JP2003189863A - アスパラギン酸アミド並びにその誘導体の製造方法 - Google Patents
アスパラギン酸アミド並びにその誘導体の製造方法Info
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- JP2003189863A JP2003189863A JP2001392033A JP2001392033A JP2003189863A JP 2003189863 A JP2003189863 A JP 2003189863A JP 2001392033 A JP2001392033 A JP 2001392033A JP 2001392033 A JP2001392033 A JP 2001392033A JP 2003189863 A JP2003189863 A JP 2003189863A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 微生物を用いてアスパラギン酸アミド並びに
その誘導体を製造する方法、及び同方法に用いる微生物
を提供する。 【解決手段】 アスパルターゼをコードする遺伝子で形
質転換され、染色体ＤＮＡ上のα−アスパルチルジペプ
チダーゼをコードする遺伝子が破壊されたことによって
アスパラギン酸アミド並びにその誘導体分解活性が低下
又は消失した微生物を、本微生物が生育できる培地で培
養して、アスパラギン酸アミド並びにその誘導体を生成
させることによって、アスパラギン酸アミド並びにその
誘導体を製造する。
その誘導体を製造する方法、及び同方法に用いる微生物
を提供する。 【解決手段】 アスパルターゼをコードする遺伝子で形
質転換され、染色体ＤＮＡ上のα−アスパルチルジペプ
チダーゼをコードする遺伝子が破壊されたことによって
アスパラギン酸アミド並びにその誘導体分解活性が低下
又は消失した微生物を、本微生物が生育できる培地で培
養して、アスパラギン酸アミド並びにその誘導体を生成
させることによって、アスパラギン酸アミド並びにその
誘導体を製造する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、L-アスパラギン酸
アミド並びにその誘導体の製造に好適に利用できる変異
型アスパルターゼをコードするDNA、該遺伝子を含む組
換えDNA、該組み換えDNAにより形質転換された微生物、
および、該形質転換細胞を用いるL-アスパラギン酸アミ
ド並びにその誘導体の製造方法に関する。
アミド並びにその誘導体の製造に好適に利用できる変異
型アスパルターゼをコードするDNA、該遺伝子を含む組
換えDNA、該組み換えDNAにより形質転換された微生物、
および、該形質転換細胞を用いるL-アスパラギン酸アミ
ド並びにその誘導体の製造方法に関する。
【０００２】L-アスパラギン酸アミド誘導体の例として
は、L-アスパルチル-α-L-フェニルアラニンメチルエス
テルが挙げられる。L-アスパルチル-α-L-フェニルアラ
ニンメチルエステルは、低カロリー甘味料として世界中
で使用されている。また、L-アスパラギン酸アミドはL-
アスパルチル-α-L-フェニルアラニンメチルエステルの
原料として使用できる（特開平10-136992）。
は、L-アスパルチル-α-L-フェニルアラニンメチルエス
テルが挙げられる。L-アスパルチル-α-L-フェニルアラ
ニンメチルエステルは、低カロリー甘味料として世界中
で使用されている。また、L-アスパラギン酸アミドはL-
アスパルチル-α-L-フェニルアラニンメチルエステルの
原料として使用できる（特開平10-136992）。
【０００３】
【従来の技術】L-アスパラギン酸アミドの合成法は、p-
トシル-L-アスパラギン酸無水物（J.Am.Chem.Soc.,196
0,82,1641-1644）やZ-D-グルタミン酸（Collect.Czech.
Chem.Commun.,1977,42,560-563）から合成する方法が知
られているが、いずれの方法においても、基質への保護
基の導入と生成物からの保護基の脱離が必要となり、製
造工程が複雑となる。
トシル-L-アスパラギン酸無水物（J.Am.Chem.Soc.,196
0,82,1641-1644）やZ-D-グルタミン酸（Collect.Czech.
Chem.Commun.,1977,42,560-563）から合成する方法が知
られているが、いずれの方法においても、基質への保護
基の導入と生成物からの保護基の脱離が必要となり、製
造工程が複雑となる。
【０００４】一方、フマル酸からアスパラギン酸を合成
する酵素としてアスパルターゼが知られているが、アス
パルターゼの基質特異性は高く、フマル酸誘導体には作
用しないことが報告されている（Biochem., 1932, 250,
193-211, Acta. Chem. Scand., 1954, 8, 151-15
6）。
する酵素としてアスパルターゼが知られているが、アス
パルターゼの基質特異性は高く、フマル酸誘導体には作
用しないことが報告されている（Biochem., 1932, 250,
193-211, Acta. Chem. Scand., 1954, 8, 151-15
6）。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記問題に鑑み鋭意研究
の結果、本発明者らはフマル酸アミド並びにその誘導体
をアスパラギン酸アミド並びにその誘導体に変換する変
異型アスパルターゼの創生に成功し、本発明を完成させ
た。すなわち本発明は、以下のとおりである。
の結果、本発明者らはフマル酸アミド並びにその誘導体
をアスパラギン酸アミド並びにその誘導体に変換する変
異型アスパルターゼの創生に成功し、本発明を完成させ
た。すなわち本発明は、以下のとおりである。
【０００６】（発明１） 配列番号５記載のアミノ酸配
列、又は当該アミノ酸配列において１又は複数のアミノ
酸残基の付加、欠失若しくは置換がされたアミノ酸配列
を有するアスパルターゼ活性を有するタンパク質であっ
て、配列番号５記載のアミノ酸配列の327番目に相当す
るリジン残基がアスパラギン残基に置換され、かつ、下
記反応を触媒する能力を有するもの。
列、又は当該アミノ酸配列において１又は複数のアミノ
酸残基の付加、欠失若しくは置換がされたアミノ酸配列
を有するアスパルターゼ活性を有するタンパク質であっ
て、配列番号５記載のアミノ酸配列の327番目に相当す
るリジン残基がアスパラギン残基に置換され、かつ、下
記反応を触媒する能力を有するもの。
【化２】
（発明２） 発明１記載のタンパク質をコードするＤＮ
Ａ。 （発明３） 発明２記載のＤＮＡを含む組換えＤＮＡ。 （発明４） 発明２記載のＤＮＡで形質転換され、染色
体ＤＮＡ上のα−アスパルチルジペプチダーゼをコード
する遺伝子が破壊され、かつ、アスパラギン酸アミド並
びにその誘導体を産生する能力を有する微生物。 （発明５） 染色体ＤＮＡ上のα−アスパルチルジペプ
チダーゼをコードする遺伝子が破壊されたことによって
アスパラギン酸アミド並びにその誘導体分解活性が低下
又は消失したことを特徴とする発明３記載の微生物。 （発明６） エシェリヒア属細菌である発明４又は５記
載の微生物。 （発明７） 発明４〜６のいずれか一項に記載の微生物
を、本微生物が生育できる培地で培養して、アスパラギ
ン酸アミド並びにその誘導体を生成させることを特徴と
するアスパラギン酸アミド並びにその誘導体の製造方
法。
Ａ。 （発明３） 発明２記載のＤＮＡを含む組換えＤＮＡ。 （発明４） 発明２記載のＤＮＡで形質転換され、染色
体ＤＮＡ上のα−アスパルチルジペプチダーゼをコード
する遺伝子が破壊され、かつ、アスパラギン酸アミド並
びにその誘導体を産生する能力を有する微生物。 （発明５） 染色体ＤＮＡ上のα−アスパルチルジペプ
チダーゼをコードする遺伝子が破壊されたことによって
アスパラギン酸アミド並びにその誘導体分解活性が低下
又は消失したことを特徴とする発明３記載の微生物。 （発明６） エシェリヒア属細菌である発明４又は５記
載の微生物。 （発明７） 発明４〜６のいずれか一項に記載の微生物
を、本微生物が生育できる培地で培養して、アスパラギ
ン酸アミド並びにその誘導体を生成させることを特徴と
するアスパラギン酸アミド並びにその誘導体の製造方
法。
【０００７】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】＜本発明のタンパク質と本発明のＤＮＡ＞
本発明のタンパク質は、配列番号５記載のアミノ酸配
列、又は当該アミノ酸配列において１又は複数のアミノ
酸残基の付加、欠失若しくは置換がされたアミノ酸配列
を有するアスパルターゼ活性を有するタンパク質であっ
て、配列番号５記載のアミノ酸配列の327番目に相当す
るリジン残基がアスパラギン残基に置換され、かつ、下
記反応（以下、「反応１」ということがある。）を触媒
する能力を有するものである。
本発明のタンパク質は、配列番号５記載のアミノ酸配
列、又は当該アミノ酸配列において１又は複数のアミノ
酸残基の付加、欠失若しくは置換がされたアミノ酸配列
を有するアスパルターゼ活性を有するタンパク質であっ
て、配列番号５記載のアミノ酸配列の327番目に相当す
るリジン残基がアスパラギン残基に置換され、かつ、下
記反応（以下、「反応１」ということがある。）を触媒
する能力を有するものである。
【化３】
【０００９】本発明のタンパク質は、配列番号５記載の
アミノ酸配列の327番目に相当するリジン残基がアスパ
ラギン残基に置換される変異を除いては、アスパルター
ゼ活性を有するタンパク質、例えばエシェリヒア・コリ
由来の野生型アスパルターゼ活性を有するタンパク質と
同じアミノ酸配列を有していてよい。野生型アスパルタ
ーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列としては、
配列番号５に示すアミノ酸配列が挙げられる。尚、上記
変異以外に加えて、上記反応１を触媒する能力を付与す
る他の変異を有していてもよい。
アミノ酸配列の327番目に相当するリジン残基がアスパ
ラギン残基に置換される変異を除いては、アスパルター
ゼ活性を有するタンパク質、例えばエシェリヒア・コリ
由来の野生型アスパルターゼ活性を有するタンパク質と
同じアミノ酸配列を有していてよい。野生型アスパルタ
ーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列としては、
配列番号５に示すアミノ酸配列が挙げられる。尚、上記
変異以外に加えて、上記反応１を触媒する能力を付与す
る他の変異を有していてもよい。
【００１０】本発明のタンパク質は、野生型アスパルタ
ーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡに、同
ＤＮＡによってコードされるアスパルターゼ活性を有す
るタンパク質の下記反応を触媒する能力を付与する変異
を導入することによって、取得することができる。
ーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡに、同
ＤＮＡによってコードされるアスパルターゼ活性を有す
るタンパク質の下記反応を触媒する能力を付与する変異
を導入することによって、取得することができる。
【化４】
野生型アスパルターゼ活性を有するタンパク質として
は、エシェリヒア・コリ由来のアスパルターゼ活性を有
するタンパク質が挙げられる。また、エシェリヒア・コ
リ由来の野生型アスパルターゼ活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡとしては、配列番号５に示す塩基配
列を有するＤＮＡが挙げられる。変異は、部位特異的変
異法等によって計画的に導入することができる。
は、エシェリヒア・コリ由来のアスパルターゼ活性を有
するタンパク質が挙げられる。また、エシェリヒア・コ
リ由来の野生型アスパルターゼ活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡとしては、配列番号５に示す塩基配
列を有するＤＮＡが挙げられる。変異は、部位特異的変
異法等によって計画的に導入することができる。
【００１１】また、本発明のタンパク質は、前記変異以
外の位置において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、
欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、かつ、反応１を触
媒する能力を有するタンパク質であってもよい。ここ
で、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構
造における位置や種類によっても異なる。それは、アミ
ノ酸によっては、類縁性の高いアミノ酸が存在し、その
ようなアミノ酸の違いが、タンパク質の立体構造に大き
な影響を与えないことに由来する。従って、アスパルタ
ーゼ活性を有するタンパク質を構成する４７８アミノ酸
残基全体に対し、３０〜５０％以上、好ましくは５０〜
７０％以上、より好ましくは８０％以上の相同性を有
し、反応１を触媒する能力を有するものであってもよ
い。
外の位置において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、
欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、かつ、反応１を触
媒する能力を有するタンパク質であってもよい。ここ
で、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構
造における位置や種類によっても異なる。それは、アミ
ノ酸によっては、類縁性の高いアミノ酸が存在し、その
ようなアミノ酸の違いが、タンパク質の立体構造に大き
な影響を与えないことに由来する。従って、アスパルタ
ーゼ活性を有するタンパク質を構成する４７８アミノ酸
残基全体に対し、３０〜５０％以上、好ましくは５０〜
７０％以上、より好ましくは８０％以上の相同性を有
し、反応１を触媒する能力を有するものであってもよ
い。
【００１２】尚、本発明において、３２７番目のリジン
残基とは、配列番号５に示す野生型アスパルターゼ活性
を有するタンパク質のアミノ酸配列における位置であ
る。上記のような活性に影響を与えないアミノ酸の欠
失、挿入、付加、又は逆位によって位置が前後すること
がある。例えば、Ｎ末端部に１つのアミノ酸残基が挿入
されれば本来３２７番目のリジン残基は３２８番目とな
るが、そのような３２７番目のリジン残基に相当するリ
ジン残基を、本発明においては３２７番目のリジン残基
と呼ぶこととする。
残基とは、配列番号５に示す野生型アスパルターゼ活性
を有するタンパク質のアミノ酸配列における位置であ
る。上記のような活性に影響を与えないアミノ酸の欠
失、挿入、付加、又は逆位によって位置が前後すること
がある。例えば、Ｎ末端部に１つのアミノ酸残基が挿入
されれば本来３２７番目のリジン残基は３２８番目とな
るが、そのような３２７番目のリジン残基に相当するリ
ジン残基を、本発明においては３２７番目のリジン残基
と呼ぶこととする。
【００１３】上記のような本発明のタンパク質をコード
するＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定
の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は
逆位を含むように塩基配列を改変することによって得ら
れる。また、当該ＤＮＡは、従来知られている変異処理
によっても取得され得る。変異処理としては、アスパル
ターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡをヒ
ドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びア
スパルターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮ
Ａを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫
外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグ
アニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用
いられている変異剤によって処理する方法が挙げられ
る。
するＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定
の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は
逆位を含むように塩基配列を改変することによって得ら
れる。また、当該ＤＮＡは、従来知られている変異処理
によっても取得され得る。変異処理としては、アスパル
ターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡをヒ
ドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びア
スパルターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮ
Ａを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫
外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグ
アニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用
いられている変異剤によって処理する方法が挙げられ
る。
【００１４】また、上記のような塩基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位等には、アスパルターゼ活性を有す
るタンパク質を保持する微生物の属、種、又は菌株の個
体差に基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又は
variant）も含まれる。
入、付加、又は逆位等には、アスパルターゼ活性を有す
るタンパク質を保持する微生物の属、種、又は菌株の個
体差に基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又は
variant）も含まれる。
【００１５】上記のような変異を有するＤＮＡを適当な
細胞で発現させ、発現産物のアスパルターゼ活性を有す
るタンパク質活性（反応1を触媒する能力）を調べるこ
とにより、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡが得
られる。また、変異を有するアスパルターゼ活性を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡまたはこれを保持する
細胞から、例えば配列表の配列番号５に記載の塩基配列
を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズし、かつ、アスパルターゼ活性を有するタンパク
質活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離す
ることによっても、タンパク質と実質的に同一のタンパ
ク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「スト
リンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリ
ッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されな
い条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難
であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例
えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリ
ダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリ
ダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイ
ゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ，
０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が
挙げられる。このような条件でハイブリダイズする遺伝
子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活
性中心の変異により活性が低下又は消失したものも含ま
れるが、それらについては、市販の発現ベクターにつな
ぎアスパルターゼ活性を有するタンパク質活性を調べる
ことによって容易に取り除くことができる。
細胞で発現させ、発現産物のアスパルターゼ活性を有す
るタンパク質活性（反応1を触媒する能力）を調べるこ
とにより、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡが得
られる。また、変異を有するアスパルターゼ活性を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡまたはこれを保持する
細胞から、例えば配列表の配列番号５に記載の塩基配列
を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズし、かつ、アスパルターゼ活性を有するタンパク
質活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離す
ることによっても、タンパク質と実質的に同一のタンパ
ク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「スト
リンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリ
ッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されな
い条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難
であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例
えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリ
ダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリ
ダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイ
ゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ，
０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が
挙げられる。このような条件でハイブリダイズする遺伝
子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活
性中心の変異により活性が低下又は消失したものも含ま
れるが、それらについては、市販の発現ベクターにつな
ぎアスパルターゼ活性を有するタンパク質活性を調べる
ことによって容易に取り除くことができる。
【００１６】本発明のＤＮＡの具体例は、配列番号７に
記載される塩基配列の1番から1434番までの配列を有す
るＤＮＡである。
記載される塩基配列の1番から1434番までの配列を有す
るＤＮＡである。
【００１７】＜野生型アスパルターゼ活性を有するタン
パク質をコードするＤＮＡ＞野生型アスパルターゼ活性
を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、「野生
型aspA」ということがある。）は、本発明のＤＮＡの調
製材料として利用できる。野生型aspAの構造はエシェリ
ヒア・コリにおいてすでに明らかであるので（配列番号
５）、その配列に基づいてオリゴヌクレオチドを作製
し、それを用いたＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション
によって、エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡ又は染色
体遺伝子ライブラリーから野生型aspAを取得することも
できる。
パク質をコードするＤＮＡ＞野生型アスパルターゼ活性
を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、「野生
型aspA」ということがある。）は、本発明のＤＮＡの調
製材料として利用できる。野生型aspAの構造はエシェリ
ヒア・コリにおいてすでに明らかであるので（配列番号
５）、その配列に基づいてオリゴヌクレオチドを作製
し、それを用いたＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション
によって、エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡ又は染色
体遺伝子ライブラリーから野生型aspAを取得することも
できる。
【００１８】後記実施例に記載の本発明のＤＮＡは、上
記のようにして取得された野生型aspAにエラープローン
（error-prone）PCRによりランダムに変異を導入し、変
異が導入された遺伝子をエシェリヒア・コリに導入し、
形質転換体の無細胞抽出液を調製し、当該無細胞抽出液
にフマル酸モノアミドアミノ化反応を有するコロニーを
選択することによって取得されたものである。
記のようにして取得された野生型aspAにエラープローン
（error-prone）PCRによりランダムに変異を導入し、変
異が導入された遺伝子をエシェリヒア・コリに導入し、
形質転換体の無細胞抽出液を調製し、当該無細胞抽出液
にフマル酸モノアミドアミノ化反応を有するコロニーを
選択することによって取得されたものである。
【００１９】野生型aspAは、エシェリヒア属細菌由来の
遺伝子および他の生物由来の遺伝子のいずれも使用する
ことができる。野生型aspAとしては、配列番号５記載の
野生型aspA遺伝子の他に、上述したようにアスパルター
ゼ活性を実質的に損なわないような１若しくは数個のア
ミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む
アミノ酸配列を有するものであってもよい。
遺伝子および他の生物由来の遺伝子のいずれも使用する
ことができる。野生型aspAとしては、配列番号５記載の
野生型aspA遺伝子の他に、上述したようにアスパルター
ゼ活性を実質的に損なわないような１若しくは数個のア
ミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む
アミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００２０】エシェリヒア・コリの野生型aspAをコード
する遺伝子がクローニングされ、塩基配列が明らかにな
っている（GenBank Accession No.AAC77099）。したが
って、その塩基配列に基づいて作製したプライマーを用
いて、エシェリヒア属細菌の染色体DNAを鋳型とするPCR
によって、野生型aspAを取得することができる。このよ
うなプライマーとして具体的には、配列番号３及び４に
示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられ
る。他の生物の野生型aspAも、同様にして取得され得
る。
する遺伝子がクローニングされ、塩基配列が明らかにな
っている（GenBank Accession No.AAC77099）。したが
って、その塩基配列に基づいて作製したプライマーを用
いて、エシェリヒア属細菌の染色体DNAを鋳型とするPCR
によって、野生型aspAを取得することができる。このよ
うなプライマーとして具体的には、配列番号３及び４に
示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられ
る。他の生物の野生型aspAも、同様にして取得され得
る。
【００２１】染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌
から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miu
ra, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工
学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、
１９９２年参照）等により調製することができる。
から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miu
ra, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工
学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、
１９９２年参照）等により調製することができる。
【００２２】PCR法により増幅された野生型aspAを含む
ＤＮＡ断片をエシェリヒア属細菌に導入するには、通常
のタンパク質発現に用いられる種々のベクターを用いる
ことができる。このようなベクターとしては、pUC19、p
UC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322,
pACYC184, pMW219等が挙げられる。
ＤＮＡ断片をエシェリヒア属細菌に導入するには、通常
のタンパク質発現に用いられる種々のベクターを用いる
ことができる。このようなベクターとしては、pUC19、p
UC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322,
pACYC184, pMW219等が挙げられる。
【００２３】野生型aspA遺伝子を含む組換えベクターを
エシェリヒア属細菌に導入するには、D.A.Morrisonの方
法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは
受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性
を増す方法（Mandel,M. andHiga,A.,J.Mol.Biol.,53,15
9(1970)）等、エシェリヒア属細菌の形質転換に通常用
いられている方法により行うことができる。
エシェリヒア属細菌に導入するには、D.A.Morrisonの方
法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは
受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性
を増す方法（Mandel,M. andHiga,A.,J.Mol.Biol.,53,15
9(1970)）等、エシェリヒア属細菌の形質転換に通常用
いられている方法により行うことができる。
【００２４】＜本発明の組換えＤＮＡ＞本発明の組換え
ＤＮＡを作製するには、本発明のＤＮＡを適当なベクタ
ーに連結する。ベクターとしては、pUC19、pUC18、pBR3
22、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pACYC177、
pACYC184、pMW219、pMW118等が挙げられる。
ＤＮＡを作製するには、本発明のＤＮＡを適当なベクタ
ーに連結する。ベクターとしては、pUC19、pUC18、pBR3
22、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pACYC177、
pACYC184、pMW219、pMW118等が挙げられる。
【００２５】上記のように調製した組換えＤＮＡをエシ
ェリヒア属細菌に導入するには、これまでに報告されて
いる形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリ
ヒア・コリ Ｋ−１２について報告されているような、
受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性
を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol.,53,
159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて
報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテン
トセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.
H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (197
7)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌
類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌
の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラス
トまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡを
ＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang,S.and Choen,S.
N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,W
ard,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);H
innen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。また、エ
レクトロポレーション法（Methods for general and mo
lecular bacteriology, 1994, Philipp Gerhardt ed.,
ASM Press, 14.1.3.3 Electroporation procedure）も
利用することができる。
ェリヒア属細菌に導入するには、これまでに報告されて
いる形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリ
ヒア・コリ Ｋ−１２について報告されているような、
受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性
を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol.,53,
159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて
報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテン
トセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.
H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (197
7)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌
類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌
の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラス
トまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡを
ＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang,S.and Choen,S.
N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,W
ard,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);H
innen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。また、エ
レクトロポレーション法（Methods for general and mo
lecular bacteriology, 1994, Philipp Gerhardt ed.,
ASM Press, 14.1.3.3 Electroporation procedure）も
利用することができる。
【００２６】導入されるＤＮＡは、aspA固有のプロモー
ターによって発現制御されてもよく、プロモーターをｌ
ａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモ
ーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプ
ロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、
ａｍｙＥプロモーター等の強力なプロモーターと置換
し、これらのプロモーターによって発現制御されてもよ
い。
ターによって発現制御されてもよく、プロモーターをｌ
ａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモ
ーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプ
ロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、
ａｍｙＥプロモーター等の強力なプロモーターと置換
し、これらのプロモーターによって発現制御されてもよ
い。
【００２７】染色体ＤＮＡの調製、染色体ＤＮＡライブ
ラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラ
スミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転
換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定
等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採
用することができる。これらの方法は、Sambrook, J.,F
ritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Clonin
g A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されてい
る。
ラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラ
スミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転
換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定
等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採
用することができる。これらの方法は、Sambrook, J.,F
ritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Clonin
g A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されてい
る。
【００２８】＜本発明の微生物＞本発明に用いられる微
生物は、配列番号５記載のアミノ酸配列、又は当該アミ
ノ酸配列において１又は複数のアミノ酸残基の付加、欠
失若しくは置換がされたアミノ酸配列を有するアスパル
ターゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号５記
載のアミノ酸配列の327番目に相当するリジン残基がア
スパラギン残基に置換され、かつ、反応１を触媒する能
力を有するタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換さ
れ、染色体ＤＮＡ上のα−アスパルチルジペプチダーゼ
をコードする遺伝子が破壊され、かつ、アスパラギン酸
アミド並びにその誘導体を産生する能力を有する微生物
である。好ましくは、染色体ＤＮＡ上のα−アスパルチ
ルジペプチダーゼをコードする遺伝子が破壊されたこと
によってアスパラギン酸アミド並びにその誘導体分解活
性が低下又は消失している微生物である。
生物は、配列番号５記載のアミノ酸配列、又は当該アミ
ノ酸配列において１又は複数のアミノ酸残基の付加、欠
失若しくは置換がされたアミノ酸配列を有するアスパル
ターゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号５記
載のアミノ酸配列の327番目に相当するリジン残基がア
スパラギン残基に置換され、かつ、反応１を触媒する能
力を有するタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換さ
れ、染色体ＤＮＡ上のα−アスパルチルジペプチダーゼ
をコードする遺伝子が破壊され、かつ、アスパラギン酸
アミド並びにその誘導体を産生する能力を有する微生物
である。好ましくは、染色体ＤＮＡ上のα−アスパルチ
ルジペプチダーゼをコードする遺伝子が破壊されたこと
によってアスパラギン酸アミド並びにその誘導体分解活
性が低下又は消失している微生物である。
【００２９】以下、本発明の微生物について説明する。
本発明の微生物は、微生物のアスパラギン酸アミド並び
にその誘導体分解活性を低下又は消失させ、さらに本発
明のＤＮＡで形質転換することによって得られる。ま
た、本発明の微生物は、本発明のＤＮＡで形質転換した
後に、形質転換株のアスパラギン酸アミド並びにその誘
導体分解活性を低下又は消失させることによっても、取
得することができる。
本発明の微生物は、微生物のアスパラギン酸アミド並び
にその誘導体分解活性を低下又は消失させ、さらに本発
明のＤＮＡで形質転換することによって得られる。ま
た、本発明の微生物は、本発明のＤＮＡで形質転換した
後に、形質転換株のアスパラギン酸アミド並びにその誘
導体分解活性を低下又は消失させることによっても、取
得することができる。
【００３０】本発明のＤＮＡを宿主微生物に導入するの
に使用されるベクターとしては、宿主微生物において複
製可能なものであればよく、具体的には、pBR322、pTWV
228、pMW119、pUC19、pUC18等のプラスミドベクターが
挙げられる。
に使用されるベクターとしては、宿主微生物において複
製可能なものであればよく、具体的には、pBR322、pTWV
228、pMW119、pUC19、pUC18等のプラスミドベクターが
挙げられる。
【００３１】本発明のＤＮＡとエシェリヒア属細菌で機
能するベクターを連結して組換えＤＮＡを調製するに
は、本発明のＤＮＡの末端に合うような制限酵素でベク
ターを切断し、両者を連結すればよい。連結は、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通であ
る
能するベクターを連結して組換えＤＮＡを調製するに
は、本発明のＤＮＡの末端に合うような制限酵素でベク
ターを切断し、両者を連結すればよい。連結は、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通であ
る
【００３２】上記のように調製した組換えＤＮＡを宿主
微生物に導入するには、例えばエシェリヒア・コリにつ
いて報告されているような、D.A.Morrisonの方法（Meth
odsin Enzymology, 68, 326, 1979）あるいは受容菌細
胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方
法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159(197
0)）等により行うことができる。また、プラスミドベク
ター以外にも、トランスダクション、トランスポゾン
（Berg,D.E. and Berg,C.M.,Bio/Technol.,1,417(198
3)）、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５）または
相同性組換え（Experiments in Molecular Genetics, C
old Spring Harbor Lab.(1972)）を用いた方法で、宿主
のゲノムに組み込んでもよい。
微生物に導入するには、例えばエシェリヒア・コリにつ
いて報告されているような、D.A.Morrisonの方法（Meth
odsin Enzymology, 68, 326, 1979）あるいは受容菌細
胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方
法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159(197
0)）等により行うことができる。また、プラスミドベク
ター以外にも、トランスダクション、トランスポゾン
（Berg,D.E. and Berg,C.M.,Bio/Technol.,1,417(198
3)）、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５）または
相同性組換え（Experiments in Molecular Genetics, C
old Spring Harbor Lab.(1972)）を用いた方法で、宿主
のゲノムに組み込んでもよい。
【００３３】本発明のＤＮＡを発現させるためのプロモ
ーターとしては、aspA遺伝子固有のプロモーターが宿主
細胞で機能する場合には該プロモーターを使用すること
ができる。また、必要に応じて宿主細胞で働く他のプロ
モーターをアスパルターゼをコードするDNAに連結し、
該プロモーター制御下で発現させるようにしてもよい。
宿主としてエシェリヒア属細菌を用いる場合、このよう
なプロモーターとしては、lacプロモーター、trpプロモ
ーター、trcプロモーター、tacプロモーター、ラムダフ
ァージのPRプロモーター、PＬプロモーター、tetプロモ
ーター、amyEプロモーター、spacプロモーター等が挙げ
られる。また、pUC18及びpUC19のようにプロモーターを
備えた発現ベクターを用い、これに同プロモーター制御
下で発現するようにアスパルターゼをコードするＤＮＡ
断片を挿入してもよい。
ーターとしては、aspA遺伝子固有のプロモーターが宿主
細胞で機能する場合には該プロモーターを使用すること
ができる。また、必要に応じて宿主細胞で働く他のプロ
モーターをアスパルターゼをコードするDNAに連結し、
該プロモーター制御下で発現させるようにしてもよい。
宿主としてエシェリヒア属細菌を用いる場合、このよう
なプロモーターとしては、lacプロモーター、trpプロモ
ーター、trcプロモーター、tacプロモーター、ラムダフ
ァージのPRプロモーター、PＬプロモーター、tetプロモ
ーター、amyEプロモーター、spacプロモーター等が挙げ
られる。また、pUC18及びpUC19のようにプロモーターを
備えた発現ベクターを用い、これに同プロモーター制御
下で発現するようにアスパルターゼをコードするＤＮＡ
断片を挿入してもよい。
【００３４】微生物が染色体上に本発明のＤＮＡを保持
している場合には、プロモーター等の発現調節配列を強
力なものに置換することによって（特開平1-215280号公
報参照）、アスパルターゼ活性を増強することができ
る。たとえば、前記のエシェリヒア属細菌で機能するプ
ロモーターは、いずれも強力なプロモーターとして知ら
れている。
している場合には、プロモーター等の発現調節配列を強
力なものに置換することによって（特開平1-215280号公
報参照）、アスパルターゼ活性を増強することができ
る。たとえば、前記のエシェリヒア属細菌で機能するプ
ロモーターは、いずれも強力なプロモーターとして知ら
れている。
【００３５】次に、微生物のアスパラギン酸アミド並び
にその誘導体分解活性を低下又は消失させる方法につい
て説明する。アスパラギン酸アミド並びにその誘導体分
解活性を低下又は消失させるには、例えば、細胞内のα
−アスパルチルジペプチダーゼ活性が低下又は消失する
ように、α−アスパルチルジペプチダーゼをコードする
遺伝子を突然変異させるか、あるいは、同遺伝子を破壊
すればよい。エシェリヒア・コリでは、α−アスパルチ
ルジペプチダーゼはpepE遺伝子によってコードされてい
る。pepE遺伝子破壊株は、例えば、pepE遺伝子の一部を
含むＤＮＡ断片を、微生物の染色体上のpepE遺伝子との
相同組換えにより染色体ＤＮＡに組み込むことによっ
て、得ることができる。
にその誘導体分解活性を低下又は消失させる方法につい
て説明する。アスパラギン酸アミド並びにその誘導体分
解活性を低下又は消失させるには、例えば、細胞内のα
−アスパルチルジペプチダーゼ活性が低下又は消失する
ように、α−アスパルチルジペプチダーゼをコードする
遺伝子を突然変異させるか、あるいは、同遺伝子を破壊
すればよい。エシェリヒア・コリでは、α−アスパルチ
ルジペプチダーゼはpepE遺伝子によってコードされてい
る。pepE遺伝子破壊株は、例えば、pepE遺伝子の一部を
含むＤＮＡ断片を、微生物の染色体上のpepE遺伝子との
相同組換えにより染色体ＤＮＡに組み込むことによっ
て、得ることができる。
【００３６】具体的には、例えば、pepE遺伝子の一部を
欠失し、正常に機能するα−アスパルチルジペプチダー
ゼを産生しないように改変したpepE遺伝子（欠失型pepE
遺伝子）を含むＤＮＡでエシェリヒア・コリ等の微生物
を形質転換し、欠失型pepE遺伝子と染色体上のpepE遺伝
子との間で組換えを起こさせることにより、染色体上の
pepE遺伝子を破壊することができる。このような相同組
換えによる遺伝子破壊は既に確立しており、直鎖ＤＮＡ
を用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを
用いる方法などによっても遺伝子破壊を行うことができ
る。以下に、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用
いる方法を説明する。
欠失し、正常に機能するα−アスパルチルジペプチダー
ゼを産生しないように改変したpepE遺伝子（欠失型pepE
遺伝子）を含むＤＮＡでエシェリヒア・コリ等の微生物
を形質転換し、欠失型pepE遺伝子と染色体上のpepE遺伝
子との間で組換えを起こさせることにより、染色体上の
pepE遺伝子を破壊することができる。このような相同組
換えによる遺伝子破壊は既に確立しており、直鎖ＤＮＡ
を用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを
用いる方法などによっても遺伝子破壊を行うことができ
る。以下に、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用
いる方法を説明する。
【００３７】エシェリヒア・コリのα−アスパルチルペ
プチダーゼをコードする遺伝子（pepE）は塩基配列が報
告されており（GenBank accession number AAC7699
1）、この塩基配列に基づいてプライマーを合成し、エ
シェリヒア属細菌、例えばエシェリヒア・コリW3110株
等の染色体ＤＮＡを鋳型にしてポリメラーゼチェインリ
アクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction；
White,T.J. et al., Trends Genet., 5,185 (1989)参
照）により、pepE遺伝子を取得することが可能である。
このようなプライマーとして具体的には、配列番号１及
び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げ
られる。
プチダーゼをコードする遺伝子（pepE）は塩基配列が報
告されており（GenBank accession number AAC7699
1）、この塩基配列に基づいてプライマーを合成し、エ
シェリヒア属細菌、例えばエシェリヒア・コリW3110株
等の染色体ＤＮＡを鋳型にしてポリメラーゼチェインリ
アクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction；
White,T.J. et al., Trends Genet., 5,185 (1989)参
照）により、pepE遺伝子を取得することが可能である。
このようなプライマーとして具体的には、配列番号１及
び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げ
られる。
【００３８】上記pepE遺伝子を材料として、pepE遺伝子
の内部を欠失し、正常に機能するα−アスパルチルジペ
プチダーゼを産生しないように改変したpepE遺伝子（欠
失型pepE遺伝子）を含むＤＮＡを作製する。この欠失型
pepE遺伝子を、宿主染色体上のpepE遺伝子と置換するに
は以下のようにすればよい。すなわち、温度感受性複製
起点と変異型pepE遺伝子とアンピシリン等の薬剤に耐性
を示すマーカー遺伝子とを挿入して組換えＤＮＡを調製
し、この組換えＤＮＡで微生物を形質転換し、温度感受
性複製起点が機能しない温度で形質転換株を培養し、続
いてこれを薬剤を含む培地で培養することにより、組換
えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形質転換株が得
られる。
の内部を欠失し、正常に機能するα−アスパルチルジペ
プチダーゼを産生しないように改変したpepE遺伝子（欠
失型pepE遺伝子）を含むＤＮＡを作製する。この欠失型
pepE遺伝子を、宿主染色体上のpepE遺伝子と置換するに
は以下のようにすればよい。すなわち、温度感受性複製
起点と変異型pepE遺伝子とアンピシリン等の薬剤に耐性
を示すマーカー遺伝子とを挿入して組換えＤＮＡを調製
し、この組換えＤＮＡで微生物を形質転換し、温度感受
性複製起点が機能しない温度で形質転換株を培養し、続
いてこれを薬剤を含む培地で培養することにより、組換
えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形質転換株が得
られる。
【００３９】こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込ま
れた株は、染色体上にもともと存在するpepE遺伝子配列
との組換えを起こし、染色体pepE遺伝子と欠失型pepE遺
伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベ
クター部分、温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカ
ー）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。したがっ
て、この状態では正常なpepE遺伝子が優性であるので、
形質転換株はpepEを発現する。
れた株は、染色体上にもともと存在するpepE遺伝子配列
との組換えを起こし、染色体pepE遺伝子と欠失型pepE遺
伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベ
クター部分、温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカ
ー）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。したがっ
て、この状態では正常なpepE遺伝子が優性であるので、
形質転換株はpepEを発現する。
【００４０】次に、染色体ＤＮＡ上に欠失型pepE遺伝子
のみを残すために、２個のpepE遺伝子の組換えにより１
コピーのpepE遺伝子を、ベクター部分（温度感受性複製
起点及び薬剤耐性マーカーを含む）とともに染色体ＤＮ
Ａから脱落させる。その際、正常なpepE遺伝子が染色体
ＤＮＡ上に残され、欠失型pepE遺伝子が切り出される場
合と、反対に欠失型pepE遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残さ
れ、正常なpepE遺伝子が切り出される場合がある。いず
れの場合も、温度感受性複製起点が機能する温度で培養
すれば、切り出されたＤＮＡはプラスミド状で細胞内に
保持される。次に、温度感受性複製起点が機能しない温
度で培養すると、欠失型pepE遺伝子が染色体ＤＮＡ上に
残された場合は、正常なpepE遺伝子を含むプラスミドが
細胞から脱落するためα−アスパルチルジペプチダーゼ
活性が低下又は消失するが、正常なpepE遺伝子が染色体
ＤＮＡ上に残された場合はα−アスパルチルジペプチダ
ーゼ活性を示す。したがって、組換え株を、例えばアス
パラギン酸アミド並びにその誘導体を含む培地に生育さ
せ、培養液を薄層クロマトグラムにより分析して、アス
パラギン酸アミド並びにその誘導体がアスパラギン酸に
分解していないクローンを選択することによって、目的
の株を得ることができる。さらに、候補株の染色体DNA
からPCRによりpepEを含む断片を増幅させ、制限酵素解
析等によってpepE遺伝子が破壊されていることを確認す
ることが好ましい。
のみを残すために、２個のpepE遺伝子の組換えにより１
コピーのpepE遺伝子を、ベクター部分（温度感受性複製
起点及び薬剤耐性マーカーを含む）とともに染色体ＤＮ
Ａから脱落させる。その際、正常なpepE遺伝子が染色体
ＤＮＡ上に残され、欠失型pepE遺伝子が切り出される場
合と、反対に欠失型pepE遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残さ
れ、正常なpepE遺伝子が切り出される場合がある。いず
れの場合も、温度感受性複製起点が機能する温度で培養
すれば、切り出されたＤＮＡはプラスミド状で細胞内に
保持される。次に、温度感受性複製起点が機能しない温
度で培養すると、欠失型pepE遺伝子が染色体ＤＮＡ上に
残された場合は、正常なpepE遺伝子を含むプラスミドが
細胞から脱落するためα−アスパルチルジペプチダーゼ
活性が低下又は消失するが、正常なpepE遺伝子が染色体
ＤＮＡ上に残された場合はα−アスパルチルジペプチダ
ーゼ活性を示す。したがって、組換え株を、例えばアス
パラギン酸アミド並びにその誘導体を含む培地に生育さ
せ、培養液を薄層クロマトグラムにより分析して、アス
パラギン酸アミド並びにその誘導体がアスパラギン酸に
分解していないクローンを選択することによって、目的
の株を得ることができる。さらに、候補株の染色体DNA
からPCRによりpepEを含む断片を増幅させ、制限酵素解
析等によってpepE遺伝子が破壊されていることを確認す
ることが好ましい。
【００４１】＜本発明の製造方法＞上記のようにして得
られる本発明のＤＮＡで形質転換され、アスパラギン酸
アミド並びにその誘導体分解活性が低下又は消失した微
生物を培地で培養し、アスパラギン酸アミド並びにその
誘導体を生成させ、同アスパラギン酸アミド並びにその
誘導体を採取することにより、アスパラギン酸アミド並
びにその誘導体を製造することができる。培養の際、培
地中に本発明のタンパク質の基質となる物質又はその前
駆体を添加することが好ましい。さらに、本発明の製造
方法は、培養された本発明の微生物を培地から分離しそ
のまま、あるいは、培養された微生物を培地から分離し
又は分離しないで細胞破砕して得られる細胞抽出液、又
は、同細胞抽出液から得られる粗精製酵素若しくは精製
酵素として、これと本発明のタンパク質の基質となる物
質又はその前駆体とを混合することによってアスパラギ
ン酸アミド並びにその誘導体を生成させ、同アスパラギ
ン酸アミド並びにその誘導体を採取することにより、ア
スパラギン酸アミド並びにその誘導体を製造する方法も
含む。使用する微生物は、一種でもよく、任意の二種以
上の混合物として用いてもよい。
られる本発明のＤＮＡで形質転換され、アスパラギン酸
アミド並びにその誘導体分解活性が低下又は消失した微
生物を培地で培養し、アスパラギン酸アミド並びにその
誘導体を生成させ、同アスパラギン酸アミド並びにその
誘導体を採取することにより、アスパラギン酸アミド並
びにその誘導体を製造することができる。培養の際、培
地中に本発明のタンパク質の基質となる物質又はその前
駆体を添加することが好ましい。さらに、本発明の製造
方法は、培養された本発明の微生物を培地から分離しそ
のまま、あるいは、培養された微生物を培地から分離し
又は分離しないで細胞破砕して得られる細胞抽出液、又
は、同細胞抽出液から得られる粗精製酵素若しくは精製
酵素として、これと本発明のタンパク質の基質となる物
質又はその前駆体とを混合することによってアスパラギ
ン酸アミド並びにその誘導体を生成させ、同アスパラギ
ン酸アミド並びにその誘導体を採取することにより、ア
スパラギン酸アミド並びにその誘導体を製造する方法も
含む。使用する微生物は、一種でもよく、任意の二種以
上の混合物として用いてもよい。
【００４２】本発明の方法によって製造されるアスパラ
ギン酸アミド誘導体としては、Ｌ−アスパラギン酸アミ
ド、L−アスパルチル−α−L−アラニン、L−アスパル
チル−α−L−フェニルアラニン等が挙げられる。本発
明においては、これらの中ではＬ−アスパラギン酸アミ
ドが好ましい。
ギン酸アミド誘導体としては、Ｌ−アスパラギン酸アミ
ド、L−アスパルチル−α−L−アラニン、L−アスパル
チル−α−L−フェニルアラニン等が挙げられる。本発
明においては、これらの中ではＬ−アスパラギン酸アミ
ドが好ましい。
【００４３】前記基質又はその前駆体としては、目的と
するアスパラギン酸アミド並びにその誘導体に対応する
フマル酸アミド並びにその誘導体が挙げられる。フマル
酸アミド誘導体としては、フマリル−L−アラニン、フ
マリル−L−フェニルアラニン等が挙げられる。例え
ば、Ｌ−アスパラギン酸アミドを目的とする場合には、
対応する基質として、フマル酸モノアミドを用いる。
するアスパラギン酸アミド並びにその誘導体に対応する
フマル酸アミド並びにその誘導体が挙げられる。フマル
酸アミド誘導体としては、フマリル−L−アラニン、フ
マリル−L−フェニルアラニン等が挙げられる。例え
ば、Ｌ−アスパラギン酸アミドを目的とする場合には、
対応する基質として、フマル酸モノアミドを用いる。
【００４４】本発明における「本微生物が生育できる培
地」とは、本微生物が代謝することによってエネルギー
を獲得できるものであればよい。この限りにおいて、炭
素源、窒素源、リン源、Ｓ源、無機イオン等、更に必要
ならばビタミン、有機窒素源を含有する通常の培地を用
いれば良い。炭素源としては、グルコース等の炭水化
物、グリセロール等のアルコール類、酢酸等の有機酸、
窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アン
モニウム塩、硝酸およびその塩等、リン源としてはリン
酸１カリウム等の無機リン酸およびその塩等、Ｓ源とし
ては硫酸マグネシウム等、無機イオンとしては、マグネ
シウムイオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイ
オン、その他が必要に応じ適宜使用される。有機栄養源
としては、ビタミン、アミノ酸等及びこれらを含有する
酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリ
カー、カゼイン分解物その他が適宜用いられる。培養条
件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下ｐＨ５
〜８及び温度２５〜４０℃の範囲内でｐＨ及び温度を適
当に制限しつつ１２〜７２時間程度培養を行なえばよ
い。また、前記培地に基質又はその前駆体を添加しても
よい。培地への基質の添加は培養初期でも培養途中でも
構わない。
地」とは、本微生物が代謝することによってエネルギー
を獲得できるものであればよい。この限りにおいて、炭
素源、窒素源、リン源、Ｓ源、無機イオン等、更に必要
ならばビタミン、有機窒素源を含有する通常の培地を用
いれば良い。炭素源としては、グルコース等の炭水化
物、グリセロール等のアルコール類、酢酸等の有機酸、
窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アン
モニウム塩、硝酸およびその塩等、リン源としてはリン
酸１カリウム等の無機リン酸およびその塩等、Ｓ源とし
ては硫酸マグネシウム等、無機イオンとしては、マグネ
シウムイオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイ
オン、その他が必要に応じ適宜使用される。有機栄養源
としては、ビタミン、アミノ酸等及びこれらを含有する
酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリ
カー、カゼイン分解物その他が適宜用いられる。培養条
件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下ｐＨ５
〜８及び温度２５〜４０℃の範囲内でｐＨ及び温度を適
当に制限しつつ１２〜７２時間程度培養を行なえばよ
い。また、前記培地に基質又はその前駆体を添加しても
よい。培地への基質の添加は培養初期でも培養途中でも
構わない。
【００４５】上記のようにして生成したアスパラギン酸
アミド並びにその誘導体は、合成吸着樹脂を用いる方法
や、その他通常の採取分離方法によって採取分離でき
る。またアスパラギン酸アミド並びにその誘導体の定量
は高速液体クロマトグラフィーを用いる方法で行えば良
い。
アミド並びにその誘導体は、合成吸着樹脂を用いる方法
や、その他通常の採取分離方法によって採取分離でき
る。またアスパラギン酸アミド並びにその誘導体の定量
は高速液体クロマトグラフィーを用いる方法で行えば良
い。
【００４６】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。
説明する。
【００４７】
【実施例１】α-アスパルチルジペプチダーゼ遺伝子（p
epE）欠失株の取得 pepEの取得は遺伝子データバンク（GeneBank Accession
No.AAC76991）の情報に基づき、TATTTGTTATTT CCATTGG
C（配列番号１）とAATGTCGCTCAACCTTGAAC（配列番号2）
の20merと20mer の両端プライマーによるPCR法（94℃,1
min,54℃,2 min,72℃,3 min,30サイクル）で行い、SD-
ATGと翻訳終止コドンをカバーする構造遺伝子領域の約1
400bpをpUC18ベクターのSmaIサイトにSureClone Ligati
on Kit（Amersham Pharmacia Biotech社製）を用いてク
ローン化した。
epE）欠失株の取得 pepEの取得は遺伝子データバンク（GeneBank Accession
No.AAC76991）の情報に基づき、TATTTGTTATTT CCATTGG
C（配列番号１）とAATGTCGCTCAACCTTGAAC（配列番号2）
の20merと20mer の両端プライマーによるPCR法（94℃,1
min,54℃,2 min,72℃,3 min,30サイクル）で行い、SD-
ATGと翻訳終止コドンをカバーする構造遺伝子領域の約1
400bpをpUC18ベクターのSmaIサイトにSureClone Ligati
on Kit（Amersham Pharmacia Biotech社製）を用いてク
ローン化した。
【００４８】クローン化された1400bpのpepE断片の開始
コドン側から約525bpの位置にNruIサイトが1ヶ所あるの
で、プラスミドをNruI消化し、EcoRI-NotI-BamHIアダプ
ター（Takara製）と連結した。こうして得られたプラス
ミドをNotI消化し、セルフライゲーション反応を行い、
このライゲーション反応液を用いて、E.coli JM 109 co
mpetent cellを形質転換した。アンピシリン50μg/mlを
含むLB（Tryptone 1%,Yeast extract 0.5%,NaCl 0.5%,p
H7.0）寒天プレートに生育する形質転換体からプラスミ
ドを調製後、NotIにて切断されるプラスミドDNA（pUCpe
pE´）を選択した。本プラスミドDNAが有するpepEはNru
Iサイトでフレームシフトが生じることになり、コード
される酵素は機能を持たなくなると予測される。
コドン側から約525bpの位置にNruIサイトが1ヶ所あるの
で、プラスミドをNruI消化し、EcoRI-NotI-BamHIアダプ
ター（Takara製）と連結した。こうして得られたプラス
ミドをNotI消化し、セルフライゲーション反応を行い、
このライゲーション反応液を用いて、E.coli JM 109 co
mpetent cellを形質転換した。アンピシリン50μg/mlを
含むLB（Tryptone 1%,Yeast extract 0.5%,NaCl 0.5%,p
H7.0）寒天プレートに生育する形質転換体からプラスミ
ドを調製後、NotIにて切断されるプラスミドDNA（pUCpe
pE´）を選択した。本プラスミドDNAが有するpepEはNru
Iサイトでフレームシフトが生じることになり、コード
される酵素は機能を持たなくなると予測される。
【００４９】次に、pUCpepE´をEcoRI並びにSalI消化
後、pepEを含む約1.4KbpのDNA断片を調製した。このDNA
断片を温度感受性複製起点（tsori）を有する相同組換
え用ベクターであるpMAN997のEcoRI/SalIサイトに挿入
し、目的のプラスミドpMAN997 pepE´を得た。プラスミ
ドpMAN997 pepE´でE.coli ATCC8739を30℃で形質転換
し、得られた形質転換体の複数個をLB液体培地（4ml/φ
1.4 cm×18 cm試験管）にて30℃、16時間培養後、培養
液を生理食塩水で希釈後、LBプレートにスプレッドし、
42℃にて10時間培養を行い、シングルコロニーを得た。
さらに、ここで得たシングルコロニーから、上記と同様
にして、シングルコロニーを得、相同組み換えによりプ
ラスミド全体が染色体に組み込まれたクローンを選択し
た。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないこ
とを確認した。
後、pepEを含む約1.4KbpのDNA断片を調製した。このDNA
断片を温度感受性複製起点（tsori）を有する相同組換
え用ベクターであるpMAN997のEcoRI/SalIサイトに挿入
し、目的のプラスミドpMAN997 pepE´を得た。プラスミ
ドpMAN997 pepE´でE.coli ATCC8739を30℃で形質転換
し、得られた形質転換体の複数個をLB液体培地（4ml/φ
1.4 cm×18 cm試験管）にて30℃、16時間培養後、培養
液を生理食塩水で希釈後、LBプレートにスプレッドし、
42℃にて10時間培養を行い、シングルコロニーを得た。
さらに、ここで得たシングルコロニーから、上記と同様
にして、シングルコロニーを得、相同組み換えによりプ
ラスミド全体が染色体に組み込まれたクローンを選択し
た。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないこ
とを確認した。
【００５０】次に、上記の相同組み換えによりプラスミ
ド全体が染色体に組み込まれたクローンから、10クロー
ンを選び、M9最少液体培地（4 ml、１L当りNa2HPO4 6.8
g, KH2PO4 3g, NaCl 0.5g, NH4Cl 1g, MgSO4・7H2O 0.5
g, CaCl2・２H2O 15mg, ThiaminHCl 2mg, Glucose 0.2
g, pH7.0）にて30℃、24時間培養後、培養液100μlを同
培地（4 ml）に移し、更に42℃にて24時間培養を行っ
た。
ド全体が染色体に組み込まれたクローンから、10クロー
ンを選び、M9最少液体培地（4 ml、１L当りNa2HPO4 6.8
g, KH2PO4 3g, NaCl 0.5g, NH4Cl 1g, MgSO4・7H2O 0.5
g, CaCl2・２H2O 15mg, ThiaminHCl 2mg, Glucose 0.2
g, pH7.0）にて30℃、24時間培養後、培養液100μlを同
培地（4 ml）に移し、更に42℃にて24時間培養を行っ
た。
【００５１】培養液を生理食塩水にて希釈後、M9最少プ
レートにスプレッドし、42℃にて12時間培養を行いシン
グルコロニーを得た。出現したコロニーをLBプレートと
アンピシリン50μg/mlを含むLBプレートに植菌し、30℃
で12時間培養後、LBプレートのみに生育するアンピシリ
ン感受性のクローンを選択した。さらに、これらアンピ
シリン感受性のクローンの染色体DNAからPCRによりpepE
約1.4Kbp断片を増幅させ、Not IにてDNA断片の切断が認
められたクローンをpepE欠質株とし、ここではE.coliΔ
pepE株とした。
レートにスプレッドし、42℃にて12時間培養を行いシン
グルコロニーを得た。出現したコロニーをLBプレートと
アンピシリン50μg/mlを含むLBプレートに植菌し、30℃
で12時間培養後、LBプレートのみに生育するアンピシリ
ン感受性のクローンを選択した。さらに、これらアンピ
シリン感受性のクローンの染色体DNAからPCRによりpepE
約1.4Kbp断片を増幅させ、Not IにてDNA断片の切断が認
められたクローンをpepE欠質株とし、ここではE.coliΔ
pepE株とした。
【００５２】
【実施例２】アスパルターゼ遺伝子（aspA）の取得
aspAの取得は遺伝子データバンク（GeneBank Accession
No.AAC77099）の情報に基づき、E.coli K-12株由来gen
ome DNAを鋳型として、ATAATCGTCGGTCGAAAAAC（配列番
号3）とTTTAAGTTACTGCTCACA AG（配列番号4）の20merと
20mer の両端プライマーによるPCR法（94℃,1 min,54
℃,2 min,72℃,3 min,30サイクル）で行い、SD-ATGと翻
訳終止コドンをカバーする構造遺伝子領域の約1.6Kbpを
pUC18ベクターのSmaIサイトにSureClone Ligation Kit
（Amersham Pharmacia Biotech社製）を用いてクローン
化した。このライゲーション反応液を用いて、E.coli J
M 109competent cellを形質転換し、アンピシリン50μg
/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体からpUC
aspAプラスミドを調製した。
No.AAC77099）の情報に基づき、E.coli K-12株由来gen
ome DNAを鋳型として、ATAATCGTCGGTCGAAAAAC（配列番
号3）とTTTAAGTTACTGCTCACA AG（配列番号4）の20merと
20mer の両端プライマーによるPCR法（94℃,1 min,54
℃,2 min,72℃,3 min,30サイクル）で行い、SD-ATGと翻
訳終止コドンをカバーする構造遺伝子領域の約1.6Kbpを
pUC18ベクターのSmaIサイトにSureClone Ligation Kit
（Amersham Pharmacia Biotech社製）を用いてクローン
化した。このライゲーション反応液を用いて、E.coli J
M 109competent cellを形質転換し、アンピシリン50μg
/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体からpUC
aspAプラスミドを調製した。
【００５３】
【実施例３】変異型aspAライブラリーの構築
aspAへの変異導入は、pUCaspAプラスミドを鋳型とし
て、M13Primer M3とM13Primer RV（Takara製）の両端プ
ライマーによるerror-prone PCR法（0.2mM dGTP、0.2mM
dATP、0.2 mM dCTP、1.0mM dTTP、94℃,1 min,54℃,2
min,72℃,3 min,30サイクル）にて行った。こうして増
幅した1.6KbpのDNA断片を脱塩後、SacI 並びにSphI 消
化した。このDNA断片を、pHSG298（Takara製）のSacI/
SphIサイトにライゲーションし、このライゲーション溶
液を変異型aspAライブラリーとした。
て、M13Primer M3とM13Primer RV（Takara製）の両端プ
ライマーによるerror-prone PCR法（0.2mM dGTP、0.2mM
dATP、0.2 mM dCTP、1.0mM dTTP、94℃,1 min,54℃,2
min,72℃,3 min,30サイクル）にて行った。こうして増
幅した1.6KbpのDNA断片を脱塩後、SacI 並びにSphI 消
化した。このDNA断片を、pHSG298（Takara製）のSacI/
SphIサイトにライゲーションし、このライゲーション溶
液を変異型aspAライブラリーとした。
【００５４】
【実施例４】変異型aspAライブラリーからのフマル酸モ
ノアミドアミノ化酵素の選択 上記ライゲーション溶液にてE.coliΔpepE株を形質転換
し、得られた形質転換体2100クローンをカナマイシン10
0μg/mlを含むLB液体培地（2 ml）に植菌し、37℃にて1
6時間培養した。培養後、培養液を遠心分離し、得られ
た菌体を20 mM MOPS-KOH buffer (pH7.0)にて洗浄後、1
mM DTTを含む同buffer1 mlに懸濁した。菌体懸濁液を
超音波破砕し、遠心分離（12, 000g×10 min）により無
細胞抽出液を得、これを酵素源としてフマル酸モノアミ
ドアミノ化反応を行った。フマル酸モノアミドアミノ化
反応は、酵素液20μlを基質溶液20μl（フマル酸モノア
ミド200 mM,アンモニア 200 mM, MgCl2 2mM, 100 mM MO
PS-KOH buffer (pH 7.0)）に添加し、30℃にて16時間行
った。反応後、反応液をTLCプレート（Merck製、 Silic
agel 60F 254）に1μlスポットし、ブタノール/酢酸/水
= 4/1/2 （volume/volume）にて展開し、L-アスパラギ
ン酸アミドを生成するクローンを１クローン取得した。
ノアミドアミノ化酵素の選択 上記ライゲーション溶液にてE.coliΔpepE株を形質転換
し、得られた形質転換体2100クローンをカナマイシン10
0μg/mlを含むLB液体培地（2 ml）に植菌し、37℃にて1
6時間培養した。培養後、培養液を遠心分離し、得られ
た菌体を20 mM MOPS-KOH buffer (pH7.0)にて洗浄後、1
mM DTTを含む同buffer1 mlに懸濁した。菌体懸濁液を
超音波破砕し、遠心分離（12, 000g×10 min）により無
細胞抽出液を得、これを酵素源としてフマル酸モノアミ
ドアミノ化反応を行った。フマル酸モノアミドアミノ化
反応は、酵素液20μlを基質溶液20μl（フマル酸モノア
ミド200 mM,アンモニア 200 mM, MgCl2 2mM, 100 mM MO
PS-KOH buffer (pH 7.0)）に添加し、30℃にて16時間行
った。反応後、反応液をTLCプレート（Merck製、 Silic
agel 60F 254）に1μlスポットし、ブタノール/酢酸/水
= 4/1/2 （volume/volume）にて展開し、L-アスパラギ
ン酸アミドを生成するクローンを１クローン取得した。
【００５５】
【実施例５】フマル酸モノアミドアミノ化酵素の変異点
解析 フマル酸モノアミドアミノ化酵素をコードする変異型as
pA遺伝子の塩基配列は、Dye Terminator Cycle Sequenc
ing Kit（ABI社製）を用いたPCR反応にて、DNASequence
r model 373（ABI社製）を用いて行った。フマル酸モノ
アミドアミノ化酵素をコードする変異型aspAには、2塩
基1アミノ酸置換が生じていた（置換塩基：462番目のシ
トシンがチミン、981番目のアデニンがチミン、置換ア
ミノ酸：327番目のLysがAsn、配列番号７）。フマル酸
モノアミドアミノ化酵素をコードする変異型アスパルタ
ーゼ遺伝子をLys327Asn型aspAとする。
解析 フマル酸モノアミドアミノ化酵素をコードする変異型as
pA遺伝子の塩基配列は、Dye Terminator Cycle Sequenc
ing Kit（ABI社製）を用いたPCR反応にて、DNASequence
r model 373（ABI社製）を用いて行った。フマル酸モノ
アミドアミノ化酵素をコードする変異型aspAには、2塩
基1アミノ酸置換が生じていた（置換塩基：462番目のシ
トシンがチミン、981番目のアデニンがチミン、置換ア
ミノ酸：327番目のLysがAsn、配列番号７）。フマル酸
モノアミドアミノ化酵素をコードする変異型アスパルタ
ーゼ遺伝子をLys327Asn型aspAとする。
【００５６】
【実施例６】フマル酸モノアミドアミノ化酵素を用いた
L-アスパラギン酸アミドの生産 実施例4記載の形質転換体を、カナマイシン100μg/mlを
含むLB液体培地（5 ml）に植菌し、37℃にて16時間培養
した。培養後、培養液を遠心分離し、得られた菌体を20
mM MOPS-KOH buffer (pH7.0)にて洗浄後、1 mM DTTを
含む同buffer1 mlに懸濁した。菌体懸濁液を超音波破砕
し、遠心分離（12, 000g×10 min）により無細胞抽出液
を得た。この無細胞抽出液1mlを基質溶液1ml（フマル酸
モノアミド 200 mM,アンモニア 200 mM, MgCl2 2mM, 10
0 mM MOPS-KOH buffer (pH 7.0)）に添加し、30℃にて1
6時間反応を行った。反応液を95℃、5 min熱処理にて反
応停止後、遠心分離（20800 g×10 min）にて得た上清
をHPLCアナライザーにて分析したところ、20 mMのL-ア
スパラギン酸アミドが生成していた。
L-アスパラギン酸アミドの生産 実施例4記載の形質転換体を、カナマイシン100μg/mlを
含むLB液体培地（5 ml）に植菌し、37℃にて16時間培養
した。培養後、培養液を遠心分離し、得られた菌体を20
mM MOPS-KOH buffer (pH7.0)にて洗浄後、1 mM DTTを
含む同buffer1 mlに懸濁した。菌体懸濁液を超音波破砕
し、遠心分離（12, 000g×10 min）により無細胞抽出液
を得た。この無細胞抽出液1mlを基質溶液1ml（フマル酸
モノアミド 200 mM,アンモニア 200 mM, MgCl2 2mM, 10
0 mM MOPS-KOH buffer (pH 7.0)）に添加し、30℃にて1
6時間反応を行った。反応液を95℃、5 min熱処理にて反
応停止後、遠心分離（20800 g×10 min）にて得た上清
をHPLCアナライザーにて分析したところ、20 mMのL-ア
スパラギン酸アミドが生成していた。
【００５７】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> AJINOMOTO CO., INC.
<120> THE METHOD OF PRODUCING ASPARTATIC ACID AMIDO
DERIVATIVES
<130> alf2 KIRA et al
<140>
<141>
<160> 9
<170> PatentIn Ver. 2.1
【００５８】
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCR primer
<400> 1
tatttgttat ttccattggc 20
【００５９】
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCR primer
<400> 2
aatgtcgctc aaccttgaac 20
【００６０】
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCR primer
<400> 3
ataatcgtcg gtcgaaaaac 20
【００６１】
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PCR primer
<400> 4
tttaagttac tgctcacaag 20
【００６２】
<210> 5
<211> 1440
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1437)
<400> 5
atg tca aac aac att cgt atc gaa gaa gat ctg ttg ggt acc agg gaa 48
Met Ser Asn Asn Ile Arg Ile Glu Glu Asp Leu Leu Gly Thr Arg Glu
1 5 10 15
gtt cca gct gat gcc tac tat ggt gtt cac act ctg aga gcg att gaa 96
Val Pro Ala Asp Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg Ala Ile Glu
20 25 30
aac ttc tat atc agc aac aac aaa atc agt gat att cct gaa ttt gtt 144
Asn Phe Tyr Ile Ser Asn Asn Lys Ile Ser Asp Ile Pro Glu Phe Val
35 40 45
cgc ggt atg gta atg gtt aaa aaa gcc gca gct atg gca aac aaa gag 192
Arg Gly Met Val Met Val Lys Lys Ala Ala Ala Met Ala Asn Lys Glu
50 55 60
ctg caa acc att cct aaa agt gta gcg aat gcc atc att gcc gca tgt 240
Leu Gln Thr Ile Pro Lys Ser Val Ala Asn Ala Ile Ile Ala Ala Cys
65 70 75 80
gat gaa gtc ctg aac aac gga aaa tgc atg gat cag ttc ccg gta gac 288
Asp Glu Val Leu Asn Asn Gly Lys Cys Met Asp Gln Phe Pro Val Asp
85 90 95
gtc tac cag ggc ggc gca ggt act tcc gta aac atg aac acc aac gaa 336
Val Tyr Gln Gly Gly Ala Gly Thr Ser Val Asn Met Asn Thr Asn Glu
100 105 110
gtg ctg gcc aat atc ggt ctg gaa ctg atg ggt cac cag aaa ggt gaa 384
Val Leu Ala Asn Ile Gly Leu Glu Leu Met Gly His Gln Lys Gly Glu
115 120 125
tat cag tac ctg aac ccg aac gac cat gtt aac aaa tgt cag tcc act 432
Tyr Gln Tyr Leu Asn Pro Asn Asp His Val Asn Lys Cys Gln Ser Thr
130 135 140
aac gac gcc tac ccg acc ggt ttc cgt atc gca gtt tac tct tct ctg 480
Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Gly Phe Arg Ile Ala Val Tyr Ser Ser Leu
145 150 155 160
att aag ctg gta gat gcg att aac caa ctg cgt gaa ggc ttt gaa cgt 528
Ile Lys Leu Val Asp Ala Ile Asn Gln Leu Arg Glu Gly Phe Glu Arg
165 170 175
aaa gct gtc gaa ttc cag gac atc ctg aaa atg ggt cgt acc cag ctg 576
Lys Ala Val Glu Phe Gln Asp Ile Leu Lys Met Gly Arg Thr Gln Leu
180 185 190
cag gac gca gta ccg atg acc ctc ggt cag gaa ttc cgc gct ttc agc 624
Gln Asp Ala Val Pro Met Thr Leu Gly Gln Glu Phe Arg Ala Phe Ser
195 200 205
atc ctg ctg aaa gaa gaa gtg aaa aac atc caa cgt acc gct gaa ctg 672
Ile Leu Leu Lys Glu Glu Val Lys Asn Ile Gln Arg Thr Ala Glu Leu
210 215 220
ctg ctg gaa gtt aac ctt ggc gca aca gca atc ggt act ggt ctg aac 720
Leu Leu Glu Val Asn Leu Gly Ala Thr Ala Ile Gly Thr Gly Leu Asn
225 230 235 240
acg ccg aaa gag tac tct ccg ctg gca gtg aaa aaa ctg gct gaa gtc 768
Thr Pro Lys Glu Tyr Ser Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu Ala Glu Val
245 250 255
act ggc ttc cca tgc gta ccg gct gaa gac ctg atc gaa gcg acc tct 816
Thr Gly Phe Pro Cys Val Pro Ala Glu Asp Leu Ile Glu Ala Thr Ser
260 265 270
gac tgc ggc gct tat gtt atg gtt cac ggc gcg ctg aaa cgc ctg gct 864
Asp Cys Gly Ala Tyr Val Met Val His Gly Ala Leu Lys Arg Leu Ala
275 280 285
gtg aag atg tcc aaa atc tgt aac gac ctg cgc ttg ctc tct tct ggc 912
Val Lys Met Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ser Ser Gly
290 295 300
cca cgt gcc ggc ctg aac gag atc aac ctg ccg gaa ctg cag gcg ggc 960
Pro Arg Ala Gly Leu Asn Glu Ile Asn Leu Pro Glu Leu Gln Ala Gly
305 310 315 320
tct tcc atc atg cca gct aaa gta aac ccg gtt gtt ccg gaa gtg gtt 1008
Ser Ser Ile Met Pro Ala Lys Val Asn Pro Val Val Pro Glu Val Val
325 330 335
aac cag gta tgc ttc aaa gtc atc ggt aac gac acc act gtt acc atg 1056
Asn Gln Val Cys Phe Lys Val Ile Gly Asn Asp Thr Thr Val Thr Met
340 345 350
gca gca gaa gca ggt cag ctg cag ttg aac gtt atg gag ccg gtc att 1104
Ala Ala Glu Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Val Met Glu Pro Val Ile
355 360 365
ggc cag gct atg ttc gaa tcc gtt cac att ctg acc aac gct tgc tac 1152
Gly Gln Ala Met Phe Glu Ser Val His Ile Leu Thr Asn Ala Cys Tyr
370 375 380
aac ctg ctg gaa aaa tgc att aac ggc atc act gct aac aaa gaa gtg 1200
Asn Leu Leu Glu Lys Cys Ile Asn Gly Ile Thr Ala Asn Lys Glu Val
385 390 395 400
tgc gaa ggt tac gtt tac aac tct atc ggt atc gtt act tac ctg aac 1248
Cys Glu Gly Tyr Val Tyr Asn Ser Ile Gly Ile Val Thr Tyr Leu Asn
405 410 415
ccg ttc atc ggt cac cac aac ggt gac atc gtg ggt aaa atc tgt gcc 1296
Pro Phe Ile Gly His His Asn Gly Asp Ile Val Gly Lys Ile Cys Ala
420 425 430
gaa acc ggt aag agt gta cgt gaa gtc gtt ctg gaa cgc ggt ctg ttg 1344
Glu Thr Gly Lys Ser Val Arg Glu Val Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu
435 440 445
act gaa gcg gaa ctt gac gat att ttc tcc gta cag aat ctg atg cac 1392
Thr Glu Ala Glu Leu Asp Asp Ile Phe Ser Val Gln Asn Leu Met His
450 455 460
ccg gct tac aaa gca aaa cgc tat act gat gaa agc gaa cag taa tcg 1440
Pro Ala Tyr Lys Ala Lys Arg Tyr Thr Asp Glu Ser Glu Gln
465 470 475
【００６３】
<210> 6
<211> 478
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 6
Met Ser Asn Asn Ile Arg Ile Glu Glu Asp Leu Leu Gly Thr Arg Glu
1 5 10 15
Val Pro Ala Asp Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg Ala Ile Glu
20 25 30
Asn Phe Tyr Ile Ser Asn Asn Lys Ile Ser Asp Ile Pro Glu Phe Val
35 40 45
Arg Gly Met Val Met Val Lys Lys Ala Ala Ala Met Ala Asn Lys Glu
50 55 60
Leu Gln Thr Ile Pro Lys Ser Val Ala Asn Ala Ile Ile Ala Ala Cys
65 70 75 80
Asp Glu Val Leu Asn Asn Gly Lys Cys Met Asp Gln Phe Pro Val Asp
85 90 95
Val Tyr Gln Gly Gly Ala Gly Thr Ser Val Asn Met Asn Thr Asn Glu
100 105 110
Val Leu Ala Asn Ile Gly Leu Glu Leu Met Gly His Gln Lys Gly Glu
115 120 125
Tyr Gln Tyr Leu Asn Pro Asn Asp His Val Asn Lys Cys Gln Ser Thr
130 135 140
Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Gly Phe Arg Ile Ala Val Tyr Ser Ser Leu
145 150 155 160
Ile Lys Leu Val Asp Ala Ile Asn Gln Leu Arg Glu Gly Phe Glu Arg
165 170 175
Lys Ala Val Glu Phe Gln Asp Ile Leu Lys Met Gly Arg Thr Gln Leu
180 185 190
Gln Asp Ala Val Pro Met Thr Leu Gly Gln Glu Phe Arg Ala Phe Ser
195 200 205
Ile Leu Leu Lys Glu Glu Val Lys Asn Ile Gln Arg Thr Ala Glu Leu
210 215 220
Leu Leu Glu Val Asn Leu Gly Ala Thr Ala Ile Gly Thr Gly Leu Asn
225 230 235 240
Thr Pro Lys Glu Tyr Ser Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu Ala Glu Val
245 250 255
Thr Gly Phe Pro Cys Val Pro Ala Glu Asp Leu Ile Glu Ala Thr Ser
260 265 270
Asp Cys Gly Ala Tyr Val Met Val His Gly Ala Leu Lys Arg Leu Ala
275 280 285
Val Lys Met Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ser Ser Gly
290 295 300
Pro Arg Ala Gly Leu Asn Glu Ile Asn Leu Pro Glu Leu Gln Ala Gly
305 310 315 320
Ser Ser Ile Met Pro Ala Lys Val Asn Pro Val Val Pro Glu Val Val
325 330 335
Asn Gln Val Cys Phe Lys Val Ile Gly Asn Asp Thr Thr Val Thr Met
340 345 350
Ala Ala Glu Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Val Met Glu Pro Val Ile
355 360 365
Gly Gln Ala Met Phe Glu Ser Val His Ile Leu Thr Asn Ala Cys Tyr
370 375 380
Asn Leu Leu Glu Lys Cys Ile Asn Gly Ile Thr Ala Asn Lys Glu Val
385 390 395 400
Cys Glu Gly Tyr Val Tyr Asn Ser Ile Gly Ile Val Thr Tyr Leu Asn
405 410 415
Pro Phe Ile Gly His His Asn Gly Asp Ile Val Gly Lys Ile Cys Ala
420 425 430
Glu Thr Gly Lys Ser Val Arg Glu Val Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu
435 440 445
Thr Glu Ala Glu Leu Asp Asp Ile Phe Ser Val Gln Asn Leu Met His
450 455 460
Pro Ala Tyr Lys Ala Lys Arg Tyr Thr Asp Glu Ser Glu Gln
465 470 475
【００６４】
<210> 7
<211> 1440
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1437)
<400> 7
atg tca aac aac att cgt atc gaa gaa gat ctg ttg ggt acc agg gaa 48
Met Ser Asn Asn Ile Arg Ile Glu Glu Asp Leu Leu Gly Thr Arg Glu
1 5 10 15
gtt cca gct gat gcc tac tat ggt gtt cac act ctg aga gcg att gaa 96
Val Pro Ala Asp Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg Ala Ile Glu
20 25 30
aac ttc tat atc agc aac aac aaa atc agt gat att cct gaa ttt gtt 144
Asn Phe Tyr Ile Ser Asn Asn Lys Ile Ser Asp Ile Pro Glu Phe Val
35 40 45
cgc ggt atg gta atg gtt aaa aaa gcc gca gct atg gca aac aaa gag 192
Arg Gly Met Val Met Val Lys Lys Ala Ala Ala Met Ala Asn Lys Glu
50 55 60
ctg caa acc att cct aaa agt gta gcg aat gcc atc att gcc gca tgt 240
Leu Gln Thr Ile Pro Lys Ser Val Ala Asn Ala Ile Ile Ala Ala Cys
65 70 75 80
gat gaa gtc ctg aac aac gga aaa tgc atg gat cag ttc ccg gta gac 288
Asp Glu Val Leu Asn Asn Gly Lys Cys Met Asp Gln Phe Pro Val Asp
85 90 95
gtc tac cag ggc ggc gca ggt act tcc gta aac atg aac acc aac gaa 336
Val Tyr Gln Gly Gly Ala Gly Thr Ser Val Asn Met Asn Thr Asn Glu
100 105 110
gtg ctg gcc aat atc ggt ctg gaa ctg atg ggt cac cag aaa ggt gaa 384
Val Leu Ala Asn Ile Gly Leu Glu Leu Met Gly His Gln Lys Gly Glu
115 120 125
tat cag tac ctg aac ccg aac gac cat gtt aac aaa tgt cag tcc act 432
Tyr Gln Tyr Leu Asn Pro Asn Asp His Val Asn Lys Cys Gln Ser Thr
130 135 140
aac gac gcc tac ccg acc ggt ttc cgt att gca gtt tac tct tct ctg 480
Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Gly Phe Arg Ile Ala Val Tyr Ser Ser Leu
145 150 155 160
att aag ctg gta gat gcg att aac caa ctg cgt gaa ggc ttt gaa cgt 528
Ile Lys Leu Val Asp Ala Ile Asn Gln Leu Arg Glu Gly Phe Glu Arg
165 170 175
aaa gct gtc gaa ttc cag gac atc ctg aaa atg ggt cgt acc cag ctg 576
Lys Ala Val Glu Phe Gln Asp Ile Leu Lys Met Gly Arg Thr Gln Leu
180 185 190
cag gac gca gta ccg atg acc ctc ggt cag gaa ttc cgc gct ttc agc 624
Gln Asp Ala Val Pro Met Thr Leu Gly Gln Glu Phe Arg Ala Phe Ser
195 200 205
atc ctg ctg aaa gaa gaa gtg aaa aac atc caa cgt acc gct gaa ctg 672
Ile Leu Leu Lys Glu Glu Val Lys Asn Ile Gln Arg Thr Ala Glu Leu
210 215 220
ctg ctg gaa gtt aac ctt ggc gca aca gca atc ggt act ggt ctg aac 720
Leu Leu Glu Val Asn Leu Gly Ala Thr Ala Ile Gly Thr Gly Leu Asn
225 230 235 240
acg ccg aaa gag tac tct ccg ctg gca gtg aaa aaa ctg gct gaa gtc 768
Thr Pro Lys Glu Tyr Ser Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu Ala Glu Val
245 250 255
act ggc ttc cca tgc gta ccg gct gaa gac ctg atc gaa gcg acc tct 816
Thr Gly Phe Pro Cys Val Pro Ala Glu Asp Leu Ile Glu Ala Thr Ser
260 265 270
gac tgc ggc gct tat gtt atg gtt cac ggc gcg ctg aaa cgc ctg gct 864
Asp Cys Gly Ala Tyr Val Met Val His Gly Ala Leu Lys Arg Leu Ala
275 280 285
gtg aag atg tcc aaa atc tgt aac gac ctg cgc ttg ctc tct tct ggc 912
Val Lys Met Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ser Ser Gly
290 295 300
cca cgt gcc ggc ctg aac gag atc aac ctg ccg gaa ctg cag gcg ggc 960
Pro Arg Ala Gly Leu Asn Glu Ile Asn Leu Pro Glu Leu Gln Ala Gly
305 310 315 320
tct tcc atc atg cca gct aat gta aac ccg gtt gtt ccg gaa gtg gtt 1008
Ser Ser Ile Met Pro Ala Asn Val Asn Pro Val Val Pro Glu Val Val
325 330 335
aac cag gta tgc ttc aaa gtc atc ggt aac gac acc act gtt acc atg 1056
Asn Gln Val Cys Phe Lys Val Ile Gly Asn Asp Thr Thr Val Thr Met
340 345 350
gca gca gaa gca ggt cag ctg cag ttg aac gtt atg gag ccg gtc att 1104
Ala Ala Glu Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Val Met Glu Pro Val Ile
355 360 365
ggc cag gct atg ttc gaa tcc gtt cac att ctg acc aac gct tgc tac 1152
Gly Gln Ala Met Phe Glu Ser Val His Ile Leu Thr Asn Ala Cys Tyr
370 375 380
aac ctg ctg gaa aaa tgc att aac ggc atc act gct aac aaa gaa gtg 1200
Asn Leu Leu Glu Lys Cys Ile Asn Gly Ile Thr Ala Asn Lys Glu Val
385 390 395 400
tgc gaa ggt tac gtt tac aac tct atc ggt atc gtt act tac ctg aac 1248
Cys Glu Gly Tyr Val Tyr Asn Ser Ile Gly Ile Val Thr Tyr Leu Asn
405 410 415
ccg ttc atc ggt cac cac aac ggt gac atc gtg ggt aaa atc tgt gcc 1296
Pro Phe Ile Gly His His Asn Gly Asp Ile Val Gly Lys Ile Cys Ala
420 425 430
gaa acc ggt aag agt gta cgt gaa gtc gtt ctg gaa cgc ggt ctg ttg 1344
Glu Thr Gly Lys Ser Val Arg Glu Val Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu
435 440 445
act gaa gcg gaa ctt gac gat att ttc tcc gta cag aat ctg atg cac 1392
Thr Glu Ala Glu Leu Asp Asp Ile Phe Ser Val Gln Asn Leu Met His
450 455 460
ccg gct tac aaa gca aaa cgc tat act gat gaa agc gaa cag taa tcg 1440
Pro Ala Tyr Lys Ala Lys Arg Tyr Thr Asp Glu Ser Glu Gln
465 470 475
【００６５】
<210> 8
<211> 478
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 8
Met Ser Asn Asn Ile Arg Ile Glu Glu Asp Leu Leu Gly Thr Arg Glu
1 5 10 15
Val Pro Ala Asp Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg Ala Ile Glu
20 25 30
Asn Phe Tyr Ile Ser Asn Asn Lys Ile Ser Asp Ile Pro Glu Phe Val
35 40 45
Arg Gly Met Val Met Val Lys Lys Ala Ala Ala Met Ala Asn Lys Glu
50 55 60
Leu Gln Thr Ile Pro Lys Ser Val Ala Asn Ala Ile Ile Ala Ala Cys
65 70 75 80
Asp Glu Val Leu Asn Asn Gly Lys Cys Met Asp Gln Phe Pro Val Asp
85 90 95
Val Tyr Gln Gly Gly Ala Gly Thr Ser Val Asn Met Asn Thr Asn Glu
100 105 110
Val Leu Ala Asn Ile Gly Leu Glu Leu Met Gly His Gln Lys Gly Glu
115 120 125
Tyr Gln Tyr Leu Asn Pro Asn Asp His Val Asn Lys Cys Gln Ser Thr
130 135 140
Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Gly Phe Arg Ile Ala Val Tyr Ser Ser Leu
145 150 155 160
Ile Lys Leu Val Asp Ala Ile Asn Gln Leu Arg Glu Gly Phe Glu Arg
165 170 175
Lys Ala Val Glu Phe Gln Asp Ile Leu Lys Met Gly Arg Thr Gln Leu
180 185 190
Gln Asp Ala Val Pro Met Thr Leu Gly Gln Glu Phe Arg Ala Phe Ser
195 200 205
Ile Leu Leu Lys Glu Glu Val Lys Asn Ile Gln Arg Thr Ala Glu Leu
210 215 220
Leu Leu Glu Val Asn Leu Gly Ala Thr Ala Ile Gly Thr Gly Leu Asn
225 230 235 240
Thr Pro Lys Glu Tyr Ser Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu Ala Glu Val
245 250 255
Thr Gly Phe Pro Cys Val Pro Ala Glu Asp Leu Ile Glu Ala Thr Ser
260 265 270
Asp Cys Gly Ala Tyr Val Met Val His Gly Ala Leu Lys Arg Leu Ala
275 280 285
Val Lys Met Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ser Ser Gly
290 295 300
Pro Arg Ala Gly Leu Asn Glu Ile Asn Leu Pro Glu Leu Gln Ala Gly
305 310 315 320
Ser Ser Ile Met Pro Ala Asn Val Asn Pro Val Val Pro Glu Val Val
325 330 335
Asn Gln Val Cys Phe Lys Val Ile Gly Asn Asp Thr Thr Val Thr Met
340 345 350
Ala Ala Glu Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Val Met Glu Pro Val Ile
355 360 365
Gly Gln Ala Met Phe Glu Ser Val His Ile Leu Thr Asn Ala Cys Tyr
370 375 380
Asn Leu Leu Glu Lys Cys Ile Asn Gly Ile Thr Ala Asn Lys Glu Val
385 390 395 400
Cys Glu Gly Tyr Val Tyr Asn Ser Ile Gly Ile Val Thr Tyr Leu Asn
405 410 415
Pro Phe Ile Gly His His Asn Gly Asp Ile Val Gly Lys Ile Cys Ala
420 425 430
Glu Thr Gly Lys Ser Val Arg Glu Val Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu
435 440 445
Thr Glu Ala Glu Leu Asp Asp Ile Phe Ser Val Gln Asn Leu Met His
450 455 460
Pro Ala Tyr Lys Ala Lys Arg Tyr Thr Asp Glu Ser Glu Gln
465 470 475
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
Ｆターム(参考） 4B024 AA05 BA07 CA02 DA06
4B050 CC03 DD02 LL02
4B064 AE02 CA19 CC24 DA10
4B065 AA26X AA26Y AB01 BA01
CA29 CA41
Claims (7)
- 【請求項１】 配列番号５記載のアミノ酸配列、又は当
該アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸残基の付
加、欠失若しくは置換がされたアミノ酸配列を有するア
スパルターゼ活性を有するタンパク質であって、配列番
号５記載のアミノ酸配列の327番目に相当するリジン残
基がアスパラギン残基に置換され、かつ、下記反応を触
媒する能力を有するもの。 【化１】 - 【請求項２】 請求項１記載のタンパク質をコードする
ＤＮＡ。 - 【請求項３】 請求項２記載のＤＮＡを含む組換えＤＮ
Ａ。 - 【請求項４】 請求項２記載のＤＮＡで形質転換され、
染色体ＤＮＡ上のα−アスパルチルジペプチダーゼをコ
ードする遺伝子が破壊され、かつ、アスパラギン酸アミ
ド並びにその誘導体を産生する能力を有する微生物。 - 【請求項５】 染色体ＤＮＡ上のα−アスパルチルジペ
プチダーゼをコードする遺伝子が破壊されたことによっ
てアスパラギン酸アミド並びにその誘導体分解活性が低
下又は消失したことを特徴とする請求項４記載の微生
物。 - 【請求項６】 エシェリヒア属細菌である請求項４又は
５記載の微生物。 - 【請求項７】 請求項４〜６のいずれか一項に記載の微
生物を、本微生物が生育できる培地で培養して、アスパ
ラギン酸アミド並びにその誘導体を生成させることを特
徴とするアスパラギン酸アミド並びにその誘導体の製造
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001392033A JP2003189863A (ja) | 2001-12-25 | 2001-12-25 | アスパラギン酸アミド並びにその誘導体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001392033A JP2003189863A (ja) | 2001-12-25 | 2001-12-25 | アスパラギン酸アミド並びにその誘導体の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003189863A true JP2003189863A (ja) | 2003-07-08 |
Family
ID=27599452
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001392033A Pending JP2003189863A (ja) | 2001-12-25 | 2001-12-25 | アスパラギン酸アミド並びにその誘導体の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003189863A (ja) |
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-
2001
- 2001-12-25 JP JP2001392033A patent/JP2003189863A/ja active Pending
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