile Glu Leu Pro Glu65 70 75 80Ala Gly Glu Tyr Ala Thr Gly Ile Ala Phe Leu Pro Arg Gly Arg Met

85 90 95Ala Met Met Asp Ala Gln Lys Glu Ile Glu Arg Ile Ala Lys Gln Glu

100 105 110Gly Ala Asp Val Leu Gly Trp Arg Met Val Pro Phe Asp Ser Arg Glu

115 120 125Leu Gly Ser Met Ala Glu Glu Ala Met Pro Ser Phe Ala Gln Ile Phe

130 135 140Leu Thr Val Pro Gly Lys Ser Gly Glu Asp Leu Asp Arg Val Met Phe145 150 155 160Phe Ile Arg Lys Arg Cys Glu Arg Glu Leu Gly Thr Thr Asn Gly Arg

165 170 175Asp Thr Val Tyr Phe Pro Ser Leu Ser Ser Arg Thr Ile Ile Tyr Lys

180 185 190Gly Met Leu Thr Thr Leu Gln Leu Glu Gly Phe Phe Glu Asp Leu Gly

195 200 205Asp Ala Arg Leu Glu Ser Ala Ile Ala Ile Val His Ser Arg Phe Ser

210 215 220Thr Asn Thr Phe Pro Ser Trp Pro Leu Ala His Pro Tyr Arg Phe Val225 230 235 240Ala His Asn Gly Glu Ile Asn Thr Val Arg Gly Asn Glu Asn Trp Met

245 250 255Arg Ala Arg Glu Ala Leu Ile Lys Asn Asp Lys Leu Gly Asn Leu Ser

260 265 270Ser Val Leu Pro Ile Cys Thr Pro Glu Gly Ser Asp Thr Ala Arg Phe

275 280 285Asp Glu Ala Leu Glu Leu Leu His Leu Gly Gly Tyr Ser Leu Pro His

290 295 300Ala Val Ala Met Met Ile Pro Gln Ala Trp Glu His Asn Lys Thr Leu305 310 315 320Ser Pro Glu Leu Arg Asp Phe Tyr Glu Tyr His Ser Cys Leu Met Glu

325 330 335Pro Trp Asp Gly Pro Ala Ala Leu Ala Phe Thr Asp Gly Arg Phe Val

340 345 350Gly Ala Val Leu Asp Arg Asn Gly Leu Arg Pro Gly Arg Ile Thr Ile

355 360 365Thr Asp Ser Gly Leu Val Val Met Ala Ser Glu Ser Gly Val Leu Asp

370 375 380Leu Arg Glu Glu Ser Val Val Lys Arg Thr Arg Val Gln Pro Gly Arg385 390 395 400Met Phe Leu Val Asp Thr Ala Glu Gly Arg Ile Val Glu Asp Glu Glu

405 410 415Ile Lys Gln Lys Leu Ser Glu Ala Gln Pro Tyr Gly Glu Trp Ile Arg

420 425 430Asp Asn Phe Val His Leu Asp Arg Leu Pro Gln Thr Arg Tyr Asn Tyr

435 440 445Met Ala His Ser Arg Ala Val Leu Arg Gln Arg Val Phe Gly Ile Thr

450 455 460Glu Glu Asp Val Asp Leu Leu Leu Leu Pro Met Ala Arg Gln Gly Ala465 470 475 480Glu Ala Ile Gly Ser Met Gly Ser Asp Thr Pro Ile Ala Ala Leu Ser

485 490 495Gln Arg Pro Arg Met Leu Tyr Asp Phe Phe Ala Gln Arg Phe Ala Gln

500 505 510Val Thr Asn Pro Pro Leu Asp Ser Ile Arg Glu Lys Pro Val Thr Ser

515 520 525Met Phe Thr Leu Leu Gly Ala Gln Ser Asp Val Leu Asn Pro Gly Pro

530 535 540Asp Ala Ala Arg Arg Ile Arg Leu Glu Ser Pro Ile Ile Asp Asn His545 550 555 560Glu Leu Ala Thr Leu Ile Asn Ala Asn Ala His Gly Glu Trp Asp Ser

565 570 575Phe Gly Ala Ala Val Ile Ser Gly Leu Tyr Pro Val Ala His His Gly

580 585 590Ala Gly Met Lys Ala Ala Ile Ala Arg Val Arg Arg Glu Val Ser Glu

595 600 605Ala Ile Arg Asn Gly Lys Thr Leu Ile Val Leu Ser Asp Arg Glu Ser

610 615 620Asp Glu Arg Met Ala Pro Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ser Ala Val625 630 635 640His Gln Tyr Leu Val Gln Gln Arg Thr Arg Thr Gln Cys Ser Leu Val

645 650 655Val Glu Ser Gly Asp Ala Arg Glu Val His His Leu Ala Met Leu Ile

660 665 670Gly Phe Gly Ala Asp Ala Ile Asn Pro Tyr Met Ala Phe Glu Thr Ile

675 680 685Asp Glu Leu Arg Met Lys Gly Gln Leu Gly Asp Leu Ser Leu Asp Glu

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725 730 735Leu Ala Asp Val Thr Gly Leu His Gln Asp Leu Leu Asp Asn Tyr Phe

740 745 750Gly Gly Ile Ala Ser Pro Ile Ser Gly Ile Gly Leu Asp Glu Val Ala

755 760 765Ala Asp Val Glu Ala Arg His Arg Ser Ala Phe Leu Pro Arg Pro Glu

770 775 780Glu His Ala His Arg Glu Leu Asp Leu Gly Gly Glu Tyr Lys Trp Arg785 790 795 800Arg Glu Gly Glu Tyr His Leu Phe Asn Pro Glu Thr Ile Phe Lys Leu

805 810 815Gln His Ala Thr Arg Ser Gly Ser Tyr Glu Ile Phe Lys Asp Tyr Thr

820 825 830Arg Lys Val Asp Asp Gln Ser Thr Arg Leu Gly Thr Ile Arg Gly Leu

835 840 845Phe Glu Phe Ser Thr Asp Arg Lys Pro Ile Ser Val Ser Glu Val Glu

850 855 860Pro Val Ser Glu Ile Val Lys Arg Phe Ser Thr Gly Ala Met Ser Tyr865 870 875 880Gly Ser Ile Ser Ala Glu Ala His Glu Val Leu Ala Ile Ala Met Asn

885 890 895Arg Leu Gly Gly Met Ser Asn Ser Gly Glu Gly Gly Glu Asp Ala Arg

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915 920 925Gln Val Ala Ser Gly Arg Phe Gly Val Thr Ser His Tyr Leu Asn Asn

930 935 940Cys Thr Asp Ile Gln Ile Lys Met Ala Gln Gly Ala Lys Pro Gly Glu945 950 955 960Gly Gly Gln Leu Pro Pro Asn Lys Val Tyr Pro Trp Val Ala Glu Val

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980 985 990Asp Ile Tyr Ser Ile Glu Asp Leu Ala Gln Leu Ile His Asp Leu Lys

995 1000 1005Asn Ala Asn Pro Arg Ala Arg Ile His Val Lys Leu Val Ala Glu Gln1010 1015 1020Gly Val Gly Thr Val Ala Ala Gly Val Ser Lys Ala His Ala Asp Val025 1030 1035 1040Val Leu Ile Ser Gly His Asp Gly Gly Thr Gly Ala Ser Pro Leu Thr

1045 1050 1055Ser Leu Lys His Ala Gly Gly Pro Trp Glu Leu Gly Leu Ala Glu Thr

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1075 1080 1085Cys Asp Gly Gln Leu Lys Thr Gly Arg Asp Val Val Ile Ala Ala Leu1090 1095 1100Leu Gly Ala Glu Glu Phe Gly Phe Ala Thr Ala Pro Leu Val Val Glu105 1110 1115 1120Gly Cys Ile Met Met Arg Val Cys His Leu Asp Thr Cys Pro Val Gly

1125 1130 1135Ile Ala Thr Gln Asn Pro Asp Leu Arg Ser Lys Phe Thr Gly Lys Ala

1140 1145 1150Glu His Val Val Asn Phe Phe Thr Phe Ile Ala Gln Glu Val Arg Glu

1155 1160 1165Tyr Leu Ala Gln Leu Gly Phe Arg Ser Ile Asp Glu Ala Val Gly Gln1170 1175 1180Ala Gln Val Leu Arg Lys Arg Ser Gly Ile Pro Ala Asp Ser Arg Ala185 1190 1195 1200Ala His Leu Asp Leu Ser Pro Ile Phe His Arg Pro Glu Thr Pro His

1205 1210 1215Phe Pro Thr Gln Asp Val Arg Cys Thr Lys Thr Gln Glu His Ser Leu

1220 1225 1230Glu Lys Ala Leu Asp Asn Ala Phe Ile Asp Lys Ala Ser Asp Thr Ile

1235 1240 1245Thr Arg Ala Ala Ala Gly Val Glu Thr Ser Ile Val Ile Asp Ser Ser1250 1255 1260Ile Ser Asn Val Asn Arg Ser Val Gly Thr Met Leu Gly Ser Ala Val265 1270 1275 1280Ser Arg Val Ala Gly Ala Gln Gly Leu Pro Asp Gly Thr Ile Thr Leu

1285 1290 1295Asn Leu Gln Gly Cys Ala Gly Asn Ser Phe Gly Ala Phe Ile Pro Arg

1300 1305 1310Gly Ile Thr Ile Asn Leu Thr Gly Asp Ala Asn Asp Phe Val Gly Lys

1315 1320 1325Gly Leu Ser Gly Gly Lys Ile Val Ile Lys Pro Ser Ala Gln Ala Pro1330 1335 1340Lys Gln Leu Lys Asn Asn Pro Asn Ile Ile Ala Gly Asn Val Leu Gly345 1350 1355 1360Tyr Gly Ala Thr Ser Gly Glu Leu Phe Ile Arg Gly Gln Val Gly Glu

1365 1370 1375Arg Phe Cys Val Arg Asn Ser Gly Ala Thr Ala Val Val Glu Gly Ile

1380 1385 1390Gly Asn His Gly Cys Glu Tyr Met Thr Gly Gly Arg Val Leu Val Leu

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1445 1450 1455Leu Ile Ala Arg His Arg Glu Leu Thr Gly Ser Glu Thr Lys Leu Arg

1460 1465 1470Ala Gln Asp Leu Val Lys Ile Met Pro Arg Asp Phe Gln Lys Val Leu

1475 1480 1485Asn Ile Ile Glu Thr Ala His Ala Glu Gly Gln Asp Pro Ala Ile Lys1490 1495 1500Ile Met Glu Ala Val Ser505 1510<210>9<211>506<212>PRT<213>Brevibacterium lactofermentum<400>9Met Ala Asp Pro Gln Gly Phe Ile Lys Tyr Ser Arg Arg Glu Pro Ala1 5 10 15His Arg Pro Val Pro Leu Arg Leu Met Asp Tyr Ser Glu Val Tyr Glu

20 25 30Lys Ala Pro Ala Gly Gln Ile Glu Glu Gln Ala Ala Arg Cys Met Asp

35 40 45Cys Gly Val Pro Phe Cys His Glu Gly Cys Pro Leu Gly Asn Ile Ile

50 55 60Pro Glu Trp Asn Asp Leu Val Arg Gln Gly Arg Trp Lys Glu Ala Tyr65 70 75 80Asp Arg Leu His Ala Thr Asn Asn Phe Pro Glu Phe Thr Gly Arg Leu

85 90 95Cys Pro Ala Pro Cys Glu Gly Ala Cys Val Leu Gly Ile Asn Asp Asp

100 105 110Ser Val Thr Ile Lys Asn Val Glu Leu Glu Ile Val Glu Lys Ala Phe

115 120 125Arg Glu Gly Trp Val Gln Pro Val Val Ala Ser Met Ser Thr Gly Leu

130 135 140Ser Val Ala Val Val Gly Ser Gly Pro Ala Gly Leu Ala Ala Ala Gln145 150 155 160Gln Leu Thr Arg Ala Gly His Ser Val Thr Val Phe Glu Arg Asp Asp

165 170 175Arg Leu Gly Gly Leu Met Arg Tyr Gly Val Pro Glu Tyr Lys Met Glu

180 185 190Asn Arg Trp Ile Asp Arg Arg Ile Glu Gln Met Glu Ala Glu Gly Thr

195 200 205Thr Phe Gln Val Gly Thr Ser Pro Arg Ala Ala Glu Leu Ala Leu Phe

210 215 220Asp Ala Ile Leu Leu Ala Thr Gly Thr Pro Val Ala Arg Glu Leu Ser225 230 235 240Val Pro Gly His Asp Leu Asn Gly Ile His Ala Ala Met Asp Tyr Leu

245 250 255Thr Ala Gln Asn Arg Ile Asn Glu Gly Asp Gly Glu Val Ser Pro Ile

260 265 270Asn Ala Lys Gly Lys Lys Val Val Ile Ile Gly Gly Gly Asp Thr Gly

275 280 285Thr Asp Cys Phe Gly Thr Ala Leu Arg Gln Gly Ala Glu Ser Val Thr

290 295 300Gln Phe Asp Ile Arg Pro Arg Ala Pro Phe Gln Arg Ala Asp Ser Thr305 310 315 320Pro Trp Pro Met Tyr Pro Asn Leu Phe Arg Thr Ala Thr Ala His Glu

325 330 335Glu Gly Glu Tyr Ile Ile Thr Gly Asp Glu Ser Ala Asp Glu Ile Ala

340 345 350Ala Leu Gly Leu Ala Glu Arg Ala Ala Gly Ser Thr Leu Gly Glu Arg

355 360 365Lys Phe Ala Val Asn Thr Val Glu Phe His Gly Asn Asn Gly His Val

370 375 380Thr Gly Leu Thr Gly Asn Gln Ile Arg Val Val Asn Gly Lys Arg Glu385 390 395 400Pro Ile Glu Gly Thr Glu Phe Pro Phe Glu Ala Asp Leu Val Leu Val

405 410 415Ala Leu Gly Phe Thr Gly Ala Glu Gln Gly Gly Leu Ala His Glu Leu

420 425 430Gly Val Gly Phe Asp Asp Arg Gly Arg Ile Leu Arg Asp Ser Glu Tyr

435 440 445Arg Ser Pro Thr Asn Ser Arg Val Tyr Ile Ala Gly Asp Asn Gly Arg

450 455 460Gly Gln Ser Leu Ile Val Trp Ala Ile Ala Glu Gly Arg Ala Cys Ala465 470 475 480Ala Ala Ile Asp Ala Asp Leu Met Gly Glu Thr Ala Leu Pro Val Ala

485 490 495Val Ala Pro Gln Asp Val Pro Leu Ala Val

500 505

Claims

1.一种具有L-谷氨酸生产能力的棒状杆菌属细菌菌株，其中在所述的细菌菌株的细胞中，谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的活性被增强。

2.根据权利要求1的菌株，其中谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶活性的增强是通过扩增编码谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的基因的拷贝数来实现的。

3.根据权利要求1的菌株，其中谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶活性的增强是通过改变编码谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的基因的表达调控序列来实现的。

4.根据权利要求1的菌株，其中所述的谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶来源于埃希氏杆菌属或棒状杆菌属细菌。

5.根据权利要求2或3的菌株，其中所述编码谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的基因包含有至少对应于SEQ ID NO：7中所描述的核苷酸序列中的第565至6614位核苷酸的核苷酸序列。

6.一种编码谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的基因，包含有至少对应于SEQ ID NO：7中所描述的核苷酸序列中的第565至6614位核苷酸的核苷酸序列。

7.一种通过发酵生产L-谷氨酸的方法，包括如下步骤：

在液体培养基中培养具有L-谷氨酸生产能力的棒状杆菌属细菌菌株，其中，在所述细菌菌株的细胞中，谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的活性被增强，

在培养基中生产并积累L-谷氨酸，以及

从培养基中回收L-谷氨酸。