JP2002338596A - 糖トランスポーター及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
及びそれをコードするＤＮＡ。 （Ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、糖ト
ランスポーター活性を有するタンパク質。 【効果】 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
の非ＰＴＳ糖トランスポーター及びそれをコードするＤ
ＮＡが提供される。本発明のＤＮＡは、コリネ型細菌の
育種に利用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な糖トランス
ポーター及びそれをコードする遺伝子に関する。該遺伝
子は、糖の細胞膜輸送が改変された微生物の育種等に利
用することができる。

【０００２】

【従来の技術】ヘキソース等の糖が細胞膜を透過するた
めの機構として、ＰＴＳ（phosphoenolpyruvate-sugar
transport system）及び非ＰＴＳ（non-PTS）が知られ
ている。ＰＴＳは糖の細胞内への取り込みにホスホエノ
ールピルビン酸を消費するため、生合成系の上流にホス
ホエノールピルビン酸が位置するアミノ酸等の合成にと
っては不利であると考えられる。一方、非ＰＴＳは、糖
の細胞内への取り込みにホスホエノールピルビン酸を必
要としないため、糖の取り込み速度やアミノ酸等の生産
性の点からは有利であると考えられる。

【０００３】いくつかの細菌では種々の糖のトランスポ
ーター及びその遺伝子の構造が解析され、非ＰＴＳの糖
トランスポーター遺伝子の構造も知られている（araE,
glf,glcP等）が、コリネ型細菌の糖トランスポーターや
その構成成分をコードする遺伝子は未知のものが多い。

【０００４】

【発明の概要】本発明者は、コリネ型Ｌ−グルタミン酸
生産菌の育種を目的として、Ｌ−グルタミン酸生合成経
路のうちの一つに関与する酵素グルタミン−オキソグル
タル酸アミノトランスフェラーゼ（グルタミン酸シンタ
ーゼとも呼ばれる。以下「ＧＯＧＡＴ」と略す）をコー
ドする遺伝子をクローニングした。その過程において、
ＧＯＧＡＴをコードする遺伝子（ｇｌｔＢＤ）を含むＤ
ＮＡ断片が、糖の輸送に関わるトランスポーターをコー
ドする遺伝子を含むことを偶然見出し、本発明を完成す
るに至った。

【０００５】すなわち本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）
に示すタンパク質である。 （Ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、糖ト
ランスポーター活性を有するタンパク質。 本発明はまた、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
をコードするＤＮＡを提供する。 （Ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、糖ト
ランスポーター活性を有するタンパク質。 上記ＤＮＡとして具体的には、下記（ａ）又は（ｂ）に
示すＤＮＡが挙げられる。尚、本発明において「糖トラ
ンスポーター活性」とは、グルコース、アラビノース、
ガラクトース等の糖の細胞膜を介した輸送に関与する性
質をいう。

【０００６】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＤＮＡは、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムからｇｌｔＢＤ遺伝子の上流に存在するＯＲＦ
として見い出されたものであり、次のようにして取得す
ることができる。

【０００７】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム、例えばブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ATCC13869の染色体ＤＮＡを鋳型とし、エシェリヒア・
コリＫ−１２（Ｇｅｎｅ、第６０巻、１〜１１頁、１９
８７年）及び酵母（サッカロマイセス・セレビシエ、Ge
nBank accession No.X89221）のｇｌｔＢＤ遺伝子間で
相同性の高い領域の塩基配列、例えば配列表の配列番号
１に示す塩基配列を有するプライマー及び配列表の配列
番号２に示す塩基配列を有するプライマーを用いたPCR
（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）により、約
１．４ｋｂのＤＮＡ断片を取得する。ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムATCC13869は、ATCC（アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Ty
pe Culture Collection)：アメリカ合衆国、メリーラン
ド 20852、ロックビル、パークローンドライブ 10301）
から入手することができる。

【０００８】次に、上記のようにして得られるPCR増幅
断片をプローブとし、ブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタム ATCC13869の染色体ＤＮＡライブラリーのコ
ロニーハイブリダイゼーションを行い、前記プローブに
ハイブリダイズするＤＮＡ断片を取得することにより、
ｇｌｔＢＤ遺伝子とともに本発明のＤＮＡを取得するこ
とができる。染色体ＤＮＡライブラリーの調製に、Hind
IIIで切断した染色体ＤＮＡを用いると、上記ＤＮＡ断
片は約１４ｋｂの大きさを持つ断片として得ることがで
きる。

【０００９】上記のＤＮＡ断片にはｇｌｔＢＤ遺伝子が
含まれ、その上流に、ｇｌｔＢＤ遺伝子と逆向きにオー
プンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在する。この
ＯＲＦ及びそれによってコードされ得るアミノ酸配列
を、配列番号５に示す。る。このＯＲＦは、その塩基配
列及び隣接する領域の塩基配列が明らかになったので、
それらの塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチ
ドをプライマーに用いたＰＣＲによっても、取得するこ
とができる。

【００１０】染色体ＤＮＡの調製、染色体ＤＮＡライブ
ラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラ
スミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転
換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定
等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採
用することができる。これらの方法は、Sambrook,J.,Fr
itsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning, Cold Spr
ing Harbor LaboratoryPress,1.21(1989)等に記載され
ている。

【００１１】上記のＯＲＦ及びそれによってコードされ
るアミノ酸配列について、既知の配列と相同性比較を行
った。用いたデータベースは、EMBLおよびSWISS-PROTで
ある。その結果、これらの配列は、表１に示す既に報告
されているグルコース、アラビノース、ガラクトース等
のヘキソースのトランスポーター（非ＰＴＳ）遺伝子と
比較的高い相同性が認められ、上記ＯＲＦは糖トランス
ポーター遺伝子であることが判明した。

【００１２】

【表１】

【００１３】本発明の糖トランスポーターをコードする
遺伝子は、コードされるタンパク質の糖トランスポータ
ー活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での
１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、
又は逆位を含む糖トランスポーターをコードするもので
あってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基の
タンパク質の立体構造における位置や種類によっても異
なる。それは、イソロイシンとバリンのように、アミノ
酸によっては、類縁性の高いアミノ酸が存在し、そのよ
うなアミノ酸の違いが、蛋白質の立体構造に大きな影響
を与えないことに由来する。従って、各タンパク質を構
成するアミノ酸配列全体に対し、２５から３０％以上、
好ましくは３０〜３５％以上の相同性を有するものであ
ってもよい。

【００１４】上記のような糖トランスポーターの構成成
分と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、
例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ
酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むよう
に塩基配列を改変することによって得られる。また、上
記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異
処理によっても取得され得る。変異処理としては、各タ
ンパク質をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等で
インビトロ処理する方法、及び各々のタンパク質をコー
ドするＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属
細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−
ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変
異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が
挙げられる。

【００１５】また、上記のような塩基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位等には、各構成成分を保持する微生
物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生
じる変異（mutant又はvariant）も含まれる。

【００１６】上記のような変異を有するＤＮＡを、適当
な細胞で発現させ、発現産物の性質を調べることによ
り、糖トランスポータータンパク質と実質的に同一のタ
ンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を
有する糖トランスポータータンパク質をコードするＤＮ
Ａまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表配列番
号５に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、かつ、糖トランスポーター活性を有する
タンパク質をコードするＤＮＡを単離することによって
も、糖トランスポータータンパク質と実質的に同一のタ
ンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハ
イブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成
されない条件をいう。この条件を明確に数値化すること
は困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同
士、例えば６０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハ
イブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハ
イブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブ
リダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳ
Ｃ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする
条件が挙げられる。

【００１７】このような条件でハイブリダイズする遺伝
子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活
性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、そ
れらについては、市販の活性発現ベクターを用いて発現
産物の特性を調べることにより、容易に取り除くことが
できる。

【００１８】本発明の糖トランスポータータンパク質を
コードするＤＮＡは、コリネ型細菌の育種に利用するこ
とができる。すなわち、本発明の糖トランスポーターは
糖のの輸送に関与していると考えられるため、その遺伝
子の発現を改変することによって、細胞の糖輸送に関す
る特性を改変させることができると考えられる。

【００１９】本発明を適用し得るコリネ型細菌は、従来
ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバ
クテリウム属に統合された細菌を含み（Int. J. Syst.
Bacteriol., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウ
ム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。
このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げら
れる。

【００２０】 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム コリネバクテリウム・アセトグルタミカム コリネバクテリウム・アルカノリティカム コリネバクテリウム・カルナエ コリネバクテリウム・グルタミカム コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） コリネバクテリウム・メラセコーラ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス コリネバクテリウム・ハーキュリス ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・ロゼウム ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ブレビバクテリウム・アルバム ブレビバクテリウム・セリヌム ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム

【００２１】具体的には、下記のような菌株を例示する
ことができる。 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ
１３８７０ コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１
５８０６ コリネバクテリウム・アルカノリティカム ＡＴＣＣ２
１５１１ コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１ コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０２
０、１３０３２、１３０６０ コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ＡＴＣＣ１５９９０ コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６
５ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３
４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９） コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６
８ ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１４０２０ ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０
６７ ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ＡＴＣＣ１
４０６８ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３６６５、Ａ
ＴＣＣ１３８６９、 ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５ ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１
４０６６ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２
４０ ブレビバクテリウム・アルバム ＡＴＣＣ１５１１１ ブレビバクテリウム・セリヌム ＡＴＣＣ１５１１２ ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１
５３５４

【００２２】本発明の遺伝子を改変する方法としては、
遺伝子の増幅又は破壊が挙げられる。遺伝子等の増幅
は、遺伝子をプラスミド等のベクターに連結して得られ
る組換えベクターでコリネ型細菌を形質転換することに
よって行うことができる。その際、マルチコピー型のベ
クターを用いることによって、増幅の効率を高めること
ができる。そのようなベクターとしては、コリネ型細菌
で自律複製出来るプラスミド、例えば以下のものが挙げ
られる。

【００２３】 ｐＡＭ ３３０ 特開昭５８−６７６９９号公報参照 ｐＨＭ １５１９ 特開昭５８−７７８９５号公報参照 ｐＡＪ ６５５ 特開昭５８−１９２９００号公報参照 ｐＡＪ ６１１ 同 上 ｐＡＪ １８４４ 同 上 ｐＣＧ １ 特開昭５７−１３４５００号公報参照 ｐＣＧ ２ 特開昭５８−３５１９７号公報参照 ｐＣＧ ４ 特開昭５７−１８３７９９号公報参照 ｐＣＧ １１ 同 上

【００２４】コリネ型細菌の形質転換は、電気パルス法
（特開平２−２０７７９１号公報参照）により行うこと
ができる。

【００２５】遺伝子の増幅は、本発明のＤＮＡを上記宿
主の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによって
も達成できる。コリネ型細菌の染色体ＤＮＡ上に目的と
する遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上
に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えに
より行う（Experiments in Molecular Genetics, Cold
Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama,
S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196(198
5)）。また、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列と
しては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在す
るインバーティッド・リピートが利用できる。あるい
は、特開平２−１０９９８５号公報に開示されているよ
うに、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転
移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能
である。

【００２６】また、染色体上にもともと存在する遺伝子
のプロモーター等の発現調節配列を強力なもの又は機能
の弱いものに置換することによっても、該遺伝子の発現
を改変させることができる。

【００２７】一方、遺伝子の破壊は、相同組換による遺
伝子破壊法が既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方
法や温度感受性プラスミドを用いる方法などによって、
行うことができる。

【００２８】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。

【００２９】（１）ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタム ＡＴＣＣ１３８６９のｇｌｔＢＤ遺伝子のク
ローニング 大腸菌と酵母のｇｌｔＢ遺伝子産物間でアミノ酸配列の
相同性の高い領域を選び、その配列から塩基配列を推定
し、配列番号１および配列番号２に示すオリゴヌクレオ
チドを合成した。一方、Bacterial Genomic DNA Purifi
cation Kit（Advanced Genetic Technologies Corp.
製）を用いて、ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを調製した。
この染色体ＤＮＡを鋳型とし、前記オリゴヌクレオチド
をプライマーに用いて、ＰＣＲテクノロジー（ヘンリー
エーリッヒ編、ストックトンプレス、１９８９年）８頁
に記載されている標準反応条件でＰＣＲを行った。ＰＣ
Ｒ産物をアガロースゲル電気泳動したところ、約１．４
キロベースのＤＮＡ断片が増幅されていることが判明し
た。

【００３０】得られたＤＮＡは、配列番号１および配列
番号２に示すオリゴヌクレオチドを用いて両端の塩基配
列の決定を行った。塩基配列の決定は、DNA Sequencing
Kit（Applied Biosystems社製）を用いてSangerの方法
（J. Mol. Biol., 143, 161（1980））に従って行っ
た。決定された塩基配列をアミノ酸配列に翻訳して、大
腸菌と酵母のｇｌｔＢ遺伝子から予想されるアミノ酸配
列と比較したところ、相同性が高かったので、ＰＣＲに
より増幅したDNA断片はブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９のｇｌｔＢ遺伝子の
一部であると判断した。このＰＣＲ増幅DNA断片をプロ
ーブとし、上記の方法で調製したブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体Ｄ
ＮＡを定法によりEcoRI、BamHI、HindIII、PstI、SalI
（宝酒造社製）で切断した断片について、DIG DNA Labe
ling and Detection Kit（ベーリンガー・マンハイム社
製）を用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。
その結果、HindIIIで切断された約１４キロベースの切
断断片がプローブDNAとハイブリダイズすることが判明
した。

【００３１】そこで、定法により調製したブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９染
色体DNAのHindIII断片をアガロース電気泳動し、約１０
キロベース以上のDNA断片をガラスパウダーを用いて回
収し、回収されたDNA断片と制限酵素HindIII（宝酒造社
製）で切断したベクターpMW219（ニッポンジーン製）は
ライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結し、
エシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテントセル（宝
酒造社製）を用いて形質転換を行った。形質転換株をＩ
ＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド）１０μｇ／ｍｌ、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）４０μ
ｇ／ｍｌ及びカナマイシン25μｇ／ｍｌを含むＬ培地
（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、バクトイーストエキス
トラクト５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／
ｌ、ｐＨ７．２）に塗布し、一晩培養後、出現した白色
のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、約１,００
０個の形質転換体を得た。

【００３２】得られた形質転換体は、アルカリ法（生物
工学実験書、日本生物工学会編、１０５頁、培風館、１
９９２年）を用いてプラスミドを調製した。プローブと
して用いたDNA配列の中で塩基配列が決定している部分
をもとに作製した配列番号３および配列番号４に示す塩
基配列を有する合成オリゴヌクレオチドをプライマーと
して、上記プラスミドを鋳型として上記の条件でＰＣＲ
を行い、このプライマーを用いてブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体を
鋳型としてＰＣＲを行った時に増幅されるDNA断片と同
じ約１．３キロベースの大きさの増幅断片が得られるプ
ラスミドを保持する形質転換体を選択した。

【００３３】（２）ブレビバクテリウム・ラクトフェル
メンタム ＡＴＣＣ１３８６９ ｇｌｔＢＤ遺伝子を含
むDNA断片の全塩基配列の決定及び糖トランスポーター
遺伝子の単離 上記（１）により得られた形質転換体からアルカリ法に
より調製したプラスミドDNAは、ブレビバクテリウム・
ラクトフェルメンタム ＡＴＣＣ１３８６９染色体由来
の約１４キロベースのDNA断片を含んでいた。上記の方
法と同様にして、得られたプラスミドのブレビバクテリ
ウム・ラクトフェルメンタム ＡＴＣＣ１３８６９染色
体由来の約１４キロベースのDNA断片の全塩基配列決定
を行った。この結果、得られたDNA断片中には、ｇｌｔ
ＢＤ遺伝子の全長が含まれていたが、５０００bｐ以上
のオープン・リーディング・フレームがｇｌｔＢＤ遺伝
子の上流に逆向きで存在することも明らかとなった。こ
のオープン・リーディング・フレームの塩基配列は、配
列表配列番号５に示す通りである。配列表配列番号５の
配列には、その塩基配列から推定される産物のアミノ酸
配列も示した。なお、タンパク質のＮ末端にあるメチオ
ニン残基は開始コドンであるATGに由来するためタンパ
ク質本来の機能とは無関係であることが多く、翻訳後ペ
プチダーゼの働きにより除去されることがよく知られて
おり、上記タンパク質の場合にもメチオニン残基の除去
が生じている可能性がある。塩基配列、アミノ酸配列お
のおのについて既知の配列と相同性比較を行った。用い
たデータベースは、EMBLおよびSWISS-PROTである。その
結果、配列表配列番号５に示されるDNAおよびそれにコ
ードされるタンパク質は、すでに報告されているグルコ
ース、アラビノース、ガラクトース等のヘキソースのト
ランスポーター遺伝子と比較的相同性の高いコリネバク
テリウム属細菌では新規な遺伝子であることが判明し
た。

【００３４】

【発明の効果】本発明により、ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムの糖トランスポーター及びそれをコ
ードするＤＮＡが提供される。本発明の遺伝子は、コリ
ネ型細菌の育種に利用することができる。

【００３５】

【配列表】 Sequence Listing

【００３６】 <110> 味の素株式会社(Ajinomoto Co., Inc.) <120> 糖トランスポーター及びそれをコードする遺伝子 <130> P-6002 <141> 1998-12-18 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００３７】 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (3,9,12) <223> n=a or c or g or t <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying Brevibacterium lactofermentum gltBD gene <400> 1 ggngarggng gngarga 17

【００３８】 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (1,4,7,) <223> n=a or c or g or t <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying Brevibacterium lactofermentum gltBD gene <400> 2 nccnccngtc atrtaytc 18

【００３９】 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying Brevibacterium lactofermentum gltBD gene <400> 3 aatccacgtg aagctagtgg cagaacaagg cg 32

【００４０】 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying Brevibacterium lactofermentum gltBD gene <400> 4 acgaatgaac aattcaccac tggttgcgcc 30

【００４１】 <210> 5 <211> 1476 <212> DNA <213> Brevibacterium lactofermentum <220> <221> CDS <222> (1)..(1473) <400> 5 atg gct agt acc ttc att cag gcc gac agc cct gaa aaa agt aag aag 48 Met Ala Ser Thr Phe Ile Gln Ala Asp Ser Pro Glu Lys Ser Lys Lys 1 5 10 15 ctg ccc cca ctc aca gaa ggt ccg tat aga aag cgg cta ttc tac gtt 96 Leu Pro Pro Leu Thr Glu Gly Pro Tyr Arg Lys Arg Leu Phe Tyr Val 20 25 30 gca cta gtt gcg acg ttt ggt ggg ctg ctc ttc ggc tac gac acc ggc 144 Ala Leu Val Ala Thr Phe Gly Gly Leu Leu Phe Gly Tyr Asp Thr Gly 35 40 45 gtc atc aac ggt gca ctc aac ccg atg acc cgc gag ctc gga cta acc 192 Val Ile Asn Gly Ala Leu Asn Pro Met Thr Arg Glu Leu Gly Leu Thr 50 55 60 gcg ttc acc gag ggt gtt gta act tct tcc ctg ctg ttt ggt gca gca 240 Ala Phe Thr Glu Gly Val Val Thr Ser Ser Leu Leu Phe Gly Ala Ala 65 70 75 80 gct ggt gcg atg ttt ttc ggt cgc att tcc gac aac tgg ggt cgc cgg 288 Ala Gly Ala Met Phe Phe Gly Arg Ile Ser Asp Asn Trp Gly Arg Arg 85 90 95 aaa aca atc atc tca ctt gca gta gct ttc ttt gtc ggc acc atg gtc 336 Lys Thr Ile Ile Ser Leu Ala Val Ala Phe Phe Val Gly Thr Met Val 100 105 110 tgc gtg ttt gct cca tct ttt gca gta atg gtt gtc gga cgt gtg ctt 384 Cys Val Phe Ala Pro Ser Phe Ala Val Met Val Val Gly Arg Val Leu 115 120 125 ctt gga ctc gca gtt ggt ggc gct tcc act gtt gtc cct gtc tac ctg 432 Leu Gly Leu Ala Val Gly Gly Ala Ser Thr Val Val Pro Val Tyr Leu 130 135 140 gct gaa ctt gct cct ttt gaa atc cgt ggc tca ctg gct ggc cgt aat 480 Ala Glu Leu Ala Pro Phe Glu Ile Arg Gly Ser Leu Ala Gly Arg Asn 145 150 155 160 gag ttg atg att gtt gtt ggt cag ctc gca gct ttc gtc atc aat gcg 528 Glu Leu Met Ile Val Val Gly Gln Leu Ala Ala Phe Val Ile Asn Ala 165 170 175 att att gga aat gtt ttt gga cac cac gat ggt gtg tgg cgc tac atg 576 Ile Ile Gly Asn Val Phe Gly His His Asp Gly Val Trp Arg Tyr Met 180 185 190 ctg gca att gcc gca atc cca gca att gcc ctc ttc ttt gga atg ctc 624 Leu Ala Ile Ala Ala Ile Pro Ala Ile Ala Leu Phe Phe Gly Met Leu 195 200 205 cga gtt cca gaa tcc cca cgc tgg ctt gtt gag cga gga cgc att gat 672 Arg Val Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Val Glu Arg Gly Arg Ile Asp 210 215 220 gag gct cgc gca gtt ctt gaa acc att cgc cct ctt gaa cgt gcc cat 720 Glu Ala Arg Ala Val Leu Glu Thr Ile Arg Pro Leu Glu Arg Ala His 225 230 235 240 gca gaa gtt gct gat gtt gag cac cta gca aga gaa gag cac gcc gtt 768 Ala Glu Val Ala Asp Val Glu His Leu Ala Arg Glu Glu His Ala Val 245 250 255 tcc gag aag tcc atg ggc tta agg gaa att ttg tcc agc aaa tgg ctt 816 Ser Glu Lys Ser Met Gly Leu Arg Glu Ile Leu Ser Ser Lys Trp Leu 260 265 270 gta cgc atc ctc cta gta ggt atc gga ttg ggt gtc gca cag cag ctg 864 Val Arg Ile Leu Leu Val Gly Ile Gly Leu Gly Val Ala Gln Gln Leu 275 280 285 acc ggc att aac tcc atc atg tat tac ggc cag gtt gtt ctc att gag 912 Thr Gly Ile Asn Ser Ile Met Tyr Tyr Gly Gln Val Val Leu Ile Glu 290 295 300 gct ggt ttc tcc gaa aat gca gct ctg atc gcc aac gtg gca cct gga 960 Ala Gly Phe Ser Glu Asn Ala Ala Leu Ile Ala Asn Val Ala Pro Gly 305 310 315 320 gtt atc gca gtt gtc ggt gca ttc atc gca ctg tgg atg atg gat cgt 1008 Val Ile Ala Val Val Gly Ala Phe Ile Ala Leu Trp Met Met Asp Arg 325 330 335 atc aac cgc cgt acc acc ctc att acc ggt tat tct ctc acc acc att 1056 Ile Asn Arg Arg Thr Thr Leu Ile Thr Gly Tyr Ser Leu Thr Thr Ile 340 345 350 agc cac gta ttg atc ggt atc gca tcc ata gca ttc cca gtc ggc gat 1104 Ser His Val Leu Ile Gly Ile Ala Ser Ile Ala Phe Pro Val Gly Asp 355 360 365 cca ctt cgc cca tac gtt att ttg acc cta gtt gtg gtc ttc gtg gga 1152 Pro Leu Arg Pro Tyr Val Ile Leu Thr Leu Val Val Val Phe Val Gly 370 375 380 tcc atg cag acc ttc ctc aac gta gcc acc tgg gtc atg ctc tct gag 1200 Ser Met Gln Thr Phe Leu Asn Val Ala Thr Trp Val Met Leu Ser Glu 385 390 395 400 ctc ttc ccg ctg gca atg cga ggt ttc gca atc ggt atc tca gtg ttc 1248 Leu Phe Pro Leu Ala Met Arg Gly Phe Ala Ile Gly Ile Ser Val Phe 405 410 415 ttc ctc tgg atc gca aac gcg ttc ctc gga ttg ttc ttc ccc acc atc 1296 Phe Leu Trp Ile Ala Asn Ala Phe Leu Gly Leu Phe Phe Pro Thr Ile 420 425 430 atg gaa gca gta gga cta acc gga acc ttc ttc atg ttc gcc gga atc 1344 Met Glu Ala Val Gly Leu Thr Gly Thr Phe Phe Met Phe Ala Gly Ile 435 440 445 ggt gtg gtt gcc ttg atc ttc atc tac acc cag gtt cct gaa act cgt 1392 Gly Val Val Ala Leu Ile Phe Ile Tyr Thr Gln Val Pro Glu Thr Arg 450 455 460 gga cgt acc ttg gag gag att gat gag gat gtt act tcc ggt gtc att 1440 Gly Arg Thr Leu Glu Glu Ile Asp Glu Asp Val Thr Ser Gly Val Ile 465 470 475 480 ttc aac aag gac atc cga aaa gga aag gtg cac taa 1476 Phe Asn Lys Asp Ile Arg Lys Gly Lys Val His 485 490

【００４２】 <210> 6 <211> 491 <212> PRT <213> Corynebacterium afermentans <400> 6 Met Ala Ser Thr Phe Ile Gln Ala Asp Ser Pro Glu Lys Ser Lys Lys 1 5 10 15 Leu Pro Pro Leu Thr Glu Gly Pro Tyr Arg Lys Arg Leu Phe Tyr Val 20 25 30 Ala Leu Val Ala Thr Phe Gly Gly Leu Leu Phe Gly Tyr Asp Thr Gly 35 40 45 Val Ile Asn Gly Ala Leu Asn Pro Met Thr Arg Glu Leu Gly Leu Thr 50 55 60 Ala Phe Thr Glu Gly Val Val Thr Ser Ser Leu Leu Phe Gly Ala Ala 65 70 75 80 Ala Gly Ala Met Phe Phe Gly Arg Ile Ser Asp Asn Trp Gly Arg Arg 85 90 95 Lys Thr Ile Ile Ser Leu Ala Val Ala Phe Phe Val Gly Thr Met Val 100 105 110 Cys Val Phe Ala Pro Ser Phe Ala Val Met Val Val Gly Arg Val Leu 115 120 125 Leu Gly Leu Ala Val Gly Gly Ala Ser Thr Val Val Pro Val Tyr Leu 130 135 140 Ala Glu Leu Ala Pro Phe Glu Ile Arg Gly Ser Leu Ala Gly Arg Asn 145 150 155 160 Glu Leu Met Ile Val Val Gly Gln Leu Ala Ala Phe Val Ile Asn Ala 165 170 175 Ile Ile Gly Asn Val Phe Gly His His Asp Gly Val Trp Arg Tyr Met 180 185 190 Leu Ala Ile Ala Ala Ile Pro Ala Ile Ala Leu Phe Phe Gly Met Leu 195 200 205 Arg Val Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Val Glu Arg Gly Arg Ile Asp 210 215 220 Glu Ala Arg Ala Val Leu Glu Thr Ile Arg Pro Leu Glu Arg Ala His 225 230 235 240 Ala Glu Val Ala Asp Val Glu His Leu Ala Arg Glu Glu His Ala Val 245 250 255 Ser Glu Lys Ser Met Gly Leu Arg Glu Ile Leu Ser Ser Lys Trp Leu 260 265 270 Val Arg Ile Leu Leu Val Gly Ile Gly Leu Gly Val Ala Gln Gln Leu 275 280 285 Thr Gly Ile Asn Ser Ile Met Tyr Tyr Gly Gln Val Val Leu Ile Glu 290 295 300 Ala Gly Phe Ser Glu Asn Ala Ala Leu Ile Ala Asn Val Ala Pro Gly 305 310 315 320 Val Ile Ala Val Val Gly Ala Phe Ile Ala Leu Trp Met Met Asp Arg 325 330 335 Ile Asn Arg Arg Thr Thr Leu Ile Thr Gly Tyr Ser Leu Thr Thr Ile 340 345 350 Ser His Val Leu Ile Gly Ile Ala Ser Ile Ala Phe Pro Val Gly Asp 355 360 365 Pro Leu Arg Pro Tyr Val Ile Leu Thr Leu Val Val Val Phe Val Gly 370 375 380 Ser Met Gln Thr Phe Leu Asn Val Ala Thr Trp Val Met Leu Ser Glu 385 390 395 400 Leu Phe Pro Leu Ala Met Arg Gly Phe Ala Ile Gly Ile Ser Val Phe 405 410 415 Phe Leu Trp Ile Ala Asn Ala Phe Leu Gly Leu Phe Phe Pro Thr Ile 420 425 430 Met Glu Ala Val Gly Leu Thr Gly Thr Phe Phe Met Phe Ala Gly Ile 435 440 445 Gly Val Val Ala Leu Ile Phe Ile Tyr Thr Gln Val Pro Glu Thr Arg 450 455 460 Gly Arg Thr Leu Glu Glu Ile Asp Glu Asp Val Thr Ser Gly Val Ile 465 470 475 480 Phe Asn Lys Asp Ile Arg Lys Gly Lys Val His 485 490

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松井 和彦 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 中松 亘 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA05 AA20 BA80 CA03 CA09 DA06 EA04 GA11 GA19 HA01 4B050 CC03 DD02 LL02 LL10 4H045 AA10 BA10 CA11 EA01 FA74

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク
   質。 （Ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有す
   るタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列におい
   て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
   加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、糖ト
   ランスポーター活性を有するタンパク質。
2. 【請求項２】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
   をコードするＤＮＡ。 （Ａ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有す
   るタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列におい
   て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
   加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、糖ト
   ランスポーター活性を有するタンパク質。
3. 【請求項３】 下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであ
   る請求項２記載のＤＮＡ。 （ａ）配列表の配列番号５に示す塩基配列を含むＤＮ
   Ａ。 （ｂ）配列表の配列番号５に示す塩基配列とストリンジ
   ェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、糖トランス
   ポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。